JP2011525612A - 蛍光検出のための容器及び方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、液体を保持するための底部及び側壁を含む液体容器に関する。底部は、充填した場合に液体と接触する平らなセンサ表面と、センサ表面の下方にあり、センサ表面上に光線を集束させるのに適した入光面と、出光面と、センサ表面からの光線を出光面から出ることができるように反射するのに適した外被面とを含む。さらに、本発明は、この種の液体容器内で分析物の質的又は量的決定を行うための方法であって、励起光線が入光面を介してセンサ表面上に集束され、これにより分析物を特徴付ける発光マーカが励起され、次いで、このようにして生成された発光が外被表面上で反射され、出光面から離れた後に検出される。本発明はまた、液体容器用のホルダと、その光線が入光面を介して液体容器のセンサ表面上に集束できるように配置されている光源と、液体容器の出光面から離れた光を検出できるように配置されている検出器とを含む分析装置にも関する。
Description
本発明は、表面上に結合された蛍光性分子の検出に使用することができる、一体化された集光光学系を有する反応容器に関する。
バイオ分析では、検出すべき物質が溶液から固定した受容体を介して表面上に濃縮される、固相ベースの分析が中心的な役割を演じている。表面上での親和性に基づく反応により、混合物からであっても非常に選択的に生物学的物質が検出できる。典型的な受容体は抗体及びDNA分子である。特に関連性の高い例は、高親和性の抗体を介して抗原を検出することである。蛍光ベースの検出には、しばしばいわゆるサンドイッチ法が使用され、この場合、捕獲抗体、すなわち受容体が、検出すべき抗原を表面上に結合する。第二の、蛍光標識された抗体が同じく抗原上に結合し、複合体の高感度の検出を可能にする。抗原濃度は、結合された蛍光マーカの強度を測定することで定量することができる。高い感度が達成可能なので、蛍光検出はバイオテクノロジにおける重要な検出技術の一つである。
僅かな量の生体試料の定量は、高い感度、確実性及び経費の点で検出技術に高度の要件を課す。例えば、癌又は心臓循環器疾患に関連して生成されるバイオマーカの検出のために、ますます低い検出限界が追及されている。医学的用途では、分析の堅固さと再現性がともに非常に重要である。その他に、このような検査の数が絶えず増加し続けるため、できるだけ少ない材料及び時間での測定が必要である。高感度の測定方法の性能にとって、SN比が中心的な意味をもつ。
これは特に蛍光測定に当てはまり、この測定では蛍光強度とノイズの比の技術的改善が、低い検出限界値及び/又は材料及び消費時間の節約をもたらす。蛍光法による結合分析の検出の場合、SN比の最適化は、表面に結合した分子からの蛍光集光を最大にし、同時にすべての妨害源の集光を最小にすることで実現される。
通常、結合反応は、水性溶液と、ガラス又はプラスチック物質からなり、受容体分子がコーティングされている、透明な測定用基板との間の境界面上で行われる。一つの重要な妨害源は、試料溶液中に自由拡散している分子の蛍光信号であり、これが表面に結合された分子の蛍光信号に重なり、それによって濃度測定を困難にする可能性がある。これは洗浄ステップで阻止することができるが、時間と経費がかかる。結合反応のリアルタイム測定を可能にし、手間のかかる洗浄ステップを回避するには、表面選択的蛍光検出が決定的に有利である。その際に、検出ボリュームをできるだけ表面上に限定し、それによって未結合の分子に由来する蛍光を検出から除外することが重要である。
蛍光の発光には、適切な波長の光による光学的励起が必要である。励起光は試料及び基板中での、散乱及び自家蛍光を誘導する。特に問題となるのは、光のうちで、検出すべき蛍光色素の発光とスペクトル的に重なり、波長フィルタで遮断できない部分である。この光の多くの部分が測定用基板内で生じるので、この寄与の抑制は基板材料内の検出ボリュームを低減させることによって行われる。このボリュームの低減は、蛍光信号を空間的にフィルタすることで達成できる。その際に、蛍光と散乱光は空間的に別々に発生し、したがって光学系で分離できることを利用する。蛍光と散乱光の光学的経路が異なることから、後者は幾何的手段で、例えば、穴あきスクリーンで強く抑制することができる。総括すると、蛍光測定の検出ボリュームのための簡単な設計目標がもたらされる。第一に、界面上での光学系の蛍光集光はできるだけ高くすべきである。第二に、水性試料中並びに基板内部での集光はできるだけ僅かにすべきである。
