JP2003144155A - Ｎｏｔｃｈ遺伝子の導入を用いて骨髄間質細胞を神経細胞及び骨格筋細胞に分化・誘導する方法 - Google Patents
Ｎｏｔｃｈ遺伝子の導入を用いて骨髄間質細胞を神経細胞及び骨格筋細胞に分化・誘導する方法Info
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- JP2003144155A JP2003144155A JP2002030003A JP2002030003A JP2003144155A JP 2003144155 A JP2003144155 A JP 2003144155A JP 2002030003 A JP2002030003 A JP 2002030003A JP 2002030003 A JP2002030003 A JP 2002030003A JP 2003144155 A JP2003144155 A JP 2003144155A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｎｏｔｃｈ遺伝子の導入を用いて骨髄間質細
胞を神経細胞及び骨格筋細胞に分化・誘導する方法の提
供。 【解決手段】 本願発明は、骨髄間質細胞をインビトロ
において神経細胞又は骨格筋細胞に分化・誘導する方法
であって、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮ
ｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入することを含
み、ここで、最終的に得られた分化・誘導された細胞
が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグ
ナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞が細胞分
裂した結果として得られたものである、前記分化・誘導
方法を提供する。上記分化・誘導された神経細胞を、さ
らにドーパミン作動性ニューロン、及びアセチルコリン
作動性ニューロンに分化・誘導する方法、並びにこのよ
うにして得られたドーパミン作動性ニューロンを含む、
パーキンソン病治療用医薬組成物をも提供する。
胞を神経細胞及び骨格筋細胞に分化・誘導する方法の提
供。 【解決手段】 本願発明は、骨髄間質細胞をインビトロ
において神経細胞又は骨格筋細胞に分化・誘導する方法
であって、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮ
ｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入することを含
み、ここで、最終的に得られた分化・誘導された細胞
が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグ
ナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質細胞が細胞分
裂した結果として得られたものである、前記分化・誘導
方法を提供する。上記分化・誘導された神経細胞を、さ
らにドーパミン作動性ニューロン、及びアセチルコリン
作動性ニューロンに分化・誘導する方法、並びにこのよ
うにして得られたドーパミン作動性ニューロンを含む、
パーキンソン病治療用医薬組成物をも提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎｏｔｃｈ遺伝子
の導入を含む多段階から成る操作を加えることによって
骨髄間質細胞を神経細胞又は骨格筋細胞にインビトロに
おいて分化・誘導する方法に関する。
の導入を含む多段階から成る操作を加えることによって
骨髄間質細胞を神経細胞又は骨格筋細胞にインビトロに
おいて分化・誘導する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アルツハイマー病、パーキンソン病、Ａ
ＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）などの、病状の進行した神
経変性疾患を対象にする場合、細胞死によって失われた
神経細胞そのものを補充しなくては神経機能再建が実現
しない。神経細胞移植に対して動物実験レベルで試みら
れているとしては胎児及び成体由来の神経幹細胞、ES細
胞又は胎児由来の神経細胞などである。しかしながら、
いずれもヒトヘの応用において大きなハードルがある。
胎児由来の幹細胞又は神経細胞の使用に対しては倫理的
な問題があり、安定した供給性が得られるか不安があ
る。またＥＳ細胞はその多分化能という点において現在
多くの注目を集めているが、やはり倫理問題を大きく含
み、特定の細胞への分化・誘導に対して費用と労力がか
かること、さらに移植後奇形腫を形成する危険性がある
ことなども不安定要素として挙げられる。また成体由来
の神経幹細胞を用いる場合、中枢神経系の極く限られた
中心部分に存在するため開頭して採取しなくてはなら
ず、再生治療と引き換えに受ける患者の危険と負担は多
大なものである。
ＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）などの、病状の進行した神
経変性疾患を対象にする場合、細胞死によって失われた
神経細胞そのものを補充しなくては神経機能再建が実現
しない。神経細胞移植に対して動物実験レベルで試みら
れているとしては胎児及び成体由来の神経幹細胞、ES細
胞又は胎児由来の神経細胞などである。しかしながら、
いずれもヒトヘの応用において大きなハードルがある。
胎児由来の幹細胞又は神経細胞の使用に対しては倫理的
な問題があり、安定した供給性が得られるか不安があ
る。またＥＳ細胞はその多分化能という点において現在
多くの注目を集めているが、やはり倫理問題を大きく含
み、特定の細胞への分化・誘導に対して費用と労力がか
かること、さらに移植後奇形腫を形成する危険性がある
ことなども不安定要素として挙げられる。また成体由来
の神経幹細胞を用いる場合、中枢神経系の極く限られた
中心部分に存在するため開頭して採取しなくてはなら
ず、再生治療と引き換えに受ける患者の危険と負担は多
大なものである。
【０００３】インビトロで中枢神経系幹細胞が分離され
てから約１０年程たつが、今のところ一般に受け入れら
れたプロトコルでは、神経幹細胞を分化させ、機能しう
るドーパミン作動性又はコリン作動性ニューロンを大量
に得ることはできていない（Ｌｏｒｅｎｚ Ｓｔｕｄｅ
ｒ，ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２
月号Ｐ．１１１７（２００１））。
てから約１０年程たつが、今のところ一般に受け入れら
れたプロトコルでは、神経幹細胞を分化させ、機能しう
るドーパミン作動性又はコリン作動性ニューロンを大量
に得ることはできていない（Ｌｏｒｅｎｚ Ｓｔｕｄｅ
ｒ，ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２
月号Ｐ．１１１７（２００１））。
【０００４】また、カルガリー大学（Ｃａｌｇａｒｙ、
カナダ）のワイス・サミュエル、新郷哲郎教授らの研究
グループは、複数のチロシン水酸化酵素誘導因子の混合
液（ＴＨカクテル）をマウス脳内に投与し、ドーパミン
産生神経細胞を高効率で分化・誘導することに成功して
いるようであるが、本願発明におけるように骨髄間質細
胞からドーパミン作動性ニューロン及びコリン作動性ニ
ューロンを分化・誘導した例は全くない。
カナダ）のワイス・サミュエル、新郷哲郎教授らの研究
グループは、複数のチロシン水酸化酵素誘導因子の混合
液（ＴＨカクテル）をマウス脳内に投与し、ドーパミン
産生神経細胞を高効率で分化・誘導することに成功して
いるようであるが、本願発明におけるように骨髄間質細
胞からドーパミン作動性ニューロン及びコリン作動性ニ
ューロンを分化・誘導した例は全くない。
【０００５】運動性ニューロンは、アセチルコリン作動
性であり、この細胞はＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）と
いう難病への適用が考えられる。ＡＬＳは何らかの理由
で脊髄の運動性ニューロンが細胞死に陥り、筋肉を動か
す神経が無くなるために呼吸筋にいたるまで全身の筋肉
を動かすことができなくなり発病２〜３年で死亡に至る
疾患である。現在有効な治療法は無いが、ラットにおい
てＡＬＳモデル動物が作成されつつある。筋ジストロフ
ィーなどの変性性筋肉疾患の多くは進行性であり、やは
り骨格筋細胞の移植が解決となりうる。正常人において
は筋組織に存在する衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃ
ｅｌｌ）が再生能力を持ち失われた骨格筋の補充に働く
が、進行性の筋疾患の場合、細胞数も減少しており再生
能力も低くなっている。したがって骨格筋又はその前駆
細胞の移植が治療となり得るが現在有効な手段は存在し
ない。
性であり、この細胞はＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）と
いう難病への適用が考えられる。ＡＬＳは何らかの理由
で脊髄の運動性ニューロンが細胞死に陥り、筋肉を動か
す神経が無くなるために呼吸筋にいたるまで全身の筋肉
を動かすことができなくなり発病２〜３年で死亡に至る
疾患である。現在有効な治療法は無いが、ラットにおい
てＡＬＳモデル動物が作成されつつある。筋ジストロフ
ィーなどの変性性筋肉疾患の多くは進行性であり、やは
り骨格筋細胞の移植が解決となりうる。正常人において
は筋組織に存在する衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃ
ｅｌｌ）が再生能力を持ち失われた骨格筋の補充に働く
が、進行性の筋疾患の場合、細胞数も減少しており再生
能力も低くなっている。したがって骨格筋又はその前駆
細胞の移植が治療となり得るが現在有効な手段は存在し
ない。
【０００６】脳神経系の発生過程では、比較的均一な神
経前駆細胞（神経幹細胞ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅ
ｌｌ）から、ニューロンやグリア細胞が分化・誘導され
る。前駆細胞群の一部の細胞は分化シグナルに反応して
さるサブタイプの細胞に分化するが、残りの細胞は未分
化のままで留まる機構が存在している。つまり、先に分
化した細胞が周りにあるシグナルを出して自分と同じ細
胞に分化するのを防ぐメカニズムが存在する。これを側
方制御（ｌａｔｅｒａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）とい
う。ショウジョウバエでは先に神経に分化した細胞がＤ
ｅｌｔａというリガンドを発現し、その周りの細胞がＤ
ｅｌｔａの受容体であるＮｏｔｃｈを発現し、それらは
神経細胞にならない（Ｎｏｔｃｈシグナリング）。この
Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ系は、脊椎細胞においても働い
ているようである（例えば、Chitnis, A., Henrique,
D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C.: Natu
re,375, 761-766 (1995)を参照のこと）。
経前駆細胞（神経幹細胞ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅ
ｌｌ）から、ニューロンやグリア細胞が分化・誘導され
る。前駆細胞群の一部の細胞は分化シグナルに反応して
さるサブタイプの細胞に分化するが、残りの細胞は未分
化のままで留まる機構が存在している。つまり、先に分
化した細胞が周りにあるシグナルを出して自分と同じ細
胞に分化するのを防ぐメカニズムが存在する。これを側
方制御（ｌａｔｅｒａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）とい
う。ショウジョウバエでは先に神経に分化した細胞がＤ
ｅｌｔａというリガンドを発現し、その周りの細胞がＤ
ｅｌｔａの受容体であるＮｏｔｃｈを発現し、それらは
神経細胞にならない（Ｎｏｔｃｈシグナリング）。この
Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ系は、脊椎細胞においても働い
ているようである（例えば、Chitnis, A., Henrique,
D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C.: Natu
re,375, 761-766 (1995)を参照のこと）。
【０００７】このように均一なものから多様なものを生
み出す発生過程においては、膜タンパク質Ｎｏｔｃｈを
介した細胞間相互作用が重要な役割を担っていること、
すなわち、Ｎｏｔｃｈは隣接細胞からリガンド刺激を受
けると、Ｍａｓｈ１、Ｍａｔｈ１、ニューロゲニン（Ｎ
ｅｕｒｏｇｅｎｉｎ）に代表されるｂＨＬＨ（ｂａｓｉ
ｃ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ）型神経分化因
子を阻害するＨＥＳ１やＨＥＳ５の発現を誘導すること
により隣接細胞と同じ種類の細胞への分化を抑制すると
考えられている（例えば、影山ら、細胞工学Vol.18, N
o.9, 1301-1306(1999)を参照のこと）。
み出す発生過程においては、膜タンパク質Ｎｏｔｃｈを
介した細胞間相互作用が重要な役割を担っていること、
すなわち、Ｎｏｔｃｈは隣接細胞からリガンド刺激を受
けると、Ｍａｓｈ１、Ｍａｔｈ１、ニューロゲニン（Ｎ
ｅｕｒｏｇｅｎｉｎ）に代表されるｂＨＬＨ（ｂａｓｉ
ｃ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ）型神経分化因
子を阻害するＨＥＳ１やＨＥＳ５の発現を誘導すること
により隣接細胞と同じ種類の細胞への分化を抑制すると
考えられている（例えば、影山ら、細胞工学Vol.18, N
o.9, 1301-1306(1999)を参照のこと）。
【０００８】Ｎｏｔｃｈの細胞内経路は以下のように考
えられている。Ｎｏｔｃｈは、まず隣接細胞の表面に存
在するリガンド（Ｄｅｌｔａ，Ｓｅｒｒａｔｅ，Ｊａｇ
ｇｅｄ）によって活性化されるとその細胞内ドメインが
切り出される（Artavanis-Tsakonas S, et al: Science
(1999) 284: 770-776、及び影山ら、細胞工学Vol.18,
No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこと)。Ｎｏｔｃｈの
細胞内ドメインが切り出された後、核移行シグナル（Ｎ
ＬＳ）によって細胞膜から核に移行して核内でＲＢＰ−
ＪκというＤＮＡ結合タンパク質と複合体を形成する
（Honjo T: GenesCells (1996) 1: 1-9、及び影山ら、
細胞工学Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこ
と）。ＲＢＰ−Ｊκそのものは、ＤＮＡに結合して転写
を抑制するレプレッサーで、Ｎｏｔｃｈが不活性のとき
には分化抑制因子であるＨＥＳ１遺伝子のプロモーター
に結合してその発現を制御しているが、ＲＢＰ−Ｊκと
Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインが複合体を形成すると、こ
の複合体が逆にＨＥＳ１遺伝子の転写を活性化する(jar
riault S, et al: Nature (1995) 377: 355-358、Kagey
ama R, et al: Curr Opin Genet Dev (1997) 7: 659-66
5、及び影山ら、細胞工学Vol.18, No.9, 1301-1306 (19
99)を参照のこと)。その結果、ＨＥＳ１の発現が誘導さ
れ、さらにＨＥＳ１により分化が抑制される。すなわ
ち、ＮｏｔｃｈはＨＥＳ１を介して分化を抑制している
と考えられている（影山ら、細胞工学Vol.18, No.9, 13
01-1306 (1999)を参照のこと)。
えられている。Ｎｏｔｃｈは、まず隣接細胞の表面に存
在するリガンド（Ｄｅｌｔａ，Ｓｅｒｒａｔｅ，Ｊａｇ
ｇｅｄ）によって活性化されるとその細胞内ドメインが
切り出される（Artavanis-Tsakonas S, et al: Science
(1999) 284: 770-776、及び影山ら、細胞工学Vol.18,
No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこと)。Ｎｏｔｃｈの
細胞内ドメインが切り出された後、核移行シグナル（Ｎ
ＬＳ）によって細胞膜から核に移行して核内でＲＢＰ−
ＪκというＤＮＡ結合タンパク質と複合体を形成する
（Honjo T: GenesCells (1996) 1: 1-9、及び影山ら、
細胞工学Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこ
と）。ＲＢＰ−Ｊκそのものは、ＤＮＡに結合して転写
を抑制するレプレッサーで、Ｎｏｔｃｈが不活性のとき
には分化抑制因子であるＨＥＳ１遺伝子のプロモーター
に結合してその発現を制御しているが、ＲＢＰ−Ｊκと
Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインが複合体を形成すると、こ
の複合体が逆にＨＥＳ１遺伝子の転写を活性化する(jar
riault S, et al: Nature (1995) 377: 355-358、Kagey
ama R, et al: Curr Opin Genet Dev (1997) 7: 659-66
5、及び影山ら、細胞工学Vol.18, No.9, 1301-1306 (19
99)を参照のこと)。その結果、ＨＥＳ１の発現が誘導さ
れ、さらにＨＥＳ１により分化が抑制される。すなわ
ち、ＮｏｔｃｈはＨＥＳ１を介して分化を抑制している
と考えられている（影山ら、細胞工学Vol.18, No.9, 13
01-1306 (1999)を参照のこと)。
【０００９】哺乳動物においても、神経前駆細胞（神経
幹細胞）の維持や多様性に富んだニューロンの分化過程
に、Ｎｏｔｃｈを介した遺伝子発現制御が重要であるこ
と、また、Ｎｏｔｃｈ経路は神経系以外の細胞分化にも
必須であることがわかってきている(Tomita K, et al:
