JP2012154955A

JP2012154955A - 分析対象物を検出するための試薬及び方法ならびに分析対象物を検出するための試薬を含む装置

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Inventors: Mark S Vreeke; マーク・エス・ブリーク; Mary Ellen Warchal-Windham; メアリー・エレン・ワーチャル−ウインダム; Christina Blaschke; クリスティーナ・ブラーシュカ; Barbara J Mikel; バーバラ・ジェイ・マイケル; Howard A Cooper; ハワード・エイ・クーパー
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Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2012-08-16
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Abstract

【課題】環境干渉因子及び放射滅菌処理に対して改善された安定性を示す、フラビンタンパク質及びキノンタンパク質ベースのバイオセンサ試薬を提供する。
【解決手段】（ａ）フラビンタンパク質、キノンタンパク質及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素、及び（ｂ）フェノチアジン、フェノキサジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される媒介物を含む、分析対象物を検出するための試薬。
【選択図】なし

Description

本発明は、分析対象物の計測のための試薬、方法及び装置に関し、より具体的には、血液中のグルコースの計測のための試薬、方法及び装置に関する。

体内のある種の分析対象物の濃度のモニタは、健康危機の早期検出を可能にし、治療手段の導入の必要性を特定する。もっとも一般的にモニタされる分析対象物の１種は、その血中濃度が糖尿病患者にとってインスリンの適切な投与量を決定する際に重要であるグルコースである。血液中のグルコース濃度をモニタするために、電気化学的バイオセンサの使用をはじめとする多様な方法が開発されている。電気化学的バイオセンサは、対象の分析対象物を伴う酵素触媒化学反応に基づく。グルコースモニタの場合、該当する化学反応は、グルコースのグルコノラクトンへの酸化である。この酸化は多様な酵素によって触媒され、そのような酵素には、結合した補酵素、たとえばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（ＮＡＤ（Ｐ））を含有するものもあれば、結合した補因子、たとえばフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）又はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含有するものもある。

バイオセンサ用途では、グルコースの酸化の過程で生成された酸化還元等価物が電極の表面に運ばれ、それによって電気信号が発生する。そして、この電気信号の大きさをグルコースの濃度と相関させる。酵素中の化学反応の場から電極の表面への酸化還元等価物の移動は、電子移動媒介物の使用によって達成される。

バイオセンサにおける電子移動媒介物の使用に伴う重要な問題は、温度や湿度のような一般的な環境条件に暴露されたときのこれらの化合物の不安定性である。結果として、グルコースバイオセンサにおける使用に適した媒介物の数は非常に限られる。

電子移動媒介物として酵素ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ＮＡＤＰＨ及びそれらの類似体との使用に適したフェノチアジン及びフェノキサジン化合物の族が報告されている（例えば、特許文献１参照）。補因子ベースの酵素、たとえばＦＡＤ−グルコースオキシダーゼ及びＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤベースの酵素に対し、より少ない費用、より高い酵素活性、安定性の増大及び解離しやすい補因子ではなく結合した補因子であることをはじめとするいくつかの利点を有する。

ＦＡＤ−グルコースオキシダーゼ及びＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼとで以前に使用されていた電子移動媒介物は、キノン、フェンジンメトスルフェート、ジクロロフェノールインドフェノール及びフェリシアン化物を含む。残念ながら、これらの化合物は、上記の環境作用因子に対して非常に感受性であり、安定性の低いバイオセンサ試薬をもたらすことがわかっている。したがって、一般的に遭遇される環境作用因子に曝露されたときでも良好な安定性を示し、フラビンタンパク質及びキノンタンパク質ベースの系で使用することができる媒介物が必要である。

上記の環境作用因子に対して安定であるバイオセンサ試薬の必要性に加えて、ランセット滅菌処理で一般に使用される放射線条件に対して安定であるバイオセンサ試薬を提供することが望ましいであろう。そのような放射線滅菌処理に対して安定である試薬は、ランセットとバイオセンサとが組み合わされる非常に簡便なユニットに組み込むことができるであろう。

