KR101656847B1

KR101656847B1 - 석면 검출 방법

Info

Publication number: KR101656847B1
Application number: KR1020147005075A
Authority: KR
Inventors: 아키오 쿠로다; 타케노리 이시다; 토모키 니시무라
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호진 히로시마다이가쿠
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2012-08-09
Publication date: 2016-09-12
Also published as: US9322822B2; KR20140043152A; US20140170773A1; WO2013024881A1; JPWO2013024881A1; CN103733048B; CN103733048A; JP6086494B2

Abstract

위상차 현미경/전자 현미경 법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 위상차/현미경 전자 현미경과 비교하여 보다 효율적이고 간편하고, 한편 높은 정밀도로 석면을 검출할 수 있는 방법을 제공하기 위해 피검 물에 형광 표지를 갖는 석면 결합 단백질을 접촉시킨 후 위상차 현미경과 형광 현미경을 조합하여 사용함으로써 피검 물 중에 포함된 석면을 검출한다.

Description

석면 검출 방법{METHOD FOR DETECTING ASBESTOS}

본 발명은 석면 검출 방법에 관한 것이다

최근, 석면(섬유질 규산염, "이시와타(Ishiwata)"라고도 함)이 인체에 미치는 악영향이 문제가 되고 있다. 즉 기업에서는 과거에 석면을 제조 또는 취급하는 업무에 종사했던 사람들에게 폐암, 중피종(mesothelioma) 등의 건강상의 피해가 다수 나타나고 있음을 보고하였으며, 석면 분진을 흡입한 사람들이 석면폐, 폐암, 악성 중피종 등의 건강상의 장해를 일으킬 수 있음을 보고하였다.

석면폐(pulmonary asbestosis)는 폐를 섬유화하는 질병인 폐 섬유증(진폐)의 일종이다. 다른 광물성 분진 등 폐 섬유증을 일으키는 많은 원인이 있지만, 석면 노출에 의해 발생한 폐 섬유증을 특히 석면폐로 구분하고 있다. 폐암은 폐포에 포함된 석면 섬유의 물리적 자극에 의해 주로 발생하는 것으로 되어있다. 발암성의 정도는 석면의 종류에 따라 다르고, 석면의 두께, 길이도 이에 관여한다. 악성 중피종은 폐를 둘러싼 흉막(pleura)과 간, 위장 등의 장기를 둘러싼 복막 등에 있는 악성 종양이다.

석면은 온석(백석면), 쿠로시돌라이트(청석면), 아모사이트(갈석면), 안 소필라이트(anthophylite), 토레모라이토(toremolite), 양기석(actinolite) 등이 포함된다. 석면의 용도는 90 % 이상이 건축 자재에 사용되고 있으며, 나머지 10 %는 화학 플랜트 설비용 씰링(sealing) 재료, 마찰재 등의 공업 제품 등에 사용되고 있다. 아울러, 2004 년 10 월 1일부터 석면을 원료로 한 건축 자재, 마찰재, 접착제의 제조 등은 금지되어 있지만, 과거에 대량으로 석면이 사용되어 왔기 있기 때문에 많은 건물에 여전히 석면이 남겨져 있는 것이 현실이다.

석면 검출 방법으로는 예를 들어, 대기 중 석면을 검사하는 경우 펌프에서 공기를 흡입시 필터에 석면을 포집하고 필터를 아세톤 등을 이용하여 무색화(투명화) 한 후, 위상차 현미경(phase-contrast microscope )을 사용하여 관찰하고 대기 중의 총 섬유 농도를 측정한다. 총 섬유 농도가 1 개/L 이상인 경우는 위상차 현미경에 의해 관찰된 섬유가 실제로 석면인지 여부를 전자 현미경을 사용하여 판정한다(비특허 문헌 1 참조).

그러나 위상차 현미경으로 관찰하는데에는 숙련된 기술이 필요하고, 또한, 상당한 시간이 필요하기 때문에 동시에 여러 작업을 하는 것은 곤란하다. 더욱이, 전자 현미경은 아주 고가이기 때문에 누구나 간편하게 실시할 수는 없다. 또한, 전자 현미경에 의한 판정은 시료의 복잡한 전처리 등이 필요할 뿐만 아니라 위상차 현미경에 의해 관찰된 섬유를 에너지 분산형 X 선 분석 장치로 분석해야 하므로 매우 시간과 인내를 요하는 작업이다.

따라서 기존의 위상차 현미경과 전자 현미경과를 이용하는 방법(이하, "위상차 현미경/전자 현미경 법"이라 칭함)에서는 석면을 신속하게 검출할 수 없다. 따라서 신속성이 필요한 철거 현장에서의 석면 위험에 대응하기에 부적절하다. 철거 현장에서는 빠른 경우에는 2 ~ 3 일에 철거가 종료하기 때문에, 검사 결과가 나오기 전에 이미 석면이 주위에 흩뿌려 보일 경우도 적지 않다. 따라서 일본의 석면 발생원은 공장보다는 오히려 단기적으로 위치가 이동하는 철거 현장으로 이동하고 있기 때문에 석면을 신속하게 검출할 수 있는 방법의 개발이 급선무이다.

그런데 본 발명자들은 석면에 특이적으로 결합하는 단백질("석면 결합 단백질"이라 칭함)을 발견하고 상기 단백질을 이용한 석면의 바이오 분석 시스템("바이오 형광 법"이라 칭하는 )을 제공하고 있다(예를 들면, 특허 문헌 1 참조). 바이오 형광 법은 석면 결합 단백질을 형광 물질로 개질하여 바이오 프로브를 만들고, 상기 바이오 프로브를 이용하여 형광 현미경으로 석면을 검출하는 방법이다. 바이오 형광 법에서는 위상차 현미경으로는 관찰하기 매우 어려운, 보다 미세한 석면 섬유까지도 우수한 검출력으로 잘 검출해낼 수 있다. 구체적으로, 바이오 형광 법에서는 폭(직경)이 30 나노미터의 미세한 온석 단섬유까지도 검출할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 바이오 형광 법에서는 석면 섬유의 물성과 형상을 모두 확인할 수 있다. 따라서 바이오 형광 법은 효율적이고 간편하고, 한편 정확한 석면 검출 방법으로 주목받고 있다.

또한, 본 발명자들은 Escherichia coli 유래의 DksA 단백질이 석면 중에서도 특히 온석(백석면)에 강하게 결합한다고 보고하고 있다(비 특허 문헌 2).

또한, 본 발명자들은 석면 결합 단백질의 스크리닝 방법 및 당해 스크리닝 방법에 의해 얻어진 석면 결합 단백질을 이용하여 바이오 형광 법에 의해 여러 가지 시료에 포함된 석면을 검출하는 방법을 개시하고 있다(특허 문헌 2).

특허 문헌 1 : 국제 공개 제2007/055243호(국제 공개 일자 : 2007 년 5 월 18 일) 특허 문헌 2 : 일본 공개 특허 공보 제2010-32271호(공개 일자: 2010 년 2 월 12일 공개)

비특허 문헌 1 : "석면 모니터링 매뉴얼(Asbestos Monitoring Manual)(제 4.0 판)" 일본 환경부 물 · 대기 환경국 대기 환경과, 2010 년 6 월 비특허 문헌 2: "Detection of Chrysotile Asbestos by Using a Chrysotile-Binding Protein", Biotechnology and Bioengineering, Vol. 99, No. 2, February 1, 2008, p.285-289.

상술한 바와 같이, 바이오 형광 법은 위상차 현미경에서는 찾을 수 없는 미세한 석면 섬유도 검출할 수 있다. 즉, 바이오 형광 법에 의해 검출된 석면의 총 수는 위상차 현미경에 의해 검출된 수보다 많아 질 우려가 있다. 그래서 종래 기술을 이용해 석면을 계측해왔던 사람들 사이에서는 "기존의 위상차 현미경/전자 현미경 법에 의해 수득된 과거의 데이터와 연속성이 없는 것인가?" 그리고 "석면 검출 기준이 바뀌는 것은 아닌가"라는 우려가 있다. 따라서 여하 기존의 위상차 현미경/전자 현미경 법의 기준을 바꾸지 않고 석면을 측정하는 방법을 개발하는 것이 바이오 형광 법의 기술적 과제이다.

여기서 비 특허 문헌 1에 따르면, 기존 방법의 기준으로, 먼저 위상차 현미경으로 길이 5μm 이상, 폭(직경) 3μm보다 작고, 길이와 너비의 비율(종횡비)이 3 : 1 이상의 섬유질 물질을 측정하고 총 섬유 수를 산출한다. 그 다음, 그 총 섬유 수의 몇 %가 석면인지, 다음의 방법으로 결정할 것이다. 이 석면의 결정(확인) 방법으로, 예를 들어 전자 현미경(분석 스캐닝 전자 현미경 또는 분석 투과 전자 현미경)을 이용한 방법이 위상차 현미경/전자 현미경 법이다. 이 방법에서는 위상차 현미경으로 측정된 섬유에 대해 전자 현미경에 의한 X 선 스펙트럼을 실시하여 석면을 판정한다.

한편, 위상차 현미경/전자 현미경 법은 상술한 바와 같이, 간편, 또한, 신속하게 석면을 검출할 수 없다는 문제점이 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 감안하여 이루어진 것이며, 그 목적은 위상차 현미경/전자 현미경 법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 위상차 현미경/전자 현미경과 비교하여 보다 효율적이고 간편하면서도 높은 정밀도로 석면을 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, 기존의 기준에 따라 위상차 현미경으로 검출 대상물을 좁힌 다음, 부과 검출 대상물의 물성을 바이오 형광 법에 의해 확인하여 위상차 현미경/전자 현미경 법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 위상차 현미경/전자 현미경과 비교하여 보다 효율적이고 간편하면서, 높은 정밀도로 석면을 검출할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

위상차 현미경/전자 현미경 법의 검출 기준에 따라 위상차 현미경으로 검출 대상물을 좁힌 다음, 부과 검출 대상물의 물성(즉, 석면인지 여부)을 바이오 형광 법에 의해 결정하여 석면을 검출하는 발상은 신규하며, 본 발명자들이 처음 공개 한것이다.

즉, 본 발명에 따른 석면 검출 방법은 피검 물에 형광 표지를 갖는 석면 결합 단백질을 접촉시키는 접촉 공정과, 상기 접촉 공정을 거친 후, 상기 피검 물 중에 함유된 섬유질 물질을 위상차 현미경을 이용하여 검출하는 제 1 검출 공정과, 상기 제 1 검출 공정에서 검출된 상기 섬유질 물질과 결합하는 상기 석면 결합 단백질을 형광 현미경을 이용하여 검출하는 제 2 검출 공정을 포함하고, 상기 제 1 검출 공정과 상기 제 2 검출 공정은 동일한 시야(visual field)에서 이루어지는 것을 특징으로 하고 있다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법은 먼저 제 1 검출 공정에서 위상차 현미경을 이용해 피검 물 내 포함된 섬유질 물질을 검출하고, 그 다음 바이오 형광 법을 이용한 제 2 검출 공정에서 제 1 검출 공정에서 검출된 각각의 섬유질 물질이 석면 인지 여부를 판정한다. 물론 위상차 현미경으로는 검출할 수 없는 미세한 석면 섬유가 제 2 검출 공정에서 관찰될 수 있으나, 이러한 미세한 석면 섬유는 제 1 검출 공정에서 배제되어 있다. 즉, 본 발명에 따른 석면 검출 방법에 의해 최종적으로 검출되는 석면의 수는 동일 시료를 위상차 현미경에 의해 검출하면 발견될 석면의 수를 초과할 우려가 없다. 따라서 위상차 현미경/전자 현미경 법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 석면을 검출할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따른 석면 검출 방법은 석면을 검출하기 위하여 위상차 현미경과 형광 현미경과 함께 사용하는 것이 특징이다.

