JP2012108163A - 石綿検出方法、石綿検出剤および石綿検出キット、並びに、石綿が病因または増悪因子となる疾病を予防または治療する薬剤候補物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】石綿と特異的に結合し得るタンパク質を見出し、当該タンパク質または当該タンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を試料中の石綿と結合させ、石綿と結合した当該タンパク質または融合タンパク質を検出することにより、試料中の石綿を迅速・簡便に検出できる。また、石綿と特異的に結合し得るタンパク質として見出されたアクチンと石綿との結合を阻害する物質は、石綿が病因または増悪因子となる疾病を予防または治療する薬剤の候補物質となる。
【選択図】図6
Description
本発明に用いられるタンパク質は、少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質であればよい。本明細書においては、「少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質」を「石綿に結合するタンパク質」と称する。また、当該タンパク質の由来は特に限定されず、細菌、酵母、植物、動物など、いずれの生物に由来するタンパク質であってもよい。
本発明に係る石綿検出方法の一実施形態は、少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質(石綿結合タンパク質)を、試料中の石綿と接触させる工程;および石綿に結合した上記タンパク質(石綿結合タンパク質)を検出する工程を包含するものであればよい。なお、上記以外の工程が設けられていてもよく、上記以外の工程の内容は限定されない。
本発明に係る石綿検出剤は、少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質(石綿結合タンパク質)、または、少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質(石綿結合タンパク質)とレポータータンパク質との融合タンパク質を含むものであればよい。
本発明に係るスクリーニング方法は、石綿が病因または増悪因子となる疾病を予防または治療する薬剤の候補物質をスクリーニングする方法であって、少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で被検物質と石綿とアクチンとを接触させる工程;および上記溶液中の石綿とアクチンとの結合レベルを測定する工程を包含するものであればよい。なお、上記以外の工程が設けられていてもよく、上記以外の工程の内容は限定されない。
(1)使用菌株
大腸菌(Escherichia coli)K12(ATCC 700926)、Pseudomonas putida KT2440および Corynebacterium glutamicum ATCC13032の3種類を用いた。
2×YT培地で37℃一晩培養したものを新しい2×YT培地に1%植菌し、37℃で4時間培養した。培養後の菌体を遠心分離により集菌した後、50mM Tris-HCl pH 7.5、10%スクロースで縣濁した。凍結融解を行い、250μg/mlになるようにリゾチームを加え、30分氷上においた。37℃で5分間反応後、再び氷上に10分おき、粘性がなくなるまで超音波破砕を行った。さらに20,000×g、15分間遠心分離した上清を細胞破砕液として用いた。
得られた細胞破砕液のタンパク質濃度が1mg/mlになるように25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20, 0.1M NaClで希釈した。調製した溶液1mlに5mgのクリソタイル(白石綿、(社)日本作業環境測定協会)を加え、4℃で30分間転倒混和した。遠心分離(10,000×g、3分間)後、上清を捨て、沈殿に25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20, 0.1M NaCl を1ml加え、ボルテックスで溶解した。この洗浄操作を計3回行った。洗浄後の沈殿にSDSサンプルバッファー(1%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、75mM Tris-HCl pH7.5, 10%グリセロール, 1%ベータメルカプトエタノール)50μlを加え、100℃で5分間インキュベートした。抽出したタンパク質は一般的なポリアクリルアミド電気泳動法(Laemmli法)により分離した。
取得タンパク質をポリアクリルアミド電気泳動法により分離後、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜にトランスファーした。膜をクマシーブリリアントブルーで染色した後、目的タンパク質のバンドを切り出した。膜片を100%アセトニトリルに浸した後、100mM酢酸、0.5%ポリビニルピロリドンK-30、1%メチオニン溶液100μl中で37℃30分間反応させた。超純水1mlで10回洗浄後、さらに50mM重炭酸アンモニウム、5%アセトニトリル100μlで3回洗浄した。0.5μg/mlのトリプシン溶液(50mM重炭酸アンモニウム、5%アセトニトリル)20μl中で37℃24時間消化した。トリプシン消化物の脱塩にはZipTipC18(ミリポア)を使用した。方法は同社のプロトコルに従った。脱塩したサンプルをマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析計 (BiflexIV:ブルカーダルトニクス)により分析し、ペプチドマスフィンガープリント解析によりタンパク質およびそれをコードする遺伝子を同定した。同定したタンパク質のアミノ酸配列はデータベース(DDBJ)から取得した。また、同定したタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列もデータベース(DDBJ)から取得した。
