JP2012005481A - 抗生物質含有画分、その抗生物質及びその抗生物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】従来ない有効性を有する微生物の産生する抗生物質含有画分、そこから得られる抗生物質とその製造方法を提供することであり、更に、上記抗生物質含有画分や抗生物質が、抗菌活性だけでなくその治療効果の有無も含めて評価されて選別された抗生物質含有画分と抗生物質を提供することである。更に、多剤耐性菌に治療効果を示す抗生物質含有画分と抗生物質を提供することである。また、上記抗生物質含有画分又は抗生物質を含有する微生物防除剤を提供することである。
【解決手段】受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物を分画することによって得られる抗生物質含有画分；その培養物から、抗菌活性を示す抗生物質及び／又は感染症に治療効果を示す抗生物質を分離・精製する抗生物質の製造方法；その培養物から得られる抗生物質。
【選択図】図１

Description

本発明は、リソバクター属に属する新規な微生物の産生する培養物から分画された抗生物質を含有する画分、その抗生物質の製造方法及びそれから得られる抗生物質に関し、更に、上記画分から得られる、抗菌活性を示すが治療効果を示さない抗生物質と、抗菌活性を示し治療効果も示す抗生物質の使用方法とそれらの製造方法に関する。

抗生物質は、微生物の防除や感染症の治療に必要不可欠なものとなっている。しかしながら、抗生物質の利用方法が不適切な場合には耐性菌が出現しやすく、その結果、多くの薬剤に耐性を有する多剤耐性菌が出現し、臨床上大きな問題となっている。そのため、新しく有効な抗生物質を見出するために化学合成による検討や新たな抗生物質を産生する微生物の探索が絶え間なく行われている。

新たな抗生物質を産生する微生物として、既に多くの種類の微生物が報告されており、本発明で用いるキサントモナス科のリソバクター属に属する微生物もそのような微生物として特許文献１〜３等に報告されている。これらの内、特許文献１と３には、上記多剤耐性菌に抗菌活性を示す抗生物質を産生する菌とその菌を用いた抗生物質の製造方法が記載されている。

多剤耐性菌の中でも、臨床上特に問題となっているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記する）、バンコマイシン耐性腸球菌（以下、「ＶＲＥ」と略記する）に対して抗菌活性を有し、かつ優れた治療効果を示す新たな抗生物質の提供が強く望まれている。しかしながら、これまで報告されている多剤耐性菌に有効な抗生物質はほとんどがＭＲＳＡのみに抗菌活性を示す抗生物質であり、同時にＶＲＥに対しても抗菌活性を示す抗生物質の報告例は少ない。ＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効な抗生物質の例としては、特許文献３に報告されている抗生物質の中に上記両多剤耐性菌にインビトロで抗菌活性を示す（以下、特に付記がない限り、抗菌活性は「インビトロで示される抗菌活性」の意味で記載する。）抗生物質が記載されている。

一方、本発明者は、抗生物質の探索に有用に用いられる、カイコ（カイコガの幼虫）を実験動物とするカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを構築し（特許文献４）、その検討を進めていた。

特公平６−９９４４４号公報 特許第３３３９２３５号公報 特許第４０５４５７６号公報 特開２００７−３２７９６４号公報

上記したように、多剤耐性菌をターゲットとした抗生物質は多いが、ＶＲＥに対して明確に有効性を示す抗生物質は少なく、実用化されているＶＲＥ用抗生物質としてはオキサゾリジノン系抗生物質であるリネゾリド(ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ)が知られている程度である。しかしながらリネゾリドは完全化学合成によって創出された合成抗生物質であり、生体に対する安全性の問題と既存薬剤に対する耐性菌の出現の可能性を考慮すると、ＶＲＥに有効な多剤耐性菌用の抗生物質の選択肢を更に増やす必要があった。

一方、微生物の産生する物質からＶＲＥに対して有効性を示す抗生物質を得ることができれば、完全化学合成品に比べて医薬品の開発・製造に必要なハードルを低くできる可能性が高い。なぜならば、少なくとも、製造は培養法によって行うことができるため、特殊な触媒等の薬剤や高温高圧が必要な化学合成法による製造よりも低コストで安全な製造を行うことが可能と考えられるからである。

そのような微生物の産生する物質でＶＲＥに有効な抗生物質として、上記特許文献３に記載の抗生物質の中に、ＭＲＳＡとＶＲＥの両者に抗菌活性を示す抗生物質が記載されている。しかし、それらは、インビボにおける感染症の治療効果（以下、特に付記しない限り、「治療効果」とは、インビボの評価系で確認された感染症の治療の効果の意味で記載する）を示すかどうかまでは記載されていない。これは、従来、抗生物質の治療における有効性は最小発育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」と略記する）で評価した抗菌活性の大きさがその抗生物質の治療効果の大きさに反映されるとして評価していたからである。従来は「治療効果」を簡便に評価する方法がなかったこともＭＩＣによる評価にたよらざるを得なかった理由と考えられる。しかしながら、後述する本発明者の検討結果からＭＩＣによって評価された「抗菌活性の大きさ」は、必ずしもそれらの抗生物質の「治療効果の大きさ」を反映していないことが確認されたのである。

つまり、従来報告されている抗生物質については、そのほとんどがＭＩＣによる抗菌活性が評価されて選別され、「抗菌活性」の大きさのみが開示されているのであり、その「治療効果」の大きさについてまで開示されているとはいえないものであった。

従って、微生物の産生する抗生物質を含有する画分（以下、「抗生物質含有画分」と記載する）や、その画分から得られる抗生物質を提供するにあたって、それらの示す抗菌活性だけでなく、その治療効果も評価した上で選別することが重要であり、従って、そのように選別された従来ない有用性の高い抗生物質含有画分や、その画分から得られる抗生物質を提供することが本発明の解決すべき課題となった。

そして上記課題を解決することで、抗菌活性を示しかつ治療効果も示す抗生物質含有画分とそこから得られる抗生物質を選別できると共に、抗菌活性は示すが治療効果を示さない抗生物質含有画分や抗生物質を選別することも可能となることに思い当たった。更に、前者が感染症治療剤として有用性が高いことは当然であるが、従来注目されることがなかった後者の抗生物質含有画分等も、微生物防除剤として用いた場合、これらは治療剤として用いられることはないので多剤耐性菌の出現を実質的に考慮する必要がなく、従って微生物防除剤として好適に用いられる性質を有することに思い当たった。

すなわち、本発明の課題は、従来ない有効性を有する微生物の産生する抗生物質含有画分、そこから得られる抗生物質とその製造方法を提供することであり、更に、上記抗生物質含有画分や抗生物質が、抗菌活性だけでなくその治療効果の有無も含めて評価されて選別された抗生物質含有画分と抗生物質を提供することである。更に、多剤耐性菌に治療効果を示す抗生物質含有画分と抗生物質を提供することである。また、上記抗生物質含有画分又は抗生物質を含有する微生物防除剤を提供することである。