米国特許第５，５２０，７８６号明細書

本発明は、環境干渉因子及び放射滅菌処理に対して改善された安定性を示す、フラビンタンパク質及びキノンタンパク質ベースのバイオセンサ試薬で使用するための電子移動媒介物に関する。

本発明の範囲は、請求の範囲によってのみ定義され、課題を解決するための手段における記述によっていかなる程度にも限定されない。まずはじめに、本明細書に記載する好ましい実施態様は、電子移動媒介物及び酵素バイオセンサの前述の安定性問題を解消することに関する。

簡潔に述べるならば、本発明の組成物態様は、（ａ）フラビンタンパク質、キノンタンパク質及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素；並びに（ｂ）フェノチアジン、フェノキサジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される媒介物とを含む、分析対象物を検出するための試薬に関する。

本発明の第一の装置態様は、（ａ）表面を有する作用電極、及び（ｂ）作用電極に結合された第二の電極を含む電気化学的センサに関する。作用電極の表面は、フラビンタンパク質、キノンタンパク質及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素、並びにフェノチアジン、フェノキサジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される媒介物、を含む試薬の溶液又は混合物でコーティングされている。

本発明の第二の装置態様は、（ａ）ランセット、及び（ｂ）ランセットに接続されたサンプリング室とを含む、分析対象物を計測するための装置に関する。サンプリング室は、（ａ）ＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ、ＦＡＤ−グルコースオキシダーゼ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素、並びに（ｂ）フェノチアジン、フェノキサジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される媒介物、を含む試薬を含む。

本発明の第一の方法態様は、分析対象物を計測するための滅菌済み装置を製造する方法であって、（ａ）本発明の装置を用意する工程、及び（ｂ）装置を電子ビーム又はγ放射線で照射する工程、を含む方法に関する。

本発明の第二の方法態様は、化学反応を受ける分析対象物を検出する方法であって、（ａ）電極面を用意する工程、（ｂ）フラビンタンパク質、キノンタンパク質及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素との化学反応を触媒する工程、（ｃ）化学反応によって酸化還元等価物を生成する工程、並びに（ｄ）フェノチアジン、フェノキサジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される媒介物を使用して酸化還元等価物を電極表面に移動させる工程、を含む方法に関する。

本明細書で論じる好ましい実施態様は、他のフラビンタンパク質及びキノンタンパク質ベースのバイオセンサ試薬に対し、バイオセンサ試薬安定性の改善、媒介物の電子移動能力の増強、最適な電極作用のために媒介物を調整する能力、媒介物の酸素感受性の低下、媒介物の熱安定性の増大、周囲湿度に対する媒介物の安定性の増大、媒介物の酸化還元電位の低下、血液中の干渉因子に対する感受性の低下及び放射線滅菌処理条件に対するバイオセンサ試薬の安定化をはじめとする一以上の利点を有することができる。

本発明の特徴を具現化する、分析対象物を計測するための装置の概略図である。本発明にしたがって使用するための統合型ランセット／バイオセンサ装置の斜視図である。増大するレベルの放射線に曝露された３種のバイオセンサ試薬処方に関するバックグラウンド電流のグラフである。グルコースに曝露されたときの放射線滅菌バイオセンサ試薬の電流レスポンスのグラフである。ＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ／フェノチアジンバイオセンサに関する増大する時間間隔における電流対グルコース濃度のグラフである。〔ＦＡＤ〕−グルコースオキシダーゼ／フェノチアジンバイオセンサに関する電流対グルコース濃度のグラフである。熱応力及び湿度応力にさらされたＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ／フェノチアジンバイオセンサ試薬に関する電流対グルコース濃度のグラフである。異なるレベルの放射線に曝露されたある種のＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ／フェノチアジンバイオセンサ処方に関する電流対グルコース濃度のグラフである。異なるレベルの放射線に曝露されたもう一種のＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ／フェノチアジンバイオセンサ処方に関する電流対グルコース濃度のグラフである。異なるレベルの放射線に曝露された別の種のＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ／フェノチアジンバイオセンサ処方に関する電流対グルコース濃度のグラフである。異なるレベルの放射線に曝露されたさらに別の種のＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ／フェノチアジンバイオセンサ処方に関する電流対グルコース濃度のグラフである。異なるレベルの放射線に曝露されたさらに別の種のＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ／フェノチアジンバイオセンサ処方に関する電流対グルコース濃度のグラフである。

