JP2012100655A - カテコールアミン認識性を指標に選抜した微生物とカテコールアミン含有組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、カテコール骨格を有する化合物を認識し増殖促進する微生物の選抜方法を鋭意開発したことにより見出し、これにより、カテコールアミン等のカテコール骨格を有する化合物を認識し増殖促進する微生物を見出したことによって上記課題を解決した。
【選択図】なし
Description
(1)カテコール骨格を有する化合物によって増殖活性が上昇するLactobacillus plantarum菌株。
(2)前記増殖活性は、1.45mM MgSO4、8.92mM NH4NO3、4.79 mM KCl、3.96mM C6H12O6、2.62mM KH2PO4 および30% ウシ血清を含む培地(pH6.5)において、
L−ドパの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.3倍上昇するか、
ドパミンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.4倍上昇するか、
ノルエピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.5倍上昇するか、
エピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.3倍上昇するか、および
ピロカテコールの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.8倍上昇する、
からなる群より選択される特徴の少なくとも1つの特徴を有する、項目1に記載のLactobacillus plantarum菌株。
(3)前記増殖活性は、1.45mM MgSO4、8.92mM NH4NO3、4.79 mM KCl、3.96mM C6H12O6、2.62mM KH2PO4 および30% ウシ血清を含む培地(pH6.5)において、
L−ドパの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも3.7倍上昇するか、
ドパミンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも2.4倍上昇するか、
ノルエピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも4.1倍上昇するか、
エピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも4.0倍上昇するか、および
ピロカテコールの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも6.3倍上昇する、
からなる群より選択される特徴の少なくとも1つの特徴を有する、項目1または2に記載のLactobacillus plantarum菌株。
(4)前記化合物は、カテコールアミンを含む、項目1〜3のいずれか1項に記載の菌株。
(5)前記化合物が、ピロカテコールまたはその塩、(−)−エピネフリン(アドレナリン)またはその塩、L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)またはその塩、3,4−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン(L−ドパ)またはその塩、およびドパミンまたはその塩、ドブタミンまたはその塩、(−)−イソプロテレノールまたはその塩、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸またはその塩、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸またはその塩、塩酸(R)−(+)−1−フェニル−2,3,4,5−テトラヒドロ−(1H)3−ベンゾアゼピン−7,8−ジオール、塩酸cis−(±)−1−(アミノメチル)−3,4−ジヒドロ−3−フェニル−1H−2−ベンゾピラン−5,6−ジオール、臭化水素酸4−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−4,5,6,7−テトラヒドロ−チエノ[2,3−c]ピリジン、一臭化水素酸6−クロロ−2,3,4,5−テトラヒドロ−1−(4−ヒドロキシフェニル)−1H−3−ベンゾアゼピン−7,8−ジオール、臭化水素酸(±)−6−クロロ−7,8−ジヒドロキシ−1−フェニル−2,3,4,5−テトラヒドロ−1H−3−ベンゾアゼピン、臭化水素酸R(−)−2,10,11−トリヒドロキシ−N−プロピル−ノルアポルフィン水和物、塩酸R(−)−プロピルノルアポモルフィン、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸および3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸ならびにそれらの溶媒和物からなる群より選択される少なくとも1つを含む項目1〜5のいずれか1項に記載の菌株。
(6)前記化合物が、ピロカテコール、(−)−エピネフリン(アドレナリン)、(+)−酒石酸水素(−)−エピネフリン(アドレナリン)、塩酸(−)−エピネフリン(アドレナリン)、L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、(+)−酒石酸水素L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)一水和物、L−ドパ、塩酸ドパミン、塩酸ドブタミン、塩酸(−)−イソプロテレノール、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸および3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸からなる群より選択される、項目1〜5のいずれか1項に記載の菌株。
(7)前記化合物がドパミンまたはその塩である、項目1〜6のいずれか1項に記載の菌株。
(8)前記菌株は、Lactobacillus plantarum TO1000、TO1001、TO1002またはTO1003(受託番号NITE P−958、NITE P−959、NITE P−960またはNITE P−961)である項目1〜7のいずれか1項に記載の菌株。
(9)カテコール骨格を有する化合物を含む、Lactobacillus plantarum菌株の増殖のための組成物。
(10)前記化合物がカテコールアミンである、項目9に記載の組成物。