本発明者は、上記の事情に鑑み、抗生物質を産生する新規微生物と、その微生物から得られる抗生物質含有画分、そこから得られる抗生物質を得るために、上記微生物の培養上清から得られる抗生物質含有画分や、その画分に分離・精製処理を加えて得られた抗生物質を評価する方法の検討を行った。その結果、微生物や培養上清中の抗生物質を分離・精製する方法の取捨選択に当たり、各試料の抗菌活性については黄色ブドウ球菌に対するＭＩＣで評価し、それと共にそれらの治療効果についても併せて評価するという方法に思い当たった。そして、各試料の治療効果の大きさの評価方法として、上記した特許文献４の、カイコを実験動物として用いたカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを適用し、目的とする微生物株や上記有用性の高い抗生物質含有画分を取得するための検討を行った。

その結果、国内各地で採取した土壌中から分離した土壌細菌１４３４６株の内その培養上清に黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を認めた菌株が３４８７株あり、それらの菌の培養上清の示す上記カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を検討したところ、治療効果を示した微生物は４５株に減少した。このことから、ＭＩＣで評価した抗菌活性は、評価された抗生物質の、ＭＩＣ対象菌の惹起した感染症に対する「治療効果」を保証するものではないことが確認された。

そして、上記４５株の培養上清から得られた抗生物質含有画分の抗菌スペクトルを検討したところ、４５株の中にＭＲＳＡとＶＲＥの両多剤耐性菌に抗菌活性を示す微生物が含まれており、更に、その微生物の培養物から分画された抗生物質含有画分中には、マウス黄色ブドウ球菌感染モデルにおいて、バンコマイシンと比較して同等又はそれより高い治療効果を示す抗生物質が含まれていることを見出した。そして、上記高い治療効果を示した抗生物質について、その化学構造を含めて詳細に検討したところ、その抗生物質は、新規抗生物質であることを確認した。

また、他の抗生物質含有画分の抗菌スペクトルの検討や、その画分中の抗生物質の検討も行ったところ、他の抗生物質含有画分の抗菌スペクトルも上記新規抗生物質と同様であり、その化学構造も上記新規抗生物質の関連化合物であることが明らかとなり、最終分画段階の上記新規抗生物質以外の他の抗生物質含有画分も有用性の高い画分であることを確認した。

また、上記新規抗生物質を含む画分の示す治療効果（ＥＤ_５０：５０％効果用量）は、精製初期画分の３００倍に濃縮されているのに対し、抗菌活性（ＭＩＣ）は５倍に濃縮されているに過ぎないことが確認された。

この事実は、後述する分画操作法によって得られた精製初期の抗生物質含有画分中には抗菌活性は比較的高いが治療効果をほとんど示さない抗生物質が高い割合で含まれていることを示している。従って、精製初期の抗生物質含有画分に含まれるこれらの抗生物質は感染症治療剤としては用い難いものと考えられた。

しかしながら、見方を変えると、抗菌活性は高いが治療効果を示さないということは、そのような抗生物質は感染症の治療剤として用いることは実質的にないので、逆に微生物防除剤等の抗菌剤に適していると評価することができる。なぜならば、治療剤には用いられないので、抗菌剤として用いた場合に懸念される多剤耐性菌の出現を考慮する必要がないからである。また、精製後半の分画からは除かれているので、上記新規抗生物質との化学構造上の類似性もないことが確認されており、感染症治療剤として選別された抗生物質との交差反応による多剤耐性菌の出現も考慮する必要はない。

つまり、精製初期の分画から得られる、抗菌活性は高いが治療効果が弱い抗生物質含有画分や、そこから得られる抗生物質も、微生物防除を用途とする場合は非常に有用性の高い画分である。

更に、以上のＭＲＳＡとＶＲＥに抗菌活性を示す抗生物質含有画分や、抗生物質を産生する微生物は、性状分析や１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列等の解析結果、その産生物の新規性等からリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物（以下、「ＲＨ２１８０−５」と表記する）であることも判明し、本発明の抗生物質含有画分やそこから得られる抗生物質は新規微生物から得られるものであることが明らかとなり本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下を提供するものである。
＜１＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物を分画することによって得られることを特徴とする抗生物質含有画分。
＜２＞ 上記抗生物質含有画分が、抗菌活性を示す抗生物質を含む画分である＜１＞に記載の抗生物質含有画分。
＜３＞ 上記抗生物質含有画分が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである＜１＞又は＜２＞に記載の抗生物質含有画分。

＜４＞ 上記抗生物質含有画分が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質を含む画分である＜１＞ないし＜３＞の何れかに記載の抗生物質含有画分。
＜５＞ 上記抗生物質含有画分が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症にバンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示す抗生物質を含む画分である＜４＞に記載の抗生物質含有画分。
＜６＞ 上記抗生物質含有画分が、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質を含有する画分である＜１＞又は＜２＞に記載の抗生物質含有画分。
＜７＞ 上記抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質が、微生物防除剤として用いられるものである＜６＞に記載の抗生物質含有画分。

＜８＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物から、抗菌活性を示す抗生物質及び／又は感染症に治療効果を示す抗生物質を、分離・精製することを特徴とする抗生物質の製造方法。
＜９＞ 上記抗生物質が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである＜８＞に記載の抗生物質の製造方法。
＜１０＞ 上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すものである＜８＞又は＜９＞に記載の抗生物質の製造方法。
＜１１＞ 上記抗生物質が、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質である＜８＞に記載の抗生物質の製造方法。

＜１２＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物から得られることを特徴とする抗生物質。
＜１３＞ 上記抗生物質が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである＜１２＞に記載の抗生物質。
＜１４＞ 上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すものである＜１２＞又は＜１３＞に記載の抗生物質。
＜１５＞ 上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症にバンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示すものである＜１４＞に記載の抗生物質。
＜１６＞ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物から得られ、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示し、かつ、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すことを特徴とする抗生物質。
＜１７＞ 下記式（１）で示される＜１２＞ないし＜１６＞の何れかに記載の抗生物質。

［式（１）中、Ｒ^１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ^２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ^３はエチル基又はメチル基を示す。］

＜１８＞ ＜１＞又は＜２＞に記載の抗生物質含有画分を含有することを特徴とする微生物防除剤。
＜１９＞ ＜１２＞に記載の抗生物質を含有することを特徴とする微生物防除剤。

本発明によれば、新たな微生物により産生される有用な抗生物質を含有する画分と、その抗生物質を提供することができる。更に、該抗生物質の中には、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示すものがあり、また、黄色ブドウ球菌に高い治療効果を示すものがある。従って、極めて有用な新規抗生物質を含有する画分や、その新規抗生物質を提供することができるという効果を有している。

また、抗菌活性を示すが治療効果を示さない抗生物質含有画分と、そこから得られる治療効果を示さない抗生物質は、治療には通常用いないため、多剤耐性菌の出現を考慮する必要がなく、微生物防除剤等の抗菌剤として好適に提供できるという効果を有している。

