PT1479767E - Processo de diferenciação/indução de células intersticiais da medula óssea em células nervosas e células de músculo esquelético por transferência do gene notch - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"PROCESSO DE DIFERENCIAÇÃO/INDUÇÃO DE CÉLULAS ESTROMAIS DA MEDULA ÓSSEA EM CÉLULAS NERVOSAS POR TRANSFERÊNCIA DO GENE NOTCH"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a um processo de indução da diferenciação das células estromais da medula óssea em células precursoras neuronais ou células neuronais e, especialmente, neurónios dopaminérgicos, por introdução de um gene Notch, e refere-se ainda a células precursoras neuronais obtidas pelo processo e à utilização terapêutica das células. Técnica Anterior A reconstrução da função neuronal em doenças neurodegenerativas avançadas, tais como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, ALS (esclerose lateral amiotrófica) e semelhantes requer a substituição das células neuronais perdidas por morte celular. Embora o transplante de células neuronais tenha sido tentado em experiências com animais utilizando células estaminais neuronais embrionárias ou adultas, células ES e células neuronais embrionárias, essas utilizações enfrentam grandes obstáculos contra a sua aplicação em humanos. Questões éticas envolvem a utilização de células estaminais embrionárias ou células neuronais e a questão de garantir um fornecimento estável também é uma preocupação. A capacidade demonstrada das 1 células ES para se diferenciarem está actualmente a atrair muita atenção mas, além das numerosas questões éticas, o custo e o trabalho necessários para induzir a diferenciação em tipos específicos de células e o risco de formação de tumores teratóides após a transplantação são factores que impedem a aplicação estável desta tecnologia. Para utilizar células estaminais neuronais adultas, estas têm de ser extraídas por craniotomia uma vez que se encontram numa secção de núcleo muito limitada do sistema nervoso central e, portanto, os doentes submetidos a um tratamento de regeneração também estão expostos a um tremendo risco e carga.

Apesar de terem passado aproximadamente 10 anos desde o isolamento de células estaminais do sistema nervoso central in vitro, ainda não foi possível pelos protocolos actualmente aceites diferenciar células estaminais neuronais e obter grandes quantidades de neurónios dopaminérgicos ou colinérgicos funcionais (Lorenz Studer, Nature Biotechnology Dec. Issue, p. 117 (2001).

Um grupo de investigação liderado pelos Professores Samuel Weiss da Universidade de Calgary (Canadá) e Tetsuro Shingo teve sucesso na indução eficiente da diferenciação de células neuronais produtoras de dopamina por administração de uma mistura de vários factores indutores de tirosina hidroxilase (cocktail TH) em cérebros de murganhos. A diferenciação de células estromais da medula óssea (BMSC) em células precursoras neuronais compreendendo a adição de agentes de aumento de cAMP como dibutiril cAMP cíclico (dbcAMP) ou isobutirilmetilxantina (IBMX) ao meio também foi publicada (Deng et al., 2001, Biochemical And Biophysical Research Communications 282, 148-152) . 2

Os neurónios motores são acetilcolinérgicos e a sua aplicação a tais doenças incuráveis como ALS (esclerose lateral amiotrófica) foi considerada. Na ALS, a morte dos neurónios motores da medula espinal por razões ainda desconhecidas leva à perda de nervos que controlam os músculos, impedindo assim o movimento dos músculos através do corpo, incluindo os músculos respiratórios e levando à morte do doente dentro de 2-3 anos após o inicio. Actualmente, não existe um tratamento eficaz para esta doença, mas estão a ser estabelecidos modelos de ALS em ratos. A maioria das doenças degenerativas musculares, tal como a distrofia muscular, são progressivas e, portanto, o transplante de células do músculo esquelético pode constituir um tratamento eficaz. Em indivíduos saudáveis, as células satélites presentes em tecido muscular suplementam o músculo esquelético que perdeu a sua capacidade de regeneração, mas em doenças musculares progressivas, o número destas células é reduzido e a capacidade de regeneração é consequentemente inferior. Assim, enquanto o transplante do músculo esquelético das células suas precursoras pode ser utilizado como tratamento, não existem ainda meios curativos eficazes.

No decurso do desenvolvimento do sistema nervoso central, os neurónios e células gliais são induzidos a diferenciar de células precursoras neuronais relativamente homogéneas ou de células estaminais neuronais. Existe um mecanismo através do qual algumas das células da população de células precursoras se diferenciam em certos subtipos de células em resposta a sinais de diferenciação, enquanto que as outras células permanecem indiferenciadas. Especificamente, células previamente diferenciadas enviam certos sinais para as suas células 3 circundantes para impedir mais diferenciação de células do seu próprio tipo. Este mecanismo é conhecido como inibição lateral. Em Drosophila, células já diferenciadas em neurónios expressam o ligando "Delta" enquanto que as suas células circundantes expressam o receptor Delta "Notch", e a ligação do ligando ao receptor garante que as células circundantes não se diferenciam em células neuronais (sinalização Notch). 0 sistema Delta-Notch parece funcionar também em células da medula espinal (ver, por exemplo, Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D.,

Kintner, C.: Nature, 375, 761-766(1995)).

Crê-se que a interacção celular através da proteína membranar Notch desempenha um papel importante no processo de desenvolvimento pelo qual de um grupo de células homogéneo produz muitos tipos diferentes e, especificamente, por estimulação do ligando por células adjacentes, a Notch induz a expressão de HES1 ou HES5 que inibem factores de diferenciação bHLH (hélice-ansa-hélice básico), tais como Mashl, Mathl e neurogenina, para suprimir a diferenciação para o mesmo tipo de células que a célula adjacente (ver, por exemplo, Kageyama et al., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol. 18, N°. 9, 1301-1306 (1999)) . A via intracelular de Notch é actualmente entendida como se segue. Quando Notch é primeiro activada por ligandos na superfície de células adjacentes (Delta, Serrate, Jagged), o seu domínio intracelular é removido por clivagem (Artavanis-Tsakonas S. et al. : Science (1999) 284: 770-776 e Kageyama et al., Saibo

Kogaku [Cell Engineering) Vol. 18, n° 9, 1301-1306 (1999)). Após a clivagem do domínio intracelular de Notch, migra da membrana celular para o núcleo com a ajuda de um sinal de localização nuclear (NLS) e no núcleo forma um complexo com a proteína de 4 ligação ao ADN RBP-JK (Honjo T.: Genes Cells (1996) 1:1-9 e Kageyama et al., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol. 18, N° . 9, 1301-1306 (1999)). A própria RBP-JK é um repressor de ligação ao ADN de transcrição e na ausência de Notch activada liga-se ao promotor do gene HES1, que é um factor de inibição da diferenciação, bloqueando assim a sua expressão; no entanto, uma vez que o complexo se forma entre RBP-JK e o domínio intracelular de Notch, o complexo actua, em vez disso, para activar transcrição do gene HES1 (ver Jarriault S. et al.: Nature (1995) 377:355-358, Kageyama R. et al. : Curr. Opin. Genet. Dev. (1997) 7:659-665 e Kageyama et al., Saibo Kogaku [Cell Engineering] vol. 18, N° . 9, 1301-1306 (1999)). Isto resulta em expressão de HES1 e supressão da diferenciação induzida por HES1. Por outras palavras, crê-se que Notch suprime a diferenciação através HES1 (ver Kageyama et al., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol. 18, N°. 9, 1301-1306 (1999)) .

Também em mamíferos, tornou-se claro que a regulação mediada por Notch da expressão génica é importante na manutenção das células precursoras neuronais ou de células estaminais neuronais e no processo altamente diversificado de diferenciação neuronal, e que a via de Notch é também essencial para diferenciação de outras células para além das do sistema nervoso (ver Tomita K. et al.: Genes Dev. (1999) 13:1203-1210 e Kageyama et al., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol. 18, N°. 9, 1301-1306 (1999)). Além disso, a existência de uma via de Notch independente de HES, regulação negativa da sinalização Notch no nível da transcrição e a interacção negativa ao nível da proteína também foram antecipadas (ver Goh, M., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol. 18, N°. 9, 1291-1300 (1999)). Acresce que todas as publicações acima mencionadas descrevem ou sugerem 5 que a sinalização Notch actua numa direcção que suprime a diferenciação.

Os distúrbios do sistema nervoso central em que a reconstrução não é uma opção incluem, na verdade, uma variedade de diferentes estados com uma elevada taxa de incidência na população, desde danos espinais induzidos por lesão ou insuficiência cerebrovascular ou de glaucoma que leva à cegueira, a estados neurodegenerativos, tais como a doença de Parkinson. A investigação sobre métodos neurorregenerativos para tratar essas doenças é, portanto, uma necessidade social urgente e crê-se que os resultados desta investigação pela presente requerente sejam um avanço para a aplicação a humanos. As células estromais da medula óssea são facilmente extraídas por aspiração da medula óssea em ambulatório e devido à sua natureza altamente proliferativa podem ser cultivadas em grande quantidade dentro de um período relativamente curto. Além disso, pode esperar-se uma tremenda vantagem, uma vez que pode ser realizado um transplante autólogo se se formarem nervos a partir das suas próprias células estaminais da medula óssea. A ausência de rejeição imunológica dispensaria a necessidade de administração de imunossupressores, tornando possível o tratamento mais seguro. Além disso, uma vez que as células estaminais da medula óssea podem ser obtidas a partir de um banco de medula óssea, este processo é realisticamente possível de um ponto de vista de fornecimento. Se essas células podem ser utilizadas para derivar células neuronais, para o que não existia até agora nenhum meio eficaz, então pode esperar-se um efeito importante no campo da medicina regenerativa. A ALS (esclerose lateral amiotrófica) é uma patologia em que a morte celular dos neurónios motores da medula espinal, por 6 razões ainda desconhecidas, leva à perda de nervos que controlam os músculos, impedindo assim o movimento de músculos em todo o corpo, incluindo os músculos respiratórios e levando à morte do doente dentro de 2-3 anos após o início, mas, no momento actual, não existe nenhum tratamento eficaz. A formação de neurónios acetilcolinérgicos das próprias células estaminais de medula óssea permitiria o transplante autólogo, e isto ofereceria uma grande vantagem que poderia até servir como uma cura para ALS.

