CN100497621C - 通过导入notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法 - Google Patents

通过导入notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN100497621C
CN100497621C CNB038055961A CN03805596A CN100497621C CN 100497621 C CN100497621 C CN 100497621C CN B038055961 A CNB038055961 A CN B038055961A CN 03805596 A CN03805596 A CN 03805596A CN 100497621 C CN100497621 C CN 100497621C
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
bmsc
neurocyte
cells
camp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CNB038055961A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1639335A (zh
Inventor
出泽真理
泽田元
菅野洋
高野雅彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanbio Inc
Original Assignee
Sanbio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2002030003A external-priority patent/JP3948971B2/ja
Application filed by Sanbio Inc filed Critical Sanbio Inc
Publication of CN1639335A publication Critical patent/CN1639335A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100497621C publication Critical patent/CN100497621C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种通过导入Notch基因将骨髓间质细胞诱导/分化神经细胞和骨骼肌细胞的方法。即，本发明提供了一种通过导入Notch基因将骨髓间质细胞体外诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法，所述方法包括将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入所述细胞，其中所得分化/诱导的细胞是导入了Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的骨髓间质细胞的细胞分裂子代。本发明还提供了将分化/诱导的神经细胞进一步诱导/分化为多巴胺能神经元或乙酰胆碱能神经元。本发明还还涉及用本发明的方法所获得的神经前体细胞、神经细胞或骨骼肌细胞治疗神经退化性疾病或肌退化性疾病的方法。