更に、本発明の製造方法は、化学合成法に比べてより簡単である微生物の培養という方法によって有用な抗生物質を製造することができるという効果を有している。具体的には、培養法であるため、有機溶媒や特殊な金属触媒、試薬類、高温・高圧を要する多くの合成ステップ等を必要としないので、コストが安く環境にもやさしい製造方法を行うことができる。

ＲＨ２１８０−５の培養物から得られた治療効果を示す抗生物質含有画分のＯＤＳカラムによる分画結果を示す図である。縦軸は吸収強度、横軸は溶出時間（分）を示す。また別枠で表示した各ピークの欄上の数字は各ピーク物質の分子量を示す。 ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸組成分析の解析結果を示す図である。 ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲ分析の解析結果を示す図である。縦軸はシグナル強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。 ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ／ＭＳ分析の解析結果を示す図である。 各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の化学構造を示す図である。 各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸の立体構造も明らかにした化学構造を示す図である。 ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性を示す図である。

以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的形態に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。

本発明の抗生物質含有画分と各画分から得られる抗生物質を産生する微生物は、沖縄の土壌中から分離した多くの微生物の中から、ＭＩＣによる抗菌活性と、特許文献４に記載されたカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた方法で治療効果を評価されて選別された微生物である。

そのような微生物として、リソバクター属に属する「ＲＨ２１８０−５株」と命名した微生物（以下、「ＲＨ２１８０−５」と表記する）を新規に発見した。このＲＨ２１８０−５は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、２０１０年１月２５日に寄託され、受託番号「ＮＩＴＥ Ｐ−８７０」として受託された微生物である。

「ＲＨ２１８０−５」は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１０年１月２５日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行ない（移管日（国際寄託日）：２０１１年５月２０日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ−８７０」を受けているものである。

ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）の菌株としての性質は次の通りである。

形態：ＲＨ２１８０−５は、グラム陰性の桿菌であり、鞭毛は認められないが滑走性が認められる。子実体の形成は認められない。また、抗酸性を示さない。

培地における生育状況：
（１）肉汁寒天平板上では薄黄色のコロニーを形成する。拡散性の色素は認められない。
（２）肉汁ゼラチン穿刺培養では内部に渡ってゼラチンを液化しながら生育する。

生理学的性質：ＲＨ２１８０−５の生理学的、化学分類学的性質は以下の通りである。
（１）生育ｐＨ（最適生育ｐＨ）：５〜９（６〜８）
（２）生育温度（至適生育温度）：１０〜４０℃（２５〜３０℃）
（３）酸素に対する態度：好気的
（４）ＭＲテスト（Ｍｅｔｈｙｌ ｒｅｄ ｔｅｓｔ）：−
（５）ＶＰテスト（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｃａｕｅｒ ｔｅｓｔ）：＋
（６）色素の生成（Ｐｉｇｍｅｎｔ）：＋
（７）オキシダーゼ（Ｏｘｉｄａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（８）カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（９）ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ ｔｅｓｔ）：−
（１０）フォスファターゼ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（１１）カゼイン加水分解（Ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１２）セルロース加水分解（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：−
（１３）ゼラチン加水分解（Ｇｅｌａｔｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１４）でんぷん加水分解（Ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：−
（１５）デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（１６）硝酸塩還元（Ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（１７）脱窒（Ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：−
（１８）硫化水素生成（Ｈ_２Ｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（１９）インドール生成（Ｉｎｄｏｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（２０）クエン酸塩の利用（Ｃｉｔｒａｔｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）：＋
（２１）ＯＦ−ｔｅｓｔ：ｏｘｉｄａｔｉｏｎ
（２２）下記の糖類等からの酸及びガスの生成能
Ｌ−アラビノース（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ）：−
Ｄ−キシロース（Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ）：−
Ｄ−グルコース（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）：＋
Ｄ−マンノース（Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ）：＋
Ｄ−フラクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−ガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）：−
Ｄ−マルトース（Ｄ−ｍａｌｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−スクロース（Ｄ−ｓｕｃｒｏｓｅ）：＋
Ｄ−ラクトース（Ｄ−ｌａｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−トレハロース（Ｄ−ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）：＋
Ｄ−ソルビトール（Ｄ−ｓｏｒｂｉｔｏｌ）：−
グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）：−
スターチ（ｓｔａｒｃｈ）：−

分子生物学的解析結果：分子生物学的な系統分類の指標として用いられている１６Ｓ ｒＲＮＡの、ＲＨ２１８０−５の解析結果は以下の通りである。
（１２）１６ｓ ｒＲＮＡ配列の解析結果
ＲＨ２１８０−５のコロニーから、コロニーＰＣＲにより、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を増幅し、シーケンサーによる解析を行った結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く、配列表の配列番号１に示される１６Ｓ ｒＲＮＡのほぼ全長に当たる塩基配列が見出された。この配列表の配列番号１の塩基配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ全長ではないため、「１６Ｓ ｒＲＮＡ領域」とした。

この塩基配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴで相同性検索を行ったところ、本ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列はリソバクター属であるＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＮ２０４３Ｔ株と相同率９９％を示した。このＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓには、抗生物質産生の報告はないので、本発明のＲＨ２１８０−５とは異なるものである。

以上のＲＨ２１８０−５の菌株としての性質を、バージース・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３ １９８９）による分類、及びその他の文献の記載内容に照らし合わせ、更に、１６Ｓ ｒＲＮＡ解析の結果を考慮して総合的に判断した結果、ＲＨ２１８０−５はリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であると判断した。

また、ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列に一致する１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する微生物が知られていないこと、後述するＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質のいくつかが、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示すという先行例の少ない抗菌スペクトルを有すること、黄色ブドウ球菌による感染症に、バンコマイシンに比較してより高い治療効果を示すこと、ＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質が新規な化学構造を有すること等を総合的に評価検討した結果、ＲＨ２１８０−５を新規なリソバクター属に属する微生物株であると判断した。

上記のＲＨ２１８０−５は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国内寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８７０を受けており、入手可能である。本発明の抗生物質含有画分とそこから得られる抗生物質は、このＲＨ２１８０−５の培養物から得ることができる。

本発明は、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物を分画することによって得られることを特徴とする抗生物質含有画分である。

なお、バクテリアの一般的な性状として、その菌株としての性質は変異し易いため、ＲＨ２１８０−５が、上記した性状の範囲内に留まらない可能性も有している。しかしながら、ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）から変異した微生物であってもリソバクター属に属する微生物であり、抗生物質含有画分を産生する能力を有している限り、ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）に含まれるものである。

また、上記変異には自然的な変異と人工的な変異の両方を含むことは言うまでもないことである。

本発明の抗生物質含有画分は、上記ＲＨ２１８０−５を培養し、その培養物に対して何らかの分画処理を施したものを言う。ここで「培養物」とは、培養上清、培養した菌体、培養した菌体の破砕物等の何れをも意味するものである。また、「分画処理」とは、通常、培養物に対して行われる抽出、沈殿、膜分離、転溶、クロマトグラム等の、目的物質の分離・精製を目的として行われる処理を全て含むものである。

