JP2012219100A - 細胞と生体適合性高分子を含む組成物 - Google Patents
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- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
Abstract
【解決手段】 骨髄間質細胞由来神経前駆細胞、骨髄間質細胞由来シュワン細胞及び骨髄間質細胞由来骨格筋細胞の何れかの細胞、及び生体適合性高分子とを含む組成物。
【選択図】なし
Description
[1] (A)以下の(a)、(b)及び(c)の何れかの細胞、及び(B)生体適合性高分子とを含む組成物。
(a)(1)Notch配列を含む核酸(ここで、Notch配列はNotch細胞内ドメインをコードする配列からなる)を骨髄間質細胞に導入し、(2)上記骨髄間質細胞を神経前駆細胞に分化するように培養することによって得られる(ここで得られる分化細胞は、上記核酸が導入された骨髄間質細胞の子孫である)、骨髄間質細胞由来神経前駆細胞;
(b)(1)骨髄から骨髄間質細胞を回収し、上記細胞を血清を補充した標準必須培地で培養し、(2)還元剤を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(3)レチノイン酸を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(4)ホルスコリン、及び/又は神経及びグリア細胞に作用する分化・生存及び増殖刺激因子を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養して骨髄間質細胞由来シュワン(Schwann)細胞を得ることによって得られる、骨髄間質細胞由来シュワン細胞;及び
(c)(1)(i)サイクリックAMP(cAMP)増加剤又はcAMPアナログ、及び(ii)bFGF、 PDGF-AA、及びニューレグリンを含む細胞分化刺激因子を、骨髄間質細胞の培養物に添加し(ここで、上記骨髄間質細胞は脱メチル化剤で処理されていない)、上記細胞を培養し、(2)(1)で得られた細胞にNotch遺伝子を導入し、細胞を培養して筋芽細胞の培養物を取得し(但し、上記培養物は、遺伝子を導入された細胞と遺伝子が導入されていない細胞との共培養物を含まない)、そして(3)Notchリガンドを(2)で得た筋芽細胞の培養物に添加し、骨格筋細胞が誘導されるように上記細胞を培養することによって得られる骨髄間質細胞由来骨格筋細胞:
[3] 生体適合性高分子が、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンである、[1]又は[2]に記載の組成物。
[4] 遺伝子組み換えゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列(X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有し(複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい)、分子量が2 KDa以上100 KDa以下である、[3]に記載の組成物。
[5] 遺伝子組み換えゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列(X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有し(複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい)、分子量が10 KDa以上90 KDa以下である、[3]又は[4]に記載の組成物。
[7] 細胞接着シグナルがArg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列である、[6]に記載の組成物。
[8] 遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列が、セリン及びスレオニンを含まない、[3]から[7]の何れか1項に記載の組成物。
[9] 遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列が、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、及びシステインを含まない、[3]から[8]の何れか1項に記載の組成物。
[10] 遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列が、Asp-Arg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列を含まない、[3]から[9]の何れか1項に記載の組成物。
式:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
(式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示される、[3]から[10]の何れか1項に記載の組成物。
[12] 遺伝子組み換えゼラチンが、
式:Gly-Ala-Pro-[(Gly−X−Y)63]3−Gly
(式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)
で示される、[3]から[11]の何れか1項に記載の組成物。
[14] 遺伝子組み換えゼラチンが架橋されている、[3]から[13]の何れか1項に記載の組成物。
[15] 架橋がアルデヒド類、縮合剤、又は酵素により施される、[14]に記載の組成物。
