KR20220151183A - 하이브리드화 연쇄 반응을 통한 샘플 내의 표적 분자의 분석 - Google Patents
하이브리드화 연쇄 반응을 통한 샘플 내의 표적 분자의 분석 Download PDFInfo
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Abstract
본원은 하이브리드화 연쇄 반응(HCR)을 이용하여 샘플을 분석하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태는 하기 측면들 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 이용한다: 1) 반복된 신호 검출, 2) 중첩 결합 부위, 및 3) 촉매 리포터 침착(CARD). 이와 관련된 조성물 및 키트도 제공한다.
Description
연방 지원 R&D에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원에 의해 부여된 승인번호 R01EB006192 및 DARPA로부터의 승인번호 HR0011-17-2-0008 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.
관련 출원의 우선권 및 교차참조
본원은 전체로서 본원에 참고로 포함되는, 2020년 3월 6일자로 출원된 미국 가출원 제62/986,436호를 우선권 주장한다.
전자 서열목록의 참조
본원은 전자 서열목록과 함께 출원되었다. 전자 서열목록은 2021년 3월 4일자로 생성된, 1,341 바이트 크기의 MOINS007WOSEQLIST.txt로 명명된 파일로서 제공된다. 전자 서열목록의 정보는 전체로서 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 발명은 일반적으로 하이브리드화 연쇄 반응에 관한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
하이브리드화 연쇄 반응(HCR)은 준안정한 헤어핀 단량체 또는 다른 준안정한 핵산 구조물로부터 시작되는 핵산 분자의 하이브리드화를 유발하는 방법이다. HCR은 어떠한 효소도 요구하지 않고 등온에서 작동할 수 있다.
HCR은 2개 이상의 준안정한 헤어핀 단량체를 이용할 수 있다. 헤어핀 단량체는 하나 이상의 단일 가닥 토홀드(toehold), 단일 가닥 루프(loop) 및 이중 가닥 스템(stem)을 각각 가진다. 자가조립 캐스케이드를 유도하는 에너지는 헤어핀의 단일 가닥 루프와 토홀드 분절에 저장된다.
각각의 단량체는 동역학 트랩에 걸려, 시스템이 빠르게 평형화되는 것을 방해한다. 즉, 단량체 쌍은 개시제(initiator)의 부재 하에 서로 하이브리드화할 수 없다. 개시제 가닥의 도입은 단량체가 하이브리드화 이벤트의 연쇄 반응을 거쳐 닉킹(nicking)된 이중 가닥 중합체를 형성하게 한다. 예를 들어, HCR은 HCR 신호 증폭을 유발하는, HCR 개시제를 보유하는 개시제-표지된 프로브로 피분석물을 검출함으로써 샘플에서 관심 있는 피분석물의 존재를 검출하는 데 이용될 수 있다. HCR 신호 증폭은 신호를 샘플로부터 비롯된 배경보다 더 높은 수준으로 증강시킴으로써 분자 검출 및 영상화 적용을 위한 신호 대 배경 비를 증가시키는 것을 가능하게 한다.
본원에서 제공된 일부 실시양태는 분획 개시제를 각각 포함하는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 포함하는 프로브 유닛을 사용하여 훨씬 더 큰 신호 대 배경 비를 제공한다. 개별 분획 개시제 프로브가 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 경우, 이 프로브는 HCR을 유발하지 않는다. 그러나, 이 프로브가 그의 동족 표적에 특이적으로 결합하는 경우, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 공국소화되어 전체 HCR 개시제를 형성함으로써, HCR 신호 증폭의 유발을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 개시제를 표적의 존재 하에만 효과적으로 공국소화하는 2개 이상의 분획 개시제로 분리하는 것은 검출 단계 동안 자동 배경 억제를 제공한다. 증폭 동안 HCR에 의해 제공된 자동 배경 억제와 조합될 때, 이 과정은 프로토콜 전체에 걸쳐 자동 배경 억제를 제공한다(예를 들어, 개별 프로브 또는 개별 헤어핀 단량체인 시약이 샘플에서 결합하는 경우, 이것은 증폭된 배경의 생성으로 이어지지 않을 것이다).
본원에서 제시된 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 각각 포함하는 2개의 분획 개시제 프로브를 포함하고, 이때 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 인접 결합 부위에 결합하여 전체 HCR 개시제를 공국소화하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 인접 결합 부위에 결합하여 HCR 신호 증폭을 유발하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 표적, 분획 개시제 프로브 및/또는 HCR 헤어핀 사이의 연접부는 에너지 면에서 유리하지 않다. 일부 실시양태에서, 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역을 구성하고/하거나, HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 하이브리드화하도록 프로브 유닛 내의 분획 개시제를 구성함으로써, 상기 연접부는 에너지 면에서 더 유리한 입체구조로 이완하여, HCR 신호 증폭의 강도를 증가시킬 수 있다.
본원에서 제공된 일부 실시양태에서, 하나 이상의 HCR 신호를 생성하고, 하나 이상의 HCR 신호를 검출하고, 하나 이상의 HCR 신호를 제거하고, 이 단계들 중 하나 이상을 반복함으로써, 샘플에서 하나 이상의 표적을 분석할 수 있다.
본원에서 제공된 일부 실시양태에서, HCR 신호 증폭을 이용하여 촉매 리포터(reporter) 침착(CARD)을 매개하여, 훨씬 더 높은 신호 획득을 유발하고 조절 목적을 위해 염색된 샘플의 장기간 보관 저장을 허용한다.
일부 실시양태에서, 리포터-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; N개의 프로브 세트 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 상기 단계들 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다. 프로브 세트는 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. HCR 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함한다. 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋(input) 도메인을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋(output) 도메인을 추가로 포함한다. HCR 헤어핀은 리포터를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 리포터-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 하나 이상의 리포터로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 및 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계를 포함한다. 프로브 세트는 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. HCR 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함한다. 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다. HCR 헤어핀은 하나 이상의 리포터를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트를 제공하는 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) N개의 상이한 기질 중 M개의 상이한 기질에 상응하는 M개의 표지 프로브(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; (g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (h) M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; (i) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및 (j) 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (f) 내지 (i) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다. 프로브 세트는 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. HCR 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함한다. 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다. HCR 헤어핀은 기질을 추가로 포함한다. 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 리포터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; d) 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; (g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (h) 하나 이상의 리포터에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; (i) 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계; 및 (j) 임의적으로 단계 (b) 내지 (i) 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계를 포함한다. 프로브 세트는 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. HCR 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함한다. 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다. HCR 헤어핀은 기질을 추가로 포함한다. 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 리포터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 레포터 및/또는 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계; 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 및 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계를 포함한다. 프로브 세트는 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. HCR 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함한다. 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다. HCR 헤어핀은 하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질을 추가로 포함한다. 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 하나 이상의 리포터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 리포터 및/또는 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 (c) 내지 (g) 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 수행하는 단계; i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트를 제공하는 단계; 하나 이상의 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성하는 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 및 임의적으로 하나 이상의 신호를 제거하는 단계를 포함하고, 이때 프로브 세트는 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. HCR 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함한다. 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다. HCR 헤어핀은 하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 중첩 결합 부위를 이용하는 HCR 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 및 리포터로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성된다. HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다. HCR 헤어핀은 리포터 및/또는 기질을 추가로 포함한다. 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 리포터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중첩 결합 부위를 이용하는 HCR 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 및 리포터로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성된다. HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다. HCR 헤어핀은 리포터 및/또는 기질을 추가로 포함한다. 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 리포터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 반복된 신호 검출과 함께 중첩 결합 부위를 이용하는 HCR 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 하나 이상의 리포터 및/또는 기질로 각각 표지된 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 하나 이상의 리포터로부터 신호를 검출하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 증폭제를 제거하는 단계; 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 및 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계를 포함한다. 프로브 세트는 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. HCR 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함한다. 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성된다. 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성된다. HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다. HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다. HCR 헤어핀은 하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질을 추가로 포함한다. 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 하나 이상의 리포터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브; 제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브; 제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인, 제1 헤어핀 루프 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인, 및 제1 합텐 분자를 포함하는 제1 헤어핀 단량체; 제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인, 제2 헤어핀 루프 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인, 및 제2 합텐 분자를 포함하는 제2 헤어핀 단량체; 및 표적 분자를 제공하는 단계; 및 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 표적과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 개시제를 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브; 제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인, 제1 헤어핀 루프 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인, 및 제1 합텐 분자를 포함하는 제1 헤어핀 단량체; 제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인, 제2 헤어핀 루프 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인, 및 제2 합텐 분자를 포함하는 제2 헤어핀 단량체; 및 표적 분자를 제공하는 단계; 및 하나 이상의 개시제를 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 표적과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브; 제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브; 제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인, 제1 헤어핀 루프 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인, 및 기질을 포함하는 제1 헤어핀 단량체; 제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인, 제2 헤어핀 루프 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인, 및 기질을 포함하는 제2 헤어핀 단량체; 및 표적 분자를 제공하는 단계; 및 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 표적과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브; 제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브; 제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인, 제1 헤어핀 루프 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인, 및 제1 분획 기질을 포함하는 제1 헤어핀 단량체; 제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인, 제2 헤어핀 루프 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인, 및 제2 분획 기질을 포함하는 제2 헤어핀 단량체; 및 표적 분자를 제공하는 단계; 및 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 표적 분자와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
도 1a 및 1b는 하이브리드화 연쇄 반응(HCR)을 통한 제자리 증폭의 일부 실시양태를 도시한다.
도 2a 및 2b는 2-단계 또는 3-단계 프로토콜을 이용하는 제자리 HCR의 개략도를 도시한다.
도 3a 및 3b는 2개의 인접 표적 구획과, 이들 인접 표적 구획에 하이브리드화하여 2개의 분획 개시제를 공국소화하는 2개의 분획 개시제 프로브에 대한 일부 배열을 도시한다.
도 4a 내지 도 4d는 표적 분자에 의해 공국소화된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 5a 내지 5e는 표적 복합체에 의해 공국소화된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 6은 최적화되지 않은 표준 프로브 및 분획 개시제 프로브를 사용하여 전체 표본고정(whole-mount) 닭 배아에서 표적 mRNA를 영상화한 것을 도시한다.
도 7a 내지 도 7c는 표적에 의해 공국소화된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시하고 표적에 의해 공국소화된 분획 개시제 프로브를 사용하여 HCR을 유발하는 것을 입증하는 시험 튜브 데이터를 표시한다.
도 8a 및 8b는 분획 개시제 프로브를 사용하는 제자리 HCR의 일부 실시양태를 도시한다.
도 9a 내지 9d는 표준 프로브 및 분획 개시제 프로브를 사용하여 배경 및 신호 대 배경을 도시한다.
도 10a 내지 10d는 프로브 세트 최적화 없이 분획 개시제 프로브를 사용하여 고정된 전체 표본고정 닭 배아에서 높은 신호 대 배경으로 mRNA 발현을 다중화 영상화한 것을 도시한다.
도 11a 및 11b는 분획 개시제 프로브를 사용하여 고정된 전체 표본고정 닭 배아에서 아세포(subcellular) 해상도로 mRNA 발현을 정량적으로 영상화한 것을 도시한다.
도 12는 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브와 표적 분자의 하이브리드화의 일부 실시양태를 도시한다.
도 13은 HCR 개시제에 의해 개시될 때 헤어핀 단량체로부터 HCR 증폭 중합체의 유발된 자가조립의 일부 실시양태를 도시한다. 도 13에서 1050은 두 부분으로부터 전체 개시제를 도시한다. 분획 개시제 프로브의 일부만이 도시되어 있다. I1(1050)은 표적에 의해 공국소화된 2개의 분획 개시제 프로브에 의해 형성된 전체 개시제를 나타낸다.
도 14는 HCR 개시제에 의해 유발된, 헤어핀 단량체를 사용한 HCR 증폭의 일부 실시양태를 도시한다. 분획 개시제 프로브의 일부만이 도시되어 있다. I1은 표적에 의해 공국소화된 2개의 분획 개시제 프로브에 의해 형성된 전체 개시제를 나타낸다.
도 15는 단순화된 HCR 헤어핀 단량체를 사용하는 HCR 기작의 일부 실시양태를 도시한다.
도 16a 내지 16d는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고 임의적으로 하나 이상의 헬퍼 프로브를 포함하는 프로브 세트의 일부 실시양태를 도시한다.
도 17a 내지 17c는 분획 개시제 프로브를 포함하는 프로브 유닛의 일부 실시양태를 도시한다.
도 18a 내지 18f는 HCR 증폭제의 일부 실시양태를 도시한다.
도 19a 및 19b는 4개의 HCR 헤어핀을 포함하는 HCR 증폭제의 일부 실시양태를 도시한다.
도 20a 내지 20f는 표지 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 21a 및 21b는 HCR 헤어핀의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 22는 표적의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 23a 내지 23o는 샘플로부터 HCR 신호를 제거하는 일부 실시양태를 도시한다. 일부 실시양태에서, 방법의 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 도 23a 내지 23o 및 도 40a 내지 40n의 다른 방법과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도 23a 내지 23o의 방법의 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 도 26a 내지 26t 및 도 40a 내지 40n의 다른 방법과 조합될 수 있다.
도 24a 및 24b는 HCR 헤어핀의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인된 분획 개시제 프로브를 사용하여 HCR 신호 강도를 증가시키는 일부 실시양태를 도시한다.
도 25a 및 25b는 배양된 인간 세포에서 반복된 리포터 검출을 통한 다중화 제자리 하이브리드화의 일부 실시양태를 도시한다.
도 26a 내지 26t는 HCR 증폭제와 함께 HCR 개시제-표지된 프로브 및/또는 HCR 분획 개시제 프로브를 사용하여 샘플에서 하나 이상의 표적을 검출하는 다양한 방법들의 일부 실시양태를 도시한다. 일부 실시양태에서, 방법의 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 도 26a 내지 26t의 다른 방법과 조합될 수 있다.
도 27은 HCR 헤어핀의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인되고 표적의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 28a 내지 28c는 분획 개시제 HCR 억제(OFF 상태) 및 전환(ON 상태)을 향상시키기 위한 협력적 프로브 연접부의 시험관내 최적화의 예의 일부 실시양태를 도시한다.
도 29a 내지 29d는 개시제-표지된 1차 항체 프로브를 사용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 마우스 뇌 박편에서 단백질 표적을 영상화하는 다중화 HCR 면역조직화학의 일부 실시양태를 도시한다.
도 30a 내지 30d는 표지되지 않은 1차 항체 프로브 및 개시제-표지된 2차 항체 프로브를 사용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 마우스 뇌 박편에서 단백질 표적을 영상화하는 다중화 HCR 면역조직화학의 일부 실시양태를 도시한다.
도 31a 내지 31c는 mRNA 표적에 대한 DNA 분획 개시제 프로브 및 단백질 표적에 대한 개시제-표지된 1차 항체 프로브를 사용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 마우스 뇌 박편에서 HCR RNA 제자리 하이브리드화 및 단백질 면역조직화학을 동시에 수행하는 일부 실시양태를 도시하는데, 이때 HCR 신호 증폭은 모든 표적들에 대해 동시적으로 수행된다.
도 32a 내지 32c는 mRNA 표적에 대한 DNA 분획 개시제 프로브, 및 단백질 표적에 대한 표지되지 않은 1차 항체 프로브 및 개시제-표지된 2차 항체 프로브를 사용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 마우스 뇌 박편에서 HCR RNA 제자리 하이브리드화 및 단백질 면역조직화학을 동시에 수행하는 일부 실시양태를 도시하는데, 이때 HCR 신호 증폭은 모든 표적들에 대해 동시적으로 수행된다.
도 33a 내지 33e는 다양한 표적 유형들에 대한 CARD 신호 증폭을 매개하기 위해 HCR을 이용하는 일부 실시양태를 도시한다.
도 34a 내지 34c는 일반적인 표적 분자 및 표적 복합체에 대한 CARD 신호 증폭을 매개하기 위해 HCR을 이용하는 일부 실시양태를 도시한다.
도 35는 HCR CARD 신호 증폭과 관련하여 합텐의 배치에 대한 일부 실시양태를 도시한다.
도 36a 및 36b는 기질-표지된 또는 분획-기질 HCR 헤어핀을 사용하는 HCR CARD 신호 증폭의 일부 실시양태를 도시한다.
도 37a 및 37b는 HCR 매개 CARD 신호 증폭을 이용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 인간 신장 및 간 박편에서 RNA 표적을 영상화하는 일부 실시양태를 도시한다.
도 38은 표적 분자 또는 표적 복합체에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 공국소화된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 39a 내지 39n은 표적 분자 또는 표적 복합체에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 개시제-표지된 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 40a 내지 40n은 샘플로부터 HCR 신호를 제거하는 일부 실시양태를 도시한다. 일부 실시양태에서, 방법의 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 도 23a 내지 23o 및 도 40a 내지 40n의 다른 방법과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도 40a 내지 도 40n의 방법의 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 도 23a 내지 23o 및 도 26a 내지 26t의 다른 방법과 조합될 수 있다.
도 41a 내지 41c는 분획 개시제 프로브를 사용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 마우스 뇌 박편에서 아세포 해상도로 mRNA 발현을 정량적으로 영상화하는 일부 실시양태를 도시한다.
도 42a 내지 42f는 하나 이상의 HCR 개시제를 포함하는 개시제-표지된 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 43a 내지 43c는 개시제-표지된 프로브를 사용하여 전체 표본고정 제브라피쉬 배아에서 표적 microRNA 및 mRNA를 영상화하는 일부 실시양태를 도시한다.
도 44a 내지 44z는 하나 이상의 차폐된 HCR 개시제를 포함하는 차폐된 개시제-표지된 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 45a 및 45b는 배경을 감소시키기 위해 차폐된 개시제-표지된 프로브를 사용하는 예의 일부 실시양태를 도시한다.
도 46a 내지 46m은 차폐된 개시제-표지된 프로브와 관련하여 사용하기 위한 차폐된 개시제의 일부 실시양태를 도시한다.
도 47은 도 25a의 HCR 중합체로부터 HCR 헤어핀을 탈하이브리드화하는 데 사용된 서열의 실시양태를 보여준다(표 2).
도 2a 및 2b는 2-단계 또는 3-단계 프로토콜을 이용하는 제자리 HCR의 개략도를 도시한다.
도 3a 및 3b는 2개의 인접 표적 구획과, 이들 인접 표적 구획에 하이브리드화하여 2개의 분획 개시제를 공국소화하는 2개의 분획 개시제 프로브에 대한 일부 배열을 도시한다.
도 4a 내지 도 4d는 표적 분자에 의해 공국소화된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 5a 내지 5e는 표적 복합체에 의해 공국소화된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 6은 최적화되지 않은 표준 프로브 및 분획 개시제 프로브를 사용하여 전체 표본고정(whole-mount) 닭 배아에서 표적 mRNA를 영상화한 것을 도시한다.
도 7a 내지 도 7c는 표적에 의해 공국소화된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시하고 표적에 의해 공국소화된 분획 개시제 프로브를 사용하여 HCR을 유발하는 것을 입증하는 시험 튜브 데이터를 표시한다.
도 8a 및 8b는 분획 개시제 프로브를 사용하는 제자리 HCR의 일부 실시양태를 도시한다.
도 9a 내지 9d는 표준 프로브 및 분획 개시제 프로브를 사용하여 배경 및 신호 대 배경을 도시한다.
도 10a 내지 10d는 프로브 세트 최적화 없이 분획 개시제 프로브를 사용하여 고정된 전체 표본고정 닭 배아에서 높은 신호 대 배경으로 mRNA 발현을 다중화 영상화한 것을 도시한다.
도 11a 및 11b는 분획 개시제 프로브를 사용하여 고정된 전체 표본고정 닭 배아에서 아세포(subcellular) 해상도로 mRNA 발현을 정량적으로 영상화한 것을 도시한다.
도 12는 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브와 표적 분자의 하이브리드화의 일부 실시양태를 도시한다.
도 13은 HCR 개시제에 의해 개시될 때 헤어핀 단량체로부터 HCR 증폭 중합체의 유발된 자가조립의 일부 실시양태를 도시한다. 도 13에서 1050은 두 부분으로부터 전체 개시제를 도시한다. 분획 개시제 프로브의 일부만이 도시되어 있다. I1(1050)은 표적에 의해 공국소화된 2개의 분획 개시제 프로브에 의해 형성된 전체 개시제를 나타낸다.
도 14는 HCR 개시제에 의해 유발된, 헤어핀 단량체를 사용한 HCR 증폭의 일부 실시양태를 도시한다. 분획 개시제 프로브의 일부만이 도시되어 있다. I1은 표적에 의해 공국소화된 2개의 분획 개시제 프로브에 의해 형성된 전체 개시제를 나타낸다.
도 15는 단순화된 HCR 헤어핀 단량체를 사용하는 HCR 기작의 일부 실시양태를 도시한다.
도 16a 내지 16d는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고 임의적으로 하나 이상의 헬퍼 프로브를 포함하는 프로브 세트의 일부 실시양태를 도시한다.
도 17a 내지 17c는 분획 개시제 프로브를 포함하는 프로브 유닛의 일부 실시양태를 도시한다.
도 18a 내지 18f는 HCR 증폭제의 일부 실시양태를 도시한다.
도 19a 및 19b는 4개의 HCR 헤어핀을 포함하는 HCR 증폭제의 일부 실시양태를 도시한다.
도 20a 내지 20f는 표지 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 21a 및 21b는 HCR 헤어핀의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 22는 표적의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 23a 내지 23o는 샘플로부터 HCR 신호를 제거하는 일부 실시양태를 도시한다. 일부 실시양태에서, 방법의 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 도 23a 내지 23o 및 도 40a 내지 40n의 다른 방법과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도 23a 내지 23o의 방법의 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 도 26a 내지 26t 및 도 40a 내지 40n의 다른 방법과 조합될 수 있다.
도 24a 및 24b는 HCR 헤어핀의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인된 분획 개시제 프로브를 사용하여 HCR 신호 강도를 증가시키는 일부 실시양태를 도시한다.
도 25a 및 25b는 배양된 인간 세포에서 반복된 리포터 검출을 통한 다중화 제자리 하이브리드화의 일부 실시양태를 도시한다.
도 26a 내지 26t는 HCR 증폭제와 함께 HCR 개시제-표지된 프로브 및/또는 HCR 분획 개시제 프로브를 사용하여 샘플에서 하나 이상의 표적을 검출하는 다양한 방법들의 일부 실시양태를 도시한다. 일부 실시양태에서, 방법의 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 도 26a 내지 26t의 다른 방법과 조합될 수 있다.
도 27은 HCR 헤어핀의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인되고 표적의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 28a 내지 28c는 분획 개시제 HCR 억제(OFF 상태) 및 전환(ON 상태)을 향상시키기 위한 협력적 프로브 연접부의 시험관내 최적화의 예의 일부 실시양태를 도시한다.
도 29a 내지 29d는 개시제-표지된 1차 항체 프로브를 사용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 마우스 뇌 박편에서 단백질 표적을 영상화하는 다중화 HCR 면역조직화학의 일부 실시양태를 도시한다.
도 30a 내지 30d는 표지되지 않은 1차 항체 프로브 및 개시제-표지된 2차 항체 프로브를 사용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 마우스 뇌 박편에서 단백질 표적을 영상화하는 다중화 HCR 면역조직화학의 일부 실시양태를 도시한다.
도 31a 내지 31c는 mRNA 표적에 대한 DNA 분획 개시제 프로브 및 단백질 표적에 대한 개시제-표지된 1차 항체 프로브를 사용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 마우스 뇌 박편에서 HCR RNA 제자리 하이브리드화 및 단백질 면역조직화학을 동시에 수행하는 일부 실시양태를 도시하는데, 이때 HCR 신호 증폭은 모든 표적들에 대해 동시적으로 수행된다.
도 32a 내지 32c는 mRNA 표적에 대한 DNA 분획 개시제 프로브, 및 단백질 표적에 대한 표지되지 않은 1차 항체 프로브 및 개시제-표지된 2차 항체 프로브를 사용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 마우스 뇌 박편에서 HCR RNA 제자리 하이브리드화 및 단백질 면역조직화학을 동시에 수행하는 일부 실시양태를 도시하는데, 이때 HCR 신호 증폭은 모든 표적들에 대해 동시적으로 수행된다.
도 33a 내지 33e는 다양한 표적 유형들에 대한 CARD 신호 증폭을 매개하기 위해 HCR을 이용하는 일부 실시양태를 도시한다.
도 34a 내지 34c는 일반적인 표적 분자 및 표적 복합체에 대한 CARD 신호 증폭을 매개하기 위해 HCR을 이용하는 일부 실시양태를 도시한다.
도 35는 HCR CARD 신호 증폭과 관련하여 합텐의 배치에 대한 일부 실시양태를 도시한다.
도 36a 및 36b는 기질-표지된 또는 분획-기질 HCR 헤어핀을 사용하는 HCR CARD 신호 증폭의 일부 실시양태를 도시한다.
도 37a 및 37b는 HCR 매개 CARD 신호 증폭을 이용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 인간 신장 및 간 박편에서 RNA 표적을 영상화하는 일부 실시양태를 도시한다.
도 38은 표적 분자 또는 표적 복합체에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 공국소화된 분획 개시제 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 39a 내지 39n은 표적 분자 또는 표적 복합체에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 개시제-표지된 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 40a 내지 40n은 샘플로부터 HCR 신호를 제거하는 일부 실시양태를 도시한다. 일부 실시양태에서, 방법의 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 도 23a 내지 23o 및 도 40a 내지 40n의 다른 방법과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도 40a 내지 도 40n의 방법의 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 도 23a 내지 23o 및 도 26a 내지 26t의 다른 방법과 조합될 수 있다.
도 41a 내지 41c는 분획 개시제 프로브를 사용하여, 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된 마우스 뇌 박편에서 아세포 해상도로 mRNA 발현을 정량적으로 영상화하는 일부 실시양태를 도시한다.
도 42a 내지 42f는 하나 이상의 HCR 개시제를 포함하는 개시제-표지된 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 43a 내지 43c는 개시제-표지된 프로브를 사용하여 전체 표본고정 제브라피쉬 배아에서 표적 microRNA 및 mRNA를 영상화하는 일부 실시양태를 도시한다.
도 44a 내지 44z는 하나 이상의 차폐된 HCR 개시제를 포함하는 차폐된 개시제-표지된 프로브의 일부 실시양태를 도시한다.
도 45a 및 45b는 배경을 감소시키기 위해 차폐된 개시제-표지된 프로브를 사용하는 예의 일부 실시양태를 도시한다.
도 46a 내지 46m은 차폐된 개시제-표지된 프로브와 관련하여 사용하기 위한 차폐된 개시제의 일부 실시양태를 도시한다.
도 47은 도 25a의 HCR 중합체로부터 HCR 헤어핀을 탈하이브리드화하는 데 사용된 서열의 실시양태를 보여준다(표 2).
하이브리드화 연쇄 반응(HCR)은 준안정한 헤어핀 단량체 또는 다른 준안정한 핵산 구조물로부터 시작되는 핵산 분자의 하이브리드를 유발하는 방법이다. 예를 들어, 전체로서 본원에 참고로 각각 포함되는 문헌[Dirks, R. and Pierce, N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(43): 15275-15278 (2004)]; 2005년 3월 22일자로 출원된 미국 특허출원 제11/087,937호; 2012년 1월 31일자로 출원된 미국 특허 제8,105,778호; 2013년 8월 13일자로 출원된 미국 특허 제8,507,204호; 및 2017년 6월 30일자로 출원된 미국 특허출원 공개 제2018/0010166호를 참조한다. 이 방법의 간단한 버전에서, 준안정한 헤어핀 단량체는 핵산 개시제 가닥에 의해 유발될 때 하이브리드화 이벤트의 연쇄 반응을 거쳐 닉킹된 이중 가닥 중합체를 형성한다. 헤어핀 단량체는 중합 과정을 유도하는 에너지를 그의 단일 가닥 루프와 토홀드에 저장한다.
HCR은 2개 이상의 준안정한 헤어핀 단량체를 이용할 수 있다. 헤어핀 단량체는 하나 이상의 단일 가닥 토홀드, 단일 가닥 루프 및 이중 가닥 스템을 각각 가진다. 자가조립 캐스케이드를 유도하는 에너지는 헤어핀의 단일 가닥 루프와 토홀드 분절에 저장된다.
각각의 단량체는 동역학 트랩에 잡혀, 시스템이 빠르게 평형화하는 것을 방해한다. 즉, 단량체 쌍은 개시제의 부재 하에 서로 하이브리드화할 수 없다. 개시제 가닥의 도입은 단량체가 하이브리드화 이벤트의 연쇄 반응을 거쳐, 닉킹된 이중 가닥 중합체를 형성하게 한다. HCR은 예를 들어, HCR 신호 증폭을 유발하는, HCR 개시제를 보유하는 프로브로 피분석물을 검출함으로써 샘플에서 관심 있는 피분석물의 존재를 검출하는 데 이용될 수 있다. HCR 신호 증폭은 신호를 샘플로부터 비롯된 배경보다 더 높은 수준으로 증강시킴으로써 분자 검출 및 영상화 적용을 위한 신호 대 배경 비를 증가시키는 것을 가능하게 한다.
본원은 HCR의 실시양태를 제공한다. 하이브리드화 연쇄 반응(HCR)을 이용하여 샘플을 분석하는 방법은 하기 측면들 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 이용할 수 있다: 1) 반복된 신호 검출, 2) 중첩 결합 부위, 및 3) 촉매 리포터 침착(CARD).
방법의 일부 실시양태에서, N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유할 수 있는 샘플은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)와 조합된다. N개의 프로브 세트 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우, 상이한 리포터로 각각 표지됨)가 첨가된다. 그 후, M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호가 검출된다. 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 이 방법의 단계가 반복된다.
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유할 수 있는 샘플은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트와 조합된다. 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터로 각각 표지됨)가 첨가되고 하나 이상의 리포터로부터 하나 이상의 신호가 검출된다.
방법의 일부 실시양태에서, N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유할 수 있는 샘플은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트와 조합된다. N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨), 및 N개의 상이한 기질 중 M개의 상이한 기질에 상응하는 M개의 표지 프로브(M≤ N인 경우, 상이한 리포터에 각각 접합됨)가 첨가된다. 그 후, M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호가 검출된다. 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 이 방법의 단계가 반복된다. 일부 실시양태에서, 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 기질-표지된 헤어핀을 포함하고, 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유할 수 있는 샘플은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트; 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(기질로 각각 표지됨); 및 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(리포터에 각각 접합됨)와 조합된다. 그 후, 하나 이상의 리포터에 상응하는 하나 이상의 신호가 검출된다. 방법의 단계는 임의의 순서로 1회 이상 반복된다.
리포터 및/또는 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유할 수 있는 샘플은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트; 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질로 각각 표지됨); 및 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)와 조합된다. 그 후, 하나 이상의 신호가 검출된다. 방법의 단계는 임의의 순서로 반복된다.
리포터 및/또는 기질-표지된 헤어핀을 사용하여 신호를 반복 검출하는 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유할 수 있는 샘플은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트와 조합된다. 검출되는 하나 이상의 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성하는 하나 이상의 HCR 증폭제가 첨가된다. 방법의 단계는 임의의 순서로 1회 이상 수행될 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유할 수 있는 샘플은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트와 조합된다. 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성된다. 그 후, 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제 및 기질에 상응하는 임의적 표지 프로브(리포터에 접합됨)가 첨가되고, 리포터로부터 신호가 검출된다. 일부 실시양태에서, 증폭제를 리포터로 표지하여, 프로브의 표지를 임의적 표지로 만들 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유할 수 있는 샘플은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트와 조합된다. 각각의 프로브 유닛 내 프로브의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성된다. 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제 및 기질에 상응하는 임의적 표지 프로브(리포터에 접합됨)가 첨가된다. 그 후, 리포터로부터 신호가 검출된다. 일부 실시양태에서, 증폭제를 리포터로 표지하여, 프로브의 표지를 임의적 표지로 만들 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유할 수 있는 샘플은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트와 조합된다. 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성된다. 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성된다. 하나 이상의 리포터 및/또는 기질로 각각 표지된 하나 이상의 HCR 증폭제, 및 (임의로) 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 임의적 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)가 첨가된다. 하나 이상의 리포터로부터 신호가 검출된다. 방법의 단계는 임의의 순서로 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 증폭제를 리포터로 표지하여, 프로브의 표지를 임의적 표지로 만들 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브, 제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브, 0개 또는 1개 이상의 합텐으로 표지된 제1 헤어핀 단량체, 0개 또는 1개 이상의 합텐으로 표지된 제2 헤어핀 단량체 및 표적 분자가 조합된다. 이것은 제1 분획 개시제 프로브와 표적 분자의 결합 및 제2 분획 개시제 프로브와 표적 분자의 결합을 야기한다. 제1 헤어핀 단량체는 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제 둘 다에 결합하고, 제2 헤어핀 단량체는 제1 헤어핀 단량체에 결합한다. 하나 이상의 리포터 물질로 표지된 항-합텐 분자가 제공된다. 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다. 하나 이상의 CARD-기질이 제공되고 CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호가 측정된다.
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 개시제를 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브, 0개 또는 1개 이상의 합텐으로 표지된 제1 헤어핀 단량체, 0개 또는 1개 이상의 합텐으로 표지된 제2 헤어핀 단량체, 및 0개 또는 1개 이상의 표적 분자가 조합된다. 이것은 하나 이상의 개시제를 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브와 0개 또는 1개 이상의 표적 분자의 결합을 야기한다. 제1 헤어핀 단량체는 하나 이상의 개시제에 결합하고, 제2 헤어핀 단량체는 제1 헤어핀 단량체에 결합한다. 하나 이상의 리포터 물질로 표지된 항-합텐 분자가 제공된다. 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다. 하나 이상의 CARD-기질이 제공되고, CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호가 측정된다.
방법의 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브, 제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브, 0개 또는 1개 이상의 기질을 포함하는 제1 헤어핀 단량체, 0개 또는 1개 이상의 기질을 포함하는 제2 헤어핀 단량체, 및 표적 분자가 조합된다. 이것은 제1 분획 개시제 프로브와 표적 분자의 결합 및 제2 분획 개시제 프로브와 표적 분자의 결합을 야기한다. 제1 헤어핀 단량체는 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제 둘 다에 결합하고, 제2 헤어핀 단량체는 제1 헤어핀 단량체에 결합한다. 하나 이상의 리포터 물질로 표지된 기질 결합 영역이 제공된다. 기질 결합 영역은 기질에 결합한다. 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다. 하나 이상의 CARD-기질이 제공되고, CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호가 측정된다.
방법의 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브, 제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브, 제1 분획 기질을 포함하는 제1 헤어핀 단량체, 제2 분획 기질을 포함하는 제2 헤어핀 단량체, 및 표적 분자가 조합된다. 이것은 제1 분획 개시제 프로브와 표적 분자의 결합 및 제2 분획 개시제 프로브와 표적 분자의 결합을 야기한다. 제1 헤어핀 단량체는 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제 둘 다에 결합하고, 제2 헤어핀 단량체는 제1 헤어핀 단량체에 결합하여, 제1 분획 기질 및 제2 분획 기질을 포함하는 전체 기질을 생성한다. 하나 이상의 리포터 물질로 표지된 기질 결합 영역이 첨가된다. 기질 결합 영역은 전체 기질에 결합한다. 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다. 하나 이상의 CARD-기질이 제공되고, CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호가 측정된다.
일부 실시양태에서, HCR 과정은 분획 HCR 과정일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브의 쌍 또는 세트는 그들 사이에 소량의 중첩을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시제는 HCR 헤어핀의 인풋 도메인보다 더 짧거나 길고/길거나 헤어핀의 인풋 도메인에 대한 불완전한 상보성을 갖지만, 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여 헤어핀을 개방하고 HCR 중합 캐스케이드를 개시할 수 있다. 본원에서 제공된 실시양태의 일부에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 영역(예를 들어, 1개 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 중첩되는 영역)에 상보적이거나, HCR 헤어핀에 실질적으로 상보적이다(예를 들어 0개, 1개, 2개, 몇몇 또는 몇 개의 불일치를 제외하고 상보적이다).
일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브의 개시제는 샘플로의 침투를 향상시키기 위해(신호를 증가시키기 위해), 그리고/또는 샘플 내에서 프로브의 비-특이적 결합을 감소시키기 위해(배경을 감소시키기 위해) 차폐될 수 있다.
일부 실시양태에서, HCR 과정은 촉매 리포터 침착(CARD)을 매개하는 효소를 포함하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 하는 기질을 포함할 수 있는 헤어핀 표지를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀 표지는 리포터 분자(또는 리포터 물질)에 접합된 표지 프로브가 개별 헤어핀의 분획 기질에 강하게 결합하지 않되, HCR 중합 후에 HCR 증폭 중합체의 인접 헤어핀이 전체 기질을 공국소화하여, 공국소화된 전체 기질이 리포터 분자(또는 CARD 신호 증폭을 매개하는 효소를 포함하는 리포터 물질)에 접합된 표지 프로브에 강하게 결합하도록 분획 기질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, HCR 과정은 촉매 리포터 침착(CARD)을 통한 신호 증폭의 추가 층을 매개하는 역할을 하는 하나 이상의 합텐(예를 들어, 도 33a 내지 33e, 34a 내지 34c, 35, 36a 및 36b 참조)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 리포터-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 (a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)를 제공하는 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) N개의 프로브 세트 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우, 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; (g) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및 (h) 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (b) 내지 (g) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 리포터-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 (a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; b) 하나 이상의 개시제를 각각 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)를 제공하는 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) N개의 프로브 세트 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우, 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; (g) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및 (h) 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (b) 내지 (g) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 리포터-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 (a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; b) 1) 하나 이상의 개시제를 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브 또는 2) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)를 제공하는 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) N개의 프로브 세트 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우, 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; (g) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및 (h) 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (b) 내지 (g) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)를 제공하는 단계; c) 샘플을 세척하는 단계; (d) N개의 프로브 세트 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우, 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; e) 샘플을 세척하는 단계; (f) M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; (g) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및 h) 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (b) 내지 (g) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) 하나 이상의 리포터로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; (g) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; (h) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; (i) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 및 (j) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계를 포함한다. 원하는 경우 과정(모든 단계 또는 서브세트)을 반복할 수 있다.
정의 및 실시양태
본원에서 사용된 "핵산"은 일부 형태의 DNA 및/또는 RNA의 올리고머를 포함한다. 핵산은 염기 또는 골격이 변형된 DNA 또는 RNA의 유사체도 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산은 펩타이드 핵산(PNA)의 사용을 포함한다. 용어 "핵산"은 키메라 분자도 포함한다. 이 용어는 인공 구축물 및 유도체 등을 포함한다. 상기 용어는 예를 들어, DNA, RNA, 2'OMe-RNA, LNA, XNA, 합성 핵산 유사체 및 PNA 중 어느 하나 이상을 포함한다.
용어 "스티키(sticky) 말단"은 상보적 핵산 서열에 하이브리드화하는 데 이용될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. "스티키 말단"의 2차 구조는 스티키 말단이 입체구조적 변화를 겪지 않으면서 적절한 반응 조건 하에 상보적 핵산에 하이브리드화하는 데 이용될 수 있도록 하는 구조이다. 전형적으로, 스티키 말단은 단일 가닥 핵산이다.
"단량체"는 개별 핵산 올리고머이다. 전형적으로, 적어도 2개의 단량체가 하이브리드화 연쇄 반응에 사용되지만, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 단량체가 사용될 수 있다. 전형적으로, 각각의 단량체는 HCR 반응에 사용되는 하나 이상의 다른 단량체에 상보적인 하나 이상의 영역을 포함한다.
조성물은 a) 제1 토홀드(1851) 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인(1852), b) 제1 헤어핀 루프(1853) 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인(1854), 및 c) 제1 리포터 분자(1850)를 포함하는 제1 헤어핀 단량체(1510)를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 13 참조). 조성물은 a) 제2 토홀드(1951) 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인(1952), b) 제2 헤어핀 루프(1953) 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인(1954), 및 c) 제2 리포터 분자(1950)를 포함하는 제2 헤어핀 단량체(1610)를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단량체는 "준안정"하다. 즉, 이 단량체는 개시제의 부재 하에 상보적 영역을 포함하는 다른 단량체와의 회합으로부터 동역학적으로 불리하다. "HCR" 단량체는 개시제 핵산에 노출될 때 조립되어 중합체를 형성할 수 있는 단량체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "중합"은 중합체를 형성하기 위한 2개 이상의 단량체의 회합을 지칭한다. "중합체"는 공유 결합, 비-공유 결합 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 2종의 단량체는 교대 패턴으로 하이브리드화하여, 닉킹된 이중 가닥 중합체를 포함하는 중합체를 형성할 수 있다. 중합체는 본원에서 "HCR 생성물"로서도 지칭된다.
"개시제-표지된 프로브"는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 HCR 개시제를 포함한다(예를 들어, 도 39a 내지 39n 및 42a 내지 42f).
"분획 개시제 프로브"는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 분획 개시제 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 3a 및 3b, 5a 내지 5e 및 38). 용어 "분획 개시제 프로브" 및 "분획-개시제 프로브"는 본원에서 사용된 바와 같이 교환 가능하다.
"전체 개시제"는 공국소화될 때 HCR 중합을 개시할 수 있는 2개 이상의 분획 개시제의 조합으로부터 비롯된다. 일부 개시제는 HCR 단량체의 개시제 상보체 영역에 상보적인 핵산 영역을 포함한다. 분획 개시제는 그 자체로는 HCR 중합을 유발하기에 불충분하지만, 하나(또는 그 이상)의 다른 분획 개시제와 함께 공국소화되어 전체 개시제를 형성할 때 HCR 중합을 유발할 수 있는 분획 개시제이다.
"프로브 유닛"은 프로브 유닛 내의 분획 개시제 프로브의 분획 개시제 도메인이 공국소화되어 전체 개시제를 생성할 수 있도록 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 포함한다.
표 1에서 하기 용어들은 본원에서 사용된 용어에 대한 대안적 옵션(문맥에 따라 범위가 달라질 수 있음)으로서 표시된다. 가장 넓은 용어의 개시내용은 본원에서 가장 넓은 개념뿐만 아니라 보다 더 좁은 개념도 의미한다. 이 접근법 및 표는 더 간결한 방식으로 두 옵션을 나타내기 위한 약어로서만 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "기질"은 1) 표지 프로브에서 기질 결합 영역에 대한 결합 부위로서 작용하는 헤어핀의 기질 도메인(예를 들어, 도 18c, 18e 및 36a에서 도메인 "e") 및 2) CARD 효소에 의해 매개된 침착된 리포터가 되는 CARD-기질(예를 들어, 도 33a 내지 33e, 34a 내지 34c, 36a 및 36b)을 의미할 수 있다. 혼동을 피하기 위해, 용법 (2)의 기질은 그 문맥상 용어 CARD가 "기질"에 부착되도록 "CARD-기질"로서 표시된다.
본원에서 사용된 단락 제목은 조직화를 위한 것일 뿐이고 기재된 보호대상을 임의의 방식으로 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 특허, 특허출원, 기사, 책, 논문 및 인터넷 웹 페이지를 포함하나 이들로 제한되지 않는, 본원에서 인용되고/되거나 기재된 모든 문헌 및 유사 자료는 임의의 목적을 위해 전체로서 명백히 참고로 포함된다. 포함된 참고문헌에 있는 용어의 정의가 본 교시에서 제공된 정의와 상이한 것으로 보일 때, 본 교시에서 제공된 정의가 우선할 것이다. 약간의 비실질적인 편차가 본원의 본 교시의 범위 내에 있도록, 본 교시에서 논의된 온도, 농도, 시간 등 앞에 내포된 "약"이 있음을 인식할 것이다. 본원에서 특별히 달리 언급하지 않는 한, 단수의 사용은 복수를 포함한다. 또한, "포함한다", "포함하고", "포함하는", "함유한다", "함유하고", "함유하는", "포괄한다", "포괄하고" 및 "포괄하는"의 사용은 제한하기 위한 것이 아니다. 상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 예시하고 설명하기 위한 것일 뿐이고 제한하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)]을 참조한다. 일반적인 설명 및 상세한 설명은 둘 다 예시하고 설명하기 위한 것일 뿐이고 청구된 본 발명을 제한하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 본원에서, 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 단수의 사용은 복수를 포함한다. 본원에서, 달리 언급되지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 나아가, 용어 "포함하는" 및 다른 형태, 예컨대, "포함한다" 및 "포함된"의 사용은 제한적이지 않다. 또한, 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, "요소" 또는 "구성요소"와 같은 용어는 하나의 유닛을 포함하는 요소와 구성요소, 및 하나 초과의 서브유닛을 포함하는 요소와 구성요소 둘 다를 포괄한다. 또한, 용어 "부분"의 사용은 모이어티의 일부 또는 전체 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 도면들 중 어느 하나 이상의 도면의 임의적 요소들 중 어느 하나 이상의 임의적 요소는 본원의 도면들 중 어느 하나 이상의 도면의 다른 임의적 단계들 중 어느 하나 이상의 임의적 단계와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 도면들 중 어느 하나 이상의 도면에 대해 상이한 요소들 중 어느 하나 이상의 요소는 본원의 도면들 중 어느 하나 이상의 도면에 대해 상이한 다른 단계들 중 어느 하나 이상의 단계와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 도면들 중 어느 하나 이상의 도면에 대해 상이한 임의적 요소들 중 어느 하나 이상의 임의적 요소는 본원의 도면들 중 어느 하나 이상의 도면에 대해 상이한 다른 임의적 단계들 중 어느 하나 이상의 단계와 조합될 수 있다.
용어 "단계"는 일어나고/나거나 수행될 수 있는 작업을 의미한다. 다수의 "단계들"이 한 번에 일어날 수 있거나 중첩되는 시간 이내에 그리고/또는 순차적으로 일어날 수 있음을 인지해야 한다. 달리 표시되지 않는 한(명시적으로 또는 묵시적으로 본 개시내용의 문맥에 비추어 볼 때), 모든 옵션이 본원에서 고려된다. 더욱이, 달리 표시되지 않는 한, 단계는 상이한 순서로 수행될 수 있거나, 반복될 수 있거나, 추가된 추가 개입 또는 중첩 단계를 가질 수 있다.