Genes Dev (1999) 13: 1203-1210、及び影山ら、細胞工
学Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこと)。さ
らに、ＨＥＳが関わらないＮｏｔｃｈ経路の存在、Ｎｏ
ｔｃｈシグナリングの転写レベルでの負の調節、タンパ
ク質レベルでの負の相互作用の存在なども予想されてい
る（郷 正博、細胞工学Vol.18, No.9, 1291-1300 (199
9)を参照のこと)。しかしながら、上記いずれの文献
も、Ｎｏｔｃｈシグナリングは分化を抑制する方向に働
くということを示唆・教示している。
幹細胞）の維持や多様性に富んだニューロンの分化過程
に、Ｎｏｔｃｈを介した遺伝子発現制御が重要であるこ
と、また、Ｎｏｔｃｈ経路は神経系以外の細胞分化にも
必須であることがわかってきている(Tomita K, et al:
Genes Dev (1999) 13: 1203-1210、及び影山ら、細胞工
学Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999)を参照のこと)。さ
らに、ＨＥＳが関わらないＮｏｔｃｈ経路の存在、Ｎｏ
ｔｃｈシグナリングの転写レベルでの負の調節、タンパ
ク質レベルでの負の相互作用の存在なども予想されてい
る（郷 正博、細胞工学Vol.18, No.9, 1291-1300 (199
9)を参照のこと)。しかしながら、上記いずれの文献
も、Ｎｏｔｃｈシグナリングは分化を抑制する方向に働
くということを示唆・教示している。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】再建が不可能とされて
いる中枢神経疾患は、外傷による脊髄損傷や脳血管障
害、失明に至る緑内症からパーキンソン氏病などの変性
疾患まで実に多種多様の疾患が含まれ、罹患人口は多い
ものと思われる。従ってこれらの疾患に対する神経再生
法の研究は社会的急務であり、我々の研究結果は実際の
人への応用の突破になるものと思われる。骨髄間質細胞
であれば骨髄穿刺によって病院の外来レベルでの採取が
容易であり、非常に旺盛な増殖能を持つので大量培養が
比較的短い時間で可能である。さらに自分の骨髄間質細
胞から神経が作成できれば自家移植が可能であり、これ
は大変大きな利点であると思われる。免疫拒絶反応が起
きないので免疫抑制剤の投与が不必要であり、安全な治
療を与えることが可能と思われる。また、骨髄バンクか
らも骨髄間質細胞を得ることが可能であるため、供給面
からは現実的な対応が可能である。これらの細胞を用い
て現在有効な手段のない神経細胞を誘導することができ
れば再生医学において大きな効果が期待される。
いる中枢神経疾患は、外傷による脊髄損傷や脳血管障
害、失明に至る緑内症からパーキンソン氏病などの変性
疾患まで実に多種多様の疾患が含まれ、罹患人口は多い
ものと思われる。従ってこれらの疾患に対する神経再生
法の研究は社会的急務であり、我々の研究結果は実際の
人への応用の突破になるものと思われる。骨髄間質細胞
であれば骨髄穿刺によって病院の外来レベルでの採取が
容易であり、非常に旺盛な増殖能を持つので大量培養が
比較的短い時間で可能である。さらに自分の骨髄間質細
胞から神経が作成できれば自家移植が可能であり、これ
は大変大きな利点であると思われる。免疫拒絶反応が起
きないので免疫抑制剤の投与が不必要であり、安全な治
療を与えることが可能と思われる。また、骨髄バンクか
らも骨髄間質細胞を得ることが可能であるため、供給面
からは現実的な対応が可能である。これらの細胞を用い
て現在有効な手段のない神経細胞を誘導することができ
れば再生医学において大きな効果が期待される。
【００１１】また、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）は何
らかの理由で脊髄の運動ニューロンが細胞死に陥り、筋
肉を動かす神経が無くなるために呼吸筋にいたるまで全
身の筋肉を動かすことができなくなり発病２〜３年で死
に至る疾患であるが、現在有効な治療法は無い。自分の
骨髄間質細胞からアセチルコリン作動性ニューロンを作
成することができれば自家移植が可能であり、これは大
変大きな利点であり、ＡＬＳの治療法となるかもしれな
い。
らかの理由で脊髄の運動ニューロンが細胞死に陥り、筋
肉を動かす神経が無くなるために呼吸筋にいたるまで全
身の筋肉を動かすことができなくなり発病２〜３年で死
に至る疾患であるが、現在有効な治療法は無い。自分の
骨髄間質細胞からアセチルコリン作動性ニューロンを作
成することができれば自家移植が可能であり、これは大
変大きな利点であり、ＡＬＳの治療法となるかもしれな
い。
【００１２】また、筋疾患、とくに骨格筋の変性疾患で
ある筋ジストロフィーなどに対しては現時点では有効な
治療手段が無い。自分の骨髄間質細胞から骨格筋細胞を
作成することができれば自家移植が可能であり、これは
大変大きな利点であると思われる。これらの細胞を用い
て現在有効な手段のない骨格筋細胞を誘導することがで
きれば再生医学において大きな効果が期待できる。上記
の臨床治療の面だけてはなく、今後開発が予想される人
工臓器などの工学的な方面においても応用が考えられ
る。培養レベルで神経細胞や筋肉細胞が容易に作成でき
ることから、ハイブリッド型の人工臓器などの作成にお
いて使用も考えられる。
ある筋ジストロフィーなどに対しては現時点では有効な
治療手段が無い。自分の骨髄間質細胞から骨格筋細胞を
作成することができれば自家移植が可能であり、これは
大変大きな利点であると思われる。これらの細胞を用い
て現在有効な手段のない骨格筋細胞を誘導することがで
きれば再生医学において大きな効果が期待できる。上記
の臨床治療の面だけてはなく、今後開発が予想される人
工臓器などの工学的な方面においても応用が考えられ
る。培養レベルで神経細胞や筋肉細胞が容易に作成でき
ることから、ハイブリッド型の人工臓器などの作成にお
いて使用も考えられる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】以上の現状を鑑み、比較
的容易に採取できる細胞を用いて人為的操作を加え、神
経細胞や骨格筋などを作成することが出来るかどうか検
討した。発明者らは骨髄間質細胞に対して形態形成の初
期において中心的な役割を果たす遺伝子の導入が骨髄間
質細胞をなんらかの形で刺激し、この刺激が骨髄間質細
胞の分化・誘導に及ぼす影響について調べてみた。すな
わち、特に神経系の発生分化において重要な役割を果た
しており、前駆細胞が神経細胞とグリア細胞とに分かれ
る時点で運命決定に作用しているとされているＮｏｔｃ
ｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング遺伝子を導入する
ことによって骨髄間質細胞をリセット（初期設定）する
ことができるかもしれないと期待した。
的容易に採取できる細胞を用いて人為的操作を加え、神
経細胞や骨格筋などを作成することが出来るかどうか検
討した。発明者らは骨髄間質細胞に対して形態形成の初
期において中心的な役割を果たす遺伝子の導入が骨髄間
質細胞をなんらかの形で刺激し、この刺激が骨髄間質細
胞の分化・誘導に及ぼす影響について調べてみた。すな
わち、特に神経系の発生分化において重要な役割を果た
しており、前駆細胞が神経細胞とグリア細胞とに分かれ
る時点で運命決定に作用しているとされているＮｏｔｃ
ｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング遺伝子を導入する
ことによって骨髄間質細胞をリセット（初期設定）する
ことができるかもしれないと期待した。
【００１４】ここで、重要なことは、Ｎｏｔｃｈ遺伝子
及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が細胞の分化・
誘導を抑制するということは示唆・教示されていたもの
の、以下に詳述するように、Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏ
ｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入を他の分化・誘導
のための刺激と組み合わせることにより、Ｎｏｔｃｈ遺
伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入され
た細胞自体（Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリ
ング関連遺伝子が導入された細胞に接触した細胞ではな
い）が分化・誘導されうるということは全く予想外の出
来事であるということである。本願発明にかかる分化・
誘導方法において、Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシ
グナリング関連遺伝子の導入が骨髄間質細胞の発生・分
化をリセットすることができたと断言することはできな
い。しかしながら、かかる遺伝子導入を他の分化・誘導
ステップと組み合わせることにより、本願発明は、結果
として、骨髄間質細胞を効率よく神経細胞又は骨格筋細
胞に分化・誘導する方法を提供すること可能にしたとい
える。
及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が細胞の分化・
誘導を抑制するということは示唆・教示されていたもの
の、以下に詳述するように、Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏ
ｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入を他の分化・誘導
のための刺激と組み合わせることにより、Ｎｏｔｃｈ遺
伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入され
た細胞自体（Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリ
ング関連遺伝子が導入された細胞に接触した細胞ではな
い）が分化・誘導されうるということは全く予想外の出
来事であるということである。本願発明にかかる分化・
誘導方法において、Ｎｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシ
グナリング関連遺伝子の導入が骨髄間質細胞の発生・分
化をリセットすることができたと断言することはできな
い。しかしながら、かかる遺伝子導入を他の分化・誘導
ステップと組み合わせることにより、本願発明は、結果
として、骨髄間質細胞を効率よく神経細胞又は骨格筋細
胞に分化・誘導する方法を提供すること可能にしたとい
える。
【００１５】今般、本願発明者らは、Ｎｏｔｃｈ遺伝子
及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入を含む複
数ステップの組み合わせ実験を繰返した結果、骨髄間質
細胞をインビトロにおいて神経細胞又は骨格筋細胞に、
効率よく分化・誘導することに初めて成功した。さら
に、かかる分化誘導方法により得られた神経細胞をパー
キンソンモデルラットや、視神経損傷による網膜・視神
経変性モデルラットに移植することにより実際に神経が
生着・機能することを確認し、ここに本願発明を完成す
るに至った。
及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入を含む複
数ステップの組み合わせ実験を繰返した結果、骨髄間質
細胞をインビトロにおいて神経細胞又は骨格筋細胞に、
効率よく分化・誘導することに初めて成功した。さら
に、かかる分化誘導方法により得られた神経細胞をパー
キンソンモデルラットや、視神経損傷による網膜・視神
経変性モデルラットに移植することにより実際に神経が
生着・機能することを確認し、ここに本願発明を完成す
るに至った。
【００１６】驚くべきことに、骨髄間質細胞にＮｏｔｃ
ｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入
し、さらに分化開始における一般的なトリガーと考えら
れている細胞内ｃＡＭＰの上昇及び神経分化に作用する
と考えられている種々の因子・サイトカインを投与する
ことによってインビトロ培養条件において骨髄間質細胞
を神経細胞に分化・誘導することに成功した。神経細胞
に特異的なＭＡＰ−２、神経細線維（Ｎｅｕｒｏｆｉｌ
ａｍｅｎｔ）のみならず、神経伝達物質、及びその合成
酵素であるチロシン・ヒドロキシラーゼ（Ｔｙｒｏｓｉ
ｎｅ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、アセチルコリン（Ａ
ｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ニューロペプチドＹ（Ｎ
ｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ）、サブスタンスＰ（Ｓｕ
ｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）などの発現も確認した。
ｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入
し、さらに分化開始における一般的なトリガーと考えら
れている細胞内ｃＡＭＰの上昇及び神経分化に作用する
と考えられている種々の因子・サイトカインを投与する
ことによってインビトロ培養条件において骨髄間質細胞
を神経細胞に分化・誘導することに成功した。神経細胞
に特異的なＭＡＰ−２、神経細線維（Ｎｅｕｒｏｆｉｌ
ａｍｅｎｔ）のみならず、神経伝達物質、及びその合成
酵素であるチロシン・ヒドロキシラーゼ（Ｔｙｒｏｓｉ
ｎｅ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、アセチルコリン（Ａ
ｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ニューロペプチドＹ（Ｎ
ｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ）、サブスタンスＰ（Ｓｕ
ｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）などの発現も確認した。
【００１７】一方、１個又はごく少数の遺伝子が５−ア
ザシチジン（５−ＡＺＣ）処理によって脱メチル化さ
れ、活性化されることによって筋芽細胞への転換が起こ
ることが示唆されている(Taylar SM, Jones PA: ell 1
7: 771-779, 1979、及び鍋島陽一、生体の科学 47(3):
184-189, 1996を参照のこと）。そこで、我々は、上記
の神経細胞におけるＮｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシ
グナリング関連遺伝子の導入を、上記５−アザシチジン
（５−ＡＺＣ）処理による脱メチル化と組み合わせてみ
た。具体的には、上記脱メチル化剤を用いて遺伝子のメ
チル化による発現抑制を解除することによって骨髄間質
細胞をリセットし、次にＮｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈシグ
ナリング関連遺伝子を導入し、次に上記遺伝子が導入さ
れた細胞を上記遺伝子を導入していない骨髄間質細胞と
ともに共培養し（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）、そして最後
に分化開始における一般的なトリガーと考えられている
細胞内ｃＡＭＰの上昇作用物質で処理することによっ
て、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子
が導入された細胞を、インビトロにおける培養により骨
格筋細胞に分化・誘導することに成功した。得られた細
胞は、特徴的な多核を有する筋管の形成と横紋を認め、
筋肉に特異的なミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ），Ｍｙ
ｆ５の発現もｍＲＮＡレベルで確認した。
ザシチジン（５−ＡＺＣ）処理によって脱メチル化さ
れ、活性化されることによって筋芽細胞への転換が起こ
ることが示唆されている(Taylar SM, Jones PA: ell 1
7: 771-779, 1979、及び鍋島陽一、生体の科学 47(3):
184-189, 1996を参照のこと）。そこで、我々は、上記
の神経細胞におけるＮｏｔｃｈ遺伝子及びＮｏｔｃｈシ
グナリング関連遺伝子の導入を、上記５−アザシチジン
（５−ＡＺＣ）処理による脱メチル化と組み合わせてみ
た。具体的には、上記脱メチル化剤を用いて遺伝子のメ
チル化による発現抑制を解除することによって骨髄間質
細胞をリセットし、次にＮｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈシグ
ナリング関連遺伝子を導入し、次に上記遺伝子が導入さ
れた細胞を上記遺伝子を導入していない骨髄間質細胞と
ともに共培養し（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）、そして最後
に分化開始における一般的なトリガーと考えられている
細胞内ｃＡＭＰの上昇作用物質で処理することによっ
て、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子
が導入された細胞を、インビトロにおける培養により骨
格筋細胞に分化・誘導することに成功した。得られた細
胞は、特徴的な多核を有する筋管の形成と横紋を認め、
筋肉に特異的なミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ），Ｍｙ
ｆ５の発現もｍＲＮＡレベルで確認した。
【００１８】本願発明の１の態様においては、骨髄間質
細胞をインビトロにおいて神経細胞又は骨格筋細胞に分
化・誘導する方法であって、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺
伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導
入することを含み、ここで、最終的に得られた分化・誘
導された細胞が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮ
ｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質