(11)前記化合物が、ピロカテコールまたはその塩、(−)−エピネフリン(アドレナリン)またはその塩、L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)またはその塩、3,4−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン(L−ドパ)またはその塩、およびドパミンまたはその塩、ドブタミンまたはその塩、(−)−イソプロテレノールまたはその塩、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸またはその塩、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸またはその塩、塩酸(R)−(+)−1−フェニル−2,3,4,5−テトラヒドロ−(1H)3−ベンゾアゼピン−7,8−ジオール、塩酸cis−(±)−1−(アミノメチル)−3,4−ジヒドロ−3−フェニル−1H−2−ベンゾピラン−5,6−ジオール、臭化水素酸4−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−4,5,6,7−テトラヒドロ−チエノ[2,3−c]ピリジン、一臭化水素酸6−クロロ−2,3,4,5−テトラヒドロ−1−(4−ヒドロキシフェニル)−1H−3−ベンゾアゼピン−7,8−ジオール、臭化水素酸(±)−6−クロロ−7,8−ジヒドロキシ−1−フェニル−2,3,4,5−テトラヒドロ−1H−3−ベンゾアゼピン、臭化水素酸R(−)−2,10,11−トリヒドロキシ−N−プロピル−ノルアポルフィン水和物、塩酸R(−)−プロピルノルアポモルフィン、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸および3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸ならびにそれらの溶媒和物からなる群より選択される少なくとも1つを含む項目9または10に記載の組成物。
(12)前記化合物が、ピロカテコール、(−)−エピネフリン(アドレナリン)、(+)−酒石酸水素(−)−エピネフリン(アドレナリン)、塩酸(−)−エピネフリン(アドレナリン)、L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、(+)−酒石酸水素L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)一水和物、塩酸ドパミン、塩酸ドブタミン、塩酸(−)−イソプロテレノール、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸および3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸からなる群より選択される、項目9〜11のいずれか1項に記載の組成物。
(13)前記化合物がドパミンまたはその塩である、項目9〜12のいずれか1項に記載の組成物。
(14)前記菌株は、Lactobacillus plantarum TO1000、TO1001、TO1002またはTO1003(受領番号NITE P−958、NITE P−959、NITE P−960またはNITE P−961)である、項目9〜13のいずれか1項に記載の組成物。
(15)項目1〜8のいずれか1項に記載の菌株を含むプロバイオティクス。
(16)項目1〜8のいずれか1項に記載の菌株とカテコール骨格を有する化合物とを組み合わせたシンバイオティクス。
(17)前記化合物は、体内で存在する場合に前記菌株の1×106コロニー形成単位(cfu)あたり少なくとも5μMで含まれる項目16に記載のシンバイオティクス。
(18)項目1〜8のいずれか1項に記載の菌株と組み合わせて使用するための、カテコール骨格を有する化合物を含むプレバイオティクス。
(19)項目1〜8のいずれか1項に記載の菌株または項目9〜14のいずれか1項に記載の組成物あるいはその両方、あるいは項目15に記載のプロバイオティクス、項目16または17に記載のシンバイオティクス、項目18に記載のプレバイオティクス、あるいはこれらの2以上を含む添加剤。
(20)前記添加剤は、稲サイレージ用である、項目19に記載の添加剤。
(21)項目1〜8のいずれか1項に記載の菌株または項目9〜14のいずれか1項に記載の組成物あるいはその両方、あるいは項目15に記載のプロバイオティクス、項目16または17に記載のシンバイオティクス、項目18に記載のプレバイオティクス、あるいはこれらの2以上を含む食品。
(22)項目1〜8のいずれか1項に記載の菌株または項目9〜14のいずれか1項に記載の組成物あるいはその両方、あるいは項目15に記載のプロバイオティクス、項目16または17に記載のシンバイオティクス、項目18に記載のプレバイオティクス、あるいはこれらの2以上を含む医薬。
(23)項目1〜8のいずれか1項に記載の菌株または項目9〜14のいずれか1項に記載の組成物あるいはその両方、あるいは項目15に記載のプロバイオティクス、項目16または17に記載のシンバイオティクス、項目18に記載のプレバイオティクス、あるいはこれらの2以上を含む飼料。
(24)カテコール骨格を有する化合物によって増殖活性が上昇するLactobacillus plantarum菌株を選択する方法であって、該方法は、
A)Lactobacillus plantarum菌を含む試料を提供する提供工程;
B)硫酸マグネシウム(MgSO4)、硝酸アンモニウム(NH4NO3)、塩化カリウム(KCl)、D−(+)−グルコース、リン酸二水素カリウム(KH2PO4)およびウシ血清を含む培地中で、カテコール骨格を有する化合物の存在下または不存在下で該試料を培養する培養工程;および
C)該化合物の不存在下で増殖せず、かつ、存在下において増殖したか、または該化合物の存在下において不存在下よりも増殖が促進された菌株を分離する分離工程
を包含する、方法。
(25)前記硫酸マグネシウムは、1.16〜1.74mM、前記硝酸アンモニウムは、8.02〜9.81mM、前記塩化カリウムは、3.83〜5.74mM、前記D−(+)−グルコースは3.96〜39.64mM、前記リン酸二水素カリウムは、2.09〜3.14mM、および前記ウシ血清は15〜30%で前記培地中に存在し、前記培地はpHが6.0〜7.0である、項目24に記載の方法。
(26)前記培養工程は、32〜48時間実施される、項目24または25に記載の方法。
(27)前記培養工程は、25〜40℃で実施される、項目24〜26のいずれか1項に記載の方法。
(28)前記培養工程は、0〜5%CO2、および1〜20%O2の条件下で実施される、項目24〜227のいずれか1項に記載の方法。
(29)前記試料は、5×105〜5×106コロニー形成単位/wellの間で前記Lactobacillus plantarum菌を含む、項目24〜28のいずれか1項に記載の方法。
