JP2012223201A - アプタマー調節される核酸及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(i)外来の酵素活性に対する基質を形成することのできる基質配列、及び(ii)リガンドに結合するアプタマーを包含する核酸であって、リガンドの該アプタマーへの結合が、核酸のコンホメーション変化を引き起こし、それが、基質配列の、該基質を形成する能力を変え及び/又は外来酵素活性の基質のKm及び/若しくはKcatを変える、当該核酸。
【選択図】なし
Description
最近数年間において、シス及びトランスRNAエレメントは、遺伝子発現の重要なレギュレーターとして十分認識されるようになった。細胞は、種々の非コードRNAベースのエレメントを利用して、複雑な遺伝子ネットワーク例えば発生のタイミング及び概日時計に関与するものを調節する(Banerjee等、Bioessays 24, 119-29(2002);Kramer等、Nature 421, 948-52(2003))。アンチセンスRNAは、小さいトランス作用性RNA(taRNA)であって、標的メッセンジャーRNA(mRNA)の相補性セグメントに結合して、ターゲティングディケイ、翻訳ブロック及び選択的スプライシングパターンなどの機構によって遺伝子発現を調節する(Good, Cell Mol Life Sci 60, 823-4(2003);Good, Cell Mol Life Sci 60, 854-61(2003);及びVacek等、Cell Mol Life Sci 60, 825-33(2003))。ミクロRNA(miRNA)、mRNA及びゲノム中の相補的配列と相互作用することにより翻訳又はRNAディケイに影響を及ぼす小型taRNAが後生動物遺伝子調節に広く行き渡っていることはありそうなことである(Bartel, Cell 116, 281-97(2004))。小さい干渉性RNA(siRNA)及び二本鎖RNA(dsRNA)は、正確にmRNAを標的として、それらの発現を後生動物におけけるRNA干渉(RNAi)経路によって阻害することができ、細胞の宿主防御システムの部分であると考えられている(Scherer, Curr Pharm Biotechnol 5, 355-60(2004))。リボザイムは、触媒機能を示すRNA分子であり、ウイルスによって遺伝子発現を調節するために利用されることが示されている(Lilley, Trends Biochem Sci 28, 495-501(2003))。リボスイッチ、mRNA中のシス作用性の代謝産物結合構造は、遺伝子発現を、翻訳開始の変調、転写終結の破壊又はmRNAのリボザイム機構による開裂により制御する(Mandal等、Nat Struct Mol Biol 11, 29-35(2004);Winkler, Nature 419, 952-6(2002);及びWinkler, Nature 428, 281-6(2004))。最近の研究は、これらのRNAベースのレギュレーターの、原核生物からヒトに至る種々の生物群を横切る普及を示した(Barrick等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101, 6421-6(2004);Yelin等、Nat Biotechnol 21, 379-86(2003);及びLavorgna等、Trends Biochem Sci 29, 88-94(2004))。
本発明は、アプタマー調節されるトランス作用性核酸、即ち「aptaスイッチ」を提供する。主題のaptaスイッチは、容易に処理して様々なリガンドに応答性とすることができ、多くの応用において有用な用途の広い核酸クラスである。例えば、aptaスイッチは、リガンド依存的様式で標的とした遺伝子の活性を変調するようにデザインすることができ、それ故、内因性又は異質遺伝子の発現を変調するのに有用である。
図1a〜1eは、新規なアンチスイッチレギュレーターのデザイン及び機能活性を示している。図1aは、アンチスイッチ分子がイン・ビボで遺伝子発現を調節するように作用する機構の一般的な図解である。1、アンチセンス配列;2、スイッチする「アプタマーステム」。エフェクターの非存在下では、アンチセンスドメインは、「アンチセンスステム」と呼ばれるRNAの二本鎖領域にて結合され、そのアンチスイッチは、「オフ」状態にある。この状態では、アンチスイッチは、その標的転写物(gfpコード領域をコードする)に結合することができず、その結果、GFP生成はオンである。エフェクターの存在下では、このアンチスイッチは、この分子に結合して、アプタマーステムを形成させ、そのコンホメーションを「オン」状態に切り替える。この状態において、アンチスイッチのアンチセンスドメインは、その標的転写物に結合して、アンチセンス機構により、GFPの生成をオフにする。図1bは、テオフィリン応答性アンチスイッチ、s1及びその標的mRNAの配列及び予想される構造切替えを示している。3、アンチセンス配列;4、スイッチングアプタマーステム配列;5、標的mRNA上の開始コドン。各スイッチングステムの安定性を示してある。図1cは、種々のエフェクター濃度でのs1及び対照のイン・ビボGFP調節活性を示している:テオフィリンの存在下でのアプタマー構築物(負の対照);テオフィリンの存在下でのアンチセンス構築物(正の対照);カフェインの存在下でのs1(負の対照);テオフィリンの存在下でのs1。データは、これらの構築物を有する細胞における、相対的な(GFP発現構築物のみを有する誘導された及び誘導されてない細胞での発現レベルに対する)、標準化されたGFP発現として与えられている。図1dは、蓄積された定常状態レベルのGFP及びアンチスイッチs1を有する細胞へのエフェクターの添加に際しての、GFP発現を阻止するs1のイン・ビボでの一過性応答を示している:テオフィリンなし(−);2mM テオフィリン(+)。図1eは、s1の、標的及びエフェクター分子に対するイン・ビトロアフィニティーアッセイを示している。放射性標識したs1の移動度を、等モル濃度の標的転写物と、示したように濃度を変えたテオフィリンの存在下でモニターした。
図2a及び2bは、アンチスイッチレギュレーターのスイッチ応答のチューニングを示している。図2aは、テオフィリン結合の非存在下で、s1に基づいて同調されたアンチスイッチ(s2〜s4)の予想された構造を示している。6、アンチセンス配列;7、スイッチングアプタマーステム配列;8、改変された配列。各スイッチングステムの安定性を示してある。図2bは、イン・ビボの、s1〜s4の、種々のテオフィリン濃度でのGFP調節活性を示している:s1−最初のアンチスイッチ構築物;s2−不安定化したアンチスイッチ構築物;s3−安定化したアンチスイッチ構築物;s4−不安定化したアンチスイッチ構築物。
図3a及び3bは、アンチスイッチ特性の、モジュレータードメインをデザインプラットフォーム中にスワップすることによる拡大を示している。図3aは、改変アプタマーアンチスイッチ構築物(s5〜s6)の、種々のテオフィリン濃度での、イン・ビボでのGFP調節活性を示している:s5−s1と比べて10倍低いテオフィリンに対する親和性を有するアプタマードメインを有するアンチスイッチ構築物;s6−s5ベースの、不安定化した、改変アプタマーアンチスイッチ構築物。図3bは、種々の小型分子エフェクターに応答性のアンチスイッチ構築物(s1、s7)の、種々のエフェクター濃度での、イン・ビトロでの、GFP調節活性を示している:s1−テオフィリンに応答性の初期のアンチスイッチ構築物;s7−s1ベースの、テトラサイクリンに応答性の、テトラサイクリンアプタマードメインで改変したアンチスイッチ構築物。