細胞が細胞分裂した結果として得られたものである、前
記分化・誘導方法が提供される。
細胞をインビトロにおいて神経細胞又は骨格筋細胞に分
化・誘導する方法であって、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺
伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導
入することを含み、ここで、最終的に得られた分化・誘
導された細胞が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮ
ｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間質
細胞が細胞分裂した結果として得られたものである、前
記分化・誘導方法が提供される。
【００１９】本願発明の他の態様においては、骨髄間質
細胞をインビトロにおいて神経細胞に分化・誘導する方
法であって、以下のステップ： （１）骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的な
基礎培地に血清を加えた培地中で上記細胞を培養し； （２）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔ
ｃｈシグナリング関連遺伝子を導入し、そしてさらに培
養し；及び （３）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリ
ックＡＭＰアナログ、及び／又は細胞分化生存作用性因
子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養して神経細
胞を得る；を含む、前記分化・誘導方法が提供される。
細胞をインビトロにおいて神経細胞に分化・誘導する方
法であって、以下のステップ： （１）骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的な
基礎培地に血清を加えた培地中で上記細胞を培養し； （２）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔ
ｃｈシグナリング関連遺伝子を導入し、そしてさらに培
養し；及び （３）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリ
ックＡＭＰアナログ、及び／又は細胞分化生存作用性因
子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養して神経細
胞を得る；を含む、前記分化・誘導方法が提供される。
【００２０】前記標準的な基礎培地はイーグルス（Ｅａ
ｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地であり、そして
前記血清はウシ胎児血清であることができる。前記Ｎｏ
ｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング遺伝子
の導入は、哺乳動物発現ベクターを用いたリポフェクシ
ョンによることができる。好ましくは、前記ステップ
（２）と（３）の間に、前記遺伝子が導入された細胞の
選択を所定期間行うステップをさらに含むことができ
る。この選択は、硫酸Ｇ４１８の添加によるネオマイシ
ン耐性に基づく選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）であること
ができる。ここで、重要なことは、この選択が、最終的
に得られた分化・誘導された神経細胞が、上記のＮｏｔ
ｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝
子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として
得られたものであることを保証しているということであ
る。
ｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地であり、そして
前記血清はウシ胎児血清であることができる。前記Ｎｏ
ｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング遺伝子
の導入は、哺乳動物発現ベクターを用いたリポフェクシ
ョンによることができる。好ましくは、前記ステップ
（２）と（３）の間に、前記遺伝子が導入された細胞の
選択を所定期間行うステップをさらに含むことができ
る。この選択は、硫酸Ｇ４１８の添加によるネオマイシ
ン耐性に基づく選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）であること
ができる。ここで、重要なことは、この選択が、最終的
に得られた分化・誘導された神経細胞が、上記のＮｏｔ
ｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝
子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として
得られたものであることを保証しているということであ
る。
【００２１】前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又は
サイクリックＡＭＰアナログは好ましくはフォルスコリ
ン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である。また、前記サイクリ
ックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナロ
グの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであることが
できる。好ましくは、この濃度は、０．５μＭ〜５０μ
Ｍであることができる。前記細胞分化生存作用性因子
は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒ
ｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧ
Ｆ））、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕ
ｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ））、及び
それらの混合物から成る群から選ぶことができる。好ま
しくは、前記細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．０
０１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである。この濃度
は、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであ
ることができる。前記のように分化誘導した神経細胞
を、さらに以下のように処理することにより、ドーパミ
ン作動性ニューロンの割合を高めることができる。本発
明の他の態様においては、前記神経細胞が、ドーパミン
作動性ニューロンであり、かつ、前記ステップ（３）の
後に、以下のステップ： （４）ステップ（３）において得られた神経細胞を、標
準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；及び （５）グリア由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ ｄｅｒｉ
ｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（Ｇ
ＤＮＦ））、及びサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又は
サイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は上記グリア由
来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用性因子を、上記
培養液に添加し、そしてさらに培養して、ドーパミン作
動性ニューロンを得る；をさらに含む、前記分化・誘導
方法が提供される。前記ステップ（４）における標準的
な基礎培地は、イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ
修飾最小必須培地であり、そして前記ステップ（４）に
おける血清はウシ胎児血清であることができる。前記ス
テップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤
又はサイクリックＡＭＰアナログは、フォルスコリン
（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である。前記ステップ（５）に
おけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリッ
クＡＭＰアナログの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μ
Ｍであることができ、そして好ましくは、５００ｎＭ〜
５０μＭであることができる。前記ステップ（５）にお
ける、グリア由来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用
性因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆ
ｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦ
ＧＦ））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄ
ｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（Ｐ
ＤＧＦ−ＡＡ））、及びそれらの混合物から成る群から
選ぶことができる。好ましくは、前記ステップ（５）に
おけるグリア由来神経栄養因子の濃度は、０．００１ｎ
ｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎ
ｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ
／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることができる。前記ス
テップ（５）における、グリア由来神経栄養因子以外の
細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍ
ｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎｇ／ｍ
ｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであることができる。あるいは、
前記のように分化誘導した神経細胞を、さらに以下のよ
うに処理することにより、アセチルコリン作動性ニュー
ロンの割合を高めることができる。本発明の他の態様に
おいては、前記神経細胞が、アセチルコリン作動性ニュ
ーロンであり、かつ、前記ステップ（３）の後に、以下
のステップ： （４）ステップ（３）において得られた神経細胞を、標
準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；及び （５）神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ）（ＮＧＦ）、及びサイクリックＡＭＰ上昇作
用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は上
記神経成長因子以外の細胞分化生存作用性因子を、上記
培養液に添加し、そしてさらに培養して、アセチルコリ
ン作動性ニューロンを得る；をさらに含む、前記分化・
誘導方法が提供される。前記ステップ（４）における標
準的な基礎培地が、イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アル
ファ修飾最小必須培地であり、そして前記ステップ
（４）における血清がウシ胎児血清であることができ
る。前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上
昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログは、フォル
スコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である。前記ステップ
（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサ
イクリックＡＭＰアナログの濃度は、０．００１ｎＭ〜
１００μＭであることができ、そして好ましくは、５０
０ｎＭ〜５０μＭであることができる。前記ステップ
（５）における、神経成長因子以外の細胞分化生存作用
性因子が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆ
ｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂ
ＦＧＦ））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−
ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ
（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、及びそれらの混合物から成る群
から選ぶことができる。好ましくは、前記ステップ
（５）における神経成長因子の濃度は、０．００１ｎｇ
／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎｇ
／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／
ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることができる。前記ステ
ップ（５）における、神経成長因子以外の細胞分化生存
作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μ
ｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎ
ｇ／ｍｌであることができる。
サイクリックＡＭＰアナログは好ましくはフォルスコリ
ン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である。また、前記サイクリ
ックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナロ
グの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであることが
できる。好ましくは、この濃度は、０．５μＭ〜５０μ
Ｍであることができる。前記細胞分化生存作用性因子
は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒ
ｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧ
Ｆ））、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕ
ｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ））、及び
それらの混合物から成る群から選ぶことができる。好ま
しくは、前記細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．０
０１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである。この濃度
は、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであ
ることができる。前記のように分化誘導した神経細胞
を、さらに以下のように処理することにより、ドーパミ
ン作動性ニューロンの割合を高めることができる。本発
明の他の態様においては、前記神経細胞が、ドーパミン
作動性ニューロンであり、かつ、前記ステップ（３）の
後に、以下のステップ： （４）ステップ（３）において得られた神経細胞を、標
準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；及び （５）グリア由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ ｄｅｒｉ
ｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（Ｇ
ＤＮＦ））、及びサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又は
サイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は上記グリア由
来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用性因子を、上記
培養液に添加し、そしてさらに培養して、ドーパミン作
動性ニューロンを得る；をさらに含む、前記分化・誘導
方法が提供される。前記ステップ（４）における標準的
な基礎培地は、イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ
修飾最小必須培地であり、そして前記ステップ（４）に
おける血清はウシ胎児血清であることができる。前記ス
テップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤
又はサイクリックＡＭＰアナログは、フォルスコリン
（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である。前記ステップ（５）に
おけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリッ
クＡＭＰアナログの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μ
