CN102171567A - 阵列荧光均衡方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荧光强度均衡方法。所述方法包括:提供检测装置,所述检测装置具有至少一个结合到联以荧光标记物的分析物的分子探针固定阵列;提供干燥设备,所述干燥设备包括具有开口的第一及第二端的吸引管,所述吸引管的第二端连接到通过所述管提供真空的真空源;将所述吸引管的第一端设置到邻近所述至少一个分子探针固定阵列;以及通过所述吸引管提供真空,以将蒸汽从所述至少一个分子探针固定阵列清除。本发明申请通过减少信号淬灭因子提供了更可靠的荧光信号强度读取。
Description
技术领域
本发明涉及检测点样和阵列荧光强度均衡方法,其通过在对检测点样阵列组件进行可控干燥期间诱导流体蒸汽的均匀清除来实现。
背景技术
荧光光谱的优点在于测量和分析与荧光量子产率和/或荧光发光体的寿命有关的多种特性。发射的荧光强度是与发射体浓度、激发波长处的吸光系数(吸收率)和发射波长处的量子产率有关的方程。然而,时间分辨和稳态荧光淬灭是荧光强度测量存在显著差异的原因。强度波动的差异和不均匀性与荧光淬灭浓度成比例,其部分是由扩散中的瞬时效应以及荧光团与淬光剂相互作用的特性引起的。时间分辨频域和稳态数据的分析已经显示淬灭速率与发射体与荧光团-淬光剂的距离呈指数关系,这反映了电子迁移和交换的相互作用是很可能的淬灭机理。
用于改进由检测点样和微阵列发射的定量荧光信号的检测技术已包含在通过改进检测硬件和修正荧光信号处理来改进检测方法中;举例说明,在由Tamura等人于2004年提交、标题为“Methods for displaying micro-array information”、6,690,461号的美国专利中,使用了累积强度的计算机图像数据处理;;在由Caren等人于2004年提交、标题为“Polynucleotide array fabrication”、200420138号的美国专利中,检测干燥后的点样以示出由干燥引起的制造误差的结果;在Anderson等人提交的、标题为“Quality control and normalization methods for protein micro-arrays”、2006/0063197A1号的美国专利中,通过比较基于染色校正的缓冲和印刷点样的量/浓度来比较化学发光反应;在由Montagu和Webb提交的、标题为“Reading of fluorescent arrays”、2006127946号的美国专利中,比较阵列本身的强度校准特性;在由Mohammed和Dzidic提交的、标题为“Microarray quality control”、2006058031号的国际申请中,通过检测二维荧光交叉点样样品对印刷点样进行成像,然后与印刷参考图像进行比较。
起源于定量荧光检测的现有技术,基于信号能正确反映发射体浓度的假设,侧重于所述信号的最优化精确测量和信号分析前的修正。这种方法在由Ge等人于2007年提交的、标题为“A calibration slide for fluorescence detection instruments and process of preparation”、1774292号的欧洲专利申请中进行了阐述,该发明涉及荧光检测仪器的日常校准,包括微阵列扫描仪,荧光显微镜,荧光光谱和荧光多孔板读数校准。
现有的用于改进点样和微阵列之间观测到的荧光强度定量的变异系数(%c.v.)的技术,主要关注于通过改进荧光信号和图像处理来获得信号强度读数的改进。当使用普通来源的流体印刷时,需要一种方法来改善和设定具有相同成分的点样之间的荧光信号强度的定量均衡对比,并在类似的成分浓度下提供均匀的信号能级。
因此需要这样一种方法,其对通过微阵列和点样进行控制下的干燥来诱导水合作用的均一态,以使流体的荧光信号淬灭效应和点样成分(例如微粒)的空间分布最小化,继而通过将信号淬灭流体蒸汽从潮湿阵列和点样内部及其附近以受控和被包含的形式清除,以能够进行相当的定量信号分析。期望提供这样一种流体清除方法,其使用一种新颖的、简单的实施方法清除蒸汽。
还需要提供对检测点样信号的均衡,其将淬灭组分减少到一个能够允许使用短的干燥时间提高生物阵列数据的对比分析的相对浓度。
