JP2012067096A - E2epfucp−vhl相互作用及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】UCPのmRNAに相補的に結合する小さな干渉RNA(RNAi)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチド;ペプチド、ペプチドミメティックス、抗体;ならびに低分子化合物からなる群より選択されたUCPの活性抑制剤。血管生成増加は、遺伝子伝達体によってUCP遺伝子が過発現して内因性VHLが減少してHIF−1αが安定化し、これによってHIF−1α安定化に基づくVEGF活性化が増強されることによってなされる。
【選択図】図4
Description
RNA干渉(RNAi)は、UCP遺伝子に対応する二本鎖RNA(dsRNA)を細胞または有機体に導入することで、対応するmRNAの分解が起きる転写後遺伝子サイレンシングメカニズム(post−transcriptional gene silencing mechanism)である。前記RNAiは、遺伝子サイレンシングに特異性及び効率性を示すので、RNAレベルで標的遺伝子のノックアウト(knockout)または「ノックダウン(knockdown)」を作る非常に強力な方法である。RNAiは、ヒトの胚芽腎臓(embryonic kidney)及びHeLa細胞を含んだヒト細胞で成功的であることが確認された(Elbashir等,Nature May,2001年,第24;411(6836)巻,494−8頁)。
UCPをコードする核酸に対してアンチセンスである核酸分子を阻害剤に使用することができる。「アンチセンス」核酸は、UCPをコードする「センス」核酸に相補的な、例えば二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的やmRNA配列に相補的な核酸配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合を形成することができる。前記アンチセンス核酸は、全体UCPコード鎖または単にそれらの一部(例:コード領域)に相補的なことがある。前記アンチセンス核酸分子は、UCP mRNAの全体コード領域に相補的なことがあるが、UCP mRNAのコードまたは非コード領域の単に一部(例:翻訳開始部)にのみ、アンチセンスであるオリゴヌクレオチドがさらに好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約5ないし50ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンス核酸は、公知の方法を使用した化学合成及び酵素結合反応を使用して構成することができる。化学合成法、例えば文献[Tetrahedron Lett.,1991年,第32巻,30005−30008頁]に記載しているように、アセトニトリルの中からテトラエチルチウラムジスルフィドで硫化させるホスホアミダート化学のような方法によって非常に容易に製造することができる。前記アンチセンス核酸の生成に使用することができる変形ヌクレオチドの例としては、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ハイポキサンチン、キサンチン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−アデニン、5−カルボキシルメチルアミノメチル−2−チオウリジン、3−(3−アミノ−3−N−2−カルボキシプロピル)ウラシル、5’−メトキシカルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルグアニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、ベータ−D−マンノシルケオシン、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、2,6−ジアミノプリン、5−メチル−2−チオウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、シュードウラシル、ケオシン、2−チオシトシン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−D−ガルラクトシルケオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデニル、5−メチル−2−チオウラシル、(acp3)w及びワイブトキソシンが挙げられる。必要によって、前記アンチセンス核酸は、発現ベクターを使用して生物学的に生成することができる。
UCPポリペプチドのタンパク質結合ドメインを抑制したミメティックス(例、ペプチドまたは非ペプチド性薬剤)を製作して、元来のUCPポリペプチドがVHLに結合することを抑制することができる(欧州特許出願EP 0412765号及びEP 0031080号)。
1)VHLを発現する細胞株を使用してUCPの活性を阻害する物質を捜す工程、あるいは
2)UCPの転写調節に関与する転写因子を捜す工程、
3)前記転写因子を調節する物質を選抜(screening)する工程、及び