Description

通过导入NOTCH基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种通过导入Notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经前体细胞(neural precursor cells)或神经细胞，特别是多巴胺能神经元，或骨骼肌细胞的方法，还涉及用该方法所获得的神经前体细胞、神经细胞或骨骼肌细胞和所述细胞的治疗用途以及治疗方法。
背景技术
在晚期神经退化性病症如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)等病中重建神经功能需要取代由细胞死亡所致的神经细胞丧失。虽然已经使用胚胎或成体神经干细胞、ES细胞和胚胎神经细胞在动物实验中尝试进行神经细胞移植，然而将其应用于人类仍面临很大的障碍。使用胚胎干细胞或神经细胞涉及伦理问题，而能否保证稳定供应也是一个问题。近来，ES细胞的已得到证实的分化能力得到很多关注，然而除了很多伦理问题外，诱导分化为特定细胞类型所需的费用和劳动量以及移植后形成畸胎瘤的风险是妨碍该技术稳定应用的因素。为了使用成体神经干细胞，由于仅在中枢神经系统非常局限的核心区中发现所述细胞故必需通过开颅术才能提取所述细胞，因此接受再生治疗的患者也会承受巨大的风险和负担。
虽然中枢神经系统干细胞的体外分离至今已过去了近十年，但现在仍不能通过目前公认的方法分化神经干细胞及获得大量多巴胺能或胆碱能神经元(Lorenz Studer，Nature Biotechnology Dec.Issue，p.117(2001))。
由卡尔加里大学(加拿大)的Samuel Weiss教授和Tetsuro Shingo领导的研究组已通过将几种酪氨酸羟化酶诱导因子的混合物(THcocktail)施用于小鼠脑内而成功地有效诱导产多巴胺神经细胞的分化，然而如根据本发明的从骨髓基质细胞诱导分化多巴胺能神经元和胆碱能神经元目前仍无先例。
运动神经元是乙酰胆碱能的，且其被认为适于治疗如ALS(肌萎缩性侧索硬化症)的难治性疾病。在ALS中，原因不明的脊髓运动神经元死亡导致了肌肉控制神经的丧失，从而妨碍包括呼吸肌在内全身肌肉的运动，并导致病人在发作后2-3年之内死亡。目前，尚无对这种病症的有效治疗方法，但正在建立大鼠ALS模型。
大多数退化性肌肉病如肌肉萎缩症是进行性的，因此骨骼肌细胞移植可构成有效的治疗。在健康的个体中，存在于肌肉组织中的卫星细胞补充丧失再生力的骨骼肌，但是在进行性肌肉疾病中，所述细胞数量减少且再生力相应较低。因此，虽然骨骼肌细胞或其前体细胞的移植可作为治疗方法，但目前仍不存在有效的治疗方法。
在中枢神经系统发育期间，从相对同质的神经前体细胞或神经干细胞诱导分化神经元和神经胶质细胞。存在这样一种适当的机制，即通过此机制前体细胞群体中部分细胞响应分化信号而分化为特定的细胞亚型，而其它细胞保持未分化状态。具体地，先分化细胞对其周围细胞发送特定信号从而阻止细胞再分化为先分化细胞自身的类型。该机制已知为侧抑制(lateral inhibition)。在果蝇中，已分化为神经元的细胞表达“Delta”配体，而其周围细胞表达Delta受体“Notch”，配体和受体的结合确保周围细胞不分化为神经细胞(Notch信号传导)。Delta-Notch系统似乎也在脊髓细胞中起作用(参见例如Chitnis，A.，Henrique，D.，Lewis，J.，Ish-Horowicz，D.，Kintner，C.：Nature，375，761-766(1995))。
一般认为借助膜蛋白Notch的细胞相互作用在发育过程中发挥主要作用，由此均一细胞群体产生多种不同的类型，特别是依靠通过邻近细胞的配体刺激，Notch诱导了能够抑制bHLH(碱性螺旋-环-螺旋)神经分化因子如Mash1、Math1和neurogenin的HES1或HES5的表达，从而抑制分化为与邻近细胞相同类型(参见例如Kageyama等，Saibo Kogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。
目前对Notch细胞内通路存在如下认识。当Notch首先被邻近细胞表面上的配体激活时(Delta，Serrate，Jagged)，其细胞内结构域被剪切掉(Artavanis-Tsakonas S等：Science(1999)284：770-776和Kageyama等，Saibo Kogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。在剪切了Notch的细胞内结构域之后，其在核定位信号(NLS)辅助下从细胞膜移至核并在细胞核中与DNA-结合蛋白RBP-Jκ构成复合物(Honj o T.：Genes Cells(1996)1：1-9和Kageyama等，Saibo Kogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。RBP-Jκ本身是转录的DNA-结合抑制物，且在不存在活化的Notch时，其结合HES1基因(是分化抑制因子)的启动子，由此阻断其表达；然而，一经形成RBP-Jκ和Notch细胞内结构域间的复合物，该复合物即转而发挥活化HES1基因的转录的作用(参见Jarriault S.等：Nature(1995)377：355-358，Kageyama R等：Curr.Opin.Genet.Dev.(1997)7：659-665和Kageyama等，SaiboKogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。这导致HES1表达和HES1-诱导的分化抑制。换言之，已经确信Notch借助HES1而抑制分化(参见Kageyama等，Saibo Kogaku[CellEngineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。
同样在哺乳动物中，已经很清楚Notch介导的基因表达的调节在保持神经前体细胞或神经干细胞中和在神经分化的高度多变的过程中是重要的，且Notch通路对神经系统外的细胞分化也是非常重要的(参见Tomita K等：Genes Dev。(1999)13：1203-1210和Kageyama等，Saibo Kogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1301-1306(1999))。另外，已经预期了HES-非依赖性Notch通路的存在、Notch信号对转录水平的负调节和对蛋白水平的负相互作用(参见Goh，M.，SaiboKogaku[Cell Engineering]Vol.18，No.9，1291-1300(1999))。而且，前述所有公开内容教导或提示Notch信号传导在抑制分化方面发挥作用。
不能通过重建来治疗的中枢神经疾病实际上包括人群中多种不同的具有高发病率的疾病，从损伤诱导的脊髓损伤或脑血管损伤或能导致失明的青光眼，至神经退化症如帕金森氏病。因此对治疗所述疾病的神经再生方法的研究是非常紧迫的社会需要，而本发明人的研究结果确信是应用于人类的一个突破。在门诊病人中通过骨髓穿刺可很容易地提取骨髓基质细胞，且由于其高增殖性，其可在相对短的时期内得以大量培养。而且，如果神经从自体骨髓干细胞构建，则可实施自体移植，故可以预期巨大的优势。不产生免疫排斥将免除使用免疫抑制剂，故此能使治疗更安全。
而且，由于骨髓干细胞可获自骨髓库，从供应角度来看，该方法实际上是可行的。如果所述细胞可用于生成神经细胞(迄今为止尚无有效方法)，则可以在再生医学领域中期待主要效果。
ALS(肌萎缩性侧索硬化症)是一种不明原因脊髓运动神经元细胞死亡的疾病，其中细胞死亡导致肌肉控制神经的丧失，从而妨碍包括呼吸肌在内全身肌肉的运动，并导致病人在发作后2-3年之内死亡，然而目前尚无有效治疗方法。从自体骨髓干细胞构建乙酰胆碱能神经元将可以进行自体移植，这将提供显著的甚至可治疗ALS的优势。
目前尚无肌肉疾病如肌肉萎缩症(骨骼肌的退行性疾病)的有效治疗方法。由于骨骼肌细胞从自体骨髓干细胞构建将能允许实施自体移植，故也能对所述疾病提供显著的优势。使用所述细胞生成骨骼肌细胞(迄今为止尚无有效方法)，则可以在再生医学领域中期待主要效果。
该技术不仅可用于临床治疗领域还可用于预期在未来会成为重要领域的人造器官等工程学领域。如果能在细胞培养水平容易地制备神经细胞或肌细胞，则可设想用于生成杂合人造器官等。
发明概述
本发明提供了体外诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法，所述方法包括将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞中，其中最终得到的分化细胞是已导入Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的骨髓基质细胞分裂的结果。本发明还提供了一种用于神经变性疾病和骨骼肌退行性疾病的新治疗方法，该方法使用由前述方法获得的神经前体细胞，神经细胞或骨骼肌细胞。
附图简述
图.1是代替图的显微照片(相差显微镜)，显示了根据本发明诱导分化的神经细胞。
图.2是代替图的免疫荧光照片组，显示了根据本发明诱导分化的神经细胞对MAP-2抗体、神经丝抗体和巢蛋白(nestin)抗体的阳性反应。
图.3是代替图的免疫荧光照片组，显示了根据本发明诱导分化的神经细胞对针对神经递质合成酶酪氨酸羟化酶(TH)和神经递质或神经递质-相关肽囊泡乙酰胆碱转运体(vesicular acetylcholinetransporter(VAChT))、神经肽Y(NPY)、P物质(SP)、谷氨酰胺(Glu)、降钙素基因相关肽(CGRP)和血管活性肠肽(VIP)的抗体的阳性反应。
图.4是代替图的两个免疫荧光照片，显示了GDNF处理前后，根据本发明诱导分化的神经细胞的酪氨酸羟化酶阳性的变化(多巴胺能神经元分化率)。
图.5显示了GDNF处理前后，根据本发明诱导分化的神经细胞的酪氨酸羟化酶阳性的变化(多巴胺能神经元分化率)。
图.6是代替图的一对免疫荧光照片，显示了神经营养蛋白(NTs；2.5S NGF)处理前后，根据本发明诱导分化的神经细胞的囊泡乙酰胆碱转运体阳性的变化(乙酰胆碱能神经元分化率)。
图.7显示了神经营养蛋白(NTs；2.5S NGF)处理前后，根据本发明诱导分化的神经细胞的囊泡乙酰胆碱转运体阳性的变化(乙酰胆碱能神经元分化率)。
图.8是代替图的显微照片(相差显微镜)，显示了根据本发明诱导分化的骨骼肌细胞。
图.9是代替图的另一显微照片(相差显微镜)，显示了根据本发明诱导分化的骨骼肌细胞。该照片显示了图.8的骨骼肌随时间的增加。
图.10是代替图的共焦激光显微照片，显示了根据本发明诱导分化的骨骼肌细胞的多核特性。核显示为绿色和肌动蛋白纤维显示为红色。
图.11是显示了将由本发明分化诱导方法获得的多巴胺能神经元植入大鼠帕金森氏病模型纹状体的治疗效果的两个图。
图.12是代替图的免疫荧光照片组，显示了植入纹状体的细胞不是神经胶质细胞而是神经细胞和多巴胺能神经元。
图.13是代替图的放大免疫荧光照片组，显示了植入纹状体的细胞是神经细胞和多巴胺能神经元。
图.14a～14f显示了分离的骨髓基质细胞(MSC)的特征。图.14a显示大鼠(MSC)的FACS分析结果。该细胞表达CD29(β1-整联蛋白)，CD90(Thy-1)和CD54(ICAM)，而不表达CD34(造血干细胞标记物)或CD11b/c(巨噬细胞相关标记物)。图.14b和14c是未处理的大鼠MSC(b)和未处理的人MSC(c)的相差显微照片。图.14d～14f为人MSC中CD29(d)、CD90(e)和CD34(f)的免疫组织化学照片。MSC为CD29和CD90阳性的，但却是CD34阴性的。条带代表50μm。
图.15a～15h显示了NICD(Notch细胞内结构域)转染后的表现型。图.15a显示了NICD转染前(泳道1)和NICD转染后(泳道2)大鼠MSC中Notch细胞外结构域(ECD)和细胞内结构域(ICD)的RT-PCR结果。因为在未处理的MSC中检测到了ECD，故天然表达少量内源性Notch。然而，在NICD转染之后，ECD下调和NICD稍上调。图.15b～15g是未处理的大鼠MSC(b，d，f)和NICD-转染的大鼠MSC(c，e，g)中GLAST(b，c)、3-PGDH(d，e)和巢蛋白(f，g)的免疫组织化学照片。条带在b，c，d和g中代表50μm而在e和f中代表80μm。图.15h显示了未处理的大鼠MSC(MSC)和NICD-转染的大鼠MSC(NICD)的3-PGDH启动子活性。3-PGDH的全长型和截短型(M1965)均显示了NICD转染后启动子活性增加了9～10倍(p<0.01)。
图.16显示了用不同营养因子处理时，MAP-2ab+细胞转化率。当营养因子导入未处理的或用对照载体转染的大鼠MSC时，均未检测到MAP-2ab+细胞。导入三种营养因子(FSK+6FGF+CNTF)显示出最高神经细胞生成率(96.5％)，而缺少这三种因子的任何一种都会导致较低的转化率。
图.17a～17q显示了诱导的神经细胞的分析结果。图.17a～17c是从大鼠MSC(a，b)和人MSC(c)中诱导的神经细胞的相差显微照片。条带在图.17a中表示200μm而在图.17b和17c表示50μm。图.17d～17g和17i～17k是在导入营养因子后，大鼠MSC(f，g，i，j，k)和人MSC(d，e)(5日)中神经元标记物和神经胶质标记物的免疫组织化学照片。在人MSC中观测到了标记物MAP-2ab(d)和神经丝-M(e)，而β3-微管蛋白(f)和TuJ-1(g)在大鼠MSC中表达。大鼠或人类细胞都不与神经胶质标记物GFAP(I)，GalC(j)和O4(k)反应。条带在d，e和f中表示100μm，在g中表示60μm而在在i～k中表示100μm。图.17h显示了神经细胞的Brd-U标记。MAP-2ab阳性细胞(Alexa Fluor 488-标记的，绿码)未整合Brd-U(Alexa Fluor 546-标记的，红色码)。图.17l显示了MAP-2ab大鼠样本(1)和GFAP大鼠样本(2)的蛋白印迹分析结果。泳道1为蛋白印迹而泳道2为丽春红S染色。未处理的MSC(M)既不表达MAP-2ab也不表达GFAP。在导入营养因子后第5日(N)，MSC为MAP-2ab阳性，但仍为GFAP阴性。将脑(B)作为MAP-2ab和GFAP二者的阳性对照。图.17m～17q显示了从大鼠MSC(m)诱导的神经细胞和从人MSC(n，p)诱导的神经细胞膜片箝测试的结果。与未处理的MSC(o，p)相比，诱导导致了整流K+电流的显著增加，其在大鼠MSC(m)和人MSC(n)中分别达到约1600pA和4000pA。图.17q显示了记录于图.17n中的人MSC的相差显微照片。
图.18是一对显示了未处理的大鼠MSCs(MSC)、NICD-转染的大鼠MSC(NICD)和神经诱导的大鼠MSC(诱导的)的Neuro D和GFAP的相对启动子活性的图。