需要提供这样一种方法:使源荧光量中的任何不均匀性随机化,产生用于检测点样的更均匀照明信号定量。
还需要提供这样一种方法:使各自相异且扩散的淬灭源最少化,提供接近每个检测点样的相当的荧光信号强度以计算差异系数(cv),使用认可的参考标准来测量和确认该强度。
发明内容
本发明是一种荧光强度均衡方法,优选通过将淬灭组分减少到能够提高检测数据对比分析的相对浓度。所述方法包括干燥检测装置,以清除结合到联以荧光标记物的分析物的至少一个分子探针固定阵列附近的蒸汽。
根据本发明的一个方面,提供了一种荧光强度均衡的方法,包括以下步骤:提供检测装置,所述检测装置具有至少一个结合到联以荧光标记物的分析物的分子探针固定阵列;提供干燥设备,所述干燥设备包括具有开口的第一及第二端的吸引管,所述吸引管的第二端连接到真空源,以通过所述管提供真空;将所述吸引管的第一端设置到所述至少一个分子探针固定阵列附近;以及通过所述吸引管提供真空,所述真空用于将蒸汽从所述至少一个分子探针固定阵列清除。
附图说明
通过下面对附图中示出的本发明优选实施方式的具体描述,本发明与上述和其他目的及优点将被很好地理解,其中:
图1为本发明干燥设备的优选实施方式的透视图;
图2为与本发明结合使用的检测装置的顶部立视图;
图3为在不同温度下进行干燥时,干燥时间与相对湿度的对比曲线图;
图4为示出了在将由真空诱导的连续气流调节到超过3.0mm距离和4.0mm距离的点样高度时,在4分钟内IgA,IgG及IgM的免疫球蛋白点的点样差异系数(%cv)的柱状图。
具体实施方式
如图1所示,干燥设备1具有框架2。框架2可连接到使框架沿XYZ平面的三个维度移动的致动器(未显示)。致动器作为移动装置可以是本领域中公知的多种致动器中的一种。优选致动器为美国伯腾(BioTek)仪器有限公司的Elx405型微型板清洗机。
干燥设备包括附接到框架2的壳4。多个吸引管10设置在壳内。在可替换的实施方式中,干燥机可具有少到只有1个的管。每个管10限定一长度,并且沿第一开口端6和第二开口端8之间的长度限定一纵向孔12。如图3所示,所述纵向孔12优选为锥形,其中所述第一开口端6具有比所述第二开口端8更大的直径。
吸引管10的长度可以改变。在优选实施方式中,所述长度足以保持约18的高宽比,所述高宽比由基于3.5度倾斜角的约为1.7的开口直径高宽比获得。邻近于基板的第一开口端6处的吸引管10的壁厚优选为约400μm。第一开口端6的直径为约5mm。第二开口端6具有约2mm的直径,其为优选直径,以允许稳定的气流通过所有吸引管10流入到真空头部,所述头部通过设定跨越基板表面区域的流动通路来调整,该表面区域由包含可清除的流体负载检测装置的周长和壁高比所限定。
干燥设备1包括向每个吸引管的第二开口端8提供真空的装置。用于提供真空的装置可以是本领域中公知的各种这类装置中的一种。在优选实施方式中,真空装置是美国VacuuBrand公司的ME 4C NT Vario型真空泵。
优选地,优选实施方式中的干燥设备1用于干燥检测装置,特别是如图4中所示的检测装置50的类型。检测装置50具有多个凹孔52。每个所述凹孔52由交叉的壁54分隔;在板上提供有效的上部构造,从而形成单个的凹孔或者分离的多个凹孔。由于每个凹陷部分可具有以例如蛋白质点微阵列格式形式印制在板上的试样,因此多个凹陷部分具有容许在同一板上处理多个物体的额外优势。
基于对由特别地与分子探针固定阵列发生反应的被标记目标分子处获取的荧光信号的检测,分析来自被印刷在检测装置上的微阵列的数据。在优选实施方式中,分子探针阵列为固定到印刷于检测装置上蛋白质点中的捕获抗体。所述捕获抗体结合到联以荧光标记物的抗原上。分子探针可直接附接到基板上。在优选实施方式中,三维生物阵列(阵列化的探针)通过涂覆有环氧树脂的基板载体附接到玻璃基板上。
在一个典型的蛋白质点检测中,流体样品与反应物如具有荧光标记的抗体,特指特定的被测物(待测试的物质)如抗原混合。另一类型的抗体固定到蛋白质点中的固体支撑物上。具有荧光标记的抗体与样品混合。所述具有荧光标记的抗体、待测试的物质以及所述第二个抗体之间形成复合物,将所述标记固定到蛋白质点中。然后检测所述荧光标记。存在的抗原的数量与由蛋白质点发射的荧光的强度成比例。在具有多个不同蛋白质点或不同蛋白质点阵列的检测装置上实施本发明的优选实施方式。