図4a及び4bは、新規な「オン」アンチスイッチレギュレーターの再デザイン及び特性表示を示している。図4aは、テオフィリンに応答性の「オン」アンチスイッチレギュレーター(s8)の配列及び構造スイッチングを示している。9、アンチセンス配列;10、スイッチングアプタマーステム配列;11、標的mRNA上の開始コドン。各スイッチングステムの安定性を示してある。s8は、テオフィリンの非存在下でアンチスイッチが「オン」であり又はアンチセンスドメインが自由にその標的に結合するようにデザインされている。テオフィリンの存在下で、アンチスイッチは、アンチセンスドメインが、アプタマーステムの部分である二本鎖RNAステムにて結合するように、「オフ」状態へのコンホメーション変化を受ける。図4bは、種々のテオフィリン濃度での、「オン」及び「オフ」アンチスイッチ構築物のイン・ビボでのGFP調節活性を示している:s1−初期の「オフ」アンチスイッチ構築物;s8−再デザインした「オン」アンチスイッチ構築物(s1ベース)。
図5a及び5bは、多数の遺伝子の、多数のアンチスイッチレギュレーターによる同時調節を示している。図5aは、2つの独立したアンチスイッチ分子が、多数の標的遺伝子の発現をイン・ビボで調節するように作用する機構を示している。それらのそれぞれのエフェクターの非存在下において、アンチスイッチは、「オフ」状態にあり、それらの標的転写物に結合することができない。この状態において、GFP及びYFPの生成は、両方とも、オンである。テオフィリンの存在下では、一つのアンチスイッチがそのコンホメーションを「オン」状態に切り替えて、GFP生成をオフにする。テトラサイクリンの存在下では、第二のアンチスイッチが、そのコンホメーション「オン」状態に切り替えて、YFP生成をオフにする。これらのアンチスイッチは、互いに独立に作用して、遺伝的サーキットにわたる組合せた制御を与える。図5bは、2つのアンチスイッチ構築物(s1、s9)の、それらのそれぞれの標的(GFP、YFP)に対する、それらのそれぞれのエフェクター分子(テオフィリン、テトラサイクリン)の存在下又は非存在下での、イン・ビボでの調節活性を示している。
図6は、ncRNA発現構築物の配列及び開裂機構を示している。この発現構築物は、2つのハンマーヘッドリボザイム配列の間に、ユニークな制限部位BamHI、EcoRI、SalI及びXhoIによって、一般的配列をクローン化することができる(12)。予想された開裂部位を、矢印によって示し、一般的なncRNAインサートを点線で示してある。開裂後に、生成したncRNAは、限定された3’及び5’末端を有する。
図7は、アンチスイッチs1の、ヌクレアーゼマッピングによる構造探査を示している。試料は、濃度を変えたテオフィリン及びRNアーゼT1の存在下でインキュベートしたs1に対応している。RNアーゼT1は、一本鎖G’sの3’を開裂させる。ピーク1は、アンチセンスドメインに対応し、ピーク2は、スイッチングアプタマーステムに対応する。テオフィリンの非存在下及び200μMテオフィリンの両方において、スイッチングアプタマーステムは、開裂され(ピーク2)、これは、このドメインが、一本鎖形態(ヌクレアーゼが接近可能)であることを示している。2mM テオフィリンにおいて、このピークは、存在せず、これは、アプタマーステムが、二本鎖ステム中に防護されていることを示している。その上、2mM テオフィリンにおいて、ピーク2の消失がピーク1の出現と同時に起き、これは、アンチセンスドメインが、ヌクレアーゼに接近可能な一本鎖形態であることを示している。このピークは、一層低レベルのテオフィリンでは存在せず、これは、これらの濃度におけるアンチスイッチのこの領域の接近可能性の変化を支持している。
図8は、リガンド結合の非存在下での、アンチスイッチs5、s6及びs7の配列及び予想された構造を示している。13、アンチセンス配列;14、スイッチングアプタマーステム配列;15、改変配列。各ステム部分の安定性を示してある。s1−s1ベースの改変されたテオフィリンアプタマーアンチスイッチ;s6−不安定化された改変テオフィリンアプタマーアンチスイッチ;s7−s1ベースのテトラサイクリンアプタマーアンチスイッチ。
図9は、テトラサイクリン応答性Venus(YFP)レギュレーター、s9の配列及び構造スイッチング、並びにその標的mRNAを示している。16、アンチセンス配列;17、スイッチングアプタマーステム配列;18、標的mRNA上の開始コドン。各ステムの安定性を示してある。
図10は、イン・ビボのアンチスイッチ特性決定研究で用いられるプラスミドのセットを示している。pTARGET1及びpSWITCH1を単一アンチスイッチ−単一標的研究において用い、pTARGET2及びpSWITCH2を多数のアンチスイッチ−多数の標的研究で用いた。すべての構築物は、誘導可能なガラクトースプロモーターの制御下にあり、酵母の栄養ベースの選択マーカー、酵母の動原体複製起点、大腸菌f1複製起点、及び大腸菌アンピシリン耐性マーカーを含んでいる。
図11は、標的mRNA及びアンチスイッチs1の相対的RNAレベルを示している。相対的レベルは、テオフィリンの非存在下におけるGFPmRNAに対して標準化される。
図12は、この発明で用いることのできるプラスミドの一覧表を示している。
図13は、この発明で用いることのできるアンチスイッチ構築物、対照、及びqRT−PCRプライマーの典型的配列を示している。配列は、5’から3’方向に示されており、それらのRNA形態で示されている。
図14a〜cは、アンチスイッチベースのカフェインセンサー/勾配フィルターを示すグラフである。
図15a〜bは、多数のリガンドに結合して応答して、多数の分子リガンド入力の論理的シグナル統合を与えるアプタマー調節される核酸を示している。
図16は、多数のリガンドに結合して応答する協同的アプタマー調節される核酸の概略図を示している。
図17は、RNA干渉を利用する標的のリガンド制御された調節のためのDicer基質スイッチを示している。図17aにおいて、このスイッチは、リガンドの非存在下で「オン」であり、リガンド結合により「オフ」となる。図17bにおいて、このスイッチは、リガンドの非存在下で「オフ」であり、リガンド結合により「オン」コンホメーションに活性化される。両方の場合において、活性化状態は、エフェクタードメイン及びセンス鎖を、そのドメインをDicerによる開裂のために利用可能にするコンフィギュレーションで与える。この開裂された生成物は、標的活性の調節のためのRNAi機構において機能する。
図18は、RNA干渉を利用する標的のリガンド制御された調節のためのDrosha基質スイッチを示している。図18aにおいて、スイッチは、リガンドの非存在下で「オン」であり、リガンド結合時に「オフ」である。図18bにおいて、このスイッチは、リガンドの非存在下で「オフ」であり、リガンド結合時に「オン」コンホメーションに活性化される。