2種の誘電性材料、例えば水(屈折率n1≒1.33)とガラス(n2≒1.52)の境界面の近傍は、蛍光発光の特性に著しい影響を及ぼす。均質な媒体中での蛍光放射とは異なり、表面からの発光は等方性ではなく、全反射の臨界角αcの方向に強い最大値を有する。ただし、
αc= arcsin(n1/n2)
水/ガラス界面ではαc≒61°である。境界面上に結合されている蛍光性分子は、光の約74%をガラス中に放射する。この場合に全発光量の34%は臨界角αcを超えて生じる。臨界角を超える蛍光発光(supercritical angle fluorescence)は結合分析にとってきわめて重要である。これは、境界面の直前に位置する、すなわち基板から発光波長よりも明らかに小さい距離にある、分子からのみ生じる。したがって、臨界角を超える領域のみに制限された蛍光集光は、表面選択的検出を可能にする。未結合の蛍光色素の寄与はこうしてほぼ完全に抑制され、それにより例えば結合反応のリアルタイム測定が可能になる。
αc= arcsin(n1/n2)
水/ガラス界面ではαc≒61°である。境界面上に結合されている蛍光性分子は、光の約74%をガラス中に放射する。この場合に全発光量の34%は臨界角αcを超えて生じる。臨界角を超える蛍光発光(supercritical angle fluorescence)は結合分析にとってきわめて重要である。これは、境界面の直前に位置する、すなわち基板から発光波長よりも明らかに小さい距離にある、分子からのみ生じる。したがって、臨界角を超える領域のみに制限された蛍光集光は、表面選択的検出を可能にする。未結合の蛍光色素の寄与はこうしてほぼ完全に抑制され、それにより例えば結合反応のリアルタイム測定が可能になる。
従来の表面選択的蛍光測定の方法は、いわゆる境界面のエバネッセント励起を介して行われる。この場合、励起光は臨界角を超えて境界面に当たり、測定基板内部で完全に反射される。こうして境界面の試料側に薄い励起層が生じ、それにより表面に結合した分子を選択的に励起して蛍光させることができる。しかしこの方法は技術的に複雑で、小型化が難しい。
Ruckstuhl及びSeegerは臨界角を超える蛍光発光を非常に効率的に集光する方法を記載している(PCT/EP099/1548)。ガラス又はプラスチックからなる光学的導波路は、光を内部反射によってコリメートする、外被面を有する。パラボラ形の外被面を使用すると、蛍光が平行な光線束にコリメートされ、信号のさらなる処理が特に簡単になる。コリメートされた蛍光は、空間フィルタとして使用される穴あきスクリーンで集束させることができる。穴あきスクリーンは基板内部の検出ボリュームを減少させ、基板中で励起光によって誘導された散乱光/自己蛍光をフィルタ除去する。したがってこのコリメータは非常に高いSN比を達成し、単分子の検出さえも可能にする。臨界角を超える蛍光の集光のみの場合でも、コリメータの集光効率は30%を超え、これは従来の検出システムの値より明らかに優っている。光ファイバをベースとする蛍光センサは、集光効率約1%に達する。光の屈折をベースとする単一レンズは開口数(N.A.)約0.6までのものが作成可能であり、結果的に集光効率約5%を達成する。しかしながら従来のレンズ又はレンズ系は、主として臨界角未満の蛍光を集光し、したがって表面選択的蛍光集光を可能にしない。
バイオ分析では、しばしば小さな標準化された反応容器、例えば単独測定には試験管又はキュベットが、また高スループットの測定にはマイクロタイタープレートが使用される。マイクロタイタープレート上には多数の反応容器、いわゆるウェルが約7×11cm2の平面上に格子状に配置されており、標準的に96、384又は1526の独立した測定が可能である。ウェルは通常逐次読み取られ、それぞれ測定間のプレートの速やかな移動が必要である。超臨界蛍光用のコリメータをマイクロタイタープレートと一体化することで、信号収率が従来のプレートに比べて著しく改善される。加えて、結合反応のリアルタイム測定が高スループットで可能になる。しかしながらこのためにはコリメータを直径数ミリメートルに縮小しなければならない。
コリメータの卓越した集光特性は、光軸周辺の限られた領域に限定されている。光軸から蛍光発光までの距離が増加するにつれて、光束化の質及び集光効率が悪化する。これは、高い開口数を持つ光学系が高い集光効率及び感度を達成するが、それが対象空間内の比較的小さな領域内のみに限られる、蛍光顕微鏡と類似している。コリメータの性能を完全に利用し尽くすには、励起光を表面上でコリメータの光軸周りに集束させなければならない。その際、利用可能な平面の大きさ、及び励起光を光軸上に中心合わせしなければならない精度は、コリメータの大きさに依存する。コリメータを小型化すると、利用可能な面積が縮小し、したがって精度要件が高まる。このため、モータ付き移動装置に対する要件及び経費が高くなり、必要時間がより長くなり、また測定の堅固さ及び再現性にマイナスの影響を及ぼす可能性もある。