图.19a～19m显示了移植至大鼠帕金森氏病模型的结果。图.19a显示了营养因子诱导后大鼠MSC中下述神经递质的百分比：γ-氨基丁酸(GABA)；0.3±0.1，血管活性肠肽(VIP)；0.5±0.1，5-羟色胺(Ser)；2.0±0.4，谷氨酸(Glu)；2.3±0.7，P物质(SP)；2.4±0.9，TH；3.9±0.6，囊泡乙酰胆碱转运体(VACht)；5.2±2.4，降钙素基因相关肽(CGRP)；5.3±0.8，神经肽Y(NPY)6.1±1.6。通过随后施用GDNF，TH-阳性细胞百分比显著增加至41.0±14.1(G-TH)。图.19b和19c显示了营养因子诱导后和然后GDNF处理后的人MSC中TH表达。人MSC表现出与大鼠MSC相同的反应，在GDNF处理后TH-阳性细胞明显增加。条带在b中表示100μm而在c中表示30μm。图.19d显示了大鼠MSC中Nurr-1的RT-PCR结果。与营养因子单独诱导(N)的细胞相比，在施用GDNF(Ng)后可观察到增加的Nurr-1上调。图.19e显示了大鼠MSC中TH的蛋白印迹。在MSC中导入营养因子(N)后TH表达较弱，但在导入GDNF(Ng)后则增加。肾上腺髓质(A)作为阳性对照。泳道1为蛋白印迹而泳道2为丽春红S染色。图.19f显示了将大鼠MSC植入纹状体后的行为效果。该图显示了MSC组(▲-▲)，N-MSC组(●-●)和G-MSC组(■-■)(＊：0.01<p<0.05；＊＊：p<0.01)中阿朴吗啡诱导的旋转。图.19g～19k是在移植入G-MSC组中后第10周时，纹状体中神经丝-M(s)、TH(h)、DAT(i)、GFAP(j)和O4(i)的免疫染色照片。这些标记物的信号全部用Alexa546标记(红码)。首先用GFP标记移植的大鼠MSC。在g，h和i中观测到成双的GFP-神经丝、GFP-TH和GFP-DAT，而在GFAP染色或O4染色时不能观测到。条带代表50μm。图.19l是一组显示了GFP-标记的大鼠MSC(G-MSC组)整合至纹状体中的一组截面图。将在TH免疫组织化学(红色)后通过图中点所标记的区域显示共焦图像。条带代表50μm。图.19m显示了在移植GDNF-处理的人神经MSC后大鼠中阿朴吗啡诱导的旋转。显示了直至移植后4周的来自5只大鼠(平均旋转：0.44±0.2)的结果(每种颜色代表一只大鼠)。
发明详述
本发明人研究了通过导入在骨髓基质细胞形态发生初期中发挥中心作用的基因刺激骨髓基质细胞，并检测了所述刺激对诱导骨髓基质细胞分化的影响。具体地，通过导入Notch基因和Notch信号传导基因(其在神经系统的发育分化和在前体细胞分化为神经细胞或神经胶质细胞时在确定细胞命运中发挥作用)，可以“重新设定(reset)”骨髓基质细胞。
重要的是注意到尽管Notch基因和Notch信号传导相关基因涉及抑制细胞诱导分化机制，完全意料不到地发现是：将导入Notch基因和Notch信号传导相关基因与其它诱导分化的刺激联合，也能诱导分化已经导入了Notch基因和Notch信号传导相关基因的特定细胞(而不是与已经导入了Notch基因和Notch信号传导相关基因的细胞接触的细胞)。未证实在本发明分化诱导方法中导入Notch基因和Notch信号传导相关基因能导致骨髓基质细胞的发育分化重新设定。然而，通过将该基因导入与根据本发明的其它分化诱导步骤联合，结果能够提供有效地将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法。
根据联合步骤(包括导入Notch基因和Notch信号传导相关基因)的重复实验，本发明人首先成功地有效诱导骨髓基质细胞体外分化为神经细胞或骨骼肌细胞。而且，已经证实了通过将用分化诱导方法获得的神经细胞植入大鼠帕金森氏病模型或大鼠视神经损伤相关性视网膜模型或视神经退化模型，植入的神经确实可以保留并发挥功能，由此完成了本发明。
令人惊奇的是，通过将Notch基因和Notch信号传导相关基因导入骨髓基质细胞，通过施用确信与促进神经分化有关的多种因子和细胞因子，和通过增加被认为是分化开始的一般引发因子的细胞内cAMP，可以成功地在体外培养条件下将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞。我们不仅证实了神经细胞特异性MAP-2和神经丝的表达，还证实了神经递质合成酶酪氨酸羟化酶的表达和神经递质如乙酰胆碱、神经肽Y和P物质的产生。
另一方面，已有人指出由5-氮胞苷(5-AZC)造成的一个或非常少的几个基因的脱甲基化和活化导致了向成肌细胞的转变(参见Taylar SM，Jones PA：Cell 17：771-779，1979和Nabeshima Y.，Seitaino Kagaku 47(3)：184-189，1996)。因此，我们将前述Notch基因和Notch信号传导相关基因导入神经细胞与采用5-氮胞苷(5-AZC)处理的前述脱甲基化联合起来。具体地，通过采用前述脱甲基剂的基因脱甲基化作用而消除被抑制的表达从而重新设置骨髓基质细胞，随后导入Notch和Notch信号传导相关基因，并将该基因导入的细胞与无该基因的骨髓基质细胞共培养，最后用细胞内cAMP的增多剂处理细胞，其中细胞内cAMP被认为是启动分化的一般引发子，我们成功地通过体外培养将Notch和Notch信号传导相关基因导入的细胞诱导分化为骨骼细胞。在最终所得细胞中发现了特征性多核肌管形成和横纹化，且肌肉-特异性蛋白质即肌细胞生成素和Myf5的表达也在mRNA水平得到证实。
根据本发明的一个方面，提供了将骨髓基质细胞体外诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法，所述方法包括将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，其中所得分化细胞是导入了Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的骨髓基质细胞的细胞分裂子代。
根据本发明的另一个方面，提供了将骨髓基质细胞体外诱导分化为神经前体细胞的方法，包括如下步骤：
(1)从骨髓分离骨髓基质细胞，并在添加了血清的标准基本培养基中培养细胞；和
(2)将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，并进一步培养细胞以生成神经前体细胞。
分离的骨髓基质细胞可以是人类细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了用前述方法制备的神经前体细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了表达神经前体细胞标记物GLAST，3PGDH和巢蛋白的神经前体细胞。
而根据本发明的另一个方面，提供了将骨髓基质细胞体外诱导分化为神经细胞的方法，包括如下步骤：
(1)从骨髓分离骨髓基质细胞，并在添加了血清的标准基本培养基中培养细胞；
(2)将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，并进一步培养细胞，和
(3)在培养基中加入环AMP-增多剂(augmenting agent)或环AMP类似物，和/或细胞分化刺激因子，并进一步培养细胞以生成神经细胞，
其中所得分化细胞是导入了Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的骨髓基质细胞的细胞分裂子代。
标准基本培养基可以是伊格尔氏α改良的最低必需培养基(Eaglesalpha modified minimum essential medium)，血清可以是胎牛血清。
Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的导入可通过使用哺乳动物表达载体的脂转染法实施。
所述方法还可包括，在步骤(2)和(3)间，在一个预定的时期选择已经导入了基因的细胞的步骤。
环AMP-增多剂或环AMP类似物可以是毛喉素，其浓度可以是0.001nM～100μM。
细胞分化刺激因子可选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，睫状神经营养因子(CNTF)及其混合物。
细胞分化刺激因子的浓度可以是0.001ng/ml～100μg/ml。
分离的骨髓基质细胞优选为人类细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了用前述方法制备的神经细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了表达神经细胞标记物β-微管蛋白同种型3和TuJ-1的神经细胞。
而根据本发明的另一个方面，提供了将骨髓基质细胞体外诱导分化为多巴胺能神经元的方法，包括如下步骤：
(1)从骨髓分离骨髓基质细胞，并在添加了血清的标准基本培养基中培养细胞；
(2)将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，并进一步培养细胞，和
(3)在培养基中加入环AMP-增多剂或环AMP类似物，和/或细胞分化刺激因子，并进一步培养细胞以生成神经细胞；
(4)在添加了血清的标准基本培养基培养获自步骤(3)的神经细胞；和
(5)在培养基中加入神经胶质源性神经营养因子(GDNF)，和环AMP-增多剂或环AMP类似物，和/或除神经胶质源性神经营养因子之外的细胞分化刺激因子，并进一步培养细胞以获得多巴胺能神经元，
其中所得多巴胺能神经元是导入了Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的骨髓基质细胞的子代。
步骤(4)中的标准基本培养基可以是伊格尔氏α改良的最低必需培养基。
步骤(4)中的血清可以是胎牛血清。
步骤(5)中的环AMP-增多剂或环AMP类似物可以是毛喉素。步骤(5)中环AMP-增多剂或环AMP类似物的浓度可以是0.001nM～100μM。
步骤(5)中除神经胶质源性神经营养因子以外的细胞分化刺激因子可选自碱性成纤维细胞生长因子(bFG)、血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)及其混合物。
步骤(5)中神经胶质源性神经营养因子的浓度可以是0.001ng/ml～100μg/ml，优选为1ng/ml～100ng/ml。
步骤(5)中除神经胶质源性神经营养因子以外的细胞分化刺激因子的浓度可以是0.001ng/ml～100μg/ml。
分离的骨髓基质细胞优选是人类细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了用前述方法制备的多巴胺能神经元。
而根据本发明的另一个方面，提供了将骨髓基质细胞体外诱导分化为乙酰胆碱能神经元的方法，包括如下步骤：
(1)从骨髓分离骨髓基质细胞，并在添加了血清的标准基本培养基中培养细胞；
(2)将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，并进一步培养细胞；
(3)在培养基中加入环AMP-增多剂或环AMP类似物，和/或细胞分化刺激因子，并进一步培养细胞以生成神经细胞；
(4)在添加了血清的标准基本培养基中培养获自步骤(3)的神经细胞；和
(5)在培养基中加入神经生长因子(NGF)，和环AMP-增多剂或环AMP类似物，和/或除神经生长因子外的细胞分化刺激因子，并进一步培养细胞以获得乙酰胆碱能神经元，
其中所得乙酰胆碱能神经元是导入了Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的骨髓基质细胞的子代。
步骤(4)中的标准基本培养基可以是伊格尔氏α改良的最低必需培养基。步骤(4)中的血清可以是胎牛血清。
步骤(5)中环AMP-增多剂或环AMP类似物可以是毛喉素。步骤(5)中的环AMP-增多剂或环AMP类似物的浓度可以是0.001nM～100μM。
步骤(5)中除神经生长因子以外的细胞分化刺激因子可选自碱性成纤维细胞生长因子(bFG)、血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)及其混合物。
步骤(5)中神经生长因子的浓度可以是0.001ng/ml～100μg/ml，优选为1ng/ml～100ng/ml。
步骤(5)中除神经生长因子以外的细胞分化刺激因子的浓度可以是0.001ng/ml～100μg/ml。
分离的骨髓基质细胞优选是人类细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了用前述方法制备的乙酰胆碱能神经元。
而根据本发明的另一个方面，提供了将骨髓基质细胞体外诱导分化为骨骼肌细胞的方法，包括如下步骤：
(1)从骨髓分离骨髓基质细胞，并在添加了血清的标准基本培养基中培养细胞；
(2)在培养基中加入脱甲基剂，并进一步培养细胞；
(3)在培养基中加入环AMP-增多剂或环AMP类似物，和/或细胞分化刺激因子，并进一步培养细胞，
(4)将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入细胞，并进一步培养细胞，
(5)将导入了所述基因的细胞与没有导入所述基因的未处理骨髓基质细胞共培养；和
(6)在培养基中加入环AMP-增多剂或环AMP类似物，并进一步培养细胞以获得骨骼肌细胞，
其中所得分化细胞是导入了Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的骨髓基质细胞的子代。
标准基本培养基可以是伊格尔氏α改良的最低必需培养基，血清可以是胎牛血清。
脱甲基剂可以是5-氮胞苷，其浓度为30nmol/l～300μmol/l。
步骤(3)中环AMP-增多剂或环AMP类似物可以是毛喉素。
步骤(3)中的环AMP-增多剂或环AMP类似物浓度可以是0.001nM～100μM。
细胞分化刺激因子可选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)、heregulin，及其混合物，其浓度可以是0.001ng/ml～100μg/ml。Notch基因和/或Notch信号传导相关基因的导入可通过使用哺乳动物的表达载体的脂转染法实施。
所述方法还可包括，在步骤(4)和(5)间，在一个预定的时期选择已经导入了基因的细胞的步骤。
步骤(5)中环AMP-增多剂或环AMP类似物可以是毛喉素。
步骤(5)中环AMP-增多剂或环AMP类似物的浓度可以是0.001nM～100μM。
分离的骨髓基质细胞优选是人类细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了用前述方法制备的骨骼肌细胞。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述神经前体细胞施用于发现有疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域，其中神经前体细胞的存在表现出对疾病、紊乱或病症的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的前述神经前体细胞在制备用于治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述神经细胞施用于发现疾病、紊乱或症状的患者的中枢神经系统区域，其中神经细胞的存在表现出对疾病、紊乱或症状的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的前述神经细胞在制备用于治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述表达神经细胞标记物β-微管蛋白同种型3和TuJ-1的神经细胞施用于发现有疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域，其中神经细胞的存在表现出对疾病、紊乱或病症的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的表达神经细胞标记物β-微管蛋白同种型3和TuJ-1的前述神经细胞在制备用于治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述多巴胺能神经元施用于发现有疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域，其中神经细胞的存在表现出对疾病、紊乱或病症的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的前述多巴胺能神经元在制备用于治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途。
