JP2012254098A - 調節可能な融合プロモーター - Google Patents
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- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
Abstract
【解決手段】本発明は、細胞中の短いRNA分子、特に、RNA阻害(RNAi)、miRNA媒介発現調節に関与し得るdsRNA(siRNA、shRNAなど)およびmiRNAまたはRNAアプタマー(例えば、リボスイッチ)の発現をターゲティングおよび/または調節するために使用することができる遺伝子構築物に関する。
【選択図】なし
Description
本出願は、以前に出願された仮出願である米国特許出願第60/722,568号(2005年10月1日出願)の優先権を主張し、この米国出願の内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
本発明は、コード配列の転写をターゲティングおよび/または調節するため、特に、RNA干渉(RNAi)、ミクロRNA(miRNA)、アプタマー、短い干渉RNA(siRNA)、および/または短いヘアピンRNA(shRNA)のRNA配列を発現するためのRNAポリメラーゼプロモーターに関する。
以下の考察は、読み手の理解を補助することのみを目的として提供し、考察した情報または引用した文献のいずれも本発明に対する先行技術を構成すると認めない。
本発明は、少なくとも一部が、PolIIIプロモーターの基本的領域およびPolIIプロモーターの調節領域を有するプロモーターを含むように生成された構築物を使用して、細胞中の短いRNA分子の発現をターゲティングおよび/または調節することができるという発見に基づく。かかる構築物は、PolIIIプロモーターおよびPolIIプロモーターの両機能のいくつかを利用する(すなわち、特定の長さを有するRNAを得ることおよび特定の発現プロフィールを有するRNAを得ること)。いくつかの現在利用可能な構築物には、特異的ターゲティングおよび/または調節が可能ではない全PolIIIプロモーター(U6プロモーターなど)が含まれる。本出願は、PolII発現プロフィールに類似の特定の発現プロフィールを有する構築物を特色とする。
構築物は、組織特異的調節エレメントを含む。標的遺伝子は、組織特異的調節エレメントに対応する組織の細胞中で優先的に阻害される。構築物は、腫瘍特異的調節エレメントを含む。標的遺伝子は、腫瘍特異的調節エレメントに対応する腫瘍の細胞中で優先的に阻害される。放射線に応答して阻害が誘導される。有効量の非ペプチドおよび非ヌクレオチド化学種(例えば、エストロゲン)の存在に応答して阻害が誘導される。
I.複製欠損ベクター:ウイルス非構造遺伝子(nsP1〜4)および対象の外来遺伝子を含むRNA分子をウイルス構造遺伝子含有ヘルパーベクターによってアルファウイルス粒子にパッケージングする。生成された組換えアルファウイルス粒子は、宿主細胞に感染することができるが、ウイルス構造遺伝子が提供されないので、さらなるウイルス複製が起こらない。したがって、得られた導入遺伝子発現は、一過性である。
II.複製能力のあるベクター:上記の自殺ベクターと対照的に、これらのベクターは、全長アルファウイルスゲノムに付加した第2サブゲノムプロモーターおよび対象の外来遺伝子を含む。複製能力のある粒子の宿主細胞への感染により、明らかにウイルスが複製する。
III.層状DNAベクター:RNAポリメラーゼII発現カセットを導入して、自己複製RNA(レプリコン)ベクターの転写を駆動し、それにより、トランスフェクションおよび発現研究のためのプラスミドDNA(Berglundら、1996,Dubenskyら、1996)およびパルボウイルスベクターを直接使用できる。
本発明は例えば、以下の項目を提供する:
(項目1)
PolIII/PolII融合プロモーターを含む核酸構築物であって、
RNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域、および
前記基本プロモーター領域に作動可能に連結された、PolIIプロモーター由来のシス活性調節領域
を含み、前記シス活性調節領域が前記構築物由来の発現の特異的調節を提供する、核酸構築物。
(項目2)
前記シス活性調節領域が細胞特異的調節を提供する、項目1に記載の構築物。
(項目3)
前記シス活性調節領域が組織特異的調節を提供する、項目1に記載の構築物。
(項目4)
前記シス活性調節領域が細胞周期特異的調節を提供する、項目1に記載の構築物。
(項目5)
前記シス活性調節領域がインビボで腫瘍特異的調節を提供する、項目1に記載の構築物。
(項目6)
前記シス活性調節領域がインビボで放射線誘導発現を提供する、項目1に記載の構築物。