本発明は、経済的な価格の液体容器、例えばプラスチック製の試験管及びマイクロタイタープレート内での、臨界角を超える蛍光集光の方法に関する。
これは、新規のコリメータと、容器底部への構成要素の一体化によって達成される。一つの改善点は、とりわけ励起光用の集束レンズを容器底部へ一体化したことである。分析物と容器底部の間の境界面の下方に配置された凸状の面によって、励起光をコリメータの光軸近くで境界面上に集束させることができる。このため、コリメータの光軸上に励起光を中心合わせする際に、許容される公差が明らかに拡大される。このことから、とりわけ、複数の反応を逐次読み取る際に、検出システム上での容器の移動が、測定の感度及び再現性に対する不利な影響なしに、より少なく、より低い精度で実施できるという利点が生じる。したがって、二つの測定間の手動又は自動的な容器の交換をより迅速に実施し及び/又はより経済的に有利な構成要素で実現することができる。
図1は、本発明の一実施形態を示す。図示されているコリメータ1は、液体容器の一部分である。励起光を集束させるために、コリメータ1の下側に凸状に形成された面2が一体化されている。凸状面2は好ましくはコリメータの光軸周りに回転対称に配置され、光を、好ましくは軸近傍で、液体状の分析物と接触している対向するセンサ表面3上に集束させる。結合分析では、センサ表面3を受容体分子でコーティングすることができる。大きな角度で導波路材料中に放出された蛍光は、コリメータの外被面4で反射され、下側の出光面5からコリメータを出る。外被面のコリメーションは、外被面が屈折率1.1より小さい媒体で、すなわち例えば屈折率1.0の空気で囲まれているとき、完全な内部反射に基づいて行うことができる。しかし外被面は金属で鏡面加工することもできる。外被面は、蛍光がコリメータから離れた後、光軸9周りに集束されて進むように、凸面状に形成することが好ましい。パラボラ形の外被面を使用すると、それにより蛍光がほぼ平行な光線束にコリメートできるので、特に有利である。外被面4は出光面5と直接接してもよいが、例えば構成要素を保持する目的に使用できる、別の面6と接してもよい。非透光性のスクリーン7により、励起光が入光面2以外からコリメータ1内に侵入するのを阻止することができる。加えてスクリーン7の外径を選択することで、蛍光集光の角度領域を上側で制限することができる。非透光性スクリーン8により、蛍光集光の角度領域を下側で、好ましくは臨界角αcを超える角度に制限することができる。しかしスクリーン8を使わずに、すなわち外被面4の外径を適切に選択することで、集光の角度領域を下側で制限することもできる。センサ表面3の領域は、少なくとも光源によって励起される領域では平坦である。この平坦な領域は、100マイクロメートルを超える直径を有することが好ましい。コリメータの大きさはそのときどきの分析物容器の大きさに適合させることが好ましい。典型的には直径は2〜15ミリメートルである。パラボラ形の外被面4を選択した場合、その焦点距離は0.4〜3ミリメートルの範囲にあることが好ましい。パラボラ形の外被面の焦点はこのときセンサ表面上にあることが好ましく、その結果、外被面に当たった蛍光はほぼ平行な光線束にコリメートされる。凸状の入光面からセンサ表面までの距離は2ミリメートル〜20ミリメートルであることが好ましい。入光面2の直径は通常、外被面4の内径よりも小さく、0.5ミリメートル〜6ミリメートルの範囲にあることが好ましい。コリメータの経済的に有利な大量生産には、特に押出成形可能な光学用プラスチック、例えばPMMA、PC、PS、ゼオノア又はゼオネックスが適している。
図2は、容器底部内に一体化されたコリメータ1を備える、蛍光測定のための分析装置の可能な一実施形態を示す。光源10が蛍光励起に適した波長の光を発光する。この光は光学的構成要素11によって十分にコリメートされ、適切な光線直径にされる。この構成要素は、光学レンズ、光ファイバ、鏡、及びスクリーンを含むことができる。光は波長フィルタ12でスペクトル的にフィルタされる。励起光は光軸の方向でコリメータ内に入射する。臨界角を超えて放出された蛍光は、集束された放射としてコリメータから環状となって出る。しかしコリメータは、凸面状の面2でも蛍光を集光する。光軸周りのこの角度領域の蛍光は、境界面3上に結合されていない分子から放射されることも可能である。