Ｍであることができ、そして好ましくは、５００ｎＭ〜
５０μＭであることができる。前記ステップ（５）にお
ける、グリア由来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用
性因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆ
ｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦ
ＧＦ））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄ
ｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（Ｐ
ＤＧＦ−ＡＡ））、及びそれらの混合物から成る群から
選ぶことができる。好ましくは、前記ステップ（５）に
おけるグリア由来神経栄養因子の濃度は、０．００１ｎ
ｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎ
ｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ
／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることができる。前記ス
テップ（５）における、グリア由来神経栄養因子以外の
細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍ
ｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎｇ／ｍ
ｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであることができる。あるいは、
前記のように分化誘導した神経細胞を、さらに以下のよ
うに処理することにより、アセチルコリン作動性ニュー
ロンの割合を高めることができる。本発明の他の態様に
おいては、前記神経細胞が、アセチルコリン作動性ニュ
ーロンであり、かつ、前記ステップ（３）の後に、以下
のステップ： （４）ステップ（３）において得られた神経細胞を、標
準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；及び （５）神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ）（ＮＧＦ）、及びサイクリックＡＭＰ上昇作
用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は上
記神経成長因子以外の細胞分化生存作用性因子を、上記
培養液に添加し、そしてさらに培養して、アセチルコリ
ン作動性ニューロンを得る；をさらに含む、前記分化・
誘導方法が提供される。前記ステップ（４）における標
準的な基礎培地が、イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アル
ファ修飾最小必須培地であり、そして前記ステップ
（４）における血清がウシ胎児血清であることができ
る。前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ上
昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログは、フォル
スコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である。前記ステップ
（５）におけるサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサ
イクリックＡＭＰアナログの濃度は、０．００１ｎＭ〜
１００μＭであることができ、そして好ましくは、５０
０ｎＭ〜５０μＭであることができる。前記ステップ
（５）における、神経成長因子以外の細胞分化生存作用
性因子が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆ
ｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂ
ＦＧＦ））、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−
ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ
（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、及びそれらの混合物から成る群
から選ぶことができる。好ましくは、前記ステップ
（５）における神経成長因子の濃度は、０．００１ｎｇ
／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎｇ
／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／
ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることができる。前記ステ
ップ（５）における、神経成長因子以外の細胞分化生存
作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μ
ｇ／ｍｌであり、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎ
ｇ／ｍｌであることができる。
【００２２】また、本願発明の他の態様においては、骨
髄間質細胞をインビトロにおいて骨格筋細胞に分化・誘
導する方法であって、以下のステップ： （１）骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的な
基礎培地に血清を加えた培地中で上記細胞を培養し； （２）上記培養液に脱メチル化剤を添加し、そしてさら
に培養し； （３）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリ
ックＡＭＰアナログ、及び／又は細胞分化生存作用性因
子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養し； （４）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔ
ｃｈシグナリング関連遺伝子を導入し、そしてさらに培
養し； （５）上記の遺伝子導入された細胞を、遺伝子導入のさ
れていない無処理の上記骨髄間質細胞と接触させなが
ら、これとともに共培養し；及び （６）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリ
ックＡＭＰアナログを上記培養液に添加し、そしてさら
に培養して骨格筋細胞を得る；を含む、前記分化・誘導
方法が提供される。
髄間質細胞をインビトロにおいて骨格筋細胞に分化・誘
導する方法であって、以下のステップ： （１）骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的な
基礎培地に血清を加えた培地中で上記細胞を培養し； （２）上記培養液に脱メチル化剤を添加し、そしてさら
に培養し； （３）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリ
ックＡＭＰアナログ、及び／又は細胞分化生存作用性因
子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養し； （４）上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔ
ｃｈシグナリング関連遺伝子を導入し、そしてさらに培
養し； （５）上記の遺伝子導入された細胞を、遺伝子導入のさ
れていない無処理の上記骨髄間質細胞と接触させなが
ら、これとともに共培養し；及び （６）サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイクリ
ックＡＭＰアナログを上記培養液に添加し、そしてさら
に培養して骨格筋細胞を得る；を含む、前記分化・誘導
方法が提供される。
【００２３】前記標準的な基礎培地はイーグルス（Ｅａ
ｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地であり、そして
前記血清はウシ胎児血清であることができる。前記脱メ
チル化剤は好ましくは５−アザシチジン（５−ａｚａｃ
ｙｔｉｄｉｎｅ）である。前記５−アザシチジンの濃度
は３０ｎｍｏｌ／ｌ〜３００μｍｏｌ／ｌであることが
でき、好ましくは、３００ｎｍｏｌ／ｌ〜３０μｍｏｌ
／ｌであることができる。前記ステップ（３）における
サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭ
Ｐアナログはフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）で
あることができる。前記ステップ（３）におけるサイク
リックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナ
ログの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであること
ができ、そして好ましくは、５００ｎＭ〜５０μＭであ
ることができる。前記細胞分化生存作用性因子が、塩基
性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａ
ｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、血
小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−Ａ
Ａ））、ヘレグリン（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ商標）、及び
それらの混合物から成る群から選ぶことができる。前記
細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍ
ｌ〜１００μｇ／ｍｌであることができ、そして好まし
くは、０．５ｎｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌであることがで
きる。
ｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地であり、そして
前記血清はウシ胎児血清であることができる。前記脱メ
チル化剤は好ましくは５−アザシチジン（５−ａｚａｃ
ｙｔｉｄｉｎｅ）である。前記５−アザシチジンの濃度
は３０ｎｍｏｌ／ｌ〜３００μｍｏｌ／ｌであることが
でき、好ましくは、３００ｎｍｏｌ／ｌ〜３０μｍｏｌ
／ｌであることができる。前記ステップ（３）における
サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭ
Ｐアナログはフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）で
あることができる。前記ステップ（３）におけるサイク
リックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナ
ログの濃度は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであること
ができ、そして好ましくは、５００ｎＭ〜５０μＭであ
ることができる。前記細胞分化生存作用性因子が、塩基
性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａ
ｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、血
小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−Ａ
Ａ））、ヘレグリン（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ商標）、及び
それらの混合物から成る群から選ぶことができる。前記
細胞分化生存作用性因子の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍ
ｌ〜１００μｇ／ｍｌであることができ、そして好まし
くは、０．５ｎｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌであることがで
きる。
【００２４】前記Ｎｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃ
ｈシグナリング関連遺伝子の導入は哺乳動物発現ベクタ
ーを用いたリポフェクションによるものであることがで
きる。好ましくは、前記ステップ（４）と（５）の間
に、前記遺伝子が導入された細胞の選択を所定期間行う
ステップをさらに含むことがきる。この選択は、硫酸Ｇ
４１８の添加によるネオマイシン耐性に基づく選択（ｓ
ｅｌｅｃｔｉｏｎ）であることができる。ここで、重要
なことは、この選択が、最終的に得られた分化・誘導さ
れた骨格筋細胞が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又は
Ｎｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間
質細胞が細胞分裂した結果として得られたものであるこ
とを保証しているということである。
ｈシグナリング関連遺伝子の導入は哺乳動物発現ベクタ
ーを用いたリポフェクションによるものであることがで
きる。好ましくは、前記ステップ（４）と（５）の間
に、前記遺伝子が導入された細胞の選択を所定期間行う
ステップをさらに含むことがきる。この選択は、硫酸Ｇ
４１８の添加によるネオマイシン耐性に基づく選択（ｓ
ｅｌｅｃｔｉｏｎ）であることができる。ここで、重要
なことは、この選択が、最終的に得られた分化・誘導さ
れた骨格筋細胞が、上記のＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又は
Ｎｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子が導入された骨髄間
質細胞が細胞分裂した結果として得られたものであるこ
とを保証しているということである。
【００２５】前記ステップ（５）におけるサイクリック
ＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログは
フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）であることがで
きる。前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ
上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度
は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであることができ、そ
して好ましくは５００ｎＭ〜５μＭであることができ
る。本発明のさらに他の態様においては、前記分化・誘
導方法を用いて製造されたドーパミン作動性ニューロン
が提供される。本発明のさらに他の態様においては、前
記ドーパミン作動性ニューロンを含む、パーキンソン病
治療用医薬組成物が提供される。本願明細書中、用語
「骨髄間質細胞」とは、骨髄中に存在する造血系以外の
細胞をいい、骨、軟骨、脂肪細胞等の細胞に分化できる
と考えられている。骨髄間質細胞は、Ｔｈｙ１，２が
＋、β１−インテグリンが＋、及びＣＤ３４が−により
識別しうる。
ＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログは
フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）であることがで
きる。前記ステップ（５）におけるサイクリックＡＭＰ
上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度
は、０．００１ｎＭ〜１００μＭであることができ、そ
して好ましくは５００ｎＭ〜５μＭであることができ
る。本発明のさらに他の態様においては、前記分化・誘
導方法を用いて製造されたドーパミン作動性ニューロン
が提供される。本発明のさらに他の態様においては、前
記ドーパミン作動性ニューロンを含む、パーキンソン病
治療用医薬組成物が提供される。本願明細書中、用語
「骨髄間質細胞」とは、骨髄中に存在する造血系以外の
細胞をいい、骨、軟骨、脂肪細胞等の細胞に分化できる
と考えられている。骨髄間質細胞は、Ｔｈｙ１，２が
＋、β１−インテグリンが＋、及びＣＤ３４が−により
識別しうる。
【００２６】本願明細書中に使用するとき、分化誘導に
おいて用語「効率よく」とは、本願発明に係る分化・誘
導方法により、前記選択後の骨髄間質細胞が、最終に神
経細胞又は骨格筋細胞に変換される割合が高いことをい
う。本願発明に係る分化・誘導方法においては、この効
率は、５０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ま
しくは９０％以上、そして最も好ましくは９５％以上で
ある。
おいて用語「効率よく」とは、本願発明に係る分化・誘
導方法により、前記選択後の骨髄間質細胞が、最終に神
経細胞又は骨格筋細胞に変換される割合が高いことをい
う。本願発明に係る分化・誘導方法においては、この効
率は、５０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ま
しくは９０％以上、そして最も好ましくは９５％以上で
ある。
【００２７】本願明細書中、用語「神経細胞」とは、ニ
ューロン（ｎｅｕｒｏｎ）のことをいい、形態学的に
は、細胞体と２種類の突起（樹状突起と軸索）を特徴と
し、そして生化学的にはＭＡＰ−２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ
ＡＢ１５１）、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，８１４３４２）、
及びｎｅｓｔｉｎ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＢＭＳ４
３５３）に対する抗体と反応するものをいう。また、神
経伝達物質、及びその合成酵素である、例えば、チロシ