まず、AP発現ベクターの構築を行った。既知のphoA遺伝子配列(配列番号20)より2種のオリゴヌクレオチドプライマーP1:GTTAAGCTTCGGACACCAGAAATGCCTGT(配列番号31)およびP2:GTTGCGGCCGCTTTCAGCCCCAGAGCGGCT(配列番号32)を作製し、大腸菌K12の染色体を鋳型としてPCRを行った。反応はKOD Plus DNAポリメラーゼ(TOYOBO)を用い、同社のプロトコルに従った。PCR産物および発現ベクターpET21-b(Novagen)を制限酵素HindIIIおよびNotIにより37℃2時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのDNA断片をLigation High(TOYOBO)により16℃2時間ライゲーションし、大腸菌MV1184株に形質転換した。得られたコロニーから目的のDNA断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pET APとした。
pET APまたはpET DksA-APで形質転換したRosetta BL21(DE3) pLysS (Novagen)を2×YT培地で37℃一晩培養し、新しい2×YT培地に1%植菌した。OD600が0.6になるまで28℃で培養後、終濃度が0.2mMになるようにIPTGを添加してさらに4時間培養を行った。ペレットに500μlの緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20)を加えて縣濁し、超音波により破砕を行った。破砕後、20,000×gで15分間遠心した上清を、それぞれAPタンパク質を含む細胞破砕液(以下「AP細胞破砕液」と記す)およびDksA-AP融合タンパク質を含む細胞破砕液(以下「DksA-AP細胞破砕液」と記す)とした。
50μlのAP細胞破砕液またはDksA-AP細胞破砕液と950μlの緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20)を混合後、石綿(クリソタイル、(社)日本作業環境測定協会)5mgを加えて室温5分間放置して結合させた。遠心操作(10,000×g、3分間)で石綿を沈殿させ、各濃度(0mM、100mMまたは300mM)のNaClを含む緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20)で懸濁して再度遠心操作で石綿を回収し、結合しているタンパク質を電気泳動で確かめた。
50μlのAP細胞破砕液、またはDksA-AP細胞破砕液、または組み換えタンパク質を発現させていない大腸菌由来の細胞破砕液と、950μlの緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20)とを混合後、石綿(クリソタイル)5mgを加えて室温5分間放置して結合させた。また、石綿を加えないもの、いずれの細胞破砕液も加えないものをコントロールとした。遠心操作(10,000×g、3分間)で石綿を沈殿させ、NaClを含まない緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20)で懸濁して再度遠心操作で石綿を回収した。
10μlのDksA-AP細胞破砕液と90μlの緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20)を混合後、石綿(クリソタイル、(社)日本作業環境測定協会)を0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5または1mg加えて室温5分間放置して結合させた。遠心操作(10,000×g、3分間)で石綿を沈殿させ、NaClを含有しない緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20)で懸濁して再度遠心操作で石綿を回収した。
10μlのDksA-AP細胞破砕液と990μlの緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20)を混合後、石綿(クリソタイル、(社)日本作業環境測定協会)を0、5または50μg加えて4℃、15分間結合させた。結合後の溶液を1mlのシリンジを用いてSWINNEXフィルターホルダー(MILLIPORE)に装着したDURAPORE MEMBRANE FILTERS(直径13mm、孔径0.45mm:MILLIPORE)に通過させた。1mlの上記緩衝液で3回洗浄を行った後、フィルターの表面を50μlの発色試薬(100mM Tris-HCl pH9.5, 100mM NaCl, 50mM MgCl2, 0.4mM BCIP, 0.3mM NBT)で覆い、37℃で10分間反応させた。反応後のフィルターは乾燥させ、スキャナーにより取り込んだ。
(1)使用マウス肺
マウス肺はフナコシ株式会社から購入した(商品コード:J110、マウスの系統:C57BL/6J)。
マウス肺(170mg)にM-PER(登録商標、PIERCE社製、哺乳類タンパク質抽出試薬)1.7mlおよびプロテアーゼ阻害剤0.017ml(シグマ社製)を添加し、超音波処理(7分30秒)により細胞を破砕した。続いて遠心分離(10,000×g、15分)して上清を採取し、さらに超遠心分離(100,000×g、20分)した上清を試料とした。
得られた試料(タンパク質濃度:4mg/ml)0.15mlに緩衝液(25mM Tris-HCl pH8.0, 0.5% Tween20, 0.1M NaCl)0.45mlを加えて全量を0.6ml(タンパク質濃度:1mg/ml)とした。この溶液に5mgのクリソタイル(白石綿、(社)日本作業環境測定協会)を加え、4℃で30分間転倒混和した後、遠心分離(20,000×g、10分)し、石綿(クリソタイル)を沈澱として回収した。沈殿に0.5Mまたは1MのNaClを含む緩衝液(25mM Tris-HCl pH8.0, 0.5% Tween20)を1ml加え、ボルテックスで溶解した。この洗浄操作を計3回行った。洗浄後の沈殿にSDSサンプルバッファー(1%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、75mM Tris-HCl pH7.5, 10%グリセロール, 1%ベータメルカプトエタノール)50μl加え、100℃で5分間インキュベートした。抽出したタンパク質は一般的なポリアクリルアミド電気泳動法(Laemmli法)により分離した。