(a)(1)Notch配列を含む核酸(ここで、Notch配列はNotch細胞内ドメインをコードする配列からなる)を骨髄間質細胞に導入し、(2)上記骨髄間質細胞を神経前駆細胞に分化するように培養することによって得られる(ここで得られる分化細胞は、上記核酸が導入された骨髄間質細胞の子孫である)、骨髄間質細胞由来神経前駆細胞;
(b)(1)骨髄から骨髄間質細胞を回収し、上記細胞を血清を補充した標準必須培地で培養し、(2)還元剤を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(3)レチノイン酸を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(4)ホルスコリン、及び/又は神経及びグリア細胞に作用する分化・生存及び増殖刺激因子を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養して骨髄間質細胞由来シュワン(Schwann)細胞を得ることによって得られる、骨髄間質細胞由来シュワン細胞;
[17] 局所的に投与される、[16]に記載の神経疾患の治療剤。
[18] 患者の中枢神経系に投与される、[16]又は[17]に記載の神経疾患の治療剤。
(c)(1)(i)サイクリックAMP(cAMP)増加剤又はcAMPアナログ、及び(ii)bFGF、 PDGF-AA、及びニューレグリンを含む細胞分化刺激因子を、骨髄間質細胞の培養物に添加し(ここで、上記骨髄間質細胞は脱メチル化剤で処理されていない)、上記細胞を培養し、(2)(1)で得られた細胞にNotch遺伝子を導入し、細胞を培養して筋芽細胞の培養物を取得し(但し、上記培養物は、遺伝子を導入された細胞と遺伝子が導入されていない細胞との共培養物を含まない)、そして(3)Notchリガンドを(2)で得た筋芽細胞の培養物に添加し、骨格筋細胞が誘導されるように上記細胞を培養することによって得られる骨髄間質細胞由来骨格筋細胞:
[20] 局所的に投与される、[19]に記載の筋肉疾患の治療剤。
(I)本発明で使用する細胞
(a)骨髄間質細胞由来神経前駆細胞;
本発明で使用する骨髄間質細胞由来神経前駆細胞は、米国特許第7,682,825号に記載の通り、(1)Notch配列を含む核酸(ここで、Notch配列はNotch細胞内ドメインをコードする配列からなる)を骨髄間質細胞に導入し、(2)上記骨髄間質細胞を神経前駆細胞に分化するように培養することによって得られる(ここで得られる分化細胞は、上記核酸が導入された骨髄間質細胞の子孫である)ものである。米国特許第7,682,825号の記載内容は引用により本明細書書中に取り込むものとする。
(1)骨髄から骨髄間質細胞を単離し、この細胞を血清を補充した標準必須培地中で培養する工程;及び
(2)Notch遺伝子及び/又はNotchシグナル伝達関連遺伝子を細胞に導入し、この細胞を培養して神経前駆細胞を製造する工程:
によってインビトロで神経前駆細胞に分化誘導することができる。
上記方法により製造された神経前駆細胞は、本発明において使用することができる。
本発明においては、神経前駆細胞マーカーであるGLAST、3PGDH及びネスチンを発現する神経前駆細胞を使用してもよい。
(1)骨髄から骨髄間質細胞を単離し、この細胞を血清を補充した標準必須培地中で培養する工程;
(2)Notch遺伝子及び/又はNotchシグナル伝達関連遺伝子を細胞に導入し、この細胞を培養する工程;及び
(3)サイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログ、及び/又は細胞分化刺激因子を培地に添加し、細胞をさらに培養して神経細胞を製造する工程(ここで、得られる分化細胞は、Notch遺伝子及び/又はNotchシグナル伝達関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞の細胞分裂の子孫である):
によってインビトロで神経細胞に分化誘導することができる。
Notch遺伝子及び/又はNotchシグナル伝達関連遺伝子の導入は、哺乳動物用発現ベクターを用いてリポフェクションにより行うことができる。
上記の方法は、工程(2)と(3)の間に、所定の期間、遺伝子が導入された細胞を選択する工程を含んでいてもよい。
サイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログとしては、ホルスコリンを挙げることができ、その濃度は0.001 nM から100 μMとすることができる。
単離された骨髄間質細胞は、好ましくはヒト細胞である。
上記方法により製造された神経細胞は、本発明において使用することができる。
本発明においては、神経細胞マーカーであるβ−チューブリンアイソタイプ3及びTuJ-1を発現する神経細胞を使用してもよい。
(1)骨髄から骨髄間質細胞を単離し、この細胞を血清を補充した標準必須培地中で培養する工程;
(2)Notch遺伝子及び/又はNotchシグナル伝達関連遺伝子を細胞に導入し、この細胞を培養する工程;
(3)サイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログ、及び/又は細胞分化刺激因子を培地に添加し、細胞をさらに培養して神経細胞を製造する工程;
(4)工程(3)で得た神経細胞を血清を補充した標準必須培地中で培養する工程;及び