図19a〜cは、リガンドテオフィリンの結合に応答性のDicer依存性スイッチを示している。図19aは、テオフィリン濃度が、スイッチとセンス鎖との結合に影響を与えることを示している。スイッチへのテオフィリン結合は、スイッチとセンス鎖との減少した結合を生じる。図19bは、スイッチとセンス鎖のDicer依存性の開裂を示している。5’末端放射性標識したミクロスイッチとセンス鎖を、組換えDicerの存在下又は非存在下に、16時間にわたって、テオフィリン濃度を変えてインキュベートした後に、12%非変性ポリアクリルアミドゲル上に展開した。図19cは、Dicer依存性スイッチ機構の概略図を示している。このスイッチは、リガンドの非存在下で「オン」である。
図20a及び20bは、イン・ビボテオフィリン濃度に応答するDicer依存性スイッチに応答したGFP発現の減少を示している。図20aは、10nMミクロスイッチ及びセンス鎖の、テオフィリン濃度を変えて成長させているHeLa細胞へのトランスフェクションを反映するデータを示すグラフである。テオフィリンの結合は、「オフ」スイッチを引き起こす。このスイッチは、一層低いテオフィリン濃度では「オン」であり、GFP発現のRNAi媒介の減衰を引き起こす。エラーバーは、2つの独立の測定を表している。図20bは、Dicer依存性スイッチ機構の概略図を示しており、このスイッチは、リガンドの非存在下で「オン」である。
図21a〜bは、RNAiを利用する標的のリガンド制御された調節のための単一分子Dicer依存性スイッチを示している。図21aでは、このスイッチは、リガンドの非存在下で「オン」であり、リガンド結合時に「オフ」である。図21bでは、このスイッチは、リガンドの非存在下で「オフ」であり、リガンド結合時に「オン」コンホメーションに活性化される。両方の場合に、活性化状態は、エフェクタードメイン及びセンス鎖を、そのドメインをDicerによる開裂に利用可能にするコンフィギュレーションで与える。その開裂産物は、標的活性を調節するためのRNAi機構において機能する。
1.概観
本発明は、リガンド結合に応答する、トランス作用性アプタマー調節される核酸、即ち「aptaスイッチ」を提供する。一つの面は、アプタマー調節される核酸及び方法並びにこれらのアプタマー調節される核酸を含む、細胞における遺伝子発現を変調する(例えば、減衰させる)ための組成物に関係する。他の面は、試料中の分子の存否又は量を検出するためのイン・ビボセンサーとして用いることのできるアプタマー調節される核酸に関係する。トランス作用性とは、本発明のaptaスイッチが、それらのリガンド依存性の活性を、aptaスイッチと異なる分子(例えば、他の核酸)(例えば、ホスホジエステル(又は、同等物)主鎖リンカーを介して結合しておらず、尚一層好ましくは、aptaスイッチと全く共有結合していない)に対して発揮することを意味する。
一具体例において、この発明のアプタマー調節される核酸は、アプタマードメイン及びエフェクター核酸ドメインを含む。この発明のアプタマー調節される核酸には、DNA又はRNAが含まれて、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。アプタマー調節される核酸は、多数のモジュラーコンポーネント例えば一つ以上のアプタマードメイン及び一つ以上のエフェクタードメインを含むことができる。アプタマー調節される核酸は、更に、官能基又は官能性薬剤例えば挿入剤又はアルキル化剤を含むことができる。アプタマー調節される核酸は、合成の又は非天然の核酸類似体(例えば、6−メルカプトプリン、5−フルオロウラシル、5−ヨード-2’−デオキシウリジン及び6−チオグアニン)を含むことができ、又は改変核酸を含むことができる。典型的な改変には、シトシン環外アミン、5−ブロモ−ウラシルの置換、主鎖改変、メチル化、及び異常な塩基対合の組合せが含まれる。アプタマー調節される核酸は、蛍光標識、放射性標識、化学標識、又は酵素標識などの標識を含むことができる。アプタマードメインは、リガンド結合に応答して、エフェクタードメインにおけるアロステリック変化を誘導してそのエフェクタードメインの標的分子と相互作用する能力を変える。それ故、リガンド結合は、エフェクタードメインを、「オフ」から「オン」(又は、その逆)に切り替える。それ故、アプタマー調節される核酸は、リガンド結合に応答して活性が「オフ」及び「オン」に切り替わるスイッチとして作用する。アプタマードメインのリガンドに対する応答は又、リガンドの正体及び/又はアプタマードメインに露出されたリガンドの量若しくは濃度にも依存しうる。例えば、アプタマーは、小型分子例えば薬物、代謝産物、中間体、補因子、遷移状態類似体、イオン、金属、核酸、及び毒素に結合することができる。或は、アプタマーは、天然の及び合成のポリマー(タンパク質、ペプチド、核酸、多糖類、糖タンパク質を含む)、ホルモン、レセプター及び細胞表面例えば細胞壁及び細胞膜に結合することができる。ある別の具体例において、リガンド制御される核酸のアプタマードメインは、環境変化に応答性である。環境変化には、制限はしないが、pH、温度、浸透性、又は塩濃度の変化が含まれる。エフェクター核酸ドメインは又、RNAi配列として用いることのできる配列例えばsiRNA又はmiRNAを含みうる。好適具体例において、アプタマードメインへのリガンド結合は、これらの分子のコンホメーション力学の変化を媒介し、それは、エフェクター核酸ドメインが標的核酸例えばmRNAと相互作用することを可能にする。
「アプタマー」は、特異的分子に高い親和性及び特異性で結合することのできる核酸分子例えばRNA又はDNAであってよい(Ellington等、Nature 346, 818-22(1990);及びTuerk等、Science 249, 505-10(1990))。アプタマーに結合する典型的なリガンドには、制限はしないが、小型分子例えば薬物、代謝産物、中間体、補因子、遷移状態類似体、イオン、金属、核酸及び毒素が含まれる。アプタマーは又、天然及び合成のポリマー(タンパク質、ペプチド、核酸、多糖類、糖タンパク質、ホルモンを含む)、レセプター及び細胞表面例えば細胞壁及び細胞膜に結合することもできる。このリガンドのアプタマーへの結合(典型的には、RNA)は、そのエフェクタードメインのコンホメーション変化を引き起こし、その標的分子と相互作用する能力を変える。それ故、リガンド結合は、エフェクタードメインの、遺伝子不活性化、転写、翻訳を媒介し、或は例えば標的遺伝子又はmRNAの正常な活性に干渉する能力に影響を与える。アプタマーは、最も典型的には、標的分子の結合についてのイン・ビトロ選択により得られてきた。しかしながら、アプタマーのイン・ビボ選択も又、可能である。アプタマーは、他の物質がこの核酸と複合体化されない環境において、意図する標的分子との複合体を形成することのできる特異的結合領域を有する。この結合の特異性は、アプタマーのリガンドに対する、環境中の他の物質についての又は一般に無関係の分子についての解離定数と比較した、比較解離定数(Kd)により規定される。リガンドは、アプタマーに、無関係の物質より一層大きい親和性で結合するものである。典型的には、アプタマーの、リガンドに関するKdは、無関係の物質又は環境において付随する物質とのKdより約10倍小さい。尚一層好ましくは、このKdは、少なくとも約50倍小さく、一層好ましくは、少なくとも約100倍小さく、最も好ましくは、少なくとも約200倍小さい。アプタマーは、典型的には、約10〜300ヌクレオチド長である。一層一般的に、アプタマーは、約30〜100ヌクレオチド長である。