実施例1と同様の方法で、当該石綿結合タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、当該石綿結合タンパク質は配列番号21に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質(ACCESSION:NM_009609)および配列番号23に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質(ACCESSION:NM_007393)の少なくとも1種、すなわちアクチンであることが明らかとなった。なお、配列番号21に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は配列番号22に示される塩基配列からなる遺伝子(actg1)にコードされるタンパク質であり、配列番号23に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は配列番号24に示される塩基配列からなる遺伝子(actb)にコードされるタンパク質である。
(1)使用菌株
大腸菌(Echerichia coli)K12(ATCC 700926)、高度好熱性細菌(Thermus thermophilus)HB27(ATCC BAA-163)の2種類を用いた。
実施例1と同様の方法で細胞破砕液を調製した。
得られた細胞破砕液のタンパク質濃度が1mg/mlになるように25mM Tris-HCl pH8.0, 0.5% Tween20, 1M NaClで希釈した。調製した溶液1mLに5mgのアモサイト(青石綿、(社)日本作業環境測定協会)またはクロシドライト(茶石綿、(社)日本作業環境測定協会)をそれぞれ加え、4℃で30分間転倒混和した。遠心分離(10,000×g、3分間)後、上清を捨て、沈殿に25mM Tris-HCl pH8.0, 0.5% Tween20, 1M NaCl を1ml加え、ボルテックスで溶解した。この洗浄操作を計3回行った。洗浄後の沈殿にSDSサンプルバッファー(1%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、75mM Tris-HCl pH7.5, 10%グリセロール, 1%ベータメルカプトエタノール)50μlを加え、100℃で5分間インキュベートした。抽出したタンパク質は一般的なポリアクリルアミド電気泳動法(Laemmli法)により分離した。
実施例1と同様の方法で、上記3種類の石綿(クロシドライト/アモサイト)結合タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
配列番号26に示される塩基配列に基づいて、2種のオリゴヌクレオチドプライマーP5:GGAATTCCATATGGCTGCGAAGAAGACGGT(配列番号35)およびP6:GTTGGATCCCCCTTCTTGACCTTATCCTTC(配列番号36)を作製し、高度好熱性細菌HB27の染色体を鋳型としてPCRを行った。反応はKOD Plus DNAポリメラーゼ(TOYOBO)を用い、同社のプロトコルに従った。PCR産物および実施例1で作成した発現ベクターpET APを制限酵素NdeIおよびBamHIにより37℃2時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのDNA断片をLigation High(TOYOBO)により16℃2時間ライゲーションし、大腸菌MV1184株に形質転換した。得られたコロニーから目的のDNA断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pET TTC0984-APとした。
pET TTC0984-APで形質転換したRosetta gamiB pLysS (Novagen)を2×YT培地で37℃一晩培養し、新しい2×YT培地に1%植菌した。OD600が0.6になるまで28℃で培養後、終濃度が0.2mMになるようにIPTGを添加してさらに16時間培養を行った。集菌後、上記実施例1(2)に記載の方法で細胞破砕液を調製し、当該細胞破砕液をHisTrap HP 1ml (アマシャムバイオサイエンス)カラムにより精製を行った。10mMのイミダゾールを含む緩衝液A (50mM リン酸ナトリウム pH7.4, 20%グリセロール)で洗浄後、0.5Mイミダゾールを含む緩衝液Aで溶出した。精製したタンパク質について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製度を確認したところ、95%以上であった。
0、0.1、1または10μgアモサイト((社)日本作業環境測定協会)を含む超純水1mLを吸引ろ過装置(フィルターホルダー、吸引瓶、ポンプで構成)を用いてDURAPORE MEMBRANE FILTERS(直径13mm、孔径0.45mm:MILLIPORE)に通過させた。1mlの上記緩衝液で1回洗浄を行った後、フィルターの表面を5μgの精製TTC0984-APタンパク質を含む上記緩衝液50μlで覆い、室温で1分間反応させた。さらに1mlの上記緩衝液で3回洗浄を行った後、フィルターの表面を50μlの発色試薬(BCIP/NBT PLUS:Moss,INC.)で覆い、37℃で10分間反応させた。反応後のフィルターは乾燥させ、スキャナーにより取り込んだ。
(1)試料および試料の調製
実際に使用されている3種類の建材を試料とした。図12に試料とした3種類の建材を示した。これら3種類の建材は、石綿を含有していないことがわかっている。
操作は以下の(a)〜(f)の手順で行った。
(a)試料の前洗浄
上記(1)で調製した試料が入ったマイクロチューブに緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20)1mlを加えて混和した。続いて、遠心操作(10,000×g、3分間)により試料を沈殿させ、緩衝液を除去した。