또한, 제 1 검출 공정에서 위상차 현미경으로 좁힌 검출 대상물의 물성(즉, 석면인지 여부)를 제 2 검출 공정에서 바이오 형광 법에 의해 결정하는바, 즉, 상기 검출 대상물에 형광 표지를 가지는 석면 결합 단백질이 결합하는지 여부를 형광의 유무에 따라 결정하기 때문에, 매우 간편하면서, 아울러 높은 정밀도로 석면을 검출 할 수 있다.

또한, 종래의 전자 현미경 법에 의해 물성을 결정하는 경우와 비교해 매우 짧은 시간에 간편하게 검출 대상물의 물성을 결정할 수 있다. 구체적으로는 전자 현미경 법은 시료의 전처리를 포함하면 검출 대상물의 물성을 결정하기까지 약 15 시간 걸리는(Mari YAMADA et al. "Kankyotyu No Ishiwata Hunjin Noudo Sokutei Ni Okeru Bunseki Houhou No Kento", Annual Report of Tochigi Prefectural Institute of Public Health and Environmental Science, No. 12(2006), page 62-68 참조) 반면, 본 발명에 따른 석면 검출 방법에서는 약 1 시간 이내에 접촉 공정에서 제 2 검출 공정까지를 완료할 수 있다.

또한, 위상차 현미경/전자 현미경은 전자 현미경으로 피검 물 중에 석면이 함유되어 있는지를 확인할 수 있지만, 2 종류의 현미경 간에 스테이지 이동으로 인해 동일한 시야에서의 관찰이 매우 어렵다. 즉, 위상차 현미경으로 발견된 어떤 섬유가 석면인지를 개별 섬유마다 확인하는 것은 거의 불가능 하기 때문에, 통계적으로 유의미한 수를 전자 현미경으로 확인해, 그 석면의 비율을 위상차 현미경에 의해 확인한 총 섬유 수에 곱하여 석면 수를 추정하고 있다.

이에 반해, 본 발명에 따른 석면 검출 방법은 현미경으로, 위상차 현미경용 콘덴서 및 낙사 형광 장치(epifluorescence device)를 갖춘 현미경("위상차/형광 현미경"라고 칭함) 또는 두 가지를 모두 갖춘 편광 현미경을 이용함으로써 위상차 관찰 용 투과 빛(transmitting light)에서 낙사 형광으로 단지 광로(light path) 전환 만으로 시야를 바꾸는 일없이 제 1 검출 공정과 제 2 검출 공정을 행할 수 있다. 따라서 제 1 검출 공정에서 위상차 현미경으로 검출 대상물을 맞춘 후 그대로 현미경의 광로만 위상차 모드에서 형광 모드로 전환하고 동일한 시야에서 제 2 검출 공정을 수행 수 있게 된다. 따라서 제 1 검출 공정에서 검출한 섬유질 물질이 석면 인지 여부를 개별 섬유질 물질마다 즉시 판별할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 석면 검출 방법에 의하면, 위상차 현미경/전자 현미경 법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 위상차 현미경 전자 현미경과 비교하여 보다 효율적이고 간편하고 한편 높은 정밀도로 석면을 검출하는 것이 가능해진다.

또한, 상기 비 특허 문헌 2는 GFP-표지한 DksA 단백질(GFP-labeled DksA protein)을 접촉시킨 온석(백석면)의 위상차 현미경 영상과 형광 현미경 영상에 기초하여 상기 GFP에서 나오는 형광이 온석(백석면)의 섬유에서 관찰된 것을 확인하고 있는 것에 지나지 않는다. 즉 DksA 단백질이 확실히 온석(백석면)에 결합되어 있는지 확인하기 위해 위상차 현미경에 의한 관찰과 형광 현미경 이미지에 의한 관찰을 하려고 하는 것에 지나지 않는다.

마찬가지로, 상기 특허 문헌 2에도 위상차 현미경에 의한 관찰 및 형광 현미경에 의한 관찰을 모두 수행하는 것으로 개시되어 있지만, 이 특허 문헌에서도 이러한 사실, 이러한 두 가지 관찰을 실시하고 있음을 개시함에 지나지 않는다.

따라서, 비 특허 문헌 2 및 특허 문헌 2에 기재된 방법은 피검 물에 위상차 현미경에 의한 관찰 및 형광 현미경에 의한 관찰 모두를 실시하고 있지만, 석면 검출 기준은 기존 바이오 형광 법과 같다. 즉, 비 특허 문헌 2 및 특허 문헌 2에 기재된 방법으로는 형광이 관찰된 물질은 모두 석면이라고 판단하기 때문에 기존의 검출 기준을 적용하여 석면을 정확하게 검출할 수 없다.

또한, 특허 문헌 2에는 형광 표지된 석면 결합 단백질과 석면과의 결합체를 필터 위에서 관찰할 때 필터를 무색화(투명화)한다고 기재되어 있지만, 이것은 단순히 위상차 현미경에 의한 관찰 및 형광 현미경에 의한 관찰 모두를 수행할 수 있도록 하기 위한 것이며, 전술한 이유로 인해 단순히 필터를 투명화하는 것만으로는 기존의 검출 기준을 적용하여 석면을 정확하게 검출하는 것은 불가능하다.

구체적으로, 특허 문헌 2의 실시예(예를 들어, 실시예 3)에서는 위상차 현미경에 의한 관찰과 형광 현미경에 의한 관찰 모두를 기반으로 석면에 결합된 석면 결합 단백질을 식별하고 있다. 그러나, 상술한 기술은 위상차 현미경에 의해 관찰할 때 관찰될만한 섬유(구체적으로는, 소정의 크기를 갖는 섬유)를 선별해 놓지 않아서, 형광 현미경으로 관찰되는 모든 형광 신호(큰 것부터 작은 것까지 모든 형광 신호)를 석면으로 계산한다. 그 결과, 상술한 기술로 인한 판정 결과는 기존의 석면 검출 기준에 따른 판정 결과에서 크게 벗어나게 된다.

또한, 특허 문헌 2의 실시예(예를 들어, 실시예 4,5,7,8,9 및 10)은 용액 내에 분산된 상태에서 석면과 석면 결합 단백질을 결합시키는 것과 동시에, 용액 내에 분산된 상태에서 석면 결합 단백질에 연결된 표지의 효소 활성을 검출하고 있다. 즉, 상술한 기술은 위상차 현미경에 의한 관찰과 형광 현미경에 의한 관찰 모두에 따라 석면을 식별하는 기술이 아니다.

또한, 특허 문헌 2의 실시예(예를 들어, 실시예 6 )는 멤브레인 필터에 석면 을 포착하고 해당 석면에 석면 결합 단백질을 결합시킨 후 멤브레인 필터에 대해 투명화 처리를 하였다(예를 들면, 특허 문헌 2의 실시예 6 참조). 그리고 나서, 위상차 현미경에 의한 관찰과 형광 현미경에 의한 관찰 모두에 따라 석면을 확인하고 있다. 그러나 당해 기술도 상술한 실시예 3과 마찬가지로, 위상차 현미경에 의한 관찰을 할 때 관찰될만한 섬유(구체적으로는 소정의 크기를 갖는 섬유)를 선별해 놓지 않았기 때문에, 형광 현미경으로 관찰된 모든 형광 신호(큰 것부터 작은 것까지 모든 형광 신호)를 석면으로 계산한다. 그 결과, 상술한 기술로 인한 판정 결과는 기존의 석면 검출 기준에 따라 판정 결과에 크게 벗어나게 된다.

상술한 바와 같이, 특허 문헌 2의 실시예에 기재된 기술로 인한 판정 결과는 기존의 석면 검출 기준에 따른 판정 결과에서 크게 벗어나게 된다. 이 점에 대해 더욱 상세하게 설명한다.

형광 현미경은 아주 미세한 섬유(예를 들어, 30nm 직경의 온석 섬유)도 검출 할 수 있다. 즉, 형광 현미경에서는 암시야(dark field)를 배경으로 관찰 대상이 빛나 보이기 때문에 매우 미세한 섬유도 관찰할 수 있다. 형광 현미경은 어디까지나 광학 현미경의 일종이기 때문에 빛의 해상도에 한계(250nm ~ 300nm)가 있다. 그러나, 형광 현미경은, 예를 들어 30nm의 섬유도 실제 크기보다 크게 300nm 정도로 굵고 흐리게 관찰된다.

즉, 형광 현미경은 빛의 해상도 한계 이하의 섬유도 관찰되므로, 위상차 현미경보다 섬유 수가 더 많은 것으로 계산해 버릴 위험성이 높다. 또한, 빛의 해상도 한계 부근의 측정은 그 측정값 다음을 포함할 위험이 있고, 따라서 신뢰도가 부족하다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법은 상기의 문제점을 바로 해결하는 방법을 제공하는 것이다.

구체적으로는, 본 발명에서는 먼저 위상차 현미경으로 기존의 석면의 크기 조건을 충족시키는 섬유를 검출하고 그 조건에 맞는 섬유만을 형광 영상에 따라 석면인지 여부를 판정하여, 위의 문제점을 해결할 수 있다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법에 의하면, 위상차 현미경/전자 현미경 법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 위상차 현미경/전자 현미경과 비교하여 보다 효율적이고 간편하고, 한편 높은 정확도로 석면을 검출할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 위상차 형광법에 의한 석면의 현미경 관찰 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 위상차 형광법에 의한 석면의 현미경 관찰 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 위상차 형광법에 의한 석면의 현미경 관찰 결과를 나타내는 것이다.

이하, 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니라, 상세한 설명의 범위 내에서 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 언급된 학술 논문 및 특허 문헌 모두가 본 명세서에 참고로 원용된다. 또한, 특별히 언급하지 않으면 본 명세서에서 숫자 범위를 나타내는 "A ~ B"는 "A 이상 B 이하"를 의미한다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법은 피검 물에 형광 표지를 갖는 석면 결합 단백질을 접촉시키는 접촉 공정,

상기 접촉 공정을 거친 후, 상기 피검 물 중에 포함된 섬유질 물질을 위상차 현미경을 이용하여 검출하는 제 1 검출 공정, 및

상기 제 1 검출 공정에서 검출된 상기 섬유질 물질과 결합한 석면 결합 단백질을 형광 현미경을 이용하여 검출하는 제 2 검출 공정을 포함하고,

상기 제 1 검출 공정과 상기 제 2 검출 공정은 동일한 시야(visual field)에서 이루어진다.

상기 "피검 물"은 석면이 포함되어 있는지 여부를 검출하는 대상물을 의미한다. 피검 물의 예로, 모르타르, 암면 등의 건축 자재, 사문석 등의 광석, 및 석면을 검출하려고 하는 환경에서 샘플링 한 공기 등을 들 수 있다.

공기(대기) 중의 피검 물은 측정 환경의 공기를 필터로 여과하여 포집할 수 있다. 피검 물을 필터에 포집하는 방법은 측정 환경의 공기를 필터로 여과하여 피검 물을 포집할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, "석면 모니터링 매뉴얼(제 4.0 판)" (비 특허 문헌 1)에 기재된 방법에 따라 피검 물의 포집을 행할 수 있다. 상기 "필터"로는 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 셀룰로오스 에스테르로 만들어진 멤브레인 필터 또는 폴리 카보네이트 필터 등이 사용된다.