この発明のアプタマー調節される核酸は、アンチセンス配列を含んで、標的遺伝子の発現を阻止するためにアンチセンス機構によって作用するエフェクタードメインを含むことができる。ここで用いる場合、かかるアプタマー調節される核酸は又、「アンチスイッチ」とも呼ばれる。アンチセンス技術は、遺伝子発現を調節するために広く利用されてきた(Buskirk等、Chem Biol 11, 1157-63(2004);及びWeiss等、Cell Mol Life Sci 55, 334-58(1999))。ここで用いる場合、「アンチセンス」技術は、細胞条件下で、少なくとも一種の標的タンパク質をコードする関心ある標的核酸(mRNA及び/又はゲノムDNA)と特異的に、該タンパク質の発現を、例えば転写及び/又は翻訳を立体障害などにより阻止すること、選択的スプライシング、又は転写物の開裂誘導若しくは酵素的不活性化によって阻害するようにハイブリダイズする(例えば、結合する)分子又はそれらの誘導体の投与又はイン・シトゥー生成を指す。この結合は、慣用の塩基対相補性によるものであってよく、又は、例えばDNA二本鎖への結合の場合には、二重らせんの大きい溝における特異的相互作用によるものであってよい。一般に、「アンチセンス」技術は、当分野で一般的に用いられる技術の範囲を指し、核酸配列への特異的結合に依存する任意の治療を含む。
RNA干渉(RNAi)は、二本鎖(ds)RNA依存性の遺伝子特異的な転写後サイレンシングを示す現象である。この現象を哺乳動物細胞の実験操作に利用しようとする初期の試みは、長いdsRNA分子に応答して活性化される丈夫な非特異的アンチウイルス防御機構によってくじかれた。Gil等、Apoptosis 2000, 5:107-114。この分野は、合成の二本鎖の21ヌクレオチドのRNAが、遺伝子特異的なRNAiを哺乳動物細胞において、包括的なアンチウイルス防御機構を呼び出すことなく、媒介することができるということが示されて有意に進歩した。Elbashir等、Nature 2001, 411:494-498;Caplen等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001, 98:9742-9727。結果として、小さい干渉性RNA(siRNA)及びミクロRNA(miRNA)が、遺伝子機能を分析するための強力なツールとなった。小型RNAの化学合成は、有望な結果を生み出してきた一本の大通りである。やはり多くのグループが、かかるsiRNAを細胞内で生成することのできるDNAベースのベクターの開発を追求してきた。幾つかのグループは、最近、このゴールを確認して、一般に、細胞内で効率的にプロセッシングを受けてsiRNAを形成する短かいヘアピン(sh)RNAの転写を含む類似のストラテジーを公開した。Paddison等、PNAS 2002, 99:1443-1448;Paddison等、Genes & Dev 2002, 16:948-958;Sui等、PNAS 2002, 8:5515-5520;及びBrummelkamp等、Science 2002, 296:550-553。これらの報告は、多くの内因的及び外因的に発現された遺伝子を特異的に標的とすることのできるsiRNAを生成する方法を記載している。
発明の更なる面は、リガンド制御される核酸分子の種々の分野における応用に関係する。例えば、アプタマー調節される核酸を利用して、試料中の標的分子の存否又は量を検出することができる。標的分子は、代謝産物、イオン、ペプチド、核酸などであってよい。同様に、アプタマー調節される核酸を、イメージング目的のために利用することができる。更に、アプタマー調節される核酸は、エフェクター核酸ドメインが、ある環境(例えば、特定の細胞内位置又は細胞膜)を標的とするように利用することができる。
この発明のアプタマー調節される核酸は、細胞における代謝産物のレベルを感知して検出するためのツール(非侵襲的でありうる)として機能することができる。このイメージング又は検出は、少なくとも一種の関心ある代謝産物の定量化のために利用することができる。或は、それを用いて、経路を通る過剰な流れ及び生成物形成を制御するためのシグナリング経路中のある種の酵素を調節すること又は細胞内のタンパク質又は酵素のターゲティングレベルによる代謝状態を変えることができる。
この発明のアプタマー調節される核酸は又、取込み、分配及び/又は吸収を助成するために、他の分子、分子構造、又は化合物の混合物(例えば、リポソーム、ポリマー、レセプター標的分子、経口投与用、局所投与用その他の配合物)と混合し、結合させ、或は会合させることができる。主題のアプタマー調節される核酸は、浸透増進剤、キャリアー化合物及び/又はトランスフェクション剤をも含む配合物にて提供することができる。
この発明の一つの面は、細胞におけるリガンドの量及び/又は活性を変調する方法を提供する。この方法は、リガンドに応答性のアプタマーをデザインして選択すること及び、選択したアプタマー及びエフェクターRNAを含むアプタマー調節される核酸を用意することを含むことができ、このエフェクターRNAは、リガンドを例えば代謝産物又は中間体分子として含む細胞内の、分子、シグナリング及び/又は代謝経路(即ち、リガンドと関係したシグナリング及び/又は代謝経路)を標的とする。この方法は、細胞をアプタマー調節される核酸と、細胞中のリガンドの濃度及び/又は活性を変調するのに十分な量及び/又は時間で接触させることを更に含むことができる(スイッチオンの場合)。
この発明を今や一般的に説明したので、それは、下記の実施例を参照することにより一層容易に理解することができよう。これらは、単に、本発明のある面及び具体例の説明の目的で含むものであり、この発明を制限することを意図したものではない。
標準的分子生物学技術を利用してすべてのプラスミドを構築した(Sambrook等、Molecular cloning:A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001))。4つの異なるプラスミド構築物を、pRS314−Gal及びpRS316−Galシャトルベクター中にクローン化することによって生成した(Sikorski等、Genetics 122, 19-27(1989))。遺伝子及びアンチスイッチ構築物を、GAL1プロモーターの下流のマルチクローニング部位にクローン化した。これらのプラスミド(図10及び12参照)は、大腸菌の複製起点(f1)及びアンピシリン耐性の選択マーカー、並びにS.セレビシエの複製起点(CEN6−ARSH4)及びトリプトファンに対する選択マーカー(TRP1−pRS314)及びウラシル(URA3−pRS316)生合成遺伝子を、これらのプラスミドを有する細胞を、適当なアミノ酸欠落溶液を補った合成の完全培地で選択するために含んでいる(Sambrook等、Molecular cloning:A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001))。第一のプラスミドシステム、pTARGET1において、yEGFPを、マルチクローニング部位にクローン化した(GAL1プロモーターとADH1ターミネーターの間に位置する)。