ン・ヒドロキシラーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｌａｓｅ），小胞アセチルコリン・トランスポータ
ー（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ），ニューロペプチドＹ（Ｎ
ｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ），サブスタンスＰ（Ｓｕ
ｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）等を分泌することを特徴とする。
ここで、上記チロシン・ヒドロキシラーゼは、ドーパミ
ン作動性ニューロンの指標であり、そして小胞アセチル
コリン・トランスポーターは、運動性ニューロンに代表
されるアセチルコリン作動性ニューロンの指標である。
ューロン（ｎｅｕｒｏｎ）のことをいい、形態学的に
は、細胞体と２種類の突起（樹状突起と軸索）を特徴と
し、そして生化学的にはＭＡＰ−２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ
ＡＢ１５１）、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，８１４３４２）、
及びｎｅｓｔｉｎ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＢＭＳ４
３５３）に対する抗体と反応するものをいう。また、神
経伝達物質、及びその合成酵素である、例えば、チロシ
ン・ヒドロキシラーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｌａｓｅ），小胞アセチルコリン・トランスポータ
ー（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ），ニューロペプチドＹ（Ｎ
ｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ），サブスタンスＰ（Ｓｕ
ｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）等を分泌することを特徴とする。
ここで、上記チロシン・ヒドロキシラーゼは、ドーパミ
ン作動性ニューロンの指標であり、そして小胞アセチル
コリン・トランスポーターは、運動性ニューロンに代表
されるアセチルコリン作動性ニューロンの指標である。
【００２８】本願明細書中、用語「グリア細胞」とは、
中枢神経において、ニューロンとその突起の間を埋めて
いるアストロサイト、オリゴデンドロサイト、マイクロ
グリアと上皮細胞をいう。ここで、グリアル・フィブリ
ラー酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒ
ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ））は、ア
ストロサイトの指標であり、そして、Ｏ４は、オリゴデ
ンドロサイトの指標である。
中枢神経において、ニューロンとその突起の間を埋めて
いるアストロサイト、オリゴデンドロサイト、マイクロ
グリアと上皮細胞をいう。ここで、グリアル・フィブリ
ラー酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒ
ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ））は、ア
ストロサイトの指標であり、そして、Ｏ４は、オリゴデ
ンドロサイトの指標である。
【００２９】本願明細書中、用語「骨格筋細胞」とは、
筋線維又は筋肉線維のことをいい、骨格筋の単一筋細胞
である。形態学的には、細長い巨大な多核であり、筋管
の形成と横紋があり、そして生化学的にはミオゲニン
（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）Ｍｙｆ５などの転子制御因子の発
現を特徴とする。
筋線維又は筋肉線維のことをいい、骨格筋の単一筋細胞
である。形態学的には、細長い巨大な多核であり、筋管
の形成と横紋があり、そして生化学的にはミオゲニン
（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）Ｍｙｆ５などの転子制御因子の発
現を特徴とする。
【００３０】本願発明に係る骨髄間質細胞をインビトロ
において神経細胞又は骨格筋細胞に分化・誘導する方法
は、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃ
ｈシグナリング関連遺伝子を導入するステップを含む点
で新規である。さらに、新規のステップを従来技術の他
の分化・誘導ステップと一定の順序で組み合わせる点に
おいても新規である。本願発明における上記ステップの
選択及び最適な組み合わせは、本願発明者らにより初め
て発見された意義はひじょうに高いといえる。なぜな
ら、骨髄間質細胞が、骨芽細胞、血管内皮細胞、骨格筋
細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞等に分化誘導される可能性
がある間葉系の幹細胞又は前駆細胞であることは判って
いたとしても、骨髄間質細胞を、実際に、神経胞又は骨
格筋細胞に分化させることができるかどうかについては
知られておらず、かつ、切望されていたにも拘らず未だ
かつて誰も実際にこれに成功した者はいなかったからで
ある。いずれの理論に拘束されることを望まないが、本
願発明者らは、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又
はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入すること
が、細胞の発生・分化をリセットするように機能し、そ
して他の分化・誘導処理の働きを助けると推定する。
において神経細胞又は骨格筋細胞に分化・誘導する方法
は、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃ
ｈシグナリング関連遺伝子を導入するステップを含む点
で新規である。さらに、新規のステップを従来技術の他
の分化・誘導ステップと一定の順序で組み合わせる点に
おいても新規である。本願発明における上記ステップの
選択及び最適な組み合わせは、本願発明者らにより初め
て発見された意義はひじょうに高いといえる。なぜな
ら、骨髄間質細胞が、骨芽細胞、血管内皮細胞、骨格筋
細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞等に分化誘導される可能性
がある間葉系の幹細胞又は前駆細胞であることは判って
いたとしても、骨髄間質細胞を、実際に、神経胞又は骨
格筋細胞に分化させることができるかどうかについては
知られておらず、かつ、切望されていたにも拘らず未だ
かつて誰も実際にこれに成功した者はいなかったからで
ある。いずれの理論に拘束されることを望まないが、本
願発明者らは、上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又
はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入すること
が、細胞の発生・分化をリセットするように機能し、そ
して他の分化・誘導処理の働きを助けると推定する。
【００３１】以下の実施例により、本願発明をさらに詳
細に説明する。但し、本願発明の範囲を何ら限定するも
のと解してはならない。
細に説明する。但し、本願発明の範囲を何ら限定するも
のと解してはならない。
【００３２】
【実施例】実施例１：神経誘導
成体ラット（Ｗｉｓｔｅｒ種）の骨髄より間質細胞を採
取し培養する。培地はＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉ
ａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ ＥａｇｌｅＭｏｄｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に２０
％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４
−５０１Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたものを
用いた。４代まで継代培養し、８０−９０％の集密（ｃ
ｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達した時点でＮｏｔｃｈ細胞内
ドメインの遺伝子を導入した。これはＰｒｏｍｅｇａ
社、ｐＣＩ−ｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（＃Ｅ１８４
１）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩマルチクローニング部位
に、３．１ｋｂのＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのＥｃｏＲ
Ｉ−ＸｂａＩ断片を挿入し組み換えたものであった。導
入には、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｇｉｂ
ｃｏＢＲＬ，１１６６８−０２７）のシステムを用い
た。
取し培養する。培地はＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉ
ａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ ＥａｇｌｅＭｏｄｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に２０
％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４
−５０１Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたものを
用いた。４代まで継代培養し、８０−９０％の集密（ｃ
ｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達した時点でＮｏｔｃｈ細胞内
ドメインの遺伝子を導入した。これはＰｒｏｍｅｇａ
社、ｐＣＩ−ｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（＃Ｅ１８４
１）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩマルチクローニング部位
に、３．１ｋｂのＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのＥｃｏＲ
Ｉ−ＸｂａＩ断片を挿入し組み換えたものであった。導
入には、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｇｉｂ
ｃｏＢＲＬ，１１６６８−０２７）のシステムを用い
た。
【００３３】導入の翌日にＧ４１８ｓｕｌｆａｔｅ（Ｇ
ｉｂｃｏＢＲＬ，８３−５０２７）を２００ｎｇ／ｍｌ
の濃度で添加し導入細胞の選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）
を１０日間行った。細胞数が９０％集密を回復した後、
Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎｅ ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ，３４４２７３）、ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓ
ｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐ
ｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ）、
ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔ
ｏｒ５０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，５５７
−ＮＴ）を添加した。
ｉｂｃｏＢＲＬ，８３−５０２７）を２００ｎｇ／ｍｌ
の濃度で添加し導入細胞の選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）
を１０日間行った。細胞数が９０％集密を回復した後、
Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎｅ ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ，３４４２７３）、ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓ
ｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐ
ｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ）、
ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔ
ｏｒ５０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，５５７
−ＮＴ）を添加した。
【００３４】１０日程たって細胞を解析した結果、図１
に示すように、神経細胞に特徴的な形態が観察された。
誘導された細胞は、図２に示すように、以下の抗体、Ｍ
ＡＰ−２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＭＡＢ３６４）、ｎｅｕ
ｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ，８１４３４２）、ｎｅｓｔｉｎ（Ｂｉｏｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ，ＢＭＳ４３５３）に対して陽性反応を
示した。ＭＡＰ−２とｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔは神
経細胞の、ｎｅｓｔｉｎは神経前駆細胞のマーカーであ
るため、誘導された細胞は神経細胞としての性質を持つ
ものと判断できる。
に示すように、神経細胞に特徴的な形態が観察された。
誘導された細胞は、図２に示すように、以下の抗体、Ｍ
ＡＰ−２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＭＡＢ３６４）、ｎｅｕ
ｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ，８１４３４２）、ｎｅｓｔｉｎ（Ｂｉｏｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ，ＢＭＳ４３５３）に対して陽性反応を
示した。ＭＡＰ−２とｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔは神
経細胞の、ｎｅｓｔｉｎは神経前駆細胞のマーカーであ
るため、誘導された細胞は神経細胞としての性質を持つ
ものと判断できる。
【００３５】また、図３に示すように、神経伝達物質、
及びその合成酵素であるＴｙｒｏｓｉｎｅ−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｌａｓｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１５１）、Ｖｅ
ｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａ
ｎｓｐｏｒｔｅｒ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１５７
８）、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ（Ｐｅｎｉｎｓｕ
ｌａ Ｌａｂ ＩＮＣ，ＲＩＮ７１７２）、Ｓｕｂｓｔ
ａｎｃｅ Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＩＮＣ，ＲＰＮ１５
７２）等の抗体を用いて検索したところ、それぞれ２〜
４％前後の陽性細胞を認めたため、神経伝達物質を持つ
神経細胞も存在することが分かった。
及びその合成酵素であるＴｙｒｏｓｉｎｅ−ｈｙｄｒｏ
ｘｙｌａｓｅ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１５１）、Ｖｅ
ｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａ
ｎｓｐｏｒｔｅｒ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ１５７
８）、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ（Ｐｅｎｉｎｓｕ
ｌａ Ｌａｂ ＩＮＣ，ＲＩＮ７１７２）、Ｓｕｂｓｔ
ａｎｃｅ Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＩＮＣ，ＲＰＮ１５
７２）等の抗体を用いて検索したところ、それぞれ２〜
４％前後の陽性細胞を認めたため、神経伝達物質を持つ
神経細胞も存在することが分かった。
【００３６】上記操作によって神経細胞が誘導される
が、この段階では、図５のグラフの左側に示すように、
ドーパミン作動性ニューロンの指標であるチロシン・ヒ
ドロキシラーゼに対して反応する分化誘導された神経細
胞は、全神経細胞の２．９±０．５％であった。また、
図７のグラフの左側に示すように、運動ニューロンに代
表されるアセチルコリン作動性ニューロンの指標である
Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔ
ｒａｎｓｐｏｒｔｅｒに対して反応する分化誘導された
神経細胞は、全神経細胞の１．７８±０．７５％であっ
た。
が、この段階では、図５のグラフの左側に示すように、
ドーパミン作動性ニューロンの指標であるチロシン・ヒ
ドロキシラーゼに対して反応する分化誘導された神経細
胞は、全神経細胞の２．９±０．５％であった。また、
図７のグラフの左側に示すように、運動ニューロンに代