하이브리드화 연쇄 반응을 통한 샘플 내의 표적 분자의 분석. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 HCR 개시제를 각각 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함하는 프로브 세트를 사용하여 표적을 검출한다(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 42a 내지 42f 및 43a). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 사용하여 샘플 내에서 표적을 검출하고(예를 들어, 도 8a 및 8b, 및 16a 내지 16d의 프로브 세트 참조), 이때 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함하고(예를 들어, 도 3a 내지 5e 및 17a 내지 17c의 프로브 유닛 참조), 각각의 HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다(예를 들어, 도 12 및 17a 내지 17c의 분획 개시제 프로브 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 각각의 프로브와 표적의 인접 동족 결합 부위의 결합은 분획 개시제를 공국소화함으로써, HCR 헤어핀에 하이브리드화하여 HCR 신호 증폭을 유발할 수 있는 전체 HCR 개시제를 형성한다(예를 들어, 도 3a 내지 5e, 8a 및 8b, 16a 내지 16d, 21a 내지 22, 27 및 38의 전체 HCR 개시제 참조).
일부 실시양태에서, HCR 신호 증폭은 신호를 샘플로부터 비롯된 배경보다 약 5, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 75배, 100배, 500배, 1000배 또는 2000배, 또는 앞서 언급된 값들 중 임의의 두 값들에 의해 정의된 범위 내의 값만큼 더 높은 수준으로 증강시킴으로써, 분자 검출 및 영상화 적용을 위한 신호 대 배경 비를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성된다(예를 들어, 도 8a 및 8b, 21a 및 21b, 22, 및 27 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다(예를 들어, 도 8a 및 8b, 21a 내지 22, 27 및 28 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 전체 HCR 개시제를 공국소화하지 않아, HCR 신호 증폭을 억제한다. HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다(예를 들어, 도 8a 및 8b, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 증폭제 참조). 일부 실시양태에서, 각각의 HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 가진 인풋 도메인, 및 단일 가닥 루프 및 스템 구획에 대한 상보체를 가진 아웃풋 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 8a 및 8b, 13, 14, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 헤어핀 참조). 일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브의 하나 이상의 HCR 개시제는 개시제가 제1 HCR 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 제1 헤어핀을 개방함으로써 그의 아웃 도메인을 노출시키고, 이어서 이 아웃풋 도메인이 제2 HCR 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 제2 헤어핀을 개방함으로써 그의 아웃풋 도메인을 노출시키는 방식으로 중합 단계의 연쇄 반응을 각각 개시함으로써, 헤어핀이 중합되어 표적에 연결된 HCR 증폭 중합체를 생성하는 연쇄 반응을 유발한다(예를 들어, 도 13, 14, 19a 및 19b, 29a, 30a, 33a, 33c 내지 33e, 34a 및 41a의 증폭 중합체 참조). 전체 HCR 개시제의 부재 하에, HCR 헤어핀은 동역학적으로 포획되고 중합되지 않음으로써, 배경을 억제한다. 그러나, 프로브 유닛 내의 분획 개시제 프로브가 표적에서 그의 인접 동족 결합 부위에 결합하여 전체 HCR 개시제를 공국소화하는 경우, 전체 HCR 개시제는 전체 개시제가 제1 HCR 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 제1 헤어핀을 개방함으로써 그의 아웃풋 도메인을 노출시키고, 그 다음 이 아웃풋 도메인이 제2 HCR 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 제2 헤어핀을 개방함으로써 그의 아웃풋 도메인을 노출시키는 방식으로 중합 단계의 연쇄 반응을 개시하여, 헤어핀이 중합되어 표적에 연결된 HCR 증폭 중합체를 생성하는 연쇄 반응을 유발한다(예를 들어, 도 8a, 13, 14, 18c 내지 18f, 19a 및 19b의 증폭 중합체 참조). 일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 하나 이상의 표지를 추가로 포함하고, 각각의 표지는 리포터를 포함하거나, 하나 이상의 리포터를 포함하는 표지 프로브를 동원하는 기질(또는 분획 기질)을 포함한다(예를 들어, 도 18a 내지 18f의 리포터-표지된 HCR 헤어핀, 기질-표지된 HCR 헤어핀, 및 분획 기질-표지된 HCR 헤어핀 참조). 일부 실시양태에서, HCR 헤어핀의 0개 또는 1개 이상의 기질은 촉매 리포터 침착(CARD)을 통한 신호 증폭의 추가 층을 매개하는 역할을 하는 합텐(예를 들어, 도 35 참조)을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 33a 내지 33e, 34a 내지 34d 및 37 참조). 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 하나 이상의 리포터를 포함하고 HCR 헤어핀의 기질에 상보적이거나 HCR 증폭 중합체 내에서 공국소화된 전체 기질에 상보적인 기질 결합 영역을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 20a 내지 20f, 36a 및 36b의 표지 프로브 참조). 일부 실시양태에서, 신호는 샘플 내의 표적에 연결된 HCR 증폭 중합체와 결합된 하나 이상의 리포터에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 신호는 샘플로부터 제거된다(예를 들어, 도 23 참조). 일부 실시양태에서, HCR 신호는 동일한 샘플로부터 1회 이상 생성되고 검출되고 제거된다(예를 들어, 도 23a 내지 23o 및 40a 내지 40n 참조).
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 도면들 중 임의의 도면에서 제공된 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 본원에서 제공된 다른 방법들 중 한 방법과 조합될 수 있다. 달리 표시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, 한 세트의 도면(예를 들어, 도 18)의 일반적인 언급은 각각 함께 조합된, 그 번호 내에 함유된 상이한 도면들 전부(예를 들어, 18a 내지 18f), 이들 중 하나 이상, 또는 대안적으로 이들 각각을 의미한다.
HCR 개시제. 개시제-표지된 프로브는 HCR 중합 캐스케이드를 개시할 수 있는 하나 이상의 HCR 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시제는 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여 헤어핀을 개방하고 HCR 중합 캐스케이드를 개시하도록 HCR 헤어핀의 인풋 도메인에 완전히 상보적이다. 일부 실시양태에서, 개시제는 HCR 헤어핀의 인풋 도메인에 부분적으로 상보적이지만, 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여 헤어핀을 개방하고 HCR 중합 캐스케이드를 개시할 정도로 충분히 상보적이다. 일부 실시양태에서, 개시제는 HCR 헤어핀의 인풋 도메인보다 더 짧거나 더 길고/길거나 헤어핀의 인풋 도메인에 대한 불완전한 상보성을 갖지만, 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여 헤어핀을 개방하고 HCR 중합 캐스케이드를 개시할 수 있다. 일부 실시양태에서, HCR 개시제는 HCR 헤어핀의 인풋 도메인에 대한 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 상보성을 가질 수 있고, 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여 헤어핀을 개방하고 HCR 중합 캐스케이드를 개시할 수 있다. 일부 상황에서, 하나 이상의 개시제를 포함하는 개시제-표지된 프로브는 샘플의 표면 근처에서 비-특이적으로 결합하는 개시제로 인해 샘플 내로의 감소된 침투를 경험할 수 있다. 일부 상황에서, 하나 이상의 개시제를 포함하는 개시제-표지된 프로브는 개시제와 샘플 내의 DNA, RNA, 단백질 또는 다른 분자의 비-특이적 결합으로 인해 배경 증가를 야기할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브의 개시제는 염기 페어링에 의해 차폐되어(예를 들어, 도 44a 내지 44z, 45a 및 45b, 및 46a 내지 46m 참조), (신호를 증가시키기 위해) 샘플로의 침투를 향상시키고/시키거나 (배경을 감소시키기 위해) 샘플 내의 프로브의 비-특이적 결합을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 개시제는 헤어핀 구조에 의해 차폐될 수 있다(예를 들어, 도 44a 내지 44e, 44k 및 44l, 44o 및 44p, 44s 및 44t, 44w 및 44x, 46a 내지 46e, 및 46m). 일부 실시양태에서, 개시제는 하나 이상의 보조 올리고에 의해 차폐될 수 있다(예를 들어, 도 44f 내지 44j, 44m 및 44n, 44q 및 44r, 44u 및 44v, 44y 및 44z, 46f 내지 46j). 일부 실시양태에서, 개시제는 개시제를 포함하는 올리고 내의 자가상보성 및/또는 하나 이상의 보조 가닥에 대한 상보성에 의해 차폐될 수 있다(예를 들어, 도 44a 내지 44z 및 46a 내지 46m).
HCR 분획 개시제 프로브를 사용한 자동 배경 억제. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브는 HCR 개시제(I1 또는 I2)가 한 쌍의 프로브 사이에서 분할되기 때문에 배경을 자동으로 억제한다(예를 들어, 도 8 및 12 참조). 일부 실시양태에서, 프로브가 인접 동족 결합 부위에서 표적에 특이적으로 결합하는 경우, 표적은 프로브 쌍 내의 2개의 프로브를 공국소화하여 전체 HCR 개시제를 형성한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브가 HCR 개시제의 분획만을 보유하기 때문에 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 HCR을 유발하지 않고, HCR 신호 증폭은 전체 HCR 개시제가 공국소화되는 경우에만 유발된다.
HCR 헤어핀을 사용한 자동 배경 억제. 일부 실시양태에서, HCR 헤어핀이 HCR 개시제(I1 또는 I2)의 부재 하에 중합되지 않도록 동역학적으로 포획되기 때문에, HCR 헤어핀은 배경을 자동으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브 쌍 내의 두 프로브들이 표적에서 그들의 인접 동족 결합 부위에 특이적으로 결합하는 경우, 생성된 공국소화된 전체 HCR 개시제(I1 또는 I2)는 연결된 HCR 증폭 중합체의 성장을 유발한다(예를 들어, 도 8 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 HCR 헤어핀은 동역학적으로 포획되기 때문에 HCR을 유발하지 않는다.
HCR 분획 개시제 프로브 및 HCR 헤어핀을 사용한 자동 배경 억제. 표적 검출을 위한 HCR 분획 개시제 프로브와 신호 증폭을 위한 HCR 증폭 헤어핀의 조합은 프로토콜 전반에 걸쳐 자동 배경 억제를 제공하여, 시약이 샘플 내에서 비-특이적으로 결합하더라도 증폭된 배경을 생성하지 않을 것임을 보장한다.
2개 이상의 분획 개시제 프로브 사이의 전체 HCR 개시제 분할. 본 발명자들은 전체 HCR 개시제를 생성하는 각각의 분획 개시제 프로브 세트를 프로브 유닛으로서 지칭한다(예를 들어, 도 17 참조). 일부 실시양태에서, 전체 HCR 개시제(I1 또는 I2)는 한 쌍의 분획 개시제 프로브가 함께 전체 HCR 개시제를 포함하도록 전체 HCR 개시제의 분획을 각각 보유하는 한 쌍의 분획 개시제 프로브에 의해 생성되고(f1 + f2 = 1이도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2); 이 경우, 프로브 유닛은 2개의 분획 개시제 프로브이다(예를 들어, 도 17a 참조). 분획 f1 및 f2는 전체 HCR 개시제가 표적에 의해 공국소화되지 않은 경우 HCR 신호 증폭이 억제되도록 전체 HCR 개시제에 비해 충분히 작다(예를 들어, f2 = 0.5인 경우 f1 = 0.5; 또는 f2 = 0.55인 경우 f1 = 0.45; 또는 f2 = 0.6인 경우 f1 = 0.4).
일부 실시양태에서, HCR 개시제(I1 또는 I2)는 3개의 분획 개시제 프로브로 분할되고(f1 + f2 + f3 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1, 프로브 P2에 대한 분획 f2, 프로브 3에 대한 분획 f3); 이 경우, 프로브 유닛은 3개의 분획 개시제 프로브로 구성된다. 일부 실시양태에서, HCR 개시제(I1 또는 I2)는 N개의 분획 개시제 프로브로 분할되고(f1 + f2 + ... fN = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1, 프로브 P2에 대한 분획 f2, ..., 프로브 PN에 대한 분획 fN; 예를 들어, 도 17b 참조), 이때 N은 2, 3 또는 4 이상이고; 이 경우, 프로브 유닛은 N개의 분획 개시제 프로브로 구성된다. N의 이 값들 중 임의의 값인 경우, 전체 HCR 개시제가 표적에 의해 공국소화되지 않는 경우 HCR 신호 증폭은 억제된다.
일부 실시양태에서, 전체 HCR 개시제는 프로브 쌍이 표적에서 그들의 인접 동족 결합 부위에 결합함으로써 생성된 공국소화된 전체 개시제에 의해 HCR 신호 증폭이 유발될 정도로 프로브 P1에 대한 분획 f1과 프로브 P2에 대한 분획 f2의 합계(f1 + f2)가 1에 충분히 가깝도록(예를 들어, f1 = 0.47, f2 = 0.47, f1 + f2 = 0.94) HCR 개시제의 분획을 각각 보유하는 프로브 쌍(또는 세트)에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제 프로브는 HCR 개시제의 100%에 상응하는 전체 HCR 개시제를 생성한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제 프로브는 분획 개시제 프로브가 존재하지 않거나 개별 분획 개시제 프로브가 존재하지만 표적에 의해 공국소화되지 않을 때 신호 증폭 속도에 비해 효율적인 HCR 신호 증폭을 제공하기에 충분한 비율의 HCR 개시제를 생성한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 공국소화된 프로브에 의해 생성된 전체 HCR 개시제의 비율은 99%, 95%, 90%, 80% 또는 60%(이 값들 중 어느 한 값을 넘는 임의의 범위, 또는 전체 HCR 개시제의 이 값들 중 임의의 2개의 값 사이에 정의된 임의의 범위를 포함함)이다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 프로브 유닛 내의 프로브가 표적에서 그의 인접 동족 결합 부위에 결합함으로써 공국소화될 때 HCR 개시제로서 작용하기에 충분하다. 일부 실시양태에서, HCR 개시제가 특정 길이(예를 들어, 15개 뉴클레오타이드)의 서열을 가질 수 있지만, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 정확히 동일한 길이를 가질 필요가 없다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이들의 조합된 길이는 공국소화될 때 HCR 개시제로서 여전히 작용하는 경우 14개 또는 13개 뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 실시양태에서, 임의의 2개 이상의 분획 개시제는, 이들이 함께 HCR 개시제의 기능을 제공하는 한, 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 전체 HCR 개시제는 프로브 쌍이 표적에서 그들의 인접 동족 결합 부위에 결합함으로써 생성된 공국소화된 전체 개시제에 의해 HCR 신호 증폭이 유발될 정도로 프로브 P1에 대한 분획 f1과 프로브 P2에 대한 분획 f2의 합계가 1에 충분히 가깝도록(예를 들어, f1 = 0.45, f2 = 0.47, f1+f2 = 0.92) 하나 또는 몇몇 또는 몇 개의 서열 변형을 추가로 포함하는 HCR 개시제의 분획을 각각 보유하는 한 쌍의 프로브에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제 프로브는 HCR 개시제에 대한 100% 서열 동일성을 가진 전체 HCR 개시제를 생성한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제 프로브는 분획 개시제 프로브가 존재하지 않을 때 또는 개별 분획 개시제 프로브가 존재하지만 표적에 의해 공국소화되지 않을 때 신호 증폭 속도에 비해 효율적인 HCR 신호 증폭을 제공하도록 HCR 개시제에 대한 충분한 서열 동일성을 생성한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 공국소화된 프로브에 의해 생성된 전체 HCR 개시제는 HCR 개시제에 대한 99%, 95%, 90%, 80% 또는 60% 서열 동일성(이 값들 중 어느 한 값을 넘는 임의의 범위, 또는 이 값들 중 임의의 2개의 값 사이에 정의된 임의의 범위를 포함함)을 가진다.
신호 대 배경 비를 향상시키기 위한 큰 프로브 세트의 사용. 신호는 프로브 유닛의 수에 따라 단조롭게 증가하므로, 일부 실시양태에서 표적 분자당 생성된 신호의 양을 증가시키기 위해 표적 길이가 허용할 때(예를 들어, mRNA, lncRNA, gDNA 표적) 다수의 프로브 유닛들을 포함하는 큰 프로브 세트를 사용하는 것이 유리하다. 자동 배경 억제는 전형적으로 비-특이적으로 결합하는 프로브를 제거하기 위해 프로브 세트 내의 개별 프로브를 시험할 필요가 없도록 표적에 특이적으로 결합하는 프로브 유닛만이 HCR 신호 증폭을 유발하는 것을 보장한다. 결과적으로, 자동 배경 억제는 새로운 표적에 대해 새로운 프로브 세트를 사용할 때 프로브 세트 최적화의 필요성을 제거함으로써 사용 용이성을 증가시킨다. 신호는 프로브 세트 크기에 따라 단조롭게 증가하고 배경은 모든 프로브 쌍에 대해 자동으로 억제되기 때문에, 전형적으로 신호 대 배경 비를 증가시키기 위해 프로브 세트 크기를 증가시키는 것이 유리하다. 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 1개 이상의 프로브 유닛을 포함한다(예를 들어, 도 8 및 도 16 참조). 예를 들어, 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수를 증가시키는 것은 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수를 증가시키는 것은 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
샘플 내의 전사체 및/또는 게놈에 의해 제한되는 프로브 세트 크기. 일부 상황에서, 서열 면에서 밀접하게 관련된, 샘플 내의 하나 이상의 다른 표적으로부터 샘플 내의 하나의 표적을 구별하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 1) 유기체 내의 표적 mRNA는 유기체 내의 또 다른 mRNA와 유사한 서열을 가질 수 있고(표적 mRNA가 다른 스플라이스 변이체와 구별될 필요가 있는 하나의 스플라이스 변이체일 가능성을 포함함), 2) 표적 mRNA는 유기체의 전사체 내의 하나 이상의 다른 RNA에 대한 서열 유사성을 각각 가진 다수의 영역을 함유할 수 있고, 3) 하나의 유기체에 함유된 표적 mRNA는 표적 mRNA가 또 다른 종의 전사체 내의 하나 이상의 RNA와 서열 면에서 유사한 영역을 갖도록 다종 샘플에 존재할 수 있고, 4) 하나의 유기체에 함유된 표적 rRNA 또는 gDNA는 샘플에 함유된 다른 유기체의 rRNA 또는 gDNA와 서열 면에서 유사할 수 있다. 샘플에 존재하는 표적 핵산과 모든 다른 핵산을 구별하는 한 가지 방법은 샘플에 존재하는 전사체 및/또는 게놈에 비해 표적 핵산에 대한 선택성을 가진 프로브 쌍만을 함유하는, 표적 핵산용 프로브 세트를 디자인하는 것이다. 일부 상황에서, 이 선택성 요건은 프로브 세트의 크기를 실질적으로 제한할 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산의 서열은 프로브 세트가 단일 분획 개시제 프로브 쌍만을 함유할 정도로 샘플 내의 하나 이상의 다른 핵산과 유사할 수 있다.
다수의 분획 개시제 프로브 쌍들을 포함하는 프로브 세트를 사용한 협력적 표적 결합. 표적 핵산(예를 들어, RNA 또는 DNA)에 결합하는 프로브는 표적 핵산 내의 천연 2차 구조(즉, 염기 페어링)와 에너지 면에서 경쟁한다. 예를 들어, 단일 프로브는 표적 내의 또 다른 도메인에 우선적으로 염기 페어링되는, 표적 핵산 내의 도메인에 결합할 수 없다. 주어진 프로브에 대한 결합 수율은 동족 프로브 결합 부위에서 결합된 프로브를 가진 표적 분자의 비율이고, 표적의 그 부분의 접근성, 프로브와 그의 동족 프로브 결합 부위 사이의 친화성 정도 및 다른 요인에 따라 0 내지 1이다. 다수의 분획 개시제 프로브 쌍을 포함하는 프로브 세트를 사용할 때, 하나의 프로브와 표적의 결합은 하나 이상의 다른 프로브와 표적의 결합 수율을 개선하여, 프로브 세트 내의 프로브가 프로브 세트 내의 다른 프로브의 결합 수율을 공동으로 개선하는 협력적 효과를 유발할 수 있다. 따라서, N개의 프로브를 가진 프로브 세트와 비교할 때, N+M개의 프로브를 가진 프로브 세트는 M개의 새로운 프로브가 신호를 생성할 뿐만 아니라 N개의 원래 프로브도 표적에 대한 더 높은 결합 수율을 가짐으로써 평균적으로 표적 분자당 더 많은 신호를 생성할 것이기 때문에 더 많은 신호를 생성할 수 있다.
헬퍼 프로브를 사용한 신호의 증가. 샘플에 존재하는 하나 이상의 전사체 및/또는 게놈과 관련하여 표적 핵산에 대한 선택성을 유지하기 위해, 프로브 세트 크기는 종종 1개 이하의 프로브 유닛 또는 2개 이하의 프로브 유닛 또는 N개 이하의 프로브 유닛이도록 제한되고, 이때 N은 표적 핵산의 민감성 고려 및/또는 길이를 기반으로 우선적으로 사용될 프로브 유닛의 수인 N+M보다 더 작다. 프로브 세트 크기가 선택성 고려에 의해 제한되는 이 시나리오에서, 생성된 신호의 양은 프로브 세트가 HCR 신호 증폭을 유발하기 위해 M개 더 적은 전체 개시제를 생성할 잠재력을 갖기 때문에, 그리고 M개의 추가 프로브 유닛의 부재가 협력적 효과로 인해 N개의 남은 프로브 유닛의 결합 수율을 감소시킬 수 있기 때문에 N+M개의 프로브 유닛을 사용하는 동일한 표적 검출에 비해 더 적을 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브는 신호 프로브로서 분획 개시제를 보유한다(예를 들어, 도 16a 참조). 일부 실시양태에서, 프로브는 헬퍼 프로브로서 분획 개시제를 보유하지 않는다. 선택성을 감소시키지 않으면서 신호를 증가시키기 위해, N개의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 M개의 헬퍼 프로브로 보강할 수 있다(예를 들어, 도 16d 참조).
예를 들어, 1) 고유 스플라이스 연접부를 가진 표적 RNA를 검출하기 위해, 프로브 세트는 스플라이스 연접부에 걸쳐 있는 표적에 결합하는 하나의 프로브 유닛을 포함할 수 있고, 다른 곳에서 표적 RNA에 결합하여 프로브 유닛의 결합 수율을 협력적으로 개선함으로써 선택성을 감소시키지 않으면서 신호를 증가시키는 30개(또는 임의의 수)의 헬퍼 프로브를 추가로 포함할 수 있고; 2) 선택성 고려가 5개의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트로 이어지는 경우 표적 RNA 또는 DNA를 검출하기 위해, 프로브 세트는 45개의 헬퍼 프로브를 추가로 포함할 수 있고; 3) 선택성 고려가 N개의 프로브 유닛(이때, N은 40 미만임)을 포함하는 프로브 세트로 이어지는 경우 표적 RNA 또는 DNA를 검출하기 위해, 프로브 세트는 40-N개의 헬퍼 프로브를 추가로 포함할 수 있고; 4) 선택성 고려가 N개의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트로 이어지고 표적 핵산의 길이가 프로브의 총 수를 2N+M으로 제한하는 경우 표적 핵산을 검출하기 위해, 프로브 세트는 M개의 헬퍼 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 헬퍼 프로브는 동일한 표적 핵산에 대한 신호 프로브를 디자인하는 데 사용되는 프로브보다 덜 엄격한 선택성 요건을 가진 표적 핵산에 대해 디자인될 것이다. 일부 실시양태에서, 헬퍼 프로브는 샘플에 존재하는 전사체 및/또는 게놈 내의 다른 오프-표적(off-target) 핵산에 대해 동등하게 선택적일지라도 표적 핵산을 위해 사용될 것이다. 일부 실시양태에서, 신호 프로브의 표적 결합 영역은 헬퍼 프로브의 표적 결합 영역과 동일한 길이일 것이다. 일부 실시양태에서, 신호 프로브의 표적 결합 영역은 헬퍼 프로브의 표적 결합 영역보다 더 짧거나 더 길 것이다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 영역은 상이한 신호 및/또는 헬퍼 프로브에 대한 길이의 범위(뉴클레오타이드의 수)에 걸쳐 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 프로브와 표적 핵산 사이의 친화성은 헬퍼 프로브와 표적 핵산 사이의 친화성에 필적할만 할 것이다. 일부 실시양태에서, 신호 프로브와 표적 핵산 사이의 친화성은 헬퍼 프로브와 표적 핵산 사이의 친화성보다 더 낮거나 더 높을 것이다.
1개 또는 2개의 분획 개시제를 보유하는 신호 프로브를 사용하는 신호의 증가. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 전체 HCR 개시제를 함께 생성하는 2개의 분획 개시제 프로브(f1 + f2 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2)를 포함한다. 이 상황에서, 각각의 프로브는 하나의 프로브 유닛에 참여한다. 프로브 유닛 내의 2개의 프로브가 주어진 표적 RNA 분자에 결합하는 경우, 단일 전체 HCR 개시제가 생성되어, 프로브 유닛에 연결된 하나의 HCR 증폭 중합체의 성장을 유발한다. 표적 RNA의 길이가 프로브 세트 크기를 2N개의 신호 프로브에 상응하는 N개의 프로브 유닛으로 제한하는 상황을 생각한다. 각각의 신호 프로브가 하나의 프로브 유닛에만 참여하는 경우, 전체 HCR 개시제의 최대 수는 N일 것이고, 이것은 표적 mRNA가 프로브 세트의 모든 신호 프로브들에 의해 결합된 경우에 상응한다. 따라서, 표적 RNA에 연결된 HCR 중합체의 최대 수는 N일 것이다. 표적 분자당 신호를 증가시키기 위해, 이제 프로브가 2개의 상이한 프로브 유닛에 기여하는 2개의 분획 개시제를 보유할 수 있는 경우를 생각한다(예를 들어, 도 16c 참조). 일부 실시양태에서, 하기 세 가지 가능성이 고려된다:
1. 모든 2N개의 신호 프로브가 표적 RNA를 따라 인접 서브서열에 하이브리드화하는 실시양태에서, 표적의 5' 및 3' 말단에 있는 신호 프로브는 하나의 인접 신호 프로브를 각각 갖고 모든 다른 개재 신호 프로브는 2개의 인접 신호 프로브를 가진다. 이 시나리오에서, 5' 최외각 신호 프로브와 3' 최외각 신호 프로브를 제외한 각각의 프로브가 2개의 상이한 프로브 유닛에 기여하는 2개의 분획 개시제를 보유하는 경우, 프로브 유닛의 총 수는 N에서 (2N - 1)로 증가한다. 결과적으로, 전체 HCR 개시제의 최대 수는 N에서 (2N - 1)로 증가하고 표적 RNA에 연결된 HCR 중합체의 최대 수는 N에서 (2N - 1)로 증가한다. 따라서, 표적 분자당 생성된 신호는 각각의 신호 프로브가 단일 분획 개시제를 보유하는 경우에 비해 증가된다.
2. 또 다른 실시양태에서, 샘플에 존재하는 전사체 및/또는 게놈으로부터 비롯된 선택성 고려는 2N개의 신호 프로브 및 N개의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트로 이어질 수 있고, 이때 표적 핵산을 따라 또 다른 프로브 유닛에 인접한 프로브 유닛은 없다. 이 시나리오에서, 각각의 신호 프로브는 전체 HCR 개시제의 최대 수가 N이고 연결된 HCR 증폭 중합체의 최대 수가 N이도록 단일 분획 개시제만을 보유하고 오로지 하나의 프로브 유닛에 기여한다.
3. 중간 경우를 대표하는 또 다른 실시양태에서, 일부 신호 프로브는 2N개의 신호 프로브가 N과 2N - 1 사이의 중간인 수의 프로브 유닛에 참여하도록 하나 초과의 이웃에 인접할 것이다. 예를 들어, 2N개의 신호 프로브가 있고 이들 중 M개의 신호 프로브가 표적의 한 부분을 타일링하고(이때 이 신호 프로브들의 5' 및 3'는 하나의 분획 개시제를 보유하고 하나의 프로브 유닛에 기여하고, 다른 M-2개의 신호 프로브는 2개의 분획 개시제를 보유하고 2개의 프로브 유닛에 기여함) 다른 L개의 프로브(이때 2N = M+L이고, 이때 L은 짝수임)는 오로지 하나의 다른 신호 프로브에 인접한 각각의 신호 프로브와 쌍으로 표적에 결합하는 경우(L개의 신호 프로브 각각이 하나의 분획 개시제를 보유하고 하나의 프로브 유닛에 기여함), 프로브 유닛의 총 수는 N과 2N - 1 사이의 중간일 M-1 + L/2일 것이다. 예를 들어, 40개의 신호 프로브(즉, N = 20)가 있고 이들 중 20개의 신호 프로브가 인접하여 표적을 타일링하고(즉, M = 20) 다른 20개의 신호 프로브가 인접 쌍으로 표적에 결합하는 경우(즉, L = 20), 프로브 유닛의 총 수는 M-1 + L/2 = 20 - 1 + 20/2 = 29일 것이다.
프로브 유닛이 2개 초과의 신호 프로브, 예를 들어, 3개의 신호 프로브 또는 4개 이상의 신호 프로브를 포함하는 관련 경우, 프로브 유닛의 수는 2개의 분획 개시제를 포함하고 2개의 프로브 유닛에 참여하는(프로브 유닛당 하나의 분획 개시제) 일부 프로브를 사용함으로써, 신호 프로브의 수를 증가시키지 않으면서 다시 증가될 수 있다.
2개의 헤어핀을 가진 HCR 증폭제. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개의 헤어핀(H1 및 H2; 예를 들어, 도 8 및 18 참조)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 가진 인풋 도메인, 및 단일 가닥 루프 및 스템 구획에 대한 상보체를 가진 아웃풋 도메인을 포함한다. HCR 개시제(I1 또는 I2)의 부재 하에, 헤어핀 H1 및 H2는 준안정적으로 공존한다. 즉, 이들은 동역학적으로 포획되고 중합되지 않는다.
전체 개시제 I1을 사용한 개시. 일부 실시양태에서, 개시제 I1은 헤어핀 H1의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H1의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. H1 헤어핀이 전체 개시제 I1을 만나는 경우, 전체 개시제 I1은 토홀드 매개 가닥 이탈을 통해 헤어핀 H1의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 헤어핀 H1을 개방함으로써 헤어핀 H1의 아웃풋 도메인을 노출시키고 복합체 I1-H1을 형성한다. 헤어핀 H1의 아웃풋 도메인은 헤어핀 H2의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H2의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. H2 헤어핀이 I1-H1 복합체를 만나는 경우, H1의 노출된 아웃풋 도메인은 토홀드 매개 가닥 이탈을 통해 헤어핀 H2의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 헤어핀 H2를 개방함으로써 헤어핀 H2의 아웃풋 도메인을 노출시키고 복합체 I1-H1-H2를 형성한다. 헤어핀 H2의 아웃풋 도메인은 헤어핀 H1의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H1의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. H1 헤어핀이 I1-H1-H2 복합체를 만나는 경우, H2의 노출된 아웃풋 도메인은 토홀드 매개 가닥 이탈을 통해 헤어핀 H1의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 헤어핀 H1을 개방함으로써 헤어핀 H1의 아웃풋 도메인을 노출시키고 복합체 I1-H1-H2-H1을 형성한다. 이 중합 과정은 교대 H1 및 H2 중합 단계로 반복되어, 헤어핀 H1과 H2의 N개의 교대 카피를 포함하는 중합체에 대해 본 발명자들에 의해 I1-(H1-H2)N으로서 표시될 수 있는 형태 I1-H1-H2-H1-H2-H1-H2-...의 중합체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 몇 개의 H1 및 H2 분자, 또는 수십 개의 H1 및 H2 분자, 또는 수백 개의 H1 및 H2 분자, 또는 수천 개의 H1 및 H2 분자, 또는 수만 개의 H1 및 H2 분자, 또는 더 많은 H1 및 H2 분자를 포함할 수 있다. 중합체가 H1 또는 H2로 끝나는 것도 가능하므로, I1-(H1-H2)N-H1 및 I1-(H1-H2)N-H1-H2 둘 다가 가능하고, 후자는 I1-(H1-H2)N+1와 동등하다.
전체 개시제 I2를 사용한 개시. 일부 실시양태에서, 개시제 I2는 헤어핀 H2의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H2의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. H2 헤어핀이 전체 개시제 I2를 만나는 경우, 전체 개시제 I2는 토홀드 매개 가닥 이탈을 통해 헤어핀 H2의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 헤어핀 H2를 개방함으로써 헤어핀 H2의 아웃풋 도메인을 노출시키고 복합체 I2-H2를 형성한다. H1 헤어핀이 I2-H2 복합체를 만나는 경우, H2의 노출된 아웃풋 도메인이 토홀드 매개 가닥 이탈을 통해 헤어핀 H1의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 헤어핀 H1을 개방함으로써 헤어핀 H1의 아웃풋 도메인을 노출시키고 복합체 I2-H2-H1을 형성한다. H2 헤어핀이 I2-H2-H1 복합체를 만나는 경우, H1의 노출된 아웃풋 도메인은 토홀드 매개 가닥 이탈을 통해 헤어핀 H2의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 헤어핀 H2를 개방함으로써 헤어핀 H2의 아웃풋 도메인을 노출시키고 복합체 I2-H2-H1-H2를 형성한다. 이 중합 과정은 교대 H2 및 H1 중합 단계로 반복되어, H2와 H1의 N개의 교대 카피를 포함하는 중합체에 대해 I2-(H2-H1)N으로서 표시될 수 있는 형태 I2-H2-H1-H2-H1-H2-H1...의 중합체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 몇 개의 H1 및 H2 분자, 또는 수십 개의 H1 및 H2 분자, 또는 수백 개의 H1 및 H2 분자, 또는 수천 개의 H1 및 H2 분자, 또는 수만 개의 H1 및 H2 분자, 또는 더 많은 H1 및 H2 분자를 포함할 수 있다. 중합체가 H1 또는 H2로 끝나는 것도 가능하므로, I2-(H2-H1)N-H2 및 I2-(H2-H1)N-H2-H1 둘 다가 가능하고, 후자는 I2-(H2-H1)N+1과 동등하다.
4개의 헤어핀을 가진 HCR 증폭제. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개 초과의 헤어핀을 포함할 수 있다. 예를 들어, HCR 증폭제는 4개의 헤어핀 H1, H2, H3, H4를 포함한다(예를 들어, 도 19 참조). 2-헤어핀 HCR의 경우와 마찬가지로, 각각의 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인, 및 단일 가닥 루프 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 포함한다. HCR 개시제(I1, I2, I3 또는 I4)의 부재 하에, 헤어핀 H1, H2, H3, H4는 준안정적으로 공존한다. 즉, 이들은 동역학적으로 포획되고 중합되지 않는다. 헤어핀 H1의 아웃풋 도메인은 헤어핀 H2의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H2의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. 헤어핀 H2의 아웃풋 도메인은 헤어핀 H3의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H3의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. 헤어핀 H3의 아웃풋 도메인은 헤어핀 H4의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H4의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. 헤어핀 H4의 아웃풋 도메인은 헤어핀 H1의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H1의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. 개시제 I1은 헤어핀 H1의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H1의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. 개시제 I2는 헤어핀 H2의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H2의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. 개시제 I3은 헤어핀 H3의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H3의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. 개시제 I4는 헤어핀 H4의 토홀드에 상보적인 도메인 및 H4의 스템 구획에 상보적인 도메인을 포함한다. 2-헤어핀 HCR의 경우와 유사하게, 헤어핀 H1이 전체 HCR 개시제 I1을 만나는 경우, 전체 I1은 헤어핀 H1을 개방하여 노출된 H1 아웃풋 도메인과 복합체 I1-H1을 형성하고, 그 다음으로 노출된 H1 아웃풋 도메인은 헤어핀 H2를 개방하여 노출된 H2 아웃풋 도메인과 복합체 I1-H1-H2를 형성하고, 이어서 노출된 H2 아웃풋 도메인은 헤어핀 H3을 개방하여 아웃풋 도메인을 노출시켜 노출된 H3 아웃풋 도메인과 복합체 I1-H1-H2-H3을 형성하고, 그 다음으로 노출된 H3 아웃풋 도메인은 헤어핀 H4를 개방하여 노출된 H4 아웃풋 도메인과 복합체 I1-H1-H2-H3-H4를 형성하고, 이어서 노출된 H4 아웃풋 도메인은 헤어핀 H1을 개방하여 노출된 H1 아웃풋 도메인과 복합체 I1-H1-H2-H3-H4-H1을 형성함으로써, 교대 H1, H2, H3 및 H4 중합 단계를 통한 중합을 유발하여, H1, H2, H3 및 H4의 N개의 교대 카피를 포함하는 중합체에 대해 I1-(H1-H2-H3-H4)N으로서 표시될 수 있는 형태 I1-H1-H2-H3-H4-H1-H2-H3-H4-H1-H2-H3-H4...의 중합체를 생성한다. 중합체가 H1, H2, H3 또는 H4로 끝나는 것도 가능하므로, I1-(H1-H2-H3-H4)N-H1, I1-(H1-H2-H3-H4)N-H1-H2, I1-(H1-H2-H3-H4)N-H1-H2-H3 및 I1-(H1-H2-H3-H4)N-H1-H2-H3-H4 모두가 가능하고, 후자는 I1-(H1-H2-H3-H4)N+1와 동등하다. HCR 중합은 동족 전체 개시제(I1, I2, I3 또는 I4) 중 임의의 전체 개시제에 의해 유발될 수 있다. 예를 들어, 전체 개시제 I3에 의한 개시제는 형태 I3-(H3-H4-H1-H2)N의 중합체를 생성할 수 있다. 4개의 헤어핀을 가진 HCR 증폭제는 단량체 상태에 없고 중합체 상태에는 존재하는 신호를 생성하는 데 편리하다(예를 들어, 도 19b는 헤어핀이 증폭 중합체 내에서 공국소화될 때만 FRET 신호를 생성하기 위해 공국소화되는 FRET 쌍을 보여줌으로써, 샘플로부터 세척되지 않은 미사용 헤어핀이 FRET에 참여하지 않을 것이므로 배경 생성을 피할 것이기 때문에 무세척 방법의 기반을 제공한다).
2개 이상의 헤어핀을 가진 HCR 증폭제. 보다 일반적으로, 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 M개의 HCR 헤어핀(H1, H2, ..., HM)을 포함할 수 있고, 이때 M은 2 이상의 정수이다. HCR 개시제(I1, I2, ..., IM)의 부재 하에, 헤어핀 H1, H2, ..., HM은 준안정적으로 공존한다. 즉, 이들은 동역학적으로 포획되고 중합되지 않는다. 동족 전체 HCR 개시제의 존재 하에, 중합은 2-헤어핀 또는 4-헤어핀 HCR과 유사한 교대 중합 단계를 통해 일어난다. 예를 들어, 개시제 I1은 H1, H2, ..., HM의 N개의 교대 카피를 포함하는 중합체에 대해 형태 I1-(H1-H2-...-HM)N의 중합체의 성장을 유발할 것이다. 중합체가 H1, H2, ..., HM 중 어느 하나로 끝나는 것이 가능하므로, I1-(H1-H2-...-HM)N-H1, I1-(H1-H2-...-HM)N-H1-H2, ..., 및 I1-(H1-H2-...-HM)N-H1-H2-...-HM 모두가 가능하고, 후자는 I1-(H1-H2-...-HM)N+1과 동등하다. HCR 중합은 동족 전체 개시제(I1, I2, ..., IM) 중 임의의 전체 개시제에 의해 유발될 수 있다. 예를 들어, 전체 개시제 I3에 의한 개시제는 형태 I3-(H3-...-HM-H1-H2)N의 중합체를 생성할 수 있다.
HCR 헤어핀 표지. 주어진 HCR 증폭제의 경우, 각각의 HCR 헤어핀은 0개 또는 1개 이상의 표지를 포함한다. 증폭제 내의 상이한 헤어핀의 표지는 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 헤어핀 H1 및 H2를 포함하는 증폭제는 1) H1 및 H2에서 동일한 표지를 갖거나, 2) H1 및 H2에서 상이한 표지를 갖거나, 3) H1에서 표지를 갖지만 H2에서 표지를 갖지 않거나, 4) H2에서 표지를 갖지만 H1에서 표지를 갖지 않거나, 5) H1 또는 H2에서 표지를 갖지 않거나, 6) H1에서 0개 또는 1개 이상의 표지를 갖고, 이들 중 0개 또는 1개 이상의 표지가 H2의 0개 또는 1개 이상의 표지와 동일하거나 상이하다. 유사하게, 헤어핀 H1, H2, H3, H4를 포함하는 HCR 증폭제의 경우, 각각의 헤어핀은 0개 또는 1개 이상의 표지(예를 들어, 3개, 5개 또는 10개의 표지)를 포함할 수 있고, 이들 중 0개 또는 1개 이상의 표지는 다른 헤어핀 각각의 0개 또는 1개 이상의 표지와 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 주어진 헤어핀에 대한 하나 이상의 표지는 헤어핀 및/또는 헤어핀 표지의 혼합물 내에서 고유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혼합물 내에 1개, 10개, 100개, 1000개, 10,000개 또는 100,000개 이상의 고유 표지가 있다(상기 숫자들 중 임의의 2개의 숫자 사이에 정의된 임의의 범위를 포함함).
리포터로서 HCR 헤어핀 표지. 일부 실시양태에서, HCR 헤어핀 표지는 예를 들어, 신호를 생성하거나, 신호를 변경하거나 신호를 제거함으로써, 신호의 측정을 용이하게 하는 리포터 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포터는 형광단, 발색단, 발광단, 인광체, FRET 쌍, FRET 쌍의 구성원, 소광제, 형광단/소광제 쌍, 희토류 원소 또는 화합물, 방사성 분자, 자성 분자, 또는 신호 측정을 용이하게 하는 임의의 다른 분자일 수 있다.
기질로서 HCR 헤어핀 표지. 일부 실시양태에서, HCR 헤어핀 표지는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 하는 기질을 포함할 수 있다. 예를 들어:
1. 헤어핀 표지는 리포터 물질로서 항-DIG 항체를 동원하는 디곡시제닌(DIG)을 포함할 수 있고, 이때 항-DIG는 하나 이상의 리포터로 직접적으로 표지되거나, 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 역할을 하는 하나 이상의 기질 또는 리포터 물질로 직접적으로 표지된다.
2. 헤어핀 표지는 하나 이상의 리포터를 보유하는 표지 프로브 내의 도메인에 대한 전체적 또는 부분적 서열 상보성을 가진 기질로서 작용하는 핵산 도메인을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 18c).
3. 헤어핀 표지는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 매개하는 역할을 하는 하나 이상의 기질을 보유하는 표지 프로브 내의 도메인에 대한 전체적 또는 부분적 서열 상보성을 가진 기질로서 작용하는 핵산 도메인을 포함할 수 있다.
4. 헤어핀 표지는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 리포터 물질에 대한 기질로서 작용하는 핵산 도메인을 포함할 수 있다.
5. 헤어핀 표지는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 간접적으로 매개하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 하는 기질을 포함할 수 있다.
6. 헤어핀 표지는 헤어핀 표지의 근처에서 촉매 리포터 침착(CARD)을 매개하는 효소를 포함하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 하는 기질을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 36a).
7. 헤어핀 표지는 리포터 물질로서 스트렙타비딘을 동원하는 바이오틴을 포함할 수 있고, 이때 스트렙타비딘은 하나 이상의 리포터로 직접적으로 표지되거나, 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 역할을 하는 하나 이상의 기질 또는 리포터 물질로 직접적으로 표지된다.
8. 헤어핀 표지는 CARD 신호 증폭을 통해 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 항-합텐 항체 또는 항-합텐 나노바디를 동원하는 합텐을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-합텐 항체 또는 나노바디는 CARD를 매개하는 효소인 리포터 물질을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 33a 내지 33e).
9. 헤어핀 표지는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 항-합텐을 동원하는 합텐을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-합텐은 CARD를 매개하는 효소인 리포터 물질을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 34a 내지 34c).
10. 헤어핀 표지는 CARD 신호 증폭을 매개하여 헤어핀의 근처에서 리포터 분자를 침착시키는 효소를 포함할 수 있다.
11. 헤어핀 표지는 합텐의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 0개 또는 1개 이상의 합텐을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 35).
일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 리포터로 표지된 항-합텐(예를 들어, 항체, 나노바디, 스트렙타비딘, 또는 또 다른 분자)을 동원하는 합텐을 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 일부 실시양태에서, HCR 신호 증폭을 이용하여 촉매 리포터 침착(CARD)을 매개함으로써, 훨씬 더 높은 신호 획득을 유발한다. 일부 실시양태에서, 훨씬 더 높은 신호 획득은 약 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 75배, 100배, 500배, 1000배, 2000배, 5000배 또는 10,000배, 또는 앞서 언급된 값들 중 임의의 2개의 값들에 의해 정의된 범위 내의 값이다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀 표지는 리포터 분자에 접합된 표지 프로브가 개별 헤어핀의 분획 기질에 강하게 결합하지 않지만, HCR 중합 후에 HCR 증폭 중합체에서 인접 헤어핀이 전체 기질을 공국소화하여, 공국소화된 전체 기질이 리포터 분자에 접합된 표지 프로브(예를 들어, 도 18d), 또는 CARD 신호 증폭을 매개하는 효소를 포함하는 리포터 물질(예를 들어, 도 36b)에 강하게 결합하도록 분획 기질을 포함할 수 있다.
합텐 및 항-합텐. 일부 실시양태에서, 합텐을 포함하는 기질인 헤어핀 표지는 예를 들어, 디곡시게닌(DIG), 디니트로페닐(DNP), 형광단, 바이오틴, 또는 항-합텐을 동원할 수 있는 임의의 소분자, 생물학적 분자 또는 비-생물학적 분자일 수 있다. 항-합텐의 예는 항체, 나노바디, 스트렙타비딘, 앱타머, 또는 합텐에 선택적으로 결합하는 임의의 다른 분자 또는 분자 복합체를 포함한다.