而根据本发明的另一方面，所述疾病、紊乱或病症可以是帕金森氏病。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述乙酰胆碱能神经元施用于发现有疾病、紊乱或病症的患者的中枢神经系统区域，其中神经细胞的存在表现出对疾病、紊乱或病症的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的前述乙酰胆碱能神经元在制备用于治疗患有中枢神经系统疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途。
所述疾病、紊乱或病症可选自ALS(肌萎缩性侧索硬化症)和阿耳茨海默氏病。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗患有与肌肉退化相关的疾病、紊乱或病症的患者的方法，所述方法包括将治疗有效量的前述骨骼肌细胞施用于患者的肌肉退化区域，其中骨骼肌细胞的存在表现出对疾病、紊乱或病症的治疗效果。
而根据本发明的另一方面，提供了治疗有效量的前述骨骼肌细胞在制备用于治疗患有与肌肉退化相关的疾病、紊乱或病症的患者的药物组合物中的用途。
所述疾病、紊乱或病症可以是肌肉萎缩症。
在本说明书全文中，术语“骨髓基质细胞”是指存在于骨髓中而不存在造血系统中的并具有分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等的潜能的细胞。骨髓基质细胞可通过CD29(β1-整联蛋白)、CD90(Thy-1)和CD54(ICAM-1)阳性和CD34(造血干细胞标记物)和CD11b/c(巨噬细胞标记物)阴性而得以鉴别。
如本说明书全文中所使用的与诱导分化相关的术语“有效地”是指通过本发明的分化诱导方法可将所选择的骨髓基质细胞以高转化率最终转变为神经细胞或骨骼肌细胞。本发明的分化诱导方法的效率为50％或更高、优选75％或更高、更优选80％或更高、更优选85％或更高，更优选90％或更高和最优选95％或更高。
如本说明书全文中所使用的术语“神经前体细胞”是指导入Notch基因和/或Notch信号传导相关基因后即刻可得的骨髓基质细胞，更具体地，它们是导入营养因子前的细胞。
如本说明书全文中所使用的术语“神经细胞”是指形态学特征为细胞体和两类突触(树突和轴突)，生物化学特征为与针对β-微管蛋白同种型3和TuJ-1的抗体反应的神经元。
神经细胞的特征是分泌神经递质、神经递质合成酶或神经递质-相关性蛋白，例如，酪氨酸羟化酶(TH)，囊泡乙酰胆碱转运体，神经肽Y和P物质(SP)。
酪氨酸羟化酶是多巴胺能神经元的标记物，而囊泡乙酰胆碱转运体是乙酰胆碱能神经元(通常是运动神经元)的标记物。
如本说明书全文中所使用的术语“神经胶质细胞”是指在中枢神经中，在神经元和其突触间发现的星形胶质细胞，少突胶质细胞，小胶质和上皮细胞。
神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞的标记物，O4是少突胶质细胞的标记物。
如本说明书全文中所使用的术语“骨骼肌细胞”是指肌纤维或肌肉纤维，且其是骨骼肌的单个肌细胞。在形态学上。其特征为具有肌管形成和横纹化的非常长、细、多核的细胞，而在生物化学上，其特征在于表达转录调节因子如肌细胞生成素和Myf5.
根据本发明的诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法是新的，因为其包括将Notch基因和/或Notch信号传导相关基因导入前述细胞的步骤。另一新方面是该步骤可以与其它现有技术中的分化步骤以指定顺序组合。本发明人将根据本发明的所述步骤的选择和最优组合组成了高度显著性的新发现。已知，骨髓基质细胞是能被诱导分化为成骨细胞、血管内皮细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞和平滑肌细胞的间充质干细胞或前体细胞，但骨髓基质细胞是否确实能被分化为神经细胞或骨骼肌细胞则是未知的，尽管已有大量尝试但该目标尚未成功实现。然而不想受到任何具体理论限制，本发明人推测将Notch基因和/或Notch基因信号传导相关基因导入前述细胞中会导致细胞在发育分化方面的重新设置，并能辅助其他分化诱导处理的功能。
下述实施例更详细地解释本发明，这些实施例应理解为不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：神经诱导
从成年大鼠(Wistar大鼠)的骨髓中提取基质细胞并进行培养。所使用的培养基为含有20％胎牛血清(14-501F，Lot#61-1012，BioWhittaker Co.)的Minimum Essential Medium Alpha EagleModification(M4526，Sigma Co.)。
在传4代后，当细胞接近80-90％汇合时，导入Notch细胞内结构域的基因。将Notch细胞内结构域的3.1 kb EcoRI-XbaI片段插入pCI-neo哺乳动物表达载体(#E1841)(Promega)的EcoRI-XbaI多克隆位点以实施重组。采用AlipofectAMINE 2000(11668-027，GibcoBRL)系统实施导入。
于导入后的那一天，将G418硫酸盐(83-5027，Gibco BRL)加至浓度为200ng/ml然后用10天时间选择导入的细胞。
在细胞群体恢复至90％汇合后，加入5μM毛喉素(344273，Calbiochem)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(100-18B，PeprotechEC，Ltd.)和50ng/ml睫状神经营养因子(557-NT，R&D Systems)。
约10日后分析细胞，结果如图.1所示，观测到神经细胞的特征性形态学。诱导的细胞表现出与抗MAP-2(MAB364，Chemicon)、神经丝(814342，Boehringer Manheim)和巢蛋白(BMS4353，Bioproducts)的抗体的阳性反应，如图.2中所示。因为MAP-2和神经丝是神经细胞的标记物而巢蛋白是神经前体细胞的标记物，因此可判断诱导的细胞具有神经细胞的特性。
采用抗神经递质合成酶酪氨酸羟化酶(AB151，Chemicon)和神经递质或神经递质-相关性蛋白囊泡乙酰胆碱转运体(AB1578，Chemicon)、神经肽Y(RIN7172，Peninsula Lab Inc.)、P物质(RPN1572，Amersham Inc.)等的抗体实施试验，如图.3中所示，显示了细胞对每个抗体约有2～4％的阳性，由此也显示出存在产生神经递质的神经细胞。
采用该步骤诱导神经细胞，在这一阶段，全部分化诱导的神经细胞的2.9±0.5％表现出对酪氨酸羟化酶(多巴胺能神经元的标记物)的反应，如图.5左所示。而且，如图.7左所示，全部分化诱导的神经细胞的1.78±0.75％表现出对囊泡乙酰胆碱转运体(通常是运动神经元的乙酰胆碱能神经元的标记物)的反应。
实施例2：多巴胺能神经元的诱导
在包含10％胎牛血清(14-501F，Lot #61-1012，Bio WhittakerCo.)，还包括50ng/ml神经胶质源性神经营养因子(GDNF)(人重组GDNF，#450-10，Peprotech EC Ltd.)、5μM毛喉素(344273，Calbiochem)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(100-18B，Peprotech EC，Ltd.)和5ng/ml血小板衍生生长因子-AA(396-HB，Peprotech EC Ltd.)的Minimum Essential Medium Alpha EagleModification(M4526，Sigma Co.)中培养分化诱导的神经细胞。
该步骤的结果为，与酪氨酸羟化酶反应的多巴胺能神经元增至全部神经细胞的17.2±5.1％(参见图.5右)。如图.4中照片所示，在GDNF处理后，用FIPC染成绿色的酪氨酸羟化酶蛋白的比率显著增加。
实施例3：乙酰胆碱能神经元的诱导
在包含10％胎牛血清(14-501F，Lot #61-1012，BioWhittakerCo.)，还包含神经生长因子(2.5S NGF，#T002A，Takara)、5μM毛喉素(344273，Calbiochem)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(100-18B，Peprotech EC，Ltd.)和5ng/ml血小板衍生生长因子-AA(396-HB，Peprotech EC Ltd.)的Minimum Essential Medium AlphaEagle Modification(M4526，Sigma Co.)中培养实施例1的分化诱导的神经细胞。
该步骤的结果是，与囊泡乙酰胆碱转运体反应的乙酰胆碱能神经元增至全部神经细胞的20.5±0.05％(参见图.7右)。如图.6中照片所示，在NGF(神经营养因子(Nts))处理后，用FIPC染成绿色的囊泡乙酰胆碱转运体蛋白的比率显著增加。
实施例4：骨骼肌诱导
从成年大鼠的骨髓(Wistar大鼠)中提取基质细胞并培养。所使用的培养基为包含20％胎牛血清(14-501F，Lot#61-1012，BioWhittaker Co.)的Minimum Essential Medium Alpha EagleModification(M4526，Sigma Co.)。
在传4代后，当细胞接近80-90％汇合时，加入3μmol/l 5-氮胞苷，然后毛喉素继续培养24小时。
然后将培养基换为包含5μM毛喉素(344273，Calbiochem)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(100-18B，Peprotech EC，Ltd.)和5ng/ml血小板衍生生长因子-AA(396-HB，Peprotech EC Ltd.)以及200ng/ml的heregulin(396-HB，R&D Systems)的培养基，然后再继续培养7日。
然后采用与实施例1相同的方法导入Notch细胞内结构域基因。
于导入后1日，加入G418硫酸盐(83-5027，Gibco BRL)至浓度为200ng/ml然后用10天时间筛选导入的细胞。
在细胞群体恢复至大约100％汇合后，将没有导入基因的未处理骨髓基质细胞加入培养基中并进行共培养。
3日后，加入5μM毛喉素(344273，Calbiochem)。再过几日后，该细胞随时间增加(图.9)融合至局部呈现多核的骨骼肌细胞(参见图.8)。采用共焦激光显微镜观测骨骼肌细胞，如图.10中所示。通过RT-PCR证实细胞中肌细胞生成素和Myf5 mRNA的表达。电子显微镜观察显示了骨骼肌细胞的肌纤维特征。
实施例5：将采用本发明的分化诱导方法获得的多巴胺能神经元 植入大鼠帕金森氏病模型纹状体中时的治疗效果
我们检测了将采用本发明的分化诱导方法获得的多巴胺能神经元植入大鼠帕金森氏病模型的效果。已经通过将6-OHDA(6-羟基多巴胺)注入大鼠脑黑质中而建立了帕金森氏病模型，这些模型用于本试验(Svendsen等，Exp.Neurol.137：376-388(1996)；Svensen等，Exp.Neurol.148：135-146(1997))。已知，将阿朴吗啡施用于所述大鼠模型可刺激旋转运动，旋转增加提示恶化，而旋转降低提示改善。
如图.11顶部所示，通过将诱导的神经细胞植入纹状体，在9周的观察期间，每分钟的旋转次数与紧接移植后相比几乎没有变化。在无处理时，每分钟的旋转次数倾向于逐渐增加(未显示)，因此水平斜率显示至少阻止了恶化。
如图.11底部所示，通过将诱导的多巴胺能神经元植入纹状体，每分钟的旋转次数从移植后的第一周开始降低，在大约半数动物中，在9周后发现每分钟的旋转次数达到0或1或2，从而得到非常显著的改善。(在9周后表现为超过8次旋转/分钟的图.11底部中的两例被认为是表示移植失败因此未在评估中予以考虑。)
为了研究本发明注射(移植)至纹状体中的多巴胺能神经元所分化出的细胞类型，在10周后提取纹状体组织并将其切片用于免疫组织化学检测。
使用逆转录病毒将能发出绿色荧光的绿色荧光蛋白(GFP)的基因整合至骨髓基质细胞染色体。因此，如图.12中免疫荧光照片所示，诱导分化自骨髓基质细胞的神经细胞，并因此植入纹状体的多巴胺能神经元，发射绿色荧光。
而且，将红光发射用于作为神经细胞标记物的神经丝，作为多巴胺能神经元标记物的酪氨酸羟化酶，作为星形胶质细胞(神经胶质细胞)标记物的GFAP和作为少突胶质细胞(神经胶质细胞)标记物的O4。
因此，GFP产生的绿光和前述标记物产生的红光叠加生成黄光，从而区分移植10周后移植的多巴胺能神经元形成的细胞类型。
如图.12所示，移植10周后几乎所有的纹状体-移植细胞分化为神经细胞而不是神经胶质细胞。而且，从相当多数量的酪氨酸羟化酶-阳性的神经细胞(即多巴胺能神经元)中判断，可以得出如下结论，本发明的体外分化诱导方法将多巴胺能神经元比率增至总神经细胞的17.2±5.1％，而前述移植进一步增加了该比率。
图.13是放大的免疫荧光照片组，显示了酪氨酸羟化酶的着色。在图.13中，无论何种细胞类型，细胞核均为蓝色(复染)。蓝色的核的位置显示了细胞的位置。
该步骤证实了在这些大鼠帕金森氏病模型中，将用本发明的分化诱导方法得到的多巴胺能神经元植入纹状体中能显著地改善帕金森氏病的症状。
下述为用于下列实施例6～11中的试验步骤。
试验步骤
培养骨髓基质细胞
本发明人以前的文献[4]中描述了从Wistar大鼠骨髓中分离MSC的方法。人MSC获自商业来源(PT-2501，BioWhittaker，Walkersville，Maryland)和健康供体(根据Kyoto University Graduate School ofMedicine的Ethics Committee的指南获得)。采用前述方法[3]分离人MSC。在包含10％胎牛血清(FBS)的α-MEM(M-4526，Sigma，St.Louis，Missouri)中培养细胞。
FACS分析
采用FITC-标记的小鼠抗-CD34(Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，California)，抗-CD54，抗-CD90和抗-CD11b/c或仓鼠抗-CD29(PharMingen，San Diego，California)孵育大鼠MSC。用FITC-标记的抗-小鼠或抗-仓鼠IgG，或者用未免疫小鼠血清孵育对照组。对人MSC使用藻红蛋白-标记的小鼠抗-CD34，抗-CD29，抗-CD90，抗-CD54，抗-CD11c和抗-血管性血友病(von-Willebrand)因子。对照组包括用藻红蛋白-标记的抗-小鼠IgG染色的细胞。获取数据然后用CellQuest软件(Becton Dickinson，Franklin Lakes，New Jersey)在FACScalibur上分析。
质粒
根据Weinmaster等(1991)39的方法对Notch1进行编号。将m-Notch1细胞内结构域NICD(开始于氨基酸1703并终止于3，非翻译区)，TM(氨基酸1747～2531)，M2(通过突变两个氨基酸Ala-Ala(1992和1993)为Glu-Phe而修饰自TM)(NICD，TM和M2由Dr.Masashi Kawaichi提供)[17，34]，mNIC Δ3’(氨基酸1846-2477，由Dr.Jeffery Nye提供)[35]，RAMIC(氨基酸1703-1969，通过NotI和AccIII酶切消化获自NICD cDNA)和TADIC(氨基酸2192-2531，通过XhoI和XbaI酶切消化获自NICD cDNA)的cDNA亚克隆至pCI-neo哺乳动物的表达载体(Promega，Madison，Wisconsin)。3-PGDH(全长和M1965二者)的荧光素酶报告质粒由Dr.ShigekiFuruya[29]提供，NeuroD由Ming-Jer Tsai[40]提供，GFAP启动子由Caleb E Finch[41]提供。采用lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，California)将这些质粒转染MSC和并根据厂商指南通过G418进行选择。
神经诱导实验