また、乳酸菌増殖促進作用を有する機能性成分として、これまで難消化性糖質が報告されており、いわゆるプレバイオティクスとして数多く商品化されている。本発明は、これらの技術に応用することができる。
本明細書において、必要に応じて、以下の略語を用いる。
L. plantarum:Lactobacillus plantarum
以下に本明細書において用いられる各用語の意味を説明する。各用語は本明細書中、統一した意味で使用し、単独で用いられる場合も、または他の用語と組み合わされて用いられる場合も、同一の意味で用いられる。
・16S rRNA遺伝子配列の配列解析により、L.plantarum基準株(例えば、JCM1149T株)の16S rRNA配列(DDBJ/EMBL/GenBank accession number,X52653)と例えば99%などの高い相同性を示すこと
・CLUSTALX等によるアライメント解析後のMEGA等による系統樹解析により、L.plantarum基準株と系統学的に近縁な位置関係が認められること
・recA遺伝子を標的にしたmultiplex PCR法により、recAのPCR増幅産物がL.plantarum基準株の同増副産物と同じ電気泳動パターンを示すこと。
19)も参照)。
plantarum菌株について言及する場合、その菌株の増殖のための組成物を意味する。本発明では、代表的に、カテコール骨格を有する化合物が含まれ、代謝等によってカテコール骨格を有する化合物を生じる化合物・複合物等の物質もまた、増殖のための組成物の成分として、実質的にカテコール骨格を有する化合物に加えてまたは代替的に使用することができることが理解される。
本発明の好ましい実施形態を、以下に掲げる。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
L−ドパの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.3倍上昇するか、
ドパミンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.4倍上昇するか、
ノルエピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.5倍上昇するか、
エピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.3倍上昇するか、または
ピロカテコールの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.8倍上昇する。
L−ドパの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも3.7倍上昇するか、
ドパミンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも2.4倍上昇するか、
ノルエピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも4.1倍上昇するか、
エピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも4.0倍上昇するか、または
ピロカテコールの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも6.3倍上昇する。
Detroit, USA)に塗布し、48時間培養する(30℃、嫌気条件下)。培養後、形成されたコロニーを純粋培養し、使用時まで10%グリセロールを含むnutrient broth (Difco)中で−80℃保存することができる。
リン酸二水素カリウム(KH2PO4)、和光純薬工業株式会社(試薬特級、169−04245)
硝酸アンモニウム(NH4NO3)、和光純薬工業株式会社(試薬特級、017−03235)
塩化カリウム(KCl)、和光純薬工業株式会社(試薬特級、163−03545)
硫酸マグネシウム七水和物、和光純薬工業株式会社(試薬特級、131−00405)
ウシ血清(Bovine serum),成体(Adult)、Sigma(B5433)。
本明細書において用いられる生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、以下を挙げることができる。「プロバイオティクス・プレバイオティクス・バイオジェニックス」(財団法人日本ビフィズス菌センター監修、光岡知足編集);「標準微生物学」(医学書院、山西弘一監修、平松啓一・中込治編集);「乳酸菌実験マニュアル −分離から同定まで−」(朝倉書店、小崎道雄監修、内村泰・岡田早苗著);「プロバイオティクスとバイオジェニクス 科学的根拠と今後の開発展望」(株式会社NTS、伊藤喜久治編集代表);「乳酸菌の保健機能と応用」(シーエムシー出版、上野川修一監修);Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, Fourth Edition(Crc Pr I Llc、Seppo Salminen);Handbook of Probiotics and Prebiotics(Wiley−Interscience、Seppo Salminen)およびHandbook of Probiotics(Wiley−Interscience、Yuan−Kun, Koji Nomoto, Seppo Salminen, Sherwood L. Gorbach)。
本実施例では、カテコールアミン等のカテコール骨格を有する化合物を認識する微生物の新規選抜法を開発した。
(カテコールアミン認識等のカテコール骨格を有する化合物を認識する微生物の新規選抜法)
1.新規培地
MgSO4、NH4NO3、KCl、C6H12O6、KH2PO4、ウシ血清(bovine serum)を成分とするNo.189−091201培地を開発した。本培地に含まれる各成分は、好ましくは以下の濃度およびpHで調製する(1.45mM MgSO4、8.92mM NH4NO3、4.79 mM KCl、3.96mM C6H12O6、2.62mM KH2PO4 および30% ウシ血清を含む。pH6.5)。
D(+)−グルコース(C6H12O6)、和光純薬工業株式会社(試薬特級、041−00595)
リン酸二水素カリウム(KH2PO4)、和光純薬工業株式会社(試薬特級、169−04245)
硝酸アンモニウム(NH4NO3)、和光純薬工業株式会社(試薬特級、017−03235)
塩化カリウム(KCl)、和光純薬工業株式会社(試薬特級、163−03545)
硫酸マグネシウム七水和物、和光純薬工業株式会社(試薬特級、131−00405)
ウシ血清(Bovine serum),成体(Adult)、Sigma(B5433)