4)前記物質がUCP遺伝子の発現を調節する活性を示すかどうかを確認する工程からなるUCP活性調節剤(活性抑制剤あるいは増加剤)をスクリーニングする方法を提供する。
1)UCP及びVHL発現細胞株に被検化合物を処理する工程、
2)工程1の細胞株のVHL活性を測定する工程、及び
3)工程2の結果と対照群の結果を比較してVHL活性を有意に変化させる化合物を選別する工程を含むUCP活性調節剤をスクリーニングする方法。
2)工程1の細胞株のユビキチン化されたVHLの量を測定する工程、及び
3)工程2の結果と対照群の結果を比較してユビキチン化されたVHLの量を有意に変化させる化合物を選別する工程を含むUCP活性調節剤をスクリーニングする方法。
2)工程1の細胞株のHIF活性を測定する工程、及び
3)工程2の結果と対照群の結果を比較してHIF活性を有意に変化させる化合物を選別する工程を含むUCP活性調節剤をスクリーニングする方法。及び、
2)工程1の細胞株のユビキチン化されたHIFの量を測定する工程、及び
3)工程2の結果と対照群の結果を比較してユビキチン化されたHIFの量を有意に変化させる化合物を選別する工程を含むUCP活性調節剤をスクリーニングする方法を提供する。
UCPとVHL間の相互作用検証のために次のような発現ベクターを製作して使用した。Flag−UCPは、ヒト遺伝体機能研究事業団(韓国バイオテクノロジー研究院)から提供を受けたUCP含有発現ベクター(pDESTtm27GST−UCP)を鋳型にして、PCR方法で得られた切片をNotI/BamHIでpCMV Tag1(Stratagene)にクローニングして製作した。PCR条件は、下記のとおりである。DNA重合酵素(pfu polymerase(Vent),New England Bioscience,米国)を使用してプライマー対(配列番号1:Sense:5’−tccgcggccgcatgaactccaacgtggagaa−3’、配列番号2:Antisense:5’−accggatccctacagccgccgcagcgccc−3’)と鋳型を94℃で4分間変性させて、94℃で1分、55℃で1分及び72℃で1分間30回反応させて、72℃で5分間伸長(extension)させて反応を終結した。GST−Rbx1、GST−Elongin BとGST−Elongin Cは、BamHI/NotIでpEBGベクターにクローニングし、GST−VHLは、BamHI/SpeIでpEBG ベクターにクローニングした。Flag−VHLは韓国バイオテクノロジー研究院のジョ・サヨン博士から提供受けて使用した。
過発現されたUCPと内因性VHL間の結合及び過発現されたVHLと内因性UCP間の結合有無は、HEK293T細胞株にFlag−UCP及びFlag−VHLを過発現させて、Flag−ゲルで免疫沈降反応を実施した後、内因性UCPとVHLの抗体としてウエスタンブロットを実施することで確認した。詳しく説明すると、HEK293T細胞株にFlag−UCPとFlag−VHL発現ベクターをカルシウムホスファート方法で各々細胞内に導入した。集める12時間前に10μMのMG132を処理して細胞を集めて−70℃で冷凍後、細胞破砕溶液(50mM Tris,0.5mM EDTA, 0.1%NP−40,0.5mM PMSF)で破砕した。そこにマウス抗Flag抗体(Sigma)が結合されているアガロースゲルを添加して免疫沈降反応を4℃で2時間実施した。それをSDS−試料緩衝液(62.5mM Tris,2%SDS,5%ベータ−メルカプトエタノール,10%グリセロール,0.01%ブロモフェノールブルー)と混合して95℃で5分間沸かした後、12.5%ポリアクリルアミド電気泳動を遂行した。分離したタンパク質をPVDF膜に移動させた後、膜を5%脱脂粉乳が含まれたPBST(0.05%Tween20を含んだリン酸緩衝溶液)で1時間ブロッキングして、マウス抗Flag抗体(Sigma)とマウス抗UCP抗体及びマウス抗VHL抗体(Pharmingen)として各々室温で一時間反応させた。反応後、残余抗体はPBSTで充分に洗浄してホースラディッシュペルオキシダーゼが標識されたウサギ抗マウス抗体で室温で一時間さらに反応させた後、ECL溶液で反応有無を確認した。併せて各群の細胞破砕液も一緒に前記方法のようにウエスタンブロットを実施した。その結果、Flag−UCPとVHLの結合及びFlag−VHLとUCP間の結合を確認することができた。
内因性UCPとVHL間の結合有無を調べるために、VHLとUCPの発現が両方存在するHLK3及びCk−K1癌細胞株で実施した。5枚の100mm皿にHDMEM(4.5g/lグルコース、10%牛胎児血清、100μg/mlストレプトマイシン、100unit/mlペニシリン含有)で培養されたHLK3及びCk−K1癌細胞株を集めて−70℃で冷凍後、細胞破砕溶液(50mM Tris,0.5mM EDTA,0.1%NP−40,0.5mM PMSF)で破砕した。細胞破砕液にマウス抗VHL抗体あるいはマウス抗UCP抗体と対照群としてマウス兔疫グロブリンを各々10μgを添加して、プロテインAゲルとともに4℃で2時間免疫沈降反応実施した。それをマウス抗UCP抗体あるいはマウス抗VHL抗体として前記記述した方法と同様にウエスタンブロットを実施した。その結果、細胞内で内因性UCPとVHLが結合していることが分かった(図5)。