对于营养因子诱导，将NICD-转化的MSC的亚汇合培养物在包含10％FBS、5μM FSK(Calbiochem，La Jolla，California)、10ng/mlbFGF(Peprotech，London，UK)和10ng/ml CNTF(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)的α-MEM中孵育。对于GDNF处理，将50ng/ml GDNF(Peprotech)加至包含10％FBS的α-MEM培养基中。
Brd-U标记
在营养因子诱导后(5日)，将Brd-U(10μM)加入培养基，然后培养24小时。然后用4％多聚甲醛的PBS溶液将细胞固定并在TOTO-3(Molecular Probes)复染前进行MAP-2ab和Brd-U双标记。
RT-PCR分析
采用SV总RNA提取系统(Promega)分离总细胞RNA。为了分析不同mRNA的相对表达，将cDNA的量根据来自遍在表达的β-肌动蛋白mRNA的信号进行标准化。使用Taq聚合酶(Sigma)按标准步骤实施PCR。循环参数为94℃变性30秒，54-68℃退火1分钟(依赖于引物)，和72℃延伸，35个循环。
免疫细胞化学
具体步骤如前述[4]。GLAST抗体由Dr.Masahiko Watanabe[18]提供，3-PGDH由Dr.Shigeki Furuya[19]提供。下述一抗为商业购得：巢蛋白(1:500，PharMingen)、MAP-2ab(1:250，Sigma)、神经丝-M(1:200，Chemicon，Temecula，California)、β-微管蛋白同种型3(1:400，Sigma)、TuJ-1(1:100，Babco，Richmond，California)、GFAP(1:1，DAKO，Carpinteria，California)、O4(1:20，BoehringerMannheim，Germany)、GalC(1:30，Chemicon)、GABA(1:1000，Sigma)、5-羟色胺转运体(1:200，Chemicon)、囊泡乙酰胆碱转运体(1:100，Chemicon)、谷氨酰胺(1:100，Chemicon)，神经肽Y(1:1000，Peninsula Laboratories Inc.，Belmont，California)、TH(1:200，Chemicon)、VIP(1:500，Incstar，Stillwater，Minnesota)、CGRP(1:1200，Amersham，Buckinghamshire，UK)、SP(1:500，Amersham)、DAT(1:200，Chemicon)。用Alexa Fluor488-或546-缀合的二抗孵育细胞，然后进行TOTO-3碘化物复染。在共焦激光扫描显微镜(Radians2000，Bio-Rad，Hertfordshire，UK)下检测细胞
报告物测定
根据厂商指南用lipofectamine 2000(Invitrogen)转染细胞。转染后48小时，采用双荧光酶检测试剂盒(Promega)检测细胞的萤火虫和肾海鳃(Renilla)荧光酶活性。通过表达肾海鳃荧光酶的质粒将萤火虫荧光酶值进行校正以测定转染效率。
Western-印迹分析。
制备细胞溶胞产物，然后将50μg溶胞蛋白在5％和10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。采用碱性磷酸酶检测MAP-2(1:500，Chemicon)，GFAP(1:500，Dako)和TH(1:1000，Chemicon)抗体的抗原。
电生理学方法
用CEZ-2300(Nihon Kohden，Tokyo，Japan)膜片箝放大器于室温(20-25℃)检测电流。用pClamp6.0软件(Axon Instruments，Inc.，Foster City，California)控制数据采集和刺激。在5kHz滤过信号并在10～50kHz取样。采用吸量管(硼硅玻璃，Narishige，Tokyo，Japan)以4～8MΩ的电阻值在全细胞膜片箝构型中实施实验。为记录延迟整流钾电流，标准细胞外溶液包含(mM)NaCl(150)、KCI(4)、CaCl2(2)、MgCl2(2)、葡萄糖(10)和Hepes(10)(用NaOH调为pH7.4)。标准吸量管溶液为(mM)KCl(130)、MgCl2(5)、EGTA(10)和Hepes(10)(用KOH调为pH7.4)。
帕金森病模型大鼠的分析
在先的报道[45]中已经公开了建立该病模型的步骤。简言之，用戊巴比妥钠(40mg/kg，腹膜内)麻醉成体雄性Wistar大鼠(体重250-300g)，然后将6-OHDA溶液(8μg/4μl 0.1％抗坏血酸盐水)注入左内侧位前脑束(A/P＝-4.4mm；距前囱的L＝+1.1mm，距硬脑膜的V＝-7.7mm)。
将延长的对侧旋转用作目标行为，将在施用阿朴吗啡后(0.8mg/Kg，皮下)最初30分钟表现为平均低于6旋转/分钟的大鼠排除出去。将1×105细胞/8μl以下述座标：A/P＝+0.5mm；距前囟L＝+3.0mm，和V＝-4.5mm植入受损的纹状体。MSC组中动物数为5，N-MSC组中为6和G-MSC组中为10。
为了移植的纹状体(术后10周G-MSC组)的免疫组织化学，用抗神经丝-M、TH、DAT、GFAP和O4的抗体孵育神经胶质切片。然后在TOTO-3碘化物复染前，通过Alexafluor 546-标记的二抗(Molecular Probes)进行检测。
对于人MSC的移植，植入5只动物并通过每日一次皮下注射FK506(1mg/kg，Fujisawa，Osaka，Japan)来抑制免疫。移植4周后，检测阿朴吗啡诱导的旋转。为了在HPLC检测多巴胺，制备1mm厚的脑冠状切片(距前囱A/P+2.5mm～-1.5mm；共4片)，从中线分离，在包含10％FBS的α-MEM中分别培养每一面。24小时后，收集培养基然后通过SRL Communication and Health，Tokyo，Japan对其进行HPLC分析。所有动物试验均由东京大学医学研究生院的动物照管和实验委员会(the Animal Care and ExperimentationCommittee of Kyoto University Graduate School of Medicine)批准。
统计分析
将数据表示为均数±SEM。通过用Bonferroni方法进行配对比较的ANOVA比较数据。P值<0.05是显著性的，而<0.01是高度显著性的。
实施例6：MSC的鉴定
将大鼠和人MSC用于下面的试验中。采用前述方法分离大鼠MSC(Wistar)并培养[4]。人MSC获自健康供体或购自商业来源(BioWhittaker)。
采用荧光活化的细胞分选术(FACS)评测大鼠MSC和人MSC上的细胞表面标记物。MSC表达CD29(β1-整联蛋白)、CD90(Thy-1)和CD54(ICAM-1)，而不表达CD34(造血干细胞标记物)，CD11b/c(巨噬细胞-相关性标记物)或血管性血友病因子(人内皮细胞标记物，数据未显示)(图.14a)。该数据与在先报道相符[3，11]。通过免疫细胞化学检测可以获得相似的结果(图.14b-f)。根据Pittenger等(1999)[3]所述的方法证实来自大鼠和人MSC二者的脂肪性、软骨形成性和成骨性分化。这提示该细胞是间充质细胞来源(数据未显示)。
实施例7：NICD转染对MSC的效果
将NICD转染至MSC中，因为在Notch蛋白的细胞内结构域中发现Notch信号传导活性且除去细胞外结构域能得到Notch的组成型活性形式[16]。NICD包括编码小鼠Notch的细胞外小结构域部分，跨膜区和整个细胞内结构域[17]的序列，并由the Nara Institute of Scienceand Technology的Dr.Kawaichi提供。将该片段亚克隆至pCI-neo(包含CMV启动子的哺乳动物表达载体)，然后通过脂转染法和随后的G418选择将其转染至MSC中。
由于检测到Notch细胞外和细胞内结构域，因此未处理的MSC表达少量内源性Notch。然而，NICD-转染的MSC仅主要表达NICD，而未检测到细胞外结构域的(图.15a)。
在神经干细胞(NSC)和放射状胶质中存在谷氨酸转运体GLAST和3-磷酸甘油脱氢酶(3PGDH)[18，19]。其被认为与干细胞直系相关，在胚胎发生时可作为神经元的来源[20]。成年小鼠海马的齿状回中的溴脱氧尿苷(Brd-U)-阳性的NSC几乎总是3PGDH免疫阳性的[19]。在NICD转染后，大鼠MSC上调这些分子以及已知为NSC和神经祖细胞(NPC)标记物的巢蛋白二者的转录和表达[21]。未处理的MSC差不多没有表现出GLAST或3PGDH的表达，但非常少部分的细胞是巢蛋白阳性的(0.74±0.1％)。然而，在NICD转染后，这些细胞上调GLAST，3PGDH和巢蛋白(4.92±1.0％，p<0.01)(图.15b-g)。在荧光酶启动子检测中，NICD转染后大鼠MSC中5’-侧翼全长(核苷酸-3742～-1)和5’-侧翼M1965(-1792～-1)3PGDH活性(二者均报道在放射状胶质和神经上皮干细胞中具有活性[19])显著增加(p<0.01)(图.15h)。(启动子由Dr.S.Furuya，Brain ScienceInstitute，RIKEN提供)。
在脊椎动物中，NSC和神经嵴干细胞通过神经分化抑制而形成神经胶质[13，14，16]。本发明人已经证实了将NICD插入大鼠NSC中能生成GFAP-阳性的星形胶质细胞，但在NICD-转染的MSC发现了非常少的GFAP-阳性细胞(数据未显示)。另一方面，已经报道了将激活的Notchl导入小鼠前脑能在胚胎发生期间促进放射状胶质[15]同一性。由于MSC在导入NICD后表达NSC和NPC相关标记物，故可以合理地推断NICD转染使MSC将其表型变为类似于NSC和/或NPC。
NICD-转染的MSC中的神经诱导
本发明人研究了从NICD-转染的MSC选择性生成神经细胞所需的条件。因此我们检测了已知作用于神经发生的多种因子[22](神经营养因子、白血病抑制因子、bFGF和CNTF)和毛喉素。我们发现神经细胞的特定诱导最有效的条件是同时导入FSK、bFGF和CNTF。(下文中指“营养因子导入”)。
在NICD转染至大鼠MSC后，将细胞培养至60～70％汇合并导入三种营养因子(FSK+pFGF+CNTF)，5日后96.5±0.6％的细胞为MAP-2ab阳性(图.16，图.17a～d)。本发明人发现单用bFGF时MAP-2ab-阳性率为73.2±5.1％而再加入FSK和CNTF时为87.5±3.1％和83.6±3.4％。该差异不具有显著性(p>0.05)(图.16)。FSK和CNTF分别单独产生的阳性率为29.2±5.4和4.3±1.9％(p<0.01)而同时产生的阳性率为11.4±2.4％(图.16)。
营养因子对MAP-2ab细胞的诱导最有可能是通过抑制MSC向神经胶质和其它细胞分化而导致的，而不是通过特异性杀死非-神经细胞，因为在营养因子诱导后通过TOTO-3核染色几乎没有观测到死亡细胞(数据未显示)。
营养因子自身的诱导，或在插入没有NICD的pCI-neo对照载体后，导致无可识别的神经表型(图.16)。因此，NICD转染可能对MSC神经诱导非常重要。
MSC神经细胞的表征
来自前述大鼠和人MSC的神经细胞显示了明确的神经元形态学特征，所述特征包括具有丰富膨体的神经突样突起，和表达典型神经标记物如神经丝-M，β3-微管蛋白和Tuj1(图.17a-g)。巢蛋白-阳性细胞虽然很少，但仍能识别(2.03±0.7％)(数据未显示)。诱导的神经细胞在用胰蛋白酶处理后传代培养时不能增殖。营养因子诱导后5日，Brd-U的掺入研究显示了MAP-2ab阳性细胞的最小标记(图.17h)，这提示这些神经细胞不进行有丝分裂。
在未处理的MSC中通过蛋白印迹未检测到MAP-2ab，而在营养因子诱导后则可检测到(图.17l(1))。
延迟整流钾电流随发育而增高与细胞兴奋性和神经分化的成熟相关[23]。本发明人通过采用电位钳法在诱导的神经细胞研究了该特性。在来自大鼠和人类的诱导的MSC中通过正电压步骤引发外向整流K+电流。该电流幅度显著性高于未处理的MSC中的电流(图.17m-q)。本发明人还研究了紧接全细胞构型形成后，在电流钳条件下的静息膜电位。神经细胞中的静息膜电位比未处理的MSC中的低(分别是-50～-60mV和-30～-40mV)。这些在MSC诱导的神经生理学特性与成熟神经元中的类似。
在对神经胶质细胞的检测中，本发明人实施了免疫细胞化学，其中采用GFAP作为星形胶质细胞的标记物，半乳糖脑苷脂(GalC)和O4作为少突胶质细胞的标记物。大鼠或人MSC的营养因子诱导后未发现标记物-阳性神经胶质细胞(图.17i-k)。该现象由蛋白印迹得到证实(图.17l(2))。为进一步证实神经诱导的特异性，本发明人检测了NeuroD和GFAP的启动子活性。在未处理的大鼠MSC中，NeuroD和GFAP的比率分别为67.2±15.3和5.16±1.36。然而，营养因子诱导后，NeuroD活性显著性增至132.7±20.9而GFAP降至0.63±0.22(图.18)。这些结果显示了在营养因子诱导后仅从NICD-转染的MSC特异性诱导了神经细胞。
TH-阳性细胞的生成
神经功能与细胞类型特异性神经递质密切相关。因此，本发明人在营养因子诱导后进行神经递质和相关蛋白的免疫细胞化学检测(图.19a)。已知，GDNF与中脑多巴胺能神经元的发生和发展有关[36]。本发明人还检测了GDNF的施用是否诱导神经MSC增加其酪氨酸羟化酶(TH)-阳性细胞的比率。该比率从营养因子单独诱导后的3.9±0.6％增至施用GDNF后的41.0±14.1％(图.19a-c)。GDNF还诱导Nurr-1的表达，Nurr-1是在中脑前体分化为多巴胺能神经元中发挥作用的转录因子[37](图.19d)。蛋白印迹进一步证实了这些结果(图.19e)。
将神经细胞移植至帕金森氏病模型大鼠
为了研究来自MSC的神经细胞的体内存活能力和功能，将大鼠和人类细胞植入帕金森氏病模型大鼠纹状体。在中前脑束中单侧施用6-OHDA选择性破坏了黑质中的多巴胺能神经元，由此提供帕金森氏病的有用模型。植入用绿色荧光蛋白(GFP)[4]标记的三种类型的大鼠MSC：1)未处理的(MSC组)，2)用营养因子诱导变成神经细胞后(N-MSC组)，和3)诱导后施用GDNF(G-MSC组)。动物接受在受损纹状体同侧植入1×105MSC。在细胞植入后，用10周的时间检测阿朴吗啡诱导的旋转行为。MSC组显示偏离受损侧的旋转，并一直持续，而N-MSC组显示了随时间轻微恢复。相反，G-MSC组显示了旋转行为的显著性恢复(图.19f)。移植的动物追踪观察16周，在脑中未发现肿瘤形成。
植入脑后10周实施组织化学检测，包括免疫组织化学检测。移植的纹状体显示了GFP-阳性细胞，而移植细胞为神经丝阳性的，并且在不多的情况中，显示出用抗-GFAP或抗-O4抗体标记。很多移植细胞还是TH和多巴胺转运体(DAT)阳性的(图.19g-k)。GFP-标记的MSC中GFAP-阳性细胞的百分数为2.5±1.4％，而TH-和DAT-阳性细胞的百分数分别为45.7±4.2％和30.7±0.9％。在G-MSC组的连续切片中，发现移植细胞移入并在宿主纹状体中延伸(图.19l)。在纹状体中细胞计数大约为3.4×104(34％)。
将人GDNF-处理的神经MSC同样植入6-OHDA-受损大鼠的纹状体。每日用FK506对动物实施免疫抑制，在4周记录旋转行为。移植导致旋转行为的显著改善(平均旋转指数，术后/前，为0.44±0.2)(图.19m)。采用高效液相色谱法(HPLC)检测移植脑切片的培养基中多巴胺浓度从而评测植入的人MSC合成和释放多巴胺的能力。从中线将脑切片，分为植入侧和完整侧，然后分开培养。检测每侧的培养基中多巴胺浓度并计算受损与完整侧的比率。伪操作(sham-operated)的大鼠显示比率为0.57±0.01(n＝3)而移植动物的比率为0.67±0.04(n＝3)。这与移植的多巴胺释放的增加(p＝0.04)一致。这些结果提示了从人MSC诱导的细胞能够在受损的大鼠纹状体中合成和释放多巴胺。
参考文献