(5)グリア由来神経栄養因子(GDNF)、及びサイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログ、及び/又はグリア由来神経栄養因子以外の細胞分化刺激因子を培地に添加し、細胞をさらに培養してドーパミン作動性ニューロンを得る工程(ここで得られるドーパミン作動性細胞は、Notch遺伝子及び/又はNotchシグナル伝達関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞の子孫である):
によってインビトロでドーパミン作動性ニューロンに分化誘導することができる。
工程(5)におけるサイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログとしては、ホルスコリンを挙げることができる。工程(5)におけるサイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログの濃度は、0.001 nM から100 μMとすることができる。
工程(5)におけるグリア由来神経栄養因子の濃度は、0.001 ng/ml から100 μg/mlの間とすることができ、好ましくは1 ng/mlから 100 ng/mlの間である。工程(5)におけるグリア由来神経栄養因子以外の細胞分化刺激因子の濃度は、0.001 ng/mlから100 μg/mlの間とすることができる。
上記方法により製造されたドーパミン作動性ニューロンは、本発明において使用することができる。
(1)骨髄から骨髄間質細胞を単離し、この細胞を血清を補充した標準必須培地中で培養する工程;
(2)Notch遺伝子及び/又はNotchシグナル伝達関連遺伝子を細胞に導入し、この細胞を培養する工程;
(3)サイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログ、及び/又は細胞分化刺激因子を培地に添加し、細胞をさらに培養して神経細胞を製造する工程;
(4)工程(3)で得た神経細胞を血清を補充した標準必須培地中で培養する工程;及び
(5)神経成長因子(NGF)、及びサイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログ、及び/又は神経成長因子以外の細胞分化刺激因子を培地に添加し、細胞をさらに培養してアセチルコリン作動性ニューロンを得る工程(ここで、得られるアセチルコリン作動性細胞は、Notch遺伝子及び/又はNotchシグナル伝達関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞の子孫である):
によってインビトロでアセチルコリン作動性ニューロンに分化誘導することができる。
工程(5)におけるサイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログとしては、ホルスコリンを挙げることができる。工程(5)におけるサイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログの濃度は、0.001 nM から100 μMとすることができる。
工程(5)における神経成長因子の濃度は、0.001 ng/ml から100 μg/mlの間とすることができ、好ましくは1 ng/mlから 100 ng/mlの間である。工程(5)における神経成長因子以外の細胞分化刺激因子の濃度は、0.001 ng/mlから100 μg/mlの間とすることができる。
上記方法により製造されたアセチルコリン作動性ニューロンは、本発明において使用することができる。
(1)骨髄から骨髄間質細胞を単離し、この細胞を血清を補充した標準必須培地中で培養する工程;
(2)脱メチル化剤を培地に添加し、細胞をさらに培養する工程;
(3)サイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログ、及び/又は細胞分化刺激因子を培地に添加し、細胞をさらに培養する工程;
(4)Notch遺伝子及び/又はNotchシグナル伝達関連遺伝子を細胞に導入し、この細胞を培養する工程;
(5)遺伝子を導入した細胞を、遺伝子を導入していない未処理の骨髄間質細胞と一緒に共培養する工程;及び
(6)サイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログを培地に添加し、細胞をさらに培養して骨格筋細胞を得る工程(ここで得られる分化細胞は、Notch遺伝子及び/又はNotchシグナル伝達関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞の子孫である);
によってインビトロで骨格筋細胞に分化誘導することができる。
脱メチル化剤は、5−アザシチジンでもよく、その濃度は30 nmol/lから300 μmol/lの間とすることができる。
工程(3)におけるサイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログとしては、ホルスコリンを挙げることができる。工程(3)におけるサイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログの濃度は、0.001 nM から100 μMとすることができる。
工程(5)におけるサイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログとしては、ホルスコリンを挙げることができる。工程(5)におけるサイクリックAMP増強剤又はサイクリックAMPアナログの濃度は0.001 nM から100 μMとすることができる。
上記方法により製造された骨格筋細胞は、本発明において使用することができる。