本発明の抗生物質含有画分の使用については、そこに含まれる抗生物質が、抗菌活性を示し、更に治療効果も示すものは、感染症治療剤の製造に用いることができ、抗菌活性を示すが、治療効果を示さないものは、微生物防除剤の製造に用いることができる。抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質を含有する抗生物質含有画分は、本発明の１つの態様である。

微生物防除剤としての使用方法は、特に制限はないが、例えば、抗菌性が求められる資材、用具等の表面に塗布、浸漬、湿潤させて用いる方法を挙げることができる。より具体的には、例えば、医療用のガーゼや包帯等に付着させたり浸潤させて用いたり、絆創膏等の各種の皮膚用粘着シートに用いる粘着剤の抗菌成分や塗り薬中の抗菌成分として好適に用いることができる。本発明の抗生物質含有画分は、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質が微生物防除剤として用いられる（微生物防除剤としての用途に用いられる、及び／又は、微生物防除剤として用いられる性能を有している）ものであることが好ましい。

通常、抗生物質は、多剤耐性菌の出現に留意する必要から微生物防除剤として用いることは難しいが、本発明における治療効果を示さない抗生物質含有画分とそこから得られる抗生物質は、そのような心配なしに微生物防除剤として用いることができる。微生物防除剤として用いる場合、抗生物質含有画分は、画分のまま用いたり、画分を濃縮するだけでも用いたりすることができ、また、その画分から抗生物質を分離・精製して、その抗生物質を用いることもできる。それらの処理はそれぞれの用途に応じて選択すればよい。

以上、治療効果の有無を問わず、本発明の抗生物質含有画分は、ＲＨ２１８０−５を培養し、培養物を分画処理することによって得ることができる。そこで、以下にまず各分画処理の前提となるＲＨ２１８０−５の培養方法について記載する

（ＲＨ２１８０−５の培養方法）
本発明の抗生物質含有画分等を産生するＲＨ２１８０−５の培養方法は、リソバクター属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。具体的には、ＲＨ２１８０−５を、ＹＭＥ培地、ＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地等の栄養源含有培地に接種し、好気的条件下で培養を行う。培地中の炭素源としては、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、シュクロース、デンプン、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類等の有機炭素化合物が用いられ、窒素源としては、肉エキス、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機・無機窒素化合物を用いることができる。また、塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の無機塩類を必要に応じて適宜添加する。更に、ビオチン、ビタミンＢ１、シスチン、オレイン酸メチル、ラード油等の生育促進物質を添加することが、目的物の産生量を増加させる点で好ましい。また、シリコン油や界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。

培養条件は、上記したように好気的条件下で培養するのが好ましく、液体培養法であれば通気攪拌培養が望ましい。小規模であればフラスコによる振とう培養法を用いてもよい。培養温度は２０℃〜４０℃で可能であるが、２５℃〜３５℃間に保つことが好ましく、３０℃近辺で行うことがより好ましい。培養ｐＨは、６〜８が好ましく、７付近で行うことが特に好ましい。培養期間は、用いた培地組成、培養温度、攪拌や振とうの程度等により変動するファクターであるが、ＲＨ２１８０−５の場合、通常は１〜２０日間程度、好ましくは４〜７日間程度の短期間に充分な量の目的物を確保することができる。

（抗菌活性成分の精製方法）
ＲＨ２１８０−５の培養物からの抗菌活性成分の回収は、通常の微生物培養物から生理活性物質を回収し精製する方法で行えばよい。ここで培養物とは、培養上清、培養菌体、培養菌体破砕物を含むものである。例えば、培養物に抽出処理としてアセトン等の適当な有機溶媒を加えて懸濁した後に、遠心分離やろ過膜分離等を行って菌体と分離した抽出上清に対して、通常用いられる単離精製処理を加えればよい。また必要に応じて残った菌体残渣を摩砕処理等してから再度抽出処理を行ってもよい。

通常、目的物質の分離・精製時に用いられる抽出溶媒や分離・精製手法は、ＭＩＣで判定された抗菌活性の濃縮度を指標として、その取捨選択が行われる。単なる抗菌活性成分の分離、濃縮であれば基本的にそのような手法でも問題はない。しかしながら、本発明のＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質含有画分や抗生物質の分離・精製に当たっては、ＭＩＣの結果だけでなく、特許文献４で示したカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果を指標とした選択を行っている。その結果、ＭＩＣの結果を見ただけでは濃縮・精製することが困難であったと考えられる「ＲＨ２１８０−５の産生する新規な抗生物質」の濃縮・精製が成し遂げられたのである。そこで、その点に関し次に記載する。

（カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標とした抗生物質の分離・精製）
＜ＭＩＣによる有用菌株の絞込み）
本発明においても、数万株の非常に多くの菌株から有用菌株の絞込みを行う一次スクリーニングは、抗菌活性を評価する方法が好適に用いられる。まったく抗菌活性を認めない菌株は検討対象とならないからである。抗菌活性を評価する方法であれば何れの方法であってもよいが、ＭＩＣを指標として各種供試菌株の培養上清中に黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性の認められた菌株をピックアップする方法が好ましい。その後、菌株数が数千から数百程度に絞り込まれたら、それらから得られる抗生物質含有画分や抗生物質の治療効果の評価はカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いてそのＥＤ_５０を測定することで検討することができる。

カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに対して治療効果の認められた菌株については、更に各種の分離・精製操作を行い、操作ごとにカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルで治療効果を評価する。また各精製段階の抗生物質含有画分を投与して行った分離・精製操作の種類や手法による治療効果の濃縮度についてもカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルで確認する。そうして「治療効果」を効果的に濃縮できる分離・精製操作の種類や手法を選別していく。

このような「治療効果を指標にした菌株や分離・精製操作方法の取捨選択」をマウス等の実験動物を用いて行うことは、手法上・コスト上・倫理上の問題から事実上不可能であり、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを利用することによって始めて成し遂げられたものである（実施例１参照）。

表１の結果は、ＲＨ２１８０−５の培養液から精製される各精製段階の検体の抗菌活性ＭＩＣと、カイコ感染モデルの治療効果ＥＤ_５０をまとめたものである。表１中、全活性「ｕｎｉｔ」とは、体重１ｇの黄色ブドウ球菌に感染したカイコの、５０％の確率で生存に必要な活性量と定義される。

表１に示すように、極めて興味深いことに、行った単離精製操作によって、抗菌活性の濃縮度と、治療効果の濃縮度は、必ずしも一致しないことが明らかとなった。表１の結果は、ＥＤ_５０が３００倍に濃縮されているのに対し、ＭＩＣは、この場合に行った単離精製方法では、５倍に濃縮されているに過ぎないことを示している。

表１の結果は、ＥＤ_５０がアセトン抽出段階の９０から最終精製段階のＲＰ−ＨＰＬＣの分画ピーク０．３と、３００倍に濃縮されているのに対し、ＭＩＣは、この分離・精製方法では、２５から５と、５倍に濃縮されているに過ぎないことを示している。また、治療活性の回収率は、アセトン抽出物を１００％としたとき、質量％の回収率では僅かに０．１％に過ぎない２つのピークだけで３０％近くに達していることを示している。