本明細書を通じて、以下の定義を理解しなければならない。「分析対象物」とは、対象の濃度を有する一又は複数の種をいう。「フラビンタンパク質」とは、フラビン補因子を含有する酵素をいう。「キノンタンパク質」とは、ＰＱＱ又は類似の補因子を含有する酵素をいう。「酸化還元等価物」とは、分析対象物を伴う電気化学的反応で生成される一又は複数の帯電種（たとえば電子）をいう。「電子ビーム照射」とは、高密度の電子流に曝露する処理をいう。「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「環式」、「複素環式」、「ハロ」、「ハロアルキル」、「カルボキシ」、「カルボキシアルキル」、「アルコキシカルボニル」、「アリールオキシカルボニル」、「芳香族ケト」、「脂肪族ケト」、「アルコキシ」、「アリールオキシ」、「ニトロ」、「ジアルキルアミノ」、「アミノアルキル」、「スルホ」、「ジヒドロキシホウ素」などは、分岐鎖状であっても非分岐鎖状であってもよく、そのものが一以上の置換基で置換されていてもよい、当該技術で周知の置換基をいう。「バイオセンサ試薬」とは、分析対象物の反応を触媒する酵素、並びにフェノチアジン及び／又はフェノキサジン媒介物との組み合わせをいう。「生負荷（bioburden）」とは、照射の直前に測定された、製品上で生存しうる微生物の集団をいう。

分析対象物を検出するための本発明のバイオセンサ試薬は、（１）フラビンタンパク質、キノンタンパク質及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素、並びに（２）フェノチアジン、フェノキサジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される媒介物、を含む。

本発明にしたがってモニタされる分析対象物の種類は、その分析対象物が、フラビンタンパク質、キノンタンパク質及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素によって触媒される化学反応を受ける限り、限定されない。好ましい分析対象物は、グルコース、乳酸塩、Ｄ−アミノ酸、アスコルビン酸塩、アルコール、コレステロール、コリン及びアセチルコリンを含むが、これらに限定されない。

本発明のフラビンタンパク質は、ＦＡＤ−グルコースオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．４）、フラビン−ヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．５）及びＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．９９．１０）を含む。これらのフラビンタンパク質に関する情報については、Adriaan Joseph Jan Olsthoornの「Structural and Mechanistic Aspects of Soluble Quinoprotein Glucose Dehydrogenase from Acinetobacter calcoaceticus」（博士論文、オランダDelft University of Technology １９９９）を参照されたい。本発明にしたがって使用するためのさらなるオキシダーゼ酵素は、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ（たとえばメタノールオキシダーゼ）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ及びそれらのＦＡＤ誘導体を含むが、これらに限定されない。本発明にしたがって使用するのに好ましいフラビンタンパク質は、ＦＡＤ−グルコースオキシダーゼである。

本発明のキノンタンパク質は、膜結合可溶性ＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．９９．１７）を含むが、これに限定されない。ＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼに関する情報は、上記で引用したOlsthoornの参考文献に見ることができる。本発明にしたがって使用するためのさらなるキノンタンパク質酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、メチルアミンデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（たとえばメタノールデヒドロゲナーゼ）及びそれらのＰＱＱ誘導体を含むが、これらに限定されない。本発明にしたがって使用するのに好ましいキノンタンパク質は、ＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼである。

本発明の媒介物は、式

を有するフェノチアジン及び式

を有するフェノキサジンを含む。式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸及びＲ⁹は、同一又は異なり、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシホウ素及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