VHLは、Elongin B、Elongin C、Rbx1 Cullin 2等と複合体を成し、E3ユビキチンリガーゼ活性を示し、この酵素の代表的な基質は、HIF−1αである(Nat Rev Cancer,2002年,第2巻,673−682頁)。前記VHLと結合することが示されたUCPのVHL複合体の他の分子との結合可能性の有無を試験した。Flag−UCPが常に発現されるHEK293細胞(293−F−UCP)に GST−Rbx1、GST−Elongin B、GST−Elongin C、GST−VHL及びGST発現ベクターを各々カルシウムホスファート方法で各々細胞内に導入した。集める12時間前に10μmのMG132で処理して細胞を集めて−70℃で冷凍後、細胞破砕溶液(50mM Tris、0.5mM EDTA、0.1%NP−40、0.5mM PMSF)で破砕した。そこにGST−セパロース(Amersham)を添加してGST pull−downを4℃で2時間実施して、マウス抗Flag抗体として前記のような方法でウエスタンブロットを実施した。その結果、UCPはVHLと特異的に結合することが分かった(図6)。
内因性VHLの発現が高いが、内因性UCPの発現が検出されないCAKI細胞株にF−UCPを過発現させた時、UCP−VHLの結合複合体形成を観察するために次のような実験を実施した。100mm皿5枚のCAKI細胞株に10ugのF/UCPプラスミドまたはmockベクタープラスミドをカルシウムホスファート方法として形質転換して48時間後に細胞を集めて前記実施例1−3で記述したようにスクロース密度勾配を実施してウエスタンブロット方法で複合体形成を観察した結果、UCPを過発現させない場合に2−4の分画でみられたfree VHL分子が、UCPが過発現されると4−5の分画に移動してUCP−VHL結合複合体を形成することが分かった(図8)。
UCPによるVHLの細胞内タンパク質濃度の減少は、VHLのユビキチン媒介タンパク質分解によって招来され、HIF−1αの安定化をもたらすようになると思慮され、それを検証した。
HEK293T細胞株にFlag−UCPを10μg、15μgずつ各々カルシウムホスファート方法で導入させて集める12時間前に、10μmのMG132(26Sプロテアゾーム阻害剤)で処理したり処理しない群を各々集めて−70℃で冷凍後、細胞破砕溶液(50mM Tris,0.5mM EDTA,50mM KCl、10%グリセロール,1mM DTT,0.5% NP−40,0.5mM PMSF)に溶解して準備した。これをマウス抗Flag抗体、マウス抗VHL抗体、マウス抗HIF−1α(Phamingen)抗体及びマウス抗β−アクチン抗体(Sigma)として前記方法と同様にウエスタンブロットを実施した。その結果、UCPの発現が増加するほどVHLの濃度は減少し、この現象は、MG132によって阻害され、HIF−1αの転写活性はUCP濃度依存的に高かった(図9及び図10)。この結果は、UCPがVHLを26Sプロテアゾーム分解経路で分解させるということを示している。
低酸素条件(hypoxia;1%O2)及び正常酸素条件(normoxia;20%O2)でUCPによるVHLのタンパク質濃度減少現象を調べるために次のような実験を実施した。
UCPは、E2ユビキチン結合酵素として知られていて、E3ユビキチンリガーゼ活性も有している。UCPの95番目アミノ酸であるシステインは、E2ファミリーによく保存されていて、酵素の活性に重要なことが報告されている(EMBO J,2003年,第22巻,5241−5250頁)。それで、本発明者等は、UCPによるVHLの細胞内濃度調節でE2酵素活性が重要な役割を担当しているのかどうかを調べようとした。それのために野生型のGST−UCPと95番システインをセリンに置換した突然変異GST−UCPmを、各々E.coliで発現させて純粋分離した。E1供給源として786−0細胞株(American Type Culture Collection)の細胞破砕液(S−100)を使用して、各々のタンパク質をユビキチン化緩衝溶液(50mM Tris,1mM ATP,10mM creatine phosphate,10μg creatine phosphokinase,0.5mM DTT,5mM MgCl2,1μg ubiquitin aldehyde,1μg His−ubiquitin)に混ぜて37℃で1時間反応させた後、GST−pull downした。ユビキチン化UCPを抗−His抗体としてウエスタンブロットして確認した結果、野生型GST−UCPでのみAuto−ubiquitinationが確認された(図16)。
Flag−UCPとFlag−UCPmを各々濃度別で(5,10,15μg)HEK293細胞株に導入して48時間の後に細胞を集めて−70℃に冷凍させた後、前記の細胞破砕溶液に溶解して準備した。これをマウス抗VHL抗体、マウス抗Flag抗体及びマウス抗アクチン抗体として前記方法と同様にウエスタンブロットを実施した。その結果、Flag−UCPによっては濃度依存的にVHLの量が減少したが、Flag−UCPmによっては変化がなかった。ゆえに、UCPのよるVHLタンパク質分解でUCPの酵素活性が必須であるということが分かった(図12)。