(b)ブロッキング
ブロッキング液((a)の緩衝液に0.5%カゼインを添加したもの)1mlを加え、ミキサー(RVM-2000,IWAKI社製)を用いて5分間混和した。続いて、遠心操作(10,000×g、3分間)により試料を沈殿させ、ブロッキング液を除去した。
(c)酵素の結合
タンパク質濃度が0.5mg/mlのDksA-AP細胞破砕液50μlを加え、ミキサー(T360,TOMY社製)を用いて5分間混和した。続いて、遠心操作(10,000×g、3分間)により試料を沈殿させ、余分な酵素溶液を除去した。
(d)洗浄
(a)の緩衝液1mlを加えて混和し、遠心操作(10,000×g、3分間)により試料を沈殿させ、緩衝液を除去した。この操作を計3回行った。
(e)基質添加
発色液(BCIP/NBT PLUS:Moss,INC.)50μlを加え、混和した。
(f)色調判定
基質添加から一定の時間後に色の変化を目視観察し、石綿の有無を判定した。
結果を図13に示した。図13から明らかなように、クリソタイルを1%添加した3種類の試料において、発色反応時間10分で十分に反応液の色調変化を目視判定可能であることが確認された。なお、反応時間を30分としても判定に何ら影響を及ぼすことはなく、色調変化がより明確になった。したがって、反応時間を10分より長くしてもよいことは明らかである。
ロックウールは石綿と同様の鉱物繊維であるが、石綿が天然鉱物繊維であるのに対してロックウールは人造鉱物繊維である点で異なる。現在石綿が混ざっているロックウールは市販されていないが、過去に石綿が混ざったロックウールが市販されていた時期があり、石綿を含有しているロックウールであるか否かを容易に検出できる方法が必要である。しかしながら、いずれも鉱物繊維であるため、従来の位相差顕微鏡による方法では、判別が困難である。そこで、本発明に係る方法を用いて石綿含有ロックウールと非含有ロックウールを判別できるか否かを確認した。
(1)試料および試料の調製
実験のためのサンプル調製は次の方法で行った。サンプルとしてはロックウールのみ(5mg)、および、ロックウール4mgとクリソタイル標準物質((社)日本作業環境測定協会)1mgを混合したものを用いた。
操作は以下の(a)〜(f)の手順で行った。
(a)試料の固定
スライドグラス(MATSUNAMI製、MICRO SLIDE GLASS 白縁磨 1mm厚)上に両面テープを貼付し、その上に微量(5mg)の試料を塗布し、吸着固定した。
(b)ブロッキング
固定した試料にブロッキング溶液(緩衝液[25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20]に0.5%カゼインを添加したもの)100μlを滴下し、室温で5分間放置した。続いて、スライドグラスを100mlの水が入ったビーカーに1分間浸し、洗浄することにより、余分なブロッキング剤を除去した。さらに、ビーカーよりスライドグラスを取り出し、室温で5分間放置し乾燥させた。
(c)酵素の結合
実施例4と同様のDksA-AP細胞破砕液50μlを試料の上に添加し、室温で5分間放置することにより、試料中に含まれる石綿に酵素を結合させた。
(d)洗浄
スライドグラスを100mlの水がはいったビーカーに1分間浸した後取り出し、再度、新しい水を入れたビーカーに1分間浸した。この操作を計2回行った後、スライドグラスを取り出し、5分間放置し乾燥させた。
(e)基質添加
発色液(BCIP/NBT PLUS:Moss,INC.)50μlを試料の上に滴下し、室温で反応させた。
(f)色調判定
基質添加から一定の時間後に色の変化を目視観察し、石綿の有無を判定した。
結果を図16に示した。図16から明らかなように、クリソタイルを含むサンプルに滴下した基質は5分程度で紫色に発色したが、クリソタイルを含まないサンプルの場合発色作用が見られなかった。このことから、本方法の有効性が確認された。なお、反応時間を20分としても判定に何ら影響を及ぼすことはなく、色調変化がより明確になった。したがって、反応時間を5分より長くしてもよいことは明らかである。
(1)DksA-GFP融合タンパク質発現ベクターの構築
実施例1で作製した発現ベクターpET DksA-APのphoA遺伝子をgfp遺伝子に置換することで作製した。すなわち、既知のgfp遺伝子配列(ACCESSION No.U62636: cloning vector pGFVuv)に基づいて、2種のオリゴヌクレオチドプライマーP7:AGAAAAGCTTAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACT(配列番号37)およびP8:TCATGCGGCCGCAAGCTCATCCATGCCATGTGTA(配列番号38)を作製し、pGFPuvベクター(clontech)を鋳型としてPCRを行った。反応はKOD Plus DNAポリメラーゼ(TOYOBO)を用い、同社のプロトコルに従った。PCR産物およびpET DksA-APを制限酵素NotIおよびHindIIIにより37℃2時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのDNA断片をLigation High(TOYOBO)により16℃2時間ライゲーションし、大腸菌MV1184株に形質転換した。得られたコロニーから目的のDNA断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pET DksA-GFPとした。
pET DksA-GFPで形質転換したRosetta BL21(DE3) pLysS (Novagen)を2×YT培地で37℃一晩培養し、新しい2×YT培地に1%植菌した。OD600が0.6になるまで28℃で培養後、終濃度が0.3mMになるようにIPTGを添加してさらに16時間培養を行った。集菌後、上記実施例3(6)に記載の方法で細胞破砕液の調製およびアフィニティーカラムによる精製を行った。精製したタンパク質について、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製度を確認したところ、95%以上であった。