(項目7)
前記シス活性調節領域がインビボでエストロゲン誘導発現を提供する、項目1に記載の構築物。
(項目8)
前記構築物が、前記融合プロモーターに作動可能に連結されたshRNAをコードする配列をさらに含む、項目1に記載の構築物。
(項目9)
前記構築物が、前記融合プロモーターに作動可能に連結されたsiRNAの2つの鎖をコードする配列をさらに含む、項目1に記載の構築物。
(項目10)
前記基本プロモーター領域がPolIIIプロモーターに由来する、項目1に記載の構築物。
(項目11)
前記PolIII基本プロモーターがU6基本プロモーターである、項目10に記載の構築物。
(項目12)
前記PolIII基本プロモーターがH1基本プロモーターである、項目10に記載の構築物。
(項目13)
前記PolIII基本プロモーターがtRNA基本プロモーターである、項目10に記載の構築物。
(項目14)
前記PolIII基本プロモーターが変異PolII基本プロモーターであり、前記変異PolII基本プロモーターが、PolIIの代わりにPolIIIに優先的に結合する、項目10に記載の構築物。
(項目15)
前記PolIIシス活性調節領域が、CMV初期中間調節領域を含む、項目1に記載の構築物。
(項目16)
前記PolIIシス活性調節領域が、完全なPolII調節領域から基本プロモーターを欠いたものを含む、項目1に記載の構築物。
(項目17)
疾患関連遺伝子のmRNAをターゲティングするRNAi作用因子をコードする配列をさらに含む、項目1に記載の構築物。
(項目18)
PolIII/PolII融合プロモーターを含むベクターであって、
RNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域、および
前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域
を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を可能にするベクター。
(項目19)
前記融合プロモーターに作動可能に連結されたRNAi作用因子をコードする領域をさらに含む、項目18に記載のベクター。
(項目20)
前記RNAi作用因子がsiRNAである、項目19に記載のベクター。
(項目21)
前記RNAi作用因子がshRNAである、項目19に記載のベクター。
(項目22)
前記ベクターがプラスミドである、項目18に記載のベクター。
(項目23)
前記ベクターがウイルスベースのベクターである、項目18に記載のベクター。
(項目24)
前記ベクターが複製欠損性を示す、項目18に記載のベクター。
(項目25)
前記ベクターが複製能力を示す、項目18に記載のベクター。
(項目26)
コード配列に作動可能に連結されたPolIII/PolII融合プロモーターを含む細胞であって、前記融合プロモーターが、
RNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域、および
前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域
を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を可能にする細胞。
(項目27)
前記コード配列がRNAi作用因子をコードする、項目26に記載の細胞。
(項目28)
前記RNAi作用因子がsiRNAである、項目27に記載の細胞。
(項目29)
前記RNAi作用因子がshRNAである、項目27に記載の細胞。
(項目30)
前記融合プロモーターおよび前記RNAi作用因子が1つのベクター中に存在する、項目27に記載の細胞。
(項目31)
前記ベクターがプラスミドである、項目30に記載の細胞。
(項目32)
前記ベクターがウイルスベクターである、項目30に記載の細胞。
(項目33)
前記細胞が細胞培養物中に存在する、項目26に記載の細胞。
(項目34)
前記細胞が動物細胞である、項目33に記載の細胞。
(項目35)
前記動物細胞がヒト細胞である、項目33に記載の細胞。
(項目36)
前記細胞が昆虫細胞である、項目33に記載の細胞。
(項目37)
前記細胞が植物細胞である、項目33に記載の細胞。
(項目38)
前記細胞が動物中に存在する、項目26に記載の細胞。
(項目39)
前記動物がヒトである、項目38に記載の細胞。
(項目40)
前記動物がウシである、項目38に記載の細胞。
(項目41)
前記動物がブタである、項目38に記載の細胞。
(項目42)
前記動物がヒツジである、項目38に記載の細胞。
(項目43)
前記動物がネコである、項目38に記載の細胞。
(項目44)
前記動物がイヌである、項目38に記載の細胞。
(項目45)
前記動物がトリである、項目38に記載の細胞。
(項目46)