本実施例の培地の組成は、本実施例で新たに調製したものであり、微生物用培地(例えば、大腸菌用LB培地、乳酸菌用MRS培地など)で汎用されている酵母抽出物などの微生物由来成分を一切含まないため、培養に供した微生物以外の微生物成分について、培地中への汚染を防止することが期待される。これにより、培養に供した微生物の性能・性質について、他の微生物由来成分汚染による誤認を防ぐことが強く期待できる。
供試微生物を適切な培地(例えばL. plantarum TO1000であれば、MRS培地や上述のNo.189−091201培地)で前培養し、充分に増殖させた。菌体を遠心操作により集菌後、培地上清を除去し、新鮮なPBSあるいは培地で数回、充分に遠心洗浄した。No.189−091201培地に菌体を再懸濁し、各供試カテコールアミン化合物とともに、24穴プレートで嫌気条件下(5% CO2、1% O2)あるいは好気条件下(5% CO2、20% O2)により培養した(供試微生物の菌数を約1×106 CFU/wellとなるように調整した。CFUはコロニー形成単位)。約36時間培養し、菌体の増殖をコロニー形成数、培養液濁度(OD600)あるいは培養液pH測定等により分析した。
得られた菌株は、Lactobacillus plantarum TO1000、TO1001、TO1002またはTO1003(受託番号NITE P−958、NITE P−959、NITE P−960またはNITE P−961)として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に寄託された。
本実施例から、期待できる本選抜法の有用性は以下のとおりである。本研究で発明した選抜技術により、様々な環境由来の微生物のスクリーニングが可能である。例えば、ヒトや家畜糞便由来のプロバイオティック乳酸菌について、ストレス認知時に生体から放出されるカテコールアミンの認識性を指標として選抜することにより、宿主由来である安全性が担保され、将来的に、ストレス認知時に有害微生物を積極的に競合排除しながら消化管環境を維持する機能性食品や飼料の開発が期待できる。食品残さ、サイレージ、発酵TMRには、「食品・植物由来カテコールアミン」も含まれることから、これらの素材を有効利用した家畜発酵飼料を調製する場合に、本選抜技術により選抜された乳酸菌が「飼料調製用乳酸菌添加物」としての有効活用されることが期待できる。さらに、糞便由来の大腸菌等の有害微生物の選抜した場合は、ストレス認知時に急激に増殖する有害微生物を特定することに繋がり、当該微生物に対する殺菌・静菌効果を期待した創薬にも資することが期待される。
本実施例で供試した微生物は牧草サイレージ由来乳酸菌であるL. plantarumであり、家畜飼料用の発酵貯蔵飼料より頻繁に分離される菌種として既に多数の報告がある(Rossi F. & Dellaglio F., Journal of Applied Microbiology (2007)Vol.103, 1707−1715; Ennahar S. et al., Applied and Environmental Microbiology (2003)Vol.69, 444−451; Stevenson D−M., et al., Applied microbiology and biotechnology (2006)Vol.71, 329−338など)。いずれの場合も、各飼料の懸濁液から、乳酸菌用培地により容易かつ頻繁に分離されている。容易に分離されている菌種であるが、カテコールアミン認識性については周知の事実ではなく、本実施例の選抜法により、広くL. plantarumなどの乳酸菌株の、カテコール骨格を有する化合物等のカテコールアミン認識性について評価可能であると考えられる。
次に実施例1で分離した菌株について、カテコール骨格を有する化合物の代表格であるカテコールアミンについてその認識能力の実験を行った。
(供試乳酸菌株)
チモシー・オーチャードグラス混播牧草サイレージより分離したL. plantarum TO1000、TO1001、TO1002およびTO1003と、JCM1149Tを供試した。
1.45mM MgSO4、8.92mM NH4NO3、4.79 mM KCl、3.96mM C6H12O6、2.62mM KH2PO4および30%成体ウシ血清(Adult bovine serum)を含む培地を開発し、好気(5%CO2、20%O2)および嫌気(5%CO2、1%O2)条件下で培養した。
本実施例で供試した神経伝達物質および関連化合物(L−チロシン(a),3,4−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン(L−ドパ)(b),ドパミンヒドロクロリド(c),(−)−エピネフリン(アドレナリン)(d),(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)(e),(+)−酒石酸水素(−)−エピネフリン塩(f),(+)−酒石酸水素L−(−)−ノルエピネフリン塩1水和物(g))を以下に示した(図1にも示す。)。
すべての実験を3連で実施し、独立した実験として3−9回繰り返した。GraphPad PRISM(Prism software, CA, USA)により、得られたすべてのデータを統計解析した。
エピネフリン添加(嫌気条件、36時間培養)により、100μMを最大活性とする用量依存的なL. plantarum TO1002の増殖が認められた(図2A)。100μMエピネフリンの添加により、24時間後から顕著なL. plantarum TO1002の増殖と培養液のpH低下が認められた(図2B,C)。これらの増殖促進はコロニー計数法でも確認された(図2D)。
本実施例では、ピロカテコールおよび人工合成カテコールアミン作動薬(アゴニスト)について、増殖因子であるかどうか試験した。
(供試乳酸菌株)
チモシー・オーチャードグラス混播牧草サイレージより分離したL. plantarum TO1002を供試した。
1.45mM MgSO4、8.92mM NH4NO3、4.79 mM KCl、3.96mM C6H12O6、2.62mM KH2PO4および30%成体ウシ血清(Adult bovine serum)を含むNo.189−091201培地を用い、嫌気(5%CO2、1%O2)条件下で培養した。
本実施例で供試した神経伝達物質および関連化合物(ピロカテコール(A),ドブタミンヒドロクロリド(B),(−)−イソプロテレノールヒドロクロリド(C))を以下に示した(図6にも示す。)。
すべての実験を3連で実施し、独立した実験として3−9回繰り返した。GraphPad PRISM (Prism software, CA, USA)により、得られたすべてのデータを統計解析した。