以上で確認されたUCPによるVHLの細胞内濃度減少が、ユビキチン媒介タンパク質分解(ubiquitin−mediated proteolysis)によることなのかどうかを確認するために、VHLが多重ユビキチン化されるかどうかを調査した。それのためにHis−Ub発現ベクターを使用したIn vivo及びIn vitro VHLユビキチン化分析とE1を使用した酵素反応を実施した。そのために、UCP及びUCPmをEcoR1/NotIでpGEX4T−1ベクターにクローニングして大腸菌DH5αで発現させて、GST−セパロースカラムを使用してGST−UCP、GST−UCPmを分離し、Flag−VHLをHEK293に導入させて発現させた後、それからFlag−アガロースゲル免疫沈降法を使用して、Flag−VHLのみを純粋分離した。
HEK293細胞株に先にHis−Ub発現ベクターをカルシウムホスファート方法で導入して培養させた後、同量の細胞を100mm培養皿に分けて培養した後、そこに図9に提示したFlag−VHL、Flag−VHLとGST−UCP、Falg−VHLとGST発現ベクターを再びカルシウムホスファート方法で導入させた。集める12時間前に10μMのMG132を処理して細胞を集めて、すぐdenatured lysis buffer(50mM Tris,1%SDS,4M Urea)を添加して超音波粉砕機で細胞を破砕した。用意した細胞破砕溶液にフラッグ抗体が結合されたアガロースゲルを添加して、室温で2時間免疫沈降反応を実施した。これをマウス抗Ub抗体で前記記述と同様にウエスタンブロットを実施して、併せて免疫沈降反応前の細胞破砕溶液の一部を取ってマウス抗GST抗体、マウス抗Flag抗体として同一なウエスタンブロットを実施した。その結果、UCPによるFlag−VHLの多重ユビキチン化を観察することができた(図13)。
1μgのE1(ウサギ、Sigma)と純粋分離したGST−UCP及びGST−UCPm、Flag−VHLタンパク質を各々前記のユビキチン化緩衝溶液に混ぜて37℃で1時間反応させた後、Ni2+−NTAレジンで4℃で2時間沈降させて、それを各々マウス抗Flag抗体、マウス抗GST抗体でウエスタンブロットを実施した。また、Ni2+−NTA(QIAGEN,ドイツ)pull−downさせる前の反応後試料から1/10を取って抗Flag抗体、マウス抗GST抗体でウエスタンブロットを実施した。その結果、UCPによるVHLの直接的なユビキチン化が試験管内で起きることが分かった(図14)。
UCPとVHLの相互作用によるVHLのタンパク質濃度減少現象がVHL以外の他のタンパク質でも起きるのか、あるいはVHLの場合にのみ特異的に起きるかどうかを次のように検証した。言いかえれると、UCPが特異的にVHLのみをユビキチン化させて分解を誘導するのかどうかを調査した。そのために、GST−UbcH5CとGST−CDC34は、BamHI/NotIで処理してpEBGベクターにクローニングして製作した。
10μgのFlag−UCP発現ベクターをカルシウムホスファート方法で導入させたりあるいは導入しないHEK293T細胞を−70℃に冷凍後、前記の細胞破砕溶液に溶解して準備した。これをマウス抗Flag抗体、マウス抗VHL抗体、ウサギ抗Elongin B、ウサギ抗Elongin C抗体、ウサギ抗Rbx1抗体及びマウス抗β−アクチン抗体として前記方法と同様にウエスタンブロットを実施した結果、VHLのタンパク質濃度は、UCPによって顕著に減少し、Elongin B、Elongin Cは若干の減少があることがみうけられた(図18a)。Elongin B、Cの濃度が若干減少する現象は、VHL.Elongin B、Elongin Cがお互いに複合体を形成して各々のタンパク質の安定性に影響を与えることが報告されたように(PNAS USA,2000年,第97巻,8507−8512頁)、VHLの濃度が顕著に減少することで遊離Elongin B、Elongin Cの半減期が減少して現れることであると推定された。
Elongin B、Cは、SOCS1(suppressor of cytokine signaling 1)と複合体を形成してSOCS1の分解を阻害する(Genes& Development,1998年,第12巻,3872−3881頁)。また、SOCS1は、Elongin B、C、Cul2と複合体を形成してVHLE3ユビキチンリガーゼと類似のE3ユビキチンリガーゼ活性を示す(JBC275,2000年,14005−14008頁)。このような理由で、UCPがSOCS1の分解を誘導するかどうかを調査した。HEK293細胞株にFlag−VHL及びFlag−SOCS1発現ベクターを各々カルシウムホスファート方法で導入させて、それを6ウェルプレートに各々均一に分けて培養して24時間後、GST−UCP及びGST発現ベクターを再び各々同一方法で導入させた。24時間後に細胞を集めて−70℃に冷凍させた後、前記の細胞破砕溶液に溶解して準備した。これをマウス抗Flag抗体、マウス抗GST抗体、マウス抗アクチン抗体を使用して前述したウエスタンブロット方法を実施した。その結果、UCPはSOCS1の安定性には影響を及ぼさず、VHLの細胞内濃度のみを減少させたことが示された(図18b)。