また、アセトン抽出以降の残渣部分は、抗菌活性は示すが治療効果を示さない抗生物質を比較的多く含むと考えられるので、それらを回収し濃縮することで抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質含有画分として用いることができる。

ＲＨ２１８０−５は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果を指標とした分離・精製方法を用いることによって効果的に見出された。なぜならば、従来から行われている抗菌活性のみを指標として目的物の分離・精製方法を行った場合には、治療効果の点では有効でない抗菌活性成分が濃縮されてしまい、生体内で治療効果の高い抗生物質を見逃してしまう可能性が高いことが表１の結果から推察されるからである。そして、その場合には、ＲＨ２１８０−５の有用性を確認することはできずに、ＲＨ２１８０−５自体を見逃してしまった可能性が高いのである。従って、新規微生物（ＲＨ２１８０−５）を提供するにあたり、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いる治療効果を指標として取捨選択が行われたことが、本発明における非常に重要なポイントである。

（最小発育阻止濃度ＭＩＣによる抗菌活性の評価）
ＲＨ２１８０−５の産生した培養物からの各分画段階の抗生物質含有画分や、そこから分離・精製した抗生物質の抗菌活性は、ＭＩＣによって評価することができる。ＭＩＣは一般的に認められている標準法に従って実施する。例えば、ＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量液体希釈法によって実施する。

また、感受性の判定基準は、菌株毎に異なるので、上記ＣＬＳＩの定める判定基準に基づき、Ｓ：感受性、Ｉ：中間、Ｒ：耐性、の各カテゴリー分けを行う。

（抗生物質含有画分について）
ここで、ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）を培養し、その培養物を分画することによって得られる本発明の「抗生物質含有画分」とは、ＲＨ２１８０−５の培養物から、抗菌活性及び／又は治療効果を示す抗生物質を含む画分を分画したもの、その分画から一部の物質を分離・抽出した画分、分離・抽出した画分中の抗生物質を部分的に精製した画分、更に、純物質までに精製した抗生物質を含む画分の何れの画分をも意味するものである。

また、表１のアセトン抽出物やブタノール抽出物、特にブタノール抽出物は、その後の精製工程の抗菌活性の濃縮度の低さと、逆に治療効果の濃縮度の高さから、後記する表４の９つのピーク（抗生物質含有画分）に含まれる抗生物質に比して、抗菌活性は示すが治療効果を示さないか、非常に弱い抗生物質を多く含む抗生物質含有画分であると考えることができる。このような抗生物質含有画分は、通常は有用性が低いと判断されるが、以下の理由により有用性が高く、本発明に含まれる抗生物質含有画分と判断することができる。

つまり、抗菌活性が高い抗生物質は感染症の治療剤として用いられる場合には、多剤耐性菌の出現を考慮して使用に際してはその必要性を充分に吟味して使用されるべきものである。一方、抗生物質を微生物防除剤等の抗菌剤として用いた場合には、その使用態様からどうしても乱用されることとなり、その使用に制限をつけることは難しいので、抗菌活性が高くても、治療に用いる抗生物質を微生物防除用に用いることはない。

しかしながら、本発明の抗菌活性は示すがカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルやその他の微生物感染モデルで治療効果を示さないか弱いと評価された抗生物質を多く含む抗生物質含有画分や、そこから抗菌活性は示すが治療効果を示さないか弱い抗生物質として得られた抗生物質は、微生物防除剤等のインビトロの用途に用いることが可能である。なぜならば、それらの抗生物質含有画分は、感染症治療剤として用いられることはないので、多剤耐性菌の出現を考慮する必要がないからである。本発明において、抗菌活性は示すが「実質的に治療効果を示さない」とは、治療剤として用いることのできる程度の治療効果を示さないという意味である。

この実質的に治療効果を示さない抗生物質の分離・精製に当たっては、上記治療効果を示す抗生物質と同じ評価方法を用いればよく、具体的には、ＭＩＣで抗菌活性を示し、感染症モデルで治療効果が弱いか、治療効果を示さない抗生物質が分離・精製される方法を選択して実施すればよい。この際の感染症モデルに特に制限はないが、治療効果を示す抗生物質と同様にカイコ黄色ブドウ球菌感染モデル等カイコを用いた感染症モデルを好適に用いることができる。

また、治療効果を示さない抗生物質の分離・精製は、そのことのみを目的として行ってもよいが、治療効果を示す抗生物質の分離・精製方法の検討を行った結果を利用する方法がより好ましい。つまり、抗生物質含有画分に対して治療効果を示す抗生物質を回収する方法を施し、その残渣に対して治療効果を示さない抗生物質の濃縮・分離・精製操作を行う方法を施すことによって特段の検討なしに抗菌活性を示すが治療効果を示さない抗生物質の分離・精製を行うことができる。

次いで、抗生物質含有画分からの抗生物質の分離・精製方法について、治療効果を示す抗生物質の分離・精製方法を例として記載する。

（抗生物質の分離・精製方法）
カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標として選択される分離・精製方法に特に限定はないが、培養物の溶媒抽出、転溶、水沈殿、ＯＤＳカラム等によるクロマトグラフィー、ＯＤＳカラム等を用いたＲＰ−ＨＰＬＣによる分取等を挙げることができる。上記溶媒抽出の溶媒や転溶の溶媒としては特に限定はないが、アセトン等の水溶性溶媒；ブタノール等の親水性溶媒；それらの混合溶媒；水と親水性溶媒との混合溶媒；水と水溶性溶媒との混合溶媒；等が好ましい。また、ＯＤＳカラムの代わりに、オクチル基やブチル基で修飾した担体、ポリスチレン系のポリマー担体等を充填したカラムを用いてもよい（表１参照）。

なお、上記した分離・精製方法は一例に過ぎず、最終的に目的とする抗生物質含有画分や抗生物質が得られる方法であれば、如何なる分離・精製方法であってもよい。

（分離精製された抗生物質の構造解析）
以上のＲＰ−ＨＰＬＣによって、ＲＨ２１８０−５の培養物から９つのピーク（抗生物質含有画分に相当）に分けられる化合物を分取することができた（図１）。これらはＵＶ吸収パターンが類似していることから互いに類似する化合物であり、ＲＰ−ＨＰＬＣより前段階の分離・精製方法によっては単一の成分となっている。

これらのピーク中に含まれる抗生物質の化学構造の解析方法に特に限定はなく、任意の方法を用いればよいが、例えば、これらの９つのピークのうち主要なピークであるピーク５のＲＰ−ＨＰＬＣ精製標品の構造解析は次の解析手段により行われた。

すなわち、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析（図２）、^１Ｈ−ＮＭＲ解析や^１３Ｃ−ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析（図４）等を実施した結果、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇがそれぞれ２分子、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅがそれぞれ１分子検出され（図４）、図５に示す新規骨格構造を有する新規抗生物質（以下、「ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質」と表記する）であることが判明した。