따라서, 상기 피검 물은 필터에 포집된 것 일 수 있다. 이 경우 접촉 공정을 거친 후 상기 필터를 투명화하는 투명화 공정을 더 포함하고, 따라서 제 1 검출 공정은 상기 투명화 공정을 거친 후에 수행하는 것이 바람직하다. .

즉, 필터에 포집된 피검 물에서 석면을 검출하는 경우, 본 발명에 따른 석면 검출 방법은 필터에 포집된 피검 물에 형광 표지를 갖는 석면 결합 단백질을 접촉시키는 접촉 공정,

상기 접촉 공정을 거친 후 상기 필터를 투명화하는 투명화 공정과,

상기 투명화 공정을 거친 후, 상기 피검 물 중에 함유된 섬유질 물질을 위상차 현미경을 이용하여 검출하는 제 1 검출 공정과,

상기 제 1 검출 공정에서 검출된 상기 섬유질 물질과 결합하는 석면 결합 단백질을 형광 현미경을 이용하여 검출하는 제 2 검출 공정을 포함하고,

상기 제 1 검출 공정과 상기 제 2 검출 공정은 동일한 시야에서 이루어진다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 "석면"은 일본어 "이시와타(いしわた)"와 동의어이다.

이러한 신규한 석면 검출 방법을 본 발명자들은 "위상차 형광법"이라 명명했다.

[1. 접촉 공정]

"접촉 공정"은 피검 물(또는 필터에 포집된 피검 물)에 형광 표지를 갖는 석면 결합 단백질을 접촉시키는 공정이다.

상기 "형광 표지를 갖는 석면 결합 단백질"은 형광 물질로 개질된 석면 결합 단백질이거나, 형광 단백질과 석면 결합 단백질과의 융합 단백질일 수 있다. 또한, 본 명세서에서는 상기 "형광 표지를 갖는 석면 결합 단백질"을 단순히 "석면 결합 단백질"이라고 칭할 수 있다. "형광 표지" 및 "석면 결합 단백질"에 대해서는 후술한다.

석면 결합 단백질과 피검 물을 접촉시키는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 양자를 효율적으로 접촉시킬 수 있기 때문에 용액 내에서 석면 결합 단백질과 피검 물을 접촉시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 석면 결합 단백질을 함유 한 용액에 피검 물을 첨가하고, 그것을 충분히 혼합하여도 되고, 반대로 피검 물을 포함한 현탁액에 석면 결합 단백질을 첨가하고, 그것을 충분히 혼합 수도 있다. 또한, 석면 결합 단백질을 함유한 용액과 피검 물을 포함한 현탁액을 혼합하고 그것을 충분히 혼합할 수도 있다. 피검 물이 필터에 포집된 경우에는 석면 결합 단백질을 함유하는 용액을 필터 피검 물을 포집한 필터의 표면(포집면)에 적하하여 피검 물과 석면 결합 단백질를 용액 내에서 접촉시킬 수 있다. 또한, 석면 결합 단백질과 피검 물을 접촉시키는 조건(예를 들면, 온도, 시간 등)은 양자가 충분히 접촉할 수 있는 조건이면 특별히 한정되지 않으며, 적절한 검토 후, 바람직한 조건을 선택하면 된다.

피검 물에 접촉시키는 석면 결합 단백질의 양은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 피검 물의 양에 비해 석면 결합 단백질의 양이 너무 적으면, 피검 물 중에 포함된 석면을 충분히 검출할 수 없을 수 있다. 한편, 피검 물의 양에 비해 석면 결합 단백질의 양이 과도하게 많으면 석면 이외의 물질과 석면 결합 단백질과의 비특이적인 결합이 생겨 정밀도가 떨어질 우려가 있다. 그래서 석면 이외의 물질과 비특이적인 결합을 초래할 가능성이 없고, 한편 피검 물에 충분히 접촉할 수 있는 양의 석면 결합 단백질을 피검 물에 접촉시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 석면 결합 단백질을 함유하는 용액을 필터의 포집면에 적하하는 경우 석면 결합 단백질을 0.5nM ~ 5μM, 바람직하게는 5nM ~ 500nM의 농도로 함유하고 있는 용액을 33 ~ 98μl/cm², 바람직하게는 33 ~ 49μl/cm²의 필터의 포집면에 적하하는 것이 바람직하다.

상기 "용액"은 석면 결합 단백질과 피검 물과의 결합을 억제 또는 저하시키거나 석면 결합 단백질의 피검 물에 대한 결합 특이성을 저하시키는 것이 아니라면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 용액으로는, 예를 들어 인산 완충액, 탄산 완충액 및 트리스 완충액 등을 들 수 있다.

또한, 접촉 공정에서 석면 결합 단백질과 피검 물을 용액 내에서 접촉시키는 경우 비특이적 결합을 방지하기 위해 당해 용액에는 계면 활성제(Tween20(등록 상표), Triton X-100 등)이 포함되어 있다. 후술하는 실시예에 있어서, 용액으로서 0.3M 인산 완충액(pH 8.0), 0.3M NaCl, 및 0.5 % Tween80(등록 상표)의 조성의 완충액을 사용하여 접촉 공정을 실시하고 있다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법에서 접촉 공정에서는 석면 결합 단백질로서 2 종류 이상의 다른 석면 결합 단백질을 피검 물과 접촉시킬 수 있다. 이 경우, 상기 2 종류 이상의 다른 석면 결합 단백질은 서로 다른 종류의 석면과 특이적으로 결합하는 단백질이며, 또한, 서로 다른 파장의 형광을 발하는 형광 표지를 가지고 있는 것이 바람직하다. 이러한 구성이면 이어지는 제 2 검출 공정에서 다른 종류의 석면을 형광 색상의 차이에 따라 쉽게 판별할 수 있게 된다.

구체적으로 설명하면, 석면 결합 단백질로, 예를 들어 온석에 특이적으로 결합하는 단백질(예를 들어, DksA 단백질(데이터 베이스 명: GenBank, accession No.: AAC73256))과 각섬석계 석면에 특이적으로 결합하는 단백질(예를 들어, H-NS_60-90 단백질(데이터 베이스 명: GenBank, accession No.: AAC74319))를 조합하여 사용하고, 또한, 각각의 석면 결합 단백질에 서로 다른 파장의 형광을 발하는 형광 표지를 갖도록 한다(예를 들어, 석면 결합 단백질 중 하나를 Cy3로 표지하고 다른 석면 결합 단백질을 DyLight488로 표지). 이는 후속의 제 2 검출 공정에서 온석 과 각섬석계 석면을 형광색의 차이에 따라 구별되게 검출할 수 있다. 또한, 2 종류 이상의 다른 석면 결합 단백질의 혼합, 그리고 서로 다른 파장의 형광을 발하는 형광 표지의 조합은 상기에 한정되지 않고 탐지할 석면의 종류 등에 따라 모든 석면 결합 단백질 및 모든 형광 표지 중에서 적절한 조합을 선택할 수 있다.

예를 들어, 하나의 석면 결합 단백질을 녹색 형광 염료로 표지하고 다른 석면 결합 단백질을 적색 형광 염료로 표지하면 온석과 각섬석 계 석면을 형광색의 차이에 따라 구별되게 검출할 수 있다. 상기 "녹색 형광 염료"로, 예를 들어 플루오로 세인, DyLight488, Alexa488, ATTO488 및 CF488A 등을 들 수 있다. 또한, 상기 "적색 형광 염료"로서, 예를 들면, Cy3, DyLight550, CF555 등을 들 수 있다. 이들 "녹색 형광 염료" 및 이들 "적색 형광 염료" 중에서 각각 한 종류씩 선택하여 조합하면 된다.

"석면 결합 단백질" 및 "형광 표지"에 대해 다음에 구체적으로 설명한다.

(1-1 석면 결합 단백질)

본 명세서에서 "석면 결합 단백질"은 석면과 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 단백질을 의미한다. 단백질이 석면과 특이적으로 결합하고 있는지 여부에 대해서는 최소한 0.1M 이상 염화나트륨을 포함한 용액 내에서 석면과 결합 여부를 검토하여 판단할 수 있다. 즉, 0.1M 이상의 염화나트륨을 포함한 용액에 단백질과 석면을 혼합하여 석면에 결합된 단백질을 용출 한 후, SDS-PAGE 등의 방법으로 단백질을 검출한다. 만약 단백질이 검출되면 그 단백질은 석면과 특이적으로 결합하는 단백질(석면 결합 단백질)이라고 할 수 있다(구체적으로는, 특허 문헌 1 참조). 또한, 최소한 0.1M 이상 염화나트륨을 포함한 용액 내에서 석면과 결합한다면 석면에 특이적으로 결합하는 단백질이라고 간주할 수 있지만, 0.3M 이상의 염화나트륨을 포함한 용액 내에서는 단백질이 석면과 결합하는 것이 어려워 지기 때문에 0.1M ~ 0.3M, 바람직하게는 0.2M ~ 0.3M 의 염화나트륨을 함유하는 용액 내에서 단백질과 석면이 결합하는지 여부를 검토하는 것이 바람직하다. 물론, 0.3M 이상의 염화나트륨(예를 들어, 0.3M ~ 0.5M, 0.3M ~ 1M, 0.5M ~ 1M 또는 1M 이상)을 포함한 용액 내에서 고려된 단백질과 석면의 결합 여부를 검토할 수 있다. 염화나트륨의 농도가 높을수록 석면에 대한 단백질의 결합 특이성은 높다고 할 수 있다.

이러한 석면 결합 단백질로, 예를 들어 H-NS 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC74319), DksA 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC73256), GatZ 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC75156), DnaK 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC73125), HlpA 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC73289), YgiW 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC76060), CspA 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAN68075), Cgl0974 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: BAB98367), OmpC 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC75275), OmpA 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC74043), S1 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC73997), S4 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC76321), L1 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC76958), L5 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC76333), L7 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC76960), TTC0984 단백질(데이터베이스 명 : NCBI accession No : YP_004953) 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이에 국한되지 않는다. 이러한 석면 결합 단백질은 1 종을 단독으로 사용하여도 되고, 복수 종을 조합하여 사용하여도 된다.

상기 "H-NS 단백질"의 제 1 번째 ~ 제 57 번째 아미노산 영역(서열 번호 7)은 석면 중에서도 온석(백석면)에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 제 60 번째 ~ 제 90 번째의 아미노산 영역(서열 번호 8)는 석면 중에서도 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면), 앤 소피 라이트, 토레모라이토, 및 양기석에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "DksA 단백질"은 석면 중에서도 온석(백석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "GatZ 단백질"은 석면 중에서도 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면), 안소필라이트, 토레모라이토, 양기석에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "DnaK 단백질"은 석면 중에서도 온석(백석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "HlpA 단백질"은 석면 중에서도 온석(백석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "YgiW 단백질"은 석면 중에서도 온석(백석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "CspA 단백질"은 석면 중에서도 온석(백석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "Cgl0974 단백질"은 석면 중에서도 온석(백석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "S4 단백질"은 석면 중에서도 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "L1 단백질"은 석면 중에서도 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "L5 단백질"은 석면 중에서도 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "L7 단백질"은 석면 중에서도 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "OmpC 단백질"은 석면 중에서도 온석(백석면), 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "OmpA 단백질"은 석면 중에서도 온석(백석면), 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "S1 단백질"은 석면 중에서도 온석(백석면), 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면)에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 "TTC0984 단백질"은 석면 중에서도 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면)에 결합할 수 있다.