本発明の媒介物は、Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆の単一電子移動運搬能力とは対照的に、二つの酸化還元等価物を運ぶ能力を有し、したがって、一般に２個の電子の移動を伴う、ＦＡＤ及びキノンタンパク質酸化／還元法における使用に十分に適している。そのうえ、本発明の媒介物の電位は、芳香環上の置換基を変えることにより、特定のサンプルマトリックスに最適な電位（すなわち、干渉因子からの信号への影響が最小限になる電位）に調整することができる。電子供与性置換基（たとえばアルキル、アルコキシ、アミン、ヒドロキシなど）は、酸化還元電位を低下させる結果を招き、電子求引性置換基（たとえばカルボン酸、エステル、アルデヒド、ケトン、ニトリル、ニトロ、スルホン酸、トリフルオロメチルなど）は、酸化還元電位を上昇させる結果を招く。血液又は血漿のサンプルの場合、理想的な電位は通常、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準に対して約−２００〜約１００mVの範囲にある。

芳香環上の置換基は、媒介物の酸化還元電位を調整するその用途に加えて、媒介物の溶解度を高めるために使用することもできる。たとえば、水素結合の能力を有する置換基の導入は、媒介物を、そのような置換基を欠く媒介物よりも水溶性にすると予想することができる。加えて、これらの置換基は、媒介物を支持体（たとえば電極表面又は電極表面に適用するのに適した化学的マトリックス、たとえばポリマー主鎖）に固定化するための官能基として働くことができる。

好ましくは、本発明のバイオセンサ試薬で使用される媒介物は、３−（４′−クロロフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ジエチルアミノフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−トリフルオロメチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ニトロフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−メトキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、７−アセチル−３−（４′−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、７−トリフルオロメチル−３−（４′−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ω−カルボキシ−ｎ−ブチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−アミノメチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−（２″−（５″−（ｐ−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾイル）フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−β−アミノエチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、６−（４′−エチルフェニル）アミノ−３−（４′−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、６−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニル）アミノ−３−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンボロン酸、（３−（３′，５′−ジカルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−カルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（３′，５′−ジカルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン、３−（３′，５′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン酸及び３−（３−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸を含む。

より好ましくは、本発明にしたがって使用される媒介物は、

及び

からなる群から選択される。

フェリシアン化物に比べて、フェノチアジン媒介物、特に媒介物Ｉは、酸素分解に対して感受性が低く、より熱安定性であり、周囲湿度に対してより安定性である。加えて、媒介物Ｉは、フェリシアン化物よりも低い酸化還元電位で作用する。たとえば、媒介物ＩのＥ₀は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して約０mVであるが、フェリシアン化物のＥ₀は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して約２５０mVである。フェノチアジン媒介物のより低い酸化還元電位は、電気化学的干渉の量が最小限になる、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して０mV付近の領域がある点で有利である。したがって、これらの媒介物を使用することにより、血液中の化学的干渉因子からの影響を最小限にすることができる。

本発明の特徴を具現化する試薬を、米国特許第５，１２０，４２０号及び第５，７９８，０３１号明細書に記載の装置をはじめとする多様なバイオセンサ装置に組み込むことができる。これら両明細書の内容全体を引用例として本明細書に含めるが、本出願と矛盾する開示又は定義がある場合、本明細書の開示又は定義が優先するものとする。

図面を参照すると、図１は、本発明の典型的な電気化学的センサを示す。電気化学的センサ２は、電極パターン（６及び８）を上に印刷された（通常はスクリーン印刷技術によって）絶縁ベース４と、本発明の特徴を具現化する試薬を含有する試薬層１０とで構成されている。二つの電極印刷部６、８が、電気化学的測定に必要な作用電極及び参照電極を提供する。以下さらに詳細に記載するように、ランセット要素１２を電気化学的センサに組み込む（たとえば層１と層２との間に挿入する）ことができる。図１に示す３つの層は、材料の実体に依存して、接着剤（たとえば感圧性接着剤、ホットメルトなど）又は音波溶接によって接合することができる。

ＰＱＱ−グルコースヒドロゲナーゼ及び特定のフェノチアジン媒介物を含むバイオセンサ試薬が放射線滅菌に対して高い安定性を示すことがわかった。本発明の放射線安定性バイオセンサ試薬の好ましい用途は、統合型ランセット／バイオセンサ装置の開発である。このような統合型装置の例が図２に示され、米国特許第５，８０１，０５７号明細書に記載されている。この明細書の内容全体を引用例として本明細書に含めるが、本出願と矛盾する開示又は定義がある場合、本明細書の開示又は定義が優先するものとする。