（抗菌スペクトル）
上記各ピークに含まれる抗生物質の示す抗菌スペクトルは、上記したＭＩＣによって検討することができる。それによって、例えば、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、試験例１の表３に示すように、黄色ブドウ球菌、腸球菌等のグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示した。更に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）だけでなくバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対しても抗菌活性を有し、多剤耐性細菌にも有効であることを確認することができた（表３参照）。

また、ピーク６とピーク９に含まれる抗生物質も、ＭＲＳＡとＶＲＥに対しＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同様の抗菌スペクトルを示した（表３参照）。

更に、ピーク１を除く、ピーク２、ピーク３、ピーク４、ピーク７、ピーク８に含まれる抗生物質の、多剤耐性菌と薬剤耐性を示さない菌に対する抗菌活性について検討したところ、上記ピークに含まれる抗生物質も、ピーク５、ピーク６、ピーク９と同様に多剤耐性菌と薬剤耐性を示さない菌に対して同様の抗菌活性を示し、多剤耐性の影響を受けていないことが確認された（試験例２の表４参照）。

以上から、本発明の抗生物質含有画分に含有される治療効果を有する抗生物質は、ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、ＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有することを特徴とする抗生物質であることが確認できた。

（マウス黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果）
ＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質は、各精製工程においてカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおいてその治療効果を有することが確認されている。前記特許文献４において、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに治療効果を示す物質は、マウス感染モデルに対しても治療効果を示すことが確認されている。そこで、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質に対しても同様の確認を行ったところ、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質はマウス感染モデルにおいても治療効果を示し、そのＥＤ_５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなりバンコマイシンの１．６ｍｇ／ｋｇよりも明確に低く治療効果の高いことが確認された。（試験例３の表５参照）

また、マウスに対する急性毒性試験の結果は、５０ｍｇ／ｋｇの投与量ではマウスは殺傷されなかったことから、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は低毒性である。

以上の結果から、ＲＨ２１８０−５の産生する本発明における抗生物質ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、黄色ブドウ球菌に対してバンコマイシンに比べて優れたＥＤ_５０値を示し、高い治療効果を示すと共に、臨床上非常に問題となっているＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも有効性を示すという優れた特徴を有していることが確認できた。

すなわち、ＲＨ２１８０−５の産生する本発明の抗生物質含有画分は、少なくとも黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質を含んでおり、また、その抗生物質は、上記感染症に対し、バンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示すものである。

また、他のピーク中の物質（抗生物質含有画分中の抗生物質に相当）も、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同様の抗菌スペクトル（ピーク６とピーク９で確認）とＵＶスペクトルを示すことから、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と類似する化合物と考えられる。また、そのため治療効果もＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同様の傾向を示すものと推察される。

ピーク５からのＲＰ−ＨＰＬＣ精製標品と同様に、その他のピークも、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析、^１Ｈ−ＮＭＲと^１３Ｃ−ＮＭＲによる解析、ＴＯＦ型ＭＳ解析、ＵＶスペクトル、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）で構造解析した結果、下記式（１）と表２で示される化合物であった。

［式（１）中、Ｒ^１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ^２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ^３はエチル基又はメチル基を示す。］

表２中、「高分解能質量分析」は、ＨＲ ＴＯＦ ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）^＋

本発明は、上記式（１）で示される前記の抗生物質であることが好ましく、上記式（１）で示される抗生物質としては、上記表２で示されるものが特に好ましい。

上記ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）を培養し、その培養物から抗菌活性を示す抗生物質、及び／又は、感染症に治療効果を示す抗生物質を分離・精製する方法は有用な抗生物質を製造する方法として用いることができる。該ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）は、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する。

また、その方法は、抗生物質が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示す抗生物質の製造方法として用いることができる。

更に、本発明は、抗生物質がＭＲＳＡとＶＲＥに抗菌活性を示し、更に、少なくとも黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質の製造方法として用いることができる。

受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物を培養し、その培養物を分画することによって得られた抗生物質含有画分、更には、その培養物から得られた抗生物質を含有する微生物防除剤は有用である。また、物質として単離する前の画分を含有する微生物防除剤も同様に有用である。

以下、実施例、検討例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の分離・精製＞
（１）抗菌活性を有する微生物のＭＩＣによる探索
各地から採取した土壌を生理食塩水に懸濁し、その上清をＧＡ培地及びＨＶ培地に塗布し、３０℃でインキュベート後に生育した菌を分離し、ＹＭＥ培地又はＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地にて３０℃で５日間培養した。アセトンを等量加え、懸濁後に遠心分離しその上清をエバポレーションした。得られた残存物を生理食塩水で希釈後に黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を微量液体希釈法によるＭＩＣにて評価した。その結果、１４３４６株中、３４８７株の培養上清に抗菌活性が認められた。

（２）カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル（以下、「カイコモデル」と略記する）を用いた治療活性物質を産生する微生物株の検討
上記抗菌活性が認められた３４８７株の検体を、カイコモデルに供してその治療効果を検討したところ、４５株の培養上清に治療効果が認められた。

（３）カイコモデルを用いた治療効果を指標とした治療効果物質の分離・精製
上記４５株中、沖縄で採取された土壌から分離されたＲＨ２１８０−５について、培養上清からの治療活性物質の精製を実施した。ＲＨ２１８０−５は、後述する１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の解析、産生する抗生物質の化学構造、産生する抗生物質の抗菌スペクトル等から、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規微生物と判定された。

ＲＨ２１８０−５を、ＹＭＥ培地１２００ｍＬに接種して培養し、培養物の５０％アセトン抽出物から、カイコモデルにおける治療効果を指標に、治療効果を示す抗生物質の精製方法を検討した。その結果、ブタノール転溶、水沈殿、ＯＤＳカラムによるクロマトグラフィー、更にＯＤＳカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）により、治療効果を示す抗生物質が精製された。

表１に示したように、以上の精製工程により、治療効果（ＥＤ_５０値）の比活性は、アセトン抽出物の３００倍に上昇した。一方、抗菌活性（ＭＩＣ）の上昇は５倍に留まった。これは、精製の出発材料である培養上清のアセトン抽出物の示す抗菌活性の多くは最終精製物の治療効果を示す抗生物質以外の物質に由来し、今回選択された精製工程により治療効果を示す抗生物質以外の抗菌活性物質を除去できているためと推定される。

また、上記ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、ＵＶ吸収パターンの類似した９つの化合物が検出されていることから、ＲＨ２１８０−５は少なくとも９つの関連化合物を産生していると考えられた。

実施例２
＜ＲＨ２１８０−５の培養とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の製造＞
ＲＨ２１８０−５の斜面培養から白金耳で菌を掻き取り、１００ｍＬのＹＭＥ培地を入れた５００ｍＬ容の三角フラスコに接種し、３０℃で３日間振とう培養を行い種培養液とした。次いで、この種培養液１．０ｍＬを、上記液体培地１００ｍＬを入れた５００ｍＬ容の三角フラスコ１２本に接種し、３０℃で５日間振とう培養を行った。