第二のプラスミドシステム、pSWITCH1において、様々なアンチスイッチを、GAL1プロモーターとADH1ターミネーターの間に位置する2つのハンマーヘッドリボザイムの間にクローン化した。第三のプラスミドシステム、pTARGET2において、PGAL−Venus−ADH1term構築物を、pTARGET1中のPGAL−yEGFP−ADH1term構築物の下流にクローン化した。それ故、pTARGET2は、ガラクトースで誘導された場合に、2つの標的転写物を生成する。第四のシステム、pSWITCH2において、PGAL−アンチスイッチ−ADH1term構築物を、pSWITCH1中のPGAL−アンチスイッチ−ADH1term構築物の下流にクローン化した。それ故、pSWITCH2は、ガラクトースの存在により誘導された場合に、2つのアンチスイッチ構築物を生成する。2つのプラスミドのセット、pTARGET1及びpSWITCH1又はpTARGET2及びpSWITCH2を、S.セレビシエ中に同時にトランスフォームして、適当な栄養選択圧を加えて維持した。これら2つのプラスミドセットにおいて、アンチスイッチ構築物及びそれらの標的の発現が、ガラクトースの培地への添加に際して誘導された。オリゴヌクレオチドプライマーは、Integrated DNA Technologies から購入した。すべての遺伝子及びアンチスイッチを、Dyad PCRマシン(MJ Research)にて、TaqDNAポリメラーゼ(Roche)を用いてPCR増幅した。yegfp遺伝子がpSVA1535から得られ、venus遺伝子がpCS2/Venusから得られた(Nagai等、Nat Biotechnol 20, 87-90(2002))。すべてのアンチスイッチ配列は、カスタムオリゴヌクレオチドデザインを利用して得られた(図12参照)。
酵母細胞を、適当な欠落溶液及び糖質源(2% ラフィノース、1% シュークロース)を補った合成完全培地に接種して、一晩、30℃で成長させた。細胞を新鮮な培地に戻して希釈し、0.1のOD600として、30℃で成長させた。アンチスイッチ活性をアッセイするために、この新鮮な培地は、適当な濃度のテオフィリン(Sigma)、カフェイン(Sigma)、テトラサイクリン(Sigma)、又は水(負の対照)を含み、そして発現を2%ガラクトースの終濃度にして誘導し、又は等容積の水を加えた(非誘導対照)。3時間の成長の後に、GFP及びVenusレベルをSafire(Tecan)蛍光プレートリーダーセット上で、適当な励起(GFP−485nm;Venus−515nm)及び放出(GFP−515nm;Venus−508nm)波長についてアッセイした。アンチセンスの一過性応答をアッセイするために、細胞を、2%ガラクトースを含む新鮮な培地に戻して希釈した。誘導培地で3時間成長させた後で、テオフィリン又は水を加えて、蛍光を経時的にモニターした。蛍光を、細胞数につき、相対的蛍光単位(RFU)を培地のOD600で除することによって標準化した。
酵母細胞を、タンパク質発現アッセイに詳述された方法に従って成長させた。全RNAを標準的酸フェノール抽出手順を用いて抽出した(Caponigro等、Mol Cell Biol 13, 5141-8(1993))。簡単にいえば、細胞をペレット化して、液体窒素中で凍結させた。ペレットを、50mM NaOAc(pH5.2)及び10mM EDTA緩衝液に懸濁させた。細胞を、終濃度1.6%のSDSの添加及び等容の酸フェノールの添加によって溶解させた。溶液を65℃に維持して、10分間、間欠的にボルテックスミキサー処理した。氷上で冷却後、水相を抽出して、更に、等容のクロロホルムを用いて抽出を実施した。RNA試料をエタノール沈殿させて、水中に再懸濁させた。全RNAを、OD260の読みにより定量した。RNA試料を、製造業者の指示に従ってDNアーゼ(Invitrogen)処理した。cDNAを、遺伝子特異的なプライマー(図13参照)及びスーパースクリプトIII逆転写酵素(Invitrogen)を利用して、製造業者の指示に従って合成した。qRT−PCRを、このcDNAについて、iCycler iQシステム(BioRAD)を利用して行なった。試料を、iQ SYBRグリーンスーパーミックス及び、種々のテンプレートに特異的なプライマー対(図13参照)を、cDNA希釈シリーズに用いて、製造業者の指示に従って用意した。データを、iCycler iQソフトウェアを利用して分析した。
アンチスイッチ及び標的配列を、T7ポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを用いてPCR増幅した。RNAを、AmpliscribeT7転写キット(Epicentre)を製造業者の指示に従って用いて転写した(但し、転写を、42℃で行ない、ゲルシフトアッセイには、アンチスイッチを、[α−32P]−UTPの転写混合物への添加により放射性標識した)。このRNAを、15%変性ゲル上で精製して、溶出させ、エタノール沈殿させて、水中に再懸濁させた。RNAを、OD260の読みによって定量した。ヌクレアーゼマッピングのために、アンチスイッチを、25μgのRNAを、DMSO(Sigma)に溶解させたホスフェート反応性標識と、標識緩衝液(0.12M メチルイミダゾール pH9.0、0.16M EDAC)中で4時間、製造業者の指示に従ってインキュベートすることにより、5’末端で蛍光標識(Molecular Probes)した。標識したRNAを、エタノール沈殿及び12%変性ゲル上での泳動により精製した。蛍光バンドをゲルから切り出して、37℃で3時間にわたって水中に溶出させて、エタノール沈殿させた。
RNAの自由エネルギーを、RNA structure バージョン3.71(Mathews等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101, 7287-92(2004))を用いて計算した。
アンチセンス技術は、遺伝子発現を調節するために広く利用されてきた(Weiss等、Cell Mol Life Sci 55, 334-58 (1999);及びScherer等、Nat Biotechnol 21, 1457-65 (2003))。アロステリック調節機能性は、プラットフォームであって、その上でリガンド結合構造がアンチセンス分子に付加される当該プラットフォームをデザインすることによって巧みに処理されてきた。このプラットフォームにおいて、アンチセンスドメインは、リガンドの非存在下で、「アンチセンスステム」又は「アンチセンスエフェクタードメイン」中に隔離される。リガンドのアプタマードメインへの結合は、アンチセンスステムのコンホメーション力学を変化させ、それは、一層一本鎖形態であるアンチセンスドメインを生じる(図1a)。かかる機構は、シグナリングアプタマー及び他のアロステリックに制御されるRNAの構築において記載されてきた(Nutiu等、J Am Chem Soc 125, 4771-8(2003))。
