JP2012505376A - アレイ蛍光均等化方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、蛍光強度均等化の方法を提供する。この方法は、蛍光マーカーと結合した分析物と結合する分子プローブの少なくとも１つの固定化アレイを有するアッセイデバイスを準備するステップと、第１の開口端部と第２の開口端部とを有する吸引チューブを備える乾燥装置を準備するステップであって、吸引チューブの第２の端部が、前記チューブを通じて真空を適用するための真空源に接続されているステップと、吸引チューブの第１の端部を、分子プローブの前記少なくとも１つの固定化アレイの近傍に配置するステップと、分子プローブの前記少なくとも１つの固定化アレイから蒸気を除去するために、前記吸引チューブを通じて真空を適用するステップとを含む。本発明の適用により、シグナル消光性因子の低減を原因として、より信頼性が高い蛍光シグナル強度の読み取りがもたらされる。

Description

本発明は、アッセイスポットアレイ成分の制御された乾燥中に流体蒸気の均一な除去を誘導することによる、アッセイスポット及びアレイ蛍光強度均等化の方法に関する。

蛍光分光法の利点は、蛍光発光体の蛍光量子収率及び／又は寿命に関連する種々の特徴の測定及び分析である。発光蛍光強度は、エミッター濃度、励起波長での吸光係数（吸収力）及び発光波長での量子収率の関数である。しかし、時間分解型及び定常状態での蛍光消光は、蛍光強度測定における大きな変動の原因である。強度の変動及び不均質性は、蛍光消光剤の濃度に比例して変動し、拡散における一過性の効果及び蛍光体−消光剤相互作用の性質により部分的に引き起こされる。時間分解型周波数ドメイン及び定常状態データの分析は、消光速度が、エミッターからの蛍光体−消光剤の距離に指数関数的に依存することを示し、このことは、考えられる消光機構としての電子の伝達及び交換相互作用を反映する。

アッセイスポット及びマイクロアレイから発光される定量的蛍光シグナル検出を改善するための技術が、検出ハードウェアを改良し、蛍光シグナル処理を改変することにより検出を改善するための方法に組み込まれている；例えば、蓄積強度のコンピュータ画像データ処理を用いるＴａｍｕｒａらによる「マイクロアレイ情報を表示する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｍｉｃｒｏ−ａｒｒａｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」との表題の米国特許第６，６９０，４６１号、２００４年；乾燥スポットを調べて乾燥により引き起こされる結果として生じる製造誤差を例示するＣａｒｅｎらによる「ポリヌクレオチドアレイ製造（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）」との表題の米国特許出願第２００４２０１３８号、２００４年；容量／濃度の色素に基づく修正のために緩衝液とプリントスポットとを比較することにより化学発光応答を比較するＡｎｄｅｒｓｏｎらによる「タンパク質マイクロアレイのための品質管理及び標準化の方法（Ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏ−ａｒｒａｙｓ）」との表題の米国特許出願第２００６／００６３１９７Ａ１号；アレイ自体の強度較正の特徴を比較するＭｏｎｔａｇｕ及びＷｅｂｂによる「蛍光アレイの読み取り（Ｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｒｒａｙｓ）」との表題の米国特許出願第２００６１２７９４６号；並びにスポットされた試料全体での蛍光を２次元で測定し、次いで、プリントされた参照画像と比較することによりプリントスポットを画像化するＭｏｈａｍｍｅｄ及びＤｚｉｄｉｃによる「マイクロアレイ品質管理（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）」との表題のＷＯ特許出願第２００６０５８０３１号に記載されている。

定量的蛍光測定を得るための最新技術は、シグナルがエミッター濃度を正確に反映するとの仮定に基づいて、シグナルの正確な検出、及びシグナル分析前のシグナル補正の最適化に重点を置いている。このアプローチは、Ｇｅらによる「蛍光検出装置のための較正スライド及び調製方法（Ａ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｓｌｉｄｅ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」との表題の欧州出願第ＥＰ１７７４２９２号（２００７年）により記載され、この発明は、マイクロアレイスキャナ、蛍光顕微鏡観察、蛍光分光法及び蛍光マルチウェルプレート読み取りの較正を含む、蛍光検出装置についての常法どおりの較正スライドに関する。

スポット間及びマイクロアレイ間で観察される蛍光強度定量における変動係数（％ｃ．ｖ．）を改善するための現在の技術は、蛍光シグナルの修正及び画像処理により得られるシグナル強度読み取りの改善に主に焦点を当てている。共通の供給源流体からプリントされたとき、同一の内容物を有するスポット間の蛍光シグナル強度の定量的均一性比較を改善及び設定し、同様の内容物濃度で均一なシグナルレベルを提供するための方法が必要である。