したがって表面選択的測定のためには、凸面状の面2で集光される蛍光を完全に阻止しなければならない。この目的で、コリメータの下側に反射要素14が配置され、これは軸近傍で発光された蛍光を、超臨界蛍光から分離する。図示の例では反射要素14は励起光13をコリメータの光軸上に誘導し、同時に凸面状の面2によって集光された蛍光を検出光路から完全に外して反射する。さらなる一実施形態では、反射要素は、超臨界的に発光された蛍光を反射するが、励起光及び軸近傍で集光された蛍光は通過させるようにすることができる。検出光路内には、超臨界的な蛍光を穴あきスクリーン16によって集束させ、検出機17の感光性のある面上に投影する、光学的構成要素15が配置されている。その際、穴あきスクリーンは、空間的にフィルタするために使用され、コリメータ内で生成された散乱光又は自己蛍光が十分に阻止され、表面からの蛍光は通過させるように配置されている。検出光路内には波長フィルタ18が含まれることが好ましい。
本発明の一実施形態において、凸状面2は非球面状の形態を有する。その際、面の湾曲は、励起光が屈折を制限されて導波路材料中で集束されるように選択することができる。図3に示されているように、この場合、非球面の焦点距離は、焦点がセンサ表面3の上方又は下方に位置するように選択することができる。このようにして、境界面上に、好ましくは、直径が300マイクロメートル未満の、定義された直径をもつ励起光ディスクを生成することができる。
本発明の一実施形態において、凸状面2の直径は、コリメートされた励起光線13の断面より小さく選択される(図4)。励起光線のうち、凸状面の外側でコリメータ上に当たった部分は、コリメータ上の非透光性スクリーン7によって阻止される。励起光線が均一な強度プロファイル、すなわち断面全体にわたって一定な強度を有する場合、コリメータの光軸と励起光線の間のある程度の側方変位はセンサ表面3の励起プロファイルに影響を及ぼさない。そのため、コリメータの表面に結合された蛍光は、コリメータを高精度で側方調整することなく、再現可能に読み取ることができる。これは、複数のコリメータを速やかに逐次読み取るためには特に有利である。センサ表面3は光軸周りの領域内で励起されることが好ましく、この領域は300マイクロメートル未満の直径を有することが好ましい。しかしながら直径が数ミリメートルの小さなコリメータでは、励起光線をさらに正確に光軸上に中心合わせする必要がある。凸状面2を容器底部内に一体化することで、コリメートされた励起光線13が、コリメータの光軸に対して何百マイクロメートルも側方に変位した場合でも、センサ表面に当たる励起光線を正確に光軸に中心合わせすることができる。
本発明の一実施形態において、凸状面2の直径はコリメートされた励起光線の断面より大きい(図5)。コリメータと励起光線がある程度側方に変位した場合でも、光は高度に軸に中心合わせされてコリメータのセンサ表面3上に当たる。
本発明の一実施形態において、プラスチック又はガラスからなる、透明で、好ましくは平面状の基板、例えば顕微鏡用のカバーグラスが、容器底部に一体化されている。これは図6に示されている。この場合、基板19は光学用接着剤20でコリメータと結合することができる。基板、光学用接着剤及びコリメータ1が類似の屈折率を有することが好ましい。その際、蛍光が基板の上面で励起され集光されるように、すなわちセンサ表面3が基板上に置かれるように配置を選択する。平面状基板を使用すると、以下の利点がある。第一に、顕微鏡用カバーグラスは非常に僅かなバックグラウンドで蛍光測定を可能にする。第二に、このようなガラスは大量生産され、経済的に非常に有利である。第三に、この基板は水性試料が外被面4と接触することを阻止する。外被面のガス状の周囲環境21は、完全な内部反射による損失の無いコリメーションを可能にする。第四に、ガラスは受容体分子の固定に特に適している。示された例ではコリメータは試験管22内に一体化されている。
本発明の他の実施形態は、図7に示されている。この場合、液体容器は僅か二つの構成要素、すなわち容器壁と、容器底部として機能するコリメータとからなる。その際、容器壁は、センサ表面3上に接するように形成されている。このようにして、分析対象液体と外被面との接触を阻止することができる。容器壁は好ましくはコリメータを側方から取り囲むことができる。それによって光学的外被面4が、汚れ、例えば使用者の指紋から保護される。非透光性容器壁の使用によって、周囲光が外被面からコリメータ内に到達するのを阻止することもできる。この実施形態の利点は、特に製造コストの削減と、品質のばらつきの原因となり得る接着面の数の減少である。