Actualmente também não existem métodos de tratamento eficazes para doenças musculares, tais como a distrofia muscular, uma doença degenerativa do músculo esquelético. Também seria proporcionada uma grande vantagem por esses estados, uma vez que a formação de células de músculo esquelético a partir das próprias células estaminais da medula óssea permitiria o transplante autólogo. Também seria de esperar que a utilização dessas células para derivar células de músculo esquelético, para o que até aqui não existiam meios eficazes, proporcionasse um efeito importante no campo da medicina regenerativa.

As possíveis aplicações desta tecnologia são não só no campo do tratamento clinico, mas também na área da engenharia de órgãos artificiais e semelhantes, que se espera seja um importante campo de desenvolvimento no futuro. Se as células neuronais e células de músculo puderem ser facilmente produzidas a um nível de cultura de células, então podem ser imaginadas aplicações para criação de órgãos artificiais híbridos e semelhantes. 7

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um processo para induzir as células estromais da medula óssea (BMSC) a diferenciarem-se em células precursoras neuronais in vitro, compreendendo os passos de: (1) isolamento de BMSC de medula óssea e cultura das referidas células num meio de cultura essencial convencional suplementado com um soro; e (2) introdução, nas referidas células, de um ácido nucleico compreendendo sequências que codificam um domínio intracelular de Notch, e cultura subsequente das referidas células para produzir células precursoras neuronais. A invenção proporciona, ainda, uma população de células precursoras neuronais produzidas pelo processo acima referido, em que os membros da população de células precursoras neuronais compreendem um domínio intracelular de Notch, e ainda em que as células não expressam o domínio extracelular de Notch.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é uma micrografia (microscópio de contraste de fase), em vez de um desenho, que mostra células neuronais induzidas a diferenciarem-se de acordo com a invenção. A Fig. 2 é um conjunto de fotografias de imunofluorescência, em vez de um desenho, que mostra as reacções positivas de células neuronais induzidas a diferenciarem-se de 8 acordo com a invenção, contra anticorpos MAP-2, anticorpos de neurofilamentos e anticorpos de nestina. A Fig. 3 é um conjunto de fotografias de imunofluorescência, em vez de um desenho, que mostra reacções de células neuronais induzidas a diferenciarem-se de acordo com a invenção, contra anticorpos para o neurotransmissor sintetase tirosina hidroxilase (TH) e os neurotransmissores ou péptidos relacionados com neurotransmissores transportador de acetilcolina vesicular (VAChT), neuropéptido Y (NPY), substância P (SP), glutamina (Glu), péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) e péptido intestinal vasoactivo (VIP). A Fig. 4 é um par de fotografias de imunofluorescência, em vez de um desenho, que mostra alterações da positividade de tirosina hidroxilase (velocidade de diferenciação neuronal dopaminérgica) de células neuronais induzidas a diferenciarem-se de acordo com a invenção, antes e depois do tratamento com GDNF. A Fig. 5 é um gráfico que mostra alterações da positividade de tirosina hidroxilase (velocidade de diferenciação neuronal dopaminérgica) de células neuronais induzidas a diferenciarem-se de acordo com a invenção, antes e depois do tratamento com GDNF. A Fig. 6 é um par de fotografias de imunofluorescência, em vez de um desenho, que mostra as alterações da positividade do transportador de acetilcolina vesicular (velocidade de diferenciação de neurónios acetilcolinérgicos) de células neuronais induzidas a diferenciarem-se de acordo com a invenção, antes e depois do tratamento com neurotrofinas (NT; NGF 2.5 S). 9 A Fig. 7 é um gráfico que mostra as alterações da positividade do transportador de acetilcolina vesicular (velocidade de diferenciação de neurónios acetilcolinérgicos) de células neuronais induzidas a diferenciarem-se de acordo com a invenção, antes e depois do tratamento com neurotrofinas (NTs; NGF 2.5 S) . A Fig. 8 é um par de gráficos que mostram o efeito terapêutico do transplante de neurónios dopaminérgicos obtidos pelo processo de indução de diferenciação da invenção para modelos da doença de Parkinson em corpos estriados de rato. A Fig. 9 é uma composição de fotografias imunof luorescentes, em vez de um desenho, que mostra que as células transplantadas para os corpos estriados não eram células gliais, mas células neuronais e neurónios dopaminérgicos. A Fig. 10 é uma composição de fotografias de imunofluorescência ampliadas, em vez de um desenho, que mostra que as células transplantadas para os corpos estriados foram células neuronais e neurónios dopaminérgicos.

As Fig. 11a a llf mostram as caracteristicas de células do estroma da medula óssea isoladas (MSC) . A FIG. 11a mostra os resultados da análise FACS para rato (MSC) . As células expressaram CD29 (integrina beta-1), CD90 (Thy-1) e CD54 (ICAM), mas não CD34 (marcador de células estaminais hematopoiéticas) ou CDllb/c (marcador relacionado com macrófagos). As Fig. 11b e 11c são micrografias de contraste de fase de MSC de rato não tratadas (b) e MSC humanas não tratadas (c) . As Fig. lld a llf são fotografias imuno-histoquimicas de CD29 (d), CD90 (e) e CD34 (f) em MSC humanas. As MCS eram positivas para CD29 e CD90, mas 10 negativas para CD34. A barra representa 50 pm.

As Fig. 12a a 12h mostram fenotipos após a transfecção de NICD (domínio intracelular de Notch) . A FIG. 12a mostra os resultados de RT-PCR para o domínio extracelular de Notch (ECD) e domínio intracelular (ICD) em MSC de rato, antes da transfecção de NICD (pista 1) e depois da transfecção de NICD (pista 2) . Uma vez que foi detectado ECD nas MSC não tratadas, uma pequena quantidade de Notch endógena foi expressa naturalmente. Após a transfecção de NICD, no entanto, as ECD estavam subreguladas e as NICD ligeiramente sobrerreguladas. As Fig. 12b a 12g são fotografias imuno-histoquímicas para GLAST (b, c) , 3-PGDH (d, e) e nestina (f, g) em MSC de rato não tratadas (b, d, f) e MSC de rato transfectadas em NICD (c, e, g). A barra representa 50 pm em b, c, d e g e 80 pm em e e f. A FIG. 12h é um gráfico que mostra a actividade do promotor 3-PGDH para MSC de rato não tratadas (MSC) e MSC de rato transf ectadas em NICD (NICD). Tanto a forma de comprimento completo de 3-PGDH como a forma truncada (M1965) mostraram aumentos de 9 a 10 vezes da actividade de promotor após a transfecção em NICD (p <0,01). A Fig. 13 mostra as velocidades de conversão para células MAP-2ab<+> por tratamento com vários factores tróficos. Não foram detectadas células MAP-2ab<+> quando os factores tróficos foram introduzidos em MSC de rato, quer não tratadas quer transfectadas com um vector de controlo. A introdução de três dos factores tróficos (FSK + 6FGF + CNTF) mostrou a maior taxa de produção de células neuronais (96,5%), enquanto que a eliminação de qualquer destes três factores resultou numa taxa de conversão mais baixa. 11

As Fig. 14a a 14q mostram os resultados da análise de células neuronais induzidas. As Fig. 14a a 14c são micrografias de contraste de fase de células neuronais induzidas de MSC de

rato (a, b) e MSC humanas (c) . A barra representa 200 pm na Fig. 14a e 50 pm nas Fig. 14b e 14c. As Fig. 14d a 14g e 14i a 14k são fotografias imuno-histoquímicas de marcadores de neurónios e marcadores de células gliais em MSC de rato (f, g, i, j, k) e MSC humanas (d, e) (5 dias) após a introdução de factores tróficos. Os marcadores MAP-2ab (d) e neurofilamento M (e) foram detectados em MSC humanas, enquanto beta 3-tubulina (f) e TuJ-1 (g) , foram expressos em MSC de rato. Nenhuma das células de rato ou humanas reagiram com os marcadores de células gliais GFAP (i), GalC (j) e 04 (k). A barra representa 100 pm em d, e, f, 60 pm em g e 100 pm em i a k. A Fig. 14h mostra a marcação BRD-U de células neuronais. As células positivas a MAP-2AB (marcadas com Alexa Fluor 488, código verde) não incorporaram BrD-U (marcadas com Alexa Fluor 546, código vermelho). A Fig. 141 mostra os resultados da análise de transferência de Western para a amostra de rato MAP-2ab (1) e para a amostra de rato GFAP (2) . A pista 1 é a transferência de Western e a pista 2 é uma mancha de Ponceau S. As MSC não tratadas (M) não expressaram nem MAP-2ab nem GFAP. No 5o dia (N) após a introdução dos factores tróficos, as MSC eram positivas para MAP-2ab, mas ainda negativas para GFAP. Utilizou-se cérebro (B) como um controlo positivo para MAP-2ab e GFAP. As Fig. 14m a 14q mostram os resultados de um teste de fixação de voltagem em membranas com células neuronais induzidas a partir de MSC de rato (m) e células neuronais induzidas a partir de MSC humanas (n, p). A indução resultou num aumento dramático da corrente K<+> rectificada até aproximadamente 1600 pA e 4000 pA nas MSC de rato (m) e MSC (n) humanas, respectivamente, em comparação com as MSC não tratadas (o, p). A Fig. 14q mostra uma 12 micrografia de contraste de fase de MSC humanas registada na

Fig. 14n. A Fig. 15 é um par de gráficos que mostram as actividades promotoras relativas de Neuro D e GFAP para MSC de rato não tratadas (MSC) , MSC de rato transfectadas em NICD (NICD) e MSC de rato induzidas neuromalmente (induzidas).