Rbx1は、Elongin B、Cがない場合、試験管内でVHLのユビキチン化を誘導するが、Elongin B、Cがある場合、Ubc5Hによって誘導されるVHLをユビキチン化させない(JBC,2002年,第277巻,30338−30393頁)。CDC34は、Skp1−Cul1とタンパク質複合体を形成して、E3ユビキチンリガーゼ活性を示すが、この複合体は構造的にVHLE3ユビキチンリガーゼと類似で(Curr Biol,1999年,第9巻,1180−1182頁)、CDC34は、複合体としてF−boxタンパク質であるCDC4を試験管内でユビキチン化する(JBC,2002年,第277巻,30338−30393頁)。293/HA−VHL細胞株にGST−Rbx1、GST−UbcH5C、GST−CDC34、GST−UCP発現ベクターを各々カルシウムホスファート方法で導入させて細胞を集めて、前記細胞破砕溶液で破砕した。各々の破砕液をマウス抗HA抗体、マウス抗GST抗体として前述した方法と同様にウエスタンブロットを実施した。また、GST−pull down分析を通じて各分子とVHLとの間の結合有無も確認した。その結果、GST−Rbx1、GST−UbcH5CはVHLと結合はするが、濃度には影響を与えず、CDC34はHA−VHLと結合せず、安定性に何らの影響も及ぼさず、GST−UCPだけがHA−VHLの細胞内濃度を減少させることが分かった(図19)。
培養細胞で確認されたUCPによるVHLタンパク質分解が生体内でも起きるのかを調べるために、F−UCP発現アデノウイルスベクター(Ad.F−UCP)を製作してマウスの尾静脈内に注射して肝でUCP、VHL及びHIF−1αの発現変化を検討した。
肝臓癌、大腸癌、乳癌患者の組織が植えられているTissue arrayスライド(www.tissue−array.com,SuperBioChips Lab)を対象にして、UCP、VHL、HIF−1αの各抗体で前述のように免疫組織化学染色を実施した。その結果、UCPはHIF−1αとともに原発性癌患者組織と転移性癌組織の両方で発現が高く示された一方、VHLの発現は低く示された(図22)。癌患者の組織で酸素が円滑に供給される部位でも、UCPとHIF−1αの発現が高く示されることは、正常な酸素条件でUCPによるVHLの発現減少が、HIF−1αの発現は高く維持させて癌の増殖と転移の役割をしていることを暗示している。
以上で得た結果は、UCPが癌抑制タンパク質中のひとつであるVHLの分解を促進させるということを示している。このような現象は、癌の進行及び転移にUCPが重要な役割を担当していることがあり得るという仮説を可能にして、治療用分子標的としての使用可能性もともに提示している。ゆえに、本発明者等は各種癌細胞でのUCP発現とVHL発現様相を調査して、UCP過発現及び抑制による癌細胞の増殖及び浸透(転移)効果を試験してみた。
7種の肝臓癌細胞株(ATCC,SNU368,SNU709ソウル大学校医科大学癌研究所韓国細胞株銀行)、胆道癌細胞株(Ck−K1)(全北医大キン・デゴン教授)、7種の胃癌細胞株(ソウル大学校医科大学癌研究所韓国細胞株銀行)、皮膚癌細胞株(C8161)(韓国生命工学研究院、リー・ジョンヒョン博士)、大腸癌細胞株(HCT116)(ATCC)、肺癌細胞株(A549)(ATCC)、骨肉腫細胞株(U2OS)(ATCC)、前立腺癌細胞株(PC3)(ATCC)、腎臓癌細胞株(CAKI)(ATCC)と正常繊維芽細胞株MRC5及びIMR90(ATCC)等をHDMEM(4.5g/lグルコース、10%牛胎児血清、100unit/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン含有)含有100mm培養皿に細胞数106で24時間正常酸素条件で培養して準備した後、細胞を集めて−70℃に冷凍させた後、前記の細胞破砕溶液に溶解して準備した。これをマウス抗UCP抗体、マウス抗VHL抗体、マウス抗アクチン(actin)抗体を使用して前述したウエスタンブロット方法を実施した。その結果、HLK3肝臓癌細胞株を除き、すべての細胞株でUCP水準とVHL水準が逆比例で存在した(図23)。HIF−1α水準がUCP水準と正比例して存在しなかったが、UCPが検出される15種の細胞株中12種の細胞株でHIF−1αが検出された。この結果は、UCPの発現が正常酸素条件でHIF−1α安定性を調節しているということを提示する。
腎臓癌細胞株CAKIにFlag−UCPを含むアデノウイルス(Ad.F−UCP,50,100multiplicity of infection:MOI)及び対照ウイルスとしてGFPを含むアデノウイルス(Ad.GFP,100MOI)を感染させて48時間後、細胞を集めて−70℃に冷凍させた後、前記の細胞破砕溶液に溶解して準備した。これをマウス抗Flag抗体、マウス抗VHL抗体、マウス抗HIF−1α抗体、マウス抗p21抗体、マウス抗アクチンp27抗体、マウス抗アクチン抗体を使用して、前述したウエスタンブロット方法を実施し、VEGF mRNAの変化は、VEGF、アクチンcDNAを[32P]dCTP放射能で標識させて前述した方法と同様にノーザンブロットを実施することで確認した。その結果、VHLの発現が高い腎臓癌細胞株CAKIでUCPが過発現になる場合、VHLの濃度が減少し、それによってHIF−1αとVEGFの濃度は増加することが示された(図24)。p21、p27タンパク質水準は、変化しないとみられ、UCPはVHL−HIF経路に特異的に作用すること示した(図24)。