前記細胞が植物中に存在する、項目38に記載の細胞。
(項目47)
前記細胞が真菌中に存在する、項目38に記載の細胞。
(項目48)
コード配列に作動可能に連結されたPolIII/PolII融合プロモーターを含む遺伝子構築物を含む複数の細胞を含む非ヒトトランスジェニック生物であって、前記PolIII/PolII融合プロモーターが、
RNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域、および
前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域
を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を可能にする非ヒトトランスジェニック生物。
(項目49)
前記コード配列がRNAi作用因子をコードする、項目48に記載の生物。
(項目50)
前記生物が動物である、項目48に記載の生物。
(項目51)
前記生物が植物である、項目48に記載の生物。
(項目52)
項目1〜項目17のいずれか1項に記載の核酸構築物、および
使用説明書
を含むキット。
(項目53)
前記核酸構築物が単回使用形態で包装されている、項目52に記載のキット。
(項目54)
前記核酸構築物がベクター中に存在する、項目52に記載のキット。
(項目55)
前記核酸構築物が、前記PolIII/PolII融合プロモーターに作動可能に連結されたコード配列をさらに含む、項目52に記載のキット。
(項目56)
項目1〜項目17のいずれか1項に記載の核酸構築物であって、前記核酸構築物が、前記融合プロモーターに作動可能に連結されたshRNAまたはsiRNA配列をさらに含む核酸構築物、および
薬学的に許容可能な担体または賦形剤
を含む薬学的組成物。
(項目57)
前記組成物を注射用組成物として処方する、項目56に記載の薬学的組成物。
(項目58)
前記組成物を局所投与のために処方する、項目56に記載の薬学的組成物。
(項目59)
前記組成物をリポソーム組成物として処方する、項目56に記載の薬学的組成物。
(項目60)
前記組成物がウイルスベクターを含む、項目56に記載の薬学的組成物。
(項目61)
遺伝子構築物の作製方法であって、
RNAi作用因子をコードする核酸配列をPolIII/PolII融合プロモーターに作動可能に連結させる工程であって、前記プロモーターが、前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域に作動可能に連結されたPolIII基本プロモーターを含む工程
を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を可能にする、方法。
(項目62)
前記融合プロモーターが、RNAi作用因子をコードする前記核酸の細胞特異的発現を提供する、項目61に記載の方法。
(項目63)
前記RNAi作用因子がshRNAである、項目61に記載の方法。
(項目64)
前記RNAi作用因子がsiRNAである、項目61に記載の方法。
(項目65)
細胞中にRNAi作用因子を発現する方法であって、
細胞を発現条件下に維持する工程であって、前記細胞が、RNA作用因子コード配列に作動可能に連結されたPolIII/PolII融合プロモーターを含む遺伝子構築物を含み、前記PolIII/PolII融合プロモーターが、
RNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域、および
前記基本プロモーター領域に作動可能に連結された、PolIIプロモーター由来のシス活性調節領域
を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を提供する方法。
(項目66)
前記RNAi作用因子がshRNAである、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記RNAi作用因子がsiRNAである、項目65に記載の方法。
(項目68)
細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、
前記細胞を、遺伝子構築物を含むベクターでトランスフェクトする工程であって、前記構築物が、前記標的遺伝子にターゲティングされるRNAi作用因子をコードする核酸配列に作動可能に連結されたPolIII/PolII融合プロモーターを含み、前記融合プロモーターが、
RNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域、および前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を提供する工程、および
前記細胞を発現条件下で維持する工程
を含む方法。
(項目69)
