KR101768884B1 - Dna 메틸화에 변형을 가진 신경 재생 세포 - Google Patents

Dna 메틸화에 변형을 가진 신경 재생 세포 Download PDF

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Abstract

중추신경계(CNS) 또는 말초신경계(PNS) 손상 부위에 이식 후 다양한 신경 장애에서 구제하고 및/또는 이들을 역전시킬 수 있는, 골수 유착 줄기세포(MASC)의 자손인 세포가 본원에 개시된다. 세포는 그들의 MASC의 메틸화 상태와 비교하여 어떤 유전자의 메틸화 상태에 변형을 함유한다. 또한, 어떤 유전자의 메틸화 상태의 변형에 의해서 CNS 또는 PNS 손상 부위에 이식 후 다양한 신경 장애에서 구제하고 및/또는 이들을 역전시킬 수 있는 세포의 제조 방법이 제공된다.

Description

DNA 메틸화에 변형을 가진 신경 재생 세포{NEURAL REGENERATING CELLS WITH ALTERATIONS IN DNA METHYLATION}
연방정부 지원과 관련된 서술
해당 없음
기술분야
본 명세서는 신경 장애를 위한 세포 치료법 및 유전자 발현 및 분화의 후생유전자 조절(epigenetic regulation) 분야에 관한 것이다.
세포 분화는 유전자 발현의 조절에 의해서 일부분 통제된다. 전사 조절, 특 mRNA 분자의 합성에서 주형으로서 DNA의 사용이 유전자 발현이 조절되는 기전의 하나이다. 유전자 발현의 전사 조절은, 예를 들어 크로마틴 구조의 변형 및/또는 유전자 안에서 또는 유전자 근처에서 전사 조절성 단백질과 특정 DNA 서열의 결합의 결과일 수 있다.
유전자 발현을 전사 통제하기 위한 또 다른 수단은 DNA의 화학적 변형에 의한 것이다. 이런 조절 형태에서 가장 광범위하게 연구된 양태는 DNA 메틸화이다. 진핵세포 게놈에서 DNA 메틸화의 주된 형태는 다수의 세포 메틸트랜스페라제 중 하나의 작용을 통한 시토신의 5-메틸-시토신으로의 전환이다. 대부분의 경우 메틸화된 C 잔기는 G 잔기의 바로 상류에 위치된다. 일반적으로 유전자 안에서 또는 유전자 근처에서 C 잔기의 메틸화는 그 유전자의 감소된 발현과 상호관련된다. 대부분의 경우 CpG 메틸화는 그 자체로는 유전자의 전사 억제의 직접적인 원인은 아니지만, 유전자 조절성 단백질에 의해 초기 매개된 전사 억제를 영구 존속시키는 기전인 것으로 보인다.
어떤 비-세포-타입-특이적 척추동물 유전자(즉, 하우스키핑 유전자)의 상류 영역에서는 CG 디뉴클레오티드 서열의 빈도가 그 게놈의 GC 함유량에 기초하여 예상되는 것보다 훨씬 높다; 이러한 영역은 CpG 섬이라고 알려져 있다. CpG 섬은 C 잔기의 메틸화 상태가 관련된 유전자의 전사에 영향을 미칠 수 있는 부위이다. 반대로, 특정 유전자와 관련된 CpG 섬이나 그외 다른 영역에서의 C 잔기의 메틸화 상태는 그 유전자의 전사 상태의 잠재적 표시자 및/또는 특정 세포 타입을 특성화하기 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/094836를 참조한다.
신경계 손상 또는 질환 부위에 이식 후 신경 회복 및/또는 신경 재생을 자극할 수 있는 세포가 본원에 개시된다. 어떤 구체예에서, 상기 세포는 골수 유착 줄기세포(MASC)의 자손이지만, 시험관내 처리 및 배양 후 어떤 유전자의 메틸화 상태가 변형된 것이다. 이와 같이, 본 발명자는 하나 이상의 유전자의 메틸화 상태의 변형이 선조 세포를 선조 세포가 갖지 못한 신경 재생 특성을 갖는 자손 세포로 전환시킬 수 있다는 것을 발견했다.
이런 발견의 결과, 본 명세서는 특히 다음의 구체예들을 포함한다:
1. (a) Notch 세포내 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 세포를 트랜스펙션하는 단계; 및
(b) 트랜스펙션되지 않은 세포의 유전자와 비교하여 세포 또는 그 세포의 하나 이상의 자손에서 유전자의 메틸화 상태가 변형되도록 트랜스펙션된 세포를 배양함으로써 유전자의 메틸화 상태를 변형시키는 단계
를 포함하는, 세포에서 유전자의 메틸화 상태를 변형시키는 방법.
2. 구체예 1에서, 유전자가 PITX2 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 구체예 1에서, 유전자가 DNMT3b 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 구체예 1에서, 유전자가 IGF2R 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 구체예 1에서, 유전자가 SDF4 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 구체예 1에서, 유전자가 ROPN1L 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 구체예 1에서, 유전자가 TMEM179 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 구체예 1-5의 어느 하나에서, 유전자의 메틸화가 자손 세포에서 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 구체예 1, 6 또는 7 중 어느 하나에서, 유전자의 메틸화가 자손 세포에서 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 구체예 9에서, 서열 C-A-T-Cme-G-C-C-C가 서열 C-A-T-C-G-C-C-C로 전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 구체예 1-10의 어느 하나에서, 세포가 골수 유착 기질세포(MASC)인 것을 특징으로 하는 방법.
12. (a) Notch 세포내 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 선조 세포를 트랜스펙션하는 단계;
(b) 트랜스펙션된 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 트랜스펙션된 세포의 자손 집단 중에서 유전자의 메틸화 상태가 변형된 하나 이상의 자손 세포를 얻는 단계
를 포함하는, 유전자의 메틸화 상태가 변형된 자손 세포를 제조하는 방법.