肺に転移を誘導する皮膚癌C8161細胞株は、UCPの発現が高いことが先の実験で示された(図23)。本発明者等は、UCPの発現を抑制するためにUCPに対するsiRNAを考案してUCP−siRNAを含むアデノウイルスを製作した。UCP−siRNA塩基配列は、UCPmRNA配列中の配列番号6で記載される615−633塩基部分を、H1プロモーターによって発現されるようにpSuperプラスミドベクター(OligoEngine,米国)のHind III/Bgl II部位にクローニングして製作した。細胞内に伝達及び発現を願う遺伝子を提供するアデノウイルス製作用pShuttle(BD Bioscience,米国)ベクターに、前記製作されたpSuperプラスミドベクターをXbaI/HindIIIで処理して、H1プロモーターでT5転写終了配列を含むDNA切片をクローニングすることで製作した(pShuttle/UCP−siRNA)。以後、アデノウイルス遺伝子を含んでいるpAdEasy−1とE.coli BJ5183菌株に同時に形質導入することで組換えを遂行した。作られたUCP−siRNAを含むアデノウイルスベクターを使用して実施例5と同じ方法でアデノウイルス粒子を作った。また、対照ウイルスとして配列番号7で記載されるCon−siRNAを、上記と同一な方法で製作して使用した(Ad.Con−siRNA)。
皮膚癌C8161細胞株で示されたUCPの効果が胆道癌細胞株(Ck−K1)でも再現されるのかどうか下記のように調査した。
前記使用されたUCP−siRNAが細胞内UCPのみを特異的に抑制するということを検証するために、下記のような実験を実施した。
本発明者等は、UCPの272−290位置のmRNA配列sense 5’−AUGGCGAGAUCUGCGUCAATT−3’(配列番号8)、antisense 5’−UUGACGCAGAUCUCGCCAUTT−3’(配列番号9)(三千里製薬、韓国)を各々製作した後、RNase free D.Wに20μM/mlになるように溶解して、annealing buffer(20mM KCl,6mM HEPES−KOH、pH7.5、0.2mM MgCl2)に最終濃度が8μMになるように混ぜた後、90℃で2分間denaturation後、ゆっくり温度を下げながらアニーリングして−70℃に保管しながら使用した。Control siRNA場合は、sense 5’−AAGGAGACGAGCAAGAGAATT−3’(配列番号10)、antisense 5’−UUCUCUUGCUCGUCUCCUUTT−3’(配列番号11、Ref:Chen Z等,Nature,2005年,第436巻,725−730頁)(三千里製薬、韓国)を使用して、前記の方法で製作した。
UCP−siRNA標的配列のアミノ酸は変化させないで、塩基配列を(AAG AAG CTG GCG GCC AAG AAA −> AAA AAA TTA GCA GCT AAA AAG)変換させた突然変異F−UCP(SM)(配列番号12)は、野生型F−UCPを鋳型にしてPCR方法で得られた突然変異した切片をpCMV taq1 ベクター(Stratagene,米国)のNotI/BamHIサイトにクローニングして製作した。
5×105個のC8161細胞にAd.F−UCPとAd.GFPを各100MOIずつ感染させたりリン酸緩衝液で処理した後、各々のC8161細胞を6週齢のメスのヌードマウスのお互いに異なる部位の皮下に注射した(各群当りマウス3匹、2site injection/mouse)。マウスに移植されたC8161癌細胞の成長変化を21日間、腫瘍の大きさを測定して調査した。腫瘍の大きさは、「横2×縦2/2=腫瘍体積(mm3)」公式を使用して計算した。その結果、UCPによって腫瘍の大きさが対照群と比較して約4倍以上増加することが分かった(図32及び33)。
UCP−siRNAによるC8161細胞のUCP発現阻害が腫瘍の成長に及ぼす効果を検証するために、5×105個のC8161細胞をヌードマウスの皮下に注射して、2週間後腫瘍が平均直径3mmになった時、各々109個pfu(plaque−forming unit)の精製されたAd.UCP−siRNAまたはAd.Con−siRNAウイルスを含むまたは含まないホスファート緩衝溶液100μlを腫瘍塊に直接一度注射して以後、腫瘍の大きさを17日間測定した。C8161でUCPの発現に低下による腫瘍成長抑制効果が顕著に示された(図35)。
C8161癌細胞(106cell/100μl in PBS)を ヌードマウス(メス、5W、Balb/c、N=8)の腹中央に皮下注射して1週間後、腫瘍の平均直径が約3mmになった時、各ウイルス(PBS、Ad.F−UCP、Ad.GFP)を109pfuになるように50μlのPBSに溶解して腫瘍の中央部に注射した。約9週後に肺を摘出して、Bouin's solutionに固定及びH&E染色して転移された腫瘍の有無を観察した。その結果、UCPを過発現させたグループでは、転移が顕著に増加したことが分かった(図36、37)。