本発明で使用する骨髄間質細胞由来シュワン細胞は、米国特許第6,989,271号に記載の通り、(1)骨髄から骨髄間質細胞を回収し、上記細胞を血清を補充した標準必須培地で培養し、(2)還元剤を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(3)レチノイン酸を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(4)ホルスコリン、及び/又は神経及びグリア細胞に作用する分化・生存及び増殖刺激因子を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養して骨髄間質細胞由来シュワン(Schwann)細胞を得ることによって得られるものである。米国特許第6,989,271号の記載内容は引用により本明細書中に取り込まれるものとする。
標準必須培地は、Eagleのα改変最小必須培地(M4526, Sigma)でもよく、血清は胎児ウシ血清(14-501F, Lot #61-1012, BioWhittaker Co.)でもよい。血清は、20%濃度まで添加することができる。還元剤はSH試薬であり、SH試薬は好ましくは、β-メルカプトエタノール(214-18, Lot# MOM7582, Nacalai Tesque)である。還元剤の濃度は、1 nMから10 mMとすることができ、好ましくは10 nMから5 mM であり、更に好ましくは100μM から2 mMである。工程(2)の培養時間は1時間〜5日間でもよく、好ましくは12〜48時間であり、更に好ましくは18〜30時間である。上記した試薬濃度は、細胞同士が直接接触できるような培地中濃度である(以下に記載する試薬についても同様である)。
本発明で使用する骨髄間質細胞由来骨格筋細胞は、米国特許第7,718,429号に記載の通り、(1)(i)サイクリックAMP(cAMP)増加剤又はcAMPアナログ、及び(ii)bFGF、 PDGF-AA、及びニューレグリンを含む細胞分化刺激因子を、骨髄間質細胞の培養物に添加し(ここで、上記骨髄間質細胞は脱メチル化剤で処理されていない)、上記細胞を培養し、(2)(1)で得られた細胞にNotch遺伝子を導入し、細胞を培養して筋芽細胞の培養物を取得し(但し、上記培養物は、遺伝子を導入された細胞と遺伝子が導入されていない細胞との共培養物を含まない)、そして(3)Notchリガンドを(2)で得た筋芽細胞の培養物に添加し、骨格筋細胞が誘導されるように上記細胞を培養することによって得られるものである。米国特許第7,718,429号の記載内容は、引用により本明細書中に取り込まれるものとする。
本発明で用いる生体適合性高分子は、タンパク質、ポリアミノ酸、糖質、又は生体適合性合成高分子でもよい。
タンパク質の種類は特に限定されないが、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパクが好ましく、分子量1万から100万程度のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらに限定されるものではない。コラーゲン、ゼラチン、酸処理ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、カゼイン、カゼインナトリウム、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種を使用することができる。また、タンパク質の由来は特に限定するものではなく、ヒト、牛、豚、魚、および遺伝子組み換え体のいずれも用いることができる。本発明でカゼインを用いる場合、カゼインの由来は特に限定されず、乳由来であっても、豆由来であってもよく、α−カゼイン、β−カゼイン、γ−カゼイン、κ−カゼインおよびそれらの混合物を使用することができる。カゼインは、単独で、または2種以上を組み合わせて用いることができる。本発明に用いられるタンパク質は、単独で使用してもよいし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
糖質の例としては、ポリガラクツロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、硫酸デキストラン、硫酸セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビア・ゴム、トラガカント・ゴム、ジェランガム、硫酸化ジェラン、カラヤゴム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、澱粉、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、及びレンチナンが挙げられる。
また、遺伝子組み換えゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはI型、II型、III型、IV型、およびV型である。より好ましくは、I型、II型、III型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンはプロコラーゲンを有さない。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列;又は
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上)の相同性を有し、神経細胞または神経細胞へ分化可能な細胞と接着性を有するアミノ酸配列;
を有する遺伝子組換えゼラチンである。