As Fig. 16a a 16m mostram os resultados do transplante em modelos de rato da doença de Parkinson. A Fig. 16a é um gráfico que mostra as percentagens dos seguintes neurotransmissores em MSC de rato após indução de factor trófico: ácido gama-aminobutirico (GABA), 0,3+/-0,1; péptido intestinal vasoactivo (VIP), 0,5+/-0,1; serotonina (Ser), 2,0+/-0,4; glutamato (Glu), 2,3+/-0,7; substância P (SP), 2,4+/-0,9; TH, 3,9+/-0,6; transportador de acetilcolina vesicular (VAChT), 5,2+/-2,4; péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), 5,3+/-0,8; neuropéptido Y (NPY) 6,1+/-1,6. Com a administração subsequente de GDNF, a percentagem de células positivas a TH aumentou drasticamente para 41,0+/-14,1 (G-TH). As Fig. 16a e 16b mostram a expressão de TH em MSC humanas após a indução do factor trófico e, depois, após o tratamento com GDNF. As MSC humanas apresentaram a mesma resposta que as MSC de rato, com células positivas a TH claramente a aumentar depois do tratamento com GDNF. A barra representa 100 pm em b e 30 pm em c. A Fig. 16d mostra os resultados ou RT-PCR de Nurr-1 em MSC de rato. A sobrerregulação acrescida de Nurr-1 foi observada após a administração de GDNF (Ng) em comparação com as células após introdução de factor trófico (N) sozinho. A Fig. 16e mostra uma transferência de Western para TH em MSC de rato. A expressão de TH foi fraca em MSC após a indução de factor trófico (N) , mas aumentou depois da indução de GDNF (Ng) . A medula supra-renal 13 (A) serviu como um controlo positivo. A pista 1 é uma transferência de Western e a pista 2 é uma mancha de Ponceau S. A Fig. 16f é um gráfico que mostra os efeitos comportamentais após o enxerto de MSC de rato no corpo estriado. 0 gráfico mostra a rotação induzida pela apomorfina num grupo de MSC (A-A) , grupo N-MSC (·-·) e grupo G-MSC (-) (*: 0,01 < p <0,05; **: p < 0,01).

As Fig. 16g a 16k são fotografias de imunocoloração para neurofilamento M (g) , TH (h) , DAT (i), GFAP (j) e 04 (i) no corpo estriado à 10 a semana após o transplante para o grupo G-MSC. Os sinais para estes marcadores estão todos marcados com Alexa 546 (codificação de cor vermelha). As MSC de rato enxertadas foram primeiro marcadas com GFP. Observou-se

duplicação da GFP-neurofilamento, GFP-TH e GFP-DAT em g, h e i, mas não com coloração GFAP ou coloração 04. A barra representa 50 pm. A Fig. 161 é um conjunto de ilustrações em corte que mostram a integração de MSCs de rato marcadas com GFP (grupo G-MSC) no corpo estriado. Imagens confocais após imuno-histoquimica para TH (vermelho) são indicadas em regiões marcadas por pontos no diagrama. A barra representa 50 pm. A Fig. 16m é um gráfico que mostra a rotação induzida por apomorfina em ratos após o transplante de MSC neuronais humanas tratadas com GDNF. Os resultados de 5 ratos (rotação média: 0,44+/-0,2) estão apresentados até quatro semanas após o enxerto (com um rato representado por cada cor).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente requerente investigou a estimulação de células estromais da medula óssea por introdução de genes que 14 desempenham um papel central nas fases iniciais da morfogénese de células estromais da medula óssea e examinou os efeitos dessa estimulação na indução da diferenciação das células estromais da medula óssea. Especificamente, esperava-se ser potencialmente possível "reconfigurar" células estromais da medula óssea por introdução de genes Notch e genes de sinalização Notch, que desempenham papéis importantes na diferenciação do desenvolvimento do sistema nervoso e desempenham funções na determinação dos destinos das células quando células precursoras se ramificam em células neuronais ou células gliais. É importante notar que, apesar da implicação de genes Notch e genes relacionados com a sinalização Notch no mecanismo de supressão da indução da diferenciação celular, foi uma constatação completamente inesperada que a combinação de introdução de genes Notch e genes relacionados com a sinalização Notch com outra estimulação para induzir diferenciação, também pode induzir diferenciação das próprias células nas quais foram introduzidos os genes Notch e genes relacionados com a sinalização Notch (não as células que contactam com as células nas quais foram introduzidos os genes Notch e genes relacionados com a sinalização Notch) . Não se pode afirmar que a introdução dos genes Notch e genes relacionados com a sinalização Notch no processo de indução da diferenciação da presente invenção resultou na reconfiguração da diferenciação do desenvolvimento de células estromais da medula óssea. Contudo, por combinação desta introdução de genes com outros passos de indução da diferenciação de acordo com a invenção, foi possível, como resultado, proporcionar um processo de induzir eficientemente a diferenciação de células estromais de medula óssea em células neuronais. 15

Como resultado de experimentação repetida na combinação de passos que compreendem a introdução de genes Notch e genes relacionados com a sinalização Notch, a presente requerente foi a primeira a conseguir induzir eficientemente a diferenciação de células estromais de medula óssea em células neuronais in vitro. Além disso, confirmou-se que por enxerto das células neuronais obtidas pelo processo de indução da diferenciação em modelos da doença de Parkinson no rato ou modelos no rato de degeneração da retina ou do nervo óptico associada a lesão do nervo óptico, os nervos enxertados realmente pegaram e funcionaram.

Surpreendentemente, por introdução de genes Notch e genes relacionados com a sinalização Notch em células estromais de medula óssea, por administração de vários factores e citocinas que se crê estarem envolvidas na promoção da diferenciação neuronal, e por aumento do CAMP intracelular que é considerado como um iniciador geral da diferenciação, foi possível induzir a diferenciação com êxito de células estromais da medula óssea em células neuronais em condições de cultura in vitro. Não só se confirmou a expressão de MAP-2 e neurofilamentos que são específicas das células neuronais, mas também a expressão do neurotransmissor sintetase tirosina hidroxilase e produção de neurotransmissores, tais como acetilcolina, neuropéptido Y e substância P.

Por outro lado, foi sugerido que a desmetilação e a activação de um ou de muito poucos genes por 5-azacitidina (5-AZC) conduz à conversão em mioblastos (ver Taylar SM, Jones P. A.: Cell 17:771-779, 1979 e Nabeshima Y., Seitai no Kagaku 47(3):184-189, 1996). Combinou-se portanto a introdução em células neuronais de genes Notch e genes relacionados com a sinalização Notch anteriormente referida com a desmetilação 16 anteriormente referida por tratamento com 5-azacitidina (5-AZC). Especificamente, por eliminação da expressão suprimida por metilação dos genes utilizando o agente desmetilante anteriormente referido para reconfigurar células estromais da medula óssea, introdução subsequentemente da Notch e genes relacionados com a sinalização Notch e co-cultura das células com genes introduzidos em conjunto com células estromais da medula óssea sem os genes e, finalmente, tratamento das células com um agente de aumento de CAMP intracelular, que é considerado como um iniciador geral da diferenciação, foi possível a indução da diferenciação das células com genes Notch e genes relacionados com a sinalização Notch introduzidos em células esqueléticas por cultura in vitro. Observou-se a formação e estriação de miotubos polinucleados características nas células resultantes, e a expressão de proteínas específicas dos músculos miogenina e Myf5 também foi confirmada no nível de ARNm.

De acordo com a invenção, é proporcionado um processo de indução de células estromais da medula óssea (BMSC) a diferenciarem-se em células precursoras neuronais in vitro compreendendo os passos de: (1) isolamento de BMSC de medula óssea e cultura das referidas células num meio de cultura essencial convencional suplementado com um soro; e (2) introdução, nas referidas células, de um ácido nucleico compreendendo sequências que codificam um domínio intracelular de Notch, e cultura subsequente das referidas células para produzir células precursoras neuronais.

As células estromais de medula óssea isoladas podem ser 17 derivadas de um humano.

De acordo ainda com outra forma de realização da invenção, são proporcionadas células precursoras neuronais produzidas pelo processo anteriormente referido, em que membros da população de células precursoras neuronais compreendem um domínio intracelular de Notch e, ainda, em que as células não expressam o domínio extracelular de Notch. Membros da população de células precursoras neuronais expressam marcadores para células precursoras neuronais, GLAST, 3PGDH e nestina.

De acordo com a presente invenção, num outro aspecto, é proporcionado um processo de indução de BMSC a diferenciarem-se em células neuronais in vitro compreendendo os passos de: (1) isolamento de BMSC de medula óssea e cultura das referidas células num meio de cultura essencial convencional suplementado com um soro; (2) introdução, nas referidas células, de um ácido nucleico compreendendo sequências que codificam um domínio intracelular de Notch e cultura subsequente das referidas células; e (3) adição de um agente de aumento do monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) ou de um análogo de cAMP, e/ou um factor de estimulação da diferenciação celular ao referido meio de cultura, e cultura subsequente das referidas células para produzir as referidas células neuronais, em que as células diferenciadas resultantes são descendentes de BMSC nas quais foram introduzidos ácidos nucleicos compreendendo sequências que codificam um domínio intracelular 18 de Notch. A introdução do gene Notch e/ou gene relacionado com a sinalização Notch pode ser realizada por lipofecção com um vector de expressão de mamífero. 0 processo pode também compreender, entre os passos (2) e (3), um passo de selecção de células nas quais os genes foram introduzidos, durante um período de tempo predeterminado. 0 agente de aumento de AMP cíclico ou análogo de AMP cíclico pode ser forskolina e a sua concentração pode ser de 0,001 nM a 100 μΜ. 0 factor de estimulação da diferenciação celular pode ser seleccionado do grupo consistindo em factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor neurotrófico ciliar (CNTF) e suas misturas. A concentração do factor de estimulação da diferenciação celular pode estar entre 0,001 ng/mL e 100 pg/mL.