本発明の一実施形態において、平面状基板は、マイクロタイタープレートの底部であり、これを介して蛍光が検出される(図8)。ウェルはその下側にコリメータが設けられている。その際、コリメータは、個々にマイクロタイタープレートの底部に結合することもでき、或いは、一つの平面上に配置された複数のコリメータを含む、一つの光学要素に一体化することもできる。コリメータはウェルの格子間隔をもつことができるが、それより密に配置することもでき、それにより一つのウェルの複数の位置で複数の測定が可能になる。コリメータの読み取りは、例えば移動ユニット24によって逐次行われ、この移動ユニットはコリメータを備えるマイクロタイタープレートを、光軸に対して直角に移動させる。その代わりに、励起光線を並進的に移動させることもできる。
Claims (24)
- 液体を保持するための底部及び側壁を含む液体容器であって、
前記底部が
a)前記容器を充填した場合に液体と接触する平らなセンサ表面と、
b)前記センサ表面の下方にあり、前記センサ表面上に光線を集束させるのに適した、入光面と、
c)出光面と、
d)前記センサ表面からの光線を、前記出光面から出ることができるように反射するのに適した、一つの外被面と、
を含む、液体容器。 - 請求項1に記載の液体容器内で、分析物の質的又は量的決定を行うための方法であって、励起光が前記入光面を介して前記センサ表面上に集束され、これにより分析物を特徴付ける発光マーカを励起し、次いで、生成された発光が前記外被面上で反射され、前記出光面から離れた後に検出される方法。
- a)請求項1に記載の液体容器用のホルダと、
b)光が、前記入光面を介して前記液体容器の前記センサ表面上に集束できるように配置されている光源と、
c)前記液体容器の前記出光面から離れた光を検出できるように配置されている検出器と、
を含む分析装置。 - 結合分析のための、請求項1に記載の液体容器の使用。
- 前記入光面が凸面状に形成されていることを特徴とする請求項1に記載の液体容器。
- 前記入光面が非球面状に形成されていることを特徴とする請求項1および5に記載の液体容器。
- 前記入光面が球面状に形成されていることを特徴とする請求項1および5に記載の液体容器。
- 前記入光面が円筒状に形成されていることを特徴とする請求項1に記載の液体容器。
- 前記入光面がフレネルレンズであることを特徴とする請求項1に記載の液体容器。
- 前記入光面の回折構造が、光を前記センサ表面上に集束させるように構成されていることを特徴とする請求項1に記載の液体容器。
- 非透光性スクリーンが前記底部に一体化されており、それにより前記入光面周りでの入光が側方で制限できることを特徴とする請求項1、4から10のいずれか1項に記載の液体容器。
- 外側面上に、前記液体容器を前記分析装置に固定するのに適した陥凹部を含む、請求項1、4から11のいずれか一項に記載の液体容器。
- 外側面上に、前記液体容器を前記分析装置に固定するのに適した突出構造を含む、請求項1、4から11のいずれか一項に記載の液体容器。
- 前記底部が前記容器内に接着されている、請求項1に記載の液体容器。
- 前記底部が前記容器内に接着剤なしで嵌入されている、請求項1に記載の液体容器。
- 透明な平面状基板が前記底部に一体化されている、請求項1に記載の液体容器。
- 試験管として使用される請求項1に記載の液体容器。
- マイクロ流体チップとして使用される、請求項1に記載の液体容器。
- 請求項1、4から18のいずれか1項に記載の液体容器が複数、一つの平面内に配置されている、液体容器。
- マイクロタイタープレートの陥凹部として配置した、請求項1、4から16、19のいずれか1項に記載の液体容器。
- 請求項1、4から20のいずれか1項に記載の液体容器内で、請求項2に記載の分析物の決定を行うための方法であって、
前記励起光が前記入光面を完全に照射し、側方の入光が前記非透光性スクリーンで制限されている、方法。 - 請求項1、4から20のいずれか1項に記載の液体容器内で、請求項2に記載の分析物の決定を行うための方法であって、
前記励起光が全面的に前記入光面に案内される、方法。 - 請求項1、4から20のいずれか1項に記載の液体容器内で、請求項2に記載の分析物の決定を行うための方法であって、
臨界角を超えて前記センサ表面から放出された光のみが前記出光面から出る、方法。 - 走査装置が前記液体容器の移動を可能にする、請求項3に記載の分析装置。
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