このようにして得た培養液にアセトンを等量混合し、この混合液を充分に攪拌した後に遠心分離を行い、遠心上清をエバポレーションしてアセトンを除去した。次いで、この試料をブタノール転溶に供した。ブタノール転溶はアセトン抽出物を８０ｍＬの水に懸濁し、等量のブタノールを添加して充分に振とうした後、静置、分液ロートにてブタノール層を分取し、減圧乾固後水沈殿に供した。水沈殿は上記試料を８０ｍＬの水に懸濁し、遠心後に水を取り除き、沈殿物を分取した。

ブタノール抽出物残渣７５ｍｇのサンプルを６０％メタノールに溶解し、Ｗａｔｅｒｓ、Ｓｅｐ−ｐａＫ（登録商標）Ｃ１８、２５ｍＬを用いて、０．１％ＴＦＡを含む６０％−１００％メタノールで、１０％ごとに２０ｍＬの液で溶出させた。その結果、７０％−８０％メタノール画分で治療効果を示す抗生物質含有画分が溶出された。

上記治療効果を示す抗生物質含有画分をプールして乾固させ、内２２ｍｇを５０％メタノールに溶解し、Ｓｅｎｓｈｕ ＰａＫ ＳＰ−１００ ＯＤＳカラム（直径２０ｍｍＸ長さ２５０ｍｍ）を用いて、７５％−９５％メタノール＋０．１％ＴＦＡにて溶出させた。この条件のＰＲ−ＨＰＬＣにより治療効果を示す抗生物質含有画分は、それぞれ単一物質からなる９つのピークを示す物質に分画された。

以上のＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、治療効果を示す抗生物質含有画分は、ピーク５を主要成分とする９つの類似したＵＶ吸収パターン（ＵＶ装置Ｗａｔｅｒｓ２９９６ ｐｈｏｔｏ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ）を有する化合物群からなっていることが確認された（図１参照）。以上の操作により、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を５．３ｍｇ得た。

＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の構造解析＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を、ブルカー・ダルトニクス社（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ）ＢｉｏＴＯＦ−Ｑ質量分析器による精密質量分析に供した結果、分子量は１６１６．９［ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳで、（Ｍ＋Ｈ）^＋が、ｍ／ｚ＝１６１７．８７５５］であることが分かった。
また、６Ｎ塩酸下、１０５℃で一晩加水分解処理をした後に、日立アミノ酸分析機によりアミノ酸分析を行ったところ、各々２分子のＴｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇと、各々１分子のＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅが検出された（図２）。
更に、日本電子ＥＣＡ−５００ＮＭＲによる^１Ｈ、^１３Ｃ−ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ−ＭＳ解析（図４）の結果、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、図５に示す新規骨格を有する化合物であることが明らかとなった。

更に、酸加水分解を行ったＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質について、キラルカラムによるＤ，Ｌ体の決定を行ったところ、Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，２個のＴｈｒはＬ体で、Ｎ−ＭｅＰｈｅ，２個のＡｒｇ，ＴｒｐはＤ体であることが明らかになった。
ＧｌｎとＧｌｕについては、酸加水分解の結果では両方ともＧｌｕとなり、Ｄ，Ｌ体が１：１で検出されたため、グルタミンおよびグルタミン酸を含むペプチドに対して、ビス（１，１―トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンを反応させることにより、グルタミンをジアミノ酪酸に変換し、加水分解後、反応しなかったグルタミン酸について、キラルカラムによる絶対配置の決定を行ったところ、ＧｌｎがＤ体、ＧｌｕがＬ体であることが明らかになった。（この分解法によるペプチドのＤ，Ｌ体の決定法は本願において初めて行われた新規の方法である。）
脂肪酸鎖の水酸基については、改良モッシャー法により絶対配置Ｒを決定した。
その結果、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、各アミノ酸が図６に示す立体構造を有する新規な環状ペプチド化合物であることが分かった。

試験例１
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の抗菌スペクトル＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の各種細菌に対する抗菌スペクトルを微量液体希釈法によるＭＩＣにより検討した。その結果を表３に示す。ＭＩＣの結果から、本物質は黄色ブドウ球菌、腸球菌に抗菌活性を示すことからグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示すことが明らかとなった。またメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）だけでなくバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対しても同等又はそれより高い抗菌活性を示した。このＭＩＣの値は、従来報告のある抗生物質と比べて低い値でもなく、また、特に高い抗菌活性を示したものではないが、治療効果については、後述する検討により、バンコマイシンと比べた場合、バンコマイシン以上の治療効果を有することが確認された。

試験例２
＜各ピーク物質の多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討＞
試料量の少ないピーク１物質を除くピーク２物質からピーク９物質の８つの物質について、多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討を行った。
試験対象菌には、試験例１と同じ黄色ブドウ球菌と腸球菌を選択し、微生物も同じＭＳＳＡ１とＥＦ１、ＭＲＳＡ３とＭＲＳＡ４及びＶＲＥについて各ピーク物質の示すＭＩＣをＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。その結果を表４に示す。

ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）

ＭＳＳＡ１：黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ３：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＴＣ，ＥＭ耐性黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ４：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＣＰ，ＣＰＬＸ耐性黄色ブドウ球菌
ＥＦ１ ：腸球菌
ＶＲＥ ：バンコマイシン耐性腸球菌

ＯＸ：オキサシリン、ＦＬ：フロモキエフ、ＫＭ：カナマイシン、
ＴＣ：テトラサイクリン、ＣＰ：クロラムフェニコール、ＥＭ：エリスロマイシン
ＣＰＬＸ：シプロフロキサシン

その結果、各ピーク物質の示すＭＩＣ自体は従来報告されている抗菌剤に比べると大きい値となっているものの、通常の菌とその多剤耐性菌（ＭＳＳＡ１とＭＲＳＡ３、ＭＲＳＡ４との間、ＥＦ１とＶＲＥ間）の比較においては、ＭＩＣはほとんど同等の値を示し、各ピーク物質の抗菌活性は多剤耐性の影響を受けていないことが確認された。

なお、各ピーク物質の抗菌活性と治療効果は必ずしも一致していないことが確認されている。例えば、ＭＳＳＡに対するＭＩＣが、表４の場合で６．３μｇ／ｍＬ、表３の場合で５μｇ／ｍＬを示したＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、後述するマウス黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果（ＥＤ_５０）の検討結果はバンコマイシンの１／３程度のＥＤ_５０を示しており、高い治療効果を示した。

ＭＩＣ５μｇ／ｍＬや６μｇ／ｍＬは、バンコマイシンでは耐性菌の示すＭＩＣとされている水準であり、各ピーク物質は従来のものとは異なった作用機序で治療効果を示している可能性が考えられる。従来のものと異なった作用機序で治療効果を示している場合は、今後の耐性菌の出現頻度も低いことが期待できる。