精製したDksA-GFP 0.2μgとクリソタイル(白石綿、(社)日本作業環境測定協会)40μgを緩衝液(25mM Tris-HCl pH7.5, 0.5% Tween20)10μl中で混合し、室温10分間結合させた。結合後のサンプル3μlをスライドガラス(MATSUNAMI製、MICRO SLIDE GLASS 白縁磨 1mm厚)に滴下し、落射蛍光顕微鏡BX-60(OLYMPUS)で観察した。GFPの蛍光観察にはU-MNIBAキューブ(ダイクロイックミラー:DM505、励起フィルター:BP470-490、吸収フィルター:BA515IF)を用い、画像の取り込みには顕微鏡デジタルカメラDP70(OLYMPUS)を使用した。
Claims (7)
- 少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質を、試料中の石綿と接触させる工程;および
石綿に結合した上記タンパク質を検出する工程
を包含し、
上記少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質が、
配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、並びに、配列番号13に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
より選択される1種以上のタンパク質である、ことを特徴とする石綿検出方法。 - 少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質と、レポータータンパク質との融合タンパク質を取得する工程;
得られた融合タンパク質を試料中の石綿と接触させる工程;および
石綿に結合した上記融合タンパク質を検出する工程
を包含し、
上記少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質が、
配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、並びに、配列番号13に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
より選択される1種以上のタンパク質である、ことを特徴とする石綿検出方法。 - 上記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、ジアホラーゼおよびパーオキシダーゼから選択されることを特徴とする、請求項2に記載の石綿検出方法。
- 少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質を含み、
上記少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質が、
配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、並びに、配列番号13に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
より選択される1種以上のタンパク質である、ことを特徴とする、石綿検出剤。 - 少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質と、レポータータンパク質との融合タンパク質を含み、
上記少なくとも0.1M以上の塩化ナトリウムを含む溶液中で石綿と結合し得るタンパク質が、
配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、並びに、配列番号13に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
より選択される1種以上のタンパク質である、ことを特徴とする、石綿検出剤。 - 上記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、ジアホラーゼおよびパーオキシダーゼから選択されることを特徴とする請求項5に記載の石綿検出剤。
- 請求項4〜6のいずれか1項に記載の石綿検出剤を備えることを特徴とする石綿検出キット。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013242328A (ja) * | 2013-07-26 | 2013-12-05 | Hiroshima Univ | アスベスト結合タンパク質の利用 |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1953550A4 (en) * | 2005-11-10 | 2010-04-14 | Nat University Of Corp Hiroshi | METHOD AND AGENT FOR IMMOBILIZATION OF A PROTEIN BY FIXING THE PROTEIN ON A SUBSTANCE CONTAINING SILICA |
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JP5419198B2 (ja) * | 2008-07-25 | 2014-02-19 | 国立大学法人広島大学 | アスベスト結合タンパク質のスクリーニング方法 |
JP5097668B2 (ja) * | 2008-09-30 | 2012-12-12 | 株式会社インテック | アスベスト検出装置 |
JP2010131587A (ja) * | 2008-11-04 | 2010-06-17 | Kaneka Corp | アスベスト吸着材、およびその利用 |
JP5655254B2 (ja) * | 2010-02-16 | 2015-01-21 | 国立大学法人京都工芸繊維大学 | ポリカーボネートおよび/またはポリメタクリル酸メチル親和性ペプチド、およびその利用 |
US9322822B2 (en) | 2011-08-12 | 2016-04-26 | Hiroshima University | Method for detecting asbestos |