本发明提供一种使由检测点样发射的荧光信号的能级均衡的方法,其中,在点样中捕获使用荧光标记标记的分析物表明了分析物的存在。待测量的荧光能级的淬灭或待测量的荧光信号的变形等因素对检测结果有不利的影响。
操作中,本发明提供清除蒸汽的方法,特别是从微阵列蛋白质点样检测装置清除蒸汽的方法。在优选实施方式中,所述方法由干燥设备1来实现,所述方法包括:从典型用于清洗的检测装置的表面清除流动的蒸汽;以及,处理蛋白质点样微阵列,以有效地引导组成所述微阵列的三维蛋白质点样中的水合作用的均一态。不受理论的约束,申请人发现微阵列组分的水合作用状态直接影响信号强度,从而使得生物阵列数据的定量分析能够增强,特别是当其被应用到诊断级的微阵列信号时。本发明的方法在不引起负面和破坏性的影响的情况下干燥蛋白质点生物阵列格式,保证荧光信号淬灭成分降低到一个相对浓度,该浓度能够允许改善对检测数据的比较性分析。
通过调节进入蒸汽上方的气流、区别地水合化基片平台以及部分地干燥物质来激活并完成蒸汽的清除。事实上,在受控条件下被调制的气流主动地移动跨越蒸汽源,以清除蒸汽,使得位于由真空诱导的空气流内的物质的干燥处于稳定状态。被诱导的空气流同时包含、隔离并消毒生成的潮湿废气流中携带的可能受污染和/或有传染性的材料。
通过干燥设备1实施蒸汽清除,以平衡凹孔52周围或其内存在的任何流体蒸汽。应用于气流调制的真空优选位于约106十帕(decaPascal)到约10132十帕的范围内。在优选实施方式中,管10的X-Y坐标矩阵间距,与附接到试验装置50的凹孔上层结构的X-Y坐标矩阵位置相一致。由于两个X-Y矩阵都提供准确的校准,每个凹孔52都具有一个插在每个凹孔52中心处的单独的吸引管10,吸引管10的第一开口6以预设的最佳距离设置于板状基板表面的上方,该最佳距离优选为在约20微米到5毫米的范围内。当将吸引管进口端在蛋白质点样微阵列上方的高度设置为4mm时,所述优选设定提供最佳气流。真空抽吸方法清除任何残留的流体蒸汽。
本发明的方法使源荧光量中的任何不均匀性随机化,其结果是用于检测点样的更均匀照明信号的定量。使相异且扩散的淬灭源最少化,提供接近每个检测点样的相当的荧光信号强度,以计算差异系数(cv),使用认可的参考标准来测量和确认该强度。
本发明的优选实施方式为用于对生物阵列蛋白质点样荧光信号进行比较定量分析的方法,通过同时发生的、等降的对流体蒸汽以及附着到待分析阵列附近的残余水分的清洗和处理,产生点样内以及点样中的中间点样的均匀干燥。荧光阵列水合作用中的任何不均匀都将导致荧光信号强度的差异,由此导致对结果的错误解释。
图3示出了点样相对于干燥时间的比较性曲线图,该图以%RH(相对湿度百分比)和温度℃(摄氏度)的函数绘制。T(温度)范围为从与曲线的最高点相关的T=19℃到与曲线的最低点相关的T=31℃。为了使必要的点样通过自然蒸发干燥(通过视觉检查确定),到达环境残余相对湿度百分比(%RH)的时间范围可以为从约2小时到约30个小时。
蒸发的水蒸气的相流量均匀地减少了表面区域上方表面膜的厚度。蒸发过程中,液体分子在表面区域和相邻空气之间迅速交换,以使空气层充满蒸汽,并且所述蒸汽从表面散开。在点样表面,使蒸汽在空气中扩散的同时饱和达到稳态。由蒸发引起的热梯度和浓度梯度可诱导由表面张力梯度驱动的气流,导致对点样组分的破坏性影响。
图4示出了当将由真空诱导的连续气流调整到超过点样的高度3.0mm的距离时,在4分钟内将检测点样干燥到可接受的均衡标准。距离4.0mm的并列气流对减少点样强度的荧光测量差异系数(%cv)更有效,其在IgA和IgG的免疫球蛋白上产生进一步的5-6%的(差异系数)的减少,对于IgM减少得更多。
由被辐射的点样发射的总的复合荧光信号代表发光量,包括发光量内的所有微粒和流体内容物,其影响整体输出信号,包括因微粒浓度和点样厚度的信噪比。