필터에 포집된 피검 물에서 석면을 발견하면 필터를 투명화할 필요가 있으므로, 이 경우에 사용되는 석면 결합 단백질은 후술할 투명화 공정을 거친 후에도 석면에 대한 결합이 유지되는 단백질인 것이 바람직하다. 그런 특성을 갖는 석면 결합 단백질을 이용하면, 투명화 공정을 거친 후에도 석면을 검출할 수 있다. 여기서, 상기 "투명화 공정을 거친 후 석면에 대한 결합이 유지된다"는 것은 투명화 공정 전후의 석면 결합 단백질의 석면에의 결합 양의 변화를 확인하여 판단할 수 있다. 예를 들어, 석면에 결합하는 형광 표지 단백질(형광 표지를 갖는 석면 결합 단백질)의 형광의 강도(형광 강도)를 기준으로 투명화 공정 이전의 형광 강도를 100 %로 했을 경우 투명화 공정을 거친 후 형광 강도가 바람직하게는 20 % 이상, 보다 바람직하게는 50 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상 유지되고 있으면, 투명화 공정을 거친 후 석면에 대한 결합이 유지되고 있다고 할 수 있다. 형광 강도는 형광 현미경 등을 이용하여 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다.

또한, 후술하는 바와 같이 형광 표지의 종류에 따라 투명화 과정 후 형광 강도에 영향을 받는 경우가 있기 때문에, 석면 결합 단백질의 석면에 대한 결합 양을 검토하기 위해 이용하는 형광 표지는 투명화 공정을 거친 후에도 형광 현미경으로 형광을 검출할 수 있는 것이면 무방하다. 그리고 형광 표지의 형광 강도가 투명화 공정에 의해 얼마나 영향을 받는지를 감안하여 석면 결합 단백질의 석면에 대한 결합 양을 최종적으로 결정하면 된다.

투명화 공정을 거친 후 석면에 대한 결합이 유지되는 석면 결합 단백질로, 예를 들어 H-NS 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC74319), DksA 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC73256), GatZ 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC75156) 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이에 국한되지 않는다. 이러한 석면 결합 단백질은 1 종을 단독으로 사용하여도 되고, 복수 종을 조합하여 사용하여도 된다.

석면 결합 단백질의 유래는 특별히 한정되지 않고, 세균, 효모, 식물, 동물 등 생물에서 유래하는 단백질이면 된다.

또한, 본 명세서에서, 용어 "단백질"은 "폴리펩티드"또는 "펩티드"로 대체될 수 있다. "단백질"은 단백질의 부분 조각(단편)을 포함한다. 또한, "단백질"은 융합 단백질을 포함한다. "융합 단백질"은 2 개 이상의 이종 단백질의 일부(단편) 또는 전부가 결합한 단백질이다.

또한, 본 발명에 사용되는 석면 결합 단백질로 상기에 예시한 단백질의 아미노산 서열에서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 석면과의 결합이 가능한 단백질이 이용될 수 있다.

여기서, 상기 "1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된"은 부위 특이적 돌연변이 등의 공지의 변이 펩티드 제작법에 의해 결실, 치환 및/또는 부가될 수 있는 정도의 수(예를 들어, 총 아미노산 수의 5 % 이하)의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가되는 것을 의미한다. 결실, 치환 및/또는 부가되는 아미노산의 총 갯수는 전체 아미노산 수의 5 % 이하로서, 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 후에도 석면과 결합하는 활성을 갖고 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.

또한, 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가되는 부위는 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 후의 단백질이 석면과 결합하는 활성이 있다면 해당 아미노산 서열의 어느 부위에라도 무방하다.

이러한 변이 폴리펩티드는 공지의 돌연변이 폴리펩티드 제작법에 의해 인위적으로 변이된 폴리펩티드에 한정되는 것이 아니라, 자연에 존재하는 유사한 변이 폴리펩티드를 분리 정제한 것도 포함한다.

단백질의 아미노산 서열 중 일부 아미노산이 단백질의 구조 또는 기능에 유의한 영향을 주지 않고 쉽게 변이될 수 있음은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 또한, 인위적으로 변이된 단백질뿐만 아니라 천연 단백질 중에서도 당해 단백질의 구조 또는 기능을 크게 변화시키지 않는 돌연변이가 존재한다는 것도 주지의 사실이다.

바람직한 돌연변이에는 보존성 또는 비 보존성 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있다. 바람직하게는 동의(silent) 치환, 부가 및 결실이며, 특히 바람직하게는 보존성 치환이다. 이들 변이 중 어떤 것도 본 발명에 따른 폴리펩타이드 활성을 변화시키지 않는다.

대표적으로 보존성 치환을 나타내는 예에는 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; 히드록실 잔기 Ser 및 Thr 교환; 산성 잔기 Asp 및 Glu 교환; 아미드 잔기 Asn 및 Gln 사이의 대체; 염기성 잔기 Lys 및 Arg 교환; 및 방향족 잔기 Phe, Tyr 사이의 대체가 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 석면 결합 단백질에는 추가적인 펩타이드를 포함할 수 있다. 추가적인 펩티드로서는 예를 들면, 폴리 아르기닌 태그(Arg-tag) 및 폴리 히스티딘 태그(His-tag)와 Myc, Flag 등의 에피토프 표식 펩티드들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 석면 결합 단백질로는 석면에 특이적으로 결합할 수 있는 것이면 되므로, 통상의 기술자라면 상기 예시한 단백질 이외의 단백질이라도 석면에 특이적으로 결합할 수 있는지 여부를 확인하여 그 단백질이 본 발명에서 이용될 수 있는 것인지 아닌지를 쉽게 이해할 수 있다.

마찬가지로, 통상의 기술자라면 상기 예시한 단백질 이외의 단백질이라도 투명화 공정을 거친 후 석면에 대한 결합이 유지되는 단백질에 대해서도 투명화 공정을 거친 후 석면에 대한 결합이 유지 될 수 있는지 여부를 확인하여 투명화 공정을 거친 후 석면에 대한 결합이 유지되는 단백질인지 아닌지를 쉽게 이해할 수 있다.

본 발명에 사용되는 석면 결합 단백질은 석면 결합 단백질의 전체 아미노산 서열 중에 석면과의 결합에 기여하는 일부 아미노산 서열 부분을 포함하는 부분 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 후술하는 실시예에서 H-NS 단백질의 제 60 ~ 90 번째 아미노산 영역의 부분 펩티드를 사용하고 있다. 이러한 부분 펩티드를 이용함으로써 석면(특히 아모 사이트(갈석면), 쿠로시돌라이트(청석면), 앤 소피 라이트, 토레모라이토, 양기석)에 대한 석면 결합 단백질의 결합 특이성을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 석면 결합 단백질은 석면과 석면 결합 단백질 간의 결합을 보다 강하게 한다는 점에서 다량체화된 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 사용되는 석면 결합 단백질은 다량체 단백질인 것이 바람직하다.

여기서, 상기 "다량체 단백질"은 2 이상의 단백질(폴리펩티드)가 이황화 결합 등의 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합된 단백질을 말한다. 단백질이 2 량체 이상의 다량체이면 여러 단백질을 통해 석면에 결합할 수 있기 때문에 단일 단백질을 통해 석면에 결합하는 경우와 비교하여 석면 결합 단백질과 석면 사이의 결합력이 강해진다.

다량체 단백질의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고, 공지의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 후술하는 실시예에서는 H-NS 단백질의 제 60 ~ 90 번째 아미노산 영역의 부분 펩티드와 스트렙타아비딘과의 융합 단백질을 제조하고, 스트렙타아비딘이 4 량체를 형성하는 성질을 이용하여 이러한 융합 단백질을 4 량체화한다.

본 발명에 사용되는 석면 결합 단백질은 그 공급원이 되는 세포를 배양하고 분리 정제하여 생산할 수 있다. 또한, 공지의 유전자 공학 기술에 의해 재조합 발현 벡터를 구축하고, 이것을 적절한 숙주 세포에 도입하여 재조합 단백질을 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 또한, 아미노산 합성 기계 등을 이용하여 합성할 수 있다.

(1-2. 형광 표지)

본 명세서에서 "형광 표지"는 석면 결합 단백질을 이용하여 석면을 검출할 때, 석면에 결합된 단백질이 형광에 기초해 검출될 수 있도록 하는 물질을 의미한다. 형광 표지는 그것이 존재하는 것으로 형광을 나타내기 때문에, 형광 현미경으로 관찰함으로써 쉽게 석면 결합 단백질의 유무를 결정할 수 있다. 따라서 쉽게 석면을 검출할 수 있다.

상기 "형광 표지"는 형광 현미경으로 형광을 검출 할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며 기존의 형광 물질, 형광 단백질 등 중에서 적절히 선택할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 상기 "형광 물질"이라 함은 특히 비 단백질의 저분자 형광 화합물을 의미한다. 형광 현미경으로 형광을 검출 할 수 있는 것이면 형광 물질의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, Cy3, DyLight488 플루오르 세인, Alexa488, ATTO488, CF488A, DyLight550, CF555 등을 들 수 있다. 이 외에도 녹색 형광 염료(예를 들어, Cy2, 로다민 그린), 적색 형광 색소(예를 들어, 로다 민, Cy5, Alexa546, Alexa555, Alexa568, Alexa594, CF568, CF594, DY547) 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이에 국한되지 않는다. 이러한 형광 물질은 1 종을 단독으로 사용하여도 무방하고, 복수 종을 조합하여 사용하여도 무방하다.

또한, 상기 "형광 단백질"로 녹색 형광 단백질(GFP) 등을 들 수 있다. 또한, 상기 "형광 단백질"의 유래는 특별히 한정되지 않는다.

필터에 포집된 피검 물에서 석면이 검출되면 필터를 투명화할 필요가 있으므로, 이 경우에 사용되는 "형광 표지"는 후술할 투명화 공정을 거친 후 형광 현미경을 사용하여 검출될 수 있는 형광이라면 특별히 한정되지 않는다. 석면 검출 감도를 향상시킨다는 관점에서 투명화 공정 이전 형광 표지가 발하는 형광의 강도(형광 강도)를 100 %로 했을 경우 투명화 공정을 거친 후 형광 표지가 발하는 형광 강도가 바람직하게 20 % 이상, 보다 바람직하게는 50 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상 유지되는 것을 이용하는 것이 바람직하다.

형광 표지의 형광 강도는 공지의 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 밝기를 측정하여 형광 강도를 평가할 수 있다. 구체적으로는 화상 분석 소프트웨어 VH Analyzer(KEYENCE)를 사용하여 밝기를 측정하여 형광 강도의 유지율을 산출할 수 있다. 이러한 형광 강도를 갖는 형광 표지를 사용함으로써 투명화 공정을 거친 후에도 높은 정밀도로 석면을 검출하는 것이 가능해진다.

투명화 공정을 거친 후 형광 현미경으로 형광을 검출할 수 있는 형광 표지로는 기존의 형광 물질, 형광 단백질 등 중에서 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, Cy3, DyLight488, 플루오르 세인, Alexa488, ATTO488, CF488A, DyLight550, CF555 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이에 국한되지 않는다. 이러한 형광 물질은 1 종을 단독으로 사용하여도 무방하고, 복수 종을 조합하여 사용하여도 된다.

통상의 기술자라면 상기 예시한 형광 표지 이외의 형광 표지에도 투명화 공정을 거친 후 형광 현미경을 사용해 형광을 검출할 수 있을지 여부를 확인하여 그 형광 표지가 투명화 공정을 거친 후 형광 현미경으로 형광을 검출할 수 있는 형광 표지인지 아닌지를 쉽게 이해할 수 있다.