表されるアセチルコリン作動性ニューロンの指標である
Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔ
ｒａｎｓｐｏｒｔｅｒに対して反応する分化誘導された
神経細胞は、全神経細胞の１．７８±０．７５％であっ
た。
【００３７】実施例２：ドーパミン作動性ニューロンの
誘導 上記の分化・誘導された神経細胞を、以下の培地中でさ
らに培養する。培地は、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔ
ｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ Ａｌｐｈａ Ｍｏ
ｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に
１０％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、
１４−５０１Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたも
のであり、さらに、グリア由来神経栄養因子（Ｇｌｉａ
ｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａ
ｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ ＬＴ
Ｄ，ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＧＤＮＦ，
＃４５０−１０）５０ｎｇ／ｍｌ，Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ
５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７３），ｂ
ａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈｆａｃ
ｔｏｒ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ，
ＬＴＤ，１００−１８Ｂ），Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒ
ｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ ５ｎｇ
／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ ＬＴＤ，３９６−
ＨＢ）を添加したものであった。かかる操作により、チ
ロシン・ヒドロキシラーゼに対して反応するドーパミン
作動性ニューロンは、全神経細胞に対して、１７．２±
５．１％まで劇的に上昇した（図５のグラフの右側参
照）。図４の写真に示すように、ＧＤＮＦ投与後に、Ｆ
ＩＰＣ（ ）で緑に染色さ
れるタンパク質チロシン・ヒドロキシラーゼの割合が劇
的に上昇した。
誘導 上記の分化・誘導された神経細胞を、以下の培地中でさ
らに培養する。培地は、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔ
ｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ Ａｌｐｈａ Ｍｏ
ｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に
１０％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、
１４−５０１Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたも
のであり、さらに、グリア由来神経栄養因子（Ｇｌｉａ
ｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａ
ｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ ＬＴ
Ｄ，ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＧＤＮＦ，
＃４５０−１０）５０ｎｇ／ｍｌ，Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ
５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７３），ｂ
ａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈｆａｃ
ｔｏｒ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ，
ＬＴＤ，１００−１８Ｂ），Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒ
ｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ ５ｎｇ
／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ ＬＴＤ，３９６−
ＨＢ）を添加したものであった。かかる操作により、チ
ロシン・ヒドロキシラーゼに対して反応するドーパミン
作動性ニューロンは、全神経細胞に対して、１７．２±
５．１％まで劇的に上昇した（図５のグラフの右側参
照）。図４の写真に示すように、ＧＤＮＦ投与後に、Ｆ
ＩＰＣ（ ）で緑に染色さ
れるタンパク質チロシン・ヒドロキシラーゼの割合が劇
的に上昇した。
【００３８】実施例３：アセチルコリン作動性ニューロ
ンの誘導 実施例１において分化・誘導された神経細胞を、以下の
培地中でさらに培養する。培地は、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅ
ｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ ＡｌｐｈａＭｏｄｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に１０
％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４
−５０１Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたもので
あり、さらに、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ）（２．５Ｓ ＮＧＦ，Ｔａｋａｒ
ａ，＃ Ｔ００２Ａ）５０ｎｇ／ｍｌ，Ｆｏｒｓｋｏｌ
ｉｎ ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７
３），ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ
ｈ ＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ），Ｐｌａｔｅｌｅ
ｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ａ
Ａ ５ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ ＬＴ
Ｄ，３９６−ＨＢ）を添加したものであった。かかる操
作により、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌ
ｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒに対して反応するアセ
チルコリン作動性ニューロンは、全神経細胞に対して、
２０．５±０．０５％まで劇的に上昇した（図７のグラ
フの右側参照）。図６の写真に示すように、ＮＧＦ（Ｎ
ｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴｓ））投与後に、ＦＩＰ
Ｃで緑に染色されるタンパク質Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａ
ｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒの
割合が劇的に上昇した。
ンの誘導 実施例１において分化・誘導された神経細胞を、以下の
培地中でさらに培養する。培地は、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅ
ｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ ＡｌｐｈａＭｏｄｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に１０
％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４
−５０１Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたもので
あり、さらに、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ）（２．５Ｓ ＮＧＦ，Ｔａｋａｒ
ａ，＃ Ｔ００２Ａ）５０ｎｇ／ｍｌ，Ｆｏｒｓｋｏｌ
ｉｎ ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７
３），ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔ
ｈ ｆａｃｔｏｒ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ
ｈ ＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ），Ｐｌａｔｅｌｅ
ｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ａ
Ａ ５ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ ＬＴ
Ｄ，３９６−ＨＢ）を添加したものであった。かかる操
作により、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌ
ｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒに対して反応するアセ
チルコリン作動性ニューロンは、全神経細胞に対して、
２０．５±０．０５％まで劇的に上昇した（図７のグラ
フの右側参照）。図６の写真に示すように、ＮＧＦ（Ｎ
ｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴｓ））投与後に、ＦＩＰ
Ｃで緑に染色されるタンパク質Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａ
ｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒの
割合が劇的に上昇した。
【００３９】実施例４：骨格筋誘導
成体ラット（Ｗｉｓｔｅｒ種)の骨髄より間質細胞を採
取し培養する。培地はＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉ
ａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に２０％のウシ胎
児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４−５０１
Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたものを用いた。
４代まで継代培養し、８０−９０％の集密に達した時点
で５−アザシチジン（５−Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）を
３μｍｏｌ／ｌを添加し、２４時間培養した。その後、
Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎｅ ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ，３４４２７３）、ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓ
ｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐ
ｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ）、
Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆ
ａｃｔｏｒ−ＡＡ ５ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ
ＥＣ ＬＴＤ，３９６−ＨＢ）、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ
２００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，３９６−
ＨＢ）を培地に添加したものに切り替えて７日間培養し
た。その後、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの遺伝子を実施
例１におけるのと同様に導入した。
取し培養する。培地はＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉ
ａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ４５２６）に２０％のウシ胎
児血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４−５０１
Ｆ，Ｌｏｔ＃６１−１０１２）を加えたものを用いた。
４代まで継代培養し、８０−９０％の集密に達した時点
で５−アザシチジン（５−Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）を
３μｍｏｌ／ｌを添加し、２４時間培養した。その後、
Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎｅ ５μＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ，３４４２７３）、ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓ
ｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｐ
ｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ，ＬＴＤ，１００−１８Ｂ）、
Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆ
ａｃｔｏｒ−ＡＡ ５ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ
ＥＣ ＬＴＤ，３９６−ＨＢ）、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ
２００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，３９６−
ＨＢ）を培地に添加したものに切り替えて７日間培養し
た。その後、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの遺伝子を実施
例１におけるのと同様に導入した。
【００４０】導入の翌日にＧ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ
（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，８３−５０２７）を２００ｎｇ／
ｍｌの濃度で添加し導入細胞の選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏ
ｎ）を１０日間行った。細胞数がほぼ１００％の集密を
回復した後、上記遺伝子の導入されていない無処理の骨
髄間質細胞を培地に加えてこれとともに共培養（ｃｏ−
ｃｕｌｔｕｒｅ）した。３日後、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７３）５μＭを添加
した。数日後に、細胞が融合し多核の骨格筋細胞が局所
的に出現し（図８参照）、そして経時的に増加した(図
９参照）。図１０に見られるように、多核の骨格筋細胞
が共焦点レーザー顕微鏡において観察された。これらの
細胞ではｍｙｏｇｅｎｉｎ及びＭｙｆ５のｍＲＮＡの発
現がＲＴ−ＰＣＲにおいて確認された。また電子顕微鏡
観察により、骨格筋に特徴的な筋線維が認められた。
（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，８３−５０２７）を２００ｎｇ／
ｍｌの濃度で添加し導入細胞の選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏ
ｎ）を１０日間行った。細胞数がほぼ１００％の集密を
回復した後、上記遺伝子の導入されていない無処理の骨
髄間質細胞を培地に加えてこれとともに共培養（ｃｏ−
ｃｕｌｔｕｒｅ）した。３日後、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，３４４２７３）５μＭを添加
した。数日後に、細胞が融合し多核の骨格筋細胞が局所
的に出現し（図８参照）、そして経時的に増加した(図
９参照）。図１０に見られるように、多核の骨格筋細胞
が共焦点レーザー顕微鏡において観察された。これらの
細胞ではｍｙｏｇｅｎｉｎ及びＭｙｆ５のｍＲＮＡの発
現がＲＴ−ＰＣＲにおいて確認された。また電子顕微鏡
観察により、骨格筋に特徴的な筋線維が認められた。
【００４１】実施例５：ラットのパーキンソン病モデル
を用いた、本願発明に係る分化・誘導方法により得られ
たドーパミン作動性ニューロンの、線状体への移植によ
る治療効果 本願発明に係る分化・誘導方法により得られたドーパミ
ン作動性ニューロンを、ラットのパーキンソンモデルに
適用して移植の効果を検討した。ラットの脳の黒質に６
−ＯＨＤＡ（６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ）を