前記細胞が生物中に存在する、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記構築物が組織特異的調節エレメントを含み、前記標的遺伝子を前記組織特異的調節エレメントに対応する組織の細胞中で優先的に阻害する、項目68に記載の方法。
(項目71)
前記構築物が腫瘍特異的調節エレメントを含み、前記標的遺伝子を前記組織特異的調節エレメントに対応する腫瘍の細胞中で優先的に阻害する、項目68に記載の方法。
(項目72)
前記阻害を放射線に応答して誘導する、項目68に記載の方法。
(項目73)
前記阻害を、有効量の非ペプチドおよび非ヌクレオチド化学種の存在に応答して誘導する、項目68に記載の方法。
(項目74)
前記化学種がエストロゲンである、項目73に記載の方法。
(項目75)
遺伝子機能を分析する方法であって、
細胞中の遺伝子発現を阻害する工程であって、前記阻害がRNAi作用因子をコードする核酸配列に作動可能に連結されたPolIII/PolII融合プロモーターを含む遺伝子構築物由来のRNAi作用因子の発現に起因し、前記融合プロモーターがRNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域および前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を可能にする工程、および
前記阻害後に前記細胞における生物学的変化を決定する工程であって、前記生物学的変化が前記遺伝子の機能を示す工程
を含む方法。
(項目76)
前記決定が、少なくとも1つの生物学的特徴を前記細胞の発現が阻害されないコントロール細胞と比較する工程を含む、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記細胞を、前記遺伝子構築物を含むベクターでトランスフェクトする工程をさらに含む、項目75に記載の方法。
(項目78)
前記ベクターがウイルスベクターである、項目77に記載の方法。
(項目79)
前記ベクターがプラスミドである、項目77に記載の方法。
(項目80)
標的を治療標的として実証する方法であって、
細胞中の推定治療標的遺伝子の発現を阻害する工程であって、前記阻害がRNAi作用因子をコードする核酸配列に作動可能に連結されたPolIII/PolII融合プロモーターを含む遺伝子構築物由来のRNAi作用因子の発現に起因し、前記融合プロモーターがRNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域および前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を可能にする工程、および
前記阻害後の前記細胞における生物学的変化が治療効果と対応するかどうかを決定する工程であって、前記生物学的変化の前記治療効果との対応は前記遺伝子が治療標的遺伝子であることを示す工程
を含む方法。
(項目81)
小分子試験化合物の生物学的効果の正のコントロールを得る方法であって、
第1細胞を試験化合物と接触させる工程と、
RNAi作用因子をコードする配列に作動可能に連結された、発現の特異的調節を提供するPolIII/PolII融合プロモーターを含む遺伝子構築物由来のRNAi作用因子の発現を使用して比較細胞中の標的遺伝子を阻害する工程であって、前記融合プロモーターがRNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域および前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を可能にする工程、および
前記第1細胞中の前記試験化合物の効果を、前記比較細胞中の前記標的遺伝子の阻害効果と比較する工程
を含む方法。
(項目82)
前記試験化合物を、前記標的遺伝子に対して活性であるように予め選択する、項目81に記載の方法。
(項目83)
前記比較工程は、前記試験化合物が前記阻害効果に付加的な効果を有するかどうかを決定する工程を含む、項目81に記載の方法。
(項目84)
標的遺伝子の阻害が有益な効果を提供する疾患または病態を治療する方法であって、
RNAi作用因子をコードする核酸配列に作動可能に連結された、発現を特異的に調節するPolIII/PolII融合プロモーターを含む遺伝子構築物を含む薬理学的有効量のベクターを前記疾患または病態を罹患しているか罹患リスクのある被験体に投与する工程、
を含み、前記融合プロモーターが、RNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域、および前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を提供する方法。
(項目85)
前記ベクターがプラスミドである、項目84に記載の方法。
(項目86)