상기 형광 표지는 그 물질에 따라 적절한 표지 방법으로 석면 결합 단백질에 결합시키면 된다. 예를 들어, 단백질을 표지하기 위해, 상업적으로 이용가능한 키트 등을 이용하여 석면 결합 단백질을 표지할 수 있다.

석면 결합 단백질을 형광 물질로 표지하는 경우에는 화학 결합을 이용하여 석면 결합 단백질에 형광 물질을 표지할 수 있다.

석면 결합 단백질을 형광 단백질로 표지하는 경우에는 공지의 유전 공학 기술을 이용하여 형광 단백질과 석면 결합 단백질과의 융합 단백질을 재조합 단백질로 발현시킬 수도 있다. 이 경우 석면 결합 단백질을 인코딩하는 유전자와 형광 단백질을 인코딩하는 유전자를 인위적으로 커플링한 융합 유전자를 발현하기 위해, 상기 융합 유전자를 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입하고 대장균 등의 숙주 세포에 도입하여 발현시키는 방법이 사용될 수 있다.

석면 결합 단백질 중에 형광 표지 된 후의 석면 결합 단백질이 불용성이 되어 버리는 경우가 있다. 분자량이 너무 커지는 것이 그 원인 중 하나인 것으로 추정된다. 이 경우에는, 형광 표지로서 상대적으로 적은 분자량의 형광 물질을 이용하는 것이 효과적이다.

석면 검출 감도를 보다 향상시키기 위한 형광 표지로는 형광 강도가 강하고, 안정성이 높은 물질이 바람직하다. 이러한 형광 표지를 이용하여 석면의 검출 감도를 향상시킬 수 있기 때문에, 피검 물 중에 포함된 석면의 양이 적은 경우에도 석면 검출이 가능하다.

〔2. 검출 공정]

본 발명에 따른 석면 검출 방법은 검출 공정으로

(i) 접촉 공정을 거친 후(경우에 따라서는 투명화 공정을 거친 후) 피검 물 중에 함유된 섬유질 물질을 위상차 현미경을 이용하여 검출하는 제 1 검출 공정 및,

(ii) 제 1 검출 공정에서 검출한 섬유질 물질과 결합된 석면 결합 단백질을 형광 현미경을 이용하여 검출하는 제 2 검출 공정을 포함하는 구성이다.

본원에서는 이러한 제 1 검출 공정 및 제 2 검출 공정을 통합하여 "검출 공정"이라고 칭한다. 본 발명에 따른 석면 검출 방법에 따르면 위상차 현미경과 형광 현미경을 필요에 따라 바꾸어 검출 대상을 수회 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 석면 검출 방법에서는 제 1 검출 공정 및 제 2 검출 공정을 한 번 이상 반복 실시할 수 있다. 즉, 제 1 검출 공정 후에 제 2 검출 공정을 수행하고 다시 제 1 검출 공정을 수행할 수 있다.

구체적으로, 예를 들면 제 2 검출 공정 후, 제 1 검출 공정을 다시 실시하고 형광 현미경으로 석면 결합 단백질과 결합된 것으로 검출된 섬유질 물질의 형상(길이, 너비 및 길이와 폭의 비율)을 다시 확인할 수 있었다. 이와 같이 제 1 검출 공정 및 제 2 검출 공정을 한 번 이상 반복 실시함으로써 보다 확실하게 석면을 검출 할 수 있다.

또한, 예를 들면, 피검 물에 포함된 섬유질 물질을 하나 발견할 때마다 제 2 검출 공정을 실시하여 그 섬유질 물질과 결합된 석면 결합 단백질을 검출하고, 다시 제 1 검출 공정을 실시하여 피검 물에 포함된 또 다른 섬유질 물질을 검출할 수 있다. 이와 같이 제 1 검출 공정에서 섬유질 물질을 하나 발견할 때마다 제 2 검출 공정을 수행함으로써 동일 시야에서 석면을 효율적으로 검출할 수 있다.

당연히, 제 1 검출 공정에서 피검 물에 포함된 모든 섬유질 물질에 대한 검출을 끝내고 검출된 섬유질 물질에 대해 제 2 검출 공정을 수행할 수도 있다 .

이와 같이, 본 발명에 따른 석면 검출 방법에 따르면 형광 현미경으로 검출 후 다시 위상차 현미경으로 검출하는 것처럼, 위상차 현미경과 형광 현미경을 필요 에 따라 수회 전환하여 검출 대상을 확인할 수 있으므로, 보다 확실하게 석면을 검출할 수 있다.

그러나, 제 2 검출 공정은 반드시 제 1 검출 공정 후에 실시해야 한다. 제 1 검출 공정 후에 제 2 검출 공정을 수행하여 위상차 현미경으로는 검출할 수 없는 미세한 석면 섬유는 제 1 검출 공정에서 우선 배제되므로 이러한 석면 섬유는 제 2 검출 공정에서 석면으로 관찰될 수 없다. 즉, 본 발명에 따른 석면 검출 방법에 의해 최종적으로 검출된 석면의 수는 동일 시료를 위상차 현미경에 의해 검출했을 때 검출될 석면의 수보다 많아 질 우려가 없다.

또한, 본 발명에 따른 석면 검출 방법은 상기 제 1 검출 공정과 상기 제 2 검출 공정이 동일한 시야에서 행해진다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법은 현미경으로 위상차/형광 현미경 등을 이용 하여 위상차 관찰용 투과 빛에서 낙사 형광으로 광로의 전환만으로 시야를 변경하지 않고 제 1 검출 공정과 제 2 검출 공정을 행할 수 있다. 따라서 제 1 검출 공정 과 제 2 검출 공정을 동일한 시야에서 수행하여, 즉 제 1 검출 공정에서 위상차 현미경을 이용하여 검출 대상을 좁힌 후 그대로 현미경의 광로만 위상차 모드에서 형광 모드로 전환하여 시야를 바꾸지 않고 제 2 검출 공정을 행하는 것이 가능해진다. 따라서 제 1 검출 공정에서 검출한 섬유질 물질이 석면인지 여부를 개별 섬유질 물질마다 즉시 판별할 수 있다.

여기서, "제 1 검출 공정" 및 "제 2 검출 공정"에 대해 후술한다.

(2-1 제 1 검출 공정)

"제 1 검출 공정"은 접촉 공정을 거친 후(경우에 따라서는 투명화 공정을 거친 후) 피검 물 중에 포함된 섬유질 물질을 위상차 현미경을 이용하여 검출하는 공정이다.

여기서, 상기 "섬유질 물질"은 섬유질 부분을 갖는 물질이면 되고, 섬유질 부분이 분쇄된 것도 무방하고, 섬유질 부분에 이물질이 끼어있는 것이어도 된다. 상기 "섬유질 물질"의 상세한 판단 기준은, "석면 모니터링 매뉴얼(제 4.0 판)"(비 특허 문헌 1)에 기재되어있다.

제 1 검출 공정에서는 상기 "섬유질 물질"은, 위상차 현미경의 섬유질 물질의 검출 기준에 따라 검출되어야 한다. 위상차 현미경법의 검출 기준에 부합하는 섬유질 물질은, 예를 들어 길이 5μm 이상, 폭 3μm보다 작고, 길이와 폭의 비율이 3:1 이상인 조건을 충족하는 섬유질 물질이다("석면 모니터링 매뉴얼(제 4.0 판)"(비 특허 문헌 1) 참조). 즉, 현재의 위상차 현미경 법의 검출 기준을 준수하여 본 발명에 따른 석면 검출 방법은 제 1 검출 공정에서 길이 5μm 이상, 폭 3μm보다 작고, 길이와 너비의 비율이 3 : 1 이상의 섬유질 물질을 검출하는 것이 바람직하다.

여기서, 섬유질 물질의 "길이"는 예를 들어, 접안 렌즈에 장착된 아이피스 계수선(graticule)의 눈금을 이용하면 비교적 쉽게 판단할 수 있지만, 섬유질 물질의 "길이"의 결정 방법이 이에 국한되는 것은 아니다.

섬유질 물질의 "폭"은 섬유질 물질의 "직경"으로 대체될 수 있다. 상기 "직경"은 섬유질 물질이 접하는 원의 직경을 말한다. 섬유질 물질의 "폭"은 예를 들어, 접안 렌즈에 장착된 아이피스 계수선(graticule)의 눈금을 이용하면 비교적 쉽게 결정할 수 있지만, 섬유질 물질의 "폭"의 결정 방법은 이에 국한되지 않는다.

섬유질 물질의 "길이와 폭의 비율"은 섬유질 물질의 "종횡비"로 대체할 수 있다.

섬유질 물질의 "길이", "폭"과 "길이와 폭의 비율"에 대해서는 "석면 모니터링 매뉴얼(제 4.0 판)"(비 특허 문헌 1)에 상세하게 규정되어 있으므로 해당 문헌에서 규정된 방법에 따라 섬유질 물질의 "길이", "폭"과 "길이와 폭의 비율"을 결정할 수 있다.

그러나, 본 발명에 따른 석면 검출 방법의 섬유질 물질의 검출 기준은 위의 기준에 한정되는 것은 아니다. 위상차 현미경 법의 섬유질 물질의 검출 기준이 변경된 경우, 본 발명에 따른 석면 검출 방법으로 수정된 위상차 현미경 법의 섬유질 물질의 검출 기준에 따라 섬유 물질을 검출하면 된다. 이와 같이, 본 발명에 따른 석면 검출 방법에서는 제 1 검출 공정에서 위상차 현미경 법의 섬유질 물질의 검출 기준에 따라 섬유질 물질을 검출하기 때문에, 위상차 현미경/전자 현미경 법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 석면을 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법에 따르면 먼저 제 1 검출 공정에서 위상차 현미경 하에서 필터에 포집된 피검 물로부터 소정의 섬유질 물질을 검출하고 이에 이은 제 2 검출 공정에서 검출 대상물을 좁혀낸다. 이는 바이오 형광 법을 이용한 제 2 검출 공정에서 위상차 현미경/전자 현미경 법에서는 검출할 수 없는 미세한 석면 섬유를 검출할 위험을 없앤다. 즉, 본 발명에 따른 석면 검출 방법에 의해 최종적으로 검출된 석면의 수는 동일 시료를 위상차 현미경/전자 현미경 법에 의해 검출하면 검출된 석면의 수보다 많아 질 우려가 없다. 따라서, 종래 방법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 석면을 검출할 수 있다.

(2-2 제 2 검출 공정)

"제 2 검출 공정"은 제 1 검출 공정에서 검출된 섬유질 물질과 결합된 석면 결합 단백질을 형광 현미경을 이용하여 검출하는 공정이다.

제 2 검출 공정에서는 석면 결합 단백질이 가지는 형광 표지를 형광 현미경을 사용하여 검출하여 제 1 검출 공정에서 검출한 섬유질 물질과 결합된 석면 결합 단백질을 쉽게 검출할 수 있다. 즉, 제 1 검출 공정에서 검출한 섬유질 물질에서 형광 현미경으로 형광이 확인되면 해당 섬유질 물질은 석면 결합 단백질이 결합하고 있다고 판단할 수 있으며, 형광을 볼 수 없다면, 그 섬유질 물질은 석면 결합 단백질이 결합하고 있지 않다고 판단할 수 있다. 그리고 석면 결합 단백질이 결합되어 있는 섬유질 물질은 석면이라고 판단할 수 있고 석면 결합 단백질이 결합하지 않는 섬유질 물질은 석면이 아니라고 판단할 수 있다.