As células estromais de medula óssea isoladas são, de um modo preferido, células humanas.

De acordo com ainda outra forma de realização da invenção, é proporcionado um processo de indução de células estromais de medula óssea a diferenciarem-se em neurónios dopaminérgicos in vitro compreendendo os passos de: (1) isolamento de células estromais de medula óssea da medula óssea e cultura das células num meio de 19 cultura essencial convencional suplementado com um soro; (2) introdução de um gene Notch e/ou gene relacionado com a sinalização Notch nas células e cultura subsequente das células; (3) adição de um agente de aumento de AMP cíclico ou de um análogo de AMP cíclico e/ou um factor de estimulação da diferenciação celular ao meio de cultura, e cultura subsequente das células para produzir células neuronais; (4) cultura das células neuronais obtidas no Passo (3) num meio de cultura essencial convencional suplementado com um soro; e (5) adição de factor neurotrófico derivado da glia (GDNF) e um agente de aumento do AMP cíclico ou análogo de AMP cíclico, e/ou um factor de estimulação da diferenciação celular que não o factor neurotrófico derivado da glia ao meio de cultura, e cultura subsequente das células para obter neurónios dopaminérgicos. em que os neurónios dopaminérgicos resultantes são descendentes de células estromais de medula óssea em que foram introduzidos o gene Notch e/ou um gene relacionado com a sinalização Notch. 0 meio de cultura essencial convencional no Passo (4) pode ser meio essencial mínimo alfa modificado de Eagle. 0 soro no Passo (4) pode ser de soro fetal de bovino. 0 agente de aumento de AMP cíclico ou análogo de AMP cíclico no Passo (5) pode ser forscolina. A concentração do 20 agente de aumento de AMP cíclico ou análogo de AMP cíclico no Passo (5) pode estar compreendida entre 0,001 nM e 100 μΜ. O factor de estimulação da diferenciação celular que não o factor neurotrófico derivado da glia no Passo (5) pode ser seleccionado do grupo que consiste em factor de crescimento de fibroblastos básico (bFG), factor de crescimento AA derivado de plaquetas (PDGF-AA) e as suas misturas. A concentração do factor neurotrófico derivado da glia no Passo 5 pode estar compreendida entre 0,001 ng/mL e 100 pg/mL, e está, de um modo preferido, entre 1 ng/mL e 100 ng/mL. A concentração do factor de estimulação da diferenciação celular, que não o factor neurotrófico derivado da glia, no Passo (5), pode estar compreendida entre 0,001 ng/mL e 100 pg/mL.

As células estromais de medula óssea isoladas são, de um modo preferido, células humanas.

De acordo com ainda uma outra forma de realização da invenção, é proporcionado um processo para indução de células estromais de medula óssea a diferenciarem-se em neurónios acetilcolinérgicos in vitro compreendendo os passos de: (1) isolamento de células estromais de medula óssea da medula óssea e cultura das células num meio de cultura essencial convencional suplementado com um soro; (2) introdução de um gene Notch e/ou gene relacionado com a sinalização Notch nas células e cultura 21 subsequente das células; (3) adição de um agente de aumento de AMP cíclico ou de um análogo de AMP cíclico e/ou um factor de estimulação da diferenciação celular ao meio de cultura, e cultura subsequente das células para produzir células neuronais; (4) cultura das células neuronais obtidas no Passo (3) num meio de cultura essencial convencional suplementado com um soro; e (5) adição de factor de crescimento dos nervos (NGF) e um agente de aumento do AMP cíclico ou análogo de AMP cíclico, e/ou um factor de estimulação da diferenciação celular que não o factor de crescimento dos nervos ao meio de cultura, e cultura subsequente das células para obter neurónios acetilcolinérgicos. em que os neurónios acetilcolinérgicos resultantes são descendentes de células estromais de medula óssea em que foram introduzidos o gene Notch e/ou um gene relacionado com a sinalização Notch. 0 meio de cultura essencial corrente no Passo (4) pode ser meio essencial mínimo alfa modificado de Eagle. 0 soro no Passo (4) pode ser de soro fetal de bovino. 0 agente de aumento de AMP cíclico ou análogo de AMP cíclico no Passo (5) pode ser forskolina. A concentração do agente de aumento de AMP cíclico ou análogo de AMP cíclico no Passo (5) pode estar compreendida entre 0,001 nM e 100 μΜ. O factor de estimulação da diferenciação celular, que não o 22 factor de crescimento de nervos no Passo (5), pode ser seleccionado do grupo que consiste em factor de crescimento de fibroblastos básico (bFG) , factor de crescimento AA derivado de plaquetas (PDGF-AA) e as suas misturas. A concentração do factor de crescimento de nervos no Passo 5 pode estar compreendida entre 0,001 ng/mL e 100 pg/mL, e está, de um modo preferido, entre 1 ng/mL e 100 ng/mL. A concentração do factor de estimulação da diferenciação celular, que não o factor de crescimento de nervos no Passo (5), pode estar compreendida entre 0,001 ng/mL e 100 pg/mL.

As células estromais de medula óssea isoladas são, de um modo preferido, células humanas.

De acordo com ainda uma outra forma de realização da invenção, é proporcionado a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz da população de células precursoras neuronais anteriormente referidas no fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento de um doente que sofre de uma doença, distúrbio ou estado do sistema nervoso central.

Ao longo da presente descrição, o termo "células estromais da medula óssea" refere-se a células da medula óssea que não são do sistema hematopoiético e são potencialmente capazes de se diferenciarem em osteócitos, condrócitos, adipócitos e semelhantes. As células estromais da medula óssea são identificadas pela positividade para CD29 (integrina β-l), CD90 (Thy-1) e CD54 (ICAM-1) e negatividade para CD34 (marcador de células estaminais hematopoiéticas) e CDllb/c (marcador de macrófagos). 23 0 termo "eficientemente", como utilizado ao longo da presente descrição a respeito da indução da diferenciação, significa que as células estromais da medula óssea seleccionadas são finalmente convertidos em células neuronais com uma velocidade elevada pelo processo de indução de diferenciação da invenção. A eficiência do processo de indução de diferenciação da invenção é de 50% ou superior, de um modo preferido, 75% ou mais, de um modo mais preferido, 80% ou mais, de um modo ainda mais preferido, 85% ou mais, de um modo mais preferido, ainda 90% ou mais e, de um modo muito preferido, 95% ou mais. O termo "células precursoras neuronais", como utilizado ao longo da presente descrição, refere-se a células estromais da medula óssea imediatamente após a introdução de um gene Notch e/ou gene relacionado com a sinalização Notch e, especificamente, são as células antes da introdução de factores tróficos . O termo "células neuronais", como utilizado ao longo da presente descrição, refere-se a neurónios, que são caracterizados morfologicamente por um corpo da célula e dois tipos de processos (dendrites e axónios) e bioquimicamente por reacção com anticorpos para o isótopo 3 de beta-tubulina e TuJ-1.

As células neuronais são caracterizadas por neurotransmissores secretoras, sintetases de neurotransmissores ou proteínas relacionadas com neurotransmissores, por exemplo, tirosina hidroxilase (TH) , transportador de acetilcolina vesicular, neuropéptido Y e substância P (SP). A tirosina hidroxilase é um marcador dos neurónios 24 dopaminérgicos, enquanto o transportador de acetilcolina vesicular é um marcador dos neurónios acetilcolinérgicos que são tipicamente neurónios motores. 0 termo "células gliais", como utilizado ao longo da presente descrição, refere-se aos astrócitos, oligodendrócitos, microglia e células epiteliais encontradas entre os neurónios e os seus processos nos nervos centrais. A proteína ácida fibrilar glial (GFAP) é um marcador de astrócitos e 04 e é um marcador de oligodendrócitos. O termo "células do músculo esquelético", como utilizado ao longo da presente descrição, refere-se a miofibras ou fibras musculares, e são os miócitos individuais do músculo esquelético. Morfologicamente são caracterizadas como, células finas polinucleadas gigantes, longas e finas com a formação e estriação de miotubos, enquanto que bioquimicamente são caracterizadas por expressar factores de regulação da transcrição como miogenina e Myf5. O processo de indução de diferenciação das células estromais da medula óssea em células neuronais, de acordo com a invenção, é inovador no aspecto de compreender um passo de introdução de um gene Notch e/ou gene relacionado com a sinalização Notch nas células anteriormente referidas. Outro aspecto inovador é que este passo pode ser combinado com outros passos de indução da diferenciação do estado da técnica numa ordem predeterminada. A selecção e combinação óptima desses passos de acordo com a invenção constituem uma constatação inovadora altamente significativa pela presente requerente. As células estromais da medula óssea já eram conhecidas como 25 células estaminais mesenquimatosas ou células precursoras capazes de serem induzidas a diferenciarem-se em osteoblastos, células endoteliais vasculares, células do músculo esquelético, adipócitos e células do músculo liso, mas não se sabia se as células estromais da medula óssea podiam efectivamente ser diferenciadas em células neuronais, e este objectivo ainda não tinha sido conseguido com êxito apesar de tentativas empenhadas. Embora não pretendendo ficar limitados por qualquer teoria em particular, a presente requerente conjecturou que a introdução de um gene Notch e/ou gene relacionado com a sinalização Notch nas células anteriormente referidas resulta na reposição das células em termos de diferenciação desenvolvimental e ajuda na função de outros tratamentos indutores da diferenciação. A presente invenção vai agora ser explicada em mais pormenor pelos exemplos seguintes.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Indução neuronal

As células estromais foram extraídas da medula óssea de ratos (ratos Wistar) e cultivadas. 0 meio utilizado foi o Meio Essencial Mínimo de Eagle alfa modificado (M4526, Sigma Co. ) contendo 20% de soro fetal de bovino (14-501F, Lot e N° 61-1012, BioWhittaker Co.).