前記ベクターがウイルスベクターである、項目84に記載の方法。
(項目87)
前記被験体がヒトである、項目84に記載の方法。
(項目88)
前記被験体が非ヒト動物である、項目84に記載の方法。
(項目89)
前記被験体が植物である、項目84に記載の方法。
(項目90)
前記RNAi作用因子がshRNAである、項目84に記載の方法。
(項目91)
前記RNAi作用因子がsiRNAである、項目84に記載の方法。
(項目92)
標的遺伝子の阻害によって有益な効果を提供する疾患または病態を治療するための、RNAi作用因子をコードする配列に作動可能に連結された、発現の特異的調節を提供するPolIII/PolII融合プロモーターを含む遺伝子構築物を含むベクターの使用であって、前記融合プロモーターが、RNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域、および前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を提供する使用。
(項目93)
前記ベクターがプラスミドである、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記ベクターがウイルスベクターである、項目92に記載の方法。
(項目95)
前記RNAi作用因子がshRNAである、項目92に記載の方法。
(項目96)
前記RNAi作用因子がsiRNAである、項目92に記載の方法。
(項目97)
標的遺伝子の阻害によって有益な効果を提供する疾患または病態の治療薬の調製における、RNAi作用因子をコードする配列に作動可能に連結された、発現の特異的調節を提供するPolIII/PolII融合プロモーターを含む遺伝子構築物を含むベクターの使用であって、前記融合プロモーターが、RNAポリメラーゼIII結合基本プロモーター領域、および前記基本プロモーター領域に作動可能に連結されたPolIIプロモーター由来のシス活性調節領域を含み、前記シス活性調節領域が前記融合プロモーター由来の発現の特異的調節を提供する使用。
(項目98)
前記ベクターがウイルスベクターである、項目97に記載の方法。
(項目99)
前記ベクターがプラスミドである、項目97に記載の方法。
(項目100)
前記RNAi作用因子がshRNAである、項目97に記載の方法。
(項目101)
前記RNAi作用因子がsiRNAである、項目97に記載の方法。
さらなる実施形態は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
I.概要
二本鎖RNA(dsRNA)誘導配列特異的遺伝子スプライシングは、RNA干渉(RNAi)として公知である。広範な疾患(癌および感染症が含まれる)の治療についてのRNAiの莫大な治療的潜在性が認識されつつある(Biら、Curr Gene Ther 2003,3(5):411−417;Brisibeら、Trends Biotechnol 2003,21(7):306−311;Caplen Expert Opin Biol Ther 2003,3(4):575−586;Liebermanら、Trends Mol Med 2003,9(9):397−403;Wangら、World J Gastroenterol 2003,9(8):1657−1661;Wolff & Herweijer Ernst Schering Res Found Workshop 2003(43):41− 59)。さらに、RNAiは、基礎科学者にとって逆遺伝子操作によって遺伝子機能を調査するための強力なツールである(Scherrら、Curr Med Chem 2003,10(3):245−256;Szweykowska−Kulinskaら、Acta Biochim Pol 2003,50(1):217−229;Wimmer Nat Rev Genet 2003,4(3):225−232)。科学および医学の両方におけるRNAiの役割が大きくなり続けるにつれて、短いdsRNA(siRNA)の所望の組織へのターゲティングされた送達がますます重要になるであろう。いくつかの報告では、化学的に合成したsiRNAを、ナノゲルおよびPEG化免疫リポソームのような物理的ターゲティングテクノロジーを使用してターゲティングすることができると示されている。DNAベースのRNAiアプローチは、未修飾dsRNAよりも不安定性が低く、増幅する(すなわち、1つの送達されたDNAプロモーター構築物から多数のdsRNAを発現することができる)という利点が得られる。DNAベースのRNAi構築物のターゲティングのための記載のアプローチには、Lox/CreベースのアプローチおよびナノゲルまたはPEG化免疫リポソームを使用したDNA構築物の物理的ターゲティングが含まれる。しかし、本発明のsiRNAの送達ための簡潔な転写ターゲティング法は、RNAi療法の重要な進展を示す。