형광 현미경을 이용한 형광 표지 검출 방법은 특별히 한정되는 것이 아니라, 그 형광 표지에 따른 검출 방법(여기 파장 등)을 적절하게 고려 후, 바람직한 조건을 선택하면 된다.

각 검출 공정을 수행하기 위하여 사용되는 위상차 현미경 및 형광 현미경의 구성은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 현미경으로 위상차 현미경용 콘덴서 및 낙사 형광 장치를 갖춘 현미경(위상차/형광 현미경) 또는 이들 모두를 갖춘 편광 현미경을 이용함으로써 위상차 관찰용 투과 빛에서 낙사 형광으로 광로를 전환하는 것만으로 시야를 변경하지 않고 각 검출 공정을 행할 수 있다. 즉 위상차/형광 현미경과 같은 현미경을 이용함으로써 제 1 검출 공정에서 위상차 현미경으로 검출 대상물을 맞춘 후 그대로 현미경의 광로를 위상차 모드에서 형광 모드로 전환하는 것만으로 제 2 검출 공정을 행하는 것이 가능해진다. 따라서 제 1 검출 공정에서 검출한 섬유질 물질이 석면인지 여부를 제 2 검출 공정에서 개별 섬유질 물질마다 즉시 판별할 수 있다.

[3. 투명화 공정]

"투명화 공정"은 접촉 공정을 거친 후 필터를 투명화하는 공정이다. 투명화 공정에서 필터를 투명화함으로써, 피검 물이 필터에 포집된 경우 후속의 제 1 검출 공정에서 위상차 현미경으로 피검 물 중에 함유된 섬유질 물질을 검출할 수 있게 된다. 따라서 필터의 투명화(무색화) 방법은 후속 제 1 검출 공정에서 위상차 현미경 하에서 섬유질의 물질을 검출할 수 있는 정도로 필터를 투명화 할 수 있는 방법을 말하나 이에 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 필터가 투명해질 때까지 아세톤 증기를 필터에 분무하는 방법을 들 수 있다. 이 방법은 "석면 모니터링 매뉴얼(제 4.0 판)"(비 특허 문헌 1)에 구체적으로 기재되어있다. 기타 투명화 방법은 DMF 용액 [DMF(Dimethyl formamide) 35 %, 물 50 %, 아세테이트 15 %를 이용하는 방법을 들 수 있다. 이 방법은 "석면 모니터링 매뉴얼(제 4.0 판)"(비 특허 문헌 1)에 구체적으로 기재되어있다.

또한, 투명화 공정을 거친 후 필터에 포집된 피검 물이 석면 결합 단백질과 접촉할 수 없는 상태가 되기 때문에 투명화 공정을 실시하는 경우에는 반드시 투명화 공정은 접촉 공정 뒤에 실시한다.

〔4. 기타]

본 발명에 따른 석면의 검출 방법은 상기의 공정 이외의 공정을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 접촉 공정 전에 측정 환경의 공기를 필터로 여과하여 피검 물을 포집하는 포집 공정을 포함할 수도 있다. 또한, 일련의 검출 공정에 의해 얻어진 결과에 따라 피검 물 중의 석면 농도를 산출하는 공정 또는 측정 환경 중 석면 농도를 산출하는 단계를 포함할 수도 있다.

이상과 같이, 본 발명에 따른 석면 검출 방법에 의하면, 종래 방법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 위상차 현미경/전자 현미경과 비교하여 보다 효율적이고 간편하고, 한편 높은 정밀도로 석면을 검출할 수 있다.

본 발명은 다음과 같이 구성할 수도 있다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법은 피검 물을 필터에 포집하고, 접촉 공정을 거친 후 상기 필터를 투명화하기 위해 투명화 공정을 더 포함하고, 상기 투명화 공정을 거친 후에 제 1 검출 공정을 실시하는 것이 바람직하다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 석면 검출 방법은 석면을 검출하기 위하여 위상차 현미경과 형광 현미경과 함께 사용하기 위한 것이고, 보다 구체적으로는 제 1 검출 공정에서 먼저 위상차 현미경 하에서 소정의 섬유질 물질을 검출한 후, 이러한 섬유질 물질에 대해 제 2 검출 공정에서 바이오 형광 법을 실시하는 것이 특징이지만, 대기 중 석면을 검출하는 경우 등 피검 물을 필터에 포집한 경우 투명화 공정을 통해 피검 물이 포집된 필터를 투명화하여 위상차 현미경과 형광 현미경과 함께 사용할 수도 있다. 부가되는 투명화 공정은 접촉 공정 후에 실시해야 한다. 이것은 투명화 공정을 거친 후 필터는 용액을 통과할 수 없게 되어, 필터 세척이 불가능하므로, 접촉 공정을 충분히 실시할 수 없기 때문이다.

따라서, 상기 구성이면, 위상차 현미경/전자 현미경 법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 위상차 현미경 및 전자 현미경과 비교하여 보다 효율적이고 간편하고, 한편 높은 정밀도로 대기 중 석면을 검출하는 것이 가능해진다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법은 상기 제 1 검출 공정 및 상기 제 2 검출 공정을 한 번 이상 반복하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법에 따르면 위상차 현미경 및 형광 현미경을 필요에 따라 전환해 이용하여 검출 대상을 확인할 수 있다. 따라서 형광 현미경으로 검출 후 다시 위상차 현미경으로 검출하는 것처럼, 위상차 현미경과 형광 현미경을 필요에 따라 전환해 실시하여 검출 대상을 확인할 수 있다. 그 결과, 보다 확실하게 석면을 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법에 따르면 상기 제 1 검출 공정에서는 길이 5μm 이상, 폭 3μm보다 작고, 길이와 폭의 비율이 3:1 이상의 섬유질 물질을 검출하는 것이 바람직하다.

상기 구성이면, 현재의 위상차 현미경 법의 기준에 따라 길이 5μm 이상, 폭 3μm보다 작고, 길이와 폭의 비율이 3:1 이상의 섬유질 물질을 제 1 검출 공정에서 검출할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 석면 검출 방법에 의해 최종적으로 검출되는 석면의 수는 동일 시료를 위상차 현미경에 의해 확인했을 때 확인될 석면의 수보다 많아 질 우려가 없다. 따라서 현재의 위상차 현미경/전자 현미경 법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 석면을 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법에 있어서 상기 석면 결합 단백질은 상기 투명화 공정을 거친 후 석면에 대한 결합이 유지되는 단백질이며, 상기 형광 표지는 상기 투명화 공정을 거친 후 형광 현미경으로 검출될 형광인 것이 바람직하다.

상기 구성이면, 투명화 공정을 거친 후에도 높은 정밀도로 석면을 검출하는 것이 가능해진다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법에 있어서 상기 석면 결합 단백질은 H-NS 단백질, DksA 단백질 및 GatZ 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 단백질일 수 있다.

상기 구성이면, 투명화 공정을 거친 후 심지어 높은 정밀도로 석면을 검출하는 것이 가능해진다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법에 있어서 상기 형광 표지는 Cy3, DyLight488 플루오르 세인, Alexa488, ATTO488, CF488A, DyLight550, CF555로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 형광 물질일 수 있다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법에 있어서 상기 석면 결합 단백질은 H-NS 단백질, DksA 단백질 및 GatZ 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 단백질의 다량체인 것이 바람직하다.

석면 결합 단백질이 다량체 단백질인 경우 하나의 단백질을 통해 석면에 결합하는 경우와 비교하여 석면 및 석면 결합 단백질과의 결합력을 강하게 하는 것이 가능해진다. 따라서, 상기 구성이면, 투명화 공정을 거친 후에도 고감도에서 석면을 검출하는 것이 가능해진다.

본 발명에 따른 석면 검출 방법에 있어서 상기 접촉 공정에서는 상기 석면 결합 단백질로서 2 종류 이상의 다른 석면 결합 단백질을 피검 물과 접촉시키고 상기 2 종류 이상의 다른 석면 결합 단백질은 서로 다른 종류의 석면과 특이적으로 결합하는 단백질이며, 또한, 서로 다른 파장의 형광을 발하는 형광 표지를 가지고 있는 것이 바람직하다.

상기 구성이면, 다른 종류의 석면을 형광 색상의 차이에 따라 쉽게 판별할 수 있게 된다.

본 발명은 상술한 각 실시예에 한정되는 것은 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 다양한 변경이 가능하며, 다른 실시예에 각각 개시된 기술적 수단을 적절하게 조합하여 얻어지는 실시예에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함되는 것으로 본다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1 : 석면 결합 단백질 H-NS_60-90의 제조와 형광 표지]

비오틴 - 스트렙타아비딘 상호 작용을 이용하여 비오틴 개질된 석면 결합 단백질을 형광 표지된 스트렙타아비딘에 결합시켜 형광 표지된 석면 결합 단백질을 제작했다.

먼저, 비오틴화 된 석면 결합 단백질을 제작했다. 단백질 발현 벡터 pET21-b(Novagen 사)를 주형으로, 올리고 뉴클레오티드 프라이머 P1(GCTCAGAAAATCGAATGGCACGAACACCACCACCACCACCACTGAACTA : 서열 번호 1) 및 올리고 뉴클레오티드 프라이머 P2(CTCGAAGATGTCGTTCAGACCGCCACCCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTC : 서열 번호 2)를 이용하여 인버스(inverse) PCR을 실시함으로써, pET21-b 의 HisTag 앞에 비오틴화 Tag를 삽입했다. 인버스 PCR 반응은 KOD-plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO 사)를 이용하여 TOYOBO 사의 프로토콜에 따라 실시했다. 이 비오틴화 단백질 발현 벡터를 "pET21-AviTag-C"로 명명했다.

이어서, 대장균 K-12 주(Escherichia coli K12, ATCC 700926)의 게놈 DNA를 주형으로 사용하고 뉴클레오티드 프라이머 P3(CATATGCAATATCGCGAAATGCTGATC : 서열 번호 3) 및 올리고 뉴클레오티드 프라이머 P4(GGATCCAAACAACGTTTAGCTTTGGTGCC : 서열 번호 4)를 사용하여 PCR을 실시해서 석면 결합 단백질인 H-NS 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC74319)의 제 60 ~ 90 번째 아미노산 영역(서열 번호 8)을 인코딩하는 유전자를 증폭하였다. PCR 반응은 KOD-plus Neo DNA 중합 효소(TOYOBO 사)를 이용해 TOYOBO 사의 프로토콜에 따라 실시하였다.

PCR 증폭 산물 및 비오틴화 단백질 발현 벡터 pET21-AviTag-C를 제한 효소 NdeI 및 BamHI로 37 ℃에서 1 시간 동안 처리 한 후, 아가로오스 겔 전기 영동을 실시했다. 젤에서 꺼낸 DNA 단편을 Ligation High(TOYOBO 사)를 이용하여 16 ℃에서 30 분간 라이게이션하고 대장균 JM109 주에 형질전환했다. 얻어진 콜로니에서 타겟 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 추출하고 이를 "pET-H-NS_60-90-AviTag-C"로 명명했다.

pET-H-NS_60-90-AviTag-C 플라스미드를 이용해 형질전환 한 대장균 BL21(DE3) pBirA(Novagen 사)를 2 × YT 배지를 이용하여 37 ℃에서 하룻밤 배양하고 배양물 1 %(v/v)를 200ml의 TYH 배지 [20g/l 트립톤, 10g/l 효모 추출물, 11g/l HEPES, 5g/l NaCl, 1g/l 황산 마그네슘 0.5 % 포도당, 수산화 칼륨으로 pH7.2 ~ 7.4으로 조정]에 접종했다. OD₆₀₀이 0.6가 될 때까지 37 ℃에서 배양 한 후 IPTG(isopropyl-β-D-thioglactopyranoside)(최종 농도 0.5mM)과 D-비오틴(최종 농도 100μM)을 첨가하여 28 ℃에서 4 시간 동안 배양했다. 배양액을 원심 분리하여 박테리아를 포집했다.