VHLが欠如している腎臓癌細胞株、786−0は、HIF−2αが過発現されていて(Nat,1999年,第399巻,271−299頁)、UCPの発現も高い(図41)。この細胞株をHA−VHLを常に発現するように操作して(Invitrogenで販売されているpCDNAベクターにHA−VHL遺伝子を導入させた発現ベクターpCDNA−HA−VHLで形質転換)UCPの効果を調査した。また、この実験のためにHIF−2αのmRNA配列86−104まで5’−GGAGACGGAGGTGTTCTAT−3’の配列を含むAd.HIF2α−siRNA(配列番号18)を前述したとおり製作した。
HA−VHL細胞株及び対照群細胞株に50MOIの各々のウイルスベクターを(Ad.F−UCP、Ad.GFP、Ad.UCP−siRNA、Ad.Con−siRNA、Ad.HIF−2α−siRNA)感染させた後、UCP、VHL、HIF−2α、GLUT1(HIF−1α及びHIF−2αによってその発現が誘導される遺伝子、GLUT1抗体、Santa Cruz,米国)の各々タンパク質の発現変化様相をウエスタンブロットで確認した。その結果、VHLの発現がない対照群細胞株ではUCPの発現変化によるVHLの変化もなく、HIF−2α、及びGLUT1の発現変化もなかった。しかし、HA−VHL発現細胞株では、UCPの発現によってVHLの発現が逆に変化し、それによってHIF−2α、及びGLUT1もUCPの発現変化様相と同一に変化した(図41)。
各ウイルス(Mock、Ad.F/UCP、Ad.GFP、Ad.UCP−siRNA、Ad.Con−siRNA、Ad.HIF−2α−siRNA)をHA−VHL発現細胞株と対照細胞株に各々2時間感染させて(100MOI)16時間後に細胞を集めて、107cell/100μlのPBSに懸濁してヌードマウス(メス、5W、Balb/c、N=5)の右側太ももの皮下に注射した。時間の経過による腫瘍の成長を観察した時、Ad.HIF−2α−siRNAは対照細胞株とHA−VHL発現細胞株全て腫瘍抑制効果を示し、Ad.UCP−siRNAはHA−VHL細胞株で腫瘍抑制効果を示した(図44、45)。以上の結果は、UCPがVHLを通じて癌細胞増殖を調節して、VHL−HIF経路を通じて癌細胞の浸透を調節することを示している。これは、UCPがVHL−HIFの経路を特異に調節する上位分子であり、VHLの抗癌効果を効果的に示すためにはUCPの発現抑制が必要だということを示している。
以上でUCPは、VHL−HIF経路を調節して癌細胞の増殖及び転移を促進させることが示され、実際にUCPの抑制はVHLの発現の増加による癌細胞増殖抑制効果(抗癌効果)を示した(図41、42)。それで、本発明者等は、786−O及びHA−VHLが発現するように考案された(pCDNA−HA−VHLで形質転換)786−0細胞株(786−O−HA−VHL)を、UCPを特異的に抑制する阻害剤を捜すcell−based HTS assayに使用することができるかどうかを下記のように調査した。
前記の結果は、UCPの過発現によってHIF−1αが安定化されて、VEGFの発現を促進させることができることを提示した。VEGFは血管生成を促進させる因子なので、UCP遺伝子が虚血性疾患を治療するのに有用な遺伝子なのかを調べるためにUCPを過発現した細胞培養液にVEGF量が増加されているのかどうか、増加しているのならUCP過発現細胞培養液が果たして対照群と比較してHUVEC(human umbilical vascular endothelial cell、Cambrex,米国)の増殖を促進させることができるかどうかを調査した。
配列番号3及び4は、Flag−UCPm製作のための正方向及び逆方向プライマーである。
配列番号5は、UCPcDNA配列である。
配列番号6は、UCP−siRNAを発現するDNA配列である。
配列番号7は、control−siRNAを発現するDNA配列である。
配列番号8及び9は、UCPmRNA(272−290)のセンス及びアンチセンス配列である。
配列番号10及び11は、Control siRNAのセンス及びアンチセンス配列である。
配列番号12は、F−UCP(Silent Mutation)配列である。
配列番号13及び14は、Flag/UCP確認用プライマー配列である。
配列番号15及び16は、GFP確認用プライマー配列である。
配列番号17は、GFP−siRNAを発現するDNA配列である。
配列番号18は、HIF2 alpha−siRNAを発現するDNA配列である。
Claims (27)
- 薬学的有効量のUCP(ubiquitin carrier protein)の活性抑制剤を個体に投与する工程を含む、UCPの活性抑制または欠失を通じてVHLの活性または発現量を増加させる方法。
- 薬学的有効量のUCPの活性抑制剤を個体に投与する工程を含む、UCPの活性抑制または欠失を通じてHIFの安定性を減少させる方法。
- 薬学的有効量のUCPの活性抑制剤を個体に投与する工程を含む、UCPの活性抑制を通じてVEGFの発現を抑制する方法。
- 前記UCPの活性抑制剤が、UCPのmRNAに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、UCP遺伝子に特異的な小さな干渉RNA、活性がないUCP類似タンパク質またはその断片、UCPタンパク質に結合するペプチド、UCPに特異的な抗体、UCPの転写またはUCPのmRNAの翻訳を抑制する化合物、およびUCPの機能を抑制する化合物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 小さな干渉RNAが配列番号6および配列番号8で記載されることを特徴とする、請求項4記載の方法。