本発明の組成物は、骨髄間質細胞由来神経前駆細胞、骨髄間質細胞由来シュワン細胞、又は骨髄間質細胞由来骨格筋細胞の何れかと、生体適合性高分子とを含む組成物を含む。上記以外にも必要に応じて、本発明の組成物には、薬学的に許容可能な担体を含めてもよい。薬学的に許容可能な担体としては、滅菌等張緩衝液、FRS、イソライト、滅菌希釈液、例えば水、通常生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒;抗細菌または抗真菌薬、例えばアスコルビン酸、チメロサール、トリメトプリム‐スルファメトキサゾール、ナリジクス酸、馬尿酸メセナミンまたはニトロフラントインマクロクリスタル等;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム;キレート化剤、例えばEDTA;緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩;ならびに張性の調整のための作用物質、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースなどを挙げることができるが、薬学的に許容可能な担体はこれらに限定されるものではない。本発明の組成物のpHは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。
本発明の組成物を静脈内投与する場合に適切な薬学的に許容可能な担体としては、生理食塩溶液、ノルマゾル(normasol)、イソライト、プラズマライトまたはリン酸塩緩衝生理食塩溶液(PBS)が挙げられる。本発明の組成物を静脈内投与する場合、本発明の組成物は滅菌されていることが好ましく、そして注射が容易となる程度に流動性である必要がある。
以下の実施例1−8においては、Sanbio社製のSB623 (http://www.san-bio.com/product/pipeline.php)を、(1)Notch配列を含む核酸(ここで、Notch配列はNotch細胞内ドメインをコードする配列からなる)を骨髄間質細胞に導入し、(2)上記骨髄間質細胞を神経前駆細胞に分化するように培養することによって得られる(ここで得られる分化細胞は、上記核酸が導入された骨髄間質細胞の子孫である)、骨髄間質細胞由来神経前駆細胞のモデルとして使用した。
CBE3
分子量:51.6kD
構造: Gly-Ala-Pro[(Gly−X−Y)63]3Gly
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGly−X−Y の繰り返し構造である。
CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。
CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
アミノ酸配列(配列表の配列番号1)(WO2008/103041号公報の配列番号3と同じ。但し末尾のXは「P」に修正)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
3%グルタルアルデヒド溶液(18ml)を、10%(w/v)CBE3水性溶液(162ml)に添加した。混合物を4℃で18時間放置し、ヒドロゲルを作製した。ヒドロゲルを凍結乾燥し、粉砕してCBE3粒子の小片を製造した。得られたCBE3粒子の写真を図1に示す。
10%(v/v)のCBE3粒子又は動物ゼラチン粒子を培地(α−MEM,10%FBS、1%PS)に懸濁した。その後、GFP標識Notch細胞内遺伝子を導入した骨髄由来細胞(Sanbio 社製のSB623)を各溶液に懸濁した。上記で製造した細胞懸濁液を、12ウエルプラスチックプレート上に置いたP9ラットの海馬切片上に添加した。
切片をCO2インキュベーター中で37℃でインキュベートした。インキュベーションの開始から1日後、2日後、5日後、9日後及び14日後に、切片上でGFPを発現する細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、そのような細胞の数を計測した。GFPを発現する細胞は生存細胞であるとみなした。上記のようにして、細胞の生存率を、インキュベーション開始から1日後の細胞数に対する比率として評価した。結果を図2に示す。
細胞の生存率は、CBE粒子又は動物ゼラチンの作用により向上した。
α−MEM(500μl)中のCBE3又は動物ゼラチン粒子(0.01cm3/ウエル)を超低接着培養プレート(Ultra Low Attachment Culture Dish (Corning製))に置いた。その後、50,000個のNotch細胞内遺伝子を導入した骨髄由来細胞 (Sanbio 社製SB623)を置き、CO2インキュベーター中で37℃でインキュベートした。インキュベーションの開始から2時間後、1日後、4日後、及び7日後に、試料を細胞濾過器(メッシュサイズ40μm)で濾過し、パパイン溶液(2.5mU/ml パパイン、5mM L-システイン、5mM EDTA)に60℃で一晩溶解することによってDNAを回収試料から抽出した。標準曲線を使用して、粒子上の細胞数を計測した。生存細胞は粒子に付着し、死細胞は付着しないので、細胞の生存率を、プレーティング後0日目(2時間後)の細胞数に対する比率として評価した。
図3に示すように、細胞の生存率は、CBE粒子又は動物ゼラチン粒子により向上した。
5.8%のCBE粒子及び20,000細胞/μlの細胞をα−MEMに懸濁し、穏やかに攪拌しながらCO2インキュベーター中で37℃で4時間インキュベートした。試料を6ウエル細胞培養プレートに移し、カルセイン-AM溶液(10mlPBS 中に5μlカルセイン-AM (Invitrogen社製))中で37℃で30分間染色した。試料の写真を蛍光顕微鏡で撮影した。
図4に示す通り、細胞はCBE粒子に明らかに付着した。