13. 구체예 12에서, 유전자가 PITX2 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 구체예 12에서, 유전자가 DNMT3b 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 구체예 12에서, 유전자가 IGF2R 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 구체예 12에서, 유전자가 SDF4 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 구체예 12에서, 유전자가 ROPN1L 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 구체예 12에서, 유전자가 TMEM179 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 구체예 12-16의 어느 하나에서, 유전자의 메틸화가 선조 세포와 비교하여 자손 세포에서 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 구체예 12, 17 또는 18의 어느 하나에서, 유전자의 메틸화가 선조 세포와 비교하여 자손 세포에서 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 구체예 20에서, 서열 C-A-T-Cme-G-C-C-C가 서열 C-A-T-C-G-C-C-C로 전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 구체예 12-21의 어느 하나에서, 선조 세포가 골수 유착 기질세포(MASC)인 것을 특징으로 하는 방법.
23. 선조 세포에서 하나 이상의 유전자의 메틸화 상태를 변형시키는 단계를 포함하는, 선조 세포를 신경 재생 세포로 전환시키는 방법.
24. 구체예 23에서, 유전자가 PITX2 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 구체예 23에서, 유전자가 DNMT3b 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 구체예 23에서, 유전자가 IGF2R 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
27. 구체예 23에서, 유전자가 SDF4 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 구체예 23에서, 유전자가 ROPN1L 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 구체예 23에서, 유전자가 TMEM179 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 구체예 23-27의 어느 하나에서, 유전자의 메틸화가 선조 세포와 비교하여 신경 재생 세포에서 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 구체예 23, 28 또는 29의 어느 하나에서, 유전자의 메틸화가 선조 세포와 비교하여 신경 재생 세포에서 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 구체예 31에서, 서열 C-A-T-Cme-G-C-C-C가 서열 C-A-T-C-G-C-C-C로 전환되는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 구체예 23-32의 어느 하나에서, 선조 세포가 골수 유착 기질세포(MASC)인 것을 특징으로 하는 방법.
34. 구체예 23에서, 유전자의 메틸화 상태가
(a) Notch 세포내 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 선조 세포를 트랜스펙션하는 단계;
(b) 트랜스펙션된 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 트랜스펙션된 세포의 자손 집단 중에서 유전자의 메틸화 상태가 변형된 하나 이상의 자손 세포를 얻는 단계
에 의해서 변형되며, 이때 유전자의 메틸화 상태가 변형된 상기 자손 세포가 신경 재생 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
35. 구체예 30에서, 유전자의 메틸화 상태가 메틸화 도메인과 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 또는 메틸화 도메인과 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 선조 세포와 접촉시키는 것에 의해서 변형되며, 이때 DNA-결합 도메인은 유전자의 하나 이상의 서열과 결합하도록 조작되는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 구체예 31에서, 유전자의 메틸화 상태가 탈메틸화 도메인과 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 또는 탈메틸화 도메인과 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 선조 세포와 접촉시키는 것에 의해서 변형되며, 이때 DNA-결합 도메인은 유전자의 하나 이상의 서열과 결합하도록 조작되는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 시험관내 배양을 통해서 선조 세포로부터 얻어진 자손인 세포로서,
(a) 세포는 신경 조직의 성장 및/또는 재생을 지원하고;
(b) 세포에서 하나 이상의 유전자의 메틸화 상태가 선조 세포와 비교하여 변형되고; 및
(c) 시험관내 배양 동안, 선조 세포나 그것의 어떤 자손도 Notch 세포내 도메인(NICD)을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션되지 않은 것을 특징으로 하는 세포.
38. 구체예 37에서, 유전자가 PITX2 유전자인 것을 특징으로 하는 세포.
39. 구체예 37에서, 유전자가 DNMT3b 유전자인 것을 특징으로 하는 세포.
40. 구체예 37에서, 유전자가 IGF2R 유전자인 것을 특징으로 하는 세포.
41. 구체예 37에서, 유전자가 SDF4 유전자인 것을 특징으로 하는 세포.
42. 구체예 37에서, 유전자가 ROPN1L 유전자인 것을 특징으로 하는 세포.
43. 구체예 37에서, 유전자가 TMEM179 유전자인 것을 특징으로 하는 세포.
44. 구체예 37-41의 어느 하나에서, 유전자의 메틸화가 선조 세포와 비교하여 신경 재생 세포에서 증가한 것을 특징으로 하는 세포.
45. 구체예 37, 42 또는 43의 어느 하나에서, 유전자의 메틸화가 선조 세포와 비교하여 신경 재생 세포에서 감소한 것을 특징으로 하는 세포.
46. 구체예 45에서, 서열 C-A-T-Cme-G-C-C-C가 서열 C-A-T-C-G-C-C-C로 전환된 것을 특징으로 하는 세포.
47. 구체예 37-46의 어느 하나에서, 선조 세포가 골수 유착 기질세포(MASC)인 것을 특징으로 하는 방법.
48. 구체예 37에서, 유전자의 메틸화 상태가 메틸화 도메인과 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 또는 메틸화 도메인과 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 선조 세포와 접촉시키는 것에 의해서 변형되며, 이때 DNA-결합 도메인은 유전자의 하나 이상의 서열과 결합하도록 조작된 것을 특징으로 하는 세포.
49. 구체예 37에서, 유전자의 메틸화 상태가 탈메틸화 도메인과 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 또는 탈메틸화 도메인과 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 선조 세포와 접촉시키는 것에 의해서 변형되며, 이때 DNA-결합 도메인은 유전자의 하나 이상의 서열과 결합하도록 조작된 것을 특징으로 하는 세포.
50. 세포에서 하나 이상의 유전자의 메틸화 상태를 분석하는 단계를 포함하며, 이때 분석된 유전자의 메틸화 상태의 변화가 신경 재생 세포임을 표시하는, 신경 재생 세포를 확인하는 방법.