試験例３
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のマウス黄色ブドウ球菌感染モデル（マウスモデル）における治療効果と毒性の検討＞
７％ムチン＋０．２ｍＭクエン酸鉄（III）アンモニウム（Ｆｅｒｒｉｃ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）に、黄色ブドウ球菌Ｓｍｉｔｈ株を懸濁し、６．２×１０^６個（２０×ＬＤ５０）を一群５匹のマウス（ＩＣＲ雌４週齢）の腹腔に投与した。各薬剤は、以下に示す方法で上記菌株投与２時間後に皮下注射した。

上記マウスモデルに対してＰＢＳに溶解したＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇとなるよう皮下注射し、投与後、翌日の生存数を測定することでその治療効果（ＥＤ_５０）を検討した（１群５匹）。
同様にしてバンコマイシンについても、今回用いたマウスモデルに対するＥＤ_５０を検討した。
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の場合、ＰＢＳ投与で生存なしの条件で、２５ｍｇ／ｋｇの投与量でマウス全匹の生存が確認された。また、ＥＤ_５０はプロビット法により求めた。

得られた結果を表５に示す。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、マウスモデルに対して治療効果を示し、そのＥＤ_５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなり、同時に検討したバンコマイシンのＥＤ_５０１．６ｍｇ／ｋｇより明確に低く、黄色ブドウ球菌に対して治療効果の高い抗生物質であることが確認された。

また、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質をマウスに皮下投与し、投与後、翌日の観察により、マウスに対するＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の急性毒性についても検討した。
その結果、ＥＤ_５０の８０倍量に相当する５０ｍｇ／ｋｇの投与量では急性毒性を認めなかった。従って、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は低毒性であることが示唆された。

試験例４
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の抗菌スペクトルの検討＞
先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の、ＭＲＳＡ、ＶＲＥを含む各種の微生物に対する抗菌スペクトルの検討を行った。１０％血清を添加した場合と血清を添加しなかった場合それぞれのＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。測定結果を表６に示す。

表６の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、グラム陽性菌に対し有効であり、血清の添加によって活性が上昇することが確認できた。

試験例５
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の殺菌活性の検討＞
ＣＡ−Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ培地に１．８ｘ１０^８個の黄色ブドウ球菌を摂取し、先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質（２５μｇ／ｍＬ）、バンコマイシン（ＶＭ、５μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（ＧＭ、２．５μｇ／ｍＬ）を添加し、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後の生存細胞数をＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ／ｍＬ）として求めた。結果を表７に示す。

表７の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を添加すると、バンコマイシン、ゲンタマイシンを添加した場合と比較して直ちに黄色ブドウ球菌が減少することが確認できた。

また、この結果等より、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物を培養し、その培養物を分画することによって得られた抗生物質含有画分、更には、その培養物から得られた抗生物質を含有する微生物防除剤は有用であることが分かった。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を含有する微生物防除剤は有用であるが、それ以外のピークの物質を含有しても、また、物質として単離する前の画分を含有する微生物防除剤も同様に有用であることが分かった。

試験例６
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性の検討＞
ＣＡ−Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ培地に黄色ブドウ球菌液を希釈し、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質、バンコマイシン、ダプトマイシンを試験例１で用いたときの５倍の濃度で添加し、３７℃で培養した。吸光度計（島津製作所社製）を用いて、添加後の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ_６００）を経時的に測定した。結果を図７に示す。

図７の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質が、バンコマイシン、ダプトマイシンと比較して吸光度（ＯＤ_６００）の減少が大きかったことから、溶菌活性を示すことが確認できた。

検討例１
＜１６Ｓ ｒＲＮＡ解析＞
ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基をコロニーＰＣＲ法によって増幅し、増幅できたＲＮＡ断片についてシーケンサーによって解析した。その結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く、ほぼ１６Ｓ ｒＲＮＡ領域全長に相当する塩基配列を決定した。その塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
この塩基配列を元に、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて既存菌株との相同性検索を行った。相同性検索の結果、ＲＨ２１８０−５は、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ２０４３Ｔ株と９９％の相同性を示したことから、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物であると考えられた。

＜ＲＨ２１８０−５の新規性について＞
ＲＨ２１８０−５は、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ２０４３Ｔ株と産生する生理活性物質の抗菌スペクトルが異なること、これまで報告されていない新規で有用なＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質等の物質を産生している点が異なっている。この相違点は大きな違いである。よって、以上の結果から、ＲＨ２１８０−５は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な菌株であると判定した。

本発明は、新規な抗生物質含有画分とそこに含有される抗生物質、更に、その抗生物質含有画分とそこから得られる新規で有用な抗生物質の製造方法を提供することができるという産業上の利用可能性を有している。

国内寄託：ＮＩＴＥ Ｐ−８７０
ブダペスト条約に基づく寄託：ＮＩＴＥ ＢＰ−８７０

配列番号１は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する未知の菌株の、１６Ｓ ｒＲＮＡのほぼ全長にあたる塩基配列である。

Claims (19)

1. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物を分画することによって得られることを特徴とする抗生物質含有画分。
2. 上記抗生物質含有画分が、抗菌活性を示す抗生物質を含む画分である請求項１に記載の抗生物質含有画分。
3. 上記抗生物質含有画分が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである請求項１又は請求項２に記載の抗生物質含有画分。
4. 上記抗生物質含有画分が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示す抗生物質を含む画分である請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の抗生物質含有画分。
5. 上記抗生物質含有画分が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症にバンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示す抗生物質を含む画分である請求項４に記載の抗生物質含有画分。
6. 上記抗生物質含有画分が、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質を含有する画分である請求項１又は請求項２に記載の抗生物質含有画分。
7. 上記抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質が、微生物防除剤として用いられるものである請求項６に記載の抗生物質含有画分。
8. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物から、抗菌活性を示す抗生物質及び／又は感染症に治療効果を示す抗生物質を、分離・精製することを特徴とする抗生物質の製造方法。
9. 上記抗生物質が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである請求項８に記載の抗生物質の製造方法。
10. 上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すものである請求項８又は請求項９に記載の抗生物質の製造方法。
11. 上記抗生物質が、抗菌活性を示すが実質的に治療効果を示さない抗生物質である請求項８に記載の抗生物質の製造方法。
12. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物から得られることを特徴とする抗生物質。
13. 上記抗生物質が、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示すものである請求項１２に記載の抗生物質。
14. 上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すものである請求項１２又は請求項１３に記載の抗生物質。
15. 上記抗生物質が、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症にバンコマイシンに比較して同等又はそれより高い治療効果を示すものである請求項１４に記載の抗生物質。
16. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０のリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を培養し、その培養物から得られ、少なくとも、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の両者に抗菌活性を示し、かつ、少なくとも、黄色ブドウ球菌による感染症に治療効果を示すことを特徴とする抗生物質。
17. 下記式（１）で示される請求項１２ないし請求項１６の何れかの請求項に記載の抗生物質。
    

    

    ［式（１）中、Ｒ^１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ^２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ^３はエチル基又はメチル基を示す。］
18. 請求項１又は請求項２に記載の抗生物質含有画分を含有することを特徴とする微生物防除剤。
19. 請求項１２に記載の抗生物質を含有することを特徴とする微生物防除剤。

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