5.8%のCBE粒子及び20,000細胞/μlの細胞をα−MEMに懸濁し、穏やかに攪拌しながらCO2インキュベーター中で37℃で4時間インキュベートした。混合物を細胞濾過器(メッシュサイズ40μm:Fisher Bioscience社製)に移した。細胞濾過器内に保持された試料を、15mlの円錐チューブに回収し、4mlのパパイン溶液(2.5mU/ml パパイン、5mM L-システイン、5mM EDTA)に60℃で一晩溶解して、DNAを細胞から抽出した。標準曲線を使用して、粒子上の細胞数を計測した。
図5に示す通り、57%の細胞(11,400細胞/μl)が粒子に付着した。
脳卒中モデルとして、一過性中大脳動脈閉塞(MCAo){ちゅう だいのう どうみゃく へいそく}モデルラットを使用した。脳卒中の1月後に、細胞とCBE粒子の組成物又は細胞懸濁液を、線条体に移植した。
細胞とCBE3粒子の組成物を得るために、5.8%のCBE粒子及び20,000細胞/μlの細胞をα−MEMに懸濁し、穏やかに攪拌しながらCO2インキュベーター中で37℃で4時間インキュベートした。その後、組成物を、脳卒中モデルラットの脳に移植した。
切片を、一次抗体として抗-HuNu ( Chemicon社製)で染色し、二次抗体としてAlexa 488-結合抗マウス抗体で染色した。HuNu陽性細胞の数を全ての動物について計測した。
上記の通り、脳への移植後の細胞生存率の向上は、治療効果の向上のための最善の方法である。
実施例6に記載の通り取得した切片の一部を、クレシルバイオレットで染色した。これらの切片により、虚血線条体における宿主ニューロンの保護を評価した。クレシルバイオレットで染色されたニューロンを、虚血線条体の4か所の0.14mm2の領域、並びに無傷側の対応する4か所の領域において計測した(図7)。宿主ニューロン生存率は、無傷側の対応領域におけるニューロンの総数に対する虚血線条体におけるニューロンの総数の百分率として表示した。
実施例6に記載の通り取得した切片の一部を、一次抗体として抗-MBP (Abcamの製品)で染色し、二次抗体としてAlexa 488-結合抗ラット抗体で染色した。MB陽性細胞の領域を測定した。
Sanbio社製のSB618を、米国特許第6,989,271号に記載の通り、(1)骨髄間質細胞(BMSC)を血清を補充した標準必須培地で培養し、(2)還元剤を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(3)レチノイン酸を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(4)ホルスコリン、及び/又は神経及びグリア細胞に作用する分化・生存及び増殖刺激因子を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養することによって得た骨髄間質細胞由来シュワン(Schwann)細胞のモデルとして使用した。
Claims (20)
- (A)以下の(a)、(b)及び(c)の何れかの細胞、及び(B)生体適合性高分子とを含む組成物。
(a)(1)Notch配列を含む核酸(ここで、Notch配列はNotch細胞内ドメインをコードする配列からなる)を骨髄間質細胞に導入し、(2)上記骨髄間質細胞を神経前駆細胞に分化するように培養することによって得られる(ここで得られる分化細胞は、上記核酸が導入された骨髄間質細胞の子孫である)、骨髄間質細胞由来神経前駆細胞;
(b)(1)骨髄から骨髄間質細胞を回収し、上記細胞を血清を補充した標準必須培地で培養し、(2)還元剤を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(3)レチノイン酸を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(4)ホルスコリン、及び/又は神経及びグリア細胞に作用する分化・生存及び増殖刺激因子を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養して骨髄間質細胞由来シュワン(Schwann)細胞を得ることによって得られる、骨髄間質細胞由来シュワン細胞;及び
(c)(1)(i)サイクリックAMP(cAMP)増加剤又はcAMPアナログ、及び(ii)bFGF、 PDGF-AA、及びニューレグリンを含む細胞分化刺激因子を、骨髄間質細胞の培養物に添加し(ここで、上記骨髄間質細胞は脱メチル化剤で処理されていない)、上記細胞を培養し、(2)(1)で得られた細胞にNotch遺伝子を導入し、細胞を培養して筋芽細胞の培養物を取得し(但し、上記培養物は、遺伝子を導入された細胞と遺伝子が導入されていない細胞との共培養物を含まない)、そして(3)Notchリガンドを(2)で得た筋芽細胞の培養物に添加し、骨格筋細胞が誘導されるように上記細胞を培養することによって得られる骨髄間質細胞由来骨格筋細胞: - 生体適合性高分子が、ゼラチンである、請求項1に記載の組成物。
- 生体適合性高分子が、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンである、請求項1又は2に記載の組成物。
- 遺伝子組み換えゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列(X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有し(複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい)、分子量が2 KDa以上100 KDa以下である、請求項3に記載の組成物。