표지 프로브. 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 하나 이상의 리포터(예를 들어, 도 18c 내지 18e 및 도 20 참조) 또는 리포터 물질(예를 들어, 도 33a 내지 33e 및 34a 내지 34d 참조)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 하나의 리포터 분자로 표지된 구조화되지 않은 가닥을 포함한다(예를 들어, 도 20a 참조). 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 다수의 리포터 분자들을 포함한다(예를 들어, 도 20b 참조). 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 (소광제에 접합된) 차단제 가닥에 하이브리드화된 (리포터에 접합된) 표지 가닥을 포함한다(예를 들어, 도 20c 참조). 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 헤어핀 구조(예를 들어, 도 20d의 표지 프로브 참조) 또는 다른 분자내 염기 페어링을 가진다. 일부 실시양태에서, 헤어핀 표지 프로브는 하나 이상의 리포터, 소광제, 및/또는 FRET 쌍에 접합된다(예를 들어, 도 20e 및 20f 참조). 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 HCR 헤어핀의 합텐 표지를 인식하는 항-합텐 항체 또는 나노바디를 포함하고 CARD를 매개하는 효소를 포함하는 리포터 물질을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 33a 내지 33e). 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 HCR 헤어핀의 합텐 표지를 인식하는 항-합텐 물질을 포함하고, CARD를 매개하는 효소를 포함하는 리포터 물질을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 34a 내지 34d). 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 HCR 헤어핀의 기질 표지를 인식하거나 HCR 증폭 중합체 내에 공국소화된 전체 기질을 인식하는 기질 상보체를 포함하고, CARD를 매개하는 효소를 포함하는 리포터 물질을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 36a 및 36b).
HCR 매개 촉매 리포터 침착(CARD)을 위한 효소. 일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 CARD-기질을 촉매작용하여 헤어핀의 근처에서 리포터의 침착을 유발하는 효소를 포함하는 리포터 물질에 의한 촉매 리포터 침착(CARD)을 통해 신호 증폭을 매개한다(예를 들어 도 33a 내지 33e, 34a 내지 34c, 36a 및 36b 참조). 예를 들어:
1. 효소는 CARD-기질에 작용하여 발색성 리포터, 예컨대, AEC, DAB, TMB 또는 StayYellow의 침착을 촉매작용하거나, CARD-기질을 촉매작용하여 형광 리포터, 예컨대, 형광단-표지된 티라마이드의 침착을 촉매작용하거나, 합텐-표지된 CARD-기질, 예컨대, 바이오틴-표지된 티라마이드의 침착을 촉매작용하는 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP)(또는 다수의 HRP 효소를 포함하는 중합체 HRP)일 수 있고, 이때 합텐은 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 매개하는 역할을 한다.
2. 효소는 CARD-기질에 작용하여 리포터, 예를 들어, BCIP/NBT, BCIP/TNBT, 나프톨 AS-MX 포스페이트 + FastBlue BB, 나프톨 AS-MX 포스페이트 + FastRed TR, StayGreen과 같은(그러나, 이들로 제한되지 않는) 발색성 리포터의 침착을 촉매작용하는 알칼리성 포스파타제(AP)(또는 다수의 AP 효소를 포함하는 중합체 AP)일 수 있다.
3. 효소는 CARD-기질에 작용하여 리포터, 예를 들어, NBT의 침착을 촉매작용하는 글루코스 옥시다제일 수 있다.
4. 효소는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 임의의 분자 또는 복합체일 수 있다.
일부 실시양태에서, CARD를 매개하는 효소는 리포터 침착 후(예를 들어, 화학적 또는 열 변성을 이용함으로써) 비활성화(즉, 불활성화)된다. 예를 들어, CARD를 매개하는 효소는 하기 1 내지 4의 임의의 조합을 이용함으로써 비활성화될 수 있다:
1. 열(예를 들어, 65℃ 이상)
2. 고정제(예를 들어, 4% PFA)
3. 산(예를 들어, pH 2.2에서 1% Tween 20을 가진 0.1 M 글리신-HCl, 0.2 N HCl, 10% 아세트산, 10 mM HCl)
4. 다른 화학물질(예를 들어, 과산화수소(H2O2), 과산화수소 + 페놀, 나트륨 아지드, DEPC, 10 mM EDTA를 가진 MAB)
일부 실시양태에서, HRP는 H2O2를 사용함으로써 비활성화된다. 일부 실시양태에서, AP는 열과 산을 병용함으로써 비활성화된다. 일부 실시양태에서, AP는 고정제에 의해 비활성화된다. 일부 실시양태에서, CARD를 매개하는 효소의 비활성화는 HCR 매개 CARD를 이용하는 다중화 표적 분석을 가능하게 하기 위해 상이한 표적에 대한 상이한 기질과 함께 동일한 효소를 사용하는 반복된 CARD를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, CARD를 매개하는 효소의 비활성화는 HCR 매개 CARD를 이용하는 다중화 표적 분석을 가능하게 하기 위해 상이한 표적에 대한 상이한 기질과 함께 상이한 효소를 사용하는 반복된 CARD를 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, CARD는 염색된 샘플을 10년 이상 동안 저장할 수 있게 하여, 생물의약에 대한 규제 요건을 준수하면서 재영상화할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, CARD 기반 염색된 샘플은 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년 또는 15년 이상 동안 적절하게 안정하고 생물의약에 대한 규제 요건을 여전히 준수한다. 일부 실시양태에서, CARD는 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된(FFPE) 샘플을 수십 년 동안 저장할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, CARD는 후향적 과학 연구 및 의학 연구를 제공하기 위해 병리학 샘플을 수십 년 동안 저장할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, CARD 염색은 보관 샘플의 장기간 저장을 제공한다.
표적 유형. 일부 실시양태에서, 개시제-표지된 HCR 프로브는 하나 이상의 표적 결합 영역을 포함하고, 하나 이상의 HCR 개시제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브는 하기 물질을 포함하는 표적을 검출할 수 있다:
1. RNA 분자(예를 들어, mRNA, rRNA, lncRNA, siRNA, shRNA, microRNA, 비-코딩 RNA, 합성 RNA 또는 변형된 RNA), DNA 분자, 비-천연 핵산 분자, 단백질 분자, 소분자, 생물학적 분자, 화학적으로 변형된 생물학적 분자, 비-생물학적 분자를 포함하나 이들로 제한되지 않는 임의의 분자;
2. RNA, DNA, 단백질, 소분자, 생물학적 분자 및/또는 비-생물학적 분자의 임의의 조합을 포함하는 임의의 분자 복합체(예를 들어, RNA/RNA 복합체, RNA/단백질 복합체, DNA/단백질 복합체, RNA/DNA/단백질 복합체, 및 단백질/단백질 복합체).
분획 개시제 HCR 프로브는 하나 이상의 표적 결합 영역을 포함하고, 하나 이상의 분획 개시제 영역을 추가로 포함한다. 프로브 유닛은 프로브 유닛 내의 분획 개시제 프로브가 조합되어 전체 HCR 개시제를 생성하도록 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 포함한다. 프로브 유닛은 하기 물질을 포함하는 표적을 검출할 수 있다:
1. RNA 분자(예를 들어, mRNA, rRNA, lncRNA, siRNA, shRNA, microRNA, 비-코딩 RNA, 합성 RNA 또는 변형된 RNA), DNA 분자, 비-천연 핵산 분자, 단백질 분자, 소분자, 생물학적 분자, 화학적으로 변형된 생물학적 분자, 비-생물학적 분자를 포함하나 이들로 제한되지 않는 임의의 분자;
2. RNA, DNA, 단백질, 소분자, 생물학적 분자 및/또는 비-생물학적 분자의 임의의 조합을 포함하는 임의의 분자 복합체(예를 들어, RNA/RNA 복합체, RNA/단백질 복합체, DNA/단백질 복합체, RNA/DNA/단백질 복합체, 및 단백질/단백질 복합체).
3. 프로브 유닛을 구성하는 분획 개시제 프로브들이 인접 분자 또는 복합체의 집합체 내에서 그들 각각의 표적에 결합될 때 프로브 유닛 내의 분획 개시제가 공국소화되어 전체 HCR 개시제를 형성할 수 있게 하는 인접 분자 또는 복합체의 임의의 집합체.
본원에서 제공된 임의의 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 비-중첩 영역(예를 들어, 0개, 1개 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된 영역)에 상보적이도록 디자인되거나, HCR 헤어핀의 중첩 영역(예를 들어, 1개 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 중첩되는 영역)에 상보적이도록 디자인되거나, HCR 헤어핀에 실질적으로 상보적이도록(예를 들어 0개, 1개, 2개, 몇몇 또는 몇 개의 불일치를 제외하고 상보적이도록) 디자인된다.
본원에서 제공된 임의의 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 비-중첩 영역(예를 들어, 0개, 1개 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된 영역 또는 0, 1 또는 2 이상의 nm에 의해 분리된 영역)에 결합하도록 구성되거나, 표적의 중첩 영역(예를 들어, 1개 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 중첩되는 영역, 또는 1 또는 2 이상의 nm에 의해 중첩되는 영역)에 결합하도록 구성된다.
표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성되고/되거나 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하는 분획 개시제를 갖도록 디자인된 신호 프로브. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 각각 포함하는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는
1. HCR 헤어핀의 인접 영역에 상보적이도록 디자인되거나,
2. HCR 헤어핀의 비-중첩 영역(예를 들어, 0개, 1개 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된 영역)에 상보적이도록 디자인되거나,
3. HCR 헤어핀의 중첩 영역(예를 들어, 1개 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 중첩되는 영역)에 상보적이도록 디자인되거나,
4. HCR 헤어핀에 실질적으로 상보적이도록(예를 들어 0개, 1개, 2개, 몇몇 또는 몇 개의 불일치를 제외하고 상보적이도록) 디자인되거나,
5. HCR 헤어핀의 인접 영역에 하이브리드화하도록 디자인되거나,
6. HCR 헤어핀의 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인되거나,
7. HCR 헤어핀의 중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인되거나,
8. HCR 헤어핀의 인접 영역에 상보적인 서열을 갖도록 디자인되거나,
9. HCR 헤어핀의 비-중첩 영역에 상보적인 서열을 갖도록 디자인되거나,
10. HCR 헤어핀의 중첩 영역에 상보적인 서열을 갖도록 디자인되거나,
11. HCR 헤어핀의 인접 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 갖도록 디자인되거나,
12. HCR 헤어핀의 비-중첩 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 갖도록 디자인되거나,
13. HCR 헤어핀의 중첩 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 갖도록 디자인된다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은
1. 표적의 인접 영역에 결합하도록 구성되거나,
2. 표적의 비-중첩 영역(예를 들어, 0개, 1개 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된 영역, 또는 0, 1 또는 2 이상의 nm에 의해 분리된 영역)에 결합하도록 구성되거나,
3. 표적의 중첩 영역(예를 들어, 1개 또는 2개 이상의 뉴클레오타이드에 의해 중첩되는 영역, 또는 1 또는 2 이상의 nm에 의해 중첩되는 영역)에 결합하도록 구성되거나,
4. 표적의 인접 영역에 결합하도록 디자인되거나,
5. 표적의 비-중첩 영역에 결합하도록 디자인되거나,
6. 표적의 중첩 영역에 결합하도록 디자인되거나,
7. 표적의 인접 영역에 하이브리드화하는 서열을 갖도록 디자인되거나,
8. 표적의 비-중첩 영역에 하이브리드화하는 서열을 갖도록 디자인되거나,
9. 표적의 중첩 영역에 하이브리드화하는 서열을 갖도록 디자인된다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개의 분획 개시제 프로브를 포함한다. 2개의 분획 개시제 프로브는 동족 표적에 결합하여 전체 HCR 개시제를 공국소화한다. 그 다음, 공국소화된 전체 HCR 개시제는 동족 HCR 헤어핀에 결합하여 HCR 중합을 개시하고, 이때 하나의 분획 개시제는 헤어핀에 하이브리드화하여 제1 이중체를 형성하고 다른 분획 개시제는 헤어핀에 하이브리드화하여 제2 이중체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 2개의 이중체 사이에 에너지 면에서 불리한 연접부가 존재한다. 일부 실시양태에서, 분획 개시제가 헤어핀의 중첩 영역에 결합하도록 구성함으로써, 헤어핀을 따라 연접부의 위치, 및 연접부 근처에서 2개의 프로브와 헤어핀의 3차 구조는 에너지 면에서 더 유리한 입체구조로 이완되어, 공국소화된 전체 개시제와 HCR 헤어핀 사이의 친화성을 증가시킴으로써, 주어진 시간 동안 생성된 증폭된 HCR 신호의 양을 증가시킨다(예를 들어, 도 27 및 28). 일부 실시양태에서, 분자들 사이의 연접부가 에너지 면에서 유리한 입체구조로 이완될 수 있게 하기 위해 2개의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 영역에 결합하도록 구성함으로써 2개의 프로브와 동족 표적 사이의 친화성을 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트가 동일한 샘플에서 상이한 표적에 결합하는 데 사용되는 다중화 실험을 위해 디자인되고, 이때 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트는 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트가 동일한 샘플에서 사용되는 다중화 실험을 위해 디자인되고, 이때 프로브 세트의 1% 초과, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 30% 초과, 50% 초과 또는 100%는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트가 동일한 샘플에서 상이한 표적에 결합하는 데 사용되는 다중화 실험을 위해 디자인되고, 이때 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트는 HCR 헤어핀의 중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된 분획 개시제를 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트는 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트가 동일한 샘플에서 사용되는 다중 실험을 위해 디자인되고, 이때 프로브 세트의 1% 초과, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 30% 초과, 50% 초과 또는 100%는 HCR 헤어핀의 중첩 영역에 상보적이도록 디자인된 서열을 가진 분획 개시제를 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트가 동일한 샘플에서 상이한 표적에 결합하는 데 사용되는 다중화 실험을 위해 디자인되고, 이때 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트는 표적의 중첩 영역에 결합하도록 디자인된 표적 결합 영역을 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트는 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트가 동일한 샘플에서 사용되는 다중 실험을 위해 디자인되고, 이때 프로브 세트의 1% 초과, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 30% 초과, 50% 초과 또는 100%는 표적의 중첩 영역에 결합하도록 디자인된 표적 결합 영역을 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트가 동일한 샘플에서 상이한 표적에 결합하는 데 사용되는 다중화 실험을 위해 디자인되고, 이때 1개 이상의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함하고, 1개 이상의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트는 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 100개 이상의 프로브 세트가 동일한 샘플에서 사용되는 다중화 실험을 위해 디자인되고, 프로브 세트의 0.1% 초과, 1% 초과, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 30% 초과 또는 50% 초과는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함하고, 프로브 세트의 0.1% 초과, 1% 초과, 2% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 30% 초, 또는 50% 초과는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 HCR 헤어핀의 중첩 영역에 결합하도록 디자인된 분획 개시제를 포함하고, 이때 중첩 영역은 1개의 염기, 또는 2개의 염기, 또는 3개의 염기, 또는 4개의 염기, 또는 5개의 염기, 또는 더 많은 염기에 의해 중첩된다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 표적의 중첩 영역에 결합하도록 디자인된 표적 결합 영역을 포함하고, 이때 중첩 영역은 적어도 0.1 nm, 또는 적어도 0.2 nm, 또는 적어도 0.3 nm, 또는 적어도 0.5 nm, 또는 적어도 1 nm, 또는 적어도 2 nm, 또는 적어도 3 nm, 또는 적어도 5 nm에 의해 중첩된다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 표적의 중첩 영역에 결합하도록 디자인된 서열을 포함하는 표적 결합 영역을 포함하고, 이때 중첩 영역은 적어도 1개의 염기, 또는 2개의 염기, 또는 3개의 염기, 또는 4개의 염기, 또는 5개의 염기, 또는 더 많은 염기에 의해 중첩된다.
개시제-표지된 프로브의 물질 및 조성. 일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 HCR 개시제를 포함한다(예를 들어, 도 39a 내지 39n 및 42a 내지 42f). 각각의 도메인은 DNA, RNA, 2'OMe-RNA, PNA, XNA, 화학적으로 변형된 핵산, 합성 핵산 유사체, 아미노산, 합성 아미노산 유사체, 및/또는 도메인의 목적에 적합한 임의의 다른 분자를 비롯한 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어:
1. 개시제-표지된 프로브는 DNA로 만들어진 하나 이상의 개시제, 및 DNA로 만들어진 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
2. 개시제-표지된 프로브는 DNA로 만들어진 하나 이상의 개시제, 및 아미노산으로 만들어진 표적 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 나노바디 또는 항체 단편)을 포함할 수 있다.
3. 개시제-표지된 프로브는 합성 핵산 유사체로 만들어진 개시제, 및 DNA와 2'OMe-RNA의 조합으로 만들어진 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
4. 개시제-표지된 프로브는 2'OMe-RNA로 만들어진 개시제, 및 RNA와 단백질의 조합으로 만들어진 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
5. 개시제-표지된 프로브는 DNA로 만들어진 개시제, 및 PNA로 만들어진 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
6. 개시제-표지된 프로브는 임의의 핵산 또는 핵산 유사체로 만들어진 하나 이상의 개시제, 및 표적 분자에 결합하기에 적합한 물질의 임의의 조합으로 만들어진 하나 이상의 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브는 공유 결합된 단일 분자를 포함할 수 있거나, 비-공유 상호작용하여 복합체를 형성하는 2개 이상의 분자(각각 공유 결합됨)를 포함할 수 있다. 예를 들어:
1. 개시제-표지된 프로브는 DNA로 만들어진 표적 결합 도메인에 공유 결합된, DNA로 만들어진 개시제를 포함할 수 있다.
2. 개시제-표지된 프로브는 표적 결합 도메인이 가이드 RNA(gRNA):dCas9 복합체(또는 또 다른 Cas를 사용하는 gRNA:Cas 복합체)를 포함하도록 gRNA에 비-공유 결합된 dCas9(또는 또 다른 Cas)에 공유 결합된, DNA로 만들어진 하나 이상의 개시제를 포함할 수 있다.
3. 개시제-표지된 프로브는 표적 결합 도메인이 gRNA:dCas9 복합체(또는 또 다른 Cas를 사용하는 gRNA:Cas 복합체)를 포함하도록 dCas9(또는 또 다른 Cas)에 비-공유 결합된 gRNA에 공유 결합된, DNA로 만들어진 하나 이상의 개시제를 포함할 수 있다.
4. 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 분자를 포함하는 표적 결합 도메인에 공유 결합되거나 비-공유 결합된, 핵산 또는 핵산 유사체로 만들어진 개시제를 포함할 수 있다.
분획 개시제 프로브의 물질 및 조성. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 분획 개시제 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 3a 및 3b, 5a 내지 5e, 및 38). 각각의 도메인은 DNA, RNA, 2'OMe-RNA, PNA, XNA, 화학적으로 변형된 핵산, 합성 핵산 유사체, 아미노산, 합성 아미노산 유사체, 및/또는 도메인의 목적에 적합한 임의의 다른 분자를 비롯한 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어:
1. 분획 개시제 프로브는 DNA로 만들어진 하나 이상의 분획 개시제 도메인, 및 DNA로 만들어진 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
2. 분획 개시제 프로브는 DNA로 만들어진 하나 이상의 분획 개시제 도메인, 및 아미노산으로 만들어진 표적 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 나노바디 또는 항체 단편)을 포함할 수 있다.
3. 분획 개시제 프로브는 합성 핵산 유사체로 만들어진 분획 개시제 도메인, 및 DNA와 2'OMe-RNA의 조합으로 만들어진 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
4. 분획 개시제 프로브는 2'OMe-RNA로 만들어진 분획 개시제 도메인, 및 RNA와 단백질의 조합으로 만들어진 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
5. 분획 개시제 프로브는 DNA로 만들어진 분획 개시제 도메인, 및 PNA로 만들어진 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
6. 분획 개시제 프로브는 임의의 핵산 또는 핵산 유사체로 만들어진 하나 이상의 분획 개시제 도메인, 및 표적 분자에 결합하기에 적합한 물질의 임의의 조합으로 만들어진 하나 이상의 표적 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브는 공유 결합된 단일 분자를 포함할 수 있거나, 비-공유 상호작용하여 복합체를 형성하는 2개 이상의 분자(각각 공유 결합됨)를 포함할 수 있다. 예를 들어:
1. 분획 개시제 프로브는 DNA로 만들어진 표적 결합 도메인에 공유 결합된, DNA로 만들어진 분획 개시제 도메인을 포함할 수 있다.
2. 분획 개시제 프로브는 표적 결합 도메인이 가이드 RNA(gRNA):dCas9 복합체(또는 또 다른 Cas를 사용하는 gRNA:Cas 복합체)를 포함하도록 gRNA에 비-공유 결합된 dCas9(또는 또 다른 Cas)에 공유 결합된, DNA로 만들어진 하나 이상의 분획 개시제 도메인을 포함할 수 있다.
3. 분획 개시제 프로브는 표적 결합 도메인이 gRNA:dCas9 복합체(또는 또 다른 Cas를 사용하는 gRNA:Cas 복합체)를 포함하도록 dCas9(또는 또 다른 Cas)에 비-공유 결합된 gRNA에 공유 결합된, DNA로 만들어진 하나 이상의 분획 개시제 도메인을 포함할 수 있다.
4. 분획 개시제 프로브는 하나 이상의 분자를 포함하는 표적 결합 도메인에 공유 결합되거나 비-공유 결합된, 핵산 또는 핵산 유사체로 만들어진 분획 개시제 도메인을 포함할 수 있다. 프로브 유닛 내의 각각의 분획 개시제 프로브는 프로브 유닛 내의 다른 분획 개시제 프로브와 동일하거나 상이한 물질 조성을 가질 수 있다. 프로브 유닛 내의 각각의 분획 개시제 프로브는 동일한 표적 분자의 상이한 검출 부위, 또는 표적 분자 복합체 내의 상이한 검출 부위, 또는 인접 분자 또는 복합체의 표적 집합체 내의 상이한 검출 부위에 결합하는 표적 결합 영역을 가질 수 있다.
분획 개시제 프로브를 이용한 무세척 신호 생성 및 HCR 신호 증폭. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브 및 HCR 증폭제는 미사용 프로브 및 증폭제가 샘플로부터 제거되지 않는 무세척 프로토콜을 이용하여 신호를 생성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 2개 이상의 분획 개시제 프로브는 개별 분획 개시제 프로브가 HCR 신호 증폭을 효율적으로 유발하기에 충분하지 않으나, 각각의 프로브의 표적 결합 도메인과 표적의 동족 검출 부위의 결합 시, 분획 개시제가 공국소화되어 전체 HCR 개시제를 생성하고 연결된 HCR 증폭 중합체의 성장을 유발하도록 분획 개시제 및 표적 결합 영역을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 HCR 헤어핀은 하나 이상의 리포터, 및/또는 하나 이상의 소광제, 및/또는 FRET 쌍의 하나 이상의 구성요소로 표지된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 연결된 HCR 증폭 중합체를 성장시키기 위해 교대 H1 및 H2 중합 단계의 중합 캐스케이드를 겪는 2개의 HCR 헤어핀 H1 및 H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 연결된 HCR 증폭 중합체를 성장시키기 위해 교대 H1, H2, H3 및 H4 중합 단계의 중합 캐스케이드를 겪는 4개의 HCR 헤어핀 H1, H2, H3 및 H4를 포함한다. 일부 실시양태에서, HCR 헤어핀의 하나 이상의 리포터는 중합 전에 소광된 상태로 존재하고 중합 후에 소광되지 않은 상태로 존재한다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍을 포함하는 2개의 리포터는 HCR 중합 전에 효율적인 FRET를 수행하기에 충분히 가깝지 않으나, 중합 후에 효율적인 FRET를 수행할 정도로 충분히 가깝다. 일부 실시양태에서, HCR 신호 생성은 a) HCR 단량체가 개방되어 HCR 중합체를 연결할 때 겪는 입체구조적 변화, 및/또는 b) HCR 중합체 내의 2개 이상의 HCR 헤어핀의 공국소화로 인해 샘플의 총 HCR 신호가 HCR 중합 후보다 HCR 중합 전에 더 낮도록 입체구조에 의존한다. 일부 실시양태에서, HCR 신호는 연결된 HCR 증폭 중합체의 성장으로 인해 표적 부위에 집중된다. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브 및 HCR 증폭제는 미사용 프로브 및 증폭제가 샘플로부터 제거되지 않는 무세척 프로토콜을 이용하여 신호를 생성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브 및 HCR 증폭제는 임의의 살아있는 세포, 살아있는 유기체, 조직 박편, 뇌 슬라이스, 벌크 용액, 고정된 세포, 고정된 조직 또는 고정된 배아 내의 하나 이상의 표적을 포함하는 샘플에 대해 무세척 프로토콜을 이용하여 신호를 생성하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 표적은 가교결합되지 않고/않거나, 샘플 내에서 고정되지 않고/않거나, 고체 지지체에 포획되지 않는다. 일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 HCR 증폭이 전체 기질을 공국소화하도록 분획 기질인 표지를 포함한다(예를 들어, 도 18f 참조). 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 HCR 증폭 중합체 내에서 표지 가닥과 전체 공국소화된 것의 하이브리드화가 표지 가닥으로부터 차단제 가닥을 이탈시켜, 소광제로부터 리포터를 분리하고 신호를 생성하도록 (소광제에 접합된) 차단제 가닥에 하이브리드화된 (리포터에 접합된) 표지 가닥을 포함한다.
샘플로부터의 신호의 제거. 일부 실시양태에서, HCR 신호는 신호를 검출한 후 샘플로부터 제거된다(예를 들어, 도 23a 내지 23n 및 도 40a 내지 40n 참조). 샘플에서 신호 생성 리포터의 수를 감소시키는 임의의 방법으로 샘플로부터 신호를 제거할 수 있다. 예를 들어:
어세이 포맷. 일부 실시양태에서, HCR 신호는 블롯, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 서던 블롯, 스팟 블롯, 종이 어세이, 유세포분석 어세이, 형광 유세포분석 어세이, 세포 분류 어세이, 형광 활성화 세포 분류 어세이, 자기 활성화 세포 분류 어세이, 현미경관찰 어세이, 광학 현미경관찰 어세이, 에피형광 현미경관찰 어세이, 공초점 현미경관찰 어세이, 광 시트관찰 현미경 어세이, 마이크로어레이 어세이, 비드 기반 어세이, 질량 분광측정 어세이, 형광 현미경관찰 어세이, 질량 분광측정 현미경관찰 어세이, 질량 분광측정 유세포분석 어세이, 형광 어세이, 화학발광 어세이, 생체발광 어세이, 비색 어세이, 전기화학적 임피던스 어세이, 전기화학적 화학발광 어세이, 에너지 소산 어세이, 인간의 눈을 사용한 어세이, 휴대폰 카메라를 사용한 어세이, 겔 전기영동 어세이, 제자리 하이브리드화(ISH) 어세이, RNA-ISH 어세이, DNA-ISH 어세이, 면역조직화학(IHC) 어세이, 자가방사선촬영 어세이, 또는 HCR 증폭 중합체에 의해 생성된 신호를 검출할 수 있는 임의의 어세이를 포함하나 이들로 제한되지 않는 다양한 어세이 포맷으로 측정될 수 있다.
샘플 유형. 일부 실시양태에서, HCR 개시제-표지된 프로브 및/또는 HCR 분획 개시제 프로브는 샘플에서 표적을 검출하기 위해 HCR 증폭 헤어핀과 함께 사용될 수 있고, 이때 상기 표적은 분자, 복합체, 또는 인접 분자 또는 복합체의 집합체를 포함한다. 표적 분자는 예를 들어, 박테리아, 제브라피쉬 배아, 닭 배아, 마우스 배아, 인간 생검 표본, 인간 조직 박편, FFPE 조직 박편, 소변 샘플, 혈액 샘플, 대변 샘플, 마우스 조직 박편, 뇌 슬라이스, 성게 배아, 선충류 유충, 초파리 배아, 모델 유기체, 비-모델 유기체, 유기체 다종 혼합물, 알려지지 않은 유기체를 함유하는 환경 샘플, 유기체의 컨소시엄(예를 들어, 또 다른 유기체의 장내 원생생물과 박테리아의 혼합물), 흰개미, 미생물군집, 임상 표본, 진단 샘플, 객담 샘플, 종양 생검 샘플, 연구 샘플, 인간으로부터의 물질을 포함하는 샘플, 반려동물(예를 들어, 개, 고양이, 토끼, 도마뱀, 뱀 또는 물고기)로부터의 물질을 포함하는 샘플, 야생 동물(예를 들어, 치타, 코끼리, 코뿔소 또는 침팬지)로부터의 물질을 포함하는 샘플, 멸종된 동물(예를 들어, 털매머드, 도도새, 자이언트 바다쇠오리, 트리세라톱스 또는 패신저 비둘기)로부터의 물질을 포함하는 샘플, 살아있는 세포(예를 들어, 박테리아 또는 배양된 포유동물 세포), 또는 살아있는 유기체(예를 들어, 살아있는 마우스 또는 살아있는 인간)을 비롯한 샘플 내에 함유될 수 있다.
일부 실시예에서, 표적은 샘플 내의 용액에서 자유로울 수 있다. 예를 들어, 표적은 시험 튜브, 세포, 배아, 유기체, 조직 박편, 생물학적 표본 또는 다른 샘플 내의 용액에서 자유로울 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적은 고체 지지체에 공유 또는 비공유 부착된 하나 이상의 포획 프로브에 공유 가교결합될 수 있거나 비-공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 마이크로어레이 또는 비드에 공유 결합된 포획 프로브에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다.
일부 실시양태에서, 표적은 고체 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 고정될 수 있거나, 공유 가교결합될 수 있거나, 비-공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 표적은 슬라이드, 블롯, 막, 종이 기판 또는 임의의 다른 기판에 결합될 수 있거나, 고정될 수 있거나 공유 가교결합될 수 있다. 표적은 세포, 배아, 유기체, 조직 박편, 생물학적 표본 또는 임의의 다른 샘플에 고정될 수 있거나 공유 가교결합될 수 있다. 표적은 고정되고 침투 가능해진 샘플, 고정되었으나 침투 가능해지지 않은 샘플, 또는 고정되지 않았으나 침투 가능해진 샘플 내에서 공유 결합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적은 살아있는 세포, 살아있는 배아, 살아있는 유기체, 살아있는 생태계, 또는 유기체의 컨소시엄(예를 들어, 포유동물의 장내 미생물군집) 내에서 자유로울 수 있다. 표적은 세포 또는 유기체와 연관될 수 있으나 이들의 외부에 존재할 수 있거나, 세포 또는 유기체 내에 함유될 수 있다. 표적은 살아있는 세포, 살아있는 배아, 살아있는 유기체, 살아있는 생태계 또는 유기체의 살아있는 컨소시엄 내에서 공유 가교결합될 수 있다. 표적은 샘플 내의 하나 이상의 세포 유형 내에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 표적은 샘플 내의 하나 이상의 유기체 종 내에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 표적은 표적 분자에 대한 상이한 정도의 유사성을 가진 하나 이상의 오프-표적을 함유하는 샘플 내에 존재할 수 있다. 표적은 확장된 샘플 내에 존재할 수 있다. 표적은 압축된 샘플 내에 존재할 수 있다. 샘플은 분자들 사이의 공간적 분리를 증가시키기 위해 표적을 검출하기 전에 확장될 수 있다. 샘플은 분자들 사이의 공간적 분리를 감소시키기 위해 표적을 검출하기 전에 압축될 수 있다. 표적 및/또는 다른 분자는 샘플이 확장됨에 따라 샘플 내의 분자들 사이의 상대적 위치를 유지하기 위해 확장된 샘플에 가교결합될 수 있다. 표적 및/또는 다른 분자는 샘플이 확장됨에 따라 샘플 내의 분자의 상대적 위치 및/또는 배향을 유지하면서 샘플을 확장하도록 샘플에 도입된 겔, 매트릭스 또는 다른 시약에 가교결합될 수 있다. 샘플은 샘플 내의 상이한 조직 및/또는 장기에서 상이한 확장률 및/또는 압축률로 차등적으로 확장될 수 있고/있거나 압축될 수 있다.
샘플의 고정. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 실험의 후속 단계 동안 보유되도록 샘플에 가교결합될 수 있다. 예를 들어, 표적 분자는 화학 시약(예를 들어, 포름알데하이드, 파라포름알데하이드, EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드))를 사용함으로써 샘플에 가교결합될 수 있다.
샘플의 침투 가능화. 일부 실시양태에서, 샘플은 HCR 프로브 및 증폭제에의 표적 분자의 접근성을 향상시키도록 처리될 수 있다. 예를 들어, 샘플(예를 들어, 세포, 조직 박편 또는 전체 표본고정 배아)은 화학 시약(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 세제) 또는 효소(예를 들어, 프로테이나제 K)를 사용함으로써 침투 가능하게 만들어질 수 있다. 표적 접근성은 샘플 균질화, 미세해부, 전기천공, 박편화, 열처리(예를 들어, 문헌[Smith JJ, Gunasekera TS, Barardi CR, Veal D, Vesey G (2004) J Appl Microbiol 96(2):409-417]), 및/또는 마이크로파 처리(예를 들어, 문헌[Lan HY, Mu W, NG YY, Nikolic-Paterson DH, & Atkins RC (1996) J Histochem Cytochem 44(3):281-287])를 통해 향상될 수도 있다. 또 다른 옵션은 화학적 형질감염 시약을 사용하여 세포막을 가로질러 HCR 프로브 및 증폭제를 전달하는 것이다.
샘플로부터 결합되지 않은 시약을 제거하기 위한 샘플 세척. 일부 실시양태에서, 샘플로부터 미사용 영상화 시약을 세척하여 배경을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 세척을 이용하여 샘플로부터 프로브, HCR 개시제-표지된 프로브, HCR 분획 개시제 프로브, HCR 증폭 헤어핀, 증폭 시약, 표지 프로브, 항체 및/또는 다른 영상화 시약을 제거할 수 있다. 세척은 특이적으로 결합된 영상화 시약이 거의 제거되지 않고(신호 유지), 비-특이적으로 결합된 영상화 시약이 주로 제거되도록(배경 감소) 화학 시약을 사용함으로써 일정 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 세척 완충제는 변성제(예를 들어, 포름아미드, 우레아), 염 완충제(예를 들어, 염화나트륨 구연산나트륨(SSC), 인산염 완충 식염수(PBS)), 산(예를 들어, 구연산), 계면활성제(예를 들어, Tween 20, Triton-X, SDS) 또는 차단제(예를 들어, tRNA, 연어 정자 DNA, BSA, 피콜(ficoll), 폴리비닐피롤리돈, 헤파린)를 포함할 수 있다. 세척 완충제는 세척 온도(예를 들어, 25℃ 내지 80℃)와 조합되어 세척 엄격성을 최적화할 수 있다.
정확하고 정밀한 표적 정량. 일부 실시양태에서, HCR 프로브 및 HCR 증폭제는 해부학적 환경에서 표적 분자의 정량적 분석을 제공하여, 영상화 복셀(voxel)당 표적 분자의 수에 거의 비례하여 커지는 신호를 생성한다. 이 정량적 특성은 영상화 동안 세 가지 수준에서 발생하는 신호의 합산으로부터 나온다: 1) 표적 분자당 하나 이상의 개시제-표지된 프로브 또는 표적 분자당 하나 이상의 프로브 유닛(2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함함)에 대한 합산. 2) 개시제-표지된 프로브, 또는 전체 개시제를 공국소화하는 분획 개시제 프로브의 프로브 유닛에 연결된 증폭 중합체당 다수의 HCR 증폭 헤어핀에 대한 합산. 3) 영상화 픽셀에서 0개 또는 1개 이상의 표적 분자에 대한 합산. 인접 픽셀의 강도를 평균화하는 영상화 복셀을 정의함으로써 아세포 해상도를 여전히 유지하면서 정량적 정밀도를 더 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 아세포 해상도를 이용한 정확하고 정밀한 정량적 영상화는 도 11a 및 11b에서 mRNA 표적에 대해 입증되고 도 41a 내지 41c에서 단백질 표적에 대해 입증된다. HCR 신호의 정량적 특성은 HCR 프로브의 결합 특성, HCR 증폭 헤어핀의 중합 특성 및 중심 한계 정리로부터 나오고, 이 정리는 영상 획득 동안 및 후에 합산 및 평균화를 활용하여 표적 존재도에 거의 비례하여 커지는 신호를 생성한다. 동일한 정량적 특성이 다른 어세이 포맷에 적용되고, 이때 합산 및/또는 평균화는 (예를 들어, 유세포분석기 또는 블롯 스캐너에 의해) 데이터 획득 동안 및/또는 후에 일어난다.
개시제-표지된 프로브를 사용한 다중화. 일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브를 포함하는 HCR 프로브 세트 및 HCR 헤어핀을 포함하는 HCR 증폭제는 다수의 표적들이 동일한 시간에 동일한 샘플에서 분석되는 다중화 표적 분석(예를 들어, 영상화, 블롯팅, 유세포분석, 질량 세포분석, 겔 분석, 또는 임의의 다른 분석 모드를 통한 표적 분석)에 사용될 수 있다. N개의 관심 있는 표적 유형들 중 일부 또는 전부뿐만 아니라, 관심 없는 0개 또는 1개 이상의 추가 오프-표적 종도 함유하는 샘플을 고려한다. 각각의 표적은 동족 표적에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브(하나 이상의 HCR 개시제를 각각 포함함)를 포함하는 프로브 세트를 사용함으로써 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, N개의 표적 유형들 각각에 대한 프로브 세트는 상이한 HCR 증폭제에 대한 HCR 개시제로 표지된다. 예를 들어, 표적 1은 HCR 증폭제 1을 위한 HCR 개시제로 표지된 프로브 세트 1에 의해 검출될 수 있고, 표적 2는 HCR 증폭제 2를 위한 HCR 개시제로 표지된 프로브 세트 2에 의해 검출될 수 있고, 이때 프로브 세트 N은 HCR 증폭제 N을 위한 HCR 개시제로 표지된다.
일부 실시양태에서, N개의 프로브 세트는 다른 프로브 세트 및/또는 표적이 샘플에 존재하는지 여부와 관계없이 각각의 프로브 세트가 그의 동족 표적에 선택적으로 결합하도록 오르토고날하게(orthogonally) 작동한다. 일부 실시양태에서, N개의 증폭제는 1) 각각의 증폭제에 대한 헤어핀이 동족 HCR 개시제의 부재 하에 준안정적으로 공존하고, 2) 다른 증폭제가 샘플에 존재하는지 여부와 관계없이 그의 동족 개시제가 존재하는 경우 각각의 증폭제가 중합하게끔 선택적으로 유발되도록 오르토고날하게 작동한다.
일부 실시양태에서, 각각의 HCR 증폭제에 의해 보유되는 표지는 다른 표지가 샘플에 존재하는지 여부와 관계없이 분석 방법이 각각의 HCR 증폭제에 의해 생성된 신호를 측정할 수 있도록 오르토고날하다(예를 들어, 형광 현미경관찰을 이용함으로써 구별될 수 있는 형광 표지, 또는 질량 세포분석을 이용함으로써 구별될 수 있는 희토류 표지).
예를 들어, 모든 표적들에 대해 개시제-표지된 프로브 및 동시적인 HCR 신호 증폭을 이용한 다중화 영상화는 도 29, 30, 41 및 43에 도시되어 있다.
일부 실시양태에서, N개의 표적 유형들(유형 j = 1, ..., N)에 대한 다중화 표적 분석은 다음과 같이 달성될 수 있다:
1. (표적 유형 j = 1, ..., N인 경우 표적 j에 결합하는 프로브 세트 j의 개시제-표지된 프로브로) 모든 표적들을 동시에 검출하기 위한 N개의 오르토고날 HCR 개시제-표지된 프로브 세트의 사용,
2. (j=1, ..., N인 경우 개시제 j에 대한 반응으로 중합하여 표적 유형 j에 연결된 증폭 중합체 j를 형성하는 증폭제 j로부터의 헤어핀으로) 모든 표적 유형들에 대한 신호를 동시에 증폭하기 위한 N개의 오르토고날 HCR 증폭제의 사용,
3. 표적 유형 j=1, ..., N인 경우 증폭제 j의 하나 이상의 헤어핀에 의해 직접적으로 보유되거나 증폭제 j의 하나 이상의 헤어핀에 간접적으로 결합된 리포터 j를 검출하기 위한 측정 장치를 이용한 샘플의 분석.
분획 개시제 프로브를 사용한 다중화. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브를 포함하는 HCR 프로브 세트 및 HCR 헤어핀을 포함하는 HCR 증폭제는 다중화 표적 분석(예를 들어, 영상화, 블롯팅, 유세포분석, 질량 세포분석, 겔 분석, 또는 임의의 다른 분석 모드를 통한 표적 분석)에 사용될 수 있고, 이때 다수의 표적들은 동일한 시간에 동일한 샘플에서 분석된다. N개의 관심 있는 표적 유형들의 일부 또는 전부뿐만 아니라, 관심 없는 0개 또는 1개 이상의 추가 오프-표적 종도 함유하는 샘플을 생각한다. 각각의 표적은 각각의 결합된 프로브 유닛이 전체 HCR 개시제를 공국소화하도록 동족 표적에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 프로브 유닛(2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함함)을 포함하는 프로브 세트를 사용함으로써 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, N개의 표적 유형들 각각에 대한 프로브 세트는 상이한 HCR 증폭제에 대한 전체 HCR 개시제를 공국소화한다. 예를 들어, 표적 1은 HCR 증폭제 1을 위한 하나 이상의 전체 HCR 개시제를 공국소화하는 프로브 세트 1에 의해 검출될 수 있고, 표적 2는 HCR 증폭제 2를 위한 하나 이상의 전체 HCR 개시제를 공국소화하는 프로브 세트 2에 의해 검출될 수 있고, 이때 프로브 세트 N은 HCR 증폭제 N을 위한 하나 이상의 전체 HCR 개시제를 공국소화한다.
일부 실시양태에서, N개의 프로브 세트는 다른 프로브 세트 및/또는 표적이 샘플에 존재하는지 여부와 관계없이 각각의 프로브 세트가 그의 동족 표적에 선택적으로 결합하도록 오르토고날하게 작동한다. 일부 실시양태에서, N개의 증폭제는 1) 각각의 증폭제에 대한 헤어핀이 동족 표적에 의해 공국소화된 동족 전체 개시제의 부재 하에 준안정적으로 공존하고, 2) 다른 증폭제가 샘플에 존재하는지 여부와 관계없이 그의 동족 전체 개시제가 그의 동족 표적에 의해 공국소화되는 경우 각각의 증폭제가 중합하게끔 선택적으로 유발되도록 오르토고날하게 작동한다.
일부 실시양태에서, 각각의 HCR 증폭제에 의해 보유되는 표지는 다른 표지가 샘플에 존재하는지 여부와 관계없이 분석 방법이 각각의 HCR 증폭제에 의해 생성된 신호를 측정할 수 있도록 오르토고날하다(예를 들어, 형광 현미경관찰을 이용함으로써 구별될 수 있는 형광 표지, 또는 질량 세포분석을 이용함으로써 구별될 수 있는 희토류 표지).
예를 들어, 모든 표적들에 대해 분획 개시제 프로브 및 동시적인 HCR 신호 증폭을 이용한 다중화 영상화는 도 10 및 11에 도시되어 있다.
일부 실시양태에서, N개의 표적 유형들(유형 j = 1, ..., N)에 대한 다중화 표적 분석은 다음과 같이 달성될 수 있다:
1. (표적 유형 j = 1, ..., N인 경우 프로브 세트 j 내의 각각의 프로브 유닛에 대해 전체 HCR 개시제를 공국소화하도록 표적 j에 결합하는 프로브 세트 j로부터의 분획 개시제 프로브로) 모든 표적들을 동시에 검출하기 위한 N개의 오르토고날 HCR 분획 개시제 프로브 세트의 사용,
2. (j=1, ..., N인 경우 전체 HCR 개시제 j에 대한 반응으로 중합하여 표적 유형 j에 연결된 증폭 중합체 j를 형성하는 증폭제 j로부터의 헤어핀으로) 모든 표적 유형들에 대한 신호를 동시에 증폭하기 위한 N개의 오르토고날 HCR 증폭제의 사용,
3. 표적 유형 j=1, ..., N인 경우 증폭제 j의 하나 이상의 헤어핀에 의해 직접적으로 보유되거나 증폭제 j의 하나 이상의 헤어핀에 간접적으로 결합된 리포터 j를 검출하기 위한 측정 장치를 이용한 샘플의 분석.
개시제-표지된 프로브와 분획 개시제 프로브의 조합을 사용한 다중화. 일부 실시양태에서, 다중화 분석은 (가능하게는 상이한 유형의) 하나 이상의 표적을 검출하기 위해 개시제-표지된 프로브를 사용하고 (가능하게는 상이한 유형의) 하나 이상의 다른 표적을 검출하기 위해 분획 개시제 프로브를 사용함으로써 샘플에서 수행된다. 예를 들어, 동일한 샘플에서 하나 이상의 단백질 표적 및 하나 이상의 작은 RNA 표적은 오르토고날 개시제-표지된 프로브에 의해 검출될 수 있고, 하나 이상의 mRNA 표적 및/또는 DNA 표적은 오르토고날 분획 개시제 프로브에 의해 검출될 수 있고, 하나 이상의 복합체 표적(2개 이상의 비-공유 결합된 분자의 복합체를 포함함)은 분획 개시제 프로브에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적에 대한 프로브 세트(하나 이상의 개시제-표지된 프로브, 또는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함함)는 오르토고날 신호를 (직접적으로 또는 간접적으로) 생성하는 오르토고날 HCR 증폭제를 유발할 것이다. 일부 실시양태에서, HCR 신호 증폭은 모든 표적 유형들에 대해 동시에 수행된다.