1.Bishop，A.E.，Buttery，L.D.& Polak，J.M.Embryonic stemcells(Review).J.Pathol.197，424-429(2002).
2.Weissman，I.L.Stem cells：units of development，units ofregeneration，and units in evolution(Review).Cell 100，157-168(2000).
3.Pittenger，M.F.等Multilineage potential of adult humanmesenchymal stem cells.Science 284，143-147(1999).
4.Dezawa，M.等Sciatic nerve regeneration in rats inducedby transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromalcells.Eur.J.Neurosci.14，1771-1776(2001).
5.Jiang，Y.等Pluripotency of mesenchymal stem cellsderived from adult marrow.Nature 418，41-49(2002).
6.Eglitis，M.A.，Dawson，D.，Park，K.w.& Mouradian，M.M.Targeting of marrow-derived astrocytes to the ischemic brain.Neuroreport 10，1289-1292(1999).
7.Kopen，G.C.，Prockop，D.J.& Phinney，D.G.Marrow stromalcells migrate throughout forebrain and cerebellum，and theydifferentiate into astrocytes after inj ection into neonatal mouse brains.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 96，10711-10716(1999).
8.Terada，N.等Bone marrow cells adopt the phenotype ofother cells by spontaneous cell fusion.Nature 416，542-545(2002).
9.Wagers，A.J.，Sherwood，R.I.，Christensen，J.L.& Weissman，I.L.Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoieticstem cells.Science 297，2256-2259(2002).
10.Woodbury，D.，Schwarz，E.J.，Prockop，D.J.& Black，I.B.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate intoneurons.J.Neurosci.Res.61，364-370(2000).
11.Kohyama，J.等Brain from bone：efficient“meta-differentiation”of marrow stroma-derived mature osteoblaststo neurons with Noggin or a demethylating agent.Differentiation 68，235-244(2001).
12.Sauchez-Ramos，JR.Neural cells derived from adult bonemarrow and umbilical cord blood.J.Neurosci.Res.69，880-893(2002).
13.Lundkvist，J.& Lendahl，U.Notch and the birth of glial cells(Review).Trends Neurosci.24，492-494(2001).
14.Morrison，S.J.等Transient Notch activation initiates anirreversible switch from neurogenesis to gliorenesis by neural creststem cells.Cell 101，499-510(2000).
15.Gaiano，N.，Nye，J.S.& Fishell，G.Radial glial identity ispromoted by Notch1 signaling in the murine forebrain.Neuron 26，395-404(2000).
16.Nye，J.S.，Kopan，R.&Axel，R.an activated Notch suppressesneurogenesis and myogenesis but not gliogenesis in mammalian cells.Development 120，2421-2430(1994).
17.Yamamoto，N.等Role of Deltex-1 as a transcriptionalregulator downstream of the Notch receptor.J.Biol.Chem.276，45031-45040(2001).
18.Shibata，T.等Glutamate transporter GLAST is expressedin the Radial glial-astrocyte lineage of developing mouse spinal cord.J.Neurosci.17，9212-9219(1997).
19.Yamasaki，M.等3-Phosphoglycerate dehydrogenase，a keyenzyme for 1-serine biosynthesis，is preferentially expressed in theRadial glial/astrocyte lineage and olfactory ensheathing glia in themouse brain.J.Neurosci.21，7691-7704(2001).
20.Gregg，C.T.，Chojnacki，A.K.& Weiss，S.Radial glial cells asneural precursors：the next generation？J.Neurosci.Res.69，708-713(2002).
21.Roy，N.S.等In vitro neurogenesis by progenitor cellsisolated from the adult human hippocampus.Nat.Med.6，271-277(2000).
22.Ip，N.Y.The neurotrophins and neuropoietic cytokines：twofamilies of growth factors acting on neural and hematopoietic cells(Review).Ann.N.Y.Acad.Sci.840，97-106(1998).
23.Grosse，G.等Expression of Kv1 potassium channels inmouse hippocampal primary cultures：development andactivity-dependent regulation.J.Neurosci.20，1869-1882(2000).
24.Morrison，S.J.Neural differentiation：proneural genesinhibit gliogenesis(Review).Curr.Biol.11，R349-351(2001).
25.Sun，Y.等Neurogenin promotes neurogenesis and inhibitsglial differentiation by independent mechanisms.Cell 104，365-376(2001).
26.Ishibashi，M.等Persistent expression of helix-loop-helixfactor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in thecentral nervous system.EMBO J.13，1799-1805(1994).
27.Furukawa，T.等rax，Hesl，and notch1 promote theformation of Muller glia by postnatal retinal progenitor cells.Neuron26，383-394(2000).
28.Seidel，H.M.，Lamb，P.& Rosen，J.Pharmaceuticalintervention in the JAK/Stat signaling pathway(Review).Oncogene19，2645-2656(2000).
29.Burdon，T.，smith，A.&Savatier，P.Signalling，cell cycle andpluripotency in embryonic stem cells.Trends Cell Biol.12，432-438(2002).
30.Nakashima，K.等BMP2-mediated alteration in thedevelopmental pathway of fetal mouse brain cells from neurogenesisto astrocytogenesis.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.98，5868-5873(2001).
31.Stork，P.J.&Schmitt，J.M.Crosstalk between cAMP andMAP kinase signaling in the regulation of cell proliferation.TrendsCell Biol.12，258-266(2002).
32.Neufeld，B.等Serine/Threonine kinases 3pK andMAPK-activated protein kinase 2 interact with the basiehelix-loop-helix transcription factor E47 and repress itstranscriptional activity.J.Biol.Chem 275，20239-20242(2000).
33.Shimazaki，T.，Shingo，T.& Weiss，S.The ciliary neurotrophicfactor/leukemia inhibitory factor/gp 130 receptor complex operates inthe maintenance of mammalian forebrain neural stem cells.J.Neurosci.21，7642-7653(2001).
34.Kurooka，H.，Kuroda，K.& Honjo，T.Roles of the ankyrinrepeats and C-terminal region of the mouse notch1 intracellularregion.Nucleic Acids Res.26，5448-5455(1998).
35.Franklin，J.L.等Autonomous and non-autonomousregulation of mammalian neurite development by Notch1and Deltal.Curr.Biol.9，1448-1457(1999).
36.Akerud，P.等Differential effects of glial cell line-derivedneurotrophic factor and neurturin on developing and adult substantianigra dopaminergic neurons.J.Neurochem.73，70-78(1999).
37.Sakurada，K.，Ohshima-Sakurada，M.，Palmer，T.D.& Gage，F.H.Nurr1，an orphan nuclear receptor，is a transcriptional activatorof endogenous tyrosine hydroxylase in neural progenitor cells derivedfrom the adult brain.Development 126，4017-4026(1999).
38.Kim，J.H.等Dopamine neurons derived from embryonicstem cells function in an animal model of Parkinson’s disease.Nature418，50-56(2002).
39.Weinmaster，G.，Roberts，V.J.& Lemke，G.A homolog ofDrosophila Notch expressed during mammalian development.Development 113，199-205(1991).
40.Peyton，M.等BETA3，a novel helix-loop-helix protein，canact as a negativeregulator of BETA2 and MyoD-responsive genes.Mol.Cell Biol.16，626-33(1996).
41.Rozovsky，I.等Estradiol(E2)enhances neurite outgrowthby repressing glial fibrillary acidic protein expression andreorganizing laminin.Endocrinology 143，636-646(2002).
42.Seta，Y.，Toyono，T.，Takeda，S.& Toyoshima，K.Expressionof Mash1 in basal cells of rat circumvallate taste buds is dependentupon gustatory innervation.FEBS Lett.444，43-46(1999)
43.Schwaiger，F.W.等Peripheral but not central axotomyinduces changes in Janus kinases(JAK)and signal transducers andactivators of transcription(STAT).Eur.J.Neurosci.12，1165-1176(2000).
44.Kawasaki，H.等Induction of midbrain dopaminergicneurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.Neuron 28，31-40(2000).
45.Tanaka，H.等Role of serotonergic neurons inL-DOPA-derived extracellular dopamine in the striatum of6-OHDA-lesioned rats.Neuroreport 10，631-634(1999).