生体内で合成されない人工合成作動薬であるドブタミンおよびイソプロテレノールにも同様の増殖促進活性が認められた(図7A,B)。生体カテコールアミン(実施例2を参照)のみならず、人工合成カテコールアミン作動薬においてもL. plantarum TO1002株に対する増殖促進活性が認められたことから、本活性がカテコール骨格を有する化合物の中でも、少なくとも「カテコール環(1,2−ジヒドロキシベンゼン)およびエチルアミン構造をもった化合物」と総称されるカテコールアミンにおいて増殖促進活性が共通することが明らかになった。
本実施例では、本発明の菌株の生理・生化学的性状を調べた。
チモシー・オーチャードグラス混播牧草サイレージより以下の方法に従って分離した。チモシー・オーチャードグラス混播牧草サイレージを滅菌水で充分にホモジナイズし(1:10 w/v)、サイレージ懸濁液上清を滅菌水で段階希釈後、Man Rogosa Sharpe(MRS)寒天培地(Difco, Detroit, USA)に塗布し、48 時間培養した(30℃、嫌気条件下)。培養後、形成されたコロニーを純粋培養し、使用時まで10%グリセロールを含む栄養ブロス(nutrient broth)(Difco)中で−80℃保存した。
上述の方法で分離された菌株のうち、本実施例で供試した菌株をTO1000、T1001、TO1002およびTO1003とした。16S rRNA遺伝子配列解析により、TO1000、T1001、TO1002およびTO1003のL. plantarum基準株に対する相同性は、すべて99.5%以上であった。グラム染色法による形態学的解析より、これら4菌株はすべてグラム陽性菌であり、桿菌の形態を示すことが認められた(図9および表1)。また、カタラーゼ陰性であり、発酵形式はホモ型発酵であった(表1)。生育温度の検討により、10℃、15℃、30℃および45℃において増殖が認められたが、50℃での生育は認められなかった(表1)。また、生育pH試験により、pH3.5から6.0までのpH領域で生育性が認められ、低pH領域での生存耐性が確認された(表1)。
paraF(5’−GTCACAGGCATTACGAAAAC−3’(配列番号1))、
pentF(5’−CAGTGGCGCGGTTGATATC−3’(配列番号2))、planF(5’−CCGTTTATGCGGAACACCTA−3’(配列番号3))および
pREV(5’−TCGGGATTACCAAACATCAC−3’(配列番号4))
である。それぞれのプライマー終濃度は以下の通りである:0.25μM paraF、0.25μM pentF、0.12μM planFおよび0.25μM pREV。上述したPCR反応液を以下のPCRサイクルに供した:94℃ 3分(1サイクル);94℃ 5秒、56℃ 5秒、72℃ 10秒(35サイクル);72℃ 1分30秒(1サイクル)。PCR反応終了後、2.0%アガロースゲル上にて電気泳動した。エチジウムブロマイドによりゲルを染色し、電気泳動結果を得た。
本実施例では、カテコール骨格を含むカテコールアミン代謝産物について調査した。 また、カテコール骨格を含むカテコールアミン代謝産物の具体例としては、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸(DHMA)および3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸(DOPAC)があり(これらはいずれもSigma−Aldrichなどから入手可能。)、これらを試験した。試験手法としては、実施例1〜3に記載の手法に基づき行なった。その結果を図11に示す。図11に示すように、カテコール骨格を含むカテコールアミン代謝産物でも、同様に、本発明のL.plantarumの増殖活性が認められた。
本実施例では、実施例1〜3で実施したカテコール骨格を含有する化合物について、別の塩について調査した。具体的には、エピネフリン酒石酸水素塩あるいはノルエピネフリン酒石酸水素塩のほか、エピネフリンあるいはノルエピネフリン塩酸塩を試験した。試験手法としては、実施例1〜3に記載の手法に基づき行なった。その結果、図12に示すように、カテコール骨格含有化合物が別の塩(酒石酸水素塩に加えて、塩酸塩)でも、同様に、本発明のL. plantarumの増殖活性が認められた。したがって、塩が重要なのではなく、カテコール骨格を有することが、本発明のL. plantarumの増殖活性において役割を果たすことが理解される。
本実施例では、実施例1〜3で実施した化合物のD体についても活性があるか調査した。具体的にはドパ、エピネフリンおよびノルエピネフリンのD体、L体およびDL体の活性を調査した。D体としては、3,4−ジヒドロキシ−D−フェニルアラニン,D−(−)−エピネフリン(D−アドレナリン),D−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)などを試験した。試験手法としては、実施例1〜3に記載の手法に基づき行なった。すなわち、異なる光学異性体のドパ、エピネフリンおよびノルエネフリンのLactobacillus plantarum TO1002株に対する増殖促進活性を測定した。TO1002株を無添加培地、あるいは、それぞれ1,10または100(μM)のDL-,L-,D-ドパ(A),DL-,L-,D-エピネフリン(B),DL-,L-,D-ノルエピネフリン(C)を含むNo.189−091201培地<1.45mM MgSO4、8.92mM NH4NO3、4.79 mM KCl、3.96mM C6H12O6、2.62mM KH2PO4 および30%ウシ血清(bovine serum)、pH6.5)>中で36時間,37℃,嫌気条件下で培養し,培養後の培養液の濁度を測定した。
本実施例では、別の供試菌株について同様の実験を行なった。
本実施例では、N-オレオイルドーパミン(ODA)、N−アラキドノイルドーパミン(NADA)、塩酸(R)−(+)−1−フェニル−2,3,4,5−テトラヒドロ−(1H)3−ベンゾアゼピン−7,8−ジオール(SKF−38393)、塩酸cis−(±)−1−(アミノメチル)−3,4−ジヒドロ−3−フェニル−1H−2−ベンゾピラン−5,6−ジオール(A−68930)、臭化水素酸4−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−4,5,6,7−テトラヒドロ−チエノ[2,3−c]ピリジン(SKF−89626)、一臭化水素酸6−クロロ−2,3,4,5−テトラヒドロ−1−(4−ヒドロキシフェニル)−1H−3−ベンゾアゼピン−7,8−ジオール(Fenoldopam)、臭化水素酸(±)−6−クロロ−7,8−ジヒドロキシ−1−フェニル−2,3,4,5−テトラヒドロ−1H−3−ベンゾアゼピン(6−Chloro−PB)、臭化水素酸R(−)−2,10,11−トリヒドロキシ−N−プロピル−ノルアポルフィン水和物(2,10,11−Trihydroxy−N−propyl−noraporphine)、塩酸R(−)−プロピルノルアポモルフィン(Propylnorapomorphine)のLactobacillus plantarum TO1002株に対する活性を試験した。