Após repicagem até quatro gerações, o gene para o domínio intracelular de Notch foi introduzido quando as células atingiram 80-90% de confluência. Um fragmento EcoRI-Xbal de 3,1 kb do domínio intracelular de Notch foi inserido no sítio de 26 multiclonagem de EcoRI-Xbal do vector de expressão de mamífero pCl-neo (N° E1841) de Promega para recombinação. Um sistema

LipofectAMINE 2000 (11668-027, Gibco BRL) foi utilizado para a introdução.

No dia a seguir à introdução, sulfato de G418 (83-5027,

Gibco BRL) foi adicionado numa concentração de 200 ng/mL e as células introduzidas seleccionadas durante 10 dias.

Após a restauração da população de células a 90% de confluência, adicionou-se 5 μΜ de forskolina (344273,

Calbiochem), 10 ng/mL de factor de crescimento de fibroblastos básico (100-18B, Peprotech EC, Ltd.) e 50 ng/mL de factor neurotrófico ciliar (557-NT, R&D Systems).

Como resultado da análise das células após cerca de 10 dias, a morfologia característica das células neuronais foi observada como mostrado na Fig. 1. As células induzidas apresentaram reacção positiva a anticorpos contra MAP-2 (MAB364, Chemicon), neurofilamento (814342, Boehringer Manheim) e nestina (BMS4353, Bioproducts) , como mostrado na Fig. 2. Uma vez gue MAP-2 e neurofilamento são marcadores de células neuronais e a nestina é um marcador das células precursoras neuronais, considerou-se, portanto, gue as células induzidas possuíam as propriedades de células neuronais.

Uma pesguisa realizada utilizando anticorpos contra o neurotransmissor sintetase tirosina hidroxilase (AB151,

Chemicon) e os neurotransmissores ou proteínas relacionadas com neurotransmissores transportador de acetilcolina vesicular (AB1578, Chemicon), neuropéptido Y (RIN7172, Península Lab Inc.), substância P (RPN1572, Amersham Inc.), etc., como 27 mostrado na Fig. 3, revelou aproximadamente 2-4% de células positivas para cada uma, indicando também assim a presença de células neuronais produtoras de neurotransmissores.

As células neuronais foram induzidas por este processo, e nesta fase 2,9±0,5% das células neuronais induzidas por diferenciação totais apresentaram reacção a tirosina hidroxilase, um marcador de neurónios dopaminérgicos, como ilustrado à esquerda do gráfico da Fig. 5. Além disso, como ilustrado à esquerda do gráfico na Fig. 7, 1,78±0,75% das células neuronais induzidas por diferenciação totais apresentavam reacção para o transportador de acetilcolina vesicular, um marcador de neurónios acetilcolinérgicos, que são tipicamente neurónios motores.

Exemplo 2: Indução de neurónios dopaminérgicos

As células neuronais induzidas por diferenciação foram então cultivadas em meio essencial minimo alfa modificado de Eagle (M4526, Sigma Co.) contendo 10% de soro fetal de bovino (14-501F, Lote N° 61-1012, BioWhittaker Co.), com adição posterior de 50 ng/mL de factor neurotrófico derivado da glia (GDNF) (GDNF recombinante humano, N° 450-10, Peprotech EC Ltd.), 5 μΜ de forskolina (344273, Calbiochem), 10 ng/mL de factor de crescimento de fibroblastos básico (100-18B, Peprotech EC, Ltd.) e 5 ng/mL de factor de crescimento AA derivado de plaquetas (HB-396, Peprotech EC Ltd.).

Como resultado deste processo, os neurónios dopaminérgicos que apresentaram reacção para tirosina hidroxilase aumentaram dramaticamente para 17,2±-5,1% do total de células neuronais 28 (ver gráfico da direita da Fig. 5). Como ilustrado na fotografia da Fig. 4, a proporção de proteína tirosina hidroxilase corada de verde com FIPC aumentou drasticamente após o tratamento com GDNF.

Exemplo 3: Indução de neurónios acetilcolinérgicos

As células neuronais induzidas por diferenciação do Exemplo 1 foram cultivadas em meio essencial mínimo alfa modificado de Eagle (M4526, Sigma Co.) contendo 10% de soro fetal de bovino (14-501F, Lote N° 61-1012, BioWhittaker Co.) com adição subsequente de factor de crescimento dos nervos (NGF 2.5 S, N° T002A, Takara), 5 μΜ de forscolina (344273, Calbiochem), 10 ng/mL de factor de crescimento de fibroblastos básico (100-18B, Peprotech EC, Ltd.) e 5 ng/mL de factor AA de crescimento derivado de plaquetas (396-HB, Peprotech EC Ltd.).

Como resultado deste processo, os neurónios acetilcolinérgicos que apresentam reacção para transportador de acetilcolina vesicular aumentaram dramaticamente para 20,5±0,05% das células neuronais totais (ver direita do gráfico da Fig. 7). Como se mostra na fotografia da Fig. 6, a proporção de proteína transportadora de acetilcolina vesicular corada de verde com FIPC aumentou dramaticamente após o tratamento com neurotrofina (NT) NGF. 29

Exemplo 5: Efeito terapêutico de neurónios dopaminérgicos obtidos pelo processo de indução de diferenciação da invenção quando transplantados para corpos estriados de modelos de rato da doença de Parkinson

Foi examinado o efeito do transplante de neurónios dopaminérgicos obtidos pelo processo de indução de diferenciação da invenção em modelos de rato da doença de Parkinson. A injecção de 6-OHDA (6-hidroxidopamina) em substantia nigra de cérebro de rato já foi estabelecida como um processo de criação de modelos de Parkinson e estes modelos foram utilizados para a presente experiência (Svendsen et al., Exp. Neurol. 137:376-388(1996); Svensen et al., Exp. Neurol. 148:135-146(1997)). A administração de apomorfina a esses modelos de rato é conhecida por provocar o movimento rotacional, com o aumento das rotações a sugerir deterioração e a redução das rotações a sugerir melhoria.

Como ilustrado no gráfico superior da Fig. 8, com o enxerto de células neuronais induzidas em corpos estriados, o número de rotações por minuto, durante um período de 9 semanas de observação foi aproximadamente inalterado em comparação com imediatamente após o enxerto. Na ausência de tratamento, o número de rotações por minuto tendeu a aumentar gradualmente (não mostrado) e, por conseguinte, o declive do nível indicou que, pelo menos, foi impedido o agravamento.

Como ilustrado no gráfico inferior da Fig. 8, com o enxerto de neurónios dopaminérgicos induzidos nos corpos estriados, o número de rotações por minuto começou a diminuir a partir da primeira semana após o transplante e aproximadamente metade dos animais observou-se uma melhoria muito assinalável, com o número 30 de rotações por minuto a atingir zero ou só 1 ou 2 após 9 semanas. (Considerou-se que os dois casos no gráfico inferior da Fig. 8 que apresentaram mais do que 8 rotações/minuto após 9 semanas representavam falhas do enxerto e foram excluídos da avaliação.)

Para investigar o tipo de células nas quais os neurónios dopaminérgicos da invenção injectados (enxertados) nos corpos estriados se tinham diferenciado, o tecido estriatal foi extraído após 10 semanas e secções suas foram submetidas a um exame imuno-histoquímico. O gene da proteína fluorescente verde (GFP) que emite luz verde fluorescente foi incorporado nos cromossomas de células estromais da medula óssea utilizando um retrovírus. Assim, como se pode ver nas fotografias imunofluorescentes apresentadas na Fig. 9, as células neuronais induzidas a diferenciarem-se a partir de células estromais da medula óssea e, portanto, os neurónios dopaminérgicos enxertados em corpos estriados emitem luz fluorescente verde.

Além disso, a emissão de luz vermelha foi utilizada para neurofilamento como um marcador de células neuronais, tirosina hidroxilase como um marcador de neurónios dopaminérgicos, GFAP como um marcador de astrócitos (células gliais) e 04 como um marcador de oligodendrócitos (células gliais).

Assim, a sobreposição de luz verde por GFP e luz vermelha pelos marcadores mencionados acima produz luz amarela, para distinção do tipo de células em que se tinham tornado os neurónios dopaminérgicos enxertados 10 semanas após o enxerto. 31

Como se pode observar na Fig. 9, praticamente todas as células enxertadas nos corpos estriados se tinham diferenciado em células neuronais, mas não em células gliais 10 semanas após o enxerto. Além disso, a julgar pelo número considerável de células neuronais positivas a tirosina hidroxilase (i. e., neurónios dopaminérgicos), conclui-se que o processo de indução de diferenciação in vitro da presente invenção aumentou a proporção de neurónios dopaminérgicos para 17,2±5,1% das células neuronais totais e que o enxerto anteriormente referido aumentou ainda mais esta proporção. A Fig. 10 é uma composição de fotografias de imunofluorescência ampliadas que mostram a coloração de tirosina hidroxilase. Na Fig. 10, os núcleos das células estão corados de azul (contra-coloração) independentemente do tipo de célula. As localizações dos núcleos corados de azul indicam as localizações das células.

Este procedimento demonstrou que nestes modelos de rato da doença de Parkinson, o enxerto de neurónios dopaminérgicos obtidos pelo processo de indução de diferenciação da invenção em corpos estriados melhorou drasticamente os sintomas da doença de Parkinson. A seguir estão os protocolos experimentais que foram utilizados nos Exemplos 6 a 11 abaixo. 32

Protocolos experimentais

Cultura de células estromais da medula óssea 0 isolamento de MSC de medula óssea de ratos Wistar foi descrito em publicações anteriores pelos inventores(4) da presente invenção. MSC humanas foram obtidas de uma fonte disponível comercialmente (PT-2501, BioWhittaker, Walkersville, Maryland) e de um doador saudável (obtido em conformidade com as orientações do Ethics Committee of Kyoto University Graduate School of Medicine). As MSC humanas foram isoladas por um processo descrito anteriormente(3) . As células foram cultivadas em alfa-MEM (M-4526, Sigma, St. Louis, Missouri) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) .