図２に示すように、統合型ランセット／バイオセンサ装置１４は、サンプリング室１８に接続された、細く穿孔された針１６を有する。サンプリング室１８は、少なくとも一つの採光窓２０と、サンプリング室１８が血液又は他の流体で満ちるとき空気を排気することができる通気口２２とを有する。好ましくは、サンプリング室１８は、ＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ並びにフェノチアジン及び／又はフェノキサジン媒介物を含むバイオセンサ試薬を含む。好ましくは、媒介物はフェノチアジンである。より好ましくは、媒介物は、上記媒介物Ｉ又は媒介物IIによって表される構造を有する。ひとたびサンプリング室１８がバイオセンサ試薬で充填されると、装置１４全体を放射線滅菌で処理することができる。好ましくは、滅菌法は電子ビーム照射又はγ線照射を含む。

Association for the Advancement of Medical Instrumentation文書ＡＮＳＩ／ＡＡＭＩ／ＩＳＯ１１１３７−１９９４に記されているように、皮膚を穿刺し、血液と接触する製品は、滅菌後に製品上に微生物が生存する確率１００万分の１に相当する１０^-6の無菌保証レベル（ＳＡＬ）を有しなければならない。１０^-6ＳＡＬを達成するために必要な滅菌線量は、サンプルの生負荷に依存する。たとえば、１，０２１の生負荷を有するサンプルは、１０^-6ＳＡＬを達成するために２４．９kGyの滅菌線量を要する。

以下に記す例では、滅菌方法として電子ビーム照射を使用した。電子ビームに付されたバイオセンサ試薬は電子からエネルギーを吸収する。物質の単位質量あたり吸収されるエネルギーが吸収線量と呼ばれ、このエネルギーの吸収、すなわち線量の印加こそが、微生物の生殖細胞及びＤＮＡ鎖を破壊し、それにより、製品を無菌にするものである。バイオセンサ試薬の生負荷が未知であったため、２５、５０及び１００kGyの電子ビーム線量を使用した。

図３は、増大するレベルの放射線に曝露された３種のバイオセンサ試薬処方、すなわち（１）ＮＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼと媒介物Ｉ、（２）ＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼとフェリシアン化物、及び（３）ＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼと媒介物Ｉに関して観察されたバックグラウンド電流のグラフを示す。ＰＱＱ処方は、照射に対してきわめて良好な耐性を示した。対照的に、ＮＡＤ処方は、滅菌条件に対して不十分な耐性を示し、グルコース信号の有意量を構成するバックグラウンド信号を生じさせた。処方（２）は放射線処理に対して良好な耐性を示したが、抽出された酵素の活性は、処方（３）から抽出された酵素の対応する活性よりも低かった。図４は、これらの放射線滅菌済みセンサを６００mg/dLグルコースに曝露した場合の電流レスポンスのグラフを示す。

本発明の特徴を具現化する装置を製造する方法及び当該装置を分析対象物のモニタに使用する方法は、前記記載と以下の代表的手順とを合わせて考慮すると、当業者には十分に明らかになる。本明細書に例示する好ましい実施態様の多くの変形が当業者には自明であり、請求の範囲及びその等価の範囲に該当することが理解されよう。

たとえば、本発明の電気化学的センサに使用される作用電極は種々異なることができ、その場合、適切な電極は、炭素電極、白金電極、パラジウム電極、金電極などを含むが、これらに限定されない。同様に、参照電極もまた種々異なることができ、その場合、適切な電極は、銀−塩化銀電極、カロメル電極、飽和カロメル電極などを含むが、これらに限定されない。あるいはまた、非水性電気化学的実験で一般に使用されるタイプの準参照電極（すなわち、その電位が参照される特定の酸化還元種を有しない電極）、たとえば大面積白金電極を本発明にしたがって使用することもできる。同様に、本発明にしたがって使用されるすべての電極の表面積は異なる。好ましくは、作用電極は、約０．６mm×１．２mmの面積を有する。