51. 구체예 50에서, 분석이 하나 이상의 유전자의 증가된 메틸화에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
52. 구체예 50에서, 분석이 하나 이상의 유전자의 감소된 메틸화에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
53. 구체예 50에서, 분석이 하나 이상의 제 1 유전자의 증가된 메틸화와 하나 이상의 제 2 유전자의 감소된 메틸화에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
54. 구체예 50에서, PITX2, ROPN1L, DNMT3b, IGF2R, TMEM179 및 SDF4로 구성되는 군으로부터 하나 이상의 유전자가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
상세한 설명
진단으로서의 메틸화 상태
관심의 하나 이상의 유전자 안에서 또는 근처에서 특정 CpG 서열의 DNA 메틸화 상태의 변화에 대한 분석을 사용하여 세포를 확인하고, 그것을 상이한 DNA 메틸화 패턴을 가진 다른 세포들과 구별할 수 있다. 예를 들어, 만일 줄기세포 타입이나 다른 타입의 선조 세포에서 특정한 CpG 서열이 그것의 C 잔기에서 메틸화되고, 또한 분화시에 그 C 잔기가 탈메탈화된다면, 바로 그 C 잔기의 탈메틸화가 그 분화 단계의 마커로서 사용될 수 있다. 반대로, C 잔기의 메틸화가 분화의 마커로서 사용될 수도 있다. 메틸화 상태에 있어서 전부가 아니면 무라는 식의 전적인 변화는 요구되지 않는다; 특정 CpG 서열에서 메틸화 빈도의 변화가 또한 진단에 도움이 될 수 있다.
본 분야에 공지된 많은 방법을 사용하여 메틸화된 시토신 잔기와 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 구별할 수 있다. 이들은, 제한은 아니지만, 중아황산염에 의한 DNA의 처리, 및 메틸화-감음성 및 메틸화-의존성 제한 효소에 의한 DNA 절단 분석을 포함한다. 중아황산염(SO3 -) 처리는 메틸화되지 않은 시토신을 탈아민화하여 그것을 데옥시유리딘으로 전환하고, 이것은 복제시 발생기 DNA 가닥의 아데노신 잔기를 주형으로 삼는다. 따라서, 중아황산염 처리에 의해서 결과적으로 C-G 염기쌍이 T-A 염기쌍으로 전환되며, 이러한 변화는 표준 DNA 서열화 방법에 의해 검출될 수 있다. 메틸화된 C 잔기는 중아황산염 처리에 의해 영향받지 않으므로, Cme-G 염기쌍은 그대로 유지된다.
제한 효소를 사용한 메틸화 상태 분석에서는 인식 부위에 CG 서열을 가진 효소가 사용될 수 있다. CG 서열을 함유하는 어떤 제한 부위에서 만일 C 잔기가 메틸화된다면 그 부위를 인식하는 효소는 그것을 절단하지 못할 것이지만, 그 효소의 이소스키조머(isoschizomer)(즉, 동일한 서열을 인식하는 효소)는 C 잔기가 메틸화되었든 아니든 그 부위를 절단할 것이다. 예를 들어, HpaII와 MspI는 둘 다 CCGG 서열을 인식한다. MspI는 두 번째 C 잔기의 메틸화 여부에 관계없이 이 부위를 절단한다. 그러나, HpaII는 두 번째 C 잔기가 메틸화되지 않은 경우에만 이 부위를 절단할 것이다. 따라서, 두 효소 모두에 의한 CCGG 서열의 절단은 이 부위에서 두 번째 C 잔기가 메틸화되지 않은 것을 나타내고(즉, 이 부위가 C-C-G-G 서열을 가진다), 단지 MspI에 의해서만 절단되는 것은 두 번째 C 잔기가 메틸화된 것을 나타낸다(즉, 이 부위가 C-Cme-G-G 서열을 가진다).
실제로 특정한 CpG 서열의 메틸화 상태에 대한 분석은 관심의 CpG를 포함하는 긴 서열의 확인을 수반한다. 주로 앰플리콘이라고 표시되는 이 서열은 일반적으로 그것이 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드 서열(메틸화 상태가 상이한 세포 타입에서 상이할 수 있다)을 포함하고, 예를 들어 중합효소 연쇄반응에 의한 증폭에 적합하도록 선택된다. 이러한 앰플리콘 서열은 일반적으로 포유동물 크기 게놈에서 특유하게 보일 만큼 충분히 길다.
메틸화 분석 및 DNA 메틸화 분석에 사용될 수 있는 전형적인 앰플리콘에 관한 추가의 상세한 내용 및 기타 정보는 WO 2006/094836(2006.9.14)에서 찾을 수 있으며, 이것의 내용은 메틸화 분석 및 DNA 메틸화 분석에 사용될 수 있는 전형적인 앰플리콘에 관한 추가의 상세한 내용 및 기타 정보를 제공하기 위해서 참고자료로 포함된다.
선조 세포
어떤 유전자의 메틸화 상태를 변형함으로써 신경 재생 세포로 전환될 수 있는 선조 세포는 비-말단 분화된 세포의 어떤 타입이라도 가능하다. 예를 들어, 미국특허 제5,843,780호; 제6,200,806호 및 제7,029,913호에 개시된 분화전능성 줄기세포가 선조 세포의 예로서 사용될 수 있다. 분화전능성 줄기세포는 배양될 수 있고(예를 들어, 미국특허 제6,602,711호 및 제7,005,252호), 다양한 타입의 만능 세포로 분화될 수 있으며(예를 들어, 미국특허 제6,280,718호; 제6,613,568호 및 제6,887,706호), 이것이 또한 개시된 방법의 실시시 선조 세포로서 사용될 수 있다.