Análise FACS MSC de rato foram incubadas com anti-CD34 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Califórnia), anti-CD54, -CD90 e -CDllb/c de murganho ou anti-CD29 de hamster (PharMingen, San Diego, Califórnia) marcados com FITC. Os controlos foram incubados com anti-IgG de murganho ou de hamster marcada com FITC, ou soro de murganho não imune. Para MSC humanas foram utilizados anti-CD34, -CD29, -CD90, -CD54, -CDllc e factor de von Willebrand de murganho marcados com ficoeritrina. Os controlos incluíram células coradas com anti-IgG de murganho marcado com ficoeritrina. Os dados foram adquiridos e analisados num FACScalibur com o software CellQuest (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey). 33

Plasmídeos A numeração de Notchl foi de acordo com Weinmaster et al. (1991)39. ADNc para o domínio intracelular m-Notchl NICD (começando no aminoácido 1703 e terminando na sequência 3' não traduzida), TM (aminoácidos 1747-2531), M2 (modificado a partir de TM por mutação de dois aminoácidos Ala-Ala (1992 e 1993) para Glu-Fen) (NICD, TM e M2 fornecidos pelo Dr. Masashi

Kawaichi) (17,34>, mNIC Δ3' (aminoácidos 1846-2477, fornecido pelo Dr. Jeffery Nye)<35), RAMIC (aminoácidos 1703-1969, obtidos a partir de ADNC de NICD por digestão com Notl e AccIII) e TADIC (aminoácidos 2192-2531, obtidos a partir de ADNc de NICD por digestão com Xhol e Xbal) foram subclonados em vector de expressão de mamífero pCl-neo (Promega, Madison, Wisconsin). Plasmídeos repórter de luciferase de 3-PGDH (ambos de comprimento inteiro e M1965) foram fornecidos pelo Dr. Shigeki Furuya19, NeuroD por Tsai Ming-Jer40 e promotor GFAP por Caleb E. Flinch41. As MSC foram transfectadas com estes plasmídeos utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) e seleccionadas por G418 de acordo com as instruções do fabricante.

Experiência de indução neuronal

Para a indução com factor trófico, culturas subconfluentes de MSC transferidas com NICD foram incubadas em alfa-MEM contendo 10% de FBS, FSK 5 μΜ (Calbiochem, La Jolla, Califórnia) , 10 ng/mL de bFGF (Peprotech, Londres, RU) e 10 ng/mL de CNTF (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) . Para o tratamento com GDNF, 50 ng/mL de GDNF (Peprotech) foram administrados no meio de cultura alfa-MEM contendo 10% de FBS. 34

Marcaçao com Brd-U

Após a indução com factor trófico (5 dias), adicionou-se Brd-U (10 μΜ) foi adicionado ao meio de cultura e a cultura foi realizada durante 24 horas. As células foram então fixas com paraformaldeido a 4% em PBS e duplamente marcadas para MAP-2ab e Brd-U, antes da contra coloração com TOTO-3 (Molecular Probes).

Análise por RT-PCR O ARN celular total foi isolado utilizando um sistema de isolamento de ARN total SV (Promega). Para analisar a expressão relativa de diferentes ARNm, a quantidade de ADNc foi normalizado com base no sinal de ARNM de β-actina expresso ubiquamente. A PCR foi realizada utilizando protocolos correntes com Taq polimerase (Sigma). Os parâmetros de ciclagem foram desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, emparelhamento a 54-68 °C durante 1 min dependendo do iniciador e alongamento a 72 °C, com 35 ciclos.

Imunocitoquímica O procedimento especifico foi descrito anteriormente4. Os anticorpos para GLAST foram fornecidos pelo Dr. Masahiko Watanabe18 e 3-PGDH pelo Dr. Shigeki Furuya19. Os seguintes anticorpos primários foram adquiridos comercialmente: nestina (1:500, PharMingen), MAP-2ab (1:250, Sigma), neurofilamento M (1:200, Chemicon, Temecula, Califórnia), isotipo 3 de β-tubulina (1:400, Sigma), TuJ-1 (1:100, Babco, Richmond, Califórnia), GFAP (1:1, DAKO, Carpinteria, Califórnia), 04 (1:20, Boehringer 35

Mannheim, Alemanha), GalC (1:30, Chemicon), GABA (1:1000, Sigma), transportador de serotonina (1:200, Chemicon), transportador de acetilcolina vesicular (1:100, Chemicon), glutamina (1: 100, Chemicon), neuropéptido Y (1:1000, Península Laboratories Inc. , Belmont, Califórnia), TH (1:200, Chemicon), VIP (1:500, Incstar, Stillwater, Minnesota), CGRP (1:1200, Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido), SP (1:500, Amersham) , DAT (1:200, Chemicon). As células foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 488 ou 546, e foi realizada a coloração por contraste com iodeto de TOTO-3. As células foram examinadas num microscópio de varrimento a laser confocal (Radians 2000, Bio-Rad, Hertfordshire, RU).

Ensaios repórter

As células foram transfectadas utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram doseadas quanto às actividades de luciferase de pirilampo e de Renilla utilizando um kit de doseamento de luciferase duplo (Promega). Os valores da luciferase do pirilampo foram corrigidos quanto à eficácia de transfecção por inclusão de plasmideos que expressam a luciferase de Renilla.

Análise por transferência de Western

Os lisados celulares foram preparados e 50 pg de proteínas de lisado foram submetidos a electrof orese em 5% e 10% de SDS-gel de poliacrilamida-SDS a 5% e 10%. Antigénios para anticorpos MAP-2 (1:500, Chemicon), GFAP (1:500, Dako) e TH 36 (1:1000, Chemicon) foram detectados utilizando fosfatase alcalina. Métodos electrofisiológicos

As correntes foram medidas à temperatura ambiente (20-25 °C) com um amplificador da voltagem numa pequena área CEZ-2300 (Nihon Kohden, Tóquio, Japão). A aquisição de dados e estimulação foram controladas com o software pClamp 6.0 (Axon Instruments, Inc., Foster City, Califórnia). Os sinais foram filtrados a 5 kHz e amostrados a 10-50 kHz. As experiências foram realizadas numa configuração de amplificador da voltagem numa pequena área de célula inteira utilizando pipetas (vidro de borossilicato, Narishige, Tóquio, Japão) com valores de resistência na gama de de 4-8 ΜΩ. Para registo de correntes de potássio rectificadoras retardadas, a solução extracelular padrão continha (mM) NaCl (150), KC1 (4), CaCl2 (2), MgCl2 (2), glucose (10) e Hepes (10) (pH 7,4 com NaOH). A solução padrão de pipetagem era (mM) KC1 (130), MgCl2 (5), EGTA (10) e Hepes (10) (pH 7,4 com KOH).

Análise do modelo de rato da doença de Parkinson

Um procedimento para criar este modelo de doença foi descrito num relatorio anterior . Em resumo, ratos Wistar machos adultos (pesando 250-300 g) foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg, intraperitoneal) e, em seguida, injectou-se solução de 6-OHDA (8 pg/4 pL de ascorbato a 0,1% em soro fisiológico) no feixe medial esquerdo do prosencéfalo (A/P = -4,4 mm, L = 1,1 milímetros do bregma, V = -7,7 mm de 37 dura).

Utilizou-se rotação contralateral prolongada como um comportamento alvo e foram excluídos os ratos que apresentaram uma média de menos de 6 rotações por minuto durante os primeiros 30 minutos após a administração de apomorfina (0,8 mg/kg, subcutaneamente) . 1 x 105 células/8 pL foram enxertadas no corpo estriado lesionado nas seguintes coordenadas: A/P = +0,5 mm, L = +3,0 mm do bregma e V = -4,5 mm. O número de animais foi de 5 no grupo de MSC, de 6 no grupo de N-MSC e de 10 no grupo de G-MSC.

Para imuno-histoquímica de corpos estriados enxertados (grupo G-MSC 10 semanas pós-operação), secções da glia foram incubadas com anticorpos contra neurofilamento M, TH, DAT, GFAP e 04. Estes foram depois detectados por anticorpos secundários marcados com AlexaFluor-546 (Molecular Probes), antes da coloração de contraste de TOTO 3 com iodeto.

Para o transplante de MSC humanas, 5 animais foram enxertados e imunossuprimidos por injecção subcutânea de FK506 (1 mg/kg, Fujisawa, Osaka, Japão) uma vez por dia. Quatro semanas após o transplante, foi medida a rotação induzida por apomorfina. Para a determinação de dopamina em HPLC, obteve-se secções cerebrais coronais com um milímetro de espessura (A/P +2,5 mm a -1,5 mm do bregma; 4 secções totais), separados na linha média, e cada lado foi cultivado separadamente em alfa-MEM contendo FBS a 10%. Após 24 horas, os meios de cultura foram recolhidos e fornecidos para análise por HPLC por SRL Communication and Health, Tóquio, Japão. Todas as experiências com animais foram aprovadas pelo Animal Care and Experimentation Committee da Faculdade de Medicina da Universidade de Kyoto. 38

Análise estatística

Os dados foram expressos como média +/- MEP. Os dados foram comparados utilizando ANOVA com comparações entre pares pelo processo de Bonferroni. Valores de P <0,05 foram considerados significativos e <0,01 como altamente significativos.

Exemplo 6: Identificação de MSC

Utilizou-se MSC de rato e humanas para a experiência seguinte. As MSC de rato (Wistar) foram isoladas por um processo descrito anteriormente e cultivadas(4) . As MSC humanas foram obtidas a partir de um dador saudável ou adquiridas de uma fonte comercial (BioWhittaker).