S.セレビシエにおけるアンチスイッチの発現を、前に記載された系(Taira等、Nucleic Acids Res 19, 5125-30(1991))と類似の新規な非コードRNA(ncRNA)発現構築物を利用して達成した(図6参照)。簡単にいえば、発現すべきRNAを、イン・ビボで自己開裂することが知られた2つのハンマーヘッドリボザイムの間にクローン化する(Samarsky等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 6609-14(1999))。この二重ハンマーヘッドの構築物を、PolIIプロモーターの制御下に置くことができ、転写された際に、隣接するハンマーヘッドリボザイムは、99%より大きい効率で、所望のRNAから開裂してはずれる(図11参照)。この構築物は、潜在的に干渉する隣接配列を有しない限定された5’及び3’末端を有するncRNAの創作を可能にする。アンチスイッチs1は、この構築物において、酵母細胞におけるガラクトース誘導性(GAL1)プロモーターの制御下で発現された。酵母で増進されるGFP(yEGFP)(Mateus等、Yeast 16, 1313-23(2000))をGAL1プロモーターの制御下に含むプラスミドを、同じ細胞にトランスフォームした(図1a)。
定量的リアルタイムPCR(qRT−PCR)を、種々の条件下で成長させた細胞から抽出したアンチスイッチs1及び標的mRNAについて行なって、相対的RNAレベルを測定した(図11参照)。標的転写物の相対的レベルは、テオフィリンの非存在下及び高レベルのテオフィリンにて成長させたs1を有する細胞間で有意に変わらず、これは、アンチスイッチが、標的RNAレベルに影響するよりも、翻訳の阻害によって機能することを示している。加えて、定常状態のs1の相対的レベルは、アンチスイッチと標的は、同じプロモーターから発現されるにもかかわらずに、標的レベルの約1,000倍であった。これは、アンチスイッチ分子が、おそらく二次構造を安定化するか又は一層効率的に合成されることにより、mRNAより一層高い細胞内安定性を有しうることを示している。アンチスイッチ調節の一過性の応答を、アンチスイッチの活性化を、定常状態レベルのGFP及び「オフ」状態のs1を発現する細胞へのテオフィリンの添加により誘導することによって測定した(図1d)。GFPレベルは、テオフィリンの添加後すぐに、約0.5〜1時間の半減期に相当する速度で減少を開始し、これは、これらの実験で用いたGFP変異体の半減期と一致する(Mateus等、Yeast 16, 1313-23(2000))。このデータは、アンチスイッチ分子が、それらの標的mRNAからの翻訳を、活性化レベルのエフェクターの存在下で阻止するように迅速に作用すること及び標的タンパク質レベルの低減に要する時間は、そのタンパク質の半減期によって決定されることを支持している。
アンチスイッチプラットフォームの切り替え挙動は、RNA構造のコンホメーション力学に依存しており;それ故、アンチスイッチの熱力学的特性を変えることによって、直接的仕方で切り替え挙動を調整することが可能である。アンチセンスステム及びアプタマーステムの絶対的及び相対的安定性は、アンチスイッチのスイッチ挙動の調整において重要なデザインパラメーターであるということが予想される。スイッチ挙動のダイナミックレンジを探究するために、我々は、アンチセンス及びアプタマーステムの安定性を変えて幾つかのアンチスイッチ(s2〜s4)を造った(図2a)。これらの変化させたアンチスイッチは、遺伝子発現における切り替えが認められ且つGFP発現のダイナミックレンジが増大する濃度範囲に広がるということが予想された。
アンチスイッチデザインプラットフォームのモジュール性を示すために、幾つかの異なるアンチスイッチ分子を構築して、種々のアプタマードメイン間で交換することにより特性決定した(図8参照)。アプタマードメインにおけるこれらの変化は、標的転写物を同じに維持したので、アンチセンスステム及びスイッチングアプタマーステムを以前のデザインと同じに維持するようにデザインされたが、アプタマーモジュールの残りは、交換により失われる。デザインしたアンチスイッチのリガンド応答性の範囲を更に探究するために、我々は、スイッチs5を、以前に特性決定された、テオフィリンに対して一層低い親和性を示すアプタマー(Zimmermann等、PNAS 6, 659-67(2000))を利用して構築した。このアプタマーは、s1〜s4で用いられたアプタマーより約10倍高いKdを有している。加えて、このアンチスイッチの応答は、s2と同じ仕方でアンチセンスステムを不安定化させることにより調整され、s6を生じた。このプラットフォームのモジュール性を更に調べるために、アンチスイッチを、以前にテトラサイクリンに対して特性決定したアプタマー(Berens等、Bioorg Med Chem 9, 2549-56(2001))をも用いて構築した。このアプタマーは、s1〜s4で用いたテオフィリンアプタマー(Kd=1μM)と同様に、テトラサイクリンに対する親和性を有している。図3a〜3bのデータは、異なるアプタマードメインに対するアンチスイッチプラットフォームのモジュール性を支持している。これらの改変されたテオフィリンアプタマーは、s1〜s4において、リガンド濃度に対する変化した応答を示している。予想されたように、s5及びs6に関するスイッチングは、一層高濃度のテオフィリンにおいて生じている(図3a)。有意に、s5は、s1のアプタマードメインの10倍のKdを有するアプタマードメインを含み、凡そ10倍高いテオフィリン濃度でスイッチしている。加えて、テトラサイクリンアンチスイッチs7は、s1〜s4と類似のスイッチ力学を示しており、これは、認められた応答曲線が、デザインされたアンチスイッチの一般的特徴であることを示唆している。
アンチスイッチプラットフォームの可撓性を更に調べるために、我々は、このプラットフォームを、s1のデザインにおいて利用したアプタマー及びアンチセンスドメインから「オン」アンチスイッチを構築することを企てて、改めた。テオフィリンの非存在下で発現を阻止するが、テオフィリンの存在下では発現を許すアンチスイッチs8を、類似のデザイン原理を利用して構築した。このスイッチは、そのアンチセンスドメインをリガンドの非存在下で示し、それを、自由に標的mRNAと相互作用させるが、リガンドが存在する場合には、そのアンチセンスをアプタマーステム中に隔離する(図4a)。s8は、s1と類似の力学的挙動を示す(1mM テオフィリン付近でスイッチングする)が、これは、類似の塩基対エネルギー特性のためである(図4b)。この機能的「オン」スイッチは、このスイッチプラットフォームの可撓性及びデザインテーマの一般性を示している。
このアンチスイッチプラットフォームのモジュール性は、遺伝子発現の組み合わせた制御を示すシステムを可能にする。これを説明するために、我々は、細胞に、2つのスイッチを導入した。その各々は、異なるエフェクター分子に応答性であり、各々異なるmRNA標的のタンパク質発現を調節する:s1は、テオフィリン応答性GFPレギュレーターであり、s9(図9参照)は、テトラサイクリン応答性の黄色蛍光性変異タンパク質(Venus)(Nagai等、Nat Biotechnol 20, 87-90(2002))レギュレーターである(図5a)。これらの分子のターゲティング能力の変化を、アンチセンスステムとスイッチングアプタマーステムとを、アプタマー分子の残りを同じに維持しつつ交換することにより生じさせた。これら2つのアンチスイッチの、GFPとVenusを両方有するプラスミドを用いた同時発現は、遺伝子発現のモジュラーアンチスイッチデザインによる同時調節のアッセイを可能にした。図5bに示したように、テオフィリンの添加は、GFPの発現を減少させたが、Venusの発現は、影響されないままであり、テトラサイクリンの添加は、Venusを減少させたが、GFPには影響していない。その上、両リガンドの添加は、GFPとVenusの両方の発現を減少させた。この試料系は、多数のアンチスイッチ構築物によって正確に調節される一層複雑な遺伝子サーキットの構築の潜在的可能性を示している。