II.融合プロモーター
A.PolIII/PolII融合(キメラ)プロモーターの設計および構築
種々の方法を使用して、本発明の融合プロモーターを標準的な技術を使用して産生することができる。融合プロモーターを作製するためのかかるアプローチは、(例えば、常套のクローニング技術を使用して)RNAPolII基本プロモーターをRNAPolIII基本プロモーターに置換することである。得られた構築物は、PolIII基本プロモーターに会合したPolII調節領域由来の調節エレメントを有する。PolIII基本プロモーターに連結されたPolII調節領域由来の1つまたは複数の調節エレメントの逆も行うことができる。いずれにしても、PolIII基本プロモーターおよびPolII調節領域由来の少なくとも1つのさらなる調節エレメントを有するキメラ核酸が得られる。
B.変異プロモーター
TATAボックス領域に対する簡潔な点変異によってプロモーターをRNAポリメラーゼII型プロモーターからRNAポリメラーゼIII型プロモーターに変換することができることが証明されている。このアプローチを使用して、RNAポリメラーゼII型プロモーターのターゲティング特性を保持しながらRNAポリメラーゼII型プロモーターをRNAiプロモーターに変換することができる。例えば、グリア繊維性酸性タンパク質(GFAP)のTATAボックスのATAAからAATATへの変異により、組織選択的発現を有するRNAiプロモーターに変換する。
C.RNAiプロモーターを作製するための調節エレメントのより一般的な混合、定方向変異誘発と調節エレメントの混合との組み合わせ
RNAiプロモーターの作製は、複数の調節エレメント型の混合(コアプロモーターの混合に加えるかコアプロモーターの混合の代わり)または定方向変異誘発と調節エレメントの任意の程度の混合物の組み合わせとの組み合わせ含み得る。さらに、複数のRNAポリメラーゼII型プロモーター型由来の調節エレメントを有する化合物RNAiプロモーターを使用して、RNAi発現のより特異的な制御をもたらすことができる。これには、グリア細胞へのRNAi発現のターゲティングを改良するためのグリア特異的である2つのプロモーターのような類似の発現特性を有する2つのプロモーター由来の調節エレメントの使用または特定の組織中で腫瘍をターゲティングできるキメラプロモーターを作製するための腫瘍特異的RNAiプロモーター由来のエレメントを有する組織特異的RNAiプロモーター由来の調節エレメントの使用が含まれるであろうが、これらに限定されない。特定の調節エレメントの封入または除外を使用して、ターゲティングの程度を制御するかRNAiプロモーターのターゲティングを拡大するか完全に変化させることができる。
D.PolIIIプロモーター
多くの異なるPolIIIプロモーターを、本発明のPolIII/PolII融合プロモーターの構築で使用することができる。プロモーターの周知の例には、U6プロモーター、H1プロモーター、およびtRNAプロモーター(例えば、セレノシステインtRNA遺伝子(TRSP))が含まれる。これらのプロモーターの配列は公知であり、常套の分子生物学的方法によってこれらを操作して、組換え核酸構築物を作製することができる。
E.PolII調節領域エレメント
PolIIIプロモーターと同様に、多くの異なるPolII調節領域およびエレメントが公知であり、より多くが同定されている。かかる領域およびエレメントを使用して、本発明の融合プロモーターを構築することができる。PolIIプロモーターおよびその関連する調節エレメントは、対応する遺伝子について証明された種々の特定の調節に注目すべきである。かかる調節エレメントを、本発明のPolIII/PolII融合プロモーター中に組み込み、それにより、作動可能に連結されたコード配列の融合プロモーター由来の発現の特異的調節を提供することができる。
III.RNAi作用因子および他のRNA分子をコードする核酸
本発明の核酸構築物には、RNAi作用因子またはミクロRNA(miRNA)などの他の短いRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結された融合プロモーターを有する核酸構築物が含まれる。かかるRNAi作用因子には、siRNAおよびshRNA、ならびにRNAi機構によって細胞内でより短い配列にプロセシングされるより長い配列が含まれる。
IV.ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の構築物を含むベクターに関する。発現ベクター(特に、真核細胞中での発現のための発現ベクター)が特に有利である。かかるベクターは、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、または人工染色体(例えば、酵母人工染色体)ベクターであり得る。