얻어진 박테리아 펠릿에 10ml의 완충액 A [0.05M Tris-HCl(pH8.3), 0.05M NaCl, 10 % 글리세롤]를 첨가하여 현탁하고 초음파에 의해 파쇄했다. 얻은 세포 파쇄액을 Histrap FF column(GE Healthcare Bioscience 사)에 제공, C-말단에 히스티딘을 갖는 비오틴화 H-NS_60-90 단백질을 해당 컬럼에 흡착시켜 완충액 B [0.05M Tris-HCl(pH8.3), 0.05M NaCl, 10 % 글리세롤, 0.5M 이미다졸]을 사용하여 용출시켰다. 수득한 비오틴화 H-NS_60-90 단백질에 대해 폴리아크릴 아미드 전기 영동으로 정제도를 검토한 결과, 정제도는 95 % 이상이었다.

이러한 석면 결합 단백질(H-N_S60-90 단백질)에 형광으로 표지하였다. 형광 개질을 위해서, 비오틴 - 스트렙타아비딘 간의 상호 작용을 이용하여 비오틴으로 개질된 석면 결합 단백질에 형광 표지 스트렙타아비딘을 결합시켰다. 2.7μl의 비오틴 화 H-NS_60-90 단백질(495μM)과 4μl 형광 개질된 스트렙타아비딘 용액(1mg/ml)을 혼합하고 실온에서 1 시간 동안 반응해 결합시켜 H-NS_60-90 단백질을 형광 표지했다. 이로써 H-NS_60-90 단백질과 형광 표지 스트렙타아비딘과의 복합체를 얻었다. 형광 염료 Cy3 로 표지로 스트렙타아비딘 (invitrogen 사) 를 사용하여 형광 개질한 H-NS_60-90 단백질을 "H-NS_{60 90}-스트렙타아비딘-Cy3"로 명명하고 형광 염료 DyLight488로 표지한 스트렙타아비딘 (Thermo Scientific 사) 를 사용하여 형광 개질한 H-NS_60-90 단백질을 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘- DyLight488"로 명명하고 형광 염료 DyLight550 로 표지한 스트렙타아비딘 (Thermo Scientific 사) 를 사용하여 형광 개질한 H-NS_60-90 단백질을 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘- DyLight550"로 명명하고 형광 염료 CF555 로 표지한 스트렙타아비딘 (Biotium 사) 를 사용하여 형광 개질한 H-NS_60-90 단백질을 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘- CF555"로 명명하고 형광 염료 CF488A 로 표지한 스트렙타아비딘 (Biotium 사) 를 사용하여 형광 개질한 H-NS_60-90 단백질을 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘- CF488A"로 명명했다.

덧붙여 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-Cy3", "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-DyLight488", "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-DyLight550", "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-CF555" 및 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-CF488A"는 스트렙타아비딘과 석면 결합 단백질과의 융합 단백질을 이용하고 있으므로, 스트렙타아비딘의 작용에 의해 4 량체가 된다. 즉 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-Cy3", "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-DyLight488", "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-DyLight550", "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-CF555" 및 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-CF488A"는 4 개의 H-NS_60-90 단백질이 중합하여 형성된 그리고 형광 염료에 의해 표지된 4 량체 단백질이다.

[실시예 2 : 위상차 형광법에 의한 석면의 현미경 관찰(1)]

피검 물로 아모 사이트(갈석면)(JAWE231)을 포집한 멤브레인 필터를 1/8 조각으로 잘라 포집면을 위로 향하게 하여 20μl의 완충액 C [0.3M 인산 완충액(pH8.0), 0.3M NaCl, 0.5 % Tween80(등록 상표)]를 3 회 적하했다.

이어 형광 단백질로서 H-NS_60-90-스트렙타아비딘-Cy3(12.5nM), H-NS_60-90-스트렙타아비딘-DyLight488(50nM), H-NS_60-90-스트렙타아비딘-DyLight550(12.5nM), H-NS_60-90-스트렙타아비딘-CF555(12.5nM) 또는 H-NS_60-90-스트렙타아비딘-CF488A(50nM)를 포함한 완충액 C(20μl)을 5 회 점안하여 아모 사이트에 형광 단백질을 결합시킨다. 그 후, 20μl의 완충액 C를 3 회 점안하여 미결합 형광 단백질을 제거했다. 마지막으로, 20μl의 물을 3 회 점안하여 완충액 유래의 계면 활성제와 소금을 제거했다.

이어서 필터의 포집면을 위로하여 슬라이드 글라스(MATSUNAMI, MICRO SLIDE GLASS, 광택모서리 포함 봉규산 유리(borosilicate glass with polished edges) 1mm 두께) 위에 얹어 잘 건조시켰다. 건조 후 포집면을 위로하여 아세톤 증기를 도포하여 필터를 투명화한 후 봉입액을 커버 유리(MATSUNAMI 18 × 18mm)와 필터 사이에 넣고, 관찰용 프레파라트(preparat)를 제작하였다.

수득한 프레파라트를 위상차/형광 현미경(낙사 형광 현미경 BX-60, 올림푸스 사)로 관찰했다. 첫째, 위상차 현미경으로 관찰하고, 아모 사이트 섬유를 확인한 후, 광로를 형광 모드로 전환하여 동일한 시야를 관찰했다.

도 1은 위상차 형광법에 의한 석면의 현미경 관찰 결과를 나타내는 것이다. 도 1(A) 는 형광 단백질로 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-Cy3"을 이용한 경우의 결과를 나타내고 도 1(B) 는 형광 단백질로 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-DyLight488"을 이용한 경우의 결과를 나타내고 도 1(C) 는 형광 단백질로 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-DyLight550"을 이용한 경우의 결과를 나타내고 도 1(D)는 형광 단백질로 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-CF555"를 이용한 경우의 결과를 나타내고 도 1(E)는 형광 단백질로 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-CF488A"를 이용한 경우 결과를 나타내고 있다. 도 1 (A) ~ (E)는 각각 왼쪽 도면이 위상차 현미경 영상을 나타내고, 오른쪽 도면이 위상차 현미경 사진과 동일 시야에서 관찰한 형광 현미경 영상을 나타내고 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 위상차 현미경으로 관찰한 아모 사이트 섬유에서 형광 현미경 하에서 형광 단백질의 결합을 확인할 수 있었다.

또한, 형광 염료 Cy3, DyLight550 및 CF555의 관찰에는 U-MNG 큐브(색선별 거울 : DM570, 여기 필터 : BP530-550, 흡수 필터 : BA590)를 이용하고 형광 염료 DyLight488 및 CF488A의 관찰에는 U- NIBA 큐브(색선별 거울 : DM505, 여기 필터 : BP470-490 흡수 필터 : BA515-550)을 사용하였다. 이미지 캡처는 현미경 디지털 카메라 DP-70(올림푸스 사)를 사용했다.

또한, 투명화 공정 전후의 섬유의 형광 강도(= 단백질 결합량 + 형광 물질 강도)는 밝기를 측정하여 평가했다. 구체적으로는, 투명화 공정의 전후에서 이미지의 섬유의 밝기를 화상 분석 소프트웨어 VH Analyzer(KEYENCE)를 이용하여 측정하고 형광 강도의 유지율을 계산하였다. 그 결과 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-Cy3"는 투명화 공정 이전 형광 강도를 100 %로 했을 경우 투명화 공정을 거친 후 형광 강도가 90 %로 유지되고 있었다. 또한, "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-DyLight488"는 투명화 공정 이전 형광 강도를 100 %로 했을 경우 투명화 공정을 거친 후 형광 강도가 90 % 로 유지되고 있었다. 또한, "H-N_S60-90-Neutravidin-DyLight550"는 투명화 공정 이전 형광 강도를 100 % 로 했을 경우 투명화 공정을 거친 후 형광 강도가 80 % 로 유지되고 있었다. 또한, "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-CF555"은 투명화 공정 이전 형광 강도를 100 %로 했을 경우 투명화 공정을 거친 후 형광 강도가 80 %로 유지되고 있었다. 또한, "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-CF488A"는 투명화 공정 이전 형광 강도를 100 %로 했을 경우 투명화 공정을 거친 후 형광 강도가 90 %로 유지되고 있었다.

이상에서 석면 결합 단백질로서 H-NS_60-90 단백질을 이용한 형광 표지로서 Cy3, DyLight488, DyLight550, CF555 또는 CF488A을 이용함으로써 위상차 형광법에서 아모 사이트를 관찰할 수 있는 것으로 확인했다.

[실시예 3 : 위상차 형광법에 의한 석면의 현미경 관찰(2)]

피검 물로 아모 사이트(갈석면)(JAWE231)과 암면(JFM 표준 섬유 시료)을 포집 한 멤브레인 필터를 이용하고 형광 표지된 단백질로서 "H-NS_60-90-스트렙타아비딘-Cy3"를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 프레파라트를 제작했다.

얻어진 프레파라트를 위상차/형광 현미경(낙사 형광 현미경 BX-60, 올림푸스 사)에서 관찰했다. 우선, 위상차 현미경으로 관찰하고, 섬유질 물질을 확인한 후, 광로를 형광 모드로 전환하여 동일한 시야를 관찰했다.

도 2는 위상차 형광법에 의한 석면의 현미경 관찰 결과를 나타내는 것이다. 도 2(A) 는 위상차 현미경 이미지를 나타내고, (B)는 (A)의 위상차 현미경 사진과 동일 시야에서의 형광 현미경 이미지를 나타내고, (C)는 (A)의 위상차 현미경 이미지와 (B) 형광 현미경 이미지를 중첩시킨 것이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 위상차 현미경으로 관찰한 섬유질 물질 2 및 3에 형광 단백질이 결합된 것은 형광 현미경을 통해 확인할 수 있었다. 한편, 위상차 현미경으로 관찰한 섬유질 물질 1 및 4에서는 형광 현미경을 통해서는 형광 단백질의 결합을 확인할 수 없었다. 따라서 섬유질 물질 2와 3은 석면이라고 판정하고 섬유질 물질 1과 4는 석면이 아니라고 판정했다.

이상에서 위상차 형광법을 이용하면, 위상차 현미경으로 관찰한 섬유질 물질이 석면인지 여부를 매우 효율적으로 간편하게, 한편 높은 정밀도로 판정 얻을 수 있음이 확인되었다.

[실시예 4 : 석면 결합 단백질 DksA의 제조와 형광 표지]

이어서, 대장균 K-12 주(Escherichia coli K12, ATCC 700926)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 올리고 뉴클레오티드 프라이머 P5(GGAATTCGCTAGCATGCAAGAAGGGCAAAACCG : 서열 번호 5) 및 올리고 뉴클레오티드 프라이머 P6(GTTGGATCCCCGCAGCCAGCCATCTGTTTTTCGC : 서열 번호 6)를 사용하여 PCR을 실시하여 석면 결합 단백질인 DksA 단백질(데이터베이스 명: GenBank accession No.: AAC73256)을 인코딩하는 유전자를 증폭하였다. PCR 반응은 KOD-plus DNA 중합 효소(TOYOBO 사)를 이용해 TOYOBO 사의 프로토콜에 따라 실시하였다.