다른 전형적인 타입의 선조 세포는 골수 기질세포(BMSC), 골수 유착 줄기세포 및 간엽 줄기세포라고도 하는 골수 유착 기질세포(MASC)이다. MASC에 관한 전형적인 내용은 미국특허출원 공개 제2003/0003090호; Prockop (1997) Science 276: 71-74 및 Jiang (2002) Nature 418:41-49에 제공된다. MASC의 분리 및 정제 방법은, 예를 들어 미국특허 제5,486,359호; Pittenger et al. (1999) Science 284: 143-147 및 Dezawa et al. (2001) Eur . J. Neurosci . 14:1771-1776에서 찾을 수 있다. 인간 MASC는 상업적으로 입수할 수도 있고(예를 들어, BioWhittaker, 메릴랜드 월커스빌), 또는 공여자로부터, 예를 들어 골수 흡출 후 유착 골수 세포의 선택에 의해서 얻어질 수도 있다. 예를 들어, WO 2005/100552를 참조한다.
또한, MASC는 제대혈로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, Campagnoli et al. (2001) Blood 98:2396-2402; Erices et al. (2000) Br. J. Haematol . 109:235-242 및 Hou et al. (2003) Int . J. Hematol . 78:256-261을 참조한다.
Notch 세포내 도메인
Notch 단백질은 모든 후생동물에서 발견되는 막통과 수용체로서, 세포내 신호화를 통해 세포 분화에 영향을 미친다. Notch 세포외 도메인과 Notch 리간드(예를 들어, Delta, Serrate, Jagged)의 접촉은 Notch 단백질을 2번 단백질 분해 절단하고, 이 중 두 번째는 γ-분비효소에 의해 촉매되어 세포질에 Notch 세포내 도메인(NICD)을 분비한다. 마우스 Notch 단백질에서는 이 절단이 아미노산 gly1743과 val11744 사이에서 일어난다. NICD는 핵으로 전위되고, 여기서 그것은 전사 인자로서 작용하여, 추가의 전사 조절성 단백질(예를 들어, MAM, 히스톤 아세틸라제)을 동원하여 여러 표적 유전자(예를 들어, Hes1)의 전사 억제를 완화한다.
Notch 신호화에 관한 추가의 상세한 내용 및 정보는, 예를 들어, Artavanis-Tsakonas et al. (1995) Science 268:225-232; Mumm and Kopan (2000) Develop. Biol. 228:151-165 및 Ehebauer et al. (2006) Sci . STKE 2006 (364), cm7. [DOI: 10.1126/stke.3642006cm7]에서 찾을 수 있다.
선조 세포(예를 들어, MASC)를 인간 Notch 세포내 도메인을 암호화하는 핵산으로 트랙스펙션한 다음, 약물 선택 및 추가 배양에 의해 트랜스펙션된 세포를 부화시키면, 게놈에서 DNA 메틸화가 변형된 신경 재생 세포가 생성된다. 추가의 상세한 내용은 하기 실시예 2를 참조한다.
세포 배양 및 트랜스펙션
표준 세포 배양 방법은 본 분야에 알려져 있다. 예를 들어, R. I. Freshney "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique," Fifth Edition, Wiley, New York, 2005를 참조한다.
세포에 외인성 DNA를 도입하는 방법(즉, 트랜스펙션) 역시 본 분야에 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, New York, 1987 및 주기적 업데이트를 참조한다.
전형적인 트랜스펙션 및 배양 방법이 하기 실시예 1 및 2에 제공된다.
DNA 메틸화의 표적화된 변형 방법
선조 세포의 신경 재생 세포로의 전환은 어떤 유전자의 메틸화 상태의 변화를 수반하므로, 메틸화 상태의 표적화된 변형을 사용하여 선조 세포를 신경 재생 세포로 전환시킬 수 있다.
특정한 C 잔기의 메틸화 상태를 변형시키는 방법은 본 분야에 알려져 있다. 특정 서열의 메틸화를 증가시키기 위해서 DNA-결합 도메인과 메틸화 도메인을 포함하는 융합 단백질이 사용될 수 있다. 예를 들어, Bestor U.S. 2002/0188103(2002. 12.12) 및 WO 97/11972(1997.4.3)를 참조한다. 메틸화 도메인의 출처로서 사용될 수 있는 전형적인 DNA 메틸트랜스페라제 효소가 전술한 참고자료에 개시된다. DNA 메틸트랜스페라제는 특정 DNA 서열을 메틸화할 수 있는 단백질이며, 특정 DNA 서열은 CpG일 수 있다. 이 단백질은 돌연변이된 DNA 메틸트랜스페라제, 야생형 DNA 메틸트랜스페라제, 자연 발생 DNA 메틸트랜스페라제, 자연 발생 DNA 메틸트랜스페라제의 변이체, 말단절단형 DNA 메틸트랜스페라제, 또는 DNA를 메틸화할 수 있는 DNA 메틸트랜스페라제의 세그먼트일 수 있다. DNA 메틸트랜스페라제는 포유류 DNA 메틸트랜스페라제, 박테리아 DNA 메틸트랜스페라제, M.SssI DNA 메틸트랜스페라제 및 DNA를 메틸화하는 능력을 가진 다른 단백질 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
융합 단백질의 구성에서 메틸화 도메인의 출처로서 사용될 수 있는 전형적인 DNA 메틸트랜스페라제는, 제한은 아니지만, 시토신 DNA 메틸트랜스페라제, dam 메틸트랜스페라제, dcm 메틸트랜스페라제, DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b, CpG 메틸라제, M.SssI, M.CviPI, HhaI 메틸트랜스페라제, HpaII 메틸트랜스페라제, MspI 메틸트랜스페라제, TaqI 메틸트랜스페라제, BamHI 메틸트랜스페라제, EcoRI 메틸트랜스페라제, HaeIII 메틸트랜스페라제, AluI 메틸트랜스페라제, 및 SssI 메틸트랜스페라제를 포함한다.
특정 DNA 서열의 메틸화도를 감소시키기 위해서는 DNA-결합 도메인과 탈메틸화 도메인의 융합체가 사용될 수 있다. 전형적인 DNA 탈메틸화 도메인은 설명되어 있다. 예를 들어, Bhattacharya et al., (1999) Nature (London) 397:579-583; Cervoni et al. (1999) J. Biol . Chem . 274:8363-8366를 참조한다.