Os marcadores da superfície das células foram avaliados nas MSC de rato e MSC humanas utilizando selecção de células activadas fluorescentes (FACS). As MSC expressaram CD29 (integrina beta-1), CD90 (Thy-1) e CD54 (ICAM-1), mas não CD34 (marcador de células estaminais hematopoiéticas), CDllb/c (marcador relacionado com macrófagos) ou factor de von Willebrand (marcador de células endoteliais humanas, dados não apresentados) (Fig. 11a). Este resultado corresponde a relatórios anteriores13,111' Resultados semelhantes foram obtidos por análise imunocitoquímica (Fig. llb-f). Diferenciação lipogénica, condrogénica e osteogénica das MSC de rato e humanas foram confirmadas de acordo com o processo descrito em Pittenger et al. (1999) (3). Isto indicou que as células foram uma fonte mesenquimal (dados não apresentados). 39

Exemplo 7: Efeito da transfecção de NICD em MSC NICD foi transfectado para as MSC, uma vez que a actividade de sinalização Notch é encontrada no domínio intracelular da proteína Notch e deleções que removem o domínio extracelular pode induzir uma forma constitutivamente activa de Notch(16). 0 NICD compreende uma sequência que codifica uma pequena porção do domínio extracelular, a região transmembranar e todo o domínio intracelular de Notch de murganho(17) e foi fornecido pelo Dr. Kawaichi do Nara Institute of Science and Technology. 0 fragmento foi subclonado em pCl-Neo, um vector de expressão de mamífero contendo o promotor CMV, e depois transfectado para as MSC por lipofecção e subsequente selecção de G418.

Uma vez que os domínios extracelulares e intracelulares de Notch foram detectados, as MSC não tratadas expressaram pequenas quantidades de Notch endógeno. No entanto, as MSC transfectadas com NICD expressaram, predominantemente, apenas NICD e o domínio extracelular não foi detectado (Fig. 12a). 0 transportador de glutamato GLAST e 3-fosfoglicerato desidrogenase (3PGDH) estão presentes em células estaminais neuronais (NSC) e glia radial<18,19> . Pensa-se que estes estão linearmente relacionados com células estaminais e podem servir como uma fonte de neurónios durante a embriogénese(20) . NSC positivas a bromodesoxiuridina (Brd-U) no giro denteado do hipocampo de murganho adulto eram quase invariavelmente imunopositivas para 3PGDH(19>. Após transfecção de NICD, as MSD de rato sobrerregularam a transcrição e expressão destas duas moléculas bem como de nestina, um marcador conhecido de NSC e células progenitoras neuronais (NPC) (21) . As MSC não tratadas não apresentaram quase nenhuma expressão de GLAST ou 3PGDH, mas uma 40 fracção muito pequena das células eram positivas para nestina (0,74+/-0,1%). Após a transfecção de NICD, contudo, estas células sobrerregularam GLAST, 3PGDH e nestina (4,92+/1,0%, p <0,01) (Fig. 15b-g). Num ensaio promotor de luciferase, as actividades de 3PGDH 5'-flanqueadora de comprimento total (nucleotidos -3472 a -1) e M1965 5'-flanqueadora (-1792 a -1) (ambas descritas como sendo activas na glia radial e células estaminais gliais(19)) estavam significativamente aumentadas nas MSC de rato após a transfecção de NICD (p <0,01) (Fig. 12h). (Os promotores foram fornecidos pelo Dr. S. Furuya, Brain Science Institute, RIKEN).

Em vertebrados, NSC e as células estaminais da cristã neural adoptam um destino glial através da inibição da diferenciação neuronal <13,14'16) . A presente requerente confirmou que a inserção de NICD em NSC de rato gera astrocitos positivos a GFAP, mas muito poucas células positivas a GFAP foram verificadas na MSC transfectadas com NICD (dados não apresentados). Por outro lado, foi descrito que a introdução de

Notchl activado em prosencéfalo de rato promove a identidade da glia radial durante a embriogénese(15) . Uma vez que as MSC expressam marcadores relacionados com NSC e NPC após a introdução de NICD, é plausível que a transfecção de NICD tenha feito com que as MSC nudassem o seu fenotipo para um que se assemelha a NSC e/ou NPC.

Indução neural em MSC transfectadas com NICD A presente requerente investigou as condições necessárias para gerar selectivamente células neuronais a partir de MSC transfectadas com NICD. Testou-se por isso vários factores 41 conhecidos para actuarem sobre a neurogénese(22) (neurotrofinas, factor inibidor de leucemia, bFGF e CNTF) e forskolina. Verificou-se que a condição mais eficiente para a indução especifica de células neuronais era a introdução simultânea de FSK, bFGF e CNTF. (Doravante referida como "introdução de factor trófico" ao longo da presente especificação.)

Após a transfecção de NICD em MSC de rato, cultura das células até 60-70% de confluência e introdução de três factores tróficos (FSK + pFGF + CNTF), 96,5+/-0,6% das células eram positivas a MAP-2ab após cinco dias (Fig. 13, Fig. 14a-d) . A presente requerente observou taxas de positividade a MAP-2AB de 73,2+/-5,1% com bFGF sozinho com e 87,5+/-3,1% e 83,6+/-3,4% quando FSK e CNTF também foram adicionados. Esta diferença não era significativa (p> 0,05) (Fig. 16). FSK e CNTF respectivamente produziram taxas de 29,2+/-5,4 e 4,3+/-1,9% sós (p <0,01) e de 11,4+/-2,4% em conjunto (Fig. 13). A indução de células MAP-2ab por factores tróficos foi provavelmente causada pela inibição da diferenciação celular glial e outras a partir de MSC em vez de por morte especifica de células não neuronais, porque praticamente não foram observadas células mortas por coloração nuclear com TOTO-3 após a indução de factor trófico (dados não apresentados). A indução de factor trófico, por si só, ou após a inserção de um vector de controlo pCl-neo sem NICD, resultou em fenotipos neurais não reconhecíveis (Fig. 13). Portanto, parece que a transfecção de NICD é fundamental para a indução neural de MSC. 42

Caracterização de células neuronais de MSC

As células neuronais derivadas das MSC de rato e humanas acima referidas apresentaram caracteristicas morfológicas distintas caracteristicas de neurónios, incluindo os processos semelhantes a neuritos com varicosidades abundantes, e expressaram marcadores neuronais típicas como neurofilamento-M, beta 3-tubulina e Tujl (Fig. 14a-g). Também foi possível reconhecer células positivas a nestina, embora poucas (2,03+/-0,7%) (dados não apresentados). As células neuronais induzidas foram incapazes de proliferar quando subcultivadas após tratamento com tripsina. A incorporação de Brd-U estudada 5 dias após a indução com factor trófico mostrou marcação mínima de células positivas a MAP-2ab (Fig. 14h), sugerindo que estas células neuronais são terminadas mitoticamente. MAP-2ab não foi detectado por transferência Western em MSC não tratadas, mas foi encontrado após a indução com factor trófico (Fig. 141(1)).

Um aumento do desenvolvimento da corrente de potássio rectificadora retardada está associada à maturação da excitabilidade celular e diferenciação neuronal(23) . A presente requerente investigou esta propriedade nas células neuronais induzidas pelo processo de fixação da voltagem. Uma corrente de K+ rectificada exteriormente foi eliciada por degraus de voltagem positivos em MSC induzidas derivadas de ratos e de humanos. A amplitude desta corrente era significativamente maior do que em MSC não tratadas (Fig. 14m-q) . A presente requerente investigou também o potencial de membrana em repouso em condições de fixação da corrente imediatamente após a configuração de célula inteira ter sido formada. Os potenciais 43 de membrana em repouso foram inferiores entre células neuronais do que em MSC não tratadas (-50 a -60 mV e -30 a -40 mV, respectivamente) . Estas propriedades neurofisiológicos induzidas em MSC assemelham-se às de neurónios maduros.

Na verificação de células gliais, a presente requerente realizou imunocitoquímica utilizando GFAP como um marcador de astrocitos e galactocerebrosido (GalC) e 04 como marcadores de oligodendrócitos. Não foram detectadas células gliais positivas a marcadores após a indução com factor trófico de MSC de rato ou humanas (Fig. 14i-k). Isto foi confirmado por transferência Western (Fig. 141(2)). Para confirmar ainda mais a especificidade da indução neural, a presente requerente mediu as actividades promotoras de NeuroD e GFAP. Em MSC de rato não tratadas, as taxas para NeuroD e GFAP foram 67,2+/-15,3 e 5,16+/-1,36, respectivamente. Após a indução com factor trófico, no entanto, a actividade de NeuroD aumentou significativamente para 132,7+/-20,9 enquanto a de GFAP diminuiu para 0,63+/-0,22 (Fig. 15). Estes resultados indicam que só células neuronais foram especificamente induzidas a partir de MSC transfectadas com NICD após a indução com factor trófico.

Geração de células positivas a TH A função neural está infimamente relacionada com neurotransmissores específicos do tipo celular. A presente requerente realizou portanto o exame imunocitoquímico de neurotransmissores e proteínas relacionadas após a indução com factor trófico (Fig. 16a) . Sabe-se que o GDNF está envolvido na geração e desenvolvimento de neurónios dopaminérgicos do mesencéf alo(36> . A presente requerente também examinou se a 44 administração de GDNF induz MSC neurais a aumentar a sua proporção de células positivas a tirosina hidroxilase (TH) . Esta percentagem aumentou de 3,9+/-0,6% após indução só com factor trófico até 41,0+/-14,1% após a administração de GDNF (Fig. 16a a c). O GDNF também induziu expressão de Nurr-1, que é um factor de transcrição que tem um papel na diferenciação de precursores do mesencéfalo em neurónios dopaminérgicos(37) (Fig. 16d) . A transferência Western confirmou ainda estes resultados (Fig. 16e) .