さらには、使用される緩衝溶液の組成及びｐＨ並びにバイオセンサ試薬の成分の酵素活性及び濃度は大きく異なる。適切な緩衝溶液は、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、２−（〔２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル〕アミノ）エタンスルホン酸、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸））、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、ＡＣＥＳ（Ｎ−（カルバモイルメチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）及びダルベッコ緩衝液（０．００８Ｍリン酸ナトリウム、０．００２Ｍリン酸カリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ塩化カリウム、ｐＨ７．４）を含むが、これらに限定されない。

本発明の特徴を具現化する試薬及び装置を製造する方法並びに当該試薬及び装置を分析対象物のモニタに使用する方法は、先の記載と以下の代表的手順とを合わせて考慮すると、当業者には十分に明らかになる。

以下に記載する例は本発明のバイオセンサ試薬のインビトロ適用に関するが、フェノキサジン及び／又はフェノチアジン媒介物を（たとえば芳香環の一以上の置換基における化学反応により）化学的に固定化し、固定化した媒介物を、患者に皮下移植することができる装置に組み込むことにより、当該試薬をインビボ分析対象物モニタに適合させることもできることが考えられる。

バイオセンサの製造及びグルコース線量レスポンス
液状試薬を、１００mMリン酸ナトリウムｐＨ７．４中、２０単位／μlピロロキノリンキノン−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ−ＧＤＨ）及び２４mM媒介物Ｉになるように調製した。試薬の第一の成分を、媒介物を１００mMホスフェートｐＨ７．４に溶解し、ｐＨを調節して７．４に戻し、溶液をWhatman０．４５ミクロンＰＴＦＥシリンジフィルタに通ってろ過することによって製造した。凍結乾燥させたＰＱＱ−ＧＤＨ（Toyobo製品番号GLD-321）を２０単位／μlの活性まで加えることにより、試薬を完成させた。

この薬品処方を、Conductive Technologies社による３パススクリーン印刷法を使用して製造しておいた電極に被着させた。この工程で、まず銀／塩化銀（DuPont 5870インク）リード及び参照電極をポリカーボネートベース材料上に印刷した。DuPont 7102Tカーボングラファイト作用電極の第二のパスをこの上に印刷した。Norcote RDMSK4954-A2誘電体の最後のパスによって作用電極面積を０．００１１３cm²になるよう画定した。

Asymtek Automove（登録商標）402ディスペンシングシステムの使用によって薬品を作用電極に被着させた。このシステムは、試薬で満たした１．５mlのEppendorfバイアルに６２mlのステンレススチールピンを浸漬することによって転写を実施するようにプログラムされていた。ポリカーボネートふた材料をセンサにラミネートして、試験溶液約３μlを保持することができる毛管区域を作用電極及び参照電極上に形成した。サンプル量を画定する毛管区域は、はじめに、コイニング又はスタンピング法によってポリカーボネートふた材料に形成しておいた。

図５に示すように、０〜６００mg/dLの濃度範囲のグルコースを含有する緩衝した（１００mMホスフェート、１００mM塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）サンプルを用いて、グルコース線量−レスポンス曲線を生成することによって薬品の反応性を分析した。１００nAにセットされた起動レベルで１５０mV電位を印加するようにプログラムされたポテンシオスタットを使用して、５、１０、１５及び２０秒で電流を記録するようにプログラムされたタイミングで、各グルコース濃度で発生した電流を計測した。起動レベルとは、超えられると計時及び記録が開始されるしきいレベルをいう。

２０単位グルコースオキシダーゼ／センサ及び６mM媒介物Ｉで処方されたセンサを上記のように電極センサに被着させた。図６に示す線量レスポンスプロットを得た。

電気化学的バイオセンサの製造及び熱／湿度安定性
スクリーン印刷法を使用して電気化学的バイオセンサを構築した。センサは、炭素作用電極及び銀／塩化銀参照電極で構成した。１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に１２mM媒介物Ｉを含有する、酵素ＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ（１０単位／μl）の溶液（１５０〜８００nl）を作用電極の表面に被着させ、室温で５分間乾したのち、乾燥させた。電極を、センサへのサンプル溶液の接種を可能にする小さな毛管間隙を有するフォーマットとして組み立てた。