관심의 서열의 메틸화도를 감소시키는 다른 전형적인 방법은 세포에서 DNA-결합 도메인(관심의 서열과 결합하는)과 5-메틸시토신 DNA-글리코실라제의 융합체를 발현시키는 것이다. 이 융합 단백질은 DNA 당-포스페이트 백본으로부터 메틸화된 시토신 염기를 제거하고, 이것은 세포 DNA 수선 효소에 의해 시토신으로 대체될 수 있다.
또한, 관심의 DNA 서열의 탈메틸화는 복제 동안 보존성 메틸라제가 그 서열에 접근하는 것을 차단함으로써 달성될 수 있으며, 이로써 새로 복제된 헤미메틸화된 DNA의 메틸화되지 않은 가닥의 메틸화가 방지된다. 복제를 더 실시하면 관심의 서열에 메틸화되지 않은 딸 DNA 듀플렉스가 얻어질 것이다. 이러한 차단은 관심의 서열과 결합하도록 조작된 징크핑거 DNA-결합 도메인의 세포내 발현에 의해 달성될 수 있다(하기 참조).
메틸화 도메인 또는 탈메틸화 도메인의 활성은 메틸화 도메인과 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질(또는 이 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 구성함으로써 특정 C 잔기에 대해 표적화될 수 있으며, 이때 DNA-결합 도메인은 선택된 C 잔기에 또는 근처에 있는 서열과 자연적으로 결합하거나, 또는 선택된 C 잔기에 또는 근처에 있는 서열과 결합하도록 조작된다. DNA-결합 도메인은 자연 발생 DNA-결합 도메인 또는 비-자연 발생, 조작된 DNA-결합 도메인일 수 있다.
이와 관련하여, 선택된 어떤 DNA 서열과 결합하도록 징크핑거 단백질을 조작할 수 있는 한 징크핑거 DNA-결합 도메인이 유용하다. 징크핑거 결합 도메인은 하나 이상의 징크핑거 구조를 포함한다. Miller et al. (1985) EMBO J 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American February:56-65; 미국특허 제6,453,242호. 전형적으로, 단일 징크핑거는 약 30개 아미노산 길이이고, 4개의 아연-배위 아미노산 잔기를 함유한다. 구조 연구에 의해서 표준(C2H2) 징크핑거 모티프가 2개의 베타 시트(일반적으로 2개의 아연-배위 시스테인 잔기를 함유하는 베타 턴에 고정됨)와 알파 헬릭스(일반적으로 2개의 아연-배위 히스티딘 잔기를 함유)를 함유한다는 것이 증명되었다.
징크핑거는 표준 C2H2 징크핑거(즉, 아연 이온이 2개의 시스테인과 2개의 히스티딘 잔기에 의해 배위된 것들)와, 예를 들어 C3H 징크핑거(아연 이온이 3개의 시스테인 잔기와 1개의 히스티딘 잔기에 의해 배위된 것들) 및 C4 징크핑거(아연 이온이 4개의 시스테인 잔기에 의해 배위된 것들)와 같은 비-표준 징크핑거를 모두 포함한다. 또한, 비-표준 징크핑거는 시스테인이나 히스티딘 이외의 다른 아미노산으로 아연-배위 잔기들 중 하나가 치환된 것들도 포함할 수 있다. 예를 들어, WO 02/057293(2002.7.25) 및 US 2003/0108880(2003.6.12)을 참조한다.
징크핑거 결합 도메인은 선택된 서열과 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Beerli et al., (2002) Nature Biotechnol . 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem . 70:313-340; Isalan et al., (2001) Nature Biotechnol . 19: 656-660; Segal et al., (2001) Curr . Opin . Biotechnol . 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr . Opin . Struct . Biol . 10:411-416를 참조한다. 징크핑거 결합 도메인은 자연 발생 징크핑거 단백질과 비교하여 새로운 결합 친화성을 가지도록 조작된다. 조작 방법은, 제한은 아니지만, 합리적 설계 및 여러 종류의 경험적 선택 방법을 포함한다. 합리적 설계는, 예를 들어 3원(또는 4원) 뉴클레오티드 서열과 개별 징크핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하며, 데이터베이스에서 각 3원 또는 4원 뉴클레오티드 서열은 특정 3원 또는 4원 서열과 결합하는 징크핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들어, 미국특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제6,610,512호; 제6,746,838호; 제6,866,997호; 제7,067,617호; 미국특허출원공개 제2002/0165356호; 제2004/0197892호; 제2007/0154989호; 제2007/0213269호; 및 국제특허출원 공개 WO 98/53059 및 WO 2003/016496을 참조한다.
파지 디스플레이, 상호작용 트랩, 하이브리드 선택 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 전형적인 선택 방법들은 미국특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 제6,242,568호; 제6,410,248호; 제6,733,970호; 제6,790,941호; 제7,029,847호 및 제7,297,491호; 그리고 미국특허출원 공개 제2007/0009948호 및 제2007/0009962호; WO 98/37186; WO 01/60970 및 GB 2,338,237에 개시된다.
징크핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증진은, 예를 들어 미국특허 제6,794,136호(2004.9.21)에서 설명되었다. 핑거 간 링커 서열과 관련하여 징크핑거를 조작하는 추가의 양태가 미국특허 제6,479,626호 및 미국특허출원 공개 제2003/ 0119023에 개시된다. 또한, Moore et al., (2001a) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:1432-1436; Moore et al., (2001b) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:1437-1441 및 WO 01/53480을 참조한다.
"DNA 메틸화의 표적화된 변형 방법"을 제목으로 하는 부문에서 인용된 모든 참고자료는 전형적인 메틸화 도메인 및 탈메틸화 도메인(야생형 및 돌연변이), 징크핑거 DNA-결합 도메인의 설계, 선택 및 조작을 위한 본 분야에서 인정된 방법, 및 메틸화 도메인 및/또는 징크핑거 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질의 구성을 개시할 목적으로 이들의 전체가 참고자료로 본원에 포함된다.