Transplante de células neuronais para modelo da doença de Parkinson do rato

Para explorar a capacidade de células neuronais derivadas de MSC de sobreviver e funcionar in vivo, células tanto de rato como humanas, foram transplantadas para os corpos estriados de ratos do modelo da doença de Parkinson. A administração unilateral de 6-OHDA no feixe medial do prosencéfalo destrói selectivamente neurónios dopaminérgicos da substantia nigra, proporcionando assim um modelo útil da doença de Parkinson. Foram transplantados três tipos de MSC de rato marcadas com proteína verde fluorescente (GFP) (4) : 1) não tratadas (grupo

MSC), 2) após indução com factor trófico em células neuronais (grupo N-MSC) e 3) administração de GDNF após a indução (grupo G-MSC) . Os animais receberam o implante de 1 x 105 MSC ipsilateral em relação ao estriado lesionado. O comportamento rotacional induzido por apomorfina foi examinado durante 10 semanas após a implantação das células. O grupo MSC mostrou um desvio rotacional com afastamento do lado lesionado que persistiu, ao passo que o grupo N-MSC mostrou ligeira recuperação ao longo do tempo. Em contraste, o grupo L-MSC 45 demonstrou uma recuperação significativa do comportamento de rotação (Fig. 16f) . Os animais transplantados foram seguidos até às 16 semanas, sem qualquer formação de tumor observada no cérebro.

Dez semanas após o enxerto, os cérebros foram examinados histologicamente, incluindo por imuno-histoquimica. Os corpos estriados transplantados mostraram células positivas a GFP, enquanto que as células transplantadas foram positivas a neurofilamento e, em alguns casos, apresentaram marcação com anticorpos anti-GFAP e anti-04. Muitas das células transplantadas também eram positivos a TH e transportador de dopamina (DAT) (Fig. 16g-k). A percentagem de células positivas a GFAP entre MSC marcadas com GFP era 2,5+/-1,4%, enquanto as percentagens de células positivas a TH e DAT eram 45,7+/-4,2% e 30,7+/-0,9%, respectivamente. Em secções em série do grupo G-MSC, verificou-se que as células enxertadas migravam e estendiam-se ao corpo estriado hospedeiro (F 161) . Aproximadamente 3,4 x 104 células (34%) foram contadas no corpo estriado. MSC neurais tratadas com GDNF humana foram analogamente transplantadas para o corpo estriado de ratos lesionados com 6-OHDA. Os animais foram imunossuprimidos com FK 506 diariamente, e o comportamento de rotação foi registado às 4 semanas. O enxerto resultou em melhoramento significativo do comportamento rotacional (o indice de rotação médio, pós/pré-operação, foi de 0,44+/-0,2) (Fig. 16m). A capacidade de MSC humanas enxertadas de sintetizar e libertar dopamina foi avaliada pela determinação da concentração de dopamina no meio de cultura de secções de cérebro transplantado por cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC). As secções de cérebro foram 46 separadas na linha média em lados enxertado e intacto e cultivadas separadamente. A concentração de dopamina no meio de cultura de cada lado foi determinada e calculada a proporção entre o lado lesionado e o lado intacto. Ratos submetidos a operação simulada apresentaram uma proporção de 0,57+/-0,01 (n = 3), em contraste com a proporção de 0,67+/-0,04 (n = 3) dos animais enxertados. Isto era consistente com um aumento da libertação de dopamina (p = 0,04) com o transplante. Estes resultados sugerem que as células neuronais induzidas a partir de MSC humanas foram capazes de sintetizar e libertar dopamina em corpo estriado de rato lesionado.

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Lisboa, 30 de Outubro de 2013 51

Claims (31)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo de indução de células estromais da medula óssea (BMSC) a diferenciarem-se em células precursoras neuronais in vitro, compreendendo os passos de: (1) isolamento das BMSC da medula óssea e cultura das referidas células num meio de cultura essencial convencional suplementado com um soro; e (2) introdução, nas referidas células, de um ácido nucleico compreendendo sequências que codificam um dominio intracelular de Notch, e cultura subsequente das referidas células para produzir células precursoras neuronais.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas BMSC isoladas são derivadas de um humano.
3. 3. População de células precursoras neuronais produzidas pelo processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os membros da população de células precursoras neuronais compreendem um dominio intracelular de Notch e, ainda em que as células não expressam o domínio extracelular de Notch.
4. 4. População de células precursoras neuronais de acordo com a reivindicação 3, em que os membros da população de células precursoras neuronais expressam os marcadores de células precursoras neuronais GLAST, 3PGDH e nestina.
5. 5. Processo de indução de BMSC a diferenciarem-se em células 1 neuronais in vitro compreendendo os passos de: (1) isolamento das BMSC de medula óssea e cultura das referidas células num meio de cultura essencial convencional suplementado com um soro; (2) introdução, nas referidas células, de um ácido nucleico compreendendo sequências que codificam um domínio intracelular de Notch e cultura subsequente das referidas células; e (3) adição de um aqente de aumento do monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) ou de um análoqo de cAMP, e/ou um factor de estimulação da diferenciação celular ao referido meio de cultura, e cultura subsequente das referidas células para produzir as referidas células neuronais, em que as células diferenciadas resultantes são descendentes das BMSC nas quais foi introduzido o referido ácido nucleico compreendendo sequências que codificam um domínio intracelular de Notch.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que a referida introdução do referido ácido nucleico compreendendo sequências que codificam um domínio intracelular de Notch é realizada por lipofecção com um vector que pode ser expresso num mamífero.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, compreendendo ainda entre o Passo (2) e o Passo (3), um passo de selecção de células nas quais foi introduzido o referido ácido nucleico, durante um período de tempo predeterminado. 2
8. 8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5-7, em que o referido factor de estimulação da diferenciação celular é seleccionado do grupo consistindo em factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor neurotrófico ciliar (CNTF) e suas misturas.
9. 9. Processo de qualquer das reivindicações 5-8, em que as referidas BMSC são derivadas de um humano.
10. 10. Processo da reivindicação 5, compreendendo ainda os passos de: (4) cultura das células neuronais obtidas no Passo (3) num meio de cultura essencial convencional suplementado com um soro; e (5) adição de factor neurotrófico derivado da glia (GDNF) e um agente de aumento de cAMP ou análogo de cAMP, e/ou um factor de estimulação da diferenciação celular que não o referido GDNF ao referido meio de cultura, e cultura subsequente das referidas células para se obter neurónios dopaminérgicos, em que os neurónios dopaminérgicos resultantes são descendentes de BMSC em que foi introduzido o referido ácido nucleico.
11. 11. Processo da reivindicação 5, compreendendo ainda os passos de: (4) cultura das células neuronais obtidas no Passo (3) num meio de cultura essencial convencional suplementado com um soro; e 3 (5) adição de factor de crescimento dos nervos (NGF) e um agente de aumento de cAMP ou análogo de cAMP, e/ou um factor de estimulação da diferenciação celular que não o referido NGF ao referido meio de cultura, e cultura subsequente das referidas células para se obter neurónios acetilcolinérgicos, em que os neurónios acetilcolinérgicos resultantes são descendentes de BMSC em que foi introduzido o referido ácido nucleico.
12. 12. Processo de qualquer das reivindicações 10 ou 11, em que as referidas BMSC são derivadas de um humano.
13. 13. Processo de qualquer das reivindicações 10-12, em que o referido agente de aumento de cAMP ou análogo de cAMP, no passo (3), é forscolina.
14. 14. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10-13, em que o referido factor de estimulação da diferenciação celular, no passo (3), é seleccionado do grupo consistindo em factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor neurotrófico ciliar (CNTF) e suas misturas.
15. 15. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10-15, em que o referido meio de cultura essencial convencional no Passo (4) é um meio essencial mínimo alfa modificado de Eagle.
16. 16. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10-15, em que o referido soro no Passo (4) é soro fetal de vitelo. 4
17. 17. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10-16, em que o referido agente de aumento de cAMP ou análogo de cAMP no Passo (5) é forscolina.
18. 18. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10-17, em que a concentração do referido agente de aumento de cAMP ou análogo de cAMP no Passo (5) está entre 0,001 nM e 100 μΜ.
19. 19. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10 ou 12-18, em que o referido factor de estimulação da diferenciação celular que não GDNF no Passo (5) é seleccionado do grupo consistindo em factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento AA derivado de plaquetas (PDGF-AA) e suas misturas.
20. 20. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10 ou 12-19, em que uma concentração do referido GDNF no Passo (5) está entre 1 ng/mL e 100 ng/mL.
21. 21. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10 ou 12-20, em que uma concentração do referido factor de estimulação da diferenciação celular que não GDNF no Passo (5) está entre 0,001 ng/mL e 100 microgramas/mL.
22. 22. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 11-18, em que o referido factor de estimulação da diferenciação celular que não NGF no Passo (5) é seleccionado do grupo consistindo em factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento AA derivado de plaquetas (PDGF-AA) e suas misturas. 5
23. 23. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 11-18 ou 22, em que a concentração do referido NGF no Passo (5) está entre 1 ng/mL e 100 ng/mL.
24. 24. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 13-20, 24 ou 25, em que uma concentração do referido factor de estimulação da diferenciação celular que não NGF no Passo (5) está entre 0,001 ng/mL e 100 microgramas/mL.
25. 25. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5-9, em que o referido meio de cultura essencial convencional é um meio essencial mínimo alfa modificado de Eagle.
26. 26. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5-9 ou 25, em que o referido soro é soro fetal de vitelo.
27. 27. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5-9, 25 ou 26, em que o referido agente de aumento de cAMP ou análogo de cAMP no Passo (3) é forscolina.
28. 28. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5-9 ou 25-27, em que uma concentração do referido agente de aumento de cAMP ou análogo de cAMP no Passo (3) está entre 0,001 nM e 100 μΜ.
29. 29. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5-9 ou 25-28, em que uma concentração do referido factor de estimulação da diferenciação celular está entre 0,001 ng/mL e 100 pg/mL.
30. 30. Utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz da população de células precursoras neuronais de acordo com a 6 reivindicação 3 ou 4 no fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento de um doente que sofre de sistema que a espinal uma doença, distúrbio ou estado envolvido no nervoso central.
31. 31. Utilização de acordo com a reivindicação 30, em referida doença, distúrbio ou estado é uma lesão induzida por um ferimento. Lisboa, 30 de Outubro de 2013 7