試験方法は、実施例1〜3のものに準じた。
図15および16に示すように、追加の例についても、実施例1〜3に示したのと同様の活性を有するものが取得できたことが判明した。
なおデータは示さないが、カテコール骨格とは異なるが類似する骨格を有するα−[(tert−ブチルアミノ)メチル]−4−ヒドロキシ−m−キシレン−α,α’−ジオール(通称:サルブタモール)およびキシナホ酸(±)4−ヒドロキシ−a1−[[[6−(4−フェニルブトキシ)ヘキシル]アミノ]m−エチル]−1,3−ベンゼンジメタノール(通称:サルメテロール)は、有意な活性が認められなかった。したがって、本発明の増殖促進活性は、カテコール骨格に拠るところが大きいことが明らかになった。
本実施例では、各菌株をより特徴付けるため、増殖活性は、1.45mM MgSO4、8.92mM NH4NO3、4.79 mM KCl、3.96mM C6H12O6、2.62mM KH2PO4 および30% ウシ血清を含む培地(pH6.5)における増殖活性の変化を計算した。実施例1〜3と同様の実験を行なってその結果を、以下のような計算を行なった。
ドパミンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも2.4倍上昇するか、または
ノルエピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも4.1倍上昇するか、または
エピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも4.0倍上昇するか、または
ピロカテコールの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも6.3倍上昇する。
L−ドパの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.3倍上昇するか、または
ドパミンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.4倍上昇するか、または
ノルエピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.5倍上昇するか、またはエピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.3倍上昇するか、または
ピロカテコールの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.8倍上昇する。
本発明により同定した、化合物について、常法により次の組成からなる錠剤を製造する。本発明の成分は、菌株の場合は、乾燥させて菌株末とする。カテコール骨格を有する化合物の場合は、一般の低分子化合物と同様に調製する。これらの錠剤は、例えば、本発明菌株を用いた発酵食品等と別途、併用処方することができる。
本発明の成分 100mg
乳 糖 60mg
馬鈴薯でんぷん 30mg
ポリビニルアルコール 2mg
ステアリン酸マグネシウム 1mg
タール色素 微量。
本発明により同定した、化合物について、常法により次の組成からなる散剤を製造する。本発明の成分は、菌株の場合は、乾燥させて菌株末とする。カテコール骨格を有する化合物の場合は、一般の低分子化合物と同様に調製する。これらの散剤は、例えば、本発明菌株を用いた発酵食品等と別途、併用処方することができる。
本発明の成分 150mg
乳 糖 280mg。
本発明により同定した、化合物について、常法により次の組成からなるシロップ剤を製造する。本発明の成分は、菌株の場合は、乾燥させて菌株末とする。カテコール骨格を有する化合物の場合は、一般の低分子化合物と同様に調製する。これらのシロップ剤は、例えば、本発明菌株を用いた発酵食品等と別途、併用処方することができる。
本発明の成分 100mg
精製白糖 40 g
p−ヒドロキシ安息香酸エチル 40mg
p−ヒドロキシ安息香酸プロピル 10mg
チョコフレーバー 0.1cc
これに水を加えて全量100ccとする。
本発明により同定した、プロバイオティック乳酸菌について、常法により次の組成からなるはっ酵乳を製造する。本発明の菌株は、ヨーグルト発酵スターターと同時に添加することで、共発酵とする。乳酸菌スターターとしては、特に限定されなく、通常ヨーグルトの発酵に使用するものを用いることができる。
本発明の菌株 10kg
乳酸菌スターター 20kg
還元乳 800kg
糖類 10kg
安定剤 1kg。
本発明により同定した、プロバイオティック乳酸菌について、常法により次の組成からなる家畜貯蔵発酵飼料を製造する。本発明の菌株を、例えば、飼料作物・牧草・食品副産物に添加し、常法のロールベール法等の保存処理を実施する。飼料作物・牧草・食品副産物としては、特に限定されなく、通常家畜飼料に使用するものを用いることができる。本発明の菌株の場合は、乾燥させて菌株末とし、使用する際に50gを10Lの水に溶解させ、飼料作物・牧草・食品副産物にスプレーする。
本発明の菌株 50 g
調合水 10kg
飼料作物・牧草・食品副産物 10 t。
本発明により同定した、プロバイオティック乳酸菌について、常法により次の組成からなるはっ酵乳を製造する。本発明の菌株は、ヨーグルト発酵スターターと同時に添加することで、共発酵とする。乳酸菌スターターとしては、特に限定されなく、通常ヨーグルトの発酵に使用するものを用いることができる。カテコール骨格を有する化合物の場合は、一般の低分子化合物と同様に調製する。
本発明の菌株 10kg
本発明の化合物 10kg
乳酸菌スターター 20kg
還元乳 800kg
糖類 10kg
安定剤 1kg。
本発明により同定した、プロバイオティック乳酸菌について、常法により次の組成からなる家畜貯蔵発酵飼料を製造する。本発明の菌株を、例えば、飼料作物・牧草・食品副産物に添加し、常法のロールベール法等の保存処理を実施する。飼料作物・牧草・食品副産物としては、特に限定されなく、通常家畜飼料に使用するものを用いることができる。本発明の菌株の場合は、乾燥させて菌株末とし、使用する際に50gを本発明の化合物50gと同時に10Lの水に溶解させ、飼料作物・牧草・食品副産物にスプレーする。カテコール骨格を有する化合物の場合は、一般の低分子化合物と同様に調製する。
本発明の菌株 50 g
本発明の化合物 50 g
調合水 10kg
飼料作物・牧草・食品副産物 10 t。
本実施例では、本発明の成分を飼料添加物として利用して実施した例を記載する。