실시예
실시예 1: 골수 유착 기질세포(MASC)의 제조
인간 공여자로부터 얻은 골수 흡출물을 50ml 튜브에 12.5ml 알리쿼트씩 나누고, 각 튜브에 성장 배지(αMEM 중 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민으로 보충) 12.5ml를 가했다. 거꾸로 해서 튜브 내용물을 혼합하고, 튜브를 8분 동안 200 x g에서 원심분리했다. 위의 맑은 부분을 버리고, 아래 부분의 부피를 신선한 성장 배지로 25ml로 조정하고, 튜브를 다시 혼합하고 원심분리했다. 위의 층을 다시 버렸다. 각 튜브의 아래 부분의 부피를 다시 25ml로 조정하고, 모든 튜브의 내용물을 250ml 튜브에서 하나로 모았다. 트리판 블루 배제에 의한 세포 농도 결정 및 핵화된 세포 수의 결정 후, 세포를 플라스크 당 100 x 106 총 핵화된 세포의 밀도로 플라스크 당 성장 배지 40ml 중에서 T225 플라스크에 평판했다. 플라스크를 CO2 인큐베이터에서 3일 동안 37℃에서 인큐베이션했으며, 인큐베이션 동안 MASC가 플라스크에 부착되었다.
3일 후, 플라스크를 흔든 다음 배양 배지를 따라 내서 부착되지 않은 세포를 제거했다. 각 플라스크를 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 αMEM 40ml로 3번 세척한 다음, 미리 가온(37℃)해 둔 성장 배지 40ml를 각 플라스크에 가하고, 세포를 CO2 인큐베이터에서 30℃에서 배양했다. 인큐베이션 동안, 배지를 3-4일마다 신성한 성장 배지 40ml로 교체했으며, 콜로니 성장과 세포 밀도에 대해 세포를 모니터했다.
배양물이 25-30% 컨플루언스에 도달했을 때(일반적으로 콜로니 당 10,000- 20,000개 세포, 10-14일 이내), MASC(M0 계대)를 수거하여 더 계대했다. 한번에 10 이하의 T225 플라스크로부터 MASC를 수거했다. 플라스크로부터 배지를 제거하고, 유착 세포를 Ca/Mg가 없는 DPBS(DPBS-/-, HyClone) 20ml로 2번 헹궜다. 0.25% 트립신/EDTA(Invitrogen, 캘리포니아 칼스베드) 10ml를 각 플라스크에 가하고, 플라스크를 실온에서 약 5분 동안 인큐베이션했다. 세포가 분리되고, 콜로니가 단일 세포에 분산된 경우, 성장 배지 10ml를 가하고 부드럽게 혼합하여 트립신을 비활성화시켰다. 플라스크로부터 세포 현탁액을 꺼내어 250ml 튜브에 모았다. 이 튜브를 8분 동안 200 x g에서 원심분리했다. 상청액을 주의 깊게 제거하고, 축축한 세포 펠릿을 약 1 x 106 세포/ml의 추정된 세포 농도로 성장 배지에 재현탁했다. 생육성 세포 수를 결정하고, 세포를 성장 배지 중에서 플라스크 당 2 x 106 세포의 농도로 T225 플라스크에 평판했다(M1 계대). 2-3일마다 배지를 교환하면서 3-5일 동안, 또는 85-90% 컨플루언스까지 세포를 성장시켰다. 85-90% 컨플루언스에서 M1 계대 세포를 트립신화에 의해서 수거하고, 상기 설명된 대로 T225 플라스크당 2 x 106 세포로 재평판하여, M2 계대 배양물을 생성했다. 필요하다면 M2 배양물에는 3일마다 신선한 배지를 공급했다. M2 계대 배양물이 85-90% 컨플루언스에 도달했을 때(일반적으로 3-5일 이내), 이들을 수거하여 트랜스펙션하여 NRC를 생성하거나(하기 실시예 2 참조), 또는 추후 사용을 위해 냉동시켰다.
실시예 2: 신경 재생 세포(NRC)의 제조
NRC 또는 SB623 세포라고도 하는 신경 재생 세포를 M2 계대 배양물로부터 수거한 MASC로부터 다음과 같이 제조했다.
A. 트랜스펙션 혼합물의 제조
M2 계대 MASC를 Notch 세포내 도메인을 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙션하여 신경 재생 세포를 만들었다. 플라스미드(pN2)는 pCI-neo 백본(Promega, 위스콘신 메디슨)을 포함했고, 세포내 도메인을 암호화하는 인간 Notch-1 단백질의 아미노산 1703-2504를 암호화하는 서열이 다중 클로닝 부위에 도입되었다. 각 MASC 플라스크에 40㎍ 플라스미드를 함유하는 트랜스펙션 혼합물 5ml와 Fugene 6® 용액 0.2ml를 사용했다. 트랜스펙션 혼합물을 만들기 위해 적절한 양의 Fugene® 용액(트랜스펙션될 세포의 플라스크 수에 따라서)을 멸균 250ml 튜브에서 유리 피펫을 사용하여 αMEM에 첨가했다. 이 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션했다. 다음에, 적절한 양의 플라스미드 DNA를 Fugene®/αMEM 혼합물에 적가하고 부드럽게 혼합한 다음, 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다.
Fugene®/αMEM 혼합물에 pN2 DNA를 첨가하기 전에, 5ml를 취하여 15ml 튜브에 넣고, 거기에 pEGFP 플라스미드 40ug을 첨가했다. 이 용액을 사용하여 트랜스펙션 효능에 대한 대조군으로서 세포 플라스크 1개를 트랜스펙션했다.
B. 트랜스펙션
트랜스펙션을 위해서 M2 계대 MASC를 트립신화에 의해 수거하고(실시예 1에 설명된 대로), T225 플라스크 당 성장 배지 40ml 중에 2.5 x 106 세포의 밀도로 평판했다. 세포가 50-70% 컨플루언스에 도달했을 때(일반적으로 18-24시간 이내), 이들의 성장 배지를 플라스크 당 트랜스펙션 배지(αMEM + 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신 없음) 35mL로 교체하여 세포를 트랜스펙션을 위해 준비했다.