EP2816110B1 (en) | 2012-02-13 | 2018-11-28 | National University Corporation Kyoto Institute of Technology | Peptide having affinity for silicon nitride (si3n4), and use therefor |
US10253064B2 (en) | 2014-10-22 | 2019-04-09 | Hiroshima University | Purification method, purification kit, and silicon oxide-binding tag for use therein |
GB201514436D0 (en) * | 2015-08-14 | 2015-09-30 | Symbiose Biomaterials Sa | Asbestos detection |
EP3351556A4 (en) * | 2015-09-18 | 2019-04-24 | Hiroshima University | PROTEIN DAY BINDING TO SUBSTANCES WITH A CRYSTAL STRUCTURE AND USES THEREOF |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4248854A (en) * | 1979-08-27 | 1981-02-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Production of antibody toward asbestos and immunoassay therewith |
WO2007055288A1 (ja) * | 2005-11-10 | 2007-05-18 | National University Of Corporation Hiroshima University | 酸化ケイ素含有物質に結合するタンパク質を介したタンパク質の固定化方法および固定化剤 |
JP2010131587A (ja) * | 2008-11-04 | 2010-06-17 | Kaneka Corp | アスベスト吸着材、およびその利用 |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4918022A (en) * | 1989-03-13 | 1990-04-17 | Ohio State University | Analysis of bulk asbestos samples |
US6321208B1 (en) * | 1995-04-19 | 2001-11-20 | Brightstreet.Com, Inc. | Method and system for electronic distribution of product redemption coupons |
US5710886A (en) * | 1995-06-16 | 1998-01-20 | Sellectsoft, L.C. | Electric couponing method and apparatus |
FR2765988B1 (fr) * | 1997-07-09 | 1999-08-27 | Infomil | Dispositif, procede et systeme informatique d'encaissement pour delivrer automatiquement des billets d'avantages commerciaux |
US6406921B1 (en) * | 1998-07-14 | 2002-06-18 | Zyomyx, Incorporated | Protein arrays for high-throughput screening |
US6041309A (en) * | 1998-09-25 | 2000-03-21 | Oneclip.Com, Incorporated | Method of and system for distributing and redeeming electronic coupons |
US7231357B1 (en) * | 1999-04-19 | 2007-06-12 | Neil Shanman | System and method for the targeted distribution of discount coupons over a network |
US6721804B1 (en) * | 2000-04-07 | 2004-04-13 | Danger, Inc. | Portal system for converting requested data into a bytecode format based on portal device's graphical capabilities |
US6862575B1 (en) * | 2000-08-17 | 2005-03-01 | Nokia Corporation | Electronic coupon system |
JP2002176989A (ja) * | 2000-12-14 | 2002-06-25 | Japan Science & Technology Corp | 磁気微粒子膜特異的タンパク質 |
US6844028B2 (en) | 2001-06-26 | 2005-01-18 | Accelr8 Technology Corporation | Functional surface coating |
US7501157B2 (en) * | 2001-06-26 | 2009-03-10 | Accelr8 Technology Corporation | Hydroxyl functional surface coating |
US20040137886A1 (en) * | 2002-11-22 | 2004-07-15 | Monte Ross | Method and system for delivering electronic coupons to wireless mobile terminals |