飼料用稲を収穫後、カッターにより約10cmに細切し、サイレージ調製用材料とした。サイレージの処理区には無添加区および各乳酸菌添加区を設け、乳酸菌は原料草1gあたり105菌数(CFU)添加した。サイレージは小規模発酵試験法により調製した。すなわち、細切した飼料用稲100gをポリフレックスバッグ(登録商標)(飛竜 N−9、旭化成パックス株式会社、東京)に入れ、業務用卓上密封包装機(SQ−202、シャープ株式会社、大阪)により脱気と密封を行い、15〜25℃の室温で貯蔵した。
以下に、結果を纏めた表を示す。
配列番号2:pentF 5’−CAGTGGCGCGGTTGATATC−3’
配列番号3:planF 5’−CCGTTTATGCGGAACACCTA−3’
配列番号4:pREV 5’−TCGGGATTACCAAACATCAC−3’
NITE P−959
NITE P−960
NITE P−961
Claims (29)
- カテコール骨格を有する化合物によって増殖活性が上昇するLactobacillus plantarum菌株。
- 前記増殖活性は、1.45mM MgSO4、8.92mM NH4NO3、4.79 mM KCl、3.96mM C6H12O6、2.62mM KH2PO4 および30% ウシ血清を含む培地(pH6.5)において、
L−ドパの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.3倍上昇するか、
ドパミンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.4倍上昇するか、
ノルエピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.5倍上昇するか、
エピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.3倍上昇するか、および
ピロカテコールの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも1.8倍上昇する、
からなる群より選択される特徴の少なくとも1つの特徴を有する、請求項1に記載のLactobacillus plantarum菌株。 - 前記増殖活性は、1.45mM MgSO4、8.92mM NH4NO3、4.79 mM KCl、3.96mM C6H12O6、2.62mM KH2PO4 および30% ウシ血清を含む培地(pH6.5)において、
L−ドパの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも3.7倍上昇するか、
ドパミンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも2.4倍上昇するか、
ノルエピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも4.1倍上昇するか、
エピネフリンの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも4.0倍上昇するか、および
ピロカテコールの非存在下に比べて100μMの該化合物の存在下で、少なくとも6.3倍上昇する、
からなる群より選択される特徴の少なくとも1つの特徴を有する、請求項1に記載のLactobacillus plantarum菌株。 - 前記化合物は、カテコールアミンを含む、請求項1に記載の菌株。
- 前記化合物が、ピロカテコールまたはその塩、(−)−エピネフリン(アドレナリン)またはその塩、L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)またはその塩、3,4−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン(L−ドパ)またはその塩、およびドパミンまたはその塩、ドブタミンまたはその塩、(−)−イソプロテレノールまたはその塩、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸またはその塩、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸またはその塩、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸またはその塩、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸またはその塩、塩酸(R)−(+)−1−フェニル−2,3,4,5−テトラヒドロ−(1H)3−ベンゾアゼピン−7,8−ジオール、塩酸cis−(±)−1−(アミノメチル)−3,4−ジヒドロ−3−フェニル−1H−2−ベンゾピラン−5,6−ジオール、臭化水素酸4−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−4,5,6,7−テトラヒドロ−チエノ[2,3−c]ピリジン、一臭化水素酸6−クロロ−2,3,4,5−テトラヒドロ−1−(4−ヒドロキシフェニル)−1H−3−ベンゾアゼピン−7,8−ジオール、臭化水素酸(±)−6−クロロ−7,8−ジヒドロキシ−1−フェニル−2,3,4,5−テトラヒドロ−1H−3−ベンゾアゼピン、臭化水素酸R(−)−2,10,11−トリヒドロキシ−N−プロピル−ノルアポルフィン水和物、塩酸R(−)−プロピルノルアポモルフィン、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸および3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸ならびにそれらの溶媒和物からなる群より選択される少なくとも1つを含む請求項1に記載の菌株。
- 前記化合物が、ピロカテコール、(−)−エピネフリン(アドレナリン)、(+)−酒石酸水素(−)−エピネフリン(アドレナリン)、塩酸(−)−エピネフリン(アドレナリン)、L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、(+)−酒石酸水素L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)一水和物、L−ドパ、塩酸ドパミン、塩酸ドブタミン、塩酸(−)−イソプロテレノール、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸および3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸からなる群より選択される、請求項1に記載の菌株。
- 前記化合物がドパミンまたはその塩である、請求項1に記載の菌株。
- 前記菌株は、Lactobacillus plantarum TO1000、TO1001、TO1002またはTO1003(受託番号NITE P−958、NITE P−959、NITE P−960またはNITE P−961)である請求項1に記載の菌株。