트랜스펙션 배지 도입 3시간 후에, 트랜스펙션 혼합물(상기 섹션 A) 5ml를 배지에 피펫으로 직접 각 T225 플라스크에 첨가했으며, 성장 표면과는 접촉하지 않도록 하고, 첨가 후에는 부드럽게 혼합했다. 대조군 T225 플라스크는 트랜스펙션 효능의 결정을 위해 40㎍ pEGFP 플라스미드로 트랜스펙션했다.
24시간 동안 트랜스펙션 배지 중에서 37℃에서 배양물을 인큐베이션한 후, 트랜스펙션 배지를 αMEM + 10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신으로 교체했다.
C. 트랜스펙션된 세포의 선택
트랜스펙션 48시간 후 배지를 플라스크 당 40ml 선택 배지(100㎍/ml G-418을 함유하는 성장 배지)로 교체하여 플라스미드 DNA와 통합된 세포를 선택했다. 신선한 선택 배지를 선택 시작 후 3일째에 제공했고, 다시 5일째에 제공했다. 7일 후에 선택 배지를 제거하고, 세포에 40ml 성장 배지를 공급했다. 다음에, 2-3일마다 신선한 성장 배지를 다시 공급하면서 배양물을 약 3주 동안 성장시켰다(18-21일 범위).
선택 시작 후 약 3주 뒤 살아있는 세포가 콜로니를 형성하기 시작했을 때 세포를 수거했다. 흡입 피펫을 사용하여 플라스크로부터 배지를 제거하고, 실온에서 Ca2+/Mg2+가 없는 DPBS 20ml를 각 플라스크에 첨가했다. 배양물 표면을 부드럽게 헹구고, 흡입하여 세척 용액을 제거한 다음, 헹굼 단계를 반복했다. 다음에, 미리 가온(37℃)해 둔 0.25% 트립신/EDTA 10ml를 각 플라스크에 가하고, 성장 표면 전체를 헹군 다음, 플라스크를 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션했다. 배양물을 현미경으로 모니터하여 세포의 완전한 분리를 확보했다. 분리가 완료되었을 때, 플라스크 당 10ml 성장 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화시켰다. 배양물 표면 전체를 혼합물로 헹구고, 10ml 피펫으로 4-5회 피펫팅하여 혼합하고, 이 현탁액을 멸균 50ml 원뿔형 원심분리 튜브로 옮겨 담았다. 몇 개의 플라스크로부터 수거한 세포를 단일 튜브에 모았다. 어떤 덩어리가 존재할 경우, 이들을 침전시키고, 현탁액을 새 튜브로 옮겨 담았다.
세포 현탁액을 실온에서 8분 동안 800rpm(200 x g)에서 원심분리했다. 흡입하여 상청액을 제거했다. 튜브를 가볍게 두드려 세포 펠릿을 흩트린 다음, 각 튜브에 Ca2+/Mg2+가 없는 DPBS 약 10ml를 첨가하고, 10ml 피펫으로 4-5회 부드럽게 피펫팅해서 세포를 재현탁하여 균일한 현탁액을 얻었다.
D. 트랜스펙션된 세포의 확장
형질전환된 선택된 세포의 현탁액에서 세포 수를 측정하고, 세포를 플라스크 당 2 x 106 세포로 T225 플라스크에 평판했다(생육성 세포의 약 30% 파종을 제공). 이 배양물을 M2P1이라고 표시한다(#1 계대). M2P1 배양물에 2-3일마다 신선한 배지를 공급했고, 세포가 90-95% 컨플루언스에 도달했을 때(일반적으로 계대 후 4-7일), 이들을 수거하고 플라스크 당 2 x 106 세포로 다시 평판하여 M2P2 계대를 생성했다. M2P2 배양물이 90-95% 컨플루언스에 도달했을 때, 이들을 수거하여 더 분석했다.
실시예 3: MASC와 NRC의 메틸화 패턴 비교
3명의 독립된 인간 공여자(D33, D39 및 D41로 표시)로부터 각각 상기 실시예 1에 설명된 대로 MASC를 제조했다. 각 MASC 제조물의 일부를 사용하여 상기 실시예 2에 설명된 대로 신경 재생 세포를 제조했다. 이들 6개 세포 제조물로부터 각각 게놈 DNA를 분리하고, 3명의 공여자 각각에 대해서 신경 재생 세포의 DNA의 메틸화 상태를 이들의 MASC 선조 세포의 DNA의 메틸화 상태와 비교했다.
메틸화 상태가 분석된 유전자를 세 가지 기준에 따라서 선택했다:
1. MASC 및 간엽 셀라인에 대한 공지된 DNA 메틸화 마커;
2. 차등 메틸화 혼성화를 사용하여 게놈-와이드 스크린에서 MASC에 대한 메틸화 마커로서 확인된 유전자; 및
3. 배아줄기세포 분화에 대해 어떤 효과를 가진다고 문헌에 보고된 유전자.
메틸화 상태의 분석에서는 상기 나열된 기준에 따라서 선택된 유전자의 선택된 부분(앰플리콘)에 대해서 중아황산염 서열화를 수행했다. 어떤 유전자는 MASC와 NRC 간의 메틸화 상태에 유의한 차이를 보이지 않았다. 이들 유전자가 표 1에 기재된다. 다수의 유전자가 MASC와 NRC 간의 메틸화 상태에 차이를 나타낸 앰플리콘을 함유했다. 이들은 표 2에 기재된다. 이들 중에서 5개 유전자는 MASC로부터 NRC를 구별하는데 있어서 유용할 수 있을 정도로 메틸화 차이가 충분히 유의했다. 이들은 PITX2(뇌하수체 호메오박스 2라고도 한다; RIEG bicoid-관련 호메오박스 전사인자), ROPN1L(로포린 1-유사 단백질; AKAP-관련 정액 단백질), DNMT3b(DNA C5-N-메틸트랜스페라제 3b), IGF2R(인슐린-유사 성장인자 2 수용체) 및 SDF4(기질세포-유래 인자 4)였다. 이들 5개 유전자에서 선택된 앰플리콘에 대한 메틸화 차이의 상세한 내용이 표 3-7에 제공된다.