マイクロアレイ及びスポットの制御された乾燥により均一状態の水和を誘導して、流体の蛍光シグナル消光効果及びスポット内容物、例えば粒子の空間分布を最小限にし、その後、湿ったアレイ及びスポットの中及びその付近からのシグナル消光性流体蒸気の制御及び抑制された除去を行って、比較定量シグナル分析を可能にするための方法が必要とされている。新規で実施が簡便な方法を用いて、流体除去と、その後の蒸気除去のこのような方法を提供することが望ましい。

消光性成分を、短い乾燥時間を用いてバイオアレイデータの比較分析の向上を可能にする相対濃度まで低減させるアッセイスポットシグナル均等化もさらに提供する必要がある。

供給源蛍光量における不均一性を無作為化して、アッセイスポットについてのより均一なイルミネーションシグナルの定量をもたらす方法が必要とされている。

それぞれの発散性で拡散性の消光性供給源が最小限であり、このことにより、変動係数（ｃｖ）を算出するための認められた参照標準物質を用いて測定及び確認される、各アッセイスポットの近傍の比較できる蛍光シグナル強度がもたらされる方法もさらに必要とされている。

本発明は、好ましくは、アッセイデータの比較分析の向上を可能にする相対濃度まで消光性成分を低減させることによる、蛍光強度均等化の方法である。この方法は、アッセイデバイスを乾燥させて、蛍光マーカーと結合した分析物と結合する分子プローブの少なくとも１つの固定化アレイの近傍の蒸気を除去することを含む。

本発明のある態様によると、以下の：蛍光マーカーと結合した分析物と結合する分子プローブの少なくとも１つの固定化アレイを有するアッセイデバイスを準備するステップと、第１の開口端部と第２の開口端部とを有する吸引チューブを備える乾燥装置を準備するステップであって、吸引チューブの第２の端部が、前記チューブを通じて真空を適用するための真空源に接続されているステップと、吸引チューブの第１の端部を、分子プローブの前記少なくとも１つの固定化アレイの近傍に配置するステップと、分子プローブの前記少なくとも１つの固定化アレイから蒸気を除去するために、前記吸引チューブを通じて真空を適用するステップとを含む蛍光強度均等化の方法が提供される。

本発明は、上記の及びその他の目的並びに利点と一緒に、図面に示される本発明の好ましい実施形態についての以下の詳細な記載から最もよく理解され得る。図面において、以下のとおりである。

本発明の乾燥装置の好ましい実施形態の斜視図である。 本発明に関連して用いられるアッセイデバイスの上部正面図である。 乾燥を異なる温度で行う場合の乾燥時間対相対湿度のプロットである。 ３．０ｍｍの距離及び４ｍｍの距離のスポットの高度からせん断するように連続真空誘導気流を調節した場合の、４分での免疫グロブリンスポットＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭのスポットについての変動係数（％ｃｖ）を示す棒グラフである。

図１に示すように、乾燥装置１は、フレーム２を有する。フレーム２は、フレームをＸＹＺ平面に沿って３次元で移動させるアクチュエータ（図示せず）と連結することができる。アクチュエータは、変位手段として機能し、当技術分野において既知の多数のアクチュエータの１つであり得る。好ましいアクチュエータは、ＥＬｘ４０５ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｗａｓｈｅｒ、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．である。

乾燥装置は、フレーム２に取り付けられたハウジング４を含む。複数の吸引チューブ１０は、ハウジング内に位置する。代替の実施形態において、乾燥機はわずか１つのチューブを有することができる。それぞれのチューブ１０は、長さを画定し、第１の開口端部６と第２の開口端部８との間の長さに沿う長手方向の穴部１２を画定する。図３に示すように、長手方向の穴部１２は、第１の開口端部６が、第２の開口端部８の直径よりも大きい直径を有するように先細になるのが好ましい。

吸引チューブ１０の長さは様々であってよい。好ましい実施形態において、長さは、３．５度の円錐角ピッチに基づく約１．７の開口直径縦横比とともに導かれる約１８の縦横比を維持するのに十分である。基板の近傍の第１の開口端部６での吸引チューブ１０の壁の厚みは、好ましくは約４００μｍである。第１の開口端部６の直径は、約５ｍｍである。第２の開口端部６は、約２ｍｍの直径であり、全ての吸引チューブ１０を通じて真空ヘッドへの一定の気流を可能にする好ましい直径は、除去可能な流体充填量を含有するアッセイデバイスの周囲の長さと壁の高さの比により画定される基板表面領域全体に流れの通路を設定することにより調節される。