Claims (56)

1.一种将骨髓基质细胞(BMSC)体外诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法，包括将Notch基因导入所述BMSC，其中所得分化细胞是导入了Notch基因的BMSC的子代。
2.一种将BMSC体外诱导分化为神经前体细胞的方法，包括如下步骤：
(1)从骨髓分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中培养所述细胞；和
(2)将Notch基因导入所述细胞，和进一步培养所述细胞以生成神经前体细胞。
3.根据权利要求2的方法，其中所述分离的BMSC源自人类。
4.用根据权利要求2或3的方法制备的神经前体细胞。
5.一种将BMSC体外诱导分化为神经细胞的方法，包括如下步骤：
(1)从骨髓分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中培养所述细胞；
(2)将Notch基因导入所述细胞，和进一步培养所述细胞，和
(3)在所述培养基中加入环腺苷酸(cAMP)-增多剂，和/或细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞以生成所述神经细胞，其中所得分化细胞是导入了Notch基因的BMSC的子代。
6.根据权利要求5的方法，其中所述标准基本培养基是伊格尔氏α改良的最低必需培养基。
7.根据权利要求5的方法，其中所述血清是胎牛血清。
8.根据权利要求5的方法，其中所述导入所述Notch基因通过使用能在哺乳动物表达的载体的脂转染法实施。
9.根据权利要求5的方法，还包括，在步骤(2)和(3)间，在一个预定的时期选择已经导入了基因的细胞的步骤。
10.根据权利要求5的方法，其中所述cAMP-增多剂是毛喉素。
11.根据权利要求5的方法，其中所述cAMP-增多剂浓度是0.001nM～100μM。
12.根据权利要求5的方法，其中所述细胞分化刺激因子选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、睫状神经营养因子(CNTF)及其混合物。
13.根据权利要求5的方法，其中所述细胞分化刺激因子的浓度是0.001ng/ml～100μg/ml。
14.根据权利要求5～13任一项的方法，其中所述分离的BMSC源自人类。
15.用根据权利要求5～13任一项的方法制备的神经细胞。
16.用根据权利要求14的方法制备的神经细胞。
17.一种将BMSC体外诱导分化为多巴胺能神经元的方法，包括如下步骤：
(1)从骨髓分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中培养所述细胞；
(2)将Notch基因导入所述细胞，和进一步培养所述细胞，
(3)在所述培养基中加入环腺苷酸(cAMP)增多剂，和/或细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞以生成所述神经细胞；
(4)在添加了血清的标准基本培养基中培养步骤(3)中得到的神经细胞；和
(5)在所述培养基中加入神经胶质源性神经营养因子(GDNF)，和cAMP增多剂，和除所述GDNF外的细胞分化刺激因子，并且进一步培养所述细胞以获得所述多巴胺能神经元，
其中所得多巴胺能神经元是导入了所述Notch基因的BMSC的子代。
18.根据权利要求17的方法，其中步骤(4)中的所述标准基本培养基是伊格尔氏α改良的最低必需培养基。
19.根据权利要求17的方法，其中步骤(4)中的所述血清是胎牛血清。
20.根据权利要求17的方法，其中步骤(5)中的所述cAMP增多剂是毛喉素。
21.根据权利要求17的方法，其中步骤(5)中的所述cAMP-增多剂的浓度是0.001nM～100μM。
22.根据权利要求17的方法，其中步骤(5)中除所述GDNF以外的所述细胞分化刺激因子选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)及其混合物。
23.根据权利要求17的方法，其中步骤(5)中所述GDNF的浓度是0.001ng/ml～100μg/ml。
24.根据权利要求17的方法，其中步骤(5)中所述GDNF的浓度是1ng/ml～100ng/ml。
25.根据权利要求17的方法，其中步骤(5)中除GDNF以外的所述细胞分化刺激因子的浓度是0.001ng/ml～100μg/ml。
26.根据权利要求17～25任一项的方法，其中所述分离的BMSC源自人类。
27.用根据权利要求17～25任一项的方法制备的多巴胺能神经元。
28.用根据权利要求26的方法制备的多巴胺能神经元。
29.一种将BMSC体外诱导分化为乙酰胆碱能神经元的方法，包括如下步骤：
(1)从骨髓分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中培养所述细胞；
(2)将Notch基因导入所述细胞，和进一步培养所述细胞；
(3)在所述培养基中加入环腺苷酸(cAMP)-增多剂，和/或细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞以生成所述神经细胞；
(4)在添加了血清的标准基本培养基中培养步骤(3)中得到的神经细胞；和
(5)在所述培养基中加入神经生长因子(NGF)和cAMP-增多剂和除NGF外的细胞分化刺激因子，并且进一步培养所述细胞以获得所述乙酰胆碱能神经元，
其中所得乙酰胆碱能神经元是导入了所述Notch基因的BMSC的子代。
30.根据权利要求29的方法，其中步骤(4)中所述标准基本培养基是伊格尔氏α改良的最低必需培养基。
31.根据权利要求29的方法，其中步骤(4)中所述血清是胎牛血清。
32.根据权利要求29的方法，其中步骤(5)中所述cAMP-增多剂是毛喉素。
33.根据权利要求29的方法，其中步骤(5)中所述cAMP-增多剂的浓度是0.001nM～100μM。
34.根据权利要求29的方法，其中步骤(5)中所述除NGF以外的细胞分化刺激因子选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)及其混合物。
35.根据权利要求29的方法，其中步骤(5)中所述NGF的浓度是0.001ng/ml～100μg/ml。
36.根据权利要求35的方法，其中步骤(5)中所述NGF的浓度为1ng/ml～100ng/ml。
37.根据权利要求29的方法，其中步骤(5)中所述除NGF以外的细胞分化刺激因子的浓度是0.001ng/ml～100μg/ml。
38.根据权利要求29～37任一项的方法，其中所述分离的BMSC源自人类。
39.用根据权利要求29～37任一项的方法制备的乙酰胆碱能神经元。
40.用根据权利要求38的方法制备的乙酰胆碱能神经元。
41.一种将BMSC体外诱导分化为骨骼肌细胞的方法，包括如下步骤：
(1)从骨髓分离BMSC，和在添加了血清的标准基本培养基中培养所述细胞；
(2)在所述培养基中加入脱甲基剂，和进一步培养所述细胞；
(3)在所述培养基中加入cAMP-增多剂，和/或细胞分化刺激因子，和进一步培养所述细胞；
(4)将Notch基因导入所述细胞，和进一步培养所述细胞，和
(5)将导入了所述基因的所述细胞与没有导入所述基因的未处理的BMSC共培养；和
(6)在所述培养基中加入cAMP-增多剂，和进一步培养所述细胞以获得所述骨骼肌细胞，
其中所得分化细胞是导入了所述Notch基因的BMSC的子代。
42.根据权利要求41的方法，其中所述标准基本培养基是伊格尔氏α改良的最低必需培养基。
43.根据权利要求41的方法，其中所述血清是胎牛血清。
44.根据权利要求41的方法，其中所述脱甲基剂是5-氮胞苷。
45.根据权利要求41的方法，其中所述5-氮胞苷的浓度为30nmol/l～300μmol/l。
46.根据权利要求41的方法，其中步骤(3)中所述cAMP-增多剂是毛喉素。
47.根据权利要求41的方法，其中步骤(3)中所述的cAMP-增多剂浓度是0.001nM～100μM。
48.根据权利要求41的方法，其中所述细胞分化刺激因子选自碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)、Heregulin，及其混合物。
49.根据权利要求41的方法，其中所述细胞分化刺激因子的浓度是0.001ng/ml～100μg/ml。
50.根据权利要求41的方法，其中所述导入所述Notch基因通过使用能在哺乳动物中表达的载体的脂转染法实施。
51.根据权利要求41的方法，其中还包括，在步骤(4)和(5)间，在一个预定的时期选择已导入了所述基因的细胞的步骤。
52.根据权利要求41的方法，其中步骤(5)中所述cAMP-增多剂是毛喉素。
53.根据权利要求41的方法，其中步骤(5)中所述cAMP-增多剂的浓度是0.001nm～100μm。
54.根据权利要求41～53任一项的方法，其中所述分离的BMSC源自人类。
55.用根据权利要求41～53任一项的方法制备的骨骼肌细胞。
56.用根据权利要求54的方法制备的骨骼肌细胞。
CNB038055961A 2002-02-06 2003-02-06 通过导入notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法 Expired - Lifetime CN100497621C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP30003/2002 2002-02-06
JP2002030003A JP3948971B2 (ja) 2001-08-30 2002-02-06 Ｎｏｔｃｈ遺伝子の導入を用いて骨髄間質細胞を神経細胞及び骨格筋細胞に分化・誘導する方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910147488XA Division CN101584869B (zh) 2002-02-06 2003-02-06 通过导入notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1639335A CN1639335A (zh) 2005-07-13
CN100497621C true CN100497621C (zh) 2009-06-10