2:スイッチする「アプタマーステム」
3:アンチセンス配列
4:スイッチングアプタマーステム配列
5:標的mRNA上の開始コドン
6:アンチセンス配列
7:スイッチングアプタマーステム配列
8:改変された配列
9:アンチセンス配列
10:スイッチングアプタマーステム配列
11:標的mRNA上の開始コドン
12:ユニークな制限部位
13:アンチセンス配列
14:スイッチングアプタマーステム配列
15:改変配列
16:アンチセンス配列
17:スイッチングアプタマーステム配列
18:標的mRNA上の開始コドン
Claims (61)
- (i)外来の酵素活性に対する基質を形成することのできる基質配列、及び(ii)リガンドに結合するアプタマーを包含する核酸であって、リガンドの該アプタマーへの結合が、核酸のコンホメーション変化を引き起こし、それが、基質配列の、該基質を形成する能力を変え及び/又は外来酵素活性の基質のKm及び/若しくはKcatを変える、当該核酸。
- (i)標的遺伝子の発現を阻止するアンチセンス配列、及び(ii)リガンドに結合するアプタマーを含む核酸であって、リガンドの該アプタマーへの結合が、核酸のコンホメーション変化を引き起こし、これが、該アンチセンス配列の、標的配列の発現を阻止する能力を変える、当該核酸。
- (i)第二の核酸の標的配列にハイブリダイズするハイブリダイゼーション配列;及び(ii)リガンドに結合するアプタマーを含む核酸であって、該アプタマーへのリガンド結合は、核酸のコンホメーション変化を引き起こし、それが、ハイブリダイゼーション配列の、標的配列にハイブリダイズする能力を変える、当該核酸。
- 標的遺伝子の発現を変えるトランス作用性核酸であって、該核酸は、下記:
(i)該標的遺伝子にハイブリダイズすることができて該標的遺伝子の発現を調節するターゲティング配列;及び
(ii)リガンドに結合するアプタマー配列
を含み、該リガンドの該アプタマーへの結合が、該核酸のコンホメーション変化を引き起こして、該核酸が、該標的遺伝子の発現を、該リガンドの存在に依存する様式で調節する、当該核酸。 - 前記の核酸が、リボ核酸(RNA)である、請求項1〜4の何れかに記載の核酸。
- 前記の核酸が、少なくとも一つの天然にないヌクレオシド類似体及び/又は天然にないヌクレオシド残基間の主鎖リンカーを含む、請求項1〜4の何れかに記載の核酸。
- 天然のヌクレオシド及びホスフェート主鎖リンカーの対応する核酸と比較して、異なる安定性、ヌクレアーゼ感受性(又は耐性)及び/又はバイオアベイラビリティーを有する、請求項6に記載の核酸。
- 50〜200ヌクレオチドのサイズの範囲にある、請求項1〜4の何れかに記載の核酸。
- コンホメーション変化が、分子内二本鎖特徴(前記の基質配列を含む)を生成し又は除去し、二本鎖特徴が、外来酵素活性の基質である、請求項1に記載の核酸。
- 前記の外来酵素活性が、RNアーゼ酵素である、請求項1又は9に記載の核酸。
- 前記の外来酵素活性が、RNアーゼIII酵素例えばDicer又はDroshaである、請求項10に記載の核酸。
- 前記の核酸が、前記のアプタマー、前記のRNアーゼIII酵素、及び前記の基質配列の配列へのリガンド結合に依存する様式で遺伝子サイレンシングを引き起こす、請求項11に記載の核酸。
- 前記の基質配列が、siRNA、miRNA又はそれらの前駆体若しくは代謝産物をRNA干渉経路で、前記のRNアーゼIII酵素による反応の産物として生成する、請求項12に記載の核酸。
- コンホメーション変化が、基質配列の能力を変えて第二の核酸種との分子間二本鎖特徴を形成し、二本鎖特徴が外来酵素活性の基質である、請求項1に記載の核酸。
- 第二の核酸種が、mRNAであって、前記の外来酵素活性が、mRNAを、二本鎖特徴の形成に依存する様式で変える、請求項14に記載の核酸。
- 外来酵素活性が、RNアーゼH酵素及び/又はRNアーゼP酵素である、請求項1、14又は15の何れかに記載の核酸。
- 外来酵素活性が、ポリメラーゼ、レコンビナーゼ、リガーゼ、メチラーゼ、グリコシラーゼ及びヌクレアーゼよりなる群から選択される、請求項1又は14に記載の核酸。
- 前記のリガンドが、前記の基質配列の基質を形成する能力に変化をもたらし及び/又は外来酵素活性の基質のKm及び/若しくはKcatを変えて投与量依存性速度論を示す、請求項1に記載の核酸。
- 前記のアプタマーへのリガンド結合が、前記のアンチセンス配列を前記の標的遺伝子へのハイブリダイゼーションに利用可能にするコンホメーション変化を引き起こす、請求項2に記載の核酸。
- 前記のアプタマーへのリガンド結合が、前記のアンチセンス配列を前記の標的遺伝子へのハイブリダイゼーションに利用不能にするコンホメーション変化を引き起こす、請求項2に記載の核酸。
- 前記のアプタマーへのリガンドの結合が、核酸内のコンホメーション変化を引き起こし、これが、前記のアンチセンス配列の前記の標的遺伝子へのハイブリダイゼーションにより形成される二本鎖の融点(Tm)を変える、請求項2に記載の核酸。
- 前記のアンチセンス配列を、前記の標的遺伝子のRNA転写物にハイブリダイズするように選択する、請求項2、19、20又は21の何れかに記載の核酸。
- 前記のアンチセンス配列を、前記の標的遺伝子のゲノム配列にハイブリダイズするように選択する、請求項2、19、20又は21の何れかに記載の核酸。
- 前記のリガンドが、前記のアンチセンス配列の、標的配列の発現を阻止する能力に変化をもたらして投与量依存性速度論を示す、請求項2に記載の核酸。
- 前記のターゲティング配列が、標的遺伝子のRNA転写物にハイブリダイズして(i)該RNA転写物から翻訳されるタンパク質の量を減少させ及び/又は(ii)該RNA転写物のスプライシングを変える、請求項4に記載の核酸。
- 前記のRNA転写物が、mRNAである、請求項25に記載の核酸。
- 前記のターゲティング配列が、前記の標的遺伝子のゲノム配列にハイブリダイズして該ゲノム配列から転写されるRNAの量を減少させる、請求項4に記載の核酸。
- 前記のリガンドが、前記の基質配列の、前記の標的配列にハイブリダイズする能力に変化をもたらして投与量依存性速度論を示す、請求項3に記載の核酸。
- リガンドが、2500amu未満の分子量を有する小型分子であり且つ/又は細胞透過性である、請求項1〜4の何れかに記載の核酸。
- リガンドが、金属イオンである、請求項1〜4の何れかに記載の核酸。
- リガンドが、天然産物である、請求項1〜4の何れかに記載の核酸。
- リガンドが、シグナル変換二次メッセンジャー分子である、請求項31に記載の核酸。
- リガンドが、翻訳後修飾されたタンパク質である、請求項31に記載の核酸。
- リガンドを、ポリペプチド、ペプチド、核酸、炭水化物、脂肪酸及び脂質、非ペプチドホルモン(ステロイドなど)及びこれらの代謝前駆体又は産物よりなる群から選択する、請求項1〜4の何れかに記載の核酸。
- リガンドを、酵素補因子、酵素基質又は酵素媒介反応の産物よりなる群から選択する、請求項1〜4の何れかに記載の核酸。