- UCPの活性抑制剤を有効成分として含む抗癌剤。
- 前記UCPの活性抑制剤が、UCPのmRNAに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、UCP遺伝子に特異的な小さな干渉RNA、活性がないUCP類似タンパク質またはその断片、UCPタンパク質に結合するペプチド、UCPに特異的な抗体、UCPの転写またはUCPのmRNAの翻訳を抑制する化合物、およびUCPの機能を抑制する化合物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項6記載の抗癌剤。
- 小さな干渉RNAが配列番号6および配列番号8で記載されることを特徴とする、請求項7記載の抗癌剤。
- 薬学的有効量のUCPの活性増加剤を個体に投与する工程を含む、UCPの活性または発現量の増加を通じてVHLの活性または発現量を減少させる方法。
- 薬学的有効量のUCPの活性増加剤を個体に投与する工程を含む、UCPの活性または発現量の増加を通じてHIFの安定性を増加させる方法。
- 薬学的有効量のUCPの活性増加剤を個体に投与する工程を含む、UCPの活性または発現量の増加を通じてVEGFの発現を促進する方法。
- UCPの活性または発現量の増加が、UCPプロモーターに作用してUCPmRNAの発現を誘導する薬剤、およびUCPの発現を誘導するプラスミドまたはウイルス遺伝子伝達体を使用することを特徴とする、請求項9〜11のいずれか一項記載の方法。
- UCPの活性増加剤、UCP遺伝子が導入された発現ベクター、またはUCPタンパク質を有効成分として含む、VEGF発現促進剤。
- UCPの活性増加剤、UCP遺伝子が導入された発現ベクター、またはUCPタンパク質を有効成分として含む、新生血管促進剤。
- UCPの活性増加剤が、UCPプロモーターに作用してUCPmRNAの発現を誘導する薬剤、UCPの発現を誘導するプラスミドまたはウイルス遺伝子伝達体であることを特徴とする、請求項13または請求項14記載の促進剤。
- 1)UCPの転写調節に関与する転写因子を捜す工程、
2)前記転写因子を調節する物質を選抜(screening)する工程、及び
3)前記物質がUCP遺伝子の発現を調節する活性を示すかどうかを確認する工程
を含む、UCP活性調節剤をスクリーニングする方法。 - 個体の診断試料中でUCPと反応する一つ以上の物質を使用してUCPの発現を測定する工程を含む、癌の診断、治療、および予後評価方法。
- UCPと反応する一つ以上の物質が、抗体またはUCP遺伝子に相補的な核酸であることを特徴とする、請求項17記載の癌の診断、治療、および予後評価方法。
- 1)UCP及びVHL発現細胞株に被検化合物を処理する工程、
2)工程1)の細胞株のVHL活性を測定する工程、及び
3)工程2)の結果と対照群の結果とを比較して、VHL活性を有意に変化させる化合物を選別する工程
を含む、UCP活性調節剤をスクリーニングする方法。 - 1)UCP及びVHL発現細胞株に被検化合物を処理する工程、
2)工程1)の細胞株のユビキチン化されたVHLの量を測定する工程、及び
3)工程2)の結果と対照群の結果とを比較して、ユビキチン化されたVHLの量を有意に変化させる化合物を選別する工程
を含む、UCP活性調節剤をスクリーニングする方法。 - 細胞株が、786−O、786−O−HA−VHL、およびHuh−7−GFP−VHL細胞株からなる群より選択されることを特徴とする、請求項19または請求項20記載の方法。
- 1)UCP及びHIF発現細胞株に被検化合物を処理する工程、
2)工程1)の細胞株のHIFの活性を測定する工程、及び
3)工程2)の結果と対照群の結果とを比較して、HIF活性を有意に変化させる化合物を選別する工程
を含む、UCP活性調節剤をスクリーニングする方法。 - 1)UCP及びHIF発現細胞株に被検化合物を処理する工程、
2)工程1)の細胞株のユビキチン化されたHIFの量を測定する工程、及び
3)工程2)の結果と対照群の結果を比較して、ユビキチン化されたHIFの量を有意に変化させる化合物を選別する工程
を含む、UCP活性調節剤をスクリーニングする方法。 - UCPと反応する一つ以上の物質を含む癌診断キット。
- UCPと反応する一つ以上の物質が、抗体またはUCP遺伝子に相補的な核酸であることを特徴とする、請求項24記載の癌診断キット。
- 1)配列番号6で記載される塩基配列をプラスミドにクローニングする工程、及び
2)前記プラスミドをウイルス性発現ベクターに導入する工程
を含む、UCP−siRNA発現ベクターの製造方法。 - 前記ウイルス性発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、及び癌細胞溶解性ウイルスからなる群より選択されることを特徴とする、請求項26記載のUCP−siRNA発現ベクターの製造方法。
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