注入することによってパーキンソンモデルを作成する方
法はすでに確立されており、今回もそのモデルを用いた
（例えば、Ｓｖｅｎｄｓｅｎら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．１３７：３７６−３８８（１９９６）；Ｓｖｅｎｓ
ｅｎら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４８，１３５−１４
６（１９９７））。このモデルにおいてはアポモルフィ
ンを投与することによってラットが回転運動することが
判っており、この回転数が増加すれば症状の悪化を、減
少すれば改善を示唆する。図１１の上段に示すように、
９週間の観察期間では、神経細胞に誘導しただけのもの
を線状体に移植した場合、回転数は移植直後とほぼ横ば
いであった。何も処置を施さない場合、回転数はどんど
ん増加する傾向にあるため（図示せず）、横ばいという
ことは少なくとも悪化を防いでいる、と言える。図１１
の下段に示すように、ドーパミン作動性の誘導をかけた
ものを線状体に移植した場合、移植１週目より回転数が
減少しはじめ、約半数の動物で、９週後に回転数がゼ
ロ、又は１〜２回という非常に顕著な改善を認めるに至
った。（尚、図１１の下段に示す９週後に８回転数／分
を超える２つのケースは、移植操作に失敗したものと考
えられるので評価から除外した。） 線状体に注入（移植）された本願発明に係るドーパミン
作動性ニューロンが、どのような細胞に分化したかを調
べるために、１０週後に、上記線状体組織を採取し、そ
の切片を作成して免疫組織化学的検査を実施した。骨髄
間質細胞は、レトロウイルスにより、緑色蛍光を発する
グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）を
産生する遺伝子をその染色体内に組込んである。したが
って、図１２中の免疫蛍光写真において、骨髄間質細胞
から分化誘導された神経細胞、それ故、線状体に移植さ
れたドーパミン作動性ニューロンは、緑色の蛍光を発し
ている。一方、神経細胞をＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ
を指標として、ドーパミン作動性ニューロンをチロシン
・ヒドロキシラーゼを指標として、グリア細胞であるア
ストロサイトをＧＦＡＰを指標として、そして同じくグ
リア細胞であるオリゴデンドロサイトをＯ４を指標とし
て、それぞれ、赤色で発色させた。したがって、上記Ｇ
ＦＰによる緑色と、上記赤色による発色が重なれば、黄
色に発色することになり、これは、移植されたドーパミ
ン作動性ニューロンが、移植から１０週後にどの細胞に
なっていたかを表すことになる。図１２に見られるよう
に、移植から１０週後の線状体においては、移植された
細胞はほぼ全てが神経細胞になっており、グリア細胞に
はなっていなかった。また、チロシン・ヒドロキシラー
ゼ陽性の神経細胞（すなわち、ドーパミン作動性ニュー
ロン）が相当数にのぼっていることから、インビトロに
おける本願発明に係る分化・誘導方法によってドーパミ
ン作動性ニューロンの全神経細胞に対する割合を、１
７．２±５．１％まで高めることができたけれども、上
記移植によって、この割合をさらに高めることができた
ことが分かる。図１３に、チロシン・ヒドロキシラーゼ
を発色させた免疫蛍光写真を拡大したものを示す。図１
３中、細胞の核を、細胞種を問わず、青色で染色した
（Ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｔａｉｎ）。青色で表される核の
位置が、細胞の位置を示す。以上により、ラットのパー
キンソン病モデルにおいて、本願発明に係る分化・誘導
方法によって得られたドーパミン作動性ニューロンを、
線状体に移植することにより、パーキンソン病の症状を
劇的に改善することが認められた。
を用いた、本願発明に係る分化・誘導方法により得られ
たドーパミン作動性ニューロンの、線状体への移植によ
る治療効果 本願発明に係る分化・誘導方法により得られたドーパミ
ン作動性ニューロンを、ラットのパーキンソンモデルに
適用して移植の効果を検討した。ラットの脳の黒質に６
−ＯＨＤＡ（６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ）を
注入することによってパーキンソンモデルを作成する方
法はすでに確立されており、今回もそのモデルを用いた
（例えば、Ｓｖｅｎｄｓｅｎら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏ
ｌ．１３７：３７６−３８８（１９９６）；Ｓｖｅｎｓ
ｅｎら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４８，１３５−１４
６（１９９７））。このモデルにおいてはアポモルフィ
ンを投与することによってラットが回転運動することが
判っており、この回転数が増加すれば症状の悪化を、減
少すれば改善を示唆する。図１１の上段に示すように、
９週間の観察期間では、神経細胞に誘導しただけのもの
を線状体に移植した場合、回転数は移植直後とほぼ横ば
いであった。何も処置を施さない場合、回転数はどんど
ん増加する傾向にあるため（図示せず）、横ばいという
ことは少なくとも悪化を防いでいる、と言える。図１１
の下段に示すように、ドーパミン作動性の誘導をかけた
ものを線状体に移植した場合、移植１週目より回転数が
減少しはじめ、約半数の動物で、９週後に回転数がゼ
ロ、又は１〜２回という非常に顕著な改善を認めるに至
った。（尚、図１１の下段に示す９週後に８回転数／分
を超える２つのケースは、移植操作に失敗したものと考
えられるので評価から除外した。） 線状体に注入（移植）された本願発明に係るドーパミン
作動性ニューロンが、どのような細胞に分化したかを調
べるために、１０週後に、上記線状体組織を採取し、そ
の切片を作成して免疫組織化学的検査を実施した。骨髄
間質細胞は、レトロウイルスにより、緑色蛍光を発する
グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）を
産生する遺伝子をその染色体内に組込んである。したが
って、図１２中の免疫蛍光写真において、骨髄間質細胞
から分化誘導された神経細胞、それ故、線状体に移植さ
れたドーパミン作動性ニューロンは、緑色の蛍光を発し
ている。一方、神経細胞をＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ
を指標として、ドーパミン作動性ニューロンをチロシン
・ヒドロキシラーゼを指標として、グリア細胞であるア
ストロサイトをＧＦＡＰを指標として、そして同じくグ
リア細胞であるオリゴデンドロサイトをＯ４を指標とし
て、それぞれ、赤色で発色させた。したがって、上記Ｇ
ＦＰによる緑色と、上記赤色による発色が重なれば、黄
色に発色することになり、これは、移植されたドーパミ
ン作動性ニューロンが、移植から１０週後にどの細胞に
なっていたかを表すことになる。図１２に見られるよう
に、移植から１０週後の線状体においては、移植された
細胞はほぼ全てが神経細胞になっており、グリア細胞に
はなっていなかった。また、チロシン・ヒドロキシラー
ゼ陽性の神経細胞（すなわち、ドーパミン作動性ニュー
ロン）が相当数にのぼっていることから、インビトロに
おける本願発明に係る分化・誘導方法によってドーパミ
ン作動性ニューロンの全神経細胞に対する割合を、１
７．２±５．１％まで高めることができたけれども、上
記移植によって、この割合をさらに高めることができた
ことが分かる。図１３に、チロシン・ヒドロキシラーゼ
を発色させた免疫蛍光写真を拡大したものを示す。図１
３中、細胞の核を、細胞種を問わず、青色で染色した
（Ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｔａｉｎ）。青色で表される核の
位置が、細胞の位置を示す。以上により、ラットのパー
キンソン病モデルにおいて、本願発明に係る分化・誘導
方法によって得られたドーパミン作動性ニューロンを、
線状体に移植することにより、パーキンソン病の症状を
劇的に改善することが認められた。
【図１】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞
の、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕微鏡像）であ
る。
の、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕微鏡像）であ
る。
【図２】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞
の、ＭＡＰ−２抗体、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ抗
体、及びｎｅｓｔｉｎ抗体に対する陽性反応を示す、図
面に代わる免疫蛍光写真である。
の、ＭＡＰ−２抗体、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ抗
体、及びｎｅｓｔｉｎ抗体に対する陽性反応を示す、図
面に代わる免疫蛍光写真である。
【図３】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞
の、神経伝達物質及びその合成酵素であるＴｙｒｏｓｉ
ｎｅ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）、Ｖｅｓｉｃｕ
ｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏ
ｒｔｅｒ（ＶＡＣｈＴ）、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ
Ｙ（ＮＰＹ）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ（ＳＰ）、Ｇｌ
ｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｌｕ）、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ Ｇ
ｅｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＧＲ
Ｐ）、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）の抗体に対する反応を示す、
図面に代わる免疫蛍光写真である。
の、神経伝達物質及びその合成酵素であるＴｙｒｏｓｉ
ｎｅ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）、Ｖｅｓｉｃｕ
ｌａｒ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏ
ｒｔｅｒ（ＶＡＣｈＴ）、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ
Ｙ（ＮＰＹ）、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ（ＳＰ）、Ｇｌ
ｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｌｕ）、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ Ｇ
ｅｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＧＲ
Ｐ）、Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）の抗体に対する反応を示す、
図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図４】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞
の、ＧＤＮＦ添加処理前後の、チロシン・ヒドロキシラ
ーゼ陽性率（ドーパミン作動性ニューロン分化・誘導
率）の変化を示す図面に代わる免疫蛍光写真である。
の、ＧＤＮＦ添加処理前後の、チロシン・ヒドロキシラ
ーゼ陽性率（ドーパミン作動性ニューロン分化・誘導
率）の変化を示す図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図５】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞
の、ＧＤＮＦ添加処理前後の、チロシン・ヒドロキシラ
ーゼ陽性率（ドーパミン作動性ニューロン分化・誘導
率）の変化を示すグラフである。
の、ＧＤＮＦ添加処理前後の、チロシン・ヒドロキシラ
ーゼ陽性率（ドーパミン作動性ニューロン分化・誘導
率）の変化を示すグラフである。
【図６】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞
の、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴｓ；２．５Ｓ Ｎ
ＧＦ）添加処理前後の、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ａｃｅｔ
ｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ陽性率
（アセチルコリン作動性ニューロン分化・誘導率）の変
化を示す図面に代わる免疫蛍光写真である。
の、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴｓ；２．５Ｓ Ｎ
ＧＦ）添加処理前後の、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ａｃｅｔ
ｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ陽性率
（アセチルコリン作動性ニューロン分化・誘導率）の変
化を示す図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図７】本願発明に従って分化・誘導された神経細胞
の、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴｓ；２．５Ｓ Ｎ
ＧＦ）添加処理前後の、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ａｃｅｔ
ｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ陽性率
（アセチルコリン作動性ニューロン分化・誘導率）の変
化を示すグラフである。
の、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴｓ；２．５Ｓ Ｎ
ＧＦ）添加処理前後の、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ａｃｅｔ
ｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ陽性率
（アセチルコリン作動性ニューロン分化・誘導率）の変
化を示すグラフである。
【図８】本願発明に従って分化・誘導された骨格筋細胞
の、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕微鏡像）であ
る。
の、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕微鏡像）であ
る。
【図９】本願発明に従って分化・誘導された骨格筋細胞
の、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕微鏡像）であ
る。図８に示す骨格筋が経時的に増加したことを示す。
の、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕微鏡像）であ
る。図８に示す骨格筋が経時的に増加したことを示す。
【図１０】本願発明に従って分化・誘導された骨格筋細
胞が多核であることを示す、図面に代わる共焦点レーザ
ー顕微鏡写真顕写真を示す。核は緑色で示され、そして
アクチン線維は赤色で示される。
胞が多核であることを示す、図面に代わる共焦点レーザ
ー顕微鏡写真顕写真を示す。核は緑色で示され、そして
アクチン線維は赤色で示される。
【図１１】ラットのパーキンソン病モデルを用いた、本
願発明に係る分化・誘導方法により得られたドーパミン
作動性ニューロンの、線状体への移植による治療効果を
示すグラフである。
願発明に係る分化・誘導方法により得られたドーパミン
作動性ニューロンの、線状体への移植による治療効果を
示すグラフである。
【図１２】線状体に移植された細胞が、グリア細胞では
なく、神経細胞、及びドーパミン作動性ニューロンであ
ることを示す、図面に代わる免疫蛍光写真である。
なく、神経細胞、及びドーパミン作動性ニューロンであ
ることを示す、図面に代わる免疫蛍光写真である。
【図１３】線状体に移植された細胞が、神経細胞、及び
ドーパミン作動性ニューロンであることを示す、図面に
代わる拡大された免疫蛍光写真である。
ドーパミン作動性ニューロンであることを示す、図面に
代わる拡大された免疫蛍光写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
(72)発明者 菅野 洋
神奈川県横浜市南区永田東２−７−８
(72)発明者 高野 雅彦
神奈川県横浜市青葉区奈良町2864−３−３
−702
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 DA02 EA04
GA13 HA20
4B065 AA91X AA91Y AB01 BA02
BA05 BB14 BB19 BB25 CA43
CA44
4C087 AA01 AA02 AA03 BB45 BB64
BB65 NA14 ZA16
Claims (43)
- 【請求項１】 骨髄間質細胞をインビトロにおいて神経
細胞又は骨格筋細胞に分化・誘導する方法であって、上
記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグ
ナリング関連遺伝子を導入することを含み、ここで、最
終的に得られた分化・誘導された細胞が、上記のＮｏｔ
ｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔｃｈシグナリング関連遺伝