Family

ID=27677898

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB038055961A Expired - Lifetime CN100497621C (zh) 2002-02-06 2003-02-06 通过导入notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法
CN200910147488XA Expired - Lifetime CN101584869B (zh) 2002-02-06 2003-02-06 通过导入notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910147488XA Expired - Lifetime CN101584869B (zh) 2002-02-06 2003-02-06 通过导入notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法

Country Status (10)

Country Link
US (7) US7682825B2 (zh)
EP (2) EP1479767B1 (zh)
CN (2) CN100497621C (zh)
AU (1) AU2003207064B2 (zh)
CA (1) CA2475288C (zh)
DK (1) DK1479767T3 (zh)
ES (1) ES2431518T3 (zh)
HK (2) HK1078610A1 (zh)
PT (1) PT1479767E (zh)
WO (1) WO2003066856A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104519891A (zh) * 2012-05-16 2015-04-15 桑比欧公司 用于治疗创伤性脑损伤和用于调节神经原性细胞迁移的方法和组合物

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003207064B2 (en) 2002-02-06 2006-07-13 Sanbio, Inc. Method of differentiating/inducing bone marrow interstitial cells into nerve cells and skeleton muscle cells by transferring Notch gene
US20050265983A1 (en) * 2002-11-17 2005-12-01 Eldad Melamed Methods, nucleic acid constructs and cells for treating neurodegenerative disorders
EP1619242A4 (en) * 2003-03-25 2006-09-06 Japan Science & Tech Agency CONTROL OF INDUCTION OF DIFFERENTIATION OF STEM CELLS AND DIFFERENTIATION CAPACITY
EP2314674A1 (en) * 2004-04-12 2011-04-27 SanBio, Inc. Cells exhibiting neuronal progenitor cell characteristics
JP4581085B2 (ja) * 2004-12-24 2010-11-17 国立大学法人京都大学 骨格筋細胞の分化誘導方法
US20060216276A1 (en) * 2005-03-07 2006-09-28 Mari Dezawa Use of materials for treatment of central nervous system lesions
GB0504881D0 (en) * 2005-03-09 2005-04-13 Univ Edinburgh Directed neural differentiation
AU2006225986B2 (en) 2005-03-23 2011-09-01 Qualcomm Incorporated Method and system for digital pen assembly
EP2465924A3 (en) 2005-06-16 2013-01-02 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Isolated cells and populations comprising same for the treament of cns diseases
WO2008102460A1 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Sanbio Inc. Transplantation of bone marrow stromal cell-induced neural stem cells for promoting fuctional recovery after spinal cord injury
JP5662147B2 (ja) * 2007-08-15 2015-01-28 サンバイオ，インコーポレイティド 神経変性を治療するための方法及び組成物
US10702554B2 (en) 2007-12-03 2020-07-07 Sanbio, Inc. Extracellular matrix from pluripotent cells
EP2222839B1 (en) * 2007-12-03 2015-09-16 SanBio, Inc. Methods and compositions for modulating differentiation of pluripotential cells
CN102027118B (zh) * 2008-04-30 2014-07-30 桑比欧公司 含有dna甲基化状态改变的神经再生细胞
WO2009144718A1 (en) 2008-05-28 2009-12-03 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Mesenchymal stem cells for the treatment of cns diseases
CN102666855A (zh) * 2009-06-10 2012-09-12 脑干生物技术有限公司 用于多能性基质细胞的神经元分化的方法、系统和组合物
CN106692193B (zh) 2011-04-06 2021-01-05 桑比欧公司 用于调节外周免疫功能的方法和组合物
US20120263681A1 (en) * 2011-04-12 2012-10-18 Fujifilm Corporation Composition comprising cell and biocompatible polymer
WO2013112917A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Sanbio, Inc. Methods and compositions for modulating angiogenesis and vasculogenesis
EP3401394A1 (en) 2012-02-22 2018-11-14 Exostem Biotec Ltd Generation of neural stem cells
EP2880151B1 (en) * 2012-08-06 2020-06-03 Brainstorm Cell Therapeutics Ltd. Methods of generating mesenchymal stem cells which secrete neurotrophic factors
JP5856029B2 (ja) * 2012-08-31 2016-02-09 阿部　博幸 間葉系幹細胞を未分化増殖させる方法、および間葉系幹細胞を濃縮する方法
AU2013330433B2 (en) 2012-10-09 2016-06-16 Sanbio, Inc. Methods and compositions for treatment of retinal degeneration
US10564149B2 (en) 2014-02-11 2020-02-18 Brainstorm Cell Therapeutics Ltd. Populations of mesenchymal stem cells that secrete neurotrophic factors
CN111668430A (zh) 2014-05-13 2020-09-15 赛尔格有限责任公司 功能化的多孔膜及其制造和使用方法
JP6663445B2 (ja) 2015-04-01 2020-03-11 サンバイオ，インコーポレイティド 細胞増殖の刺激のための方法及び組成物、ならびにｆｇｆ２アイソフォームの生物学的に活性な混合物の提供
CN106399381B (zh) * 2015-07-30 2019-11-26 中国农业大学 miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用
CA3030866A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Sanbio, Inc. Msc growth predictor assays
EP3548114A4 (en) 2016-12-28 2020-07-15 SanBio, Inc. CELL RELEASE SYSTEM AND METHOD FOR THE OPERATION THEREOF
CN111793608B (zh) * 2017-07-28 2022-05-17 杨涛 定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的HS5条件培养基
WO2019073055A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Imba - Institut Für Molekulare Biotechnologie Gmbh ENHANCED REPROGRAMMING OF SOMATIC CELLS
KR20240012562A (ko) * 2021-05-27 2024-01-29 샌바이오, 인크. 소규모 뇌졸중에 대한 세포 치료법 및 치료 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999056759A1 (en) * 1998-05-07 1999-11-11 University Of South Florida Bone marrow cells as a source of neurons for brain and spinal cord repair
CN1242802A (zh) * 1996-11-07 2000-01-26 洛伦蒂斯有限公司 Notch蛋白及其配体
WO2001022978A2 (en) * 1999-09-30 2001-04-05 Mcgill University Autologous marrow stem cell (msc) transplantation for myocardial regeneration

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5226914A (en) * 1990-11-16 1993-07-13 Caplan Arnold I Method for treating connective tissue disorders
DE4138621A1 (de) * 1991-11-25 1993-06-17 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum screenen von substanzen mit modulierender wirkung auf einen rezeptorabhaengigen zellulaeren signaluebertragungsweg
US5591625A (en) * 1993-11-24 1997-01-07 Case Western Reserve University Transduced mesenchymal stem cells
US5780300A (en) * 1995-09-29 1998-07-14 Yale University Manipulation of non-terminally differentiated cells using the notch pathway
WO2000017326A1 (en) * 1998-09-21 2000-03-30 Musc Foundation For Research Development Non-hematopoietic cells, including cardiomyocytes and skeletal muscle cells, derived from hematopoietic stem cells and methods of making and using them
US7105150B2 (en) * 1999-02-12 2006-09-12 Stemcells California, Inc. In vivo screening methods using enriched neural stem cells
US7015037B1 (en) * 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
US6555374B1 (en) * 1999-08-19 2003-04-29 Artecel Sciences, Inc. Multiple mesodermal lineage differentiation potentials for adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof
ES2292564T3 (es) 2000-02-11 2008-03-16 Philadelphia Health And Education Corporation Diferenciacion de celulas de la medula osea en celulas neuronales y usos asociados.
KR100449141B1 (ko) * 2001-04-19 2004-09-21 (주)라이프코드 간엽 간세포를 신경세포로 분화시키는 방법
AU2003207064B2 (en) 2002-02-06 2006-07-13 Sanbio, Inc. Method of differentiating/inducing bone marrow interstitial cells into nerve cells and skeleton muscle cells by transferring Notch gene
US20060216276A1 (en) * 2005-03-07 2006-09-28 Mari Dezawa Use of materials for treatment of central nervous system lesions
JP5662147B2 (ja) * 2007-08-15 2015-01-28 サンバイオ，インコーポレイティド 神経変性を治療するための方法及び組成物
EP2222839B1 (en) 2007-12-03 2015-09-16 SanBio, Inc. Methods and compositions for modulating differentiation of pluripotential cells
CN102027118B (zh) * 2008-04-30 2014-07-30 桑比欧公司 含有dna甲基化状态改变的神经再生细胞

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1242802A (zh) * 1996-11-07 2000-01-26 洛伦蒂斯有限公司 Notch蛋白及其配体
WO1999056759A1 (en) * 1998-05-07 1999-11-11 University Of South Florida Bone marrow cells as a source of neurons for brain and spinal cord repair
WO2001022978A2 (en) * 1999-09-30 2001-04-05 Mcgill University Autologous marrow stem cell (msc) transplantation for myocardial regeneration

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NOTCH SIGNALLING VIA RBP-J PROMOTES MYELOIDDIFFERENTIATION.. SCHROEDER T ET AL.EMBO J.,Vol.19 No.11. 2000
NOTCH SIGNALLING VIA RBP-J PROMOTES MYELOIDDIFFERENTIATION.. SCHROEDER T ET AL.EMBO J.,Vol.19 No.11. 2000 *
PHENOTYPICAL AND FUNCTIONAL PROPERTIES OFHUMAN BONE MARROW MESENCHYMAL PROGENITORCELLS.. PAULETTE A ETAL.JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY,Vol.181 . 1999
PHENOTYPICAL AND FUNCTIONAL PROPERTIES OFHUMAN BONE MARROW MESENCHYMAL PROGENITORCELLS.. PAULETTE A ETAL.JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY,Vol.181 . 1999 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104519891A (zh) * 2012-05-16 2015-04-15 桑比欧公司 用于治疗创伤性脑损伤和用于调节神经原性细胞迁移的方法和组合物
CN104519891B (zh) * 2012-05-16 2019-03-22 桑比欧公司 用于治疗创伤性脑损伤和用于调节神经原性细胞迁移的方法和组合物

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003207064B2 (en) 2006-07-13
US9399046B2 (en) 2016-07-26
CA2475288C (en) 2014-09-02
PT1479767E (pt) 2013-11-07
US20120009160A1 (en) 2012-01-12
DK1479767T3 (da) 2013-11-25
US7682825B2 (en) 2010-03-23
WO2003066856A1 (en) 2003-08-14
CA2475288A1 (en) 2003-08-14
US20160151418A9 (en) 2016-06-02
EP2270146A1 (en) 2011-01-05
AU2003207064A1 (en) 2003-09-02
CN101584869B (zh) 2013-03-27
CN101584869A (zh) 2009-11-25
US10196605B2 (en) 2019-02-05
US20100310523A1 (en) 2010-12-09
US8361456B2 (en) 2013-01-29
EP1479767A4 (en) 2005-02-16
CN1639335A (zh) 2005-07-13
US20130209428A1 (en) 2013-08-15
US20160304835A1 (en) 2016-10-20
US8969078B2 (en) 2015-03-03
US20190136183A1 (en) 2019-05-09
US11512284B2 (en) 2022-11-29
HK1078610A1 (en) 2006-03-17
US20060166362A1 (en) 2006-07-27
EP1479767B1 (en) 2013-08-21
EP1479767A1 (en) 2004-11-24
ES2431518T3 (es) 2013-11-26
US20100144034A1 (en) 2010-06-10
US8133725B2 (en) 2012-03-13
HK1139039A1 (en) 2010-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100497621C (zh) 通过导入notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法
Dezawa et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation
Pires et al. Old and new challenges in Parkinson's disease therapeutics
EP1737950B9 (en) Cells exhibiting neuronal progenitor cell characteristics
US20100129319A1 (en) Treatment of disease or injury of the nervous system using agents that decrease the activity of the melanocortin 4 receptor
Dezawa et al. Treatment of neurodegenerative diseases using adult bone marrow stromal cell-derived neurons
Dezawa Insights into autotransplantation: the unexpected discovery of specific induction systems in bone marrow stromal cells
Song et al. A novel approach to facilitate dopaminergic neuron generation from stem-cells: the combination of genetic modification and signaling factors within a three-dimensional perfusion microbioreactor
Marques Exploring the Secretome of Mesenchymal Like Stem Cells for Central Nervous System Regenerative Medicine: A Focus on Parkinson's Disease
Kumar Cell based therapy in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1078610

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1078610

Country of ref document: HK

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20050713

Assignee: Okonvision biomedical (Shanghai) Co.,Ltd.

Assignor: Aokangweishi biomedical (Hong Kong) Co.,Ltd.

Contract record no.: X2020990000354

Denomination of invention: Method of differentiating/inducing bone marrow interstitial cells into nerve cells and skeleton muscle cells by transferring NOTCH gene

Granted publication date: 20090610

License type: Exclusive License

Record date: 20200717

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20090610

CX01 Expiry of patent term