예를 들어, 모든 표적들에 대한 동시적인 HCR 신호 증폭과 함께, 하나 이상의 표적에 대한 개시제-표지된 프로브 및 하나 이상의 표적에 대한 분획 개시제 프로브를 사용하는 다중화 영상화는 도 31 및 32에 도시되어 있다.
스펙트럼 영상화를 이용한 다중화. 일부 실시양태에서, 서로 구별될 수 있는 표지의 수는 스펙트럼 분석을 이용함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 밴드패스(bandpass) 필터를 이용한 방출 강도의 측정이 2개의 표지들을 구별할 수 없을 정도로 2개의 형광단이 중첩 방출 스펙트럼을 가진 경우, 이들은 표지의 방출 스펙트럼이 실질적으로 중첩되더라도 상이한 파장에서의 다수의 방출 측정값을 이용하여 2개의 표지들로부터 나오는 신호를 구별하는 스펙트럼 영상화를 이용함으로써 구별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스펙트럼 영상화를 이용하여, 10개의 형광 염료를 스펙트럼으로 구별할 수 있거나, 20개의 형광 염료를 스펙트럼으로 구별할 수 있거나, 30개 이상의 형광 염료를 스펙트럼으로 구별할 수 있다.
다중리포터 중합체를 사용한 하이브리드 스펙트럼을 이용한 다중화. HCR 중합은 교대 H1 및 H2 중합 단계를 통해 진행하므로, 생성된 HCR 증폭 중합체는 1) 동일한 수의 H1 및 H2 헤어핀, 2) 하나 이상의 H1 헤어핀, 또는 3) 하나 이상의 H2 헤어핀을 함유한다. 중합체의 길이가 증가함에 따라, 중합체에서 H1 헤어핀의 비율은 0.5에 근접하고 중합체에서 H2 헤어핀의 비율도 0.5에 근접한다. 일부 실시양태에서, 헤어핀 H1은 리포터 R1으로 표지되고 헤어핀 H2는 리포터 R2로 표지된다. HCR 증폭 중합체에 의해 생성된 신호는 리포터 R1 및 리포터 R2에 의해 생성된 신호와 새로운 하이브리드 스펙트럼의 1:1 블렌드이다. 상이한 스펙트럼을 가진 N개 리포터의 세트를 고려한다. N개의 리포터는 N개 리포터의 세트로부터 선택될 수 있는 상이한 리포터 쌍의 수에 상응하는 N*(N-1)/2 하이브리드 스펙트럼을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어: 1) 6개의 리포터를 사용하여 6*5/2 = 15개의 하이브리드 리포터 스펙트럼을 생성할 수 있고, 2) 8개의 리포터를 사용하여 8*7/2 = 28개의 하이브리드 리포터 스펙트럼을 생성할 수 있고, 3) 15개의 리포터를 사용하여 15*14/2 = 105개의 하이브리드 리포터 스펙트럼을 생성할 수 있고, 4) 50개의 리포터를 사용하여 50*49/2 = 1225개의 하이브리드 리포터 스펙트럼을 생성할 수 있고, 5) 100개의 리포터를 사용하여 100*99/2 = 4950개의 하이브리드 리포터 스펙트럼을 생성할 수 있다.
NUPACK을 이용한 오르토고날 HCR 증폭제의 컴퓨터 서열 디자인. 일부 실시양태에서, 오르토고날 HCR 증폭제 세트(기질 및/또는 보조 가닥을 갖거나 갖지 않음)는 NUPACK 소프트웨어 제품군 내의 반응 경로 디자이너를 이용함으로써 디자인된다56,57. 일부 실시양태에서, 서열 디자인은 반응 경로에서 기본 단계를 표시하고 전역 크로스토크를 모델링하기 위해 표적 시험 튜브 세트를 이용함으로써 다중상태 최적화 문제로서 공식화된다56. 일부 실시양태에서, 각각의 기본 단계 튜브는 소정의 단계에 대한 온-경로(on-pathway) 하이브리드화 생성물에 상응하는 원하는 온-표적(on-target) 복합체 세트(표적 2차 구조 및 표적 농도를 각각 가짐), 및 주어진 단계에 대한 온-경로 반응물 및 오프-경로(off-pathway) 하이브리드화 크로스토크에 상응하는 원하지 않는 오프-표적 복합체 세트(사라지는 표적 농도를 각각 가짐)를 함유한다56. 이 시나리오에서, 이 기본 단계 튜브는 동족 생성물로의 동족 반응물의 완전한 전환을 촉진하고 이 동일한 반응물들 사이의 국소 하이브리드화 크로스토크에 불리하다. 일부 실시양태에서, N개의 오르토고날 시스템을 동시에 디자인하기 위해, 각각의 오르토고날 시스템에 대해 기본 단계 튜브를 특정한다. 일부 실시양태에서, 시스템들 사이의 오프-경로 상호작용에 불리하도록 디자인하기 위해, 단일 전역 크로스토크 튜브도 특정한다56. 일부 실시양태에서, 전역 크로스토크 튜브에서, 온-표적 복합체는 모든 시스템에 대한 모든 기본 단계 동안 생성된 모든 반응성 종(예를 들어, 중합을 통해 개방된 HCR 헤어핀의 단일 가닥 아웃풋 도메인)에 상응한다. 일부 실시양태에서, 전역 크로스토크 튜브에서, 오프-표적 복합체는 이 반응성 종들 사이의 비-동족 상호작용에 상응한다. 일부 실시양태에서, 전역 크로스토크 튜브 앙상블은 반응성 종이 형성하도록 의도된 동족 생성물을 누락한다(이들은 온-표적으로서 나타나지 않고 오프-표적으로서도 나타나지 않음). 이 시나리오에서, 전역 크로스토크 튜브 내의 모든 반응성 종은 강제로 반응을 수행하지 않거나(원하는 온-표적으로서 남음) 크로스토크 반응을 겪음으로써(원하지 않는 오프-표적 형성), 서열 최적화 동안 전역 크로스토크 최소화의 기반을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 디자인은 반응 경로에 고유한 상보성 제약을 받으면서 수행된다(예를 들어, 도 1a에서, 도메인 "a*"에 상보적인 도메인 "a", 도메인 "b*"에 상보적인 도메인 "b")56. 일부 실시양태에서, 서열은 다중튜브 앙상블에 걸쳐 부정확하게 페어링된 뉴클레오타이드의 평균 비율을 정량하여 앙상블 결함을 감소시킴으로써 최적화된다56. 일부 실시양태에서, 결함 가중치는 디자인 노력의 우선순위를 정하기 위해 앙상블 결함 내에 적용된다56. 앙상블 결함의 최적화는 온-경로 기본 단계에 대한 명확한 디자인인 양성 디자인 패러다임, 및 오프-경로 크로스토크에 대한 명확한 디자인인 음성 디자인 패러다임 둘 다를 구현한다56.
반복된 리포터 검출을 이용한 다중화. 일부 실시양태에서, 샘플에서 분석될 수 있는 표적의 수는 연속적인 분석 라운드에서 다수의 표적들을 검출하기 위해 동일한 N개의 표지를 사용함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, N개의 표지를 사용하여 N개의 표적을 영상화한 후, 샘플로부터 신호를 제거하고 동일한 N개의 표지를 사용하여 N개 표적의 또 다른 세트를 검출할 수 있다. 이 접근법은 1) 상이한 표적 유형의 발현 수준이 높은지 아니면 낮은지, 각각의 표적 유형 내에서 가변적인지, 그리고/또는 상이한 표적 유형에 걸쳐 가변적인지와 관계없이, 2) 상이한 표적 유형의 발현 패턴이 샘플 내에서 공간적으로 중첩되는지 아니면 중첩되지 않는지와 관계없이 동일한 샘플에서 다수의 표적 유형들을 영상화하는 데 적용될 수 있다. 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법의 예는 하기 방법 A 내지 T에 기재된 방법들을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 하기 방법 A 내지 T의 단계들 중 하나 이상의 단계 및/또는 모든 단계에서, 프로브 유형의 선택은 상이한 표적에 대해 상이할 수 있고 임의적으로 임의의 과정 내에서 혼합될 수 있다. 방법 A 내지 T의 일부 실시양태에서: 1) 모든 표적들은 개시제-표지된 프로브에 의해 검출될 수 있거나, 2) 모든 표적들은 분획 개시제 프로브에 의해 검출될 수 있거나, 3) 하나 이상의 표적은 개시제-표지된 프로브에 의해 검출될 수 있고 다른 표적은 분획 개시제 프로브에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 본원에서 한 옵션의 개시내용은 다른 것들과 이들의 조합에 대한 옵션을 제공한다. 예를 들어, "a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트를 제공하는"이라는 문장은 모든 프로브 세트들이 동일한 유형(모두 유형 a 또는 모두 유형 b)의 프로브 세트일 가능성 및 일부 프로브 세트들이 한 유형의 프로브 세트이고 일부 프로브 세트들이 다른 유형의 프로브 세트일(유형 a의 일부 및 유형 b의 일부) 가능성을 포함하는, N개의 프로브 세트 중 어느 한 프로브 세트가 어느 한 유형(a 또는 b)의 프로브 세트임을 내포한다. 본 명세서의 개시내용에서, (명확히 달리 언급되지 않는 한) 이 문맥에서 "또는"이 표시되는 임의의 실시양태의 경우 유형이 혼합될 수 있다는 것도 이해된다.
일부 실시양태에서, 하기 방법 A 내지 T 중 어느 한 방법은 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD와 조합될 수 있다. "임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있는"이라는 어구가 사용되는 경우, 이 어구는 논의되는 임의의 실시양태가 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD를 이용하는 논의된 실시양태들 중 어느 하나 이상의 실시양태와 조합될 수도 있음을 의미한다. 이것은 본원에서 제공된 다양한 방법들의 추가 조합을 명시적으로 허용한다. 유사하게, "임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있는"이라는 어구가 사용되는 경우, 이 어구는 논의되는 임의의 실시양태가 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출 및/또는 반복된 신호 제거를 이용하는 논의된 실시양태들 중 어느 하나 이상의 실시양태와 조합될 수도 있음을 의미한다. 이 어구들은 다른 개시내용 부분을 반복하기보다는 오히려 다른 개시내용 부분에 참고로 의존함으로써 개시내용을 단순화하기 위한 속기 표기법으로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법의 임의적 단계들 중 어느 하나 이상의 임의적 단계는 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법의 다른 임의적 단계들 중 어느 하나 이상의 다른 임의적 단계와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법에 대해 상이한 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법에 대해 상이한 다른 단계들 중 어느 하나 이상의 다른 단계와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법에 대해 상이한 임의적 단계들 중 어느 하나 이상의 임의적 단계는 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법에 대해 상이한 다른 임의적 단계들 중 어느 하나 이상의 다른 임의적 단계와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 A(실시예 15)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 리포터로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 A(실시예 15)는 하기 단계들을 포함한다(도 26a 참조): 단계 A1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 A2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 A3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 A4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 A5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 A6: 리포터로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조); 단계 A7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 A8: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 A(예를 들어, 이의 예는 실시예 15에 제시됨)는 하기 단계들을 포함한다(도 26a 참조): 단계 A1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 A2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 A3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 A4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 A5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 A6: 리포터로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조); 단계 A7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 A8: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 B(예를 들어, 실시예 16)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)를 포함한다:
1. N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. N개의 상이한 리포터로부터 N개의 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 B(예를 들어, 실시예 16)는 하기 단계들을 포함한다(도 26b 참조): 단계 B1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 B2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 B3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 B4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 B5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 B6: N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 B7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 B8: N개의 상이한 리포터로부터 N개의 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 B(예를 들어, 실시예 16)는 하기 단계들을 포함한다(도 26b 참조): 단계 B1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 B2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 B3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 B4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 B5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 B6: N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 B7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 B8: N개의 상이한 리포터로부터 N개의 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 C(예를 들어, 실시예 17)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 표적화함)를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 제공된 프로브 세트에 상응하는 HCR 증폭제(리포터로 표지됨)를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 리포터로부터 신호를 검출하는 단계;
9. 샘플로부터 신호를 제거하는 단계;
10. 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 C4 내지 C9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 C(예를 들어, 실시예 17)는 하기 단계들을 포함한다(도 26c 참조): 단계 C1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 C2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 C3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 C4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 C5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 C6: 제공된 프로브 세트에 상응하는 HCR 증폭제(리포터로 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조); 단계 C7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 C8: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계; 단계 C9: 샘플로부터 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 C10: 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 C4 내지 C9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 C(예를 들어, 실시예 17)는 하기 단계들을 포함한다(도 26c 참조): 단계 C1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 C2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 C3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 C4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 C5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 C6: 제공된 프로브 세트에 상응하는 HCR 증폭제(리포터로 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조); 단계 C7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 C8: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계; 단계 C9: 샘플로부터 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 C10: 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 C4 내지 C9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 D(예를 들어, 실시예 18)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 M개의 프로브 세트(M ≤ N인 경우; M개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계;
9. 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계;
10. 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 4 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 D(예를 들어, 실시예 18)는 하기 단계들을 포함한다(도 26d 참조): 단계 D1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 D2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 D3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 D4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 M개의 프로브 세트(M ≤ N인 경우; M개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 D5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 D6: M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 D7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 D8: M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; 단계 D9: 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 D10: 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 4 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 D(예를 들어, 실시예 18)는 하기 단계들을 포함한다(도 26d 참조): 단계 D1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 D2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 D3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 D4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 M개의 프로브 세트(M ≤ N인 경우; M개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 D5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 D6: M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 D7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 D8: M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; 단계 D9: 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 D10: 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 4 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 E(예를 들어, 실시예 19)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 프로브 세트들 중 하나에 상응하는 HCR 증폭제(리포터로 표지됨)를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 리포터로부터 신호를 검출하는 단계;
9. 샘플로부터 신호를 제거하는 단계;
10. 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 6 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 E(예를 들어, 실시예 19)는 하기 단계들을 포함한다(도 26e 참조): 단계 E1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 E2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 E3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 E4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 E5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 E6: 프로브 세트들 중 하나에 상응하는 HCR 증폭제(리포터로 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조); 단계 E7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 E8: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계; 단계 E9: 샘플로부터 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 E10: 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 6 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 E(예를 들어, 실시예 19)는 하기 단계들을 포함한다(도 26e 참조): 단계 E1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 E2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 E3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 E4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 E5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 E6: 프로브 세트들 중 하나에 상응하는 HCR 증폭제(리포터로 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조); 단계 E7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 E8: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계; 단계 E9: 샘플로부터 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 E10: 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 6 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 F(예를 들어, 실시예 20)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. N개의 프로브 세트 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계;
9. 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계;
10. 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 6 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 F(예를 들어, 실시예 20)는 하기 단계들을 포함한다(도 26f 참조): 단계 F1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 F2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 F3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 F4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 F5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 F6: N개의 프로브 세트들 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조); 단계 F7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 F8: M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; 단계 F9: 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 F10: 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 6 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 F(예를 들어, 실시예 20)는 하기 단계들을 포함한다(도 26f 참조): 단계 F1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 F2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 F3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 F4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 F5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 F6: N개의 프로브 세트들 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조); 단계 F7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 F8: M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; 단계 F9: 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 F10: 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 6 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 G(예를 들어, 실시예 21)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 하나 이상의 리포터로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 단계;
9. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계;
10. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계;
11. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계;
12. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계;
13. 임의적으로 단계 2 내지 12 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 G(예를 들어, 실시예 21)는 하기 단계들을 포함한다(도 26g 참조): 단계 G1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 G2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 G3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 G4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 G5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 G6: 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 G7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 G8: 하나 이상의 리포터로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 단계 G9: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 단계 G10: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; 단계 G11: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 단계 G12: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 G13: 임의적으로 단계 2 내지 12 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 G(예를 들어, 실시예 21)는 하기 단계들을 포함한다(도 26g 참조): 단계 G1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 G2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 G3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 G4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 G5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 G6: 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 G7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 G8: 하나 이상의 리포터로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 단계 G9: 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 단계 G10: 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; 단계 G11: 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 단계 G12: 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 G13: 단계 2 내지 12 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 H(예를 들어, 실시예 22)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계;
9. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
10. 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 H(예를 들어, 실시예 22)는 하기 단계들을 포함한다(도 26h 참조): 단계 H1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 H2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 H3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 H4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 H5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 H6: 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 H7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 H8: 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 H9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 H10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 H(예를 들어, 실시예 22)는 하기 단계들을 포함한다(도 26h 참조): 단계 H1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 H2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 H3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 H4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 H5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 H6: 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 H7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 H8: 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 H9: 샘플을 세척하는 단계; 단계 H10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 I(예를 들어, 실시예 23)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. N개의 상이한 기질에 상응하는 N개의 표지 프로브(상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계;
9. N개의 상이한 리포터로부터 N개의 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 I(예를 들어, 실시예 23)는 하기 단계들을 포함한다(도 26i 참조): 단계 I1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 I2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 I3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 I4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 I5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 I6: N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 I7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 I8: N개의 상이한 기질에 상응하는 N개의 표지 프로브(상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 I9: N개의 상이한 리포터로부터 N개의 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 I(예를 들어, 실시예 23)는 하기 단계들을 포함한다(도 26i 참조): 단계 I1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 I2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 I3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 I4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 I5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 I6: N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 I7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 I8: N개의 상이한 기질에 상응하는 N개의 표지 프로브(상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 I9: N개의 상이한 리포터로부터 N개의 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 J(예를 들어, 실시예 24)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. N개의 상이한 기질 중 M개의 상이한 기질에 상응하는 M개의 표지 프로브 (M ≤ N인 경우; 상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계;
9. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
10. M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계;
11. 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계;
12. 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 8 내지 11 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 J(예를 들어, 실시예 24)는 하기 단계들을 포함한다(도 26j 참조): 단계 J1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 J2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 J3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 J4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 J5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 J6: N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 J7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 J8: N개의 상이한 기질 중 M개의 상이한 기질에 상응하는 M개의 표지 프로브(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 J9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 J10: M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; 단계 J11: 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 J12: 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 J8 내지 J11 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 J(예를 들어, 실시예 24)는 하기 단계들을 포함한다(도 26j 참조): 단계 J1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 J2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 J3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 J4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 J5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 J6: N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 J7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 J8: N개의 상이한 기질 중 M개의 상이한 기질에 상응하는 M개의 표지 프로브(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 J9: 샘플을 세척하는 단계; 단계 J10: M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; 단계 J11: 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 J12: 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 J8 내지 J11 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 K(예를 들어, 실시예 25)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계;
9. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
10. 하나 이상의 리포터에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계;
11. 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계;
12. 임의적으로 단계 4 내지 11 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 K(예를 들어, 실시예 25)는 하기 단계들을 포함한다(도 26k 참조): 단계 K1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 K2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 K3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 K4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 K5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 K6: 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 K7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 K8: 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 K9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 K10: 하나 이상의 리포터에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 단계 K11: 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 K12: 임의적으로 단계 K4 내지 K11 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 K(예를 들어, 실시예 25)는 하기 단계들을 포함한다(도 26k 참조): 단계 K1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 K2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 K3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 K4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 K5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 K6: 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조); 단계 K7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 K8: 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 K9: 샘플을 세척하는 단계; 단계 K10: 하나 이상의 리포터에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 단계 K11: 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 K12: 단계 K4 내지 K11 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 L(예를 들어, 실시예 26)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트를 제공하는 단계;
5. 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
6. 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계;
7. 하나 이상의 신호를 검출하는 단계;
8. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
9. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계;
10. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계;
11. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계;
12. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계;
13. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계;
14. 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 L(예를 들어, 실시예 26)은 하기 단계들을 포함한다(도 26l 참조): 단계 L1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 L2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 L3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 L4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 L5: 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 L6: 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 L7: 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 단계 L8: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 L9: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 L10: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 단계 L11: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계; 단계 L12: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; 단계 L13: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 단계 L14: 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 L(예를 들어, 실시예 26)은 하기 단계들을 포함한다(도 26l 참조): 단계 L1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 L2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 L3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 L4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 L5: 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 L6: 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 L7: 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 단계 L8: 샘플을 세척하는 단계; 단계 L9: 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 L10: 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 단계 L11: 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계; 단계 L12: 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; 단계 L13: 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 단계 L14: 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 M(예를 들어, 실시예 27)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. 단계 5 내지 9 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 수행하는 단계;
5. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트를 제공하는 단계;
6. 하나 이상의 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성하는 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 하나 이상의 신호를 검출하는 단계;
9. 임의적으로 하나 이상의 신호를 제거하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 M(예를 들어, 실시예 27)은 하기 단계들을 포함한다(도 26m 참조): 단계 M1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 M2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 M3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 M4: 단계 M5 내지 M9 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 수행하는 단계; 단계 M5: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 M6: 하나 이상의 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성하는 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8, 18 및 20 참조); 단계 M7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 M8: 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 단계 M9: 임의적으로 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조).
일부 실시양태에서, 방법 M(예를 들어, 실시예 27)은 하기 단계들을 포함한다(도 26m 참조): 단계 M1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 M2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 M3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 M4: 단계 M5 내지 M9 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 수행하는 단계; 단계 M5: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계; 단계 M6: 하나 이상의 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성하는 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8, 18 및 20 참조); 단계 M7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 M8: 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 단계 M9: 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조).
일부 실시양태에서, 표적 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 N(예를 들어, 실시예 28)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계;
9. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
10. 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 N(예를 들어, 실시예 28)은 하기 단계들을 포함한다(도 26n 참조): 단계 N1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 N2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 N3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 N4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 22의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 N5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 N6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 N7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 N8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 N9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 N10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 N(예를 들어, 실시예 28)은 하기 단계들을 포함한다(도 26n 참조): 단계 N1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 N2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 N3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 N4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 22의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 N5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 N6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 N7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 N8: 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 N9: 샘플을 세척하는 단계; 단계 N10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 표적 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 O(예를 들어, 실시예 29)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계;
9. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
10. 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 O(예를 들어, 실시예 29)는 하기 단계들을 포함한다(도 26o 참조): 단계 O1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 O2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 O3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 O4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 21의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 O5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 O6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 O7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 O8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 O9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 O10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 O(예를 들어, 실시예 29)는 하기 단계들을 포함한다(도 26o 참조): 단계 O1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 O2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 O3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 O4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 21의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 O5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 O6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 O7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 O8: 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 O9: 샘플을 세척하는 단계; 단계 O10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 표적 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 P(예를 들어, 실시예 30)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계;
9. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
10. 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 P(예를 들어, 실시예 30)는 하기 단계들을 포함한다(도 26p 참조): 단계 P1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 P2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 P3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 P4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 27의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 P5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 P6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 P7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 P8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 P9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 P10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 P(예를 들어, 실시예 30)는 하기 단계들을 포함한다(도 26p 참조): 단계 P1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 P2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 P3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 P4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 27의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 P5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 P6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 P7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 P8: 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 P9: 샘플을 세척하는 단계; 단계 P10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 표적 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 Q(예를 들어, 실시예 31)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계;
9. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
10. 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 Q(예를 들어, 실시예 31)는 하기 단계들을 포함한다(도 26q 참조): 단계 Q1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 Q2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 Q3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 Q4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 21의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 Q5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 Q6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 Q7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 Q8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 Q9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 Q10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 Q(예를 들어, 실시예 31)는 하기 단계들을 포함한다(도 26q 참조): 단계 Q1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 Q2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 Q3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 Q4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 21의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 Q5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 Q6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 Q7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 Q8: 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 Q9: 샘플을 세척하는 단계; 단계 Q10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 표적 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 R(예를 들어, 실시예 32)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계;
9. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
10. 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 R(예를 들어, 실시예 32)은 하기 단계들을 포함한다(도 26r 참조): 단계 R1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 R2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 R3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 R4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 22의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 R5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 R6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 R7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 R8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 R9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 R10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 R(예를 들어, 실시예 32)은 하기 단계들을 포함한다(도 26r 참조): 단계 R1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 R2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 R3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 R4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 22의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 R5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 R6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 R7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 R8: 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 R9: 샘플을 세척하는 단계; 단계 R10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 표적 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 S(예를 들어, 실시예 33)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계;
9. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
10. 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 S(예를 들어, 실시예 33)는 하기 단계들을 포함한다(도 26s 참조): 단계 S1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 S2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 S3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 S4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5, 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 S5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 S6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 S7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 S8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 S9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 S10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 S(예를 들어, 실시예 33)는 하기 단계들을 포함한다(도 26s 참조): 단계 S1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 S2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 S3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 S4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5, 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 S5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 S6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 S7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 S8: 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 S9: 샘플을 세척하는 단계; 단계 S10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 반복된 리포터 검출을 이용하는 다중화 분석 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법 T(예를 들어, 실시예 34)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)이다:
1. 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
2. 임의적으로 샘플을 고정하는 단계;
3. 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계;
4. a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계;
5. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
6. 하나 이상의 리포터 및/또는 기질로 각각 표지된 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
7. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
8. 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계;
9. 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
10. 하나 이상의 리포터로부터 신호를 검출하는 단계;
11. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계;
12. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계;
13. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계;
14. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 증폭제를 제거하는 단계;
15. 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계;
16. 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 T(예를 들어, 실시예 34)는 하기 단계들을 포함한다(도 26t 참조): 단계 T1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 T2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계; 단계 T3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 T4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5, 17, 21, 22, 27의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 T5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 T6: 하나 이상의 리포터 및/또는 기질로 각각 표지된 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 T7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 T8: 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 T9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 단계 T10: 하나 이상의 리포터로부터 신호를 검출하는 단계; 단계 T11: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 T12: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 단계 T13: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계; 단계 T14: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 증폭제를 제거하는 단계; 단계 T15: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 단계 T16: 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법 T(예를 들어, 실시예 34)는 하기 단계들을 포함한다(도 26t 참조): 단계 T1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 단계 T2: 샘플을 고정하는 단계; 단계 T3: 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계; 단계 T4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5, 17, 21, 22, 27의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; 단계 T5: 샘플을 세척하는 단계; 단계 T6: 하나 이상의 리포터 및/또는 기질로 각각 표지된 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조); 단계 T7: 샘플을 세척하는 단계; 단계 T8: 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조); 단계 T9: 샘플을 세척하는 단계; 단계 T10: 하나 이상의 리포터로부터 신호를 검출하는 단계; 단계 T11: 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조); 단계 T12: 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 단계 T13: 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계; 단계 T14: 샘플로부터 하나 이상의 증폭제를 제거하는 단계; 단계 T15: 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 단계 T16: 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계.
단일 분자 바코딩을 이용한 다중화. 일부 실시양태에서, 샘플에서 분석될 수 있는 표적의 수는 상이한 분석 라운드에서 상이한 표적 유형에 사용되는 표지가 표적 분자의 각각의 종에 대한 상이한 바코드를 생성할 정도로 변경되도록 다중 분석 라운드에서 각각의 표적 분자를 분석함으로써 증가될 수 있다. 이어서, 주어진 표적 분자에 대한 바코드는 신호 측정의 바코드로서 판독된다. 예를 들어, 단일 분자 영상화를 이용하여 각각의 표적 분자의 신호를 회절 제한 점으로서 판독하는 경우, 3 라운드의 영상화를 고려한다. 각각의 주어진 표적 유형에 대해, 프로브 세트의 각각의 프로브 유닛이 표적 유형 및 영상화 라운드에 따라 적색 또는 녹색 리포터로 표지된 HCR 헤어핀을 포함하는 HCR 증폭제에 상응하는 전체 HCR 개시제를 공국소화하도록 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 배정하는 것을 고려한다. 그 다음, 예를 들어, 유형 1의 표적 분자는 바코드(적색, 적색, 녹색; 적색 리포터로 표지된 HCR 증폭제를 사용하는 라운드 1의 경우 적색 점을 표시하고, 적색 리포터로 표지된 HCR 증폭제를 사용하는 라운드 2의 경우 적색 점을 표시하고, 녹색 리포터로 표지된 HCR 증폭제를 사용하는 라운드 3의 경우 녹색 점을 표시함)로 판독될 수 있고, 유형 2의 표적 분자는 바코드(적색, 녹색, 적색)를 가질 수 있고, 유형 3의 표적 분자는 바코드(적색, 적색, 적색)를 가질 수 있고, 유형 4의 표적 분자는 바코드(녹색, 적색, 녹색)를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플에서 분석될 수 있는 표적의 수는 바코딩 라운드의 단지 일부에서 각각의 표적 분자를 검출함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 4 라운드를 이용하는 실험에서, 유형 1의 표적 분자는 바코드(적색, ---, ---, 적색; 라운드 1의 경우 적색 점을 표시하고, 라운드 2의 경우 점이 없고, 라운드 3의 경우 점이 없고, 라운드 4의 경우 적색 점을 표시함)로 판독될 수 있고, 유형 2의 표적 분자는 바코드(녹색, 적색, ---, ---)로 판독될 수 있다.
추가 실시양태
본원에서 제공된 실시양태들 및/또는 방법들 중 임의의 실시양태 및/또는 방법은 하기 실시양태들 중 임의의 실시양태와 함께 사용될 수 있거나 하기 실시양태들 중 임의의 실시양태의 대안적 형태로 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 앞서 언급된 방법은 이하에 언급된 조성물들 또는 방법들 중 임의의 조성물 또는 방법을 이용할 수 있다. 유사하게, 앞서 언급된 방법은 하기 방법을 이용하는 방법도 제공하거나 이하에 언급된 방법의 일부인 것으로 이해되어야 한다.
유사하게, 본원에서 제공된 실시양태 및/또는 방법은 방법과 관련된 실시양태, 예를 들어, 조성물, 방법의 구성요소, 키트 등도 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법들 및/또는 단계들 중 하나 이상의 방법 및/또는 단계에서 성분들 중 임의의 성분은 언급된 성분들 중 하나 이상의 성분(및 임의적으로 표적 또는 표적 서열 또는 샘플)을 포함하는 키트로서 제공될 수 있다.
조성물
조성물의 일부 실시양태는 도 12 및 13뿐만 아니라, 본원에서 제공된 다른 도면에 요약되어 있다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제(1151)를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브(1190), 및 제2 분획 개시제(1251)를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브(1290)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제(1151, 1251)는 함께 전체 개시제(1050)를 형성하고, HCR은 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체(1510, 1610)를 통해 이 전체 개시제로부터 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브(1190)는 제1 표적 결합 구획(1141)을 추가로 포함하고, 제2 분획 개시제 프로브(1290)는 제2 표적 결합 구획(1241)을 추가로 포함하고, 이때 제1 표적 결합 구획(1141)은 제1 표적 구획(1100)에 결합하도록 구성되고, 제2 표적 결합 구획(1241)은 제2 표적 구획(1200)에 결합하도록 구성된다. 이 표적 결합 구획들은 표적 분자에 효과적으로 인접하여 위치하므로, 상기 분획 개시제 프로브 둘 다가 상기 표적 둘 다에 결합될 때, (분획 개시제 프로브 내의) 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제는 전체 개시제(1050)를 형성할 정도로 충분히 가깝고, HCR은 이 전체 개시제로부터 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 분획 개시제 프로브들은 HCR 중합을 위한 헤어핀 단량체와 함께, 키트로서 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 헤어핀 단량체(1510), 제2 헤어핀 단량체(1610), 제1 분획 개시제(1151)를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브(1190), 및 제2 분획 개시제(1251)를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브(1290)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제(1151, 1251)는 함께 전체 개시제(1050)를 형성하고, HCR은 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체(1510, 1610)를 통해 이 전체 개시제로부터 진행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브 및 헤어핀 단량체를 동시에 동일한 샘플에 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브를 샘플에 도입한 후, 세척하고, 이어서 헤어핀 단량체를 샘플에 도입한 후, 세척할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브 및 헤어핀 단량체를 상이한 시간에 샘플에 도입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤어핀 단량체들 중 하나 이상의 헤어핀 단량체는 리포터 분자를 포함할 수 있으므로, 헤어핀 단량체(제1 및 제2, 및 임의적으로 그 이상)의 중합은 검출 가능한 신호전달 이벤트를 야기할 것이다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 헤어핀 단량체(들)와 공유 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 중합 후 (예를 들어, 후속 하이브리드화 이벤트에서) 후속적으로 HCR 중합체에 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 헤어핀 단량체(1510)는 표지 결합 부위(도시되지 않음)에 대한 상보체에 하이브리드화하도록 구성된 표지 결합 부위(도시되지 않음)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지 결합 부위에 대한 상보체는 리포터 분자를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, a) 제1 토홀드(1851) 및 제1 스템 구획(1755)을 포함하는 제1 인풋 도메인(1852), b) 제1 헤어핀 루프(1853) 및 제1 스템 구획에 대한 상보체(1756)를 포함하는 제1 아웃풋 도메인(1854), 및 c) 제1 리포터 분자(1850)를 포함하는 제1 헤어핀 단량체(1510)를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 a) 제2 토홀드(1951) 및 제2 스템 구획(1855)을 포함하는 제2 인풋 도메인(1952), b) 제2 헤어핀 루프(1953) 및 제2 스템 구획에 대한 상보체(1856)를 포함하는 제2 아웃풋 도메인(1954), 및 c) 제2 리포터 분자(1950)를 포함하는 제2 헤어핀 단량체(1610)를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 a) 제1 분획 개시제(1151)를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브(1190), 및 b) 제2 분획 개시제(1251)를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브(1290)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체는 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브와 함께 또는 별도로 샘플에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단량체는 함께 제공될 수 있으나, 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브와 별도로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤어핀 단량체 및 분획 개시제 프로브는 동시에 동일한 샘플에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤어핀 단량체 및 분획 개시제 프로브는 동일한 샘플에 도입될 수 있으나, 상이한 비-중첩 시간(결합되지 않은 분자를 제거하기 위한 세척이 있음)에 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 스템 구획은 제2 스템 구획과 동일한 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, 제1 스템 구획에 대한 상보체는 제2 스템 구획에 대한 상보체와 동일한 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, 제1 스템 구획에 대한 상보체는 제2 스템 구획에 대한 상보체와 동일한 서열을 갖고, 제1 스템 구획은 제2 스템 구획과 동일한 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, (2개의 헤어핀 단량체의 극성이 반대이므로, 2개의 헤어핀 단량체가 동일하지 않을지라도) 2개의 헤어핀 단량체의 토홀드 서열은 동일하고 2개의 헤어핀 단량체의 루프 서열은 동일하다.
일부 실시양태에서, 제1 토홀드(1851)는 제2 헤어핀 루프에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 제2 토홀드는 제1 헤어핀 루프에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 이 원형성은 하이브리드화 연쇄 반응이 일어날 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 제1 토홀드는 제2 헤어핀 루프에 100% 상보적이지 않지만, 하이브리드화를 허용하기에 충분하다.
일부 실시양태에서, 2개 초과의 상이한 인풋 도메인이 사용될 수 있고, 예를 들어 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 100개, 1000개, 2000개 또는 4000개 이상의 인풋 도메인이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상응하는 수의 하위부분이 각각의 인풋 도메인에 대해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물들 중 임의의 조성물은 제1 표적 구획(1100) 및 제2 표적 구획(1200)을 포함하는 표적 분자(1020)를 포함한다(예를 들어, 도 12에 도시된 바와 같음). 일부 실시양태에서, 표적 분자는 추가 표적 구획, 예를 들어 3개의 표적 구획, 4개의 표적 구획, 5개의 표적 구획, 6개의 표적 구획, 7개의 표적 구획 또는 더 많은(예를 들어, 10개, 50개, 100개 등) 표적 구획을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 구획의 수는 상응하는 수의 표적 결합 구획(예를 들어, 1141, 1241)이 있음을 의미할 것이다. 일부 실시양태에서, 이것은 (표적 구획에 결합하기 위해 더 많은 표적 결합 구획을 필요로 하기 때문에) 전체 개시제의 초기 형성에 대한 더 큰 특이성/선택성을 허용한다. 일부 실시양태에서, 이것은 한 번에 하나 초과의 표적 서열의 병렬 어세이를 허용한다(따라서, 2개 이상의 표적 결합 구획/분획 개시제 프로브를 각각 이용하여 한 번에 다수의 표적들에 대해 어세이할 수 있게 한다).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제1 분획 개시제 프로브들 중 임의의 제1 분획 개시제 프로브(1190)는 제1 표적 결합 구획(1141)을 추가로 포함하고, 본원에 기재된 제2 분획 개시제 프로브들 중 임의의 제2 분획 개시제 프로브((1290)는 제2 표적 결합 구획(1241)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 표적 결합 구획(1141)은 제1 표적 구획(1100)에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 표적 결합 구획(1241)은 제2 표적 구획(1200)에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브는 추가 표적 결합 구획, 예를 들어, 2개의 표적 결합 구획, 3개의 표적 결합 구획, 4개의 표적 결합 구획, 5개의 표적 결합 구획, 또는 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 100개, 1000개 또는 10,000개 이상의 표적 결합 구획을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 표적 결합 구획은 선택적 단백질-단백질 상호작용을 통해 (예컨대, 제1 표적 결합 구획으로서 항체를 통해) 제1 표적 구획에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 표적 결합 구획은 선택적 핵산-단백질 상호작용(예컨대, 제1 표적 결합 구획으로서 앱타머)을 통해 제1 표적 구획에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 표적 결합 구획은 선택적 단백질-단백질 상호작용을 통해(예컨대, 제2 표적 결합 구획으로서 항체를 통해) 제2 표적 구획에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 표적 결합 구획은 선택적 핵산-단백질 상호작용(예컨대, 제2 표적 결합 구획으로서 앱타머)을 통해 제2 표적 구획에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 표적 결합 구획은 하이브리드화를 통해 제1 표적 구획에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 표적 결합 구획은 하이브리드화를 통해 제2 표적 구획에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 표적 결합 구획은 공유 결합 또는 이온 결합을 통해 제1 표적 구획에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제2 표적 결합 구획은 공유 또는 이온 결합을 통해 제2 표적 구획에 결합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 존재 또는 부재를 모니터링할 수 있는 임의의 리포터 분자를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 생성된 중합체가 가시화되게 하는 형광 분자, 예컨대, 형광단, 또는 비색 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 직접적으로 관찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 간접적으로 관찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 효소를 포함하거나 효소성을 나타내고/내거나, HCR 중합 후 효소적 신호전달을 매개할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보고는 촉매작용된 리포터 침착("CARD")에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 각각의 헤어핀 단량체의 표지 결합 부위는 표지 결합 부위에 대한 상보체의 결합을 제공할 수 있고, 이때 표지 결합 부위에 대한 상보체는 리포터 분자를 보유한다. 일부 실시양태에서, 헤어핀 단량체 또는 표지 결합 부위에 대한 상보체에 의해 보유되는 한 유형의 리포터 분자는 HCR 중합체/표적 분자의 근처에서 침착된 제2 유형의 리포터 분자가 검출되도록 HCR 중합 후 효소적 신호 증폭(CARD)을 매개할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 발광 분자, FRET 분자, 형광단/소광제 분자 쌍 또는 다른 검출 가능한 마커 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 2차 분자(예컨대, 2차 항체)가 중합 이벤트의 검출에 사용될 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 헤어핀 단량체는 헤어핀 단량체가 소광되지만 HCR 중합 동안 발생하는 입체구조 변화가 형광 HCR 증폭 중합체를 유발하도록 리포터 분자(예를 들어, 형광단 및 소광제)로 표지될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법들 및/또는 단계들 중 하나 이상의 방법 및/또는 단계에서 임의의 성분은 언급된 성분들 중 하나 이상의 성분(및 임의적으로 표적 또는 표적 서열 또는 샘플)을 포함하는 조성물로서 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 5b, 5c, 5d, 5e, 8a, 8b, 12, 13, 14, 15, 16a, 16b, 16c, 16d, 17a, 17b, 17c, 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 18f, 19a, 19b, 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f, 21a, 21b, 22, 23a, 23b, 23c, 23d, 23e, 23f, 23g, 23h, 23i, 23j, 23k, 23l, 23m, 23n, 23o, 27, 28a, 29a, 29b, 30a, 30b, 31a, 32a, 33a, 33b, 33c, 33d, 33e, 34a, 34b, 34c, 35, 36a, 36b, 37a, 38, 39a, 39b, 39c, 39d, 39e, 39f, 39g, 39h, 39i, 39j, 39k, 39l, 39m, 39n, 40a, 40b, 40c, 40d, 40e, 40f, 40g, 40h, 40i, 40j, 40k, 40l, 40m, 40n, 41a, 42a, 42b, 42c, 42d, 42e, 42f, 43a, 44a, 44b, 44c, 44d, 44e, 44f, 44g, 44h, 44i, 44j, 44k, 44l, 44m, 44n, 44o, 44p, 44q, 44r, 44s, 44t, 44u, 44v, 44w, 44x, 44y, 44z, 46a, 46b, 46c, 46d, 46e, 46f, 46g, 46h, 46i, 46j, 46k, 46l 및/또는 46m 중 어느 하나 이상의 도면에서 분자들 중 어느 하나 이상의 분자 또는 분자의 조합은 조성물로서 이들의 표시된 구조적 구성요소로서 예상된다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 구성요소는 샘플에 첨가된 조성물 또는 구성요소이다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 구성요소는 도면에 나타낸 바와 같이 과정의 각각의 단계에서 첨가된 조성물 또는 구성요소이다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 구성요소는 초기에 반응에 첨가된 조성물 또는 구성요소 및/또는 도면에 표시된 임의의 반응 단계에서 첨가된 조성물 또는 구성요소이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 도 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 5b, 5c, 5d, 5e, 8a, 8b, 12, 13, 14, 15, 16a, 16b, 16c, 16d, 17a, 17b, 17c, 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 18f, 19a, 19b, 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f, 21a, 21b, 22, 23a, 23b, 23c, 23d, 23e, 23f, 23g, 23h, 23i, 23j, 23k, 23l, 23m, 23n, 23o, 27, 28a, 29a, 29b, 30a, 30b, 31a, 32a, 33a, 33b, 33c, 33d, 33e, 34a, 34b, 34c, 35, 36a, 36b, 37a, 38, 39a, 39b, 39c, 39d, 39e, 39f, 39g, 39h, 39i, 39j, 39k, 39l, 39m, 39n, 40a, 40b, 40c, 40d, 40e, 40f, 40g, 40h, 40i, 40j, 40k, 40l, 40m, 40n, 41a, 42a, 42b, 42c, 42d, 42e, 42f, 43a, 44a, 44b, 44c, 44d, 44e, 44f, 44g, 44h, 44i, 44j, 44k, 44l, 44m, 44n, 44o, 44p, 44q, 44r, 44s, 44t, 44u, 44v, 44w, 44x, 44y, 44z, 46a, 46b, 46c, 46d, 46e, 46f, 46g, 46h, 46i, 46j, 46k, 46l 및/또는 46m 중 어느 한 도면에 나타낸 바와 같이 분자와 표적의 하이브리드화를 포함하는 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 구성요소는 도 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 5b, 5c, 5d, 5e, 8a, 8b, 12, 13, 14, 15, 16a, 16b, 16c, 16d, 17a, 17b, 17c, 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 18f, 19a, 19b, 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f, 21a, 21b, 22, 23a, 23b, 23c, 23d, 23e, 23f, 23g, 23h, 23i, 23j, 23k, 23l, 23m, 23n, 23o, 27, 28a, 29a, 29b, 30a, 30b, 31a, 32a, 33a, 33b, 33c, 33d, 33e, 34a, 34b, 34c, 35, 36a, 36b, 37a, 38, 39a, 39b, 39c, 39d, 39e, 39f, 39g, 39h, 39i, 39j, 39k, 39l, 39m, 39n, 40a, 40b, 40c, 40d, 40e, 40f, 40g, 40h, 40i, 40j, 40k, 40l, 40m, 40n, 41a, 42a, 42b, 42c, 42d, 42e, 42f, 43a, 44a, 44b, 44c, 44d, 44e, 44f, 44g, 44h, 44i, 44j, 44k, 44l, 44m, 44n, 44o, 44p, 44q, 44r, 44s, 44t, 44u, 44v, 44w, 44x, 44y, 44z, 46a, 46b, 46c, 46d, 46e, 46f, 46g, 46h, 46i, 46j, 46k, 46l 및/또는 46m 중 어느 한 도면에 나타낸 바와 같이 과정 또는 프로토콜의 마지막 단계에서의 조성물 또는 구성요소이다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 구성요소는 적절한 도 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 5b, 5c, 5d, 5e, 8a, 8b, 12, 13, 14, 15, 16a, 16b, 16c, 16d, 17a, 17b, 17c, 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 18f, 19a, 19b, 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f, 21a, 21b, 22, 23a, 23b, 23c, 23d, 23e, 23f, 23g, 23h, 23i, 23j, 23k, 23l, 23m, 23n, 23o, 27, 28a, 29a, 29b, 30a, 30b, 31a, 32a, 33a, 33b, 33c, 33d, 33e, 34a, 34b, 34c, 35, 36a, 36b, 37a, 38, 39a, 39b, 39c, 39d, 39e, 39f, 39g, 39h, 39i, 39j, 39k, 39l, 39m, 39n, 40a, 40b, 40c, 40d, 40e, 40f, 40g, 40h, 40i, 40j, 40k, 40l, 40m, 40n, 41a, 42a, 42b, 42c, 42d, 42e, 42f, 43a, 44a, 44b, 44c, 44d, 44e, 44f, 44g, 44h, 44i, 44j, 44k, 44l, 44m, 44n, 44o, 44p, 44q, 44r, 44s, 44t, 44u, 44v, 44w, 44x, 44y, 44z, 46a, 46b, 46c, 46d, 46e, 46f, 46g, 46h, 46i, 46j, 46k, 46l 및/또는 46m 중 어느 한 도면에 나타낸 바와 같이 표적에 부착되거나 결합된 표지를 가진 조성물 또는 구성요소(표적에 부착되거나 결합된 표지를 가진 조성물 또는 구성요소)이다.