V.トランスジェニック動物
本発明はまた、トランスジェニック生物(導入遺伝子を発現する少なくともいくつかの細胞を有する動物である非ヒト動物など)に関する。このような非ヒトトランスジェニック動物を、例えば、選択された障害(変異体または異常な遺伝子の発現、機能獲得型変異体に関連する疾患および障害、および神経疾患および障害など)の有害な症状を改善することができる活性薬剤または化合物(例えば、薬物、医薬品など)を同定するために設計されたスクリーニングアッセイで使用することができる。
A.前核注入
トランスジェニック動物を、卵細胞への本発明の核酸構築物の注入によって産生することができる。種々の発生段階の胚標的細胞を使用して、導入遺伝子を導入する。胚標的細胞の発生段階に応じて、異なる方法を使用する。導入遺伝子の例示的導入方法には、受精卵または接合子の微量注入(Brinster,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:4438−4442)およびウイルス組み込み(Jaenisch R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1976)73:1260−1264;Jahner,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:6927−6931;Van der Putten,ら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:6148−6152)が含まれるが、これらに限定されない。胚操作および微量注入の手順は、例えば、Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986(その内容が本明細書中で参考により援用される))に記載されている。他のトランスジェニック動物の産生のために類似の方法を使用する。
B.胚幹細胞由来のトランスジェニック動物
トランスジェニック動物(例えば、トランスジェニックマウス)の別の作製方法では、組換えDNA分子(例えば、構築物または導入遺伝子)を、胚幹(ES)細胞(例えば、マウス細胞)に導入する。次いで、得られた組換えES細胞を、標準的技術を使用して胚盤胞に微量注入する。
VI.PolIII/PolII融合プロモーターの構築および試験
少なくとも1つのPolII調節領域由来の1つまたは複数のさらなる調節エレメントと共にPolIII転写遺伝子由来の基本プロモーターを使用して、融合プロモーターを構築することができる。さらに、同一または異なるPolIII遺伝子由来のさらなる調節エレメントを、融合プロモーターに組み込むことができる。構築を簡潔にするために、開始部位に対して5’側の調節エレメントを選択して使用することが有利である。
VII.標的遺伝子および標的部位
一般に、機能的RNAi機構を含む細胞中でRNAiを使用して、任意の遺伝子を下方制御することができる。特に、本発明の核酸構築物を使用して、かかる遺伝子を下方調節することができる。多数のかかる遺伝子発現の阻害を、siRNAまたはshRNAのいずれかを使用して記載している。かかる遺伝子のターゲティングはまた、本発明に関連して有用である。
VIII.使用方法
本発明は、例えば、バイオテクノロジー、遺伝子分析、薬物の同定および開発、薬物の同定および開発、及び医学的治療法における種々の異なる適用に適切である。例えば、現在、ヒトならびに他の動物および他の生物における遺伝子機能の分析が多数行われている。したがって、特異的の遺伝子が調整されたトランスジェニック生物または組換え細胞を都合良く得ることができれば、遺伝子機能を分析し、薬物となる化合物を同定および評価することができる。
A.スクリーニング、アッセイ、および治療薬試験
本発明は、例えば、潜在的な薬理学的作用因子を同定および/または分析(例えば、試験化合物ライブラリーからの新規の薬理学的作用因子の同定および/または既知の薬理学的活性を有する化合物の作用および/または副作用の機構の特徴づけ)するためのスクリーニングアッセイで使用するために適用することができる。
B.機能的ゲノミクスおよび/またはプロテオミクス
本発明の細胞および生物の一定の適用には、遺伝子発現プロフィールおよび/またはプロテオームの分析が含まれる。多くの場合、かかる分析は、標的遺伝子のノックアウトまたはノックダウン、遺伝子機能または阻害効果の指標において見られる表現型の変化の決定を含む。あるいは、かかる分析を、1つまたは複数の標的タンパク質の変異体または変異形態に対して行うことができ、この変異体または変異形態を上記の外因性標的核酸によって細胞または生物に再導入する。内因性遺伝子のノックアウトと変異した(例えば、部分的に欠失した)外因性標的の使用によるレスキューとの組み合わせは、ある利点(ターゲティングされたタンパク質の機能的ドメインの同定の補助など)を有する。かかる分析を、複数の細胞型および/または組織および/または生物のために行うことができる。これらの細胞および/または生物を、一般に、(i)標的遺伝子が阻害されていないコントロール細胞またはコントロール生物、(ii)標的遺伝子阻害が行われた細胞または生物、および(iii)標的遺伝子阻害および外因性標的核酸による標的遺伝子補完が行われた細胞または成分から選択する。