PCR 증폭 산물과 단백질 발현 벡터 pET21-b를 제한 효소 NheI과 BamHI와 37 ℃에서 1 시간 처리 한 후, 아가로오스 겔 전기 영동을 실시했다. 젤에서 꺼낸 DNA 단편을 Ligation High를 이용하여 16 ℃에서 30 분간 라이게이션하고 대장균 JM109 주에 형질전환했다. 얻어진 콜로니에서 원하는 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 추출하고 이를 "pET-DksA"로 명명했다.

pET-DksA로 형질전환 한 Rosetta^TM(DE3) pLysS(Novagen 사)를 2 × YT 배지에서 37 ℃ 하룻밤 배양하고 200ml의 LB 배지 [10g/l 트립 톤, 5g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl]에 배양물 1 %(v/v) 접종했다. OD₆₀₀이 0.6가 될 때까지 37 ℃에서 배양 후 최종 농도가 0.5mM이 되도록 IPTG(isopropyl-β-D-thioglactopyranoside)을 첨가하여 28 ℃에서 4 시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 박테리아를 포집했다. 얻어진 박테리아 펠릿에 10ml의 완충액 A [0.05M Tris-HCl(pH8.3), 0.05M NaCl, 10 % 글리세롤]을 첨가하여 현탁하고 초음파에 의해 파쇄했다.

얻은 세포 파쇄액을 Histrap FF column에 제공, C-말단에 히스티딘을 갖는 DksA 단백질을 해당 컬럼에 흡착시켜 완충액 B [0.05M Tris-HCl(pH8.3), 0.05M NaCl, 10 % 글리세롤, 0.5M 이미다졸]에서 용출시켰다. 폴리아크릴 아미드 전기 영동으로 취득한 DksA 단백질의 정제도를 검토한 결과, 95 % 이상이었다.

그 다음 DksA 단백질의 형광 표지를 실시했다. 먼저 DksA 단백질을 플루오르 세인으로 표시했다. 5nmol의 DksA 단백질을 400μl의 50mM NaCl 및 10 % 글리세롤을 포함 25mM HEPES-NaOH 완충액(pH 7.4)에 용해시켰다. 4.3μl의 10mg/ml의 플루오로세인-5- 마레이이미도(Thermo Scientfic 사)/디메틸포름아미드를 상기 용액에 첨가한 후 실온에서 암실에 2 시간 방치했다. 상기 반응 용액은 겔 여과에서 미 결합 플루오르세인을 제거하여 정제되었다. 이 플루오르세인으로 표지된 DksA을 "DksA-Fluorescein"로 명명했다.

그런 다음 DksA을 Alexa488로 분류했다. 5nmol의 DksA 단백질을 400μl의 50mM NaCl 및 10 % 글리세롤을 포함 25mM HEPES-NaOH 완충액(pH 7.4)에 용해시켰다. 6.4μl의 10mg/ml의 Alexa488-5-마레이이미도(invitrogen 사)/디메틸 포름아미드를 상기 용액에 첨가 한 후 실온에서 암실에 2 시간 방치했다. 상기 반응 용액은 겔 여과에서 미 결합의 Alexa488을 제거하여 정제되었다. 이 Alexa488로 표지된 DksA 단백질을 "DksA-Alexa488"로 명명했다.

[실시예 5 : 위상차 형광법에 의한 석면의 현미경 관찰(3)]

피검 물로 온석(백석면)(JAWE111)을 포집한 멤브레인 필터를 이용하고 형광법 단백질로 DksA-Fluorescein(350nM) 또는 DksA-Alexa488(200nM)를 이용하며 버퍼로 버퍼 D [0 .1 M 탄산 완충액(pH9.4), 1.0 % Tween80(등록 상표)]를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 동일한 방법으로 프레파라트를 제작했다.

얻어진 프레파라트를 위상차/형광 현미경(낙사 형광 현미경 BX-60, 올림푸스 사)에서 관찰했다. 첫째, 위상차 현미경으로 관찰하고, 온석 섬유를 확인 한 후, 광로를 형광 모드로 전환하여 동일한 시야를 관찰했다.

도 3은 위상차 형광법에 의한 석면의 현미경 관찰 결과를 나타내는 도면이다. 도 3(A) 는 형광 단백질로 "DksA-Fluorescein"을 이용한 경우의 결과를 나타내고, 도 3(B) 는 형광 단백질로 "DksA-Alexa488"을 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 도 3(A) 와 (B)는 각각 왼쪽 도면이 위상차 현미경 이미지를 나타내고, 오른쪽 도면이 위상차 현미경 사진과 동일 시야에서 관찰한 형광 현미경 이미지를 나타낸다. 도 3과 같이, 위상차 현미경으로 관찰한 온석 섬유에서 형광 현미경으로 형광 단백질의 결합을 확인할 수 있었다.

물질 1은 도 3(A) 와 같이, 위상차 현미경으로 섬유를 확인할 수 있고 형광 현미경으로 형광 단백질의 결합도 확인할 수 있다. 한편, 물질 2는 도 3(A) 와 같이 형광 현미경으로 형광 단백질의 결합을 확인할 수는 있지만 폭(직경)이 0.25μm 이하의 미세한 섬유이기 때문에 일반적으로 위상차 현미경은 석면으로 검출되지 않는다. 위상차 형광법에서는 이러한 미세한 석면 섬유를 위상차 현미경으로 소정의 섬유질 물질을 검출하는 제 1 검출 공정에서 제외하므로 물질 2와 같은 위상차 현미경 석면으로 검색되지 않는 섬유가 마지막으로 발견되는 석면의 총수에 포함될 우려가 없다.

또한, 형광 염료 플루오로 세인과 형광 색소 Alexa488의 관찰에는 U-NIBA 큐브(색선별 거울 : DM505, 여기 필터 : BP470-490, 흡수 필터 : BA515-550)을 사용 하였다. 이미지 캡처는 현미경 디지털 카메라 DP-70(올림푸스 사)를 사용했다.

또한, 실시예 2와 동일한 방법으로 투명화 공정 전후의 섬유의 형광 강도(= 단백질 결합량 + 형광 물질 강도)를 평가 한 결과, "DksA-Fluorescein"는 투명화 공정 이전 형광 강도를 100 %로 했을 경우 투명화 공정을 거친 후 형광 강도가 80 %로 유지되고 있었다. 또한, "DksA-Alexa488"는 투명화 공정 이전 형광 강도를 100 %로 했을 경우 투명화 공정을 거친 후 형광 강도가 80 %로 유지되고 있었다.

이상에서 석면 결합 단백질로서 DksA 단백질을 이용하고 형광 표지로서 플루오르 세인과 Alexa488을 이용함으로써 위상차 형광법에서 온석을 검출 할 수 있는 것으로 확인되었다.

[산업상 이용가능성]

위 설시한 바와 같이, 본 발명에 따른 석면 검출 방법에 의하면, 위상차 현미경/전자 현미경 법 등의 종래의 방법에 의한 석면 검출 기준을 변경하지 않고 위상차 및 현미경 전자 현미경과 비교하여 보다 효율적이고 간편하고, 또한, 높은 정밀도로 석면을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 석면의 검출에 신속성이 요구되는 철거 현장 등의 석면 위험에 대응하는 수단으로서 매우 중요하다.

따라서, 본 발명은 석면을 취급하는 산업, 석면 검출을 행하는 산업 등의 다양한 광범위한 산업에서 이용 가능하다.

<110> Hiroshima University <120> METHOD FOR DETECTION OF ASBESTOS <130> IMP142220 <150> JP 2011-177254 <151> 2011-08-12 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Oligonucleotide <400> 1 gctcagaaaa tcgaatggca cgaacaccac caccaccacc actgaacta 49 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Oligonucleotide <400> 2 ctcgaagatg tcgttcagac cgccaccctc gagtgcggcc gcaagcttgt c 51 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Oligonucleotide <400> 3 catatgcaat atcgcgaaat gctgatc 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Oligonucleotide <400> 4 ggatccaaac aacgtttagc tttggtgcc 29 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Oligonucleotide <400> 5 ggaattcgct agcatgcaag aagggcaaaa ccg 33 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized Oligonucleotide <400> 6 gttggatccc cgcagccagc catctgtttt tcgc 34 <210> 7 <211> 57 <212> PRT <213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 <400> 7 Met Ser Glu Ala Leu Lys Ile Leu Asn Asn Ile Arg Thr Leu Arg Ala 1 5 10 15 Gln Ala Arg Glu Cys Thr Leu Glu Thr Leu Glu Glu Met Leu Glu Lys 20 25 30 Leu Glu Val Val Val Asn Glu Arg Arg Glu Glu Glu Ser Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Glu Val Glu Glu Arg Thr Arg Lys 50 55 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 <400> 8 Gln Tyr Arg Glu Met Leu Ile Ala Asp Gly Ile Asp Pro Asn Glu Leu 1 5 10 15 Leu Asn Ser Leu Ala Ala Val Lys Ser Gly Thr Lys Ala Lys Arg 20 25 30

Claims

피검 물에 형광 표지를 갖는 석면 결합 단백질을 접촉시키는 접촉 공정,
상기 접촉 공정을 거친 후, 상기 피검 물 중에 포함된 길이 5μm 이상, 폭 3μm보다 작고, 길이와 폭의 비율이 3:1 이상인 섬유질 물질을 위상차/형광 현미경을 이용하여 위상차 모드에서 먼저 검출하는 선별 공정, 및
상기 선별 공정에서 검출된 섬유질 물질과 결합하는 석면 결합 단백질을 위상차/형광 현미경을 이용하여 형광 모드에서 검출하고, 상기 석면 결합 단백질이 결합하고 있는 상기 섬유질 물질을 석면으로 판단하는 바이오-형광 검출 공정을 포함하고,
상기 선별 공정과 상기 바이오-형광 검출 공정은 동일한 시야에서 이루어지고,
상기 석면 결합 단백질은 4 개의 H-NS 단백질이 중합하여 형성된 4량체 단백질인 것을 특징으로 하는 석면 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 피 검물은 필터에 포집되어 있으며,
상기 접촉 공정을 거친 후 상기 필터를 투명화하기 위해 투명화 공정을 더 포함하고,
상기 선별 공정을 상기 투명화 공정을 거친 후에 실시하는 것을 특징으로 하는 석면 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 선별 공정 및 상기 바이오-형광 검출 공정을 한 번 이상 반복하는 것을 특징으로 하는 석면 검출 방법.
삭제
제2항에 있어서, 상기 석면 결합 단백질은 상기 투명화 공정을 거친 후 석면에 대한 결합이 유지되는 단백질이며,
상기 형광 표지는 상기 투명화 공정을 거친 후 형광 현미경으로 형광이 검출되는 것임을 특징으로 하는 석면 검출 방법.
삭제
제5항에 있어서,
상기 형광 표지는 Cy3, DyLight488, 플루오르세인, Alexa488, ATTO488, CF488A, DyLight550 및 CF555로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 형광 물질인 것을 특징으로 하는 석면 검출 방법.
삭제
제1항 내지 제3항, 제5항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접촉 공정에서 상기 석면 결합 단백질로서 2 종류 이상의 다른 석면 결합 단백질을 피검 물과 접촉시키고,
상기 2 종류 이상의 다른 석면 결합 단백질은 서로 다른 종류의 석면과 특이적으로 결합하는 단백질이며 서로 다른 파장의 형광을 발하는 형광 표지를 가지는 것을 특징으로 하는 석면 검출 방법.