- カテコール骨格を有する化合物を含む、Lactobacillus plantarum菌株の増殖のための組成物。
- 前記化合物がカテコールアミンである、請求項9に記載の組成物。
- 前記化合物が、ピロカテコールまたはその塩、(−)−エピネフリン(アドレナリン)またはその塩、L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)またはその塩、3,4−ジヒドロキシ−L−フェニルアラニン(L−ドパ)またはその塩、およびドパミンまたはその塩、ドブタミンまたはその塩、(−)−イソプロテレノールまたはその塩、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸またはその塩、3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸またはその塩、塩酸(R)−(+)−1−フェニル−2,3,4,5−テトラヒドロ−(1H)3−ベンゾアゼピン−7,8−ジオール、塩酸cis−(±)−1−(アミノメチル)−3,4−ジヒドロ−3−フェニル−1H−2−ベンゾピラン−5,6−ジオール、臭化水素酸4−(3,4−ジヒドロキシフェニル)−4,5,6,7−テトラヒドロ−チエノ[2,3−c]ピリジン、一臭化水素酸6−クロロ−2,3,4,5−テトラヒドロ−1−(4−ヒドロキシフェニル)−1H−3−ベンゾアゼピン−7,8−ジオール、臭化水素酸(±)−6−クロロ−7,8−ジヒドロキシ−1−フェニル−2,3,4,5−テトラヒドロ−1H−3−ベンゾアゼピン、臭化水素酸R(−)−2,10,11−トリヒドロキシ−N−プロピル−ノルアポルフィン水和物、塩酸R(−)−プロピルノルアポモルフィン、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸および3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸ならびにそれらの溶媒和物からなる群より選択される少なくとも1つを含む請求項9に記載の組成物。
- 前記化合物が、ピロカテコール、(−)−エピネフリン(アドレナリン)、(+)−酒石酸水素(−)−エピネフリン(アドレナリン)、塩酸(−)−エピネフリン(アドレナリン)、L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)、(+)−酒石酸水素L−(−)−ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)一水和物、塩酸ドパミン、塩酸ドブタミン、塩酸(−)−イソプロテレノール、DL−3,4−ジヒドロキシマンデル酸および3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸からなる群より選択される、請求項9に記載の組成物。
- 前記化合物がドパミンまたはその塩である、請求項9に記載の組成物。
- 前記菌株は、Lactobacillus plantarum TO1000、TO1001、TO1002またはTO1003(受領番号NITE P−958、NITE P−959、NITE P−960またはNITE P−961)である、請求項9に記載の組成物。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の菌株を含むプロバイオティクス。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の菌株とカテコール骨格を有する化合物とを組み合わせたシンバイオティクス。
- 前記化合物は、体内で存在する場合に前記菌株の1×106コロニー形成単位(cfu)あたり少なくとも5μMで含まれる請求項16に記載のシンバイオティクス。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の菌株と組み合わせて使用するための、カテコール骨格を有する化合物を含むプレバイオティクス。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の菌株または請求項9〜14のいずれか1項に記載の組成物あるいはその両方を含む添加剤。
- 前記添加剤は、稲サイレージ用である、請求項19に記載の添加剤。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の菌株または請求項9〜14のいずれか1項に記載の組成物あるいはその両方を含む食品。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の菌株または請求項9〜14のいずれか1項に記載の組成物あるいはその両方を含む医薬。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の菌株または請求項9〜14のいずれか1項に記載の組成物あるいはその両方を含む飼料。
- カテコール骨格を有する化合物によって増殖活性が上昇するLactobacillus plantarum菌株を選択する方法であって、該方法は、
A)Lactobacillus plantarum菌を含む試料を提供する提供工程;
B)硫酸マグネシウム(MgSO4)、硝酸アンモニウム(NH4NO3)、塩化カリウム(KCl)、D−(+)−グルコース、リン酸二水素カリウム(KH2PO4)およびウシ血清を含む培地中で、カテコール骨格を有する化合物の存在下または不存在下で該試料を培養する培養工程;および
C)該化合物の不存在下で増殖せず、かつ、存在下において増殖したか、または該化合物の存在下において不存在下よりも増殖が促進された菌株を分離する分離工程
を包含する、方法。 - 前記硫酸マグネシウムは、1.16〜1.74mM、前記硝酸アンモニウムは、8.02〜9.81mM、前記塩化カリウムは、3.83〜5.74mM、前記D−(+)−グルコースは3.96〜39.64mM、前記リン酸二水素カリウムは、2.09〜3.14mM、および前記ウシ血清は15〜30%で前記培地中に存在し、前記培地はpHが6.0〜7.0である、請求項24に記載の方法。
- 前記培養工程は、32〜48時間実施される、請求項24に記載の方法。
- 前記培養工程は、25〜40℃で実施される、請求項24に記載の方法。
- 前記培養工程は、0〜5%CO2、および1〜20%O2の条件下で実施される、請求項24に記載の方法。
- 前記試料は、5×105〜5×106コロニー形成単位/wellの間で前記Lactobacillus plantarum菌を含む、請求項24に記載の方法。
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