C.治療方法
本発明は、(例えば、ある予防的および/または治療的適用で)治療的に有用なRNAi作用因子発現構築物を提供する。例えば、かかる作用因子を、対応する標的遺伝子の望ましくないか異常な発現に関連する疾患または障害の治療における予防薬および/または治療薬として使用することができる。
IX.薬学的組成物
予防的および/または治療的処置のための本発明のRNAi作用因子を含む薬学的組成物のために、作用因子を、投与に適切な薬学的組成物に日常的に組み込む。かかる組成物は、核酸分子を含み、一般に、薬学的に許容可能な担体を含み、さらなる成分を含み得る。薬学的に活性な物質のためのかかる担体の使用は、当該分野で周知である。活性化合物に適合する任意の常套の媒質または作用因子を、本発明の薬学的組成物中で使用することができる。さらなる成分には、例えば、さらなるまたは補足的な活性化合物が含まれ得る。
X.例示的な送達方法および組成物
核酸分子、特に、転写可能な核酸分子に適用可能な多数の送達方法が記載されており、さらなる方法が開発されている。すべてのかかる方法および関連する組成物を、本発明に適用可能である。かかる送達は、典型的には、裸の線状核酸、ウイルスベクター、またはプラスミドベクターを使用する。
実施例1:PolIII/PolII融合プロモーター、関連する構築物、およびベクターの構築
組織特異的RNAiプロモーターを、キメラプロモーターを使用して作製することができるかどうかを試験するために、GFAPとU6プロモーターとの融合物であるプロモーターを作製した。プロモーター研究により、GFAPプロモーターが組織特異的発現に関与するいくつかのエレメント(A領域、B領域、およびD領域が含まれる)から構成されることが明らかとなった。これらのシス活性エレメントは、ヒトGFAPプロモーターの転写プログラムに関与する。以下の2つのプロモーターを作製した:GFAP−EcoNIpと呼ばれるU6のコアプロモーターに連結されたGFAPのAおよびBエレメントを含むプロモーターならびにGFAP−SmaIpと呼ばれるU6のコアプロモーターに連結されたGFAPプロモーターのA、B、およびDエレメントを含むプロモーター(図1を参照のこと)。
実施例2:shRNAコード配列に連結されたPolIII/PolII融合プロモーターを含むベクターでの細胞のトランスフェクション
C6神経膠腫細胞、HelaS3細胞、およびHepG2細胞を、10%FBSを補足したDMEMを使用して、標準的なプロトコールにしたがって培養した。トランスフェクションの前日に、トランスフェクションの翌日に60〜70%の密度が達成されるように細胞を6ウェルプレートにプレートした。
実施例3:shRNAの発現および分析
予備分析により、例示的構築物がshRNAをコードする連結コード配列の細胞特異的調節を提供することが証明された。細胞を、一般に、上記のように成長させた。
蛍光顕微鏡法
プラスミドを試験するために、6ウェルプレートにプレートされたC6神経膠腫細胞およびHelaS3細胞を、作製したプラスミドの異なる組み合わせでトランスフェクションした。6ウェルプレート中で成長した細胞の培地を、カルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水と交換し、プレートを、倒立顕微鏡(Olympus 1X70)にロードした。ImagePro画像化ソフトウェアおよびハードウェア(Media Cybernetics)を使用して画像をキャプチャーし、その後にAdobe Photoshop 6.0(Adobe Systems,San Jose,CA)を使用して画像を操作した。いくつかの細胞の視野由来の代表的画像をキャプチャーした。
ウェスタンブロット分析
蛍光顕微鏡法によって決定された発現の結果を確認し、さらに試験するために、ウェスタンを使用してタンパク質レベルを定量的に試験した。これらの実験を、peGFP/HcRed1でのキメラプロモーターの同時トランスフェクションによる蛍光顕微鏡分析と同一の様式で行った。ほとんどの場合、蛍光顕微鏡法を使用して実験を特徴づけたが、次いで、各ウェルに対してウェスタン分析を行ってサイレンシングeGFPでの各キメラプロモーターの有効性をより高感度に測定した。
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