本发明优选实施方式产生的最小水合作用的相对均匀状态,确定了水合状态对所获得的荧光信号的均匀度的影响。具有检测点样量的发光体分子的浓度产生净信号荧光强度,其为发射的光子数量与吸收或淬灭的数量的比值。通过增加或减少能耗来调整荧光量子产率和寿命,基于荧光团的浓度、激发波长下的吸收系数以及量子产率,有效地充当淬灭剂。混浊的发光量,即:试验点样,仅由发光的荧光团发出荧光,并且从该处,荧光从点样的表面离开。包含在点样中的不含水的微粒的密度、折射率和介电常数的随机空间差异使点样量中产生了弹性散射现象。这些现象显著促进了内部和中间点样荧光定量信号的强度差异。
在4分钟的干燥时间内,所公开的方法的实施方式中制备的点样和微阵列的%cv’s的值少于10%。这种新颖的方法通过提高干燥速率显著提高了微阵列检测性能,其产生了用于信号检测的一致的、准确的定量荧光信号。
优选地,实施本发明的方法以同时干燥所有在单个限制空间或凹孔中的多阵列矩阵中的所有检测点样或者在多区域空间或凹孔中的多阵列矩阵中的所有检测点样。
优选地,在约10分钟内,更优选地,在5分钟内清除足够的蒸汽,以获得检测点样的相当的相对干燥。
虽然参照附图中示出的本发明的实施方式的具体细节描述了本发明,但是这些细节并不旨在限制所附权利要求书中声明的本发明保护范围。
Claims (19)
1.一种荧光强度均衡方法,包括下述步骤:
提供检测装置,所述检测装置具有至少一个结合到联以荧光标记物的分析物的分子探针固定阵列;
提供干燥设备,所述干燥设备包括具有开口的第一及第二端的吸引管,所述吸引管的第二端连接到通过所述管提供真空的真空源;
将所述吸引管的第一端设置到邻近所述至少一个分子探针固定阵列;以及
通过所述吸引管提供真空,以将蒸汽从所述至少一个分子探针固定阵列清除。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述吸引管的第一端被设置在距离所述至少一个分子探针固定阵列约25微米到5毫米。
3.如权利要求2所述的优选方法,其中所述吸引管的第一端距离所述至少一个分子探针固定阵列约3mm。
4.如权利要求1所述的优选方法,其中所述吸引管的第一端被设置在距离所述至少一个分子探针固定阵列约4mm。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述检测装置包括多个分子探针固定阵列。
6.如权利要求5所述的优选方法,其中每一所述分子探针固定阵列位于蛋白质点中。
7.如权利要求6所述的方法,其中每一所述分子探针阵列位于形成在所述检测装置上的平面上。
8.如权利要求7所述的方法,其中每一所述分子探针阵列位于形成在所述检测装置上的凹孔中。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述分子探针为结合到所述检测装置上的抗原。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述分子探针为结合到所述检测装置的捕获抗体。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述分子探针为结合到所述检测装置的蛋白质。
12.如权利要求6所述的方法,其中所述蛋白质点通过涂覆有环氧树脂的基板载体附着到所述检测装置上。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述检测装置包括由玻璃制成的支撑板,捕获分析物通过涂覆有环氧树脂的基板载体附着到所述检测装置。
14.如权利要求13所述的方法,其中所述通过所述吸引管提供真空的步骤在所述至少一个分子探针固定阵列上产生诱导的空气流,以清除剩余的液体和蒸汽。
15.如权利要求14所述的方法,其中所述提供的真空产生连续的空气流。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述空气流由提供在10-3托和1个大气压之间的压力的真空所诱导。
17.如权利要求16所述的方法,其中清除足够的蒸汽以在约十分钟内获得检测点样相当的相对干度。
18.如权利要求17所述的方法,其中清除足够的蒸汽以在约三分钟内获得检测点样相当的相对干度。
19.如权利要求18所述的方法,其中清除足够的蒸汽以获得检测点样的有效水平的相对干度是通过预处理的剪切气流在约1分钟内获得的。
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