방법
일부 실시양태에서, 방법을 제공된다. 이 방법은 (i) 제1 분획 개시제 프로브(1190), 제2 분획 개시제 프로브(1290), 제1 헤어핀 단량체(1510), 제2 헤어핀 단량체(1610) 및 표적 분자(1020)를 제공하는 단계; (ii) 인큐베이션하여 결합하게 하는 단계, 및 (iii) 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR을 수행하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 제1 분획 개시제(1151) 및 제2 분획 개시제(1251)를 샘플에 첨가하는 단계로서, 제1 분획 개시제(1151) 및 제2 분획 개시제(1251)가 함께 전체 HCR 개시제를 제공하는 것인 단계, 및 (ii) 전체 HCR 개시제의 존재 하에 HCR이 일어나도록 HCR 헤어핀 단량체 세트를 샘플에 첨가하는 단계를 포함한다. HCR 헤어핀 단량체 세트는 HCR을 통해 중합하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) I. 제1 분획 개시제(1151)를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브(1190), 및 II. 제2 분획 개시제(1251)를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브(1290)를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 III. a. 제1 토홀드(1851) 및 제1 스템 구획(1755)을 포함하는 제1 인풋 도메인(1852), b. 제1 헤어핀 루프(1853) 및 제1 스템 구획에 대한 상보체(1756)를 포함하는 제1 아웃풋 도메인(1854), 및 c. 제1 리포터 분자(1850)를 포함하는 제1 헤어핀 단량체(1510)를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, IV. a. 제2 토홀드(1951) 및 제2 스템 구획(1855)을 포함하는 제2 인풋 도메인(1952), b. 제2 헤어핀 루프(1953) 및 제2 스템 구획에 대한 상보체(1856)를 포함하는 제2 아웃풋 도메인(1954), 및 c. 제2 리포터 분자(1950)를 포함하는 제2 헤어핀 단량체(1610)도 제공한다. V. 표적 분자(1020)도 제공한다. 상기 방법은 (b) 제공된 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 표적과 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 언급된 바와 같이, 분획 개시제 프로브는 2개의 분획 개시제를 공국소화함으로써 전체 개시제를 형성하도록 표적 결합 구획을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브를, 먼저 표적을 포함할 수 있는 샘플에 첨가한 다음, 결합된 분획 개시제 프로브를 유지하면서 벌크 용액을 세척할 수 있고, 이어서 표적에 특이적으로 결합된 분획 개시제 프로브는 분획 개시제를 공국소화하고 HCR을 유발하나, 비-특이적으로 결합된 개별 분획 개시제 프로브는 전체 개시제를 공국소화하지 않고 HCR을 유발하지 않도록 헤어핀 단량체를 첨가할 수 있다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법에서, 분자, DNA 분자, RNA 분자, 단백질 분자, 소분자, 합성 분자 또는 분자의 복합체 중 어느 하나 이상을 검출할 수 있고/있거나 어세이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 하나 초과의 표적, 예컨대, 단백질의 복합체, 또는 단백질과 핵산의 복합체 등이다. 따라서, 단백질의 결합은 본 발명의 분획 개시제 접근법에 의해 어세이될 수 있다. 일부 실시양태에서, 무기 또는 비-유기 물질도 어세이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분획 개시제 프로브의 일부가 될 수 있는 표적에 결합할 수 있는 상응하는 표적 결합 구획이 있는 한, 임의의 표적이 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 임의의 핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 표적은 단백질이다. 일부 실시양태에서, 표적은 mRNA, miRNA, lncRNA, rRNA, 비-코딩 RNA 또는 게놈 DNA 중 하나 이상으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 표적은 아미노산 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, 표적은 분자의 복합체로 구성된다. 일부 실시양태에서, 표적은 시험관내, 제자리 또는 생체내 DNA, RNA, 단백질, 또는 소분자 표적 분자 또는 복합체 중 하나 이상이다. 일부 실시양태에서, 표적은 DNA, RNA, 단백질 또는 소분자 표적 분자 중 하나 이상으로 구성된 분자의 복합체이다. 일부 실시양태에서, 표적은 시험관내, 제자리 또는 생체내 분자 또는 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 분자는 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍 내의 표적 결합 부위가 복합체 내의 그의 표적 부위에 특이적으로 결합할 때 HCR 개시제의 두 절반이 인접하여, 전체 개시제가 HCR 신호 증폭을 시작할 수 있게 되도록 분자의 복합체일 수 있다. 도 5는 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용한 표적 복합체의 검출(패널 a), 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 핵산 프로브를 사용한 핵산의 표적 복합체의 검출(패널 b), 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 항체 프로브를 사용한 단백질의 표적 복합체의 검출(패널 c), 1차 항체 프로브 및 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 2차 항체 프로브를 사용한 단백질의 표적 복합체의 검출(패널 d), 분할 개시제 항체 및 핵산 프로브를 사용한 표적 단백질/핵산 복합체의 검출(패널 e)을 보여준다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 DNA 제자리 하이브리드화(ISH), RNA 제자리 하이브리드화(ISH) 또는 단백질 면역조직화학(IHC)을 비롯한, DNA, RNA, 단백질 또는 소분자 표적을 영상화하는 제자리 과정의 일부로서 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 하나 이상의 구성요소를 표적에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적은 수화된다. 일부 실시양태에서, 표적은 용액에 있으나, 고체 지지체에 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 용액에 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 비드 또는 다른 지지체에 고정된다. 일부 실시양태에서, 지지체는 메쉬 또는 겔 또는 강성 표면이다. 일부 실시양태에서, 표적은 고정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 검출은 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 표적이 비드 또는 마이크로어레이에 고정되는 시험관내 방법을 포함하는 HCR 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 표적은 비드에 고정된다. 일부 실시양태에서, 표적은 마이크로어레이에 고정된다. 일부 실시양태에서, 표적이 고정되지 않는 생체내 또는 시험관내 방법을 포함하는 HCR 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 표적이 고정되는 생체내 또는 시험관내 방법을 포함하는 HCR 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 인큐베이션은 제1 분획 개시제 프로브(1190)를 표적 분자에 결합시키고 제2 분획 개시제 프로브(1290)를 표적 분자에 결합시킨다. 표적 분자는 단일 분자 또는 다수의 결합된 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 실온에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 4℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 37℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 45℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 50℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 55℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 60℃에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 적어도 1분, 예를 들어, 5분, 15분, 30분 또는 1시간의 인큐베이션 시간을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 1시간, 예를 들어, 2시간, 4시간, 12시간, 16시간 또는 24시간을 초과한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 0% 포름아미드를 함유하는 하이브리드화 완충제에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 포름아미드를 포함하는 하이브리드화 완충제에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 포름아미드의 퍼센트 농도는 1% 내지 80%, 예를 들어, 10% 내지 70%, 또는 30% 내지 60%이다. 일부 실시양태에서, 하이브리드화 완충제는 구연산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구연산의 몰 농도는 1 nM 내지 30 nM, 예를 들어, 5 nM 내지 15 nM, 또는 8 nM 내지 12 nM이다. 일부 실시양태에서, 하이브리드화 완충제는 Tween을 포함한다. 일부 실시양태에서, Tween의 퍼센트 농도는 0% 내지 1.0%, 예를 들어, 0.05% 내지 0.5%이다. 일부 실시양태에서, 하이브리드화 완충제는 헤파린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 헤파린의 농도는 20 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖, 예를 들어, 30 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖, 예를 들어, 40 ㎍/㎖ 내지 60 ㎍/㎖이다. 일부 실시양태에서, 하이브리드화 완충제는 덴하르트의 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하이브리드화 완충제는 덱스트란 설페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 설페이트의 퍼센트 농도는 1% 내지 60%, 예를 들어, 40% 내지 60%이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법의 제1 분획 개시제(1151)는 제1 분획 개시제 프로브(1190)의 일부이고 제2 분획 개시제(1251)는 제2 분획 개시제 프로브(1290)의 일부이다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브(1190)는 제1 표적 결합 구획(1141)을 추가로 포함하고, 제2 분획 개시제 프로브(1290)는 제2 표적 결합 구획(1241)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브(1190) 및 제2 분획 개시제 프로브(1290)가 둘 다 표적(1020)에 특이적으로 결합될 때, 제1 표적 결합 구획(1141)은 표적의 제2 표적 결합 구획(1241)에 인접하여 결합하도록 구성된다.
용어 "인접"은 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브(및/또는 제1 표적 결합 구획 및 제2 표적 결합 구획)의 결합에 사용되지만, 제1 개시제 프로브 및 제2 개시제 프로브가 HCR을 유발할 수 있는 전체 개시제를 형성할 정도로 서로 충분히 가깝게 있는 한, 결합이 바로 인접할 필요는 없다. 일부 실시양태에서, 제1 표적 결합 구획은 제2 표적 결합 구획의 적어도 10개 아미노산 이내, 예를 들어, 5개 아미노산 이내 또는 1개 아미노산 이내에서 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 표적 결합 구획은 제2 표적 결합 구획의 적어도 10개 뉴클레오타이드 이내, 예를 들어, 5개 뉴클레오타이드 이내 또는 1개 뉴클레오타이드 이내에서 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브(및/또는 제1 표적 결합 구획 및 제2 표적 결합 구획)는 서로의 2, 5, 10, 50, 100 또는 1000 옹스트롬 이내에 있다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브는 2개의 표적 구획 사이에 더 많은 공간을 허용하도록 스페이서를 포함할 수 있다. 이러한 스페이서는 제1 표적 구획 및 제2 표적 구획(또는 추가 표적 구획)의 위치에 대한 더 많은 유연성을 제공하기 위해 추가 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적의 각각의 표적 구획은 2개 이상의 분획 개시제가 전체 개시제를 공국소화할 수 있도록 서로 충분히 인접해 있다.
일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브(1190)는 하나 초과의 표적 결합 구획, 예를 들어, 2개의 표적 결합 구획, 3개의 표적 결합 구획, 4개의 표적 결합 구획 또는 5개의 표적 결합 구획을 포함한다. 이것은 한 번에 다수의 가능한 표적들을 어세이할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브(1190)는 5개 초과의 표적 결합 구획을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 분획 개시제 프로브(1290)는 하나 초과의 표적 결합 구획, 예를 들어, 2개의 표적 결합 구획, 3개의 표적 결합 구획, 4개의 표적 결합 구획 또는 5개의 표적 결합 구획을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 분획 개시제 프로브(1290)는 5개 초과의 표적 결합 구획을 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍 내의 표적 결합 구획(예를 들어, 영역)은 DNA, RNA, 2'OMe-RNA, PNA, 아미노산, 또는 임의의 합성 핵산 유사체, 또는 임의의 합성 아미노산 유사체로 만들어질 수 있다. 도 4는 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용한 표적 분자의 검출(패널 a), 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 핵산 프로브를 사용한 표적 mRNA의 검출(패널 b), 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 항체 프로브를 사용한 표적 단백질의 검출(패널 c), 및 1차 항체 프로브 및 분할 개시제 2차 항체 프로브를 사용한 표적 단백질의 검출(패널 d)을 보여준다. 각각의 경우, 프로브 쌍과 동족 표적 분자의 선택적 결합은 전체 HCR 개시제의 두 절반을 공국소화하여, 연결된 HCR 증폭 중합체의 성장을 유발한다. 표적 분자는 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍 내의 표적 결합 부위가 단백질 또는 소분자에서 그의 표적 부위에 특이적으로 결합할 때, HCR 개시제의 두 절반이 인접하게 되어, 전체 개시제가 HCR 신호 증폭을 개시할 수 있게 되도록 단백질 또는 소분자일 수 있다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀 단량체는 형광성이 아닌 리포터 분자(예를 들어, 동위원소적으로 순수한 희토류 원소, 발색단 등)로 표지될 수 있다.
도식 E의 경우, 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍 내의 각각의 프로브는 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브가 그의 표적 구획(예를 들어, 동족 인접 표적 부위)에 특이적으로 염기 페어링할 때, HCR 개시제의 두 절반이 공국소화되도록 표적 결합 부위 및 HCR 개시제의 절반을 함유하고; 이 기능은 다양한 입체구조로 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍 내에서 표적 결합 부위 및 개시제 단편을 배열함으로써 달성될 수 있다(도 3).
일부 실시양태에서, 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍 내의 HCR 개시제는 두 프로브가 인접하는 경우에만 HCR 증폭이 개시되게 하는 방식으로 두 프로브 사이에 분할될 수 있다(절반과 절반으로 분할될 필요는 없음).
일부 실시양태에서, HCR 개시제는 2개 이상의 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 사이에 분할될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 mRNA는 하나 이상의 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍을 함유하는 분획 개시제 프로브 세트(또는 프로브 세트)를 사용함으로써 검출될 수 있고; 각각의 프로브 쌍은 표적 mRNA의 상이한 하위서열을 겨냥하는 표적 결합 부위를 함유한다. 분획 개시제 프로브 세트 내에서, 각각의 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍은 동일한 HCR 개시제 서열을 형성하도록 공국소화됨으로써, 동일한 표적 mRNA에 결합된 다수의 프로브 쌍들의 동시적인 HCR 증폭 중합체 성장을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 표적 분자는 mRNA, miRNA, lncRNA, rRNA, 게놈 DNA, 또는 임의의 핵산 분자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 쌍 내의 2개의 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 사이에 분할되는 개시제는 DNA, RNA, 2'OMe-RNA, PNA, 또는 HCR 증폭을 개시할 수 있는 임의의 합성 중합체로 만들어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 하나 초과, 예를 들어, 10개, 20개, 50개, 100개, 1000개, 10,000개 등의 제1 분획 개시제(1151) 및 제2 분획 개시제(1251)를 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 각각의 단계 후에 세척을 이용하는 2-단계 접근법을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적이 고정되고/되거나, 샘플이 고정된다. 일부 실시양태에서, 제1 단계는 분획 개시제 프로브(들)를 표적에 결합시키고 결합되지 않은 분획 개시제 프로브(들)를 씻어내는 것을 포함하는 검출 단계이고, 제2 단계는 HCR 증폭이 일어나는 증폭 단계이다. 이것 다음에 중합되지 않은 HCR 단량체(예컨대, 헤어핀 단량체)를 씻어낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 단계 후 1회 초과의 세척, 예를 들어, 2회 세척, 3회 세척, 4회 세척 또는 5회 세척이 있다. 일부 실시양태에서, HCR 방법은 세척이 없는 단일 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀 단량체는 리포터 분자를 헤어핀 단량체 그 자체에 직접 혼입하기 보다는 오히려 표지 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 샘플을 세척하여 중합되지 않은 HCR 헤어핀 단량체를 제거하는 단계, 표지 결합 부위에 대한 상보체 및 리포터 분자를 포함하는 표지 프로브를 첨가하는 단계; 결합되지 않은 표지 프로브를 세척하는 단계; 및 리포터 분자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 헤어핀 단량체가 폐쇄될 때 형광단이 소광되나, 표지 프로브가 HCR 중합체의 표지 결합 부위에 결합할 때 형광단이 소광되지 않도록 형광단/소광제 쌍을 추가로 포함하는 헤어핀 분자이다. 일부 실시양태에서, 표지 프로브는 표지 프로브가 HCR 중합체의 표지 결합 부위에 결합할 때 소광제-표지된 가닥이 이탈되고 형광단-표지된 가닥이 HCR 중합체의 표지 결합 부위에 결합되도록 형광단을 보유하는 하나의 가닥 및 소광제를 보유하는 다른 가닥을 가진 이중체이다. 일부 실시양태에서, 헤어핀 단량체는 FRET 쌍의 한 부분인 리포터를 보유하고, 표지 프로브는 표지 프로브가 HCR 중합체의 표지 결합 부위에 결합할 때 FRET 쌍의 두 부분이 인접하게 되고 FRET를 겪을 수 있도록 FRET 쌍의 다른 부분을 보유한다. 일부 실시양태에서, 세척을 통해 중합되지 않은 HCR 헤어핀 단량체를 제거하는 것은 중합되지 않은 HCR 헤어핀 단량체의 50% 초과, 예를 들어, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 99% 초과, 99.9% 초과, 99.99% 초과, 99.999% 초과 또는 99.9999999% 초과의 제거를 야기한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 세척 중 임의의 세척은 분획 개시제(및/또는 분획 개시제 프로브)의 50% 초과, 예를 들어, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 99% 초과, 99.9% 초과, 99.99% 초과, 99.999% 초과 또는 99.9999999% 초과의 제거를 야기할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세척은 표적에 특이적으로 결합되지 않은 프로브의 적어도 50% 내지 99%의 제거를 야기한다. 일부 실시양태에서, 세척은 프로브의 50% 초과, 예를 들어, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과, 99% 초과, 99.9% 초과, 99.99% 초과, 99.999% 초과 또는 99.9999999% 초과의 제거를 야기한다.
본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 1차 세척을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 세척은 제1 표적 분자를 함유하는 샘플로부터 결합되지 않은 제1 분획 개시제 프로브(1190) 및 결합되지 않은 제2 분획 개시제 프로브(1290)를 제거한다. 일부 실시양태에서, 1차 세척 후, 표적 분자의 공국소화된 제1 개시제 프로브 및 제2 개시제 프로브는 제1 헤어핀 단량체(1510)에 의해 결합되고, 그 다음 이 제1 헤어핀 단량체는 제2 헤어핀 단량체(1610)에 의해 결합되어, HCR 증폭을 야기한다. 일부 실시양태에서, 1차 세척 후, 결합되지 않은 헤어핀 단량체는 샘플로부터 세척된다. 일부 실시양태에서, 방법은 추가 세척, 예를 들어, 2회 세척, 3회 세척, 4회 세척, 5회 세척, 6회 세척 또는 7회 세척을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 7회 초과의 세척을 포함한다.
일부 실시양태에서, 분획 개시제는 1개 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 10개 내지 80개, 10개 내지 60개, 10개 내지 50개, 20개 내지 50개, 20개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이것은 임의의 기능적 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 각각의 표적 구획은 1개 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 10개 내지 80개, 10개 내지 60개, 10개 내지 50개, 20개 내지 50개, 20개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이것은 임의의 기능적 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 각각의 표적 결합 구획은 1개 내지 1000개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 10개 내지 80개, 10개 내지 60개, 10개 내지 50개, 20개 내지 50개, 20개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이것은 임의의 기능적 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 구획 및/또는 표적 구획은 핵산이 아니므로, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 구획은 각각 개별 원자 내지 최대 수백 kDa(예를 들어, 항체 등)일 수 있거나 더 클 수 있다.
일부 실시양태에서, 각각의 전체 개시제는 전체 개시제를 형성하는 분획 개시제의 합계만큼 길 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 분획 개시제는 전체 개시제의 약 1/2 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분획 개시제의 분획 크기는 전체 개시제를 완성하기 위한 분획 개시제의 수에 의해 좌우된다. 따라서, 2개, 3개, 4개, 5개 등의 분획 개시제가 단일 전체 개시제에 사용될 때, 개시제의 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 등이 각각의 분획 개시제에 존재할 것이다. 일부 실시양태에서, 개시제의 크기가 각각의 분획 개시제에 대해 균등하게 나누어질 필요는 없다. 전체 개시제의 크기는 HCR이 전체 개시제를 통해 일어날 수 있게 하기에 적절하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법들 및/또는 조성물들 중 임의의 방법 및/또는 조성물은 하나 이상의 추가 분획 개시제 프로브를 첨가하는 것, 예를 들어, 3개의 분획 개시제를 첨가하는 것, 4개의 분획 개시제를 첨가하는 것, 5개의 분획 개시제를 첨가하는 것, 6개의 분획 개시제를 첨가하는 것, 7개의 분획 개시제를 첨가하는 것, 8개의 분획 개시제를 첨가하는 것, 9개의 분획 개시제를 첨가하는 것, 10개의 분획 개시제를 첨가하는 것, 11개의 분획 개시제를 첨가하는 것, 12개의 분획 개시제를 첨가하는 것, 14개의 분획 개시제를 첨가하는 것 또는 15개의 분획 개시제를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 15개 초과의 분획 개시제, 예를 들어, 16개 내지 100개의 분획 개시제 또는 더 많은, 예를 들어, 500개, 1000개 등의 분획 개시제를 첨가한다.
일부 실시양태에서, 표적 분자(1020)는 제1 표적 구획(1100) 및 제2 표적 구획(1200)을 포함한다. 제1 분획 개시제 프로브(1190)는 제1 표적 결합 구획(1141)을 포함할 수 있고, 제2 분획 개시제 프로브(1290)는 제2 표적 결합 구획(1241)을 포함한다. 제1 표적 구획(1100)은 제1 표적 결합 구획(1141)에 결합하도록(또는 결합되도록) 구성되고, 제2 표적 구획(1200)은 제2 표적 결합 구획(1241)에 결합하도록(또는 결합되도록) 구성된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 제1 헤어핀 단량체(1510)를 제1 분획 개시제(1151) 및 제2 분획 개시제(1251) 둘 다에 결합시키는 단계, 제2 분획 개시제(1610)를 제1 헤어핀 단량체(1510)에 결합시키는 단계, 및 신호를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 신호는 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체가 하이브리드화 연쇄 반응을 거쳐, 제1 헤어핀 단량체 및/또는 제2 헤어핀 단량체 중 하나 또는 둘 다와 결합된 리포터 분자의 양을 추가하고/하거나 농축함으로써 생성될 수 있거나 증폭될 수 있다.
세척 단계는 헤어핀 단량체의 첨가 및/또는 검출 전에 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 표적을 함유하는 샘플로부터 결합되지 않은 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 제거하기 위한 세척을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 1회 초과의 세척, 예를 들어, 2회 세척, 3회 세척, 4회 세척 또는 5회 세척을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 후 샘플 및/또는 용액 내에 남아 있고 표적에 특이적으로 결합되지 않은 개별 분획 개시제 프로브는 전체 개시제를 공국소화하지 않으므로 HCR을 유발하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 추가 제1 헤어핀 단량체(1510)를 제2 헤어핀 단량체(1610)(이미 제1 헤어핀 단량체에 결합됨)에 결합시키는 단계를 포함한다. 따라서, HCR 중합을 통해 단량체 쇄의 연장을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 10개의 추가 제1 헤어핀 단량체가 존재한다. 일부 실시양태에서, 적어도 100개, 예를 들어, 1000개, 10000개 등의 추가 제1 헤어핀 단량체가 존재한다. 일부 실시양태에서, 방법은 추가 제2 헤어핀 단량체를 이미 제2 헤어핀 단량체에 결합되어 있는 추가 제1 헤어핀 단량체에 결합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 10개의 추가 제2 헤어핀 단량체가 존재한다. 일부 실시양태에서, 적어도 100개, 예를 들어, 1000개, 10000개 등의 추가 제2 헤어핀 단량체가 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법들 중 임의의 방법은 중합체가 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체의 교대 첨가를 통해 성장하도록 전체 개시제가 제1 헤어핀 단량체(1510)에 결합하고, 제1 헤어핀 단량체가 차례로 제2 헤어핀 단량체(1610)에 결합하고, 제2 헤어핀 단량체가 차례로 또 다른 제1 헤어핀 단량체에 결합하고, 이 또 다른 제1 헤어핀 단량체가 차례로 또 다른 제2 헤어핀 단량체에 결합하는 교대 케스케이드의 중합 이벤트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 교대 캐스케이드는 2개 초과의 헤어핀 단량체, 예를 들어, 3개의 헤어핀 단량체, 4개의 헤어핀 단량체, 5개의 헤어핀 단량체, 6개의 헤어핀 단량체, 7개의 헤어핀 단량체, 8개의 헤어핀 단량체, 9개의 헤어핀 단량체, 10개의 헤어핀 단량체, 100개, 1000개, 10000개, 100000개 또는 1000000개 이상의 헤어핀 단량체의 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 결합 반응 중 임의의 결합 반응에서, 결합은 하이브리드화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합은 선택적 단백질-단백질 상호작용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합은 선택적 핵산-단백질 상호작용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합은 이온 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합은 공유 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법들 또는 조성물들 중 임의의 방법 또는 조성물에서, 리포터 분자는 형광 분자이다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 소광된 또는 FRET 배열을 포함하고, 이때 헤어핀 단량체의 형광 분자는 중합체 입체구조가 제1 헤어핀 단량체 및 제2 헤어핀 단량체에 의해 달성될 때 소광되지 않는다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 비-형광 분자이다. 일부 실시양태에서, 리포터 분자는 희토류 원소이다.
일부 실시양태에서, 제1 헤어핀 단량체와 제2 헤어핀 단량체는 중합체로서 조합될 때 FRET 쌍을 형성한다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍은 헤어핀 단량체가 개방되고 중합될 때 발생하는 소광 또는 FRET의 변화로 인해 형성된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 헤어핀 단량체는 FRET를 허용하도록 구성된다(예를 들어, 모니터링될 FRET의 변화에 대한 인접성 요건 및 리포터 분자 페어링 요건을 충족함).
일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브(1190)는 아미노산 서열을 포함할 수 있고 제2 분획 개시제 프로브(1290)는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 표적 서열(들)에 하이브리드화하기 위한 핵산 서열도 포함할 것이다. 이들은 제1 표적 결합 구획 및 제2 표적 결합 구획일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 구획은 제1 표적 구획 및 제2 표적 구획(1100 및 1200)에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브는 공국소화될 때 전체 개시제를 형성하는 적절한 길이의 핵산 서열을 제공하는, 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제도 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브(1190)는 핵산 서열을 포함하고 제2 분획 개시제 프로브(1290)는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제(1151, 1251)는 제1 헤어핀 단량체(1510)와 염기 페어링할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 분획 개시제 프로브는 DNA, RNA, 2'Ome-RNA, LNA, 합성 핵산 유사체, 아미노산, 합성 아미노산 유사체 및 PNA 중 하나 이상을 포함하고, 제2 분획 개시제 프로브는 DNA, RNA, 2'Ome-RNA, LNA, 합성 핵산 유사체, 아미노산, 합성 아미노산 유사체 및 PNA 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세척 완충제들 중 임의의 세척 완충제는 포름아미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포름아미드의 퍼센트 농도는 0% 내지 80%, 예를 들어, 10% 내지 70%, 또는 30% 내지 60%이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충제는 구연산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구연산의 몰 농도는 1 nM 내지 30 nM, 예를 들어, 5 nM 내지 15 nM, 또는 8 nM 내지 12 nM이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충제는 Tween을 포함한다. 일부 실시양태에서, Tween의 퍼센트 농도는 0% 내지 1.0%, 예를 들어, 0.05% 내지 0.5%이다. 일부 실시양태에서, 세척 완충제는 헤파린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 헤파린의 농도는 20 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖, 예를 들어, 30 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖, 예를 들어, 40 ㎍/㎖ 내지 60 ㎍/㎖이다.
분획 개시제는 다른 조건부 프로브와 구별된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 분획 개시제는 입체구조 변화 프로브가 아니다(예를 들어, 도 2의 도식 B). 일부 실시양태에서, 분획 개시제는 2개의 별도의 핵산 가닥을 포함하는 분획 개시제이다. 일부 실시양태에서, (2개의 구획이 단일 분자에 있을 수 있지만) 분획 개시제는 적어도 2개의 상이한 표적 구획에 대한 적어도 2개의 별도의 결합 이벤트에 의존한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 하이브리드화 연쇄 반응(HCR)을 통한 제자리 신호 증폭에 대한 신호 대 배경 비를 개선하는 데 이용될 수 있다.
도 18c는 HCR, 특히 표지 결합 부위를 보유하는 헤어핀 단량체와 함께 분획 개시제 프로브를 사용하는 3-단계 제자리 HCR 프로토콜을 이용하는 추가 실시양태를 도시한다. 검출 단계: 분획 개시제 프로브 쌍은 표적 mRNA에 하이브리드화되고 미사용 프로브는 샘플로부터 세척된다. 각각의 분획 개시제 프로브 세트는 표적 mRNA를 따라 상이한 하위서열에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 프로브 쌍을 함유한다. 쌍 내의 각각의 프로브는 HCR 개시제 I1의 일부(예를 들어, 1/2)를 보유한다. 쌍 내의 2개의 프로브와 이들의 동족 표적 결합 부위의 선택적 하이브리드화는 전체 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화한다. 증폭 단계: 전체 HCR 개시제 I1은 연결된 증폭 중합체의 자가조립을 유발하고 미사용 H1 및 H2 헤어핀 단량체는 샘플로부터 세척된다. 각각의 헤어핀 단량체는 표지 결합 부위를 가진다. 표지 결합 부위는 생성된 HCR 증폭 중합체를 장식한다. 표지부착 단계: 표지 결합 부위에 대한 상보체를 포함하고 형광단 리포터를 추가로 포함하는 표지 프로브가 증폭 중합체에 하이브리드화된 다음, 결합되지 않은 표지 프로브가 샘플로부터 세척된다. 별모양은 형광단을 표시한다. 각각의 단계는 원하는 결과에 따라 반복될 수 있거나, 조합될 수 있거나 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계는 나열된 순서로 일어난다.
도 15는 단순화된 HCR 헤어핀을 사용하는 HCR 기작을 도시한다. 준안정한 형광 헤어핀은 동족 개시제의 검출 시 형광 증폭 중합체로 자가조립된다. 개시제 I1은 단일 가닥 토홀드 'a'와의 염기 페어링을 통해 헤어핀 H1과 핵을 형성하여, 헤어핀을 개방하는 분지 이동을 매개함으로써 단일 가닥 분절 'a*-b*'를 함유하는 복합체 I1·H1을 형성한다. 이 복합체는 토홀드 'a'와의 염기 페어링을 통해 제2 헤어핀 단량체(헤어핀 H2)와 핵을 형성하여, 헤어핀을 개방하는 분지 이동을 매개함으로써 단일 가닥 분절 'b*-a*'를 함유하는 복합체 I1·H1·H2를 형성한다. 따라서, 개시제 서열은 재생되고, 이것은 교대 H1 및 H2 중합 단계의 연쇄 반응의 기반을 제공한다. 별모양은 형광단을 표시한다. 화살표는 각각의 가닥의 3' 말단을 표시한다. 2개의 헤어핀들은 동일한 서열 도메인을 갖지만 반대 가닥 극성(5'에서 3'으로 이어지는 헤어핀 단량체 H1의 경우 a-b-a*-b* 및 3'에서 5'로 이어지는 헤어핀 단량체 H2의 경우 a-b-a*-b*)을 가짐을 주목한다.
일부 실시양태에서, "도메인 a"는 도메인 "c"와 동일하다(예를 들어, 도 13에 도시된 바와 같음). 즉, 두 헤어핀은 동일한 루프 및 토홀드 서열을 사용한다. 이것은 동일한 기능을 달성하기 위해 더 적은 서열 공간을 사용하는 표준 HCR 사례의 특별한 사례이다.
FISH
일부 실시양태에서, 방법은 생명공학 프로토콜의 일부이다. 일부 실시양태에서, 방법은 형광 제자리 하이브리드화(FISH)의 일부일 수 있다. 형광 제자리 하이브리드화 방법은 세포, 조직, 장기, 유기체 및 생태계 내에서 표적 mRNA의 발현 패턴을 밝혀 내생성 생물학적 회로의 공간적 조직화에 대한 중요한 창을 생물학자들에게 제공한다(1-7). 샘플 내의 자가형광이 낮은 경우, 하나 이상의 형광 리포터 분자를 각각 보유하고 표적 mRNA의 일부에 상보적인 표적 결합 서열을 각각 함유하는 하나 이상의 핵산 프로브를 함유하는 분획 개시제 프로브 세트를 사용하여 충분한 신호를 생성할 수 있고(8-14); 전체 표본고정 척추동물 배아 및 두꺼운 뇌 박편을 비롯한 많은 환경에서, 이 접근법은 충분한 신호를 생성하지 않으므로, 프로브를 대신 사용하여 제자리 신호 증폭을 매개함으로써 신호 대 배경 비를 증가시킨다(3, 6, 7, 11, 15-31).
일부 실시양태에서, 상기 방법은 높은 신호 대 배경 비로 샘플 내의 표적 mRNA를 맵핑할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, FISH 방법은 제자리 신호 증폭을 혼입하고, 이 경우 샘플 내의 모든 형광은 증폭된 신호 또는 배경의 일부 형태이다:
증폭된 신호. 증폭된 신호는 프로브가 그의 동족 표적에 특이적으로 하이브리드화된 후 표적 분자의 부위에서 형광 증폭 생성물의 생성을 매개할 때 생성된다.
배경. 샘플의 모든 다른 형광은 배경의 일부 형태이다:
자가형광. 자가형광은 샘플 고유의 배경 형광이다.
증폭된 배경. 증폭된 배경은 프로토콜의 임의의 단계에서 시약의 비-특이적 결합이 프로토콜의 후속 단계에서 증폭 생성물의 생성을 유발할 때 생성된다.
증폭되지 않은 배경. 형광 시약이 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 경우 증폭되지 않은 배경이 생성되나, 증폭 생성물의 생성으로 이어지지는 않는다.
따라서, 기법의 성능은 올바른 것(증폭된 신호의 생성)과 잘못된 것(세 가지 공급원, 즉 자가형광, 증폭되지 않은 배경 및 증폭된 배경 중 임의의 공급원으로부터의 배경 생성)에 의해 좌우된다. 영상 내의 복셀에서 높은 신호 대 배경 비를 달성하기 위해, 복셀 내의 총 배경보다 훨씬 더 높은 증폭된 신호를 생성하는 것이 유용하다.
하이브리드화 연쇄 반응(HCR)의 기작에 기반한 프로그래밍 가능한 제자리 증폭(32)은 다양한 유기체들에서 간단한 다중화, 깊은 샘플 침투, 높은 신호 대 배경, 및 아세포 해상도를 가능하게 한다(33-35). HCR 증폭제는 동족 개시제 가닥의 부재 하에 준안정적으로 공존하는 2개의 동역학적으로 포획된 핵산 헤어핀 분자(H1 및 H2)를 포함한다(I1; 도 1a). 개시제의 도착은 H1 및 H2 헤어핀이 순차적으로 핵을 형성하고 개방되어 긴 닉킹된 이중 가닥 증폭 중합체로 조립되는 연쇄 반응을 유발한다(32). 제자리 HCR을 이용할 때, mRNA 표적에 상보적인 DNA 프로브는 준안정한 형광단-표지된 DNA 헤어핀이 연결된 형광 증폭 중합체로 자가조립되는 연쇄 반응을 유발하는 DNA HCR 개시제를 보유한다(도 1b). 동일한 2-단계 제자리 하이브리드화 프로토콜은 표적 RNA의 수와 무관하게 사용되고(도 1c): 검출 단계에서 모든 분획 개시제 프로브 세트는 병렬로 하이브리드화되고; 증폭 단계에서 오르토고날 HCR 증폭제는 병렬로 작동한다.
HCR은 분자 프로그래밍 및 동적 핵산 나노기술 분야의 원리를 바탕으로 다양한 기술적 환경에서 등온 무효소 신호 증폭을 제공하고(36-39), 제자리 증폭의 요건에 특히 매우 적합하다(33, 34). 첫째, HCR은 프로그래밍될 수 있으므로, 독립적으로 작동하고 스펙트럼에 의해 구별되는 형광단을 보유하는 오르토고날 증폭제를 사용한 간단한 다중화를 위한 기반을 제공한다. 표적 mRNA의 수와 무관한 2-단계 프로토콜의 이용은 임의의 샘플에 편리하지만, 일련의 다중화 프로토콜 동안 쉽게 손상되는 성게 배아와 같은 섬세한 샘플에 필수적이다. 둘째, HCR 헤어핀 단량체는 동족 개시제를 보유하는 프로브를 만날 때까지 자가조립되지 않으므로, 표적 분자의 부위에서 밝은 증폭 중합체의 성장 전에 깊은 샘플 침투를 가능하게 한다. 이중체 스템을 가진 구조화된 헤어핀인 증폭 시약의 사용은 샘플 내에서 비-특이적 하이브리드화에 대한 잠재력을 감소시키고 또한 다수의 오르토고날 증폭제들의 조작 용이성을 증가시킨다. 증폭 중합체가 수백 개의 형광단을 보유할 수 있다는 사실(34)은 자가형광이 높을 때조차도(예를 들어, 전체 표본고정 척추동물 배아(34, 40, 41), 또는 환경 샘플 또는 다른 유기체 내에 함유된 박테리아(42-44)에서) 높은 신호 대 배경을 달성할 수 있게 한다. 셋째, HCR 증폭 중합체는 그의 개시 프로브에 연결된 상태로 남아 있어, 신호가 표적으로부터 멀리 확산되는 것을 방지하고 아세포 해상도를 유발한다. 넷째, HCR 증폭제 서열은 mRNA 표적 서열과 독립적이기 때문에, 이전에 검증된 증폭제(34)는 변형 없이 새로운 연구에 사용될 수 있다. 새로운 표적 mRNA를 맵핑하기 위해 필요한 것은 기존 DNA HCR 증폭제용 DNA 개시제를 보유하는 새로운 DNA 분획 개시제 프로브 세트이다. 종합하면, 제자리 HCR의 특성은 다양한 유기체들에서 간단한 다중화, 깊은 샘플 침투, 높은 신호 대 배경 및 아세포 해상도로 이어져, 생물학적 회로의 공간적 조직화에 대한 획기적으로 개선된 창을 생물학자들에게 제공한다. HCR 제자리 신호 증폭을 사용하여 신호 대 배경 비를 최적화하기 위해 상이한 접근법을 채택하는 5개의 도식(A, B, C, D, E)이 이하에 설명되어 있다(도 2). 도 1b(34)에 도시된 표준 제자리 HCR 접근법은 도식 A에 상응한다.
도식 A: 2-단계 프로토콜: 구조화되지 않은 프로브를 사용한 표적 검출 후, HCR 헤어핀 단량체를 사용한 프로브 검출 및 HCR 증폭. 구조화되지 않은 프로브는 표적 결합 구획(예를 들어, 표적 결합 서열) 및 구조화되지 않은 HCR 개시제 서열을 함유한다. 개시제는 프로브가 동족 표적 mRNA에 하이브리드화되는지 여부와 관계없이 HCR을 개시하기 위해 접근 가능하다. HCR 헤어핀 단량체는 동족 HCR 개시제에 의해 개시되는 때를 제외하고 거의 상호작용하지 않고; 개시는 순차적인 헤어핀 핵형성 및 개방을 통해 중합을 유발하여, 개시제에 염기 페어링된 HCR 증폭 중합체를 생성한다.
단계 1: 구조화되지 않은 프로브를 사용한 표적 검출: 프로브는 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 프로브는 세척된다. 프로브는 동족 표적 mRNA에 주로 결합하나, 무시할 수 없는 비율의 프로브가 샘플의 다른 곳에서 결합한다. 샘플에 남아 있는 프로브는 동족 표적 mRNA에 결합되어 있는지 여부에 관계없이 단계 2 동안 증폭을 유발할 것이다.
단계 2: HCR 헤어핀 단량체를 사용한 프로브 검출 및 HCR 증폭: HCR 헤어핀 단량체는 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 헤어핀은 세척된다. 샘플 내의 프로브는 연결된 HCR 증폭 중합체의 성장을 개시하여, 표적 분자에 결합된 프로브 부위에서 증폭된 신호를 생성하고 샘플의 다른 곳에서 결합된 프로브 부위에서 증폭된 배경을 생성한다. 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 HCR 헤어핀 단량체는 HCR 중합을 유발하지 않으므로, 증폭된 배경의 생성에 기여하지 않는 대신에, 무시할 수 있는 양의 증폭되지 않은 배경에 기여한다.
수행 결과: 도식 A는 단계 1 동안 비-특이적 프로브 결합에 취약하여, 단계 2 동안 증폭된 배경의 생성을 유발한다. 프로브가 구조화되지 않았기 때문에, 도식 A는 표적 결합 서열과 HCR 개시제 서열이 독립적이라는 이점을 갖고; 그 결과, 검증된 HCR 개시제 및 HCR 헤어핀 단량체는 HCR 개시제 및 HCR 헤어핀 단량체 서열을 변경하지 않으면서 다양한 새로운 프로브들 및 표적들을 위해 사용될 수 있다.
도식 B: 2-단계 프로토콜: 헤어핀 프로브를 사용한 표적 검출 후, HCR 헤어핀 단량체를 사용한 프로브 검출 및 HCR 증폭. 헤어핀 프로브는 표적 결합 구획(예를 들어, 표적 결합 서열) 및 HCR 개시제 서열을 함유하고; HCR 개시제는 헤어핀 프로브 내의 염기 페어링으로 인해 처음에 접근될 수 없고; 헤어핀 프로브가 그의 동족 표적 mRNA와 염기 페어링하는 경우, 프로브는 입체구조를 바꾸고 HCR 개시제는 접근 가능하게 되고 HCR 증폭을 개시할 수 있게 된다. HCR 헤어핀 단량체는 동족 HCR 개시제에 의해 개시되는 경우를 제외하고 거의 상호작용하지 않고; 개시는 순차적인 헤어핀 핵형성 및 개방을 통해 중합을 유발하여, 개시제에 염기 페어링된 HCR 증폭 중합체를 생성한다.
단계 1: 헤어핀 프로브를 사용한 표적 검출: 프로브는 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 프로브는 세척된다. 프로브는 동족 표적 mRNA에 주로 결합하나, 무시할 수 없는 비율의 프로브가 샘플의 다른 곳에서 결합한다. 동족 표적 mRNA에 하이브리드화된 프로브는 입체구조를 바꾸어 접근 가능한 HCR 개시제를 노출시킴으로써, 단계 2에서 증폭된 신호의 생성을 유발한다. 샘플의 다른 곳에서 결합된 프로브는 접근될 수 없는 HCR 개시제를 가져 HCR 증폭을 유발하지 않음으로써, 단계 2에서 증폭된 배경의 생성을 피한다.
단계 2: HCR 헤어핀 단량체를 사용한 프로브 검출 및 HCR 증폭: HCR 헤어핀 단량체는 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 헤어핀은 세척된다. 그의 동족 표적에 하이브리드화된 프로브는 연결된 HCR 증폭 중합체의 성장을 유발하여, 표적 분자의 부위에서 증폭된 신호를 생성한다. 샘플의 다른 곳에서 결합된 프로브는 증폭을 유발하지 않아, 증폭된 배경의 생성을 피한다. 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 HCR 헤어핀 단량체는 HCR 중합을 유발하지 않으므로 증폭된 배경의 생성에 기여하지 않는 대신에 무시할 수 있는 양의 증폭되지 않은 배경에 기여한다.
수행 결과: 비-특이적으로 결합된 프로브가 단계 2 동안 HCR 증폭을 유발하지 않기 때문에, 도식 B는 단계 1 동안 비-특이적 프로브 결합에 취약하지 않다. 따라서, 도식 B는 시약이 프로토콜의 임의의 단계에서 비-특이적으로 결합하더라도, 증폭된 배경이 거의 생성되지 않을 것이라는 특성을 가진다. 도식 B의 단점은 헤어핀 프로브를 사용하는 경우 표적 결합 서열과 HCR 개시제 서열 사이에 어느 정도의 서열 상보성이 있다는 것이다. 결과적으로, 표적 결합 구획(예를 들어, 표적 결합 서열)의 변화는 HCR 개시제 및 HCR 헤어핀 단량체 서열의 변화를 필요로 하고, 이것은 도식 A의 단순성에 비해 단점이다.
도식 C: 3-단계 프로토콜: 구조화되지 않은 프로브 쌍을 사용한 표적 검출 후, 구조화되지 않은 가교를 사용한 프로브 쌍 검출, 이어서 HCR 헤어핀 단량체를 사용한 가교 검출 및 HCR 증폭. 구조화되지 않은 프로브는 쌍으로 제공되고; 각각의 프로브는 표적 결합 구획(예를 들어, 표적 결합 서열) 및 구조화되지 않은 핵형성 서열의 절반을 함유하고; 프로브 쌍 내의 2개의 프로브에 대해, 2개의 표적 결합 구획(예를 들어, 표적 결합 서열)은 2개의 프로브들이 그들의 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 특이적으로 결합할 때 핵형성 서열의 두 절반이 인접하게 되도록 표적 mRNA의 표적 구획(예를 들어, 인접 하위서열)에 상보적이다. 구조화되지 않은 가교 가닥은 핵형성 서열의 두 절반에 상보적인 인접 결합 서열을 함유하고; 구조화되지 않은 가교 가닥은 가교 가닥이 그의 동족 핵형성 부위에 특이적으로 염기 페어링되는지 여부와 관계없이 HCR을 개시하기 위해 접근될 수 있는 HCR 개시제도 함유한다. HCR 헤어핀 단량체는 동족 HCR 개시제에 의해 개시되는 경우를 제외하고 거의 상호작용하지 않고; 개시는 순차적인 헤어핀 핵형성 및 개방을 통해 중합을 유발하여, 개시제에 염기 페어링된 HCR 증폭 중합체를 생성한다.
단계 1: 구조화되지 않은 프로브 쌍을 사용한 표적 검출: 프로브는 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 프로브는 세척된다. 프로브 쌍은 그의 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 주로 염기 페어링되어, 핵형성 서열의 두 절반을 공국소화하고; 무시할 수 없는 비율의 프로브는 샘플의 다른 곳에서 결합하나, 비-특이적으로 결합된 프로브는 핵형성 서열의 두 절반을 거의 공국소화하지 않는다.
단계 2: 구조화되지 않은 가교를 사용한 프로브 쌍 검출: 구조화되지 않은 가교 가닥은 가교 가닥이 인접 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 특이적으로 염기 페어링된 동족 프로브 쌍에 의해 생성된 전체 핵형성 서열에 우세하게 안정적으로 염기 페어링되도록 실험 조건 하에 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고; 더욱이, 실험 조건은 가교 가닥이 그의 파트너 프로브에 인접하지 않은 개별 프로브에 의해 보유된 절반 핵형성 부위에 우세하게 안정적으로 염기 페어링되지 않게 하는 조건이다. 무시할 수 없는 비율의 가교가 샘플에서 비-특이적으로 결합하고; 비-특이적으로 결합된 가교는 단계 3 동안 HCR 증폭을 유발하여, 증폭된 배경을 생성할 것이다.