乾燥装置１は、それぞれの吸引チューブの第２の開口端部８へ真空を適用するための手段を含む。真空を適用するための手段は、当技術分野において既知の種々のそのような手段のいずれであってもよい。好ましい実施形態において、真空手段は、真空ポンプ、ＭＥ ４Ｃ ＮＴ Ｖａｒｉｏ、ＶａｃｕｕＢｒａｎｄ、Ｕ．Ｓ．Ａ．である。

好ましい実施形態の乾燥機装置１は、好ましくは、アッセイデバイスを乾燥するために用いられ、特に、図４に示すアッセイデバイス５０のようなタイプのものである。アッセイデバイス５０は、複数のウェル５２を有する。それぞれの上記のウェル５０は、交差している壁５４により分けられている。上部構造体をプレート上に有効に設けることにより、単一のウェル又は別々の複数のウェルが形成される。複数のウェルは、複数の物体を同じプレート上で処理することを可能にするという付加的な利点を有する。なぜなら、それぞれのウェルが、例えばマイクロアレイフォーマットにおいてタンパク質スポットの形態でその上にプリントされたアッセイを有し得るからである。

アッセイデバイス上にプリントされたバイオアレイのデータの解析は、分子プローブの固定化アレイと特異的に相互作用する標識された標的分子からの蛍光シグナルの検出に基づく。好ましい実施形態において、分子プローブのアレイは、アッセイデバイス上のタンパク質スポット中にプリントされた固定化された捕捉抗体である。捕捉抗体は、蛍光マーカーと結合した抗原と結合する。分子プローブは、基板上に直接結合していてよい。好ましい実施形態において、３次元バイオアレイ（アレイ化したプローブ）が、エポキシ被覆基板担体によりガラス基板に結合している。

代表的なタンパク質スポットアッセイにおいて、流体試料を、抗原などの特定の分析物（試験される物質）に特異的な蛍光標識抗体などの試薬と混合する。別のタイプの抗体は、タンパク質スポット中の固体支持体上に固定化される。蛍光標識抗体を、試料と混合する。蛍光標識抗体と、試験される物質と、２次抗体との複合体が形成され、マーカーをタンパク質スポットに固定化する。次いで、蛍光マーカーを検出する。存在する抗原の量は、タンパク質スポットから発光される蛍光強度に比例する。本発明の好ましい実施形態は、複数の異なるタンパク質スポット又は異なるタンパク質スポットのアレイを有するアッセイデバイス上で行われる。

本発明は、蛍光マーカーで標識された分析物のスポットへの捕捉が分析物の存在を示す、アッセイスポットから放射される蛍光シグナルのレベルを均等化する方法を提供する。測定される蛍光のレベルを消光させるか又は測定される蛍光シグナルをひずませる因子は、アッセイの結果に逆に影響する。

実施において、本発明は、特にマイクロアレイタンパク質スポットアッセイデバイスからの蒸気の除去の方法を提供する。好ましい実施形態において、この方法は、乾燥装置１により行われ、タンパク質スポットマイクロアレイの洗浄及び処理において代表的に用いられるアッセイデバイスの表面から流体蒸気を除去して、マイクロアレイを構成する３次元タンパク質スポットでの均一状態の水和を有効に誘導することを含む。理論に拘束されないが、我々は、マイクロアレイ構成要素の水和状態がシグナル強度に直接影響し、それにより、特に診断グレードのマイクロアレイシグナルに用いた場合は、バイオアレイデータの定量分析の向上が可能になることを見出した。本発明の方法は、不都合な及び破壊的な効果を誘導することなくタンパク質スポットバイオアレイフォーマットの乾燥を行い、蛍光シグナル消光性成分が、アッセイデータの比較分析の向上を可能にする相対濃度まで低減されることを確実にする。

蒸気の除去は、蒸気で湿り、差別的に水和された基板プラットフォーム及び部分的に乾燥した物体の上の気流を調節することにより促進及び達成される。効果的には、制御された条件下で乾燥機装置１により調節された気流の流れを、蒸気源全体にわたって能動的に移動して蒸気を除去し、真空誘導気流の流れの中に位置する物体の一定状態の水和をもたらす。誘導気流の流れは、同時に、結果として生じる湿った排出気流に含まれる可能性がある混入及び／又は感染性物質を含有し、単離し、取り除く。