JP4429105B2 (ja) | 2003-08-19 | 2010-03-10 | キヤノン株式会社 | 有機物固定化構造体及びその製造方法、ペプチド及びdna |
US20080163128A1 (en) * | 2006-12-28 | 2008-07-03 | Sean Callanan | Click-Fraud Prevention |
CA2672294A1 (en) * | 2007-01-18 | 2008-07-24 | Coupons, Inc. | System and method for controlling distribution of electronic coupons |
US20080183576A1 (en) * | 2007-01-30 | 2008-07-31 | Sang Hun Kim | Mobile service system and method using two-dimensional coupon code |
US20090070207A1 (en) * | 2007-09-10 | 2009-03-12 | Cellfire | Electronic coupon display system and method |
JP5233320B2 (ja) * | 2008-02-27 | 2013-07-10 | ソニー株式会社 | データ処理システム及びデータ処理方法 |
US20090259535A1 (en) * | 2008-04-11 | 2009-10-15 | Yahoo! Inc. | Coupon clipper |
US20090287558A1 (en) * | 2008-05-16 | 2009-11-19 | Microsoft Corporation | Electronic Coupon Tracking |
US20100094689A1 (en) * | 2008-10-15 | 2010-04-15 | Nicholas Philippe Fodor | Method, System, and Graphical User Interface For Coupon or Advertisement Delivery |
EP2380125A4 (en) * | 2008-12-31 | 2013-03-13 | Mastercard International Inc | METHODS, SYSTEMS AND COMPUTER READABLE MEDIA FOR DISCONNECTING AND DELIVERING ELECTRONIC TRUST CERTIFICATES USING A MOBILE DEVICE |
US10992817B2 (en) * | 2009-03-18 | 2021-04-27 | Mastercard International Incorporated | Methods, systems and computer readable media for selecting and delivering electronic value certificates using a mobile device |
US20110106598A1 (en) * | 2009-10-29 | 2011-05-05 | Mccann Monica Theresa | Surfacing Digital Coupons to Customers |
-
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4248854A (en) * | 1979-08-27 | 1981-02-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Production of antibody toward asbestos and immunoassay therewith |
WO2007055288A1 (ja) * | 2005-11-10 | 2007-05-18 | National University Of Corporation Hiroshima University | 酸化ケイ素含有物質に結合するタンパク質を介したタンパク質の固定化方法および固定化剤 |
JP2010131587A (ja) * | 2008-11-04 | 2010-06-17 | Kaneka Corp | アスベスト吸着材、およびその利用 |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
JPN6011067728; 医療と検査機器・試薬 Vol.28, No.5, Page.403-406, 2005 * |
JPN6011067731; 病理と臨床 Vol.22, No.7, Page.667-674, 2004 * |
JPN6011067732; J Biol Chem Vol.268, No.5, Page.3538-3545, 1993 * |
JPN6011067735; J Appl Toxicol Vol.3, No.3, Page.135-138, 1983 * |
JPN6011067736; 日本生物工学会大会講演要旨集 Vol.58th, Page.33 3B10-2, 20060803 * |
JPN6012023226; Biotechnol Bioeng Vol.99, No.2, Page.285-289, 2008 * |
JPN6012023229; SORSTジョイントシンポジウム-超微量物質の同定/認識の化学 (6th) 東京 Page.45-49, 2007 * |
JPN6012023231; Environ Sci Technol Vol.44, No.2, Page.755-759, 2010 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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