단계 3: HCR 헤어핀 단량체를 사용한 가교 검출 및 HCR 증폭: HCR 헤어핀 단량체는 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 헤어핀은 세척된다. 샘플 내의 가교 가닥은 연결된 HCR 증폭 중합체의 성장을 개시하고; 인접 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 염기 페어링된 동족 프로브 쌍에 의해 형성된 그의 동족 핵형성 부위에 염기 페어링된 가교 가닥의 경우, 이 중합체는 증폭된 신호를 나타낸다. 샘플의 다른 곳에서 결합된 가교 가닥의 경우, 이 중합체는 증폭된 배경에 상응한다. 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 HCR 헤어핀 단량체는 HCR 중합을 유발하지 않으므로, 증폭된 배경의 생성에 기여하지 않는 대신에 무시할 수 있는 양의 증폭되지 않은 배경에 기여한다.
수행 결과: 가교가 단계 2에서 단리된 프로브에 우세하게 안정적으로 염기 페어링되지 않기 때문에, 도식 C는 단계 1의 비-특이적 프로브 결합에 취약하지 않다. 그러나, 도식 C는 단계 2에서 가교의 비-특이적 결합에 취약하고, 이것은 단계 3에서 증폭된 배경의 생성으로 이어진다. 도식 C의 단계 2에서 구조화되지 않은 가교는 도식 A의 단계 1에서 구조화되지 않은 프로브와 동일한 개념적 약점을 가짐을 주목한다. 도식 A에 비해 도식 C의 이점은 도식 C를 이용하여 가교 서열의 라이브러리를 주어진 종에서 사용하기 위해 최적화한 후, 가교 서열을 바꾸지 않으면서 다양한 새로운 프로브 및 표적을 위해 이러한 가교 서열을 재사용할 수 있다는 점이다. 비교하건대, 도식 A를 이용하는 경우, 각각의 새로운 프로브 서열은 주어진 종에서 사용되도록 최적화될 필요가 있을 것이다. 그러나, 도식 C를 이용하여 최적화된 가교 서열을 사용하더라도, 무시할 수 없는 비율의 가교가 샘플에서 비-특이적으로 결합하여, 프로토콜의 다음 단계에서 증폭된 배경을 생성할 것이다. 마찬가지로, 도식 A를 이용하여 최적화된 프로브 서열을 사용하더라도, 무시할 수 없는 비율의 프로브가 샘플에서 비-특이적으로 결합하여, 프로토콜의 다음 단계에서 증폭된 배경을 생성할 것이다.
도식 D: 3-단계 프로토콜: 구조화되지 않은 프로브 쌍을 사용한 표적 검출 후, 헤어핀 가교를 사용한 프로브 쌍 검출, 이어서 HCR 헤어핀 단량체를 사용한 가교 검출 및 HCR 증폭. 구조화되지 않은 프로브는 쌍으로 제공되고; 각각의 프로브는 표적 결합 구획(예를 들어, 표적 결합 서열) 및 구조화되지 않은 핵형성 서열의 절반을 함유하고; 프로브 쌍 내의 2개의 프로브에 대해, 2개의 표적 결합 구획(예를 들어, 표적 결합 서열)은 2개의 프로브가 그들의 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 특이적으로 결합할 때 핵형성 서열의 두 절반이 인접하게 되도록 표적 mRNA의 표적 구획(예를 들어, 인접 하위서열)에 상보적이다. 헤어핀 가교는 핵형성 서열의 두 절반에 상보적인 인접 결합 서열을 함유하고; 헤어핀 가교는 또한 헤어핀 가교 내의 염기 페어링으로 인해 초기에 접근될 수 없는 HCR 개시제도 함유하고; 헤어핀 가교가 그의 동족 핵형성 서열의 두 절반에 염기 페어링되는 경우, 가교는 입체구조를 바꾸고, HCR 개시제는 접근 가능해지고 HCR 증폭을 개시할 수 있게 된다. HCR 헤어핀 단량체는 동족 HCR 개시제에 의해 개시되는 때를 제외하고 거의 상호작용하지 않고; 개시는 순차적인 헤어핀 핵형성 및 개방을 통해 중합을 유발하여, 개시제에 염기 페어링된 HCR 증폭 중합체를 생성한다.
단계 1: 구조화되지 않은 프로브 쌍을 사용한 표적 검출: 프로브는 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 프로브는 세척된다. 프로브 쌍은 그의 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 주로 염기 페어링되어, 핵형성 서열의 두 절반을 공국소화하고; 일부 프로브는 샘플의 다른 곳에서 결합하나, 비-특이적으로 결합된 프로브는 핵형성 서열의 두 절반을 거의 공국소화하지 않는다.
단계 2: 헤어핀 가교를 사용한 프로브 쌍 검출: 헤어핀 가교 가닥은 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 가교는 세척된다. 헤어핀 가교 가닥은 인접 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 특이적으로 염기 페어링된 동족 프로브 쌍에 의해 생성된 전체 핵형성 서열에 우세하게 안정적으로 염기 페어링되고; 특이적으로 결합된 헤어핀 가교는 입체구조를 바꾸어 접근 가능한 HCR 개시제를 노출시켜, 단계 3에서 증폭된 신호의 생성을 유발한다. 샘플의 다른 곳에서 결합된 헤어핀 가교는 접근될 수 없는 HCR 개시제를 갖고 HCR 증폭을 유발하지 않아, 단계 3에서 증폭된 배경의 생성을 피한다.
단계 3: HCR 헤어핀 단량체를 사용한 가교 검출 및 HCR 증폭: HCR 헤어핀 단량체는 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 헤어핀은 세척된다. 노출된 HCR 개시제를 가진 특이적으로 결합된 헤어핀 가교는 연결된 형광 증폭 중합체의 성장을 유발하여, 표적 분자 부위에서 증폭된 신호를 생성할 것이다. 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 HCR 헤어핀 단량체는 HCR 중합을 유발하지 않으므로, 증폭된 배경의 생성에 기여하지 않는 대신에 무시할 수 있는 양의 증폭되지 않은 배경에 기여한다.
수행 결과: 헤어핀 가교가 단계 2에서 단리된 프로브에 우세하게 안정적으로 염기 페어링되지 않기 때문에, 도식 D는 단계 1에서 비-특이적 프로브 결합에 취약하지 않다. 나아가, 도식 D는 비-특이적으로 결합된 헤어핀 가교가 단계 3 동안 증폭을 유발하지 않기 때문에 단계 2에서 비-특이적 헤어핀 가교 결합에 취약하지 않다. 따라서, 도식 D는 시약이 프로토콜의 임의의 단계에서 비-특이적으로 결합하더라도, 증폭된 배경이 거의 생성되지 않을 것이라는 중요한 특성을 도식 B와 공유한다. 도식 B에 비해 도식 D의 장점은 가교 핵형성 부위, 및 이에 따라 HCR 개시제와 HCR 헤어핀 단량체 서열이 프로브의 표적 결합 부위와 무관하다는 것이고; 결과적으로, 검증된 HCR 개시제 및 증폭제는 HCR 개시제 및 증폭제 서열을 변경하지 않으면서 다양한 새로운 프로브 및 표적을 위해 사용될 수 있다.
도식 B에 비해 도식 D의 단점은 단계의 수를 2개에서 3개로 증가시킨다는 것이다.
도식 E: 2-단계 프로토콜: 구조화되지 않은 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍을 사용한 표적 검출 후, HCR 헤어핀 단량체를 사용한 프로브 쌍 검출 및 HCR 증폭. 구조화되지 않은 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨)(분획 개시제로서도 지칭됨) 프로브는 쌍으로 제공되고; 각각의 프로브는 표적 결합 구획(예를 들어, 표적 결합 서열) 및 구조화되지 않은 HCR 개시제의 절반을 함유하고; 프로브 쌍 내의 2개의 프로브에 대해, 2개의 표적 결합 구획(예를 들어, 표적 결합 서열)은 2개의 프로브가 그들의 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 특이적으로 결합할 때, HCR 개시제의 두 절반이 인접하게 되도록 표적 mRNA의 표적 구획(예를 들어, 인접 하위서열)에 상보적이다. HCR 헤어핀 단량체는 동족 HCR 개시제(전체 개시제)에 의해 개시되는 경우를 제외하고 거의 상호작용하지 않고; 개시는 순차적인 헤어핀 핵형성 및 개방을 통해 중합을 유발하여, 개시제(전체 개시제)와 염기 페어링된 HCR 증폭 중합체를 생성한다.
단계 1: 구조화되지 않은 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍을 사용한 표적 검출: 프로브는 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 프로브는 세척된다. 프로브 쌍은 그의 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 우세하게 염기 페어링되어, HCR 개시제의 두 절반을 공국소화하고; 일부 프로브는 샘플의 다른 곳에 결합하지만, 비-특이적으로 결합된 프로브는 HCR 개시제의 두 절반을 거의 공국소화하지 않는다.
단계 2: HCR 헤어핀 단량체를 사용한 프로브 쌍 검출 및 HCR 증폭: HCR 헤어핀 단량체는 고정된 샘플 내에서 하이브리드화되고 미사용 헤어핀은 세척된다. 그의 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 특이적으로 하이브리드화된 프로브 쌍은 HCR 개시제의 두 절반을 공국소화하여, 연결된 형광 HCR 증폭 중합체의 성장을 협력적으로 개시함으로써, 표적 분자의 부위에서 증폭된 신호를 생성한다. 비-특이적으로 결합된 프로브는 HCR 개시제의 두 절반을 공국소화하지 않고 HCR 증폭을 유발하지 않으므로, 증폭된 배경의 생성을 피한다. 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 HCR 헤어핀 단량체는 HCR 중합을 유발하지 않으므로 증폭된 배경의 생성에 기여하지 않는 대신에 무시할 수 있는 양의 증폭되지 않은 배경에 기여한다.
수행 결과: 단리된 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브가 단계 2에서 HCR 증폭을 개시하지 않기 때문에, 도식 E는 단계 1에서 비-특이적 프로브 결합에 취약하지 않다. 따라서, 도식 E는 활성 배경 억제가 프로토콜의 모든 단계에서 제공된다는 중요한 특성을 도식 B 및 D와 공유한다: 시약이 프로토콜의 임의의 단계에서 비-특이적으로 결합하더라도, 증폭된 배경은 거의 생성되지 않을 것이다.
도식 D에 비해, 도식 E는 다른 장점들 중에서 HCR 헤어핀 단량체가 헤어핀 가교의 역할을 함으로써, 별도의 헤어핀 가교에 대한 필요성을 없애고 프로토콜의 단계 수를 3에서 2로 줄인다는 장점을 가진다. 도식 C에 비해, 도식 D 및 E는 다른 장점들 중에서 가교가 비-특이적으로 결합하는 경우 증폭된 배경의 생성에 기여하지 않을 것이라는 장점을 가진다. 도식 B에 비해, 도식 E는 다른 장점들 중에서 HCR 개시제 및 HCR 헤어핀 단량체 서열이 프로브의 표적 결합 구획(예를 들어, 표적 결합 서열)과 무관하다는 장점을 가진다. 그 결과, 검증된 HCR 개시제 및 HCR 헤어핀 단량체는 HCR 개시제 및 HCR 헤어핀 단량체 서열을 변경하지 않으면서 다양한 새로운 프로브 및 표적을 위해 사용될 수 있다. 종합하건대, 도식 E는 도식 A, B, C 및 D의 모든 장점을 갖고 단점을 갖지 않는다: 2-단계 프로토콜의 단순성, 새로운 표적 서열과 함께 검증된 HCR 개시제 및 HCR 헤어핀 단량체를 재사용한다는 다용도성, 및 시약이 프로토콜의 임의의 단계에서 샘플에서 비-특이적으로 결합하더라도 증폭된 배경의 생성을 피하는 견고성.
도 1은 하이브리드화 연쇄 반응(HCR)을 통한 제자리 증폭을 설명한다. (a) HCR 기작. 준안정한 형광 헤어핀은 동족 개시제의 검출 시 형광 증폭 중합체로 자가조립된다. 개시제 I1은 단일 가닥 토홀드 'a'에의 염기 페어링을 통해 제1 헤어핀 단량체(예를 들어, 헤어핀 H1)와 핵을 형성함으로써, 헤어핀을 개방하는 분지 이동을 매개하여 단일 가닥 분절 'c*-b*'를 함유하는 복합체 I1 H1을 형성한다. 이 복합체는 토홀드 'c'와의 염기 페어링을 통해 제2 헤어핀 단량체(헤어핀 H2)와 핵을 형성함으로써, 헤어핀을 개방하는 분지 이동을 매개하여 단일 가닥 분절 'b*-a*'를 함유하는 복합체 I1 1 H2를 형성한다. 따라서, 개시제 서열은 재생되고, 이것은 교대 H1 및 H2 중합 단계의 연쇄 반응의 기반을 제공한다. 별모양은 형광단을 표시한다. 화살표는 각각의 가닥의 3' 말단을 표시한다. (b) (도식 A의 표준 프로브를 사용한) 제자리 하이브리드화 프로토콜.
검출 단계와 관련하여: 분획 개시제 프로브 세트는 mRNA 표적에 하이브리드화되고 미사용 프로브는 샘플로부터 세척된다. 증폭 단계와 관련하여: 개시제는 연결된 형광 증폭 중합체의 자가조립을 유발하고 미사용 헤어핀은 샘플로부터 세척된다. (c) 실험 타임라인. 동일한 2-단계 프로토콜이 표적 mRNA의 수와 무관하게 이용된다. 다중화 실험(도시된 3색 예)의 경우, 상이한 표적 mRNA에 대한 분획 개시제 프로브 세트(세트당 5개의 프로브가 도시됨)는 스펙트럼에 의해 구별되는 형광단으로 표지된 오르토고날 HCR 증폭 캐스케이드를 유발하는 오르토고날 개시제를 보유한다.
도 2는 5가지 도식에 대한 상기 언급된 개략도를 요약 형식으로 제공한다. 도식 A: 2-단계 프로토콜: 구조화되지 않은 프로브를 사용한 표적 검출 후, HCR 헤어핀 단량체를 사용한 프로브 검출 및 HCR 증폭. 도식 B: 2-단계 프로토콜: 헤어핀 프로브를 사용한 표적 검출 후, HCR 헤어핀 단량체를 사용한 프로브 검출 및 HCR 증폭. 도식 C: 3-단계 프로토콜: 구조화되지 않은 프로브 쌍을 사용한 표적 검출 후, 구조화되지 않은 가교를 사용한 프로브 쌍 검출, 이어서 HCR 헤어핀 단량체를 사용한 가교 검출 및 HCR 증폭. 도식 D: 3-단계 프로토콜: 구조화되지 않은 프로브 쌍을 사용한 표적 검출 후, 헤어핀 가교를 사용한 프로브 쌍 검출, 이어서 HCR 헤어핀 단량체를 사용한 가교 검출 및 HCR 증폭. 도식 E: 2-단계 프로토콜: 구조화되지 않은 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 쌍을 사용한 표적 검출 후, HCR 헤어핀 단량체를 사용한 프로브 쌍 검출 및 HCR 증폭. 화살표는 각각의 가닥의 3' 말단을 표시한다.
도 3: 분할 개시제 프로브 쌍 내에서 2개의 표적 결합 부위 및 2개의 분획 개시제(HCR 개시제 단편)에 대한 대안적 배열. 각각의 배열(1,2,3,4,5)에 대해, 프로브 쌍 내의 각각의 프로브는 전체 HCR 개시제의 절반(HCR 개시제 I1의 절반으로서도 지칭됨)을 보유하고; 한 쌍 내의 2개의 프로브와 동족 표적 분자의 특이적 결합은 전체 HCR 개시제의 두 절반(HCR 개시제 I1의 절반으로서도 지칭됨)의 공국소화를 유발한다. 화살표는 각각의 가닥의 3' 말단을 표시한다.
도 4는 분할 개시제 프로브가 표적 분자에 의해 공국소화되는 추가 실시양태를 제공한다. (a) 분할 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브. 제1 분획 개시제 프로브(프로브 1) 및 제2 분획 개시제 프로브(프로브 2)는 HCR 개시제 I1의 절반을 각각 보유하고; 제1 분획 개시제 프로브(프로브 1) 및 제2 분획 개시제 프로브(프로브 2)와 표적 분자의 선택적 결합은 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화한다. (b) 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 핵산 프로브. 핵산 프로브 1 및 핵산 프로브 2는 HCR 개시제 I1의 절반을 각각 보유하고; 핵산 프로브 1 및 핵산 프로브 2와 표적 mRNA의 선택적 결합은 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화한다. (c) 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 항체 프로브. 항체 프로브 1 및 항체 프로브 2는 HCR 개시제 I1의 절반을 각각 보유하고; 항체 프로브 1 및 항체 프로브 2와 단백질 표적의 선택적 결합은 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화한다. (d) 분할 개시제 2차 항체 프로브. 1차 항체 프로브 1은 단백질 표적에 선택적으로 결합하고; 2차 항체 프로브 2 및 2차 항체 프로브 3은 HCR 개시제 I1의 절반을 각각 보유하고; 2차 항체 프로브 2 및 2차 항체 프로브 3과 1차 항체 프로브 1의 선택적 결합은 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화한다.
도 5는 표적 복합체에 의해 공국소화된 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브에 관한 추가 실시양태를 제공한다. (a) 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브. 표적 복합체는 분자 2에 결합된 분자 1을 포함하고; 제1 분획 개시제 프로브(프로브 1) 및 제2 분획 개시제 프로브(프로브 2)는 HCR 개시제 I1의 절반을 각각 보유하고; 프로브 1과 표적 복합체 내의 분자 1의 선택적 결합 및 프로브 2와 표적 복합체 내의 분자 2의 선택적 결합은 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화한다. (b) 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 핵산 프로브. 표적 복합체는 핵산 표적 2에 결합된 핵산 표적 1을 포함하고; 핵산 프로브 1 및 핵산 프로브 2는 HCR 개시제 I1의 절반을 각각 보유하고; 핵산 프로브 1과 표적 복합체 내의 핵산 표적 1의 선택적 결합 및 핵산 프로브 2와 표적 복합체 내의 핵산 표적 2의 선택적 결합은 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화한다. (c) 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 항체 프로브.
표적 복합체는 단백질 표적 2에 결합된 단백질 표적 1을 포함하고; 항체 제1 분획 개시제 프로브(프로브 1) 및 항체 제2 분획 개시제 프로브(프로브 2)는 HCR 개시제 I1의 절반을 각각 보유하고; 항체 제1 분획 개시제 프로브(프로브 1)와 표적 복합체 내의 단백질 표적 1의 선택적 결합 및 항체 제2 분획 개시제 프로브(프로브 2)와 표적 복합체 내의 단백질 표적 2의 선택적 결합은 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화한다. (d) 분획 개시제(일명 분할 개시제) 2차 항체 프로브. 표적 복합체는 단백질 표적 2에 결합된 단백질 표적 1을 포함하고; 1차 항체 제1 분획 개시제 프로브(프로브 1)는 표적 복합체 내의 단백질 표적 1에 선택적으로 결합하고, 1차 항체 제2 분획 개시제 프로브(프로브 2)는 표적 복합체 내의 단백질 표적 2에 선택적으로 결합하고; 2차 항체 프로브 3 및 2차 항체 프로브 4는 HCR 개시제 I1의 절반을 각각 보유하고; 2차 항체 프로브 3과 1차 항체 제1 분획 개시제 프로브(프로브 1)의 선택적 결합 및 2차 항체 프로브 4와 1차 항체 제2 분획 개시제 프로브(프로브 2)의 선택적 결합은 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화한다. (e) 분획 개시제(일명 분할 개시제) 항체 및 핵산 프로브. 표적 복합체는 핵산 표적 2에 결합된 단백질 표적 1을 포함하고; 항체 프로브 1 및 핵산 프로브 2는 HCR 개시제 I1의 절반을 각각 보유하고; 항체 프로브 1과 표적 복합체 내의 단백질 표적 1의 결합 및 핵산 프로브 2와 표적 복합체 내의 핵산 표적 2의 결합은 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화한다.
도 8의 개략도는 분획 개시제(일명 분할 개시제) 핵산 프로브(도식 E)를 사용하여 핵산 표적 분자를 영상화하는 제자리 HCR을 요약한다. 분획 개시제(일명 분할 개시제) 프로브를 사용한 제자리 HCR(도식 E). (a) 2-단계 제자리 HCR 프로토콜. 검출 단계: 분획 개시제(일명 분할 개시제) 프로브 쌍은 표적 mRNA에 하이브리드화되고 미사용 프로브는 샘플로부터 세척된다. 각각의 분획 개시제 프로브 세트는 표적 mRNA를 따라 상이한 하위서열에 선택적으로 결합하는 하나 이상의 프로브 쌍을 함유한다. 한 쌍 내의 각각의 프로브는 HCR 개시제 I1의 일부를 보유한다. 한 쌍 내의 2개의 프로브와 이들의 동족 표적 결합 부위의 선택적 하이브리드화는 HCR 개시제 I1의 두 분획을 공국소화한다. 증폭 단계: 전체 HCR 개시제 I1은 연결된 형광 증폭 중합체의 자가조립을 유발하고 미사용 H1 및 H2 헤어핀은 샘플로부터 세척된다. 별모양은 형광단을 표시한다. (b) 다중화 실험에 대한 실험 타임라인. 2-단계 프로토콜은 표적 mRNA의 수와 무관하게 사용된다.
헤어핀 단량체
바람직하게는 2개 이상의 상이한 종의 핵산 헤어핀 단량체가 HCR 반응에 사용된다. 각각의 헤어핀 단량체 종은 전형적으로 또 다른 헤어핀 단량체 종의 일부에 상보적인 하나 이상의 영역을 포함한다. 그러나, 상기 단량체는 동역학적으로 포획되도록 디자인되고, 시스템은 단량체들 중 하나의 2차 구조를 파괴할 수 있는 개시제 분자의 부재 하에 평형화될 수 없다. 따라서, 상기 단량체는 개시제의 부재 하에 중합할 수 없다. 전체 개시제 종의 도입은 2개 이상의 단량체 종에 의한 교대 동역학 탈출의 연쇄 반응을 유발하여, 중합체의 형성을 야기한다. 일부 실시양태에서, 2개의 헤어핀 단량체는 개시제의 존재 하에 중합하여 닉킹된 이중 가닥 중합체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 헤어핀 구조를 가진 2개 이상의 헤어핀 단량체가 사용된다. 헤어핀 단량체는 긴 스템에 의해 보호된 루프를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 2차 구조를 가진 단량체가 제공된다. 그러나, 2차 구조는 단량체가 개시제 핵산의 부재 하에 반응 조건 하에 준안정적일 수 있게 하는 구조일 수 있다. 전체 개시제의 존재 하에, 제1 헤어핀 단량체의 2차 구조는 제2 헤어핀 단량체 종의 스티키 말단에 하이브리드화할 수 있도록 변화한다. 이것은 차례로 제2 헤어핀 단량체의 2차 구조의 변화로 이어지고, 그 후 이 제2 헤어핀 단량체는 또 다른 제1 헤어핀 단량체와 하이브리드화하여 공정을 계속할 수 있다. 이 방식으로, 일단 제1 헤어핀 단량체의 단일 카피가 개시제의 단일 카피와 상호작용하면, 헤어핀 단량체가 교대 헤어핀 단량체 종을 포함하는 중합체로 조립될 수 있도록 연쇄 반응이 일어난다.
원하는 특성을 달성하기 위해 다수의 기준을 이용하여 단량체를 디자인할 수 있다. 예를 들어 제한 없이, 이들은 서열 대칭 최소화, 평형에서 표적 2차 구조를 채택할 확률, 표적 구조에 대해 평형에서 부정확하게 페어링된 뉴클레오타이드의 평균 수에 상응하는 앙상블 결함, 평형에서 부정확하게 페어링된 뉴클레오타이드의 농도에 상응하는 시험 튜브 앙상블 결함, 및 하이브리드화 동역학을 포함한다.
단량체는 상업적으로 입수 가능한 핵산 합성기를 포함하는 표준 방법을 이용함으로써 합성될 수 있거나, 상업적 공급원, 예컨대, 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)(아이오와주 코랄빌 소재)로부터 입수될 수 있다.
일부 실시양태에서, HCR로부터 생성되는 중합체의 분자량을 증가시키기 위해 화합물 또는 분자로 단량체를 유도체화한다. 바람직하게는, 단량체는 그의 하이브리드화 능력을 방해하지 않는 위치에서 유도체화된다. 일부 실시양태에서, 단량체는 표지 결합 부위에 의해 유도체화된다. 다른 실시양태에서, 단량체는 생성된 중합체가 가시화되게 하는 형광단 또는 비색 화합물을 포함한다.
개시제
전체 개시제는 핵산 분자일 수 있다. 전체 개시제는 헤어핀 단량체의 일부, 바람직하게는 헤어핀 단량체가 그의 동역학적으로 포획된 상태로 있는 동안 전체 개시제와의 하이브리드화에 이용될 수 있는 헤어핀 단량체의 일부에 상보적이다. 전체 개시제는 또한 바람직하게는 전체 개시제와 스티키 말단의 하이브리드화가 헤어핀 단량체의 입체구조적 변화를 야기하고 HCR 연쇄 반응을 시작하도록 스티키 말단에 인접한 헤어핀 단량체의 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 예를 들어, 전체 개시제는 전술된 바와 같이 헤어핀 단량체의 제1 상보적 영역에 상보적인 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 전체 개시제의 서열은 제1 헤어핀 단량체의 스티키 말단(개시제 상보적 영역) 및 제1 상보적 영역에 상보적이다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 이것은 또한 제2 상보적 영역의 서열 및 제2 헤어핀 단량체 종의 루프에도 영향을 미칠 것이다.
일부 실시양태에서, 전체 개시제는 샘플에서 검출될 핵산 또는 검출될 핵산의 일부이다. 이 경우, HCR 헤어핀 단량체를 디자인할 때 표적 핵산의 서열을 고려한다. 예를 들어, 하나의 헤어핀 단량체의 개시제 상보체 영역, 바람직하게는 스티키 말단은 표적 핵산 서열의 일부에 상보적이도록 디자인된다. 제2 헤어핀 단량체가 제1 헤어핀 단량체에 하이브리드화할 것이기 때문에, 제2 헤어핀 단량체의 서열은 또한 표적 핵산 서열의 적어도 일부를 반영할 것이다.
일부 실시양태에서, 다양한 인식 이벤트의 증폭은 HCR을 핵산 앱타머 유발제에 커플링함으로써 달성된다. 관심 있는 피분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머가 확인된다. 피분석물은 핵산으로 제한되지 않지만, 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 소분자일 수 있다. 앱타머는 앱타머에 결합하는 피분석물의 부재 하에 개시제가 HCR을 자극하는 데 이용될 수 없도록 하는 방식으로 개시제 영역을 포함하는 핵산에 연결된다.
HCR의 검출
HCR의 생성물은 예를 들어, 아가로스 겔 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 모세관 전기영동 및 겔 충전 모세관 전기영동을 포함하는, 당분야에서 숙련된 자에게 알려진 핵산 검출 방법에 의해 용이하게 검출될 수 있다. 중합체는 핵산을 포함하기 때문에, 표준 기법, 예컨대, 브롬화에티듐을 사용한 염색에 의해 가시화될 수 있다. 광 산란 분광법, 예컨대, 동적 광 산란(DLS), 점도 측정, 비색 시스템 및 형광 분광법을 포함하는 다른 방법도 적합할 수 있다. 더 자세히 논의된 바와 같이, 일부 제자리 영상화 및 검출 방법에서, HCR 생성물은 형광 표지된다.
일부 실시양태에서, HCR은 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의해 모니터링된다. 특정 단량체는 HCR로부터 비롯된 입체구조적 변화가 형광의 변화를 검출함으로써 모니터링될 수 있도록 형광 염료로 표지된다. 한 실시양태에서, 한 쌍의 헤어핀 분자 중 하나는 개시제 가닥에 상보적인 영역과 이중체 영역의 연접부에서 형광단으로 표지되고 이중체 영역의 반대 쪽에서 소광제 분자로 표지된다. 중합 시, 형광단과 소광제는 응집된 핵산 구조에서 공간적으로 분리되어, 형광 소광의 완화를 제공한다. 이 경우, 단일 개시제의 존재는 HCR에 의해 야기된 연쇄 형광 이벤트에 의해 증폭된다. 제자리 영상화와 관련하여, 단일 표적 분자의 존재는 연쇄 형광 이벤트에 의해 증폭될 수 있다. 또한, 제자리 영상화의 경우 미반응 단량체의 형광 소광은 배경 노이즈를 감소시킨다. 따라서, 미반응 단량체를 샘플로부터 제거할 필요가 없다.
상대적 표적 존재도는 (예를 들어, 배아 내에서의 고정을 통해, 또는 블롯에의 가교결합을 통해, 또는 비드에의 결합을 통해) 표적을 고정한 후, 표적에 의해 공국소화되어 HCR을 유발함으로써, 표적 존재도에 비례하여 커지는 신호를 생성하는 분획 개시제 프로브를 사용하여 표적을 검출함으로써 상이한 샘플들에 대해 정량될 수 있다. 샘플들 중 하나 이상의 샘플이 알려진 표적 존재도를 가진 경우, 다른 샘플에 대해 절대적인 정량을 수행할 수 있다.
제자리 영상화에의 적용
HCR의 일부 실시양태는 병렬로 다중화될 수 있는 제자리 증폭에 대한 무효소 접근법을 제공한다. 또한, 분획 개시제 프로브에 의해 유발된 HCR 증폭은 비-특이적 프로브 결합으로부터 비롯된 배경 신호를 감소시키는 수단을 제공한다. 분획 개시제 프로브는 동족 표적에 특이적으로 결합하는 경우에만 전체 개시제를 공국소화한다. 따라서, 표적만이 특이적으로 검출되는 경우 이러한 분획 개시제 프로브는 HCR을 유발하여, HCR 단량체, 바람직하게는 전술된 헤어핀 단량체로부터 구축된 (표적에) 연결된 비-공유 '중합체'의 자가조립을 유발한다. HCR 단량체는 중합체가 검출될 수 있고 표적의 존재 및/또는 위치가 확인될 수 있도록 형광 표지될 수 있다.
HCR 헤어핀 단량체는 전체 HCR 개시제에 의해 유발될 때 단량체의 중합이 검출 가능한 신호를 생성하기 때문에 본원에서 "증폭제"로서도 지칭되고, 이 신호는 단일 프로브와 표적의 결합에 의해 생성될 신호에 비해 증폭된다. 증폭제는 동일하거나 상이한 형광단으로 각각 표지될 수 있다. 예를 들어, 시스템은 표적당 2개 이상의 단량체 종을 사용하도록 디자인될 수 있고, 이때 하나 이상의 종은 형광 표지된다. 2개 유형의 헤어핀 단량체를 포함하는 HCR 증폭제는 2개 유형의 헤어핀 단량체 각각을 표지하는 상이한 유형의 형광단을 가질 수 있다. 4개 유형의 헤어핀 단량체를 포함하는 HCR 증폭제는 각각의 유형의 헤어핀 단량체에 대해 하나씩 4개의 상이한 형광단을 가질 수 있다. 이러한 경우, HCR 증폭 중합체는 알려진 비(예를 들어, 2개 유형의 교대 헤어핀 단량체로 만들어진 중합체의 경우 1:1, 또는 4개 유형의 교대 헤어핀 단량체로 만들어진 중합체의 경우 1:1:1:1)로 다수의 유형의 형광단으로 장식될 것이다. 형광 표지는 당분야에서 숙련된 자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌["The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies," 10th Edition]에 기재된 형광 표지들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 시스템 내의 증폭제는 형광단 및 소광제 둘 다로 표지되어 "분자 비콘(beacon)"과 유사한 구축물을 형성한다(Tyagi et al. Nature Biotechnology 14:303-308, 1996). 예를 들어, 헤어핀 단량체는 형광단 및 소광제 둘 다를 포함할 수 있으므로, 소광제는 단량체가 헤어핀 형태로 존재하는 동안 형광을 감소시키지만, 단량체가 HCR 중합체에 혼입될 때에는 그렇지 않다. 따라서, HCR 단량체의 분자 비콘 버전은 임의의 중합되지 않은 단량체, 예컨대, 비-특이적으로 결합하거나 샘플에서 단순히 반응하지 않은 상태로 남아 있는 단량체로부터 비롯된 배경 신호를 감소시킬 수 있다.
생물학적 샘플의 영상화를 위해, 샘플에 침투할 수 있도록 크기가 작은 증폭제 구성요소를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 약 20 nm 미만, 예를 들어, 15 nm 미만, 10 nm 미만, 및 약 8 nm 내지 16 nm의 HCR 구성요소가 사용된다. 일부 실시양태에서, HCR 헤어핀 단량체는 약 8 nm 미만이다. 제자리 영상화를 위한 표준 절차를 이용하여 HCR 생성물이 샘플에 들어갈 수 있게 한다. 숙련된 기술자는 HCR 구성요소가 샘플에 들어가게 하는 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
제자리 영상화를 위한 HCR의 장점은 존재하는 소량의 피분석물을 기반으로 신호를 빠르게 증폭하는 능력 및 동일한 샘플에서 다양한 피분석물을 영상화하는 능력을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같이, 제자리 검출 및 영상화를 위한 HCR의 이용은 많은 장점을 제공한다. 특이성은 2개 이상의 분획 개시제 프로브가 그들의 표적 구획(예를 들어, 동족 표적 부위)에 특이적으로 결합할 때에만 전체 개시제를 공국소화하는 분획 개시제 프로브를 사용함으로써 달성될 수 있다. 특이성은 프로브가 표적에 특이적으로 결합할 때까지 개시제를 보호하는 유발된 프로브를 사용함으로써 달성될 수 있다. 자가소광 HCR 단량체는 연결된 증폭 중합체로 자가조립하는 동안 분리되게 되는 형광단/소광제 쌍으로 표지될 수 있다. 이 자동 배경 억제는 미사용 증폭 구성요소가 영상화 전에 세척될 수 없는 경우인 생체내 적용에 특히 유용하다. 다용도성은 유발된 프로브 개념을 단백질 및 소분자의 검출로 일반화하는 구조 전환 앱타머(Ellinton et al. Nature 346:818-822, 1990 and Tuerk et al. Science 249:505-510, 1990)를 선택함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는 최대 치수가 8 nm 내지 16 nm인 작은 프로브 및 증폭 단량체는 샘플 침투를 용이하게 한다. 등온 조건은 HCR 증폭에 이상적이므로, 고정된 샘플 또는 이의 구성요소의 형태 손상을 피하고 생체내 영상화를 용이하게 한다. 다중화는 예를 들어, 스펙트럼에 의해 구별되는 형광단을 사용하여 고유 조합 시그니처를 각각의 HCR 생성물의 구조 내로 직접적으로 코딩하도록 동시에 작동하는 독립적인 HCR 증폭제의 사용으로부터 자연스럽게 나온다. 민감한 정량적 증폭은 규정된 유한 크기의 연결된 중합체로의 기하급수적 성장을 제공하는 비선형 HCR 기작을 이용함으로써 달성될 수 있다. 마지막으로, 생체내 적용을 위한 생체적합성은 핵산 증폭제 구성요소의 사용으로부터 나온다.
다수의 피분석물의 영상화
HCR 증폭은 다수의 표적을 동시에 증폭할 수 있게 한다. 다수의 피분석물(예를 들어, 유전자 전사체 또는 단백질)을 표적화하는 HCR을 동시에 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 HCR 시스템은 스펙트럼에 의해 구별되는 염료로 표지된다. 따라서, 피분석물의 수는 스펙트럼에 의해 구별될 수 있는 사용 가능한 염료의 수에 해당한다. 많은 상황의 경우, 이것은 충분할 것이다.
다수의 mRNA 또는 단백질의 발현을 연구하기 위해, 오르토고날 HCR 증폭제를 사용하여 모든 인식 이벤트의 다중화 증폭을 동시에 수행하는 것이 바람직하다. 스펙트럼에 의해 구별되는 형광단의 제한된 공급을 이용하여 영상화할 수 있는 상이한 표적의 수를 증가시키기 위해, 레브스키(Levsky)와 동료들의 증폭되지 않은 조합 다중화 접근법(Levsky et al. Science 297:836-840, 2002)은 상이한 고유 염료 조합으로 각각의 증폭제에 대한 단량체를 표지함으로써 HCR 증폭에 적합해질 수 있다. 최소 두 가지 색상을 가진 바코드의 사용은 특이적으로 결합되지 않은 프로브로부터 비롯된 단일 색상 신호를 스크리닝하기 위한 기반을 제공한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 각각의 표적에 대해 단일 프로브 쌍만을 사용하고, 상이한 고유 염료 조합으로 각각의 HCR 증폭제에 대한 단량체를 표지함으로써 조합 다중화를 수행한다.
HI 및 H2 헤어핀이 상이한 염료로 말단 표지된 경우, HCR 생성물은 구축에 의해 동등한 수의 각각의 염료를 보유할 것이다. 일반적으로, 스펙트럼에 의해 구별되는 N개의 형광단을 사용하여 이중 색상 증폭제로 T: N!/[(N-2)!2!]개의 표적을 처리할 수 있다(예를 들어, 6개의 표적에 대해 4개의 염료, 10개의 표적에 대해 5개의 염료). 그러나, 조합 바코드는 이 접근법을 이용하는 배경 진단제로서 사용되지 않기 때문에, 단일 색상 증폭제를 허용함으로써 표적의 수를 T= N![N-2]!2!+N까지 증가시킬 수 있다(예를 들어, 10개의 표적에 대해 4개의 염료, 15개의 표적에 대해 5개의 염료). 더욱이, 처리될 수 있는 표적의 수를 Σ(i=1,N)N!/[(Ni)!i!] = 2N - 1까지 증가시키기 위해 하나 초과의 염료로 HCR 단량체를 표지할 수 있다(예를 들어, 15개의 표적에 대해 4개의 염료, 31개의 표적에 대해 5개의 염료). 증폭제당 M개의 헤어핀을 사용하는 HCR 시스템도 디자인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법의 임의적 단계들 중 어느 하나 이상의 임의적 단계는 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법의 다른 임의적 단계들 중 어느 하나 이상의 다른 임의적 단계와 조합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법에 대해 상이한 단계들 중 어느 하나 이상의 단계는 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법에 대해 상이한 다른 단계들 중 어느 하나 이상의 다른 단계와 조합될 수 있다 .
일부 실시양태에서, 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법에 대해 상이한 임의적 단계들 중 어느 하나 이상의 임의적 단계는 본원의 방법들 중 어느 하나 이상의 방법에 대해 상이한 다른 임의적 단계들 중 어느 하나 이상의 다른 임의적 단계와 조합될 수 있다.
반복된 적용 실시양태 - 방법 1
일부 실시양태에서, 리포터-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)를 제공하는 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) N개의 프로브 세트 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우, 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; (g) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및 (h) 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (b) 내지 (g) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화)를 제공하는 단계; c) 샘플을 세척하는 단계; (d) N개의 프로브 세트 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우, 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; e) 샘플을 세척하는 단계; (f) M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; (g) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및 h) 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (b) 내지 (g) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 프로브 세트 내의 개시제-표지된 프로브의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 HCR 개시제를 포함한다(예를 들어, 도 39a 내지 39n 및 42a 내지 42f).
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, 옵션 i)의 일부(하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브) 및 옵션 ii)의 일부(2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛)가 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, N개의 프로브 세트가 사용될 때, 이들 모두는 옵션 i)이거나, 이들 모두는 옵션 ii)이거나, 예를 들어, 1:1000, 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1. 20:1, 25:1, 50:1, 100:1, 1000:1, 또는 이 비들 중 임의의 두 비 사이에 정의된 임의의 범위 내의 비를 야기하도록 옵션 i)과 ii)의 혼합물이 사용된다. 이들 혼합물 및 비는 하나 초과의 프로브 세트가 사용되는, 본원에서 제공된 실시양태들 중 임의의 실시양태에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 전체 HCR 개시제를 함께 생성하는 2개의 분획 개시제 프로브를 포함한다(f1 + f2 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2).
일부 실시양태에서, HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 각각의 프로브와 표적의 인접 동족 결합 부위의 결합은 분획 개시제를 공국소화함으로써, HCR 헤어핀에 하이브리드화여 HCR 신호 증폭을 유발할 수 있는 전체 HCR 개시제를 형성한다(예를 들어, 도 3a 내지 5e, 8a, 8b, 16a 내지 16d, 21a 내지 22, 및 27의 전체 HCR 개시제 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a, 21b, 22 및 27 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a 내지 22 및 27 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 전체 HCR 개시제를 공국소화하지 않아, HCR 신호 증폭을 억제한다.
일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다(예를 들어, 도 8a, 8b, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 증폭제 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 가진 인풋 도메인, 및 단일 가닥 루프 및 스템 구획에 대한 상보체를 가진 아웃풋 도메인을 포함한다(예를 들어, 도 8a, 8b, 13, 14, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 헤어핀 참조). 전체 HCR 개시제의 부재 하에, HCR 헤어핀은 동역학적으로 포획되고 중합되지 않아, 배경을 억제한다. 그러나, 프로브 유닛 내의 분획 개시제 프로브가 표적에서 그의 인접 동족 결합 부위에 결합하여 전체 HCR 개시제를 공국소화하는 경우, 전체 HCR 개시제는 전체 개시제가 제1 HCR 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 제1 헤어핀을 개방함으로써 그의 아웃풋 도메인을 노출시키고, 그 다음 이 아웃풋 도메인이 제2 HCR 헤어핀의 인풋 도메인에 하이브리드화하여, 제2 헤어핀을 개방함으로써 그의 아웃풋 도메인을 노출시키는 방식으로 중합 단계의 연쇄 반응을 개시함으로써, 헤어핀이 중합되어 표적에 연결된 HCR 증폭 중합체를 생성하는 연쇄 반응을 유발한다(예를 들어, 도 8a, 13, 14, 18c 내지 18f, 19a 및 19b의 증폭 중합체 참조). 일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 하나 이상의 표지를 추가로 포함하고, 각각의 표지는 리포터를 포함하거나, 하나 이상의 리포터를 포함하는 표지 프로브를 동원하는 기질(또는 분획 기질)을 포함한다(예를 들어, 도 18a 내지 18f의 리포터-표지된 HCR 헤어핀, 기질-표지된 HCR 헤어핀, 및 분획 기질-표지된 HCR 헤어핀 참조).
일부 실시양태에서, 표지 프로브는 하나 이상의 리포터를 포함하고 HCR 헤어핀의 기질에 상보적이거나 HCR 증폭 중합체 내에 공국소화된 전체 기질에 상보적인 기질 결합 영역을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 20a 내지 20f의 표지 프로브 참조). 일부 실시양태에서, 신호는 샘플 내의 표적에 연결된 HCR 증폭 중합체와 결합된 하나 이상의 리포터에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 신호는 샘플로부터 제거된다(예를 들어, 도 23a 내지 23o 및 40a 내지 40n 참조). 일부 실시양태에서, HCR 신호는 동일한 샘플로부터 1회 이상 생성되고 검출되고 제거된다(예를 들어, 도 23a 내지 23o, 26a 내지 26t, 및 40a 내지 40n 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 리포터를 추가로 포함한다. 예를 들어, 리포터는 형광단, 발색단, 발광단, 인광체, FRET 쌍, FRET 쌍의 구성원, 소광제, 형광단/소광제 쌍, 희토류 원소 또는 화합물, 방사성 분자, 자성 분자, 또는 신호 측정을 용이하게 하는 임의의 다른 분자일 수 있다.
방법 2
일부 실시양태에서, 리포터-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) 하나 이상의 리포터로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; (g) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; (h) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; (i) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 및 (j) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계; c) 샘플을 세척하는 단계; (d) 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; e) 샘플을 세척하는 단계; (f) 하나 이상의 리포터로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; (g) 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; h) 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; (i) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 및 j) 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 프로브 세트 내의 개시제-표지된 프로브의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 HCR 개시제를 포함한다(예를 들어, 도 39a 내지 39n 및 42a 내지 42f).
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 전체 HCR 개시제를 함께 생성하는 2개의 분획 개시제 프로브를 포함한다(f1 + f2 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2).
일부 실시양태에서, HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 각각의 프로브와 표적의 인접 동족 결합 부위의 결합은 분획 개시제를 공국소화함으로써, HCR 헤어핀에 하이브리드화여 HCR 신호 증폭을 유발할 수 있는 전체 HCR 개시제를 형성한다(예를 들어, 도 3a 내지 5e, 8a, 8b, 16a 내지 16d, 21a 내지 22, 및 27의 전체 HCR 개시제 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a, 21b, 22 및 27 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a 내지 22 및 27 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 전체 HCR 개시제를 공국소화하지 않아, HCR 신호 증폭을 억제한다.
일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다(예를 들어, 도 8a, 8b, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 증폭제 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 하나 이상의 리포터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 리포터는 형광단, 발색단, 발광단, 인광체, FRET 쌍, FRET 쌍의 구성원, 소광제, 형광단/소광제 쌍, 희토류 원소 또는 화합물, 방사성 분자, 자성 분자, 또는 신호 측정을 용이하게 하는 임의의 다른 분자이다.
방법 3
일부 실시양태에서, 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트를 제공하는 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) N개의 상이한 기질들 중 M개의 상이한 기질에 상응하는 M개의 표지 프로브(M ≤ N인 경우, 상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; (g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (h) M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; (i) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및 (j) 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (f) 내지 (i) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트를 제공하는 단계; c) 샘플을 세척하는 단계; (d) N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; e) 샘플을 세척하는 단계; (f) N개의 상이한 기질들 중 M개의 상이한 기질에 상응하는 M개의 표지 프로브(M ≤ N인 경우, 상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; g) 샘플을 세척하는 단계; (h) M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계; (i) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및 j) 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (f) 내지 (i) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 프로브 세트 내의 개시제-표지된 프로브의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 HCR 개시제를 포함한다(예를 들어, 도 39a 내지 39n 및 42a 내지 42f).
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 전체 HCR 개시제를 함께 생성하는 2개의 분획 개시제 프로브를 포함한다(f1 + f2 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2).