- (i)転写されたとき請求項5に記載のRNAを生成するにコード配列、及び(ii)この発現構築物を含む細胞における該RNAの転写を調節する少なくとも一つの転写調節配列を含む発現構築物。
- アプタマー調節される核酸のライブラリーであって、請求項1、2、3若しくは4の何れか又は請求項36に記載の発現構築物の何れかの核酸の多彩な集団を含む当該ライブラリー。
- 少なくとも一つの請求項36に記載の発現構築物で巧みに処理された組換え細胞。
- 請求項1〜4の何れかに記載の少なくとも一の核酸を含む細胞。
- 一種以上の反応の代謝経路を含み;且つ該代謝経路上で制御エレメントとして作用する一種以上のトランス作用性核酸を含む細胞であって、各トランス作用性核酸が、下記:
(i)該代謝経路における酵素補因子、反応体、反応の基質又は生成物から選択したリガンドに選択的に結合するアプタマー配列;
(ii)該代謝経路に含まれるタンパク質をコードする標的遺伝子の発現を低減させるための遺伝子サイレンシング配列、
を含み、該アプタマーへのリガンド結合が、該トランス作用性核酸に2つのコンホメーション状態の間で変化を引き起こし、該コンホメーション状態の一方において、トランス作用性核酸は、該標的遺伝子の発現を該遺伝子サイレンシング配列に依存する様式で阻害し、他方においては、該標的遺伝子の発現を阻害せず、それにより、この代謝経路が、少なくとも部分的に、このトランス作用性核酸によって調節調節される当該細胞。 - 代謝経路が、一つの酵素により媒介される少なくとも一つの反応を含み、少なくとも一つの該トランス作用性核酸が、該酵素の発現を調節する、請求項40に記載の細胞。
- 細胞における標的遺伝子の、リガンドの存在又は非存在に依存した発現を与える方法であって、該方法は、細胞に、下記:
(i)該標的遺伝子にハイブリダイズしてその標的遺伝子の発現を調節することのできるターゲティング配列;及び
(ii)リガンドに結合するアプタマー配列
を含むトランス作用性核酸を導入することを含み、
該アプタマーへの該リガンドの結合が、該トランス作用性核酸にコンホメーション変化を誘導し、該トランス作用性核酸が、該標的遺伝子の発現を、該リガンドの濃度に依存する投与量依存様式で調節する当該方法。 - リガンドが、前記の細胞により生成される、請求項42に記載の方法。
- リガンドが、前記の細胞と接触される細胞透過性薬剤である、請求項42に記載の方法。
- 前記のターゲティング配列が、前記の標的遺伝子の発現をアンチセンス機構の作用により阻害し、リガンド誘導されたコンホメーション変化に依存した様式での該標的遺伝子とのハイブリダイゼーションに利用可能である、請求項42に記載の方法。
- 前記のターゲティング配列が、前記の標的遺伝子の発現をRNA干渉機構の作用により阻害し、リガンド誘導されたコンホメーション変化に依存した様式で、RNアーゼIII酵素の基質になる、請求項42に記載の方法。
- 前記のターゲティング配列が、前記の標的遺伝子の発現を該標的遺伝子との相同組換えにより阻害し、リガンド誘導されたコンホメーション変化に依存した様式で、レコンビナーゼの基質になる、請求項42に記載の方法。
- 細胞内の分析物の量を測定する方法であって、下記を含む当該方法:
(i)レポーター遺伝子にハイブリダイズすることができて該レポーター遺伝子の発現を調節するターゲティング配列を含むトランス作用性核酸、及び該分析物に結合するアプタマー配列を供給し、該分析物の該アプタマーへの結合は、コンホメーション変化を該トランス作用性核酸に誘導し、該トランス作用性核酸は、該レポーター遺伝子の発現を、該分析物の濃度に依存する様式で調節し、
(ii)該レポーター遺伝子の発現量を測定し;そして
(iii)該レポーター遺伝子の発現量を分析物の量と相関させ、それにより、細胞内のリガンドの量を測定する。 - 条件付き遺伝子ネットワークを細胞において確立する方法であって、下記を含む当該方法:
(i)標的遺伝子の活性を変調するエフェクタードメインと、標的遺伝子の量又は活性を変調するシグナリング経路と無関係のリガンドに結合するアプタマードメインを含む核酸を供給し、リガンドのアプタマードメインへの結合が、核酸におけるコンホメーション変化を引き起こし、それが、エフェクタードメインの、標的遺伝子の活性を変調する能力を変え;そして
(ii)その細胞を、標的遺伝子の活性を変調するのに十分な量の核酸と接触させ、それにより、条件付き遺伝子ネットワークを確立する。 - 病原性因子による感染を治療し又は予防する方法であって、該方法は、患者に、下記を含む十分量のトランス作用性核酸を投与することを含み:
(i)病原体又は患者の標的遺伝子にハイブリダイズすることができて、該標的遺伝子の発現を調節するターゲティング配列(該標的遺伝子は、病原体による感染の維持、統合、再現、毒性又は拡大に必須である);及び
(ii)リガンドに結合するアプタマー配列(該リガンドの濃度は、該病原体の存在に依存する)、
ここに、該リガンドの該アプタマーへの結合が、該核酸にコンホメーション変化を誘導し、該核酸は、該標的遺伝子の発現を、リガンド誘導されたコンホメーション変化に依存する様式で調節して、該病原体による感染を低減させ又は阻止する当該方法。 - 患者の細胞における、細胞の成長、分化又は生存力の表現型の調節を引き起こす方法であって、該方法は、該患者の細胞に、下記:
(i)該患者の細胞中の標的遺伝子にハイブリダイズすることができて、該標的遺伝子の発現を調節するターゲティング配列(該標的遺伝子の発現は、細胞の成長、分化又は生存力を変化させる);及び
(ii)リガンドに結合するアプタマー配列(該リガンドの濃度は、細胞の表現型に依存する)、
を含むトランス作用性核酸を導入することを含み、
ここに、該リガンドの該アプタマーへの結合が、該核酸におけるコンホメーション変化を誘導し、該核酸は、該標的遺伝子の発現を、細胞の成長、分化又は生存力を該リガンドの非存在下と比較して変えるように、リガンド誘導されたコンホメーション変化に依存する様式で調節する当該方法。 - 細胞死を、前記のリガンドの存在に依存する様式で誘導するために利用される、請求項51に記載の方法。
- 細胞死を、前記のリガンドの存在に依存する様式で防止するために利用される、請求項51に記載の方法。
- 分化を、前記のリガンドの存在に依存する様式で誘導するために利用される、請求項51に記載の方法。
- 分化を、前記のリガンドの存在に依存する様式で阻止するために利用される、請求項51に記載の方法。
- 過形成又は腫瘍細胞の成長を防止するために利用する、請求項51、52又は54に記載の方法。
- 患者における脂肪細胞を低減させるために利用される、請求項51、52又は54に記載の方法。
- 幹細胞の成長及び分化を調節するために利用する、請求項51、54又は55に記載の方法。
- 免疫応答の活性化を調節するために利用される、請求項51に記載の方法。
- 前記のトランス作用性核酸、又は該トランス作用性核酸を転写するための発現構築物を、前記の患者に移植される細胞に、エキソ・ビボで導入する、請求項51、58又は59に記載の方法。
- 請求項1〜4の何れかに記載の核酸又は請求項36に記載の発現構築物、及びヒト又は非ヒト患者への投与に適した製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬製剤組成物。
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