次の試験では、試験前にセンサを以下の環境条件、すなわち１）５０℃で２、４及び８週間、及び２）相対湿度４０％の室温に付した。センサを１５０mVの電位でＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して平衡させ、得られた電流を計測した。この媒介物／酵素の組み合わせは、図７に示すように、熱応力及び湿度応力に対して非常に安定であった。

バイオセンサの滅菌及び放射線安定性データ
５種のバイオセンサ試薬処方（表１）を調製し、Titan Scan Technologies（カリフォルニア州サンディエゴ）でSureBeam（登録商標）滅菌技術を使用して電子ビーム照射に付した。処方Ｉは２５kGy、５０kGy及び１００kGyで照射したが、処方II〜Ｖそれぞれは２５kGyのみで照射した。表１の右寄り二列の見出し中、ＣＭＣはカルボキシメチルセルロースを意味し、ＰＥＯはポリエチレンオキシドを意味する。

図８〜１２は、照射の前後の５種の処方それぞれのグルコース線量レスポンス曲線を示す。照射前のグルコースレスポンスと照射後のグルコースレスポンスとがほとんどオーバーラップしていることによって明らかに示されるように、５種の処方の安定性は高かった。

表２は、照射の前後で５種の処方に対して実施された酵素検定の結果を示す。すべての場合で照射後でも酵素活性は高いままであった。

前記詳細な説明及び実施例は、説明及び例示のために提供したものであり、請求の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書で例示する好ましい実施態様の多くの変形が当業者に自明であり、請求の範囲及びその等価の範囲に該当する。

Claims

表面を有する第一の電極、及び前記第一の電極に結合された第二の電極を含み、
前記第一の電極の表面が、
フラビンタンパク質、キノンタンパク質及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酵素、並びに
二つの酸化還元等価物を運ぶ能力を有する一以上の媒介物
を含む試薬を含む、電気化学的センサ。
一以上の媒介物が、下記式：

及びそれらの組み合わせ
（式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸及びＲ⁹は、同一又は異なり、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシホウ素及びそれらの組み合わせからなる群から選択される）
から選択される、請求項１記載の電気化学的センサ。
前記媒介物が、下記：

（式中、Ｒ¹及びＲ⁴が、スルホである）である、請求項２記載の電気化学的センサ。
前記媒介物が、下記：

（式中、Ｒ²及びＲ⁴が、カルボキシである）である、請求項２記載の電気化学的センサ。
一以上の媒介物が、３−（４′−クロロフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ジエチルアミノフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−トリフルオロメチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ニトロフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−メトキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、７−アセチル−３−（４′−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、７−トリフルオロメチル−３−（４′−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ω−カルボキシ−ｎ−ブチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−アミノメチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−（２″−（５″−（ｐ−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾイル）フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−β−アミノエチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、６−（４′−エチルフェニル）アミノ−３−（４′−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、６−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニル）アミノ−３−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンボロン酸、（３−（３′，５′−ジカルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−カルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（３′，５′−ジカルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン、３−（３′，５′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン酸、３−（３−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載の電気化学的センサ。
前記フラビンタンパク質が、ＦＡＤ−グルコースオキシダーゼ、フラビン−ヘキソースオキシダーゼ、ＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ、［ＦＡＤ］−乳酸オキシダーゼ、［ＦＡＤ］−コレステロールオキシダーゼ、［ＦＡＤ］−アルコールオキシダーゼ、［ＦＡＤ］−Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、［ＦＡＤ］−コリンオキシダーゼ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載の電気化学的センサ。
前記酵素が、ＦＡＤ−グルコースオキシダーゼ、ＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載の電気化学的センサ。
カルボキシメチルセルロース、ポリエチレンオキシド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリマーをさらに含む、請求項１記載の電気化学的センサ。
前記媒介物が

を含む、請求項１記載の電気化学的センサ。
前記第二の電極が銀／塩化銀参照電極である、請求項１記載の電気化学的センサ。