일부 실시양태에서, HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 각각의 프로브와 표적의 인접 동족 결합 부위의 결합은 분획 개시제를 공국소화함으로써, HCR 헤어핀에 하이브리드화여 HCR 신호 증폭을 유발할 수 있는 전체 HCR 개시제를 형성한다(예를 들어, 도 3a 내지 5e, 8a, 8b, 16a 내지 16d, 21a 내지 22, 및 27의 전체 HCR 개시제 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a, 21b, 22 및 27 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a 내지 22 및 27 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 전체 HCR 개시제를 공국소화하지 않아, HCR 신호 증폭을 억제한다.
일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다(예를 들어, 도 8a, 8b, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 증폭제 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 기질을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질은 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 한다.
일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 리포터 물질로서 항-DIG 항체를 동원하는 디곡시제닌(DIG)을 포함할 수 있고, 이때 항-DIG는 하나 이상의 리포터, 또는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 역할을 하는 하나 이상의 기질로 직접적으로 표지된다.
일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 하나 이상의 리포터를 추가로 포함하는 표지 프로브 내의 도메인에 대한 전체적 또는 부분적 서열 상보성을 가진 기질로서 작용하는 핵산 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 매개하는 역할을 하는 하나 이상의 기질을 보유하는 표지 프로브 내의 도메인에 대한 전체적 또는 부분적 서열 상보성을 가진 기질로서 작용하는 핵산 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 리포터 물질에 대한 기질로서 작용하는 핵산 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 간접적으로 매개하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 하는 기질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 헤어핀의 근처에서 리포터 분자의 침착을 유발하는 CARD-기질을 촉매작용하는 효소를 포함하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 하는 기질을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 33a 내지 33e, 34a 내지 34c, 36a 및 36b 참조). 예를 들어,
1. 효소는 CARD-기질에 작용하여 발색성 리포터, 예컨대, AEC, DAB, TMB 또는 StayYellow의 침착을 촉매작용하거나, CARD-기질을 촉매작용하여 형광 리포터, 예컨대, 형광단-표지된 티라마이드의 침착을 촉매작용하거나, 합텐-표지된 CARD-기질, 예컨대, 바이오틴-표지된 티라마이드의 침착을 촉매작용하는 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP)(또는 다수의 HRP 효소를 포함하는 중합체 HRP)일 수 있고, 이때 합텐은 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 매개하는 역할을 한다.
2. 효소는 CARD-기질에 작용하여 리포터, 예를 들어, BCIP/NBT, BCIP/TNBT, 나프톨 AS-MX 포스페이트 + FastBlue BB, 나프톨 AS-MX 포스페이트 + FastRed TR, StayGreen과 같은(그러나, 이들로 제한되지 않는) 발색성 리포터의 침착을 촉매작용하는 알칼리성 포스파타제(AP)(또는 다수의 AP 효소를 포함하는 중합체 AP)일 수 있다.
3. 효소는 CARD-기질에 작용하여 리포터, 예를 들어, NBT의 침착을 촉매작용하는 글루코스 옥시다제일 수 있다.
4. 효소는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 임의의 분자 또는 복합체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표지 프로브는 하나 이상의 리포터를 포함하고 HCR 헤어핀의 기질에 상보적이거나 HCR 증폭 중합체 내에 공국소화된 전체 기질에 상보적인 기질 결합 영역을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 20a 내지 20f의 표지 프로브 참조). 일부 실시양태에서, 신호는 샘플 내의 표적에 연결된 HCR 증폭 중합체와 결합된 하나 이상의 리포터에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 신호는 샘플로부터 제거된다(예를 들어, 도 23a 내지 23o 및 40a 내지 40n 참조). 일부 실시양태에서, HCR 신호는 동일한 샘플로부터 1회 이상 생성되고 검출되고 제거된다(예를 들어, 도 23a 내지 23o, 26a 내지 26t, 및 40a 내지 40n 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 리포터를 추가로 포함한다. 예를 들어, 리포터는 형광단, 발색단, 발광단, 인광체, FRET 쌍, FRET 쌍의 구성원, 소광제, 형광단/소광제 쌍, 희토류 원소 또는 화합물, 방사성 분자, 자성 분자, 또는 신호 측정을 용이하게 하는 임의의 다른 분자일 수 있다.
방법 4
일부 실시양태에서, 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; d) 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; (g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (h) 하나 이상의 리포터에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; (i) 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계; 및 (j) 임의적으로 단계 (b) 내지 (i) 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계; c) 샘플을 세척하는 단계; d) 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; e) 샘플을 세척하는 단계; (f) 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; g) 샘플을 세척하는 단계; (h) 하나 이상의 리포터에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; (i) 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계; 및 j) 단계 (b) 내지 (i) 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 프로브 세트 내의 개시제-표지된 프로브의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 HCR 개시제를 포함한다(예를 들어, 도 39a 내지 39n 및 42a 내지 42f).
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 전체 HCR 개시제를 함께 생성하는 2개의 분획 개시제 프로브를 포함한다(f1 + f2 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2).
일부 실시양태에서, HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 각각의 프로브와 표적의 인접 동족 결합 부위의 결합은 분획 개시제를 공국소화함으로써, HCR 헤어핀에 하이브리드화여 HCR 신호 증폭을 유발할 수 있는 전체 HCR 개시제를 형성한다(예를 들어, 도 3a 내지 5e, 8a, 8b, 16a 내지 16d, 21a 내지 22, 및 27의 전체 HCR 개시제 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a, 21b, 22 및 27 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a 내지 22 및 27 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 전체 HCR 개시제를 공국소화하지 않아, HCR 신호 증폭을 억제한다.
일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다(예를 들어, 도 8a, 8b, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 증폭제 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 기질을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질은 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 한다.
일부 실시양태에서, 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 리포터를 포함한다(예를 들어, 도 18c 내지 18e 및 20 참조). 예를 들어, 리포터는 형광단, 발색단, 발광단, 인광체, FRET 쌍, FRET 쌍의 구성원, 소광제, 형광단/소광제 쌍, 희토류 원소 또는 화합물, 방사성 분자, 자성 분자, 또는 신호 측정을 용이하게 하는 임의의 다른 분자일 수 있다.
방법 5
일부 실시양태에서, 리포터 및/또는 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트를 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; (d) 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; (e) 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; (f) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (g) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계; (h) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; (i) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계; (j) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; (k) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 및 j) 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 리포터 및/또는 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트를 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계; d) 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; (e) 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; f) 샘플을 세척하는 단계; (g) 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계; (h) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; (i) 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계; j) 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계; k) 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 및 j) 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 프로브 세트 내의 개시제-표지된 프로브의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 HCR 개시제를 포함한다(예를 들어, 도 39a 내지 39n 및 42a 내지 42f).
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 전체 HCR 개시제를 함께 생성하는 2개의 분획 개시제 프로브를 포함한다(f1 + f2 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2).
일부 실시양태에서, HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 각각의 프로브와 표적의 인접 동족 결합 부위의 결합은 분획 개시제를 공국소화함으로써, HCR 헤어핀에 하이브리드화여 HCR 신호 증폭을 유발할 수 있는 전체 HCR 개시제를 형성한다(예를 들어, 도 3a 내지 5e, 8a, 8b, 16a 내지 16d, 21a 내지 22, 및 27의 전체 HCR 개시제 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a, 21b, 22 및 27 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a 내지 22 및 27 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 전체 HCR 개시제를 공국소화하지 않아, HCR 신호 증폭을 억제한다.
일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다(예를 들어, 도 8a, 8b, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 증폭제 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 하나 이상의 리포터를 포함한다.
방법 6
일부 실시양태에서, 리포터 및/또는 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 단계 (c) 내지 (g) 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 수행하는 단계; (c) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계; (d) 하나 이상의 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성하는 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 및 (g) 임의적으로 하나 이상의 신호를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 리포터 및/또는 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 단계 (c) 내지 (g) 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 수행하는 단계; (c) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트를 제공하는 단계; (d) 하나 이상의 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성하는 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계; e) 샘플을 세척하는 단계; (f) 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 및 g) 하나 이상의 신호를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 프로브 세트 내의 개시제-표지된 프로브의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 HCR 개시제를 포함한다(예를 들어, 도 39a 내지 39n 및 42a 내지 42f).
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 전체 HCR 개시제를 함께 생성하는 2개의 분획 개시제 프로브를 포함한다(f1 + f2 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2).
일부 실시양태에서, HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 각각의 프로브와 표적의 인접 동족 결합 부위의 결합은 분획 개시제를 공국소화함으로써, HCR 헤어핀에 하이브리드화여 HCR 신호 증폭을 유발할 수 있는 전체 HCR 개시제를 형성한다(예를 들어, 도 3a 내지 5e, 8a, 8b, 16a 내지 16d, 21a 내지 22, 및 27의 전체 HCR 개시제 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a, 21b, 22 및 27 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a 내지 22 및 27 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 전체 HCR 개시제를 공국소화하지 않아, HCR 신호 증폭을 억제한다.
일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다(예를 들어, 도 8a, 8b, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 증폭제 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질을 추가로 포함한다.
방법 7
일부 실시양태에서, 중첩 결합 부위를 이용하는 HCR 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계; (g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 및 (h) 리포터로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; c) 샘플을 세척하는 단계; (d) 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계; e) 샘플을 세척하는 단계; f) 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계; g) 샘플을 세척하는 단계; 및 (h) 리포터로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중첩은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 전체 HCR 개시제를 함께 생성하는 2개의 분획 개시제 프로브를 포함한다(f1 + f2 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2).
일부 실시양태에서, HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 각각의 프로브와 표적의 인접 동족 결합 부위의 결합은 분획 개시제를 공국소화함으로써, HCR 헤어핀에 하이브리드화여 HCR 신호 증폭을 유발할 수 있는 전체 HCR 개시제를 형성한다(예를 들어, 도 3a 내지 5e, 8a, 8b, 16a 내지 16d, 21a 내지 22, 및 27의 전체 HCR 개시제 참조).
일부 실시양태에서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a, 21b, 22 및 27 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a 내지 22 및 27 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 전체 HCR 개시제를 공국소화하지 않아, HCR 신호 증폭을 억제한다.
일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다(예를 들어, 도 8a, 8b, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 증폭제 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 리포터 및/또는 기질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 리포터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 헤어핀의 근처에서 리포터 분자의 침착을 유발하는 CARD-기질을 촉매작용하는 효소를 포함하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 하는 기질을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 33a 내지 33e, 34a 내지 34c, 36a 및 36b 참조). 예를 들어,
1. 효소는 CARD-기질에 작용하여 발색성 리포터, 예컨대, AEC, DAB, TMB 또는 StayYellow의 침착을 촉매작용하거나, CARD-기질을 촉매작용하여 형광 리포터, 예컨대, 형광단-표지된 티라마이드의 침착을 촉매작용하거나, 합텐-표지된 CARD-기질, 예컨대, 바이오틴-표지된 티라마이드의 침착을 촉매작용하는 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP)(또는 다수의 HRP 효소를 포함하는 중합체 HRP)일 수 있고, 이때 합텐은 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 매개하는 역할을 한다.
2. 효소는 CARD-기질에 작용하여 리포터, 예를 들어, BCIP/NBT, BCIP/TNBT, 나프톨 AS-MX 포스페이트 + FastBlue BB, 나프톨 AS-MX 포스페이트 + FastRed TR, StayGreen과 같은(그러나, 이들로 제한되지 않는) 발색성 리포터의 침착을 촉매작용하는 알칼리성 포스파타제(AP)(또는 다수의 AP 효소를 포함하는 중합체 AP)일 수 있다.
3. 효소는 CARD-기질에 작용하여 리포터, 예를 들어, NBT의 침착을 촉매작용하는 글루코스 옥시다제일 수 있다.
4. 효소는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 임의의 분자 또는 복합체일 수 있다.
방법 8
일부 실시양태에서, 중첩 결합 부위를 이용하는 HCR 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계; (g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 및 (h) 리포터로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; c) 샘플을 세척하는 단계; (d) 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계; e) 샘플을 세척하는 단계; f) 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계; g) 샘플을 세척하는 단계; 및 (h) 리포터로부터 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 전체 HCR 개시제를 함께 생성하는 2개의 분획 개시제 프로브를 포함한다(f1 + f2 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2).
일부 실시양태에서, HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 각각의 프로브와 표적의 인접 동족 결합 부위의 결합은 분획 개시제를 공국소화함으로써, HCR 헤어핀에 하이브리드화여 HCR 신호 증폭을 유발할 수 있는 전체 HCR 개시제를 형성한다(예를 들어, 도 3a 내지 5e, 8a, 8b, 16a 내지 16d, 21a 내지 22, 및 27의 전체 HCR 개시제 참조). 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a, 21b, 22 및 27 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a 내지 22 및 27 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 전체 HCR 개시제를 공국소화하지 않아, HCR 신호 증폭을 억제한다.
일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다(예를 들어, 도 8a, 8b, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 증폭제 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 리포터 및/또는 기질을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포터는 형광단, 발색단, 발광단, 인광체, FRET 쌍, FRET 쌍의 구성원, 소광제, 형광단/소광제 쌍, 희토류 원소 또는 화합물, 방사성 분자, 자성 분자, 또는 신호 측정을 용이하게 하는 임의의 다른 분자이다. 일부 실시양태에서, 기질은 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 한다.
일부 실시양태에서, 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 리포터를 포함한다(예를 들어, 도 18c 내지 18e 및 20 참조). 예를 들어, 리포터는 형광단, 발색단, 발광단, 인광체, FRET 쌍, FRET 쌍의 구성원, 소광제, 형광단/소광제 쌍, 희토류 원소 또는 화합물, 방사성 분자, 자성 분자, 또는 신호 측정을 용이하게 하는 임의의 다른 분자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 헤어핀의 근처에서 리포터 분자의 침착을 유발하는 CARD-기질을 촉매작용하는 효소를 포함하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 하는 기질을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 33a 내지 33e, 34a 내지 34c, 36a 및 36b 참조). 예를 들어,
1. 효소는 CARD-기질에 작용하여 발색성 리포터, 예컨대, AEC, DAB, TMB 또는 StayYellow의 침착을 촉매작용하거나, CARD-기질을 촉매작용하여 형광 리포터, 예컨대, 형광단-표지된 티라마이드의 침착을 촉매작용하거나, 합텐-표지된 CARD-기질, 예컨대, 바이오틴-표지된 티라마이드의 침착을 촉매작용하는 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP)(또는 다수의 HRP 효소를 포함하는 중합체 HRP)일 수 있고, 이때 합텐은 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 매개하는 역할을 한다.
2. 효소는 CARD-기질에 작용하여 리포터, 예를 들어, BCIP/NBT, BCIP/TNBT, 나프톨 AS-MX 포스페이트 + FastBlue BB, 나프톨 AS-MX 포스페이트 + FastRed TR, StayGreen과 같은(그러나, 이들로 제한되지 않는) 발색성 리포터의 침착을 촉매작용하는 알칼리성 포스파타제(AP)(또는 다수의 AP 효소를 포함하는 중합체 AP)일 수 있다.
3. 효소는 CARD-기질에 작용하여 리포터, 예를 들어, NBT의 침착을 촉매작용하는 글루코스 옥시다제일 수 있다.
4. 효소는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 임의의 분자 또는 복합체일 수 있다.
방법 9
일부 실시양태에서, 반복된 신호 검출과 함께 중첩 결합 부위를 이용하는 HCR 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; (c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (d) 하나 이상의 리포터 및/또는 기질로 각각 표지된 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계; (e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (f) 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; (g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; (h) 하나 이상의 리포터로부터 신호를 검출하는 단계; (i) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계; (j) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; (k) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계; (l) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 증폭제를 제거하는 단계; (m) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 및 (n) 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계; (b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계; c) 샘플을 세척하는 단계; (d) 하나 이상의 리포터 및/또는 기질로 각각 표지된 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계; e) 샘플을 세척하는 단계; (f) 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계; g) 샘플을 세척하는 단계; (h) 하나 이상의 리포터로부터 신호를 검출하는 단계; (i) 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계; j) 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; k) 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계; l) 샘플로부터 하나 이상의 증폭제를 제거하는 단계; (m) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 및 n) 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 프로브 세트가 사용될 때, (프로브 세트에 대해) 옵션 i)의 일부 및 옵션 ii)의 일부가 사용된다.
방법의 일부 실시양태에서, 0개 또는 1개 이상의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 각각 포함하고, 0개 또는 1개 이상의 다른 표적을 위해 사용되는 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브 세트는 2개 이상의 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 표적을 위해 사용되는 프로브 세트의 유형은 그 표적의 세부사항을 기반으로 각각의 표적에 대해 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 CARD 또는 반복된 CARD를 추가로 매개한다.
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 개시제-표지된 프로브의 수의 증가는 프로브 세트 내의 개시제-표지된 프로브의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시제-표지된 프로브는 하나 이상의 표적 결합 도메인 및 하나 이상의 HCR 개시제를 포함한다(예를 들어, 도 39a 내지 39n 및 42a 내지 42f).
일부 실시양태에서, 프로브 세트는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수는 1 내지 1000, 또는 10 내지 100, 또는 20 내지 50, 또는 30 내지 40의 범위 내에 있을 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 신호 대 배경 비를 2배, 또는 5배, 또는 10배, 또는 100배 이상 증가시킬 수 있다. 프로브 세트에서 프로브 유닛의 수의 증가는 프로브 세트 내의 프로브 유닛의 수, 샘플 고유의 배경 수준 및 샘플 내에서의 표적의 존재도에 따라 신호 대 배경 비를 2, 또는 5, 또는 10, 또는 50, 또는 100, 또는 200, 또는 500, 또는 1000 이상까지 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 전체 HCR 개시제를 함께 생성하는 2개의 분획 개시제 프로브를 포함한다(f1 + f2 = 1이 되도록 프로브 P1에 대한 분획 f1 및 프로브 P2에 대한 분획 f2).
일부 실시양태에서, HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 각각의 프로브와 표적의 인접 동족 결합 부위의 결합은 분획 개시제를 공국소화함으로써, HCR 헤어핀에 하이브리드화여 HCR 신호 증폭을 유발할 수 있는 전체 HCR 개시제를 형성한다(예를 들어, 도 3a 내지 5e, 8a, 8b, 16a 내지 16d, 21a 내지 22, 및 27의 전체 HCR 개시제 참조). 일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 표적 결합 영역은 표적의 중첩 또는 비-중첩 영역에 결합하도록 구성된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a, 21b, 22 및 27 참조).
일부 실시양태에서, 프로브 유닛 내의 분획 개시제는 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 영역에 하이브리드화하도록 디자인된다(예를 들어, 도 8a, 8b, 21a 내지 22 및 27 참조). 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 개별 프로브는 전체 HCR 개시제를 공국소화하지 않아, HCR 신호 증폭을 억제한다.
일부 실시양태에서, HCR 증폭제는 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함한다(예를 들어, 도 8a, 8b, 18a 내지 18f, 19a 및 19b의 HCR 증폭제 참조).
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HCR 헤어핀은 하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 표지 프로브는 기질 결합 영역 및 하나 이상의 리포터를 포함한다.
본원의 방법들(예를 들어, 방법 1 내지 9)의 일부 실시양태에서, 표적은 핵산 서열이다. 비제한적인 예는 dsDNA, dsRNA, ssDNA 및 ssRNA이다.
본원의 방법들 중 임의의 방법(예를 들어, 방법 1 또는 방법 3)의 일부 실시양태에서, N은 1 내지 1000이다. 일부 실시양태에서, N은 1 내지 10, 1 내지 50, 1 내지 100, 1 내지 250, 1 내지 500, 또는 1 내지 750이다.
본원의 방법들 중 임의의 방법(예를 들어, 방법 1 또는 방법 3)의 일부 실시양태에서, M은 2 내지 10,000이다. 일부 실시양태에서, M은 1 내지 10, 1 내지 50, 1 내지 100, 1 내지 250, 1 내지 500, 1 내지 750, 1 내지 1000, 1 내지 1250, 1 내지 2500, 1 내지 3750, 1 내지 5000, 또는 1 내지 7500이다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 기질은 합텐, 디곡시제닌(DIG), 디니트로페닐(DNP), 형광단, 바이오틴, 4개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 도메인, 리포터 분자의 침착을 촉매작용하는 효소를 동원하는 기질, 분획 기질, 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 핵산 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 리포터는 형광단, 발색단, 발광단, 인광체, FRET 쌍, FRET 쌍의 구성원, 소광제, 형광단/소광제 쌍, 희토류 원소 또는 화합물, 방사성 분자, 자성 분자이다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 샘플을 고정하는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 샘플로부터 하나 이상의 증폭제를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 청구범위에 기재된 알파벳 순서로 수행된다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 프로브 유닛은 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하고, 이때 HCR 분획 개시제 프로브는 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함한다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 중첩 결합이 이용되고 이때 중첩은 적어도 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드이다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 헤어핀의 근처에서 리포터 분자의 침착을 유발하는 CARD-기질을 촉매작용하는 효소를 포함하는 리포터 물질을 동원하는 역할을 하는 기질을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 33a 내지 33e, 34a 내지 34c, 36a 및 36b 참조). 예를 들어,
1. 효소는 CARD-기질에 작용하여 발색성 리포터, 예컨대, AEC, DAB, TMB 또는 StayYellow의 침착을 촉매작용하거나, CARD-기질을 촉매작용하여 형광 리포터, 예컨대, 형광단-표지된 티라마이드의 침착을 촉매작용하거나, 합텐-표지된 CARD-기질, 예컨대, 바이오틴-표지된 티라마이드의 침착을 촉매작용하는 호스라디쉬 퍼록시다제(HRP)(또는 다수의 HRP 효소를 포함하는 중합체 HRP)일 수 있고, 이때 합텐은 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 매개하는 역할을 한다.
2. 효소는 CARD-기질에 작용하여 리포터, 예를 들어, BCIP/NBT, BCIP/TNBT, 나프톨 AS-MX 포스페이트 + FastBlue BB, 나프톨 AS-MX 포스페이트 + FastRed TR, StayGreen과 같은(그러나, 이들로 제한되지 않는) 발색성 리포터의 침착을 촉매작용하는 알칼리성 포스파타제(AP)(또는 다수의 AP 효소를 포함하는 중합체 AP)일 수 있다.
3. 효소는 CARD-기질에 작용하여 리포터, 예를 들어, NBT의 침착을 촉매작용하는 글루코스 옥시다제일 수 있다.
4. 효소는 헤어핀 표지의 근처에서 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 임의의 분자 또는 복합체일 수 있다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, CARD를 매개하는 데 사용된 효소는 리포터 침착 후 (예를 들어, 화학적 및/또는 열 변성을 이용함으로써) 불활성화된다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 리포터 물질로 표지된 하나 이상의 2차 항체를 추가로 동원하는 하나 이상의 항-합텐 1차 항체를 동원하는 하나 이상의 합텐을 포함하고, 이때 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 하나 이상의 리포터 물질을 각각 포함하는 하나 이상의 제2 2차 항체를 추가로 동원하는 하나 이상의 항-제2 합텐 1차 항체를 추가로 동원하는 하나 이상의 제2 합텐으로 표지된 하나 이상의 제1 2차 항체를 추가로 동원하는 하나 이상의 항-제1 합텐 1차 항체를 동원하는 하나 이상의 제1 합텐을 포함하고, 이때 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다.
본원의 방법들 중 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 헤어핀 표지는 하나 이상의 리포터 물질을 각각 포함하는 하나 이상의 제2 2차 항체를 추가로 동원하는 하나 이상의 항-제2 합텐 1차 항체를 추가로 동원하는 하나 이상의 제2 합텐으로 표지된 하나 이상의 제1 2차 항체를 추가로 동원하는 하나 이상의 항-제1 합텐 1차 항체를 동원하는 하나 이상의 제1 합텐을 포함하고, 이때 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다. 일부 실시양태에서, 제2 합텐은 또한 CARD를 매개하는 효소(예를 들어, HRP 또는 AP)인 리포터 물질이다.
방법 10
일부 실시양태에서, 방법은 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브, 제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체 및 표적 분자를 제공하는 단계, 및 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 표적과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 헤어핀 단량체는 제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인, 제1 헤어핀 루프 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인, 및 제1 합텐 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 헤어핀 단량체는 제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인, 제2 헤어핀 루프 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인, 및 제2 합텐 분자를 포함한다(예를 들어, 도 34b 참조).
방법의 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 제1 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시키고 제2 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 헤어핀 단량체를 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제 둘 다에 결합시키는 단계, 제2 헤어핀 단량체를 제1 헤어핀 단량체에 결합시키는 단계, 및 하나 이상의 리포터 물질로 표지된 항-합텐 분자를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 CARD-기질을 제공하는 단계 및 CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호를 측정하는 단계를 추가로 포함한다(예를 들어, 도 34b 참조).
방법의 일부 실시양태에서, 항-합텐 분자는 항-합텐 항체이다. 방법의 일부 실시양태에서, 항-합텐 분자는 항-합텐 나노바디이다. 방법의 일부 실시양태에서, 항-합텐 분자는 항-합텐 항체와 항-합텐 나노바디의 조합이다.
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적은 핵산이다(예를 들어, 도 33b, 36a 및 36b 참조).
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 분자는 RNA이다. 일부 실시양태에서, RNA는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNA는 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNA는 단일 가닥 및 이중 가닥 둘 다이다.
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 분자는 DNA이다. 일부 실시양태에서, DNA는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, DNA는 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, DNA는 단일 가닥 및 이중 가닥 둘 다이다.
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 분자는 RNA 분자(예를 들어, 리보솜 RNA 및 mRNA)의 복합체이다. 일부 실시양태에서, RNA는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNA는 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNA는 단일 가닥 및 이중 가닥 둘 다이다.
방법 11
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 개시제를 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체 및 하나 이상의 표적 분자를 제공하는 단계, 및 하나 이상의 개시제를 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 하나 이상의 표적 분자와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 헤어핀 단량체는 제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인, 제1 헤어핀 루프 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인, 및 제1 합텐 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 헤어핀 단량체는 제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인, 제2 헤어핀 루프 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인, 및 제2 합텐 분자를 포함한다(예를 들어, 도 34a 참조). 임의로, 하나 이상의 헤어핀이 하나 이상의 합텐을 갖는 한, 각각의 헤어핀은 0개, 1개 또는 2개 이상의 합텐을 가질 수 있다.
방법의 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 하나 이상의 개시제를 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 하나 이상의 표적 분자에 결합시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 헤어핀 단량체를 하나 이상의 개시제에 결합시키는 단계, 제2 헤어핀 단량체를 제1 헤어핀 단량체에 결합시키는 단계, 및 하나 이상의 리포터 물질로 표지된 항-합텐 분자를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 CARD-기질을 제공하는 단계 및 CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호를 측정하는 단계를 추가로 포함한다(예를 들어, 도 34a 참조).
방법의 일부 실시양태에서, 항-합텐 분자는 항-합텐 항체이다. 방법의 일부 실시양태에서, 항-합텐 분자는 항-합텐 나노바디이다. 방법의 일부 실시양태에서, 항-합텐 분자는 항-합텐 항체 단편이다. 방법의 일부 실시양태에서, 항-합텐 분자는 항-합텐 항체와 항-합텐 나노바디의 조합이다.
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 분자는 단백질이다(예를 들어, 도 33c 및 33e 참조). 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 분자는 microRNA, 작은 RNA, 또는 비-코딩 RNA이다.
방법의 일부 실시양태에서, 항-합텐 분자는 항-합텐 항체이다. 방법의 일부 실시양태에서, 항-합텐 분자는 항-합텐 나노바디이다. 방법의 일부 실시양태에서, 항-합텐 분자는 항-합텐 항체와 항-합텐 나노바디의 조합이다.
일부 실시양태에서, 항-합텐 항체는 1차 항체이다. 일부 실시양태에서, 방법은 2차 항체를 추가로 포함하거나 사용한다. 일부 실시양태에서, 항-합텐 항체는 합텐에 결합하는 1차 항체를 포함하고, 방법은 1차 항체에 결합하는 2차 항체(하나 이상의 리포터 물질로 표지됨)를 추가로 포함한다.
방법 12
일부 실시양태에서, 방법은 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브, 제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체 및 표적 분자를 제공하는 단계, 및 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 표적 분자와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 헤어핀 단량체는 제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인, 제1 헤어핀 루프 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인, 및 기질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 헤어핀 단량체는 제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인, 제2 헤어핀 루프 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인, 및 기질을 포함한다.
방법의 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 제1 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시키고 제2 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 헤어핀 단량체를 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제 둘 다에 결합시키는 단계, 제2 헤어핀 단량체를 제1 헤어핀 단량체에 결합시키는 단계, 하나 이상의 리포터 물질로 표지된 기질 결합 영역을 제공하는 단계, 하나 이상의 CARD-기질을 제공하는 단계, 및 CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 기질 결합 영역은 기질에 결합하고, 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다.
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적은 핵산이다(예를 들어, 도 33b, 36a 및 36b 참조).
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 분자는 RNA이다. 일부 실시양태에서, RNA는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNA는 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNA는 단일 가닥 및 이중 가닥 둘 다이다.
방법 13
일부 실시양태에서, 방법은 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브, 제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브, 제1 헤어핀 단량체, 제2 헤어핀 단량체 및 표적 분자를 제공하는 단계, 및 제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 표적과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 헤어핀 단량체는 제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인, 제1 헤어핀 루프 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인, 및 제1 분획 기질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 헤어핀 단량체는 제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인, 제2 헤어핀 루프 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인, 및 제2 분획 기질을 포함한다.
방법의 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 제1 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시키고 제2 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 헤어핀 단량체를 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제 둘 다에 결합시키는 단계, 제2 헤어핀 단량체를 제1 헤어핀 단량체에 결합시키는 단계, 제1 분획 기질 및 제2 분획 기질을 포함하는 전체 기질을 수득하는 단계, 하나 이상의 리포터 물질로 표지된 기질 결합 영역을 제공하는 단계, 하나 이상의 CARD-기질을 제공하는 단계, 및 CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 기질 결합 영역은 전체 기질에 결합하고, 리포터 물질은 CARD를 매개하는 효소이다.
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적은 핵산이다(예를 들어, 도 33b, 36a 및 36b 참조).
방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 분자는 RNA이다. 일부 실시양태에서, RNA는 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNA는 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, RNA는 단일 가닥 및 이중 가닥 둘 다이다.
실시예
하기 실시예는 비제한적이고 당분야의 기술 범위 내의 다른 변이체도 고려된다.
실시예 1 - 최적화되지 않은 프로브 세트를 사용하여 전체 표본고정 닭 배아에서 2개의 표적 mRNA를 영상화하기
도 6은 최적화되지 않은 프로브 세트를 사용하여 전체 표본고정 닭 배아에서 2개의 표적 mRNA를 영상화하는 것을 입증한다.
표준 프로브(개시제-표지된 프로브로서도 지칭됨)를 사용하는 경우(도식 A), 비-특이적 프로브 결합은 증폭된 배경으로 이어져, 낮은 신호 대 배경을 생성한다. 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용하는 경우(도식 E), 프로토콜의 두 단계 동안 자동 배경 억제는 비-특이적 프로브 결합이 증폭된 배경으로 이어지지 않아, 최적화되지 않은 분획 개시제 프로브 세트를 사용한 경우조차도 높은 신호 대 배경을 생성하도록 보장한다. 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브의 자동 배경 억제 특성(도식 E)은 새로운 표적 mRNA의 발현 패턴을 맵핑할 때 매우 유리하므로, 지루한 분획 개시제 프로브 세트 최적화(즉, 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 것으로 관찰된 불량 프로브의 제거)를 요구하지 않으면서 고품질 결과의 신속한 생성을 허용한다.
활성 배경 억제의 이점은 표준 프로브(개시제-표지된 프로브로서도 지칭됨)(도식 A) 또는 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브(도식 E)를 가진 최적화되지 않은 프로브 세트를 사용하여 전체 표본고정 닭 배아에서 표적 mRNA를 영상화하는 것을 도시하는 도 6에 예시되어 있다. 표적 mRNA Dmbx1: 단계 HH 7 배아; 표적 mRNA Sox8: 단계 HH10 배아. 표준 프로브(개시제-표지된 프로브로서도 지칭됨)를 사용하는 경우(도식 A), 최적화되지 않은 분획 개시제 프로브 세트를 사용하였을 때 증폭된 배경의 생성을 유발하는 비-특이적 프로브 결합으로 인해 낮은 신호 대 배경이 관찰되었다. 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용하는 경우(도식 E), 최적화되지 않은 분획 개시제 프로브 세트를 사용하더라도 높은 신호 대 배경이 달성되고; 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 프로브는 HCR 개시제의 두 절반을 공국소화하지 않으므로, HCR 신호 증폭을 유발하지 않음으로써, 증폭된 배경의 생성을 피하였다. 도식 A는 표적 mRNA의 상이한 하위서열에 대한 표적 결합 부위를 각각 함유하는 12개의 구조화되지 않은 프로브를 함유하는 프로브 세트를 사용한다. 도식 E는 12개의 프로브 쌍을 함유하는 분획 개시제 프로브 세트를 사용하고; 이 12개의 쌍은 도식 A에 대한 12개의 프로브와 동일한 표적 하위서열을 겨냥한다. GEISHA로부터의 기준 영상(Darnell, D.K., Kaur, S., Stanislaw, S., Davey, S., Konieczka, J.H., Yatskievych, T.A., and Antin, P.B. (2007). GEISHA: An In situ hybridization gene expression resource for the chicken embryo. Cytogenet. Genome Res. 117:30-35).
실시예 2 - 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용한 HCR의 협력적 개시
분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용한 HCR의 협력적 개시(도식 E)(도 7). (a) 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브의 표적 매개 공국소화(도식 E). 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 P1 및 P2는 HCR 개시제 I1의 절반을 각각 보유한다. P1 및 P2와 표적 mRNA의 선택적 결합은 HCR 개시제 I1의 두 절반을 공국소화하여, HCR 증폭 캐스케이드의 협력적 개시를 허용한다.
(b) 분할 개시제 프로브 P1 및 P2를 사용한 HCR의 협력적 개시의 시험관내 검증(도식 E). 반응 조건: 각각 0.5 μM의 헤어핀 H1 및 H2(레인 1 내지 7); 각각 5 nM의 올리고 I1, P1, P2 및/또는 표적(겔에 표시된 레인); 5 SSCT 완충제; 실온에서 하룻밤 반응. Alexa647 형광단으로 표지된 헤어핀 H1 및 H2. SYBR Gold로 사전 염색된 dsDNA 1kb 래더. 레인 1: 준안정한 헤어핀 H1 및 H2는 HCR 개시제 I1의 부재 하에 그들의 동역학적으로 포획된 상태로부터의 최소 누출을 나타낸다. 레인 2: HCR 개시제 I1(올리고로서의 I1)의 존재 하에 증폭 중합체로의 HCR 헤어핀 단량체 H1 및 H2의 완전한 전환. 레인 3: HCR의 협력적 개시를 입증하는, 표적 및 두 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 P1 및 P2의 존재 하에 중합체로의 헤어핀 H1 및 H2의 강한 전환. 레인 4 내지 6: 활성 배경 억제를 입증하는, 프로브 P1, 프로브 P2, 또는 프로브 P1과 P2 둘 다의 존재 하에 중합체로의 HCR 헤어핀 단량체 H1 및 H2의 최소 전환. 레인 7: 표적 단독의 존재 하에 중합체로의 HCR 헤어핀 단량체 H1 및 H2의 최소 전환.
(c) 패널 c에서 중합체 밴드의 정량. 멀티 게이지 소프트웨어(Fuji Photo Film)를 이용하여 레인 1 내지 7에 대한 중합체 밴드를 둘러싼 Alexa647 강도 프로파일을 계산하였다. 0을 중심으로 피크 값을 가진 각각의 강도 프로파일은 ±3 mm의 겔 이동 거리에 대해 표시된다. 신호 및 배경을 자동 검출하는 멀티 게이지를 이용하여 정량 백분율을 계산하였고; 계산된 값을 레인 2에 대한 측정값으로 정규화하였다.
도 7b의 겔 연구는 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용한 HCR의 협력적 개시를 입증하였다(도식 E). 레인 1은 헤어핀 H1 및 H2가 HCR 개시제 I1의 부재 하에 그들의 동역학적으로 포획된 상태로부터 최소한으로 누출됨을 보여준다. 양성 대조군으로서, 레인 2는 전체 HCR 개시제 I1(이때 I1은 단일 올리고임)의 존재 하에 중합체로의 준안정한 HCR 헤어핀 단량체 H1 및 H2의 전환을 입증한다.
분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용하였을 때, 표적이 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브 P1 및 P2와 함께 존재하는 경우 중합체로의 준안정한 HCR 헤어핀 단량체 H1 및 H2의 강한 전환이 관찰되었다. 그러나, P1 또는 P2가 단독으로 존재하는 경우(레인 4 및 5), 또는 P1 및 P2가 함께 존재하지만 표적이 없는 경우(레인 6) 중합체로의 최소 전환이 관찰되었다.
이 결과들은 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브의 활성 배경 억제 특성을 입증하였다(도식 E): 표적에의 선택적 하이브리드화를 통해 공국소화되지 않은 프로브는 HCR 증폭을 거의 유발하지 않는다. 표적의 부재 하에 P1과 P2가 둘 다 용액에 존재할 때조차도 HCR을 유발하지 않는다는 사실(레인 6)은 분획 개시제 프로브가 심지어 세척의 부재 하에도 자동 배경 억제를 제공함을 시사한다.
실시예 3 - 표준 프로브와 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브의 성능 비교
도 9는 전체 표본고정 닭 배아에서 mRNA 표적의 영상화를 위해 프로브 세트의 크기를 증가시킬 때 표준 프로브(개시제-표지된 프로브로서도 지칭됨)(도식 A)와 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브(도식 E)의 성능을 비교한다. 표준 프로브를 사용하는 시험의 경우, 5개 프로브의 최적화된 프로브 세트를 사용한 다음, 이 프로브들을 추가 최적화되지 않은 프로브로 보강하여, 10개 프로브 및 20개 프로브의 프로브 세트를 형성하였다. 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용하는 시험의 경우, 5개, 10개 및 20개 프로브 쌍을 가진 프로브 세트를 사용하였고, 이때 각각의 프로브 쌍은 상응하는 표준 프로브와 거의 동일한 결합 부위를 표적화한다. 표준 프로브를 사용하는 경우, 프로브 세트 크기의 증가는 샘플 내에서 비-특이적으로 결합하는 추가 프로브의 일부 서브세트의 결과로서 배경의 실질적인 증가(패널 a) 및 신호 대 배경의 상응하는 감소를 야기하였다.
이 데이터는 활성 배경 억제를 제공하지 않는 표준 프로브(개시제-표지된 프로브로서도 지칭됨)(도식 A)를 사용한 프로브 세트 최적화의 중요성을 보여준다: 프로브 세트에 임의의 불량 프로브가 있는 경우, 이 불량 프로브는 증폭된 배경을 생성함으로써 성능을 저하시킬 것이다. 대조적으로, 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용하는 경우(도식 E), 프로브 쌍의 수가 5에서 10 내지 20으로 증가할 때, 배경은 거의 일정하게 유지되고(패널 a) 신호 대 배경 비는 단조롭게 증가한다(패널 b).
이 데이터는 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용한 자동 배경 억제의 상당한 이점을 보여준다: 분획 개시제 프로브 세트에 불량 프로브가 있더라도, 이 불량 프로브는 증폭된 배경을 생성하지 않으므로, 프로브 세트 최적화를 수행하지 않으면서 프로브의 수를 증가시킴으로써 신호 대 배경을 간단히 증가시킬 수 있다. 20개의 프로브(표준 프로브) 또는 20개의 프로브 쌍(분획 개시제(분할 개시제) 프로브)을 가진 프로브 세트를 사용한 대표적인 영상은 패널 c에 제시되어 있다. 이 영상에 대한 대표적인 픽셀 강도 분포는 패널 d에 표시되어 있다. 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용하는 경우, 배경 및 신호 + 배경에 대한 픽셀 강도 분포는 거의 중첩되지 않는다.
표준 프로브(개시제-표지된 프로브로서도 지칭됨)(도식 A) 및 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브(도식 E)를 사용하여 배경 및 신호 대 배경을 제시하는 도 9에 대한 약간 더 상세한 설명을 이하에 제공한다. (a) 5개, 10개 또는 20개의 프로브(표준 프로브)를 가진 프로브 세트와 5개, 10개 또는 20개의 프로브 쌍(분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브)을 가진 프로브 세트를 사용한 형광 배경. 최적화되지 않은 표준 프로브는 비-특이적 프로브 결합을 초래하여, 증폭된 배경의 생성을 유발하였다. 샘플에서 비-특이적으로 결합하는 최적화되지 않은 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브는 HCR 개시제의 두 절반을 공국소화하지 않았으므로, HCR 신호 증폭을 유발하지 않음으로써, 증폭된 배경의 생성을 피하였다. (b) 패널 a의 프로브 세트에 대한 신호 대 배경 비. 활성 배경 억제를 가진 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브는 신호 대 배경 측정에서 최적화되지 않은 표준 프로브를 능가하였다. (c) 고정된 전체 표본고정 닭 배아의 신경 능선의 공초점 현미경사진. 프로브 세트: 도식 A의 표준 프로브를 위한 20개의 프로브, 도식 E의 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 위한 20개의 프로브 쌍. (d) 신호 + 배경(패널 c에서 실선 경계 내의 픽셀) 및 배경(패널 c에서 점선 경계 내의 픽셀)에 대한 픽셀 강도 히스토그램. 각각의 영상에 대해, 실선 및 점선 경계 내의 총 픽셀 수는 동일하다. 고정된 배아: 단계 HH10. 표적: Sox10.
실시예 4 - 최적화되지 않은 분획 개시제 프로브를 사용하여 높은 신호 대 배경으로 전체 표본고정 닭 배아에서 4개의 표적 mRNA를 영상화하기
도 10은 최적화되지 않은 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용하여 높은 신호 대 배경으로 전체 표본고정 닭 배아에서 4개의 표적 mRNA를 영상화하는 것을 입증한다(도식 E).
분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브의 자동 배경 억제 특성으로 인해, 임의의 프로브 세트 최적화를 수행하지 않았을 때 4개의 표적 mRNA에 대한 신호 대 배경은 약 25 내지 60이다.
도 10. 프로브 세트 최적화 없이 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용하여 고정된 전체 표본고정 닭 배아에서 높은 신호 대 배경으로 mRNA 발현을 다중화 영상화하기. (a) 4개의 표적 mRNA에 대한 발현 개략도: FoxD3, EphA4, Sox10, Dmbx1. (b) 머리와 신경 능선의 4-채널 공초점 현미경사진. (c) 패널 b의 도시된 영역의 확대사진. (d) 신호 대 배경이 측정된 패널 c로부터의 4개의 개별 채널. 프로브 세트: 표적당 최적화되지 않은 12쌍 내지 20쌍의 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브. 증폭제: 스펙트럼에 의해 구별되는 형광단을 보유하는 4개의 오르토고날 HCR 증폭제(표적당 하나의 HCR 증폭제). 고정된 배아: 단계 HH10.
실시예 5 - 아세포 해상도로 mRNA 발현을 정량적으로 분석하기 위해 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용하는 제자리 HCR
도 11은 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용한 제자리 HCR(도식 E)이 전체 표본고정 닭 배아 내에서 아세포 해상도로 mRNA 발현을 정량적으로 분석할 수 있게 함을 입증한다.
스펙트럼에 의해 구별되는 상이한 HCR 증폭제를 각각 유발하는 2개의 분획 개시제 프로브 세트를 사용하여 각각의 표적 mRNA를 중복 검출하였다. 정규화된 복셀 강도의 2-채널 산점도를 작도하였을 때 약 0의 절편을 가진 긴밀한 선형 관계가 나타났는데, 이것은 HCR 신호가 영상화 복셀당 표적 mRNA의 수에 비례하여 커짐을 시사한다. 분포가 선형이 되고 절편이 사라짐에 따라 정확도가 개선되고; 산란이 더 조밀해짐에 따라 정밀도가 개선된다. 2X2 ㎛ 복셀은 아세포 해상도를 제공하였다.
이 결과들은 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브를 사용한 제자리 HCR이 프로브 세트 최적화를 필요로 하지 않으면서 해부학적 환경에서 아세포 해상도로 mRNA 발현을 정확하고 정밀하게 상대적으로 정량할 수 있게 함을 입증한다.
도 11. 고정된 전체 표본고정 닭 배아에서 아세포 해상도로 mRNA 발현을 정량적으로 영상화하기. (a) 표적 mRNA의 2-채널 중복 검출. 표적: Dmbx1 및 EphA4. 공초점 현미경관찰: 0.2X0.2 ㎛ 픽셀. 프로브 세트: 각각의 표적에 대해 채널당 20쌍의 분획 개시제(분할 개시제로서도 지칭됨) 프로브. 증폭제: 각각의 표적에 대해 스펙트럼에 의해 구별되는 형광단을 보유하는 2개의 오르토고날 HCR 증폭제. 고정된 배아: 단계 HH10. (b) 패널 b의 선택된 영역에서 2X2 ㎛ 복셀에 대해 고도의 상관관계를 가진 정규화된 신호(피어슨 상관 계수, r).
실시예 6 - HCR 헤어핀의 중첩 영역에 상보적인 분획 개시제 프로브와 HCR 헤어핀의 비-중첩 영역에 상보적인 분획 개시제 프로브의 성능 비교
도 24의 겔 연구는 HCR 헤어핀 H1의 중첩 영역에 상보적인 분획 개시제 프로브(예를 들어, 도 21)와 HCR 헤어핀 H1의 비-중첩 영역에 상보적인 분획 개시제 프로브(예를 들어, 도 7a)의 성능을 비교한다.