子が導入された骨髄間質細胞が細胞分裂した結果として
得られたものである、前記分化・誘導方法。 - 【請求項２】 骨髄間質細胞をインビトロにおいて神経
細胞に分化・誘導する方法であって、以下のステップ： （１） 骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的
な基礎培地に血清を加えた培地中で上記細胞を培養し； （２） 上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏ
ｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入し、そしてさらに
培養し；及び （３） サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイク
リックＡＭＰアナログ、及び／又は細胞分化生存作用性
因子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養して神経
細胞を得る；を含む、請求項１に記載の分化・誘導方
法。 - 【請求項３】 前記標準的な基礎培地がイーグルス（Ｅ
ａｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地である、請求
項２に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項４】 前記血清がウシ胎児血清である、請求項
２又は３に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項５】 前記Ｎｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏｔ
ｃｈシグナリング関連遺伝子の導入が、哺乳動物発現ベ
クターを用いたリポフェクションによる、請求項２〜４
のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項６】 前記ステップ（２）と（３）の間に、前
記遺伝子が導入された細胞の選択を所定期間行うステッ
プをさらに含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の
分化・誘導方法。 - 【請求項７】 前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又
はサイクリックＡＭＰアナログが、フォルスコリン（Ｆ
ｏｒｓｋｏｌｉｎ）である、請求項２〜６のいずれか１
項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項８】 前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又
はサイクリックＡＭＰアナログの濃度が、０．００１ｎ
Ｍ〜１００μＭである、請求項２〜７のいずれか１項に
記載の分化・誘導方法。 - 【請求項９】 前記細胞分化生存作用性因子が、塩基性
線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓ
ｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、毛様
体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐ
ｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ））、及びそれらの混
合物から成る群から選ばれる、請求項２〜８のいずれか
１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項１０】 前記細胞分化生存作用性因子の濃度
が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、
請求項２〜９のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項１１】 前記神経細胞が、ドーパミン作動性ニ
ューロンであり、かつ、前記ステップ（３）の後に、以
下のステップ： （４）ステップ（３）において得られた神経細胞を、標
準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；及び （５）グリア由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ ｄｅｒｉ
ｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（Ｇ
ＤＮＦ））、及びサイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又は
サイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は上記グリア由
来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用性因子を、上記
培養液に添加し、そしてさらに培養して、ドーパミン作
動性ニューロンを得る；をさらに含む、請求項２に記載
の分化・誘導方法。 - 【請求項１２】 前記ステップ（４）における標準的な
基礎培地が、イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修
飾最小必須培地である、請求項１１に記載の分化・誘導
方法。 - 【請求項１３】 前記ステップ（４）における血清がウ
シ胎児血清である、請求項１１又は１２に記載の分化・
誘導方法。 - 【請求項１４】 前記ステップ（５）におけるサイクリ
ックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナロ
グが、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である、
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の分化・誘導方
法。 - 【請求項１５】 前記ステップ（５）におけるサイクリ
ックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナロ
グの濃度が、０．００１ｎＭ〜１００μＭである、請求
項１１〜１４のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項１６】 前記ステップ（５）における、グリア
由来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用性因子が、塩
基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌ
ａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、
血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅ
ｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−Ａ
Ａ））、及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の分化・誘導方
法。 - 【請求項１７】 前記ステップ（５）におけるグリア由
来神経栄養因子の濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１０
０μｇ／ｍｌである、請求項１１〜１６のいずれか１項
に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項１８】 前記ステップ（５）におけるグリア由
来神経栄養因子の濃度が、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／
ｍｌである、請求項１７に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項１９】 前記ステップ（５）における、グリア
由来神経栄養因子以外の細胞分化生存作用性因子の濃度
が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、
請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の分化・誘導方
法。 - 【請求項２０】 前記神経細胞が、アセチルコリン作動
性ニューロンであり、かつ、前記ステップ（３）の後
に、以下のステップ： （４）ステップ（３）において得られた神経細胞を、標
準的な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し；及び （５）神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ）（ＮＧＦ）、及びサイクリックＡＭＰ上昇作
用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び／又は上
記神経成長因子以外の細胞分化生存作用性因子を、上記
培養液に添加し、そしてさらに培養して、アセチルコリ
ン作動性ニューロンを得る；をさらに含む、請求項２に
記載の分化・誘導方法。 - 【請求項２１】 前記ステップ（４）における標準的な
基礎培地が、イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修
飾最小必須培地である、請求項２０に記載の分化・誘導
方法。 - 【請求項２２】 前記ステップ（４）における血清がウ
シ胎児血清である、請求項２０又は２１に記載の分化・
誘導方法。 - 【請求項２３】 前記ステップ（５）におけるサイクリ
ックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナロ
グが、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である、
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の分化・誘導方
法。 - 【請求項２４】 前記ステップ（５）におけるサイクリ
ックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナロ
グの濃度が、０．００１ｎＭ〜１００μＭである、請求
項２０〜２３のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項２５】 前記ステップ（５）における、神経成
長因子以外の細胞分化生存作用性因子が、塩基性線維芽
細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇ
ｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、血小板由来
成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ））、及
びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項２０
〜２４のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項２６】 前記ステップ（５）における神経成長
因子の濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍ
ｌである、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の分
化・誘導方法。 - 【請求項２７】 前記ステップ（５）における神経成長
因子の濃度が、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであ
る、請求項２６に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項２８】 前記ステップ（５）における、神経成
長因子以外の細胞分化生存作用性因子の濃度が、０．０
０１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項２０
〜２７のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項２９】 骨髄間質細胞をインビトロにおいて骨
格筋細胞に分化・誘導する方法であって、以下のステッ
プ： （１） 骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的
な基礎培地に血清を加えた培地中で上記細胞を培養し； （２） 上記培養液に脱メチル化剤を添加し、そしてさ
らに培養し； （３） サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイク
リックＡＭＰアナログ、及び／又は細胞分化生存作用性
因子を上記培養液に添加し、そしてさらに培養し； （４） 上記細胞内にＮｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏ
ｔｃｈシグナリング関連遺伝子を導入し、そしてさらに
培養し； （５） 上記の遺伝子導入された細胞と、遺伝子導入の
されていない無処理の上記骨髄間質細胞とを共培養し；
及び （６） サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイク
リックＡＭＰアナログを上記培養液に添加し、そしてさ
らに培養して骨格筋細胞を得る；を含む、請求項１に記
載の分化・誘導方法。 - 【請求項３０】 前記標準的な基礎培地がイーグルス
（Ｅａｇｌｅ’ｓ）アルファ修飾最小必須培地である、
請求項２９に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項３１】 前記血清がウシ胎児血清である、請求
項２９又は３０に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項３２】 前記脱メチル化剤が５−アザシチジン
（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）である、請求項２９〜
３１のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項３３】 前記５−アザシチジンの濃度が３０ｎ
ｍｏｌ／ｌ〜３００μｍｏｌ／ｌである、請求項２９〜
３２のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項３４】 前記ステップ（３）におけるサイクリ
ックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナロ
グが、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である、
請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の分化・誘導方
法。 - 【請求項３５】 前記ステップ（３）におけるサイクリ
ックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナロ
グの濃度が、０．００１ｎＭ〜１００μＭである、請求
項２９〜３４のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項３６】 前記細胞分化生存作用性因子が、塩基
性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａ
ｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））、血
小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＡＡ（ＰＤＧＦ−Ａ
Ａ））、ヘレグリン（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）、及びそれ
らの混合物から成る群から選ばれる、請求項２９〜３５
のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項３７】 前記細胞分化生存作用性因子の濃度
が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、
請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の分化・誘導方
法。 - 【請求項３８】 前記Ｎｏｔｃｈ遺伝子及び／又はＮｏ
ｔｃｈシグナリング関連遺伝子の導入が、哺乳動物発現
ベクターを用いたリポフェクションによる、請求項２９
〜３７いずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項３９】 前記ステップ（４）と（５）の間に、
前記遺伝子が導入された細胞の選択を所定期間行うステ
ップをさらに含む、請求項２９〜３８のいずれか１項に
記載の分化・誘導方法。 - 【請求項４０】 前記ステップ（５）におけるサイクリ
ックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナロ
グが、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）である、
請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の分化・誘導方
法。 - 【請求項４１】 前記ステップ（５）におけるサイクリ
ックＡＭＰ上昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナロ
グの濃度が、０．００１ｎＭ〜１００μＭである、請求
項２９〜４０のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。 - 【請求項４２】 請求項１１〜１９のいずれか１項によ
り記載の分化・誘導方法を用いて製造されたドーパミン
作動性ニューロン。 - 【請求項４３】 請求項１１〜１９のいずれか１項によ
り記載の分化・誘導方法により得られた、ドーパミン作
動性ニューロンを含む、パーキンソン病治療用医薬組成
物。
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