- 遺伝子組み換えゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列(X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有し(複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい)、分子量が10 KDa以上90 KDa以下である、請求項3又は4に記載の組成物。
- 遺伝子組み換えゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列(X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有し(複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい)、細胞接着シグナルを一分子中に2配列以上含む、請求項3から5の何れか1項に記載の組成物。
- 細胞接着シグナルがArg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列である、請求項6に記載の組成物。
- 遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列が、セリン及びスレオニンを含まない、請求項3から7の何れか1項に記載の組成物。
- 遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列が、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、及びシステインを含まない、請求項3から8の何れか1項に記載の組成物。
- 遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列が、Asp-Arg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列を含まない、請求項3から9の何れか1項に記載の組成物。
- 遺伝子組み換えゼラチンが、
式:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
(式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示される、請求項3から10の何れか1項に記載の組成物。 - 遺伝子組み換えゼラチンが、
式:Gly-Ala-Pro-[(Gly−X−Y)63]3−Gly
(式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)
で示される、請求項3から11の何れか1項に記載の組成物。 - 遺伝子組み換えゼラチンが、(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列、又は(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、神経細胞または神経細胞へ分化可能な細胞と接着性を有するアミノ酸配列を有する、請求項3から12の何れか1項に記載の組成物。
- 遺伝子組み換えゼラチンが架橋されている、請求項3から13の何れか1項に記載の組成物。
- 架橋がアルデヒド類、縮合剤、又は酵素により施される、請求項14に記載の組成物。
- (A)以下の(a)及び(b)の何れかの細胞、及び(B)生体適合性高分子とを含む組成物を含む、神経疾患の治療剤。
(a)(1)Notch配列を含む核酸(ここで、Notch配列はNotch細胞内ドメインをコードする配列からなる)を骨髄間質細胞に導入し、(2)上記骨髄間質細胞を神経前駆細胞に分化するように培養することによって得られる(ここで得られる分化細胞は、上記核酸が導入された骨髄間質細胞の子孫である)、骨髄間質細胞由来神経前駆細胞;
(b)(1)骨髄から骨髄間質細胞を回収し、上記細胞を血清を補充した標準必須培地で培養し、(2)還元剤を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(3)レチノイン酸を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養し、(4)ホルスコリン、及び/又は神経及びグリア細胞に作用する分化・生存及び増殖刺激因子を上記培地に添加し、更に上記細胞を培養して骨髄間質細胞由来シュワン(Schwann)細胞を得ることによって得られる、骨髄間質細胞由来シュワン細胞; - 局所的に投与される、請求項16に記載の神経疾患の治療剤。
- 患者の中枢神経系に投与される、請求項16又は17に記載の神経疾患の治療剤。
- (A)以下の(c)の細胞、及び(B)生体適合性高分子とを含む組成物を含む、筋肉疾患の治療剤。
(c)(1)(i)サイクリックAMP(cAMP)増加剤又はcAMPアナログ、及び(ii)bFGF、 PDGF-AA、及びニューレグリンを含む細胞分化刺激因子を、骨髄間質細胞の培養物に添加し(ここで、上記骨髄間質細胞は脱メチル化剤で処理されていない)、上記細胞を培養し、(2)(1)で得られた細胞にNotch遺伝子を導入し、細胞を培養して筋芽細胞の培養物を取得し(但し、上記培養物は、遺伝子を導入された細胞と遺伝子が導入されていない細胞との共培養物を含まない)、そして(3)Notchリガンドを(2)で得た筋芽細胞の培養物に添加し、骨格筋細胞が誘導されるように上記細胞を培養することによって得られる骨髄間質細胞由来骨格筋細胞: - 局所的に投与される、請求項19に記載の筋肉疾患の治療剤。
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