반응 조건: 각각 0.6 μM의 헤어핀 H1 및 H2(레인 1 내지 11); 각각 6 nM의 올리고 I1, P1, P2 및/또는 표적(겔에 표시된 바와 같은 레인); 5 SSCT 완충제; 실온에서 하룻밤 반응. Alexa647 형광단으로 표지된 헤어핀 H1 및 H2. 레인 1: 준안정한 헤어핀 H1 및 H2는 HCR 개시제 I1의 부재 하에 그들의 동역학적으로 포획된 상태로부터 최소 누출을 나타낸다. 레인 2: HCR 개시제 I1의 존재 하에 증폭 중합체로의 HCR 헤어핀 단량체 H1 및 H2의 전환. 레인 3: 표적 단독의 존재 하에 중합체로의 HCR 헤어핀 단량체 H1 및 H2의 최소 전환. 레인 4 내지 6 및 8 내지 10: HCR 헤어핀 H1의 비-중첩 영역(레인 4 내지 6) 또는 중첩 영역(레인 8 내지 10)에 상보적인 분획 개시제 프로브를 사용한 활성 배경 억제를 입증하는, 프로브 P1, 프로브 P2, 또는 프로브 P1 및 P2 둘 다의 존재 하에 중합체로의 HCR 헤어핀 단량체 H1 및 H2의 최소 전환. 레인 7 및 11: 표적, 및 HCR 헤어핀 H1의 비-중첩(레인 7) 또는 중첩(레인 11) 영역에 상보적인 프로브 P1 및 P2 둘 다의 존재 하에 중합체로의 헤어핀 H1 및 H2의 전환.
중합체 밴드의 정량. MATLAB를 이용하여 레인 1 내지 11에 대한 중합체 밴드를 둘러싼 Alexa647 강도 프로파일을 계산하였다. 0을 중심으로 하는 피크 값을 가진 각각의 강도 프로파일이 ±3.3 mm의 겔 이동 거리에 대해 표시된다. 신호 및 배경을 자동 검출하는 MATLAB를 이용하여 정량 백분율을 계산하였고; 계산된 값을 레인 2에 대한 측정값으로 정규화하였다.
이 결과들은 표적, 및 헤어핀 H1의 중첩 영역에 상보적인 프로브 P1 및 P2의 존재 하에 중합체로의 헤어핀 H1 및 H2의 전환(레인 11; 중합체로의 85.6% 전환)이 HCR 헤어핀 H1의 비-중첩 영역에 상보적인 프로브 P1 및 P2의 존재 하에 중합체로의 헤어핀 H1 및 H2의 전환(레인 7; 중합체로의 54.7% 전환)보다 더 강함을 입증하였다. 두 프로브 유형에 대한 분획 개시제 프로브의 활성 배경 억제 특성은 필적한 만한 상태로 유지된다.
실시예 7 - 보조 가닥을 사용하여 HCR 증폭 중합체로부터 HCR 헤어핀을 탈하이브리드화하기
도 25a는 보조 가닥을 사용하여 HCR 증폭 중합체로부터 HCR 헤어핀을 탈하이브리드화하는 것의 시험관내 검증을 도시한다(예를 들어, 도 23f 참조). 반응 조건: 각각 0.6 μM의 헤어핀 H1 및 H2(레인 1 내지 5); 0.6 μM(레인 2), 60 nM(레인 3) 및 6 nM(레인 4 및 5)의 HCR 개시제 I1; 6 μM의 보조 가닥(레인 5); 5 SSCT 완충제; 실온에서 하룻밤 HCR 증폭; 실온에서 1시간 보조 가닥 인큐베이션. Alexa647 형광단으로 표지된 헤어핀 H1 및 H2. 레인 1: 준안정한 헤어핀 H1 및 H2는 HCR 개시제 I1의 부재 하에 최소 누출을 나타낸다. 레인 2: 등몰 HCR 개시제 I1 농도에서 짧은 HCR 증폭 중합체의 형성. 레인 3 및 4: 더 낮은 HCR 개시제 농도에서 더 긴 HCR 증폭 중합체의 형성. 레인 5: 보조 가닥을 사용하여 HCR 증폭 중합체로부터 헤어핀을 탈하이브리드화하여 H1, H2 및 보조 가닥으로 구성된 중합체 단편을 생성한다.
HCR 증폭 중합체로부터 HCR 헤어핀을 탈하이브리드화하는 데 사용된 서열의 일부 실시양태(예를 들어, 도 25a)는 하기 표 2에 제시되어 있다. 이 서열은 본원의 방법의 실시양태들 중 임의의 실시양태에 사용될 수 있다.
도 25b는 반복된 리포터 검출을 이용하여 슬라이드 상의 FFPE 배양된 인간 세포(HEK293) 펠렛에서 3개의 표적 mRNA를 영상화하는 것을 입증하였다(도 23f 및 26g 참조). 표적 mRNA: GAPDH, ACTB, U6. 3개의 표적들 모두에 대한 프로브 세트를 검출 단계에서 동시에 도입하였다. 증폭의 첫 번째 라운드에서, 스펙트럼에 의해 구별되는 형광단으로 표지된 증폭제를 사용하여 GAPDH 및 ACTB만을 검출하였다(GAPDH의 경우 리포터 1(Alexa647)로 표지된 증폭제 1, ACTB의 경우 리포터 2(Alexa546)로 표지된 증폭제 2). GAPDH에 대해 사용된 증폭제 1만이 보조 가닥 핵형성을 위한 토홀드를 함유하였다. 영상 획득 후, 샘플을 실온에서 1시간 동안 증폭제 1 보조 가닥과 함께 인큐베이션하여, GAPDH mRNA에 연결된 증폭 중합체로부터 Alexa647-표지된 헤어핀을 탈하이브리드화하였고; 생성된 중합체 단편을 샘플로부터 세척하였다. 제2 증폭 라운드에서, GAPDH와 동일한 리포터로 표지된 상이한 HCR 증폭제(리포터 1(Alexa647)로 표지된 증폭제 3)를 U6 신호 증폭에 사용하였다.
영상은 GAPDH에 대한 세포질 리포터 1(Alexa647) 신호가 증폭제 1 보조 가닥의 첨가에 이은 세척에 의해 완전히 제거되었고 제2 영상화 라운드에서 U6의 핵 리포터 1(Alexa647) 신호로 대체되었음을 입증하였다. ACTB 신호 강도(리포터 2(Alexa546)로 표지된 증폭제 2)는 영상화 라운드 사이에 필적할 만하게 유지된다.
실시예 8 - 분획 개시제 HCR 억제 및 전환을 향상시키기 위한 협력적 프로브 연접부의 최적화
도 28은 분획 개시제 HCR 억제(OFF 상태) 및 전환(ON 상태)을 향상시키기 위한 협력적 프로브 연접부를 입증한다. 도 28a에서, 분획 개시제 프로브 p1 및 p2는 연접부를 에너지 면에서 유리한 입체구조로 이완시킬 수 있도록 HCR 헤어핀 h1의 중첩 영역에 상보적이다(각각 h1의 도메인 u 및 v에 상보적인 도메인 u* 및 v*를 함유함). 도 28b에서, 중첩 정도가 다양한 프로브(u* = 0개, 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드, v* = 0개, 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드)를 사용하여 아가로스 겔로 누출(OFF 상태)을 어세이한다. 개별 프로브 p1 또는 p2로 HCR 개시를 시험하고(도 28b 왼쪽) 겔에서 생성된 중합 밴드를 정량함으로써(도 28b 오른쪽) OFF 상태를 특징규명한다. 도 28c에서, 중첩 정도가 다양한 프로브(u* = 0개, 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드, v* = 0개, 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드)를 사용하여 아가로스 겔로 전환(ON 상태)을 어세이한다. 프로브 p1 또는 p2와 표적으로 HCR 개시를 시험하고(도 28c 왼쪽) 겔에서 생성된 중합 밴드를 정량함으로써(도 28c 오른쪽) ON 상태를 특징규명한다. 도 28에 대한 반응 조건은 OFF 상태에 대해 각각 500 nM의 헤어핀 h1 및 h2, 및 ON 상태에 대해 각각 60 nM의 헤어핀 h1 및 h2이었고(모든 레인); 0.01X 헤어핀 농도에서 개시제 i1, 프로브 p1 및 p2, 및/또는 DNA 표적.
상이한 연접부 디자인의 시험은 깨끗한 OFF 상태(분획 개시제 HCR 억제 약 0.5%의 표준 개시제 HCR 억제; 도 28b의 상자) 및 강한 ON 상태(분획 개시제 HCR 전환 약 99%의 표준 개시제 HCR 전환; 도 28c의 상자)를 가진 프로브 p1 및 p2를 제공한다. 이 결과들은 한 쌍의 분획 개시제 프로브(v3.0)에 의한 표준 프로브(v2.0)의 대체가 증폭된 신호를 유의미하게 감소시키지 않으면서(도 28c의 레인 2 대 레인 6) 증폭된 배경을 현저히 감소시키도록(도 28b의 레인 2 대 레인 4 및 9) 조작될 수 있음을 시사한다. 이 프로브 연접부의 경우, 도메인 치수는 2개의 뉴클레오타이드에 의해 중첩되는 HCR 헤어핀 h1의 결합 부위에 하이브리드화하는, 프로브 유닛 내의 분획 개시제에 상응하는, u* = 0개 뉴클레오타이드 및 v* = 2개 뉴클레오타이드이다.
실시예 9 - 단백질 표적의 다중화 면역조직화학(IHC) HCR 영상화
도 29 및 도 30은 포르말린에 의해 고정되고 파라핀에 포매된(FFPE) 마우스 뇌 박편에서 단백질 표적의 다중화 면역조직화학(IHC) HCR 영상화를 입증한다.
도 29는 개시제-표지된 1차 항체 프로브를 사용한다. 도 29a는 단백질 검출 단계(개시제-표지된 1차 항체 프로브는 단백질 표적에 결합함; 세척) 및 증폭 단계(개시제는 연결된 형광 증폭 중합체로의 형광단-표지된 HCR 헤어핀의 자가조립을 유발함; 세척)로 구성된 2-단계 IHC 프로토콜을 표시한다. 도 29b는 표적 단백질의 수와 무관하게 동일한 2-단계 프로토콜이 사용되는 다중화 타임라인을 표시한다. 도 29c는 FFPE 마우스 뇌 박편(4개의 표적 단백질: TH, GFAP, MBP, MAP2)의 4-채널 에피형광 현미경사진을 표시하고, 도 29d는 도 29d의 도시된 영역에 대한 확대사진을 표시한다. 도 29의 접근법은 개시제-표지된 1차 항체를 사용하여 높은 수준의 다중화를 달성할 수 있다는 장점을 갖고, 이때 상이한 단백질 표적에 대한 항체 프로브는 동시에 샘플에서 독립적으로 작동하는 오르토고날 HCR 개시제를 보유한다. 1차 항체가 상이한 유기체들에서 생성될 필요가 없으므로, 상이한 표적들에 대한 1차 항체의 큰 라이브러리를 확립하는 데 있어서 유연성을 제공한다.
도 30은 표지되지 않은 1차 항체 프로브 및 개시제-표지된 2차 항체 프로브를 사용한다. 도 30a는 단백질 검출 단계(표지되지 않은 1차 항체 프로브는 단백질 표적에 결합함; 세척; 개시제-표지된 2차 프로브는 1차 항체 프로브에 결합함; 세척) 및 증폭 단계(개시제는 연결된 형광 증폭 중합체로의 형광단-표지된 HCR 헤어핀의 자가조립을 유발함; 세척)로 구성된 2-단계 IHC 프로토콜을 표시한다. 도 30b는 표적 단백질의 수와 무관하게 동일한 2-단계 프로토콜이 사용되는 다중화 타임라인을 표시한다. FFPE 마우스 뇌 박편의 4중 IHC. 도 30c는 FFPE 마우스 뇌 박편의 4-채널 에피형광 현미경사진(4개의 표적 단백질: TH, GFAP, PVALB, MBP)을 표시하고, 도 30d는 도 30c의 도시된 영역의 확대사진을 표시한다.
도 30의 접근법은 표지되지 않은 1차 항체를 변형 없이 사용할 수 있고, 이것이 개시제-표지된 2차 항체의 검증된 라이브러리를 사용할 수 있게 한다는 장점을 갖고, 이때 상이한 2차 항체들은 동시에 샘플에서 독립적으로 작동하는 오르토고날 HCR 개시제를 보유한다. 이 접근법을 이용하는 경우, 하나의 유형의 개시제-표지된 2차 항체만이 각각의 1차 항체를 검출하도록 상이한 유기체에서 1차 항체를 생성해야 한다.
실시예 10 - HCR IHC를 통해 아세포 해상도로 단백질 발현을 정량적으로 분석하기
도 41은 HCR IHC가 해부학적 환경에서 아세포 해상도로 단백질 발현을 정량적으로 분석할 수 있게 함을 입증한다. 스펙트럼에 의해 구별되는 상이한 HCR 증폭제를 각각 유발하는 2개의 개시제-표지된 1차 항체 프로브를 사용하여 각각의 표적 단백질을 중복 검출하였다. 정규화된 복셀 강도의 2-채널 산점도를 작도하였을 때 약 0의 절편을 가진 긴밀한 선형 관계가 나타났는데, 이것은 HCR 신호가 영상화 복셀당 표적 단백질의 수에 비례하여 커짐을 시사한다.
도 41a는 표적 단백질의 2-채널 중복 검출을 예시한다. 스펙트럼에 의해 구별되는 오르토고날 HCR 증폭제(Ch1: Alexa546, Ch2: Alexa647)를 각각 개시하는, 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 개시제-표지된 1차 항체 프로브를 사용하여 표적 단백질을 검출한다. 도 41b는 FFPE 마우스 뇌 박편의 에피형광 현미경사진을 표시한다. 도 41c는 도 41b의 상자 영역에서 아세포 2X2 ㎛ 복셀에 대해 고도의 상관관계를 가진 정규화된 신호(피어슨 상관 계수, r)를 표시한다. 이 산점도에서, 정확도는 절편이 0인 선형성에 상응하고 정밀도는 선 주변의 분포에 상응한다. 2X2 ㎛ 복셀은 아세포 해상도를 제공하였다.
이 결과들은 HCR IHC가 해부학적 환경에서 아세포 해상도로 단백질 발현을 정확하고 정밀하게 상대적으로 정량할 수 있게 함을 입증한다.
실시예 11 - 동시에 모든 mRNA 및 단백질 표적에 대한 HCR 신호 증폭을 이용한 다중화 HCR RNA-ISH 및 HCR IHC
도 31 및 도 32는 모든 mRNA 및 단백질 표적에 대해 동시에 수행된 HCR 신호 증폭을 이용한 다중화 HCR RNA-ISH 및 HCR IHC를 입증한다.
도 31은 개시제-표지된 1차 항체 프로브 및 분획 개시제 DNA 프로브를 사용한 다중화 HCR IHC + RNA-ISH를 입증한다. 도 31a는 단백질 검출 단계(개시제-표지된 1차 항체 프로브는 단백질 표적에 결합함, 세척), RNA 검출 단계(분획 개시제 DNA 프로브는 RNA 표적에 결합함, 세척) 및 증폭 단계(개시제는 연결된 형광 증폭 중합체로의 형광단-표지된 HCR 헤어핀의 자가조립을 유발함; 세척)로 구성된 3-단계 IHC + IHS 프로토콜을 표시한다. 표적 단백질 및 표적 RNA의 수와 무관하게 동일한 3-단계 프로토콜이 이용된다. 도 31b는 FFPE 마우스 뇌 박편의 4-채널 에피형광 현미경사진(2개의 표적 단백질(TH, MBP) 및 2개의 표적 mRNA(Prkca, Slc17a7))을 표시하고, 도 31c는 도 31b의 도시된 영역의 확대사진을 표시한다.
도 32는 표지되지 않은 1차 항체 프로브, 개시제-표지된 2차 항체 프로브, 및 분획 개시제 DNA 프로브를 사용한 다중화 HCR IHC + RNA-ISH를 입증한다. 도 32a는 단백질 검출 단계(표지되지 않은 1차 항체 프로브는 단백질 표적에 결합함; 세척; 개시제-표지된 2차 항체 프로브는 1차 항체 프로브에 결합함; 세척), RNA 검출 단계(분획 개시제 DNA 프로브는 RNA 표적에 결합함; 세척) 및 증폭 단계(개시제는 연결된 형광 증폭 중합체로의 형광단-표지된 HCR 헤어핀의 자가조립을 유발함; 세척)로 구성된 3-단계 IHC + ISH 프로토콜을 표시한다. 표적 단백질 및 표적 RNA의 수와 무관하게 동일한 3-단계 프로토콜이 이용된다. 도 32b는 FFPE 마우스 뇌 박편의 4-채널 에피형광 현미경사진(2개의 표적 단백질(TH, MBP) 및 2개의 표적 mRNA(Prkca, Slc17a7))을 표시하고, 도 32c는 도 32b의 도시된 영역의 확대사진을 표시한다.
실시예 12 - HCR 매개 CARD RNA-ISH
도 37은 FFPE 마우스 간 및 신장 박편에서 HCR 매개 CARD RNA-ISH를 입증한다. 도 37a는 2개의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 다수의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 사용하여 RNA 표적을 검출하는 단계, 합텐으로서 형광단 Alexa488로 표지된 헤어핀 h1 및 h2를 사용하는 HCR 신호 증폭 단계, 중합체 HRP 효소로 표지된 항-Alexa488 항체를 사용하여 합텐에 결합시키는 단계, 및 HRP에 의해 HCR 증폭 중합체의 근처에서 리포터로서 촉매작용적으로 침착된 CARD-기질 DAB를 제공하는 단계를 포함하는, HCR 매개 CARD RNA-ISH 프로토콜을 요약하는 개략도를 표시한다. 도 37b(왼쪽 패널)는 FFPE 마우스 신장 및 간 박편에서 GAPDH mRNA 발현의 명시야 현미경관찰을 도시하고; 프로브의 부재 하에, 염색이 부재한다(오른쪽 패널).
실시예 13 - 개시제-표지된 프로브를 사용한 다중화 microRNA 및 mRNA RNA-ISH
도 43은 개시제-표지된 프로브를 사용하여 다중화 microRNA 및 mRNA RNA-ISH를 입증한다. 2'OMe-RNA 표적 결합 도메인 및 DNA 개시제를 포함하는 개시제-표지된 프로브를 사용하여 microRNA 표적을 검출하였다(도 43a). DNA 표적 결합 도메인 및 2개의 DNA 개시제(표적 결합 도메인의 각각의 말단에서 하나씩; 도 43a)를 포함하는 개시제-표지된 프로브를 사용하여 mRNA 표적을 검출하였다. 두 클래스의 표적 RNA(microRNA 및 mRNA)에 대해 HCR 신호 증폭을 동시에 수행하여, 전체 표본고정 제브라피쉬 배아에서 높은 신호 대 배경을 달성하였다. 도 43b는 3개의 표적 microRNA(miR-9, miR-96, miR-206) 및 1개의 표적 mRNA(hbae3)에 대한 발현 아틀라스를 도시한다. 수정된 지 72시간 후에 배아를 고정하고 공초점 현미경관찰로 영상화하였다(도 43c).
실시예 14 - 차폐된 개시제-표지된 항체 프로브를 사용한 배경 감소
도 45는 전체 표본고정 제브라피쉬 배아에서 HCR IHC에 대한 차폐가 없는 개시제-표지된 항체 프로브에 비해 차폐된 개시제-표지된 항체 프로브의 사용에 의한 배경 감소를 입증한다. 어느 경우에서든, 표적 단백질 Desmin은 개시제-표지된 2차 항체(도 45a), 또는 개시제가 개시제에의 염기 페어링에 의해 부분적으로 차폐되는 차폐된 개시제-표지된 2차 항체(도 45b)에 결합되는 표지되지 않은 1차 항체에 의해 검출된다. 개시제-표지된 프로브에 비해 차폐된 개시제-표지된 프로브를 사용하는 경우 감소된 배경이 관찰되는데, 이것은 프로브의 개시제의 차폐를 이용하여 비-특이적 결합을 감소시킬 수 있음을 예증한다. 수정된 지 27시간 후에 배아를 고정하고 공초점 현미경관찰을 통해 영상화하였다.
실시예 15 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 A)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26a의 과정을 요약한다. 단계 A1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 A2: 샘플을 고정하는 단계. 단계 A3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 A4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 A5: 샘플을 세척하는 단계. 단계 A6: 리포터로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조). 단계 A7: 샘플을 세척하는 단계. 단계 A8: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
실시예 16 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 B)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26b의 과정을 요약한다. 단계 B1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 B2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 B3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 B4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 B5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 B6: N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 HCR 증폭제 참조). 단계 B7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 B8: N개의 상이한 리포터로부터 N개의 신호를 검출하는 단계.
실시예 17 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 C)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26c의 과정을 요약한다. 단계 C1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 C2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 C3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 C4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 C5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 C6: 제공된 프로브에 상응하는 HCR 증폭제(리포터로 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 HCR 증폭제 참조). 단계 C7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 C8: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계. 단계 C9: 샘플로부터 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조). 단계 C10: 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 C4 내지 C9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
실시예 18 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 D)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26c의 과정을 요약한다. 단계 D1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 D2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 D3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 D4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 M개의 프로브 세트(M ≤ N인 경우; M개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 D5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 D6: M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 HCR 증폭제 참조). 단계 D7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 D8: M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계. 단계 D10 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조). 단계 D11: 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 4 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
실시예 19 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 E)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26e의 과정을 요약한다. 단계 E1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 E2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 E3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 E4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 E5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 E6: 프로브 세트들 중 하나에 상응하는 HCR 증폭제(리포터로 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조). 단계 E7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 E8: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계. 단계 E9: 샘플로부터 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조). 단계 E10: 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 6 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
실시예 20 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 F)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26f의 과정을 요약한다. 단계 F1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 F2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 F3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 F4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 F5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 F6: N개의 프로브 세트들 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 증폭제 참조). 단계 F7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 F8: M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계. 단계 F9: 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조). 단계 F10: 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 6 내지 9 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
실시예 21 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 F)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26g의 과정을 요약한다. 단계 G1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 G2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 G3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 G4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 G5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 G6: 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 리포터-표지된 HCR 증폭제 참조). 단계 G7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 G8: 하나 이상의 리포터로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 단계. 단계 G9: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계. 단계 G10: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계. 단계 G11: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계. 단계 G12: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조). 단계 G13: 임의적으로 단계 2 내지 12 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계.
실시예 22 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 H)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26h의 과정을 요약한다. 단계 H1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 H2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 H3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 H4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 H5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 H6: 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조). 단계 H7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 H8: 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 H9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 H10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
실시예 23 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 I)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26i의 과정을 요약한다. 단계 I1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 I2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 I3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 I4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 I5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 I6: N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조). 단계 I7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 I8: N개의 상이한 기질에 상응하는 N개의 표지 프로브(상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 I9: N개의 상이한 리포터로부터 N개의 신호를 검출하는 단계.
실시예 24 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 J)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26j의 과정을 요약한다. 단계 J1: N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 J2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 J3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 J4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 J5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 J6: N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조). 단계 J7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 J8: N개의 상이한 기질 중 M개의 상이한 기질에 상응하는 M개의 표지 프로브(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 J9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 J10: M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계. 단계 J11: 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조). 단계 J12: 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 J8 내지 J11 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계.
실시예 25 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 K)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26k의 과정을 요약한다. 단계 K1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 K2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 K3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 K4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 K5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 K6: 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 18의 기질-표지된 HCR 증폭제 참조). 단계 K7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 K8: 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 K9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 K10: 하나 이상의 리포터에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계. 단계 K11: 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조). 단계 K12: 임의적으로 단계 K4 내지 K11 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계.
실시예 26 - 반복된 리포터 검출 이용한 다중화 분석(방법 L)을(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26l의 과정을 요약한다. 단계 L1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 L2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 L3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 L4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 L5: 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조). 단계 L6: 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 L7: 하나 이상의 신호를 검출하는 단계. 단계 L8: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 L9: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조). 단계 L10: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계. 단계 L11: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계. 단계 L12: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계. 단계 L13: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계. 단계 L14: 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계.
실시예 27 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 M)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26m의 과정을 요약한다. 단계 M1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 M2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 M3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 M4: 단계 M5 내지 M9 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 수행하는 단계. 단계 M5: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5 및 17의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계. 단계 M6: 하나 이상의 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성하는 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8, 18 및 20 참조). 단계 M7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 M8: 하나 이상의 신호를 검출하는 단계. 단계 M9: 임의적으로 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조).
실시예 28 - 표적 분석(방법 N)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출, 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26n의 과정을 요약한다. 단계 N1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 N2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 N3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 N4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 22의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계. 단계 N5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 N6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조). 단계 N7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 N8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 N9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 N10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
실시예 29 - 표적 분석(방법 O)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출, 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26o의 과정을 요약한다. 단계 O1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 O2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 O3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 O4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 21의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계. 단계 O5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 O6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조). 단계 O7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 O8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 O9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 O10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
실시예 30 - 표적 분석(방법 P)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출, 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26p의 과정을 요약한다. 단계 P1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 P2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 P3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 P4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 27의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계. 단계 P5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 P6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조). 단계 P7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 P8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 P9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 P10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
실시예 31 - 표적 분석(방법 Q)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출, 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26q의 과정을 요약한다. 단계 Q1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 Q2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 Q3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 Q4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 21의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계. 단계 Q5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 Q6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조). 단계 Q7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 Q8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 Q9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 Q10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
실시예 32 - 표적 분석(방법 R)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출, 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26r의 과정을 요약한다. 단계 R1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 R2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 R3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 R4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 22의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계. 단계 R5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 R6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조). 단계 R7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 R8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 R9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 R10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
실시예 33 - 표적 분석(방법 S)(임의적으로 다중화, CARD, 효소 비활성화, 반복된 CARD, 반복된 리포터 검출, 및/또는 반복된 신호 제거에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26s의 과정을 요약한다. 단계 S1: 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 S2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 S3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 S4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5, 17의 프로브 유닛 참조)을 포함하는 프로브 세트(예를 들어, 도 8 및 16의 프로브 세트 참조)를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계. 단계 S5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 S6: 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조). 단계 S7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 S8: 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 S9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 S10: 리포터로부터 신호를 검출하는 단계.
실시예 34 - 반복된 리포터 검출을 이용한 다중화 분석(방법 T)(임의적으로 CARD, 효소 비활성화, 및/또는 반복된 CARD에 의해 더 변형될 수 있음)
본 실시예는 도 26t의 과정을 요약한다. 단계 T1: 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계. 단계 T2: 임의적으로 샘플을 고정하는 단계. 단계 T3: 임의적으로 샘플을 침투 가능하게 만드는 단계. 단계 T4: a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브(예를 들어, 도 39a 내지 39n, 41a, 42a 내지 42f 및 43a의 프로브 참조), 또는 (b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛(예를 들어, 도 3, 4, 5, 17, 21, 22, 27의 프로브 유닛 참조)을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계. 단계 T5: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 T6: 하나 이상의 리포터 및/또는 기질로 각각 표지된 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계(예를 들어, 도 8 및 18의 HCR 증폭제 참조). 단계 T7: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 T8: 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계(예를 들어, 도 20의 표지 프로브 참조). 단계 T9: 임의적으로 샘플을 세척하는 단계. 단계 T10: 하나 이상의 리포터로부터 신호를 검출하는 단계. 단계 T11: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계(예를 들어, 도 23 참조). 단계 T12: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계. 단계 T13: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계. 단계 T14: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 증폭제를 제거하는 단계. 단계 T15: 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계. 단계 T16: 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계.
전술된 발명이 특정한 바람직한 실시양태에 대하여 설명되었지만, 다른 실시양태는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명할 것이다. 추가로, 다른 조합, 생략, 치환 및 변형은 본원의 개시내용에 비추어 볼 때 숙련된 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시양태의 언급에 의해 제한되기 위한 것이 아니고, 첨부된 청구범위를 참조함으로써 정의되어야 한다. 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 전체로서 참고로 포함된다.
본원에서 제공된 설명에 사용된 용어는 임의의 한정된 또는 제한적인 방식으로 해석되기 위한 것이 아니고, 달리 표시되지 않은 한, 본 명세서에 비추어 볼 때 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 이해될 통상의 의미를 지칭한다. 더욱이, 실시양태는 몇 가지 신규 특징들을 포함할 수 있거나, 이러한 신규 특징들로 구성될 수 있거나, 본질적으로 이러한 신규 특징들로 구성될 수 있고, 이 특징들 중 단독 하나는 그의 바람직한 속성의 단독 원인이 아니거나 본원에 기재된 실시양태를 실시하는 데 필수적인 것으로 여겨지지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단락 제목은 조직화 목적만을 위한 것이고 기재된 보호대상을 임의의 방식으로 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 특허, 특허 출원, 기사, 서적, 논문 및 인터넷 웹 페이지를 포함하나 이들로 제한되지 않는, 본원에서 인용된 모든 문헌 및 유사 자료는 임의의 목적을 위해 전체로서 명백히 참고로 포함된다. 포함된 참고문헌에 있는 용어의 정의가 본 교시에서 제공된 정의와 상이한 것처럼 보이는 경우, 본 교시에서 제공된 정의가 우선할 것이다. 약간의 비실질적인 편차가 본원의 본 교시의 범위 내에 있도록, 본 교시에서 논의된 온도, 농도, 시간 등의 앞에 "약"이 내포되어 있음을 인식할 것이다.
본 개시내용이 특정 실시양태 및 예에 대한 것이지만, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본 개시내용이 구체적으로 개시된 실시양태를 넘어 다른 대안적인 실시양태 및/또는 실시양태의 용도 및 이의 자명한 변형과 등가물까지 확장됨을 이해할 것이다. 또한, 실시양태의 여러 변경이 상세하게 도시되고 설명되었지만, 본 개시내용의 범위 내에 있는 다른 변형은 본 개시내용을 기반으로 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 용이하게 명백할 것이다. 또한, 실시양태의 특정 특징 및 양태의 다양한 조합 또는 하위조합이 만들어질 수 있고 여전히 본 개시내용의 범위 내에 속하는 것으로 여겨진다. 개시된 실시양태의 다양한 특징 및 양태는 본 개시내용의 다양한 모드 또는 실시양태를 형성하기 위해 서로 조합될 수 있거나 치환될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본원의 본 개시내용의 범위는 전술된 특정 개시된 실시양태에 의해 제한되어서는 안 된다.
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nucleation
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cgggttaaag ttgagtggag atatagaggc agggacaaag tctaatccgt ccctgcctct 60
atatctccac tctatcat 78
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic; Hairpin H2
<400> 2
gtccctgcct ctatatctcc actcaacttt aacccggagt ggagatatag aggcagggac 60
ggattagact tt 72
<210> 3
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<213> Artificial Sequence; Initiator I1
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<223> Synthetic; Initiator I1
<400> 3
gtccctgcct ctatatctcc actcaacttt aacccg 36
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic; Auxiliary strand
<400> 4
atgatagagt ggagatatag aggcagggac ggattagact tt 42
Claims (48)
- 리포터(reporter)-표지된 헤어핀(hairpin)으로 신호를 반복 검출하는 방법으로서,
(a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제(initiator)-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트(N개의 표적 유형 중 하나를 각각 표적화함)를 제공하는 단계;
(c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(d) N개의 프로브 세트 중 M개의 프로브 세트에 상응하는 M개의 HCR 증폭제(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
(e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(f) M개의 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계;
(g) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및
(h) 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (b) 내지 (g) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계
를 포함하고;
이때, 프로브 세트가 a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고,
HCR 개시제-표지된 프로브가 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함하고,
프로브 유닛이 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함하고,
HCR 분획 개시제 프로브가 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함하고,
HCR 증폭제가 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 토홀드(toehold) 및 스템 구획(stem section)을 포함하는 인풋(input) 도메인을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋(output) 도메인을 추가로 포함하고,
HCR 헤어핀이 리포터를 추가로 포함하는, 방법. - 리포터-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법으로서,
(a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계;
(c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(d) 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
(e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(f) 하나 이상의 리포터로부터 하나 이상의 신호를 검출하는 단계;
(g) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계;
(h) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계;
(i) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계; 및
(j) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계
를 포함하고;
이때, 프로브 세트가 a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고,
HCR 개시제-표지된 프로브가 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함하고,
프로브 유닛이 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함하고,
HCR 분획 개시제 프로브가 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함하고,
HCR 증폭제가 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함하고,
HCR 헤어핀이 하나 이상의 리포터를 추가로 포함하는, 방법. - 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법으로서,
(a) N개 이하의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 N개의 프로브 세트를 제공하는 단계;
(c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(d) N개의 프로브 세트에 상응하는 N개의 HCR 증폭제(상이한 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
(e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(f) N개의 상이한 기질 중 M개의 상이한 기질에 상응하는 M개의 표지 프로브(M ≤ N인 경우; 상이한 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계;
(g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(h) M개의 상이한 리포터에 상응하는 M개의 신호를 검출하는 단계;
(i) 샘플로부터 M개의 신호를 제거하는 단계; 및
(j) 임의적으로 모든 N개의 표적에 대해 신호 검출이 수행될 때까지 단계 (f) 내지 (i) 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계
를 포함하고;
이때, 프로브 세트가 a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고,
HCR 개시제-표지된 프로브가 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함하고,
프로브 유닛이 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함하고,
HCR 분획 개시제 프로브가 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함하고,
HCR 증폭제가 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함하고,
HCR 헤어핀이 기질을 추가로 포함하고,
표지 프로브가 기질 결합 영역 및 리포터를 포함하는, 방법. - 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법으로서,
(a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계;
(c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
d) 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
(e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(f) 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계;
(g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(h) 하나 이상의 리포터에 상응하는 하나 이상의 신호를 검출하는 단계;
(i) 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계; 및
(j) 임의적으로 단계 (b) 내지 (i) 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 반복하는 단계
를 포함하고;
이때, 프로브 세트가 a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고,
HCR 개시제-표지된 프로브가 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함하고,
프로브 유닛이 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함하고,
HCR 분획 개시제 프로브가 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함하고,
HCR 증폭제가 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함하고,
HCR 헤어핀이 기질을 추가로 포함하고,
표지 프로브가 기질 결합 영역 및 리포터를 포함하는, 방법. - 리포터 및/또는 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법으로서,
(a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트를 제공하는 단계;
(c) 하나 이상의 프로브 세트에 상응하는 하나 이상의 HCR 증폭제(하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질로 각각 표지됨)를 제공하는 단계;
(d) 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계;
(e) 하나 이상의 신호를 검출하는 단계;
(f) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(g) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계;
(h) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계;
(i) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계;
(j) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 HCR 증폭제를 제거하는 단계;
(k) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 및
(l) 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계
를 포함하고;
이때, 프로브 세트가 a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고,
HCR 개시제-표지된 프로브가 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함하고,
프로브 유닛이 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함하고,
HCR 분획 개시제 프로브가 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함하고,
HCR 증폭제가 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함하고,
HCR 헤어핀이 하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질을 추가로 포함하고,
표지 프로브가 기질 결합 영역 및 하나 이상의 리포터를 포함하는, 방법. - 리포터 및/또는 기질-표지된 헤어핀으로 신호를 반복 검출하는 방법으로서,
(a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 단계 (c) 내지 (g) 중 임의의 단계를 임의의 순서로 1회 이상 수행하는 단계;
(c) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 HCR 프로브 세트를 제공하는 단계;
(d) 하나 이상의 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성하는 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
(e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(f) 하나 이상의 신호를 검출하는 단계; 및
(g) 임의적으로 하나 이상의 신호를 제거하는 단계
를 포함하고;
이때, 프로브 세트가 a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고,
HCR 개시제-표지된 프로브가 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함하고,
프로브 유닛이 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함하고,
HCR 분획 개시제 프로브가 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함하고,
HCR 증폭제가 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함하고,
HCR 헤어핀이 하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질을 추가로 포함하는, 방법. - 중첩 결합 부위를 이용하는 HCR 방법으로서,
(a) 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계;
(c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(d) 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
(e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(f) 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계;
(g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 및
(h) 리포터로부터 신호를 검출하는 단계
를 포함하고;
이때, 프로브 세트가 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고,
프로브 유닛이 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함하고,
HCR 분획 개시제 프로브가 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함하고,
각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고,
HCR 증폭제가 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함하고,
HCR 헤어핀이 리포터 및/또는 기질을 추가로 포함하고,
표지 프로브가 기질 결합 영역 및 리포터를 포함하는, 방법. - 중첩 결합 부위를 이용하는 HCR 방법으로서,
(a) 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하는 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계;
(c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(d) 리포터 및/또는 기질로 표지된 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
(e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(f) 임의적으로 기질에 상응하는 표지 프로브(리포터에 접합됨)를 제공하는 단계;
(g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계; 및
(h) 리포터로부터 신호를 검출하는 단계
를 포함하고;
이때, 프로브 세트가 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고,
프로브 유닛이 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함하고,
HCR 분획 개시제 프로브가 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함하고,
각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고,
HCR 증폭제가 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함하고,
HCR 헤어핀이 리포터 및/또는 기질을 추가로 포함하고,
표지 프로브가 기질 결합 영역 및 리포터를 포함하는, 방법. - 반복된 신호 검출과 함께 중첩 결합 부위를 이용하는 HCR 방법으로서,
(a) 하나 이상의 표적뿐만 아니라 가능하게는 표적이 아닌 다른 분자도 함유하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) (i) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 (ii) 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 유닛을 각각 포함하는 하나 이상의 프로브 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고, 각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되는, 단계;
(c) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(d) 하나 이상의 리포터 및/또는 기질로 각각 표지된 하나 이상의 HCR 증폭제를 제공하는 단계;
(e) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(f) 임의적으로 하나 이상의 기질에 상응하는 하나 이상의 표지 프로브(하나 이상의 리포터에 각각 접합됨)를 제공하는 단계;
(g) 임의적으로 샘플을 세척하는 단계;
(h) 하나 이상의 리포터로부터 신호를 검출하는 단계;
(i) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계;
(j) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계;
(k) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계;
(l) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 증폭제를 제거하는 단계;
(m) 임의적으로 샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계; 및
(n) 임의적으로 상기 단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계
를 포함하고;
이때, 프로브 세트가 a) 하나 이상의 HCR 개시제-표지된 프로브, 또는 b) 하나 이상의 프로브 유닛을 포함하고,
HCR 개시제-표지된 프로브가 하나 이상의 표적 결합 영역 및 하나 이상의 개시제를 포함하고,
프로브 유닛이 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 포함하고,
HCR 분획 개시제 프로브가 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함하고,
프로브 유닛 내의 표적 결합 영역이 표적의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고,
각각의 프로브 유닛 내의 프로브의 분획 개시제가 HCR 헤어핀의 중첩 또는 비-중첩 결합 부위에 결합하도록 구성되고,
HCR 증폭제가 2개 이상의 HCR 헤어핀을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 토홀드 및 스템 구획을 포함하는 인풋 도메인을 포함하고,
HCR 헤어핀이 단일 가닥 루프, 및 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 아웃풋 도메인을 추가로 포함하고,
HCR 헤어핀이 하나 이상의 리포터 및/또는 하나 이상의 기질을 추가로 포함하고,
표지 프로브가 기질 결합 영역 및 하나 이상의 리포터를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
표적이 핵산 서열인, 방법. - 제1항 또는 제3항에 있어서,
N이 1 내지 1,000인, 방법. - 제1항 또는 제3항에 있어서,
M이 2 내지 10,000인, 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
기질이 합텐, 디곡시제닌(DIG), 디니트로페닐(DNP), 바이오틴, 형광단, 4개 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 도메인, 리포터 분자의 침착을 촉매작용하는 효소를 동원하는 기질, 분획 기질, 및 리포터의 국소화를 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 핵산 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
리포터가 형광단, 발색단, 발광단, 인광체, FRET 쌍, FRET 쌍의 구성원, 소광제, 형광단/소광제 쌍, 희토류 원소 또는 화합물, 방사성 분자, 또는 자성 분자인, 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플을 고정하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플을 침투 가능하게 만드는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플로부터 하나 이상의 신호를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플로부터 하나 이상의 리포터를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플로부터 하나 이상의 표지 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플로부터 하나 이상의 증폭제를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플로부터 하나 이상의 프로브 세트를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 중 임의의 단계를 임의의 순서로 반복하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
청구항에 기재된 알파벳 순서로 수행되는 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
프로브 유닛이 2개 이상의 HCR 분획 개시제 프로브를 각각 포함하고, HCR 분획 개시제 프로브가 표적 결합 영역 및 분획 개시제를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
중첩 결합이 수반되고, 중첩이 적어도 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드인, 방법. - 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브;
제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브;
제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인; 제1 헤어핀 루프, 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인; 및 제1 합텐 분자를 포함하는 제1 헤어핀 단량체;
제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인; 제2 헤어핀 루프, 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인; 및 제2 합텐 분자를 포함하는 제2 헤어핀 단량체; 및
표적 분자
를 제공하는 단계; 및
제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 표적과 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 방법. - 제26항에 있어서,
인큐베이션이 제1 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시키고 제2 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시키는, 방법. - 제26항 또는 제27항에 있어서,
제1 헤어핀 단량체를 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제 둘 다에 결합시키는 단계;
제2 헤어핀 단량체를 제1 헤어핀 단량체에 결합시키는 단계;
하나 이상의 리포터 물질로 표지된 항-합텐 분자를 제공하는 단계로서, 리포터 물질이 CARD를 매개하는 효소인, 단계;
하나 이상의 CARD-기질을 제공하는 단계; 및
CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호를 측정하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
항-합텐 분자가 항-합텐 항체 또는 항-합텐 나노바디인, 방법. - 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 표적이 핵산인, 방법. - 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 표적 분자가 RNA인, 방법. - 하나 이상의 개시제를 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브;
제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인; 제1 헤어핀 루프, 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인; 및 제1 합텐 분자를 포함하는 제1 헤어핀 단량체;
제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인; 제2 헤어핀 루프, 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인; 및 제2 합텐 분자를 포함하는 제2 헤어핀 단량체; 및
표적 분자
를 제공하는 단계; 및
하나 이상의 개시제를 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 표적과 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 방법. - 제32항에 있어서,
인큐베이션이 하나 이상의 개시제를 포함하는 하나 이상의 개시제-표지된 프로브를 표적 분자에 결합시키는, 방법. - 제32항 또는 제33항에 있어서,
제1 헤어핀 단량체를 하나 이상의 개시제에 결합시키는 단계;
제2 헤어핀 단량체를 제1 헤어핀 단량체에 결합시키는 단계;
하나 이상의 리포터 물질로 표지된 항-합텐 분자를 제공하는 단계로서, 리포터 물질이 CARD를 매개하는 효소인, 단계;
하나 이상의 CARD-기질을 제공하는 단계; 및
CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호를 측정하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
표적 분자가 단백질인, 방법. - 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
항-합텐 분자가 항-합텐 항체 또는 항-합텐 나노바디인, 방법. - 제36항에 있어서,
항-합텐 항체가 1차 항체인, 방법. - 제36항에 있어서,
항-합텐 항체가 합텐에 결합하는 1차 항체를 포함하고, 방법이 1차 항체에 결합하는 2차 항체(하나 이상의 리포터 물질로 표지됨)를 추가로 포함하는, 방법. - 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브;
제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브;
제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인; 제1 헤어핀 루프, 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인; 및 기질을 포함하는 제1 헤어핀 단량체;
제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인; 제2 헤어핀 루프, 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인; 및 기질을 포함하는 제2 헤어핀 단량체; 및
표적 분자
를 제공하는 단계; 및
제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 표적과 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 방법. - 제39항에 있어서,
인큐베이션이 제1 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시키고 제2 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시키는, 방법. - 제39항 또는 제40항에 있어서,
제1 헤어핀 단량체를 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제 둘 다에 결합시키는 단계;
제2 헤어핀 단량체를 제1 헤어핀 단량체에 결합시키는 단계;
하나 이상의 리포터 물질로 표지된 기질 결합 영역을 제공하는 단계로서, 기질 결합 영역이 기질에 결합하고, 리포터 물질이 CARD를 매개하는 효소인, 단계;
하나 이상의 CARD-기질을 제공하는 단계; 및
CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호를 측정하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 표적이 핵산인, 방법. - 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 표적 분자가 RNA인, 방법. - 제1 분획 개시제를 포함하는 제1 분획 개시제 프로브;
제2 분획 개시제를 포함하는 제2 분획 개시제 프로브;
제1 토홀드 및 제1 스템 구획을 포함하는 제1 인풋 도메인; 제1 헤어핀 루프, 및 제1 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제1 아웃풋 도메인; 및 제1 분획 기질을 포함하는 제1 헤어핀 단량체;
제2 토홀드 및 제2 스템 구획을 포함하는 제2 인풋 도메인; 제2 헤어핀 루프, 및 제2 스템 구획에 대한 상보체를 포함하는 제2 아웃풋 도메인; 및 제2 분획 기질을 포함하는 제2 헤어핀 단량체; 및
표적 분자
를 제공하는 단계; 및
제1 분획 개시제 프로브 및 제2 분획 개시제 프로브를 표적 분자와 함께 인큐베이션하는 단계
를 포함하는 방법. - 제44항에 있어서,
인큐베이션이 제1 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시키고 제2 분획 개시제 프로브를 표적 분자에 결합시키는, 방법. - 제44항 또는 제45항에 있어서,
제1 헤어핀 단량체를 제1 분획 개시제 및 제2 분획 개시제 둘 다에 결합시키는 단계;
제2 헤어핀 단량체를 제1 헤어핀 단량체에 결합시키는 단계;
제1 분획 기질 및 제2 분획 기질을 포함하는 전체 기질을 수득하는 단계;
하나 이상의 리포터 물질로 표지된 기질 결합 영역을 제공하는 단계로서, 기질 결합 영역이 전체 기질에 결합하고, 리포터 물질이 CARD를 매개하는 효소인, 단계;
하나 이상의 CARD-기질을 제공하는 단계; 및
CARD를 매개하는 효소에 의해 CARD-기질로부터 생성된 하나 이상의 침착된 리포터로부터 신호를 측정하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 표적이 핵산인, 방법. - 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 표적 분자가 RNA인, 방법.
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