蒸気の除去は、ウェル５２の周囲及びその中に存在する全ての流体蒸気を平衡化するために、乾燥装置１により行われる。気流調節に用いられる好ましい真空は、約１０６デカパスカル〜約１０１３２デカパスカルの範囲である。チューブ１０のＸ−Ｙ座標マトリクス空間は、好ましい実施形態において、アッセイデバイス５０に取り付けられたウェル上部構造体のＸ−Ｙ座標マトリクス配置と一致する。両方のＸ−Ｙマトリクスが正確に整列するので、それぞれのウェル５２は、それぞれのウェル５２の中央に挿入された単一の吸引チューブ１０を有し、吸引チューブ１０の第１開口６が、プレート基板表面の上方の予め決定された最適な距離に配置され、この距離は、好ましくは約２０マイクロメートル〜５ミリメートルの範囲である。好ましい設定は、吸引チューブの吸入端部の高さが、タンパク質スポットマイクロアレイの約４ｍｍ上に設定される場合に、最適な気流をもたらす。真空吸収は、全ての残存流体蒸気を除去する。

本発明の方法は、供給源蛍光量における不均一性を無作為化して、アッセイスポットについてのより均一なイルミネーションシグナルの定量をもたらす。変動係数（ｃｖ）を算出するための認められた参照標準物質を用いて測定及び確認されるように、発散性で拡散性の消光源が最小限になり、それぞれのアッセイスポットの近傍の比較できる蛍光シグナル強度をもたらす。

本発明の好ましい実施形態は、洗浄及び処理流体の蒸気並びに分析されるアレイの付近に付着する残存湿気を同時に等しく低減することにより、スポットのスポット内及びスポット間での均一な乾燥を行うためのバイオアレイタンパク質スポット蛍光シグナルの比較定量分析の方法である。蛍光アレイの水和における不均一性は、蛍光シグナル強度の変動に変換され、よって、結果の誤った解釈を導く。

図３は、％ＲＨ（パーセント相対湿度）及び温度（摂氏温度）℃の関数としてプロットした、スポット相対乾燥時間の比較プロットを示す。Ｔ（温度）は、１番上の曲線に相当するＴ＝１９℃から、１番下の曲線に相当するＴ＝３１℃までの範囲である。必要なスポットが自然な蒸発により乾燥するためには、視覚検査により確認すると、周囲残存％ＲＨに到達する時間は、約２時間から約３０時間までの範囲であり得る。

蒸発蒸気相フラックスは、表面領域全体にわたって均一に表面フィルムの厚みを低減する。蒸発プロセスにおいて、液体分子は、表面領域と隣接空気との間で迅速に置き換わり、この空気の層は蒸気で飽和されるようになり、この蒸気は表面から離れて拡散する。スポットの表面にて、蒸気は、空気中の蒸気の拡散率で、定常状態条件まで飽和する。蒸発により引き起こされる熱及び濃度勾配は、表面張力勾配により推進される流れを誘導することができ、スポット内容物に対して破壊的な影響をもたらす。

図４は、３．０ｍｍ（ミリメートル）の距離のスポット高度からせん断するように連続真空誘導気流を調節した場合の、４分以内で許容され得る均一な標準までのアッセイスポットの乾燥を示す。４ｍｍの距離での並行した気流は、ＩｇＡ及びＩｇＧの免疫グロブリンスポットについてさらに５〜６％の低減と、ＩｇＭについてより少ない低減とをもたらすことにより、スポット強度についての蛍光測定変動係数（％ｃｖ）を低減するのにより効果的である。

照射されたときにスポットから発光される混成合計蛍光シグナルは、粒子濃度及びスポットの厚みを原因とするシグナル対ノイズ比を含む、合計の出力シグナルに影響する照光された量における全ての粒子と流体内容物とを含むイルミネーションの量を示す。

本発明の好ましい実施形態から得られる最小限の水和の相対的に均一な状態により、得られる蛍光シグナルの均一性に対する水和状態の影響が確認される。アッセイスポット量中のエミッター分子濃度は、吸収又は消光された数に対する発光する光子の数の比としての正味のシグナル蛍光強度を生じる。蛍光量子収率及び寿命は、蛍光体の濃度、励起波長での吸光係数及び量子収率に依存して、シグナル消光剤として有効に作用するエネルギー喪失を増加又は減少させることにより調節される。混濁イルミネーション量、すなわちアッセイスポットは、照射された蛍光体からのみ蛍光を発光し、ここから、この発光された蛍光はスポットの表面から逃れる。スポット量における弾性散乱事象は、スポットに含まれる非含水微粒子の密度、屈折率及び誘電率の無作為な空間変動により生じる。これらの事象は、スポット間及びスポット内の蛍光定量シグナル強度変動に大きく貢献する。