표 3-7은 각 앰플리콘 내의 다수의 CpG 서열에서의 메틸화 상태를 나타낸다. "대조군 세포"는 MASC를 말하고, "표적 세포"는 NRC를 말한다. 세포는 3명의 상이한 공여자로부터 획득했고, 각 공여자로부터 MASC와 NRC를 모두 제조했다. SB101 MASCs와 SB102 NRCs는 동일한 공여자의 것이고, SB103 MASCs와 SB104 NRCs는 두 번째 공여자로부터 얻었고, SB105 MASCs와 SB106 NRCs는 세 번째 공여자로부터 얻었다. 각 표는 상이한 앰플리콘에 대해 얻어진 결과를 나타낸다. 각 표에서 칼럼 2-7은 MASC(칼럼 2-4)와 NRC(칼럼 5-7)의 앰플리콘(칼럼 1에서 클론 뒤의 번호에 의해 확인됨) 내의 특정 CpG 부위에 대한 메틸화 수준을 나타낸다. 분석된 각 CpG에서 평균 메틸화 수준은 MASC는 칼럼 8에 NRC는 칼럼 9에 제공되고, MASC와 NRC 사이의 평균 메틸화 수준의 차이는 칼럼 10에 표시된다.
칼럼 11은 분석된 각 CpG 서열에 대한 "Fisher 점수"를 나타낸다. Fisher 점수는 다음과 같이 계산된다:
Figure 112016017728400-pat00001
Fisher 기준은 특정 CpG 부위에서 메틸화 수준의 변동성을 나타낸다. 1 이상의 Fisher 점수는 유의하다고 간주된다.
이들 데이터는 PITX2, DNMT3b, IGF2R 및 SDF4 유전자에서 CpG 서열의 메틸화가 MASC에 비해서 NRC에서 증가한다는 것을 나타낸다. 반대로, RPON1L 유전자에서는 CpG 서열의 메틸화가 MASC에 비해서 NRC에서 감소된다. 유사하게 TMEM179의 메틸화도 감소된다. 특히, 앰플리콘 549의 위치 292에 있는 메틸화된 C 잔기의 탈메틸화는 이들의 MASC 선조 세포와 비교하여 NRC에서 유의한 차이를 나타낸다.
따라서, 이러한 메틸화 변화는 NRC에 대한 진단에 도움이 되며, 더욱이 다른 수단들에 의한 동일한 메틸화 변화의 달성이 NRC를 제조하는데 또한 유용하다.
Figure 112016017728400-pat00002
Figure 112016017728400-pat00003
Figure 112016017728400-pat00004
Figure 112016017728400-pat00005
Figure 112016017728400-pat00006
Figure 112016017728400-pat00007
Figure 112016017728400-pat00008
실시예 4: ROPN1L 유전자의 메틸화 상태 변화
MASC와 비교하여 NRC의 ROPN1L 유전자의 메틸화 상태에 변화를 함유하는 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 메틸화 상태가 변형된 뉴클레오티드를 정확히 확인했다. 이 분석의 결과가 표 8에 제시된다.
Figure 112016017728400-pat00009
실시예 5: DNA 메틸화가 변형된 NRC의 신경 재생 특성
실시예 3 및 4에 설명된 메틸화 변화를 가진 실시예 2에 설명된 대로 제조된 신경 재생 세포는 중추신경계와 말초신경계의 다양한 장애를 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 공동 소유의 WO 2009/023251(2009.2.19)을 참고하며, 이것의 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고자료로 포함된다.
또한, 본 명세서에서 설명되고 특성화된 세포는 추가의 처리 후에 신경 세포 및 신경 전구체 세포의 특성을 가진 세포로 전환될 수 있다. 예를 들어, 미국특허출원 공개 제2006/0166362호(2006.7.27)를 참조하며, 이러한 전형적인 처리와 이렇게 처리된 세포의 특성을 개시하는 이것의 내용이 참고로서 포함된다. 또한, 미국특허출원 공개 제2006/0216276호(2006.9.28)를 참조하며, 이렇게 처리된 세포의 추가적 특성을 개시하는 이것의 내용이 참고로서 포함된다.

Claims (10)

  1. 골수 유착 기질세포에서 PITX2, DNMT3b, IGF2R 및 SDF4 유전자의 메틸화 상태를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) Notch 세포내 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 세포를 트랜스펙션하는 단계; 및
    (b) 트랜스펙션되지 않은 세포의 상기 PITX2, DNMT3b, IGF2R 및 SDF4 유전자의 메틸화 상태와 비교하여 상기 세포에서 또는 상기 세포의 하나 이상의 자손에서 상기 PITX2, DNMT3b, IGF2R 및 SDF4 유전자의 메틸화 상태가 증가되도록 트랜스펙션된 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 골수 유착 기질세포에서 PITX2, DNMT3b, IGF2R 및 SDF4 유전자의 메틸화 상태를 증가시키는 방법.
  2. 골수 유착 기질세포에서 ROPN1L 및 TMEM179 유전자의 메틸화 상태를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) Notch 세포내 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 세포를 트랜스펙션하는 단계; 및
    (b) 트랜스펙션되지 않은 세포의 상기 ROPN1L 및 TMEM179 유전자의 메틸화 상태와 비교하여 상기 세포에서 또는 상기 세포의 하나 이상의 자손에서 상기 ROPN1L 및 TMEM179 유전자의 메틸화 상태가 감소되도록 트랜스펙션된 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 골수 유착 기질세포에서 ROPN1L 및 TMEM179 유전자의 메틸화 상태를 감소시키는 방법.
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