開示される方法の実施形態により調製されるスポット及びマイクロアレイは、４分以内の乾燥で１０％未満の％ｃｖをもたらす。この新規な方法は、シグナル測定のための一定で正確な定量蛍光シグナルをもたらすので、加速された乾燥速度を用いて、マイクロアレイアッセイ性能を著しく改善する。

本発明の方法は、好ましくは、マルチアレイマトリクスにおける全てのアッセイスポットを単一の制限容量若しくはウェルにおいて、又はマルチアレイマトリクスにおける全てのアッセイスポットを複数の制限容量若しくはウェルにおいて同時に乾燥するために行われる。

好ましくは、十分な蒸気を除去して、約１０分以内、最も好ましくは約５分以内でアッセイスポットの比較相対乾燥度を得る。

本発明を、図面に示す本発明の実施形態の詳細を参照して記載してきたが、これらの詳細は、添付の特許請求の範囲で請求される本発明の範囲を限定することを意図しない。

Claims (19)

1. 蛍光マーカーと結合した分析物と結合する分子プローブの少なくとも１つの固定化アレイを有するアッセイデバイスを準備するステップと、
   第１の開口端部と第２の開口端部とを有する吸引チューブを備える乾燥装置を準備するステップであって、吸引チューブの第２の端部が、前記チューブを通じて真空を適用するための真空源に接続されているステップと、
   吸引チューブの前記第１の端部を、分子プローブの前記少なくとも１つの固定化アレイの近傍に配置するステップと、
   分子プローブの前記少なくとも１つの固定化アレイから蒸気を除去するために、前記吸引チューブを通じて真空を適用するステップと
   を含む蛍光強度均等化の方法。
2. 吸引チューブの第１の端部が、分子プローブの少なくとも１つの固定化アレイから約２５マイクロメートル〜５ミリメートルに配置される、請求項１に記載の方法。
3. 吸引チューブの第１の端部が、分子プローブの少なくとも１つの固定化アレイから約３ｍｍに配置される、請求項２に記載の好ましい方法。
4. 吸引チューブの第１の端部が、分子プローブの少なくとも１つの固定化アレイから約４ｍｍに配置される、請求項１に記載の好ましい方法。
5. アッセイデバイスが、分子プローブの複数の固定化アレイを含む、請求項１に記載の方法。
6. 分子プローブの前記アレイのそれぞれが、タンパク質スポット中に位置する、請求項５に記載の好ましい方法。
7. 分子プローブのそれぞれのアレイが、前記アッセイデバイスに形成された平坦な表面上に位置する、請求項６に記載の方法。
8. 分子プローブのそれぞれのアレイが、前記アッセイデバイスに形成されたウェル中に位置する、請求項７に記載の方法。
9. 分子プローブが、前記アッセイデバイスに結合した抗原である、請求項１に記載の方法。
10. 分子プローブが、前記アッセイデバイスに結合した捕捉抗体である、請求項１に記載の方法。
11. 分子プローブが、前記アッセイデバイスに結合したタンパク質である、請求項１に記載の方法。
12. タンパク質スポットが、アッセイデバイスに、エポキシ被覆基板担体により結合している、請求項６に記載の方法。
13. アッセイデバイスが、ガラス製の支持体を含み、捕捉分析物が、アッセイデバイスに、エポキシ被覆基板担体により結合している、請求項１２に記載の方法。
14. 前記吸引チューブを通じて真空を適用するステップが、分子プローブの前記少なくとも１つの固定化アレイの上に誘導される気流の流れを生じて、残存流体及び蒸気を除去する、請求項１３に記載の方法。
15. 適用される真空が、連続気流の流れを作り出す、請求項１４に記載の方法。
16. 気流の流れが、１０^−３トル（Ｔｏｒｒ）〜１気圧の圧力で適用される真空により誘導される、請求項１５に記載の方法。
17. 十分な蒸気を除去して、約１０分以内でアッセイスポットの比較相対乾燥度を得る、請求項１６に記載の方法。
18. 十分な蒸気を除去して、約３分以内でアッセイスポットの比較相対乾燥度を得る、請求項１７に記載の方法。
19. 十分な蒸気を除去して、前処理したせん断気流を用いて約１分以内で達成される、アッセイスポットの相対乾燥度の効果的なレベルを得る、請求項１８に記載の方法。

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