CN101910823A - 用于荧光检测的容器与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种液体容器(22),其包括用于支撑液体的底部(1)和侧壁。所述底部(1)包括:平的传感器表面(3),在容器被注入液体时,传感器表面(3)与液体接触;光入射面(2),其位于传感器表面(3)以下,用于将光(13)聚焦到传感器表面(3)上;光出射面(5);以及壳体表面(4),所述壳体表面(4)用于反射来自传感器表面(3)的光,使得光能够通过光出射面(5)射出。本发明还涉及一种用于在所述液体容器(22)中在质量或数量上确定被分析物的方法。在该方法中,激励光(13)通过光入射面(2)被聚焦在传感器表面(3)上,使得表征被分析物的发光标记被激励,并且所激发的光在壳体表面(4)上被反射并且在通过光出射面(5)后被检测到。本发明还涉及一种分析装置,包括:用于放置所述液体容器的支持器;光源(10),该光源(10)被布置成使得该光源(10)的光(13)能够通过光入射面(2)在液体容器(22)的传感器表面(3)上聚焦;以及能够检测从液体容器(22)的光出射面(5)射出的光(9)的检测器。
Description
技术领域
本发明涉及具有集成的聚光光学装置的反应容器,该反应容器能够用于检测与表面结合的荧光分子。在生物分析中,基于固相的实验起到核心作用,在所述实验中,要检测的物质通过所述表面上固定的受体从溶液中不断聚集。通过在所述表面上的基于亲和力(affinitaetsbasierte)的反应,生物物质即使在混合物中也能够被非常有选择性地检测出。典型的受体是抗体和DNA分子。特别恰当的例子是通过具有高亲和力的抗体来检测抗原。通常,使用所谓的三文治测试(Sandwichtest)进行基于荧光的检测,其中,捕获抗体受体将待检测的抗原结合到表面上。经荧光标记的第二抗体也与抗原结合,并且使得能够进行对复合体的灵敏的检测。抗体浓度可以通过所结合的荧光标记的强度测量来量化。因为可达到的灵敏度高,所以荧光检测在生物技术中是最重要的检测技术之一。
背景技术
对少量生物物质的量化在灵敏度、安全性以及成本方面对检测技术的要求很高。生物标记例如是与癌症或心血管病症结合出现的,对于生物标记的检测追求越来越低的检测限制。对于医学应用,分析的稳固性和可复制性具有重要意义。此外,此类测试的数量持续增加,要求测量涉及尽可能少的材料和时间。对于灵敏的测量方法的有效性,信噪比具有核心意义。
这对于荧光测量特别如此,在荧光测量中,荧光强度与噪声的比例的技术改进降低了检测限制和/或节省了材料和时间。在通过荧光法进行的结合实验检测中,通过使得来自与表面结合分子的荧光收集最大化,同时使所有干扰(噪声)源的光收集最小化,可实现信噪比的优化。
结合反应通常在水溶液与由玻璃或塑料材料制成的透明测量基底之间的界面处进行,其中,透明测量基底被受体分子覆盖。实验溶液中自由扩散的分子的荧光信号是重要的干扰源,自由扩散的分子的荧光信号能够叠加在与表面结合的分子的荧光信号上,从而增加了确定浓度的难度。这可以通过清洗步骤来避免,但是这会涉及时间和成本。对于使得能够实时测量结合反应并且避免成本过高的清洗步骤,表面选择性荧光检测具有决定性的优点。在此,重要的是限定检测容积(Detektionsvolumen)尽可能地远离表面,以将由自由分子引起的荧光排除在所述检测之外。
要发出荧光需要具有合适波长的光的光学激励。激励光引起样本和基底中的散射和荧光。特别地,问题是由与要检测的荧光染料的发光在频谱上重叠并且通过波长滤波器无法滤除的那部分光引起的。因为该部分光的重要部分是在测量基底中生成的,所以通过减少基底材料中的检测容积来抑制其贡献。这可以通过荧光信号的空间过滤来实现。在此,充分利用其中的荧光与散射光以在空间上分离的方式生成的环境,因此荧光与散射光可以通过光学系统分离。借助于荧光和散射光的不同的光通路,例如通过光圈可以几何方式强烈抑制散射光。总之,荧光测量的检测容积的简单的设计目标为:第一,光学系统在界面处的荧光检测应尽可能高;第二,在含水试样中以及在基底中的光收集应尽可能少。
两个电介质材料(例如在水(折射率n1≈1.33)和玻璃(n2≈1.52)之间)的界面的紧密性对荧光出射具有显著的影响。与均匀介质内的荧光照射相比,表面的出射并非各向同性,而是在全反射临界角αc方向上具有最大值,其中
αc=arcsin(n1/n2)。
对于水/玻璃界面,αc≈61°。与界面结合的荧光分子将大约74%的光照射进入玻璃中。在此,光总量的34%是在临界角αc以上实现的。在临界角以上的荧光出射(超临界角荧光)对于结合实验具有极为重要的意义。其专门由直接位于界面前(也就是说,到基底的距离与发射波长相比小很多)的分子进行。因此,仅限制在临界角以上区域内的荧光收集允许实现表面选择性检测。未结合的荧光染料的贡献因此可以几乎被完全抑制,这例如使得对结合反应的实时测量成为可能。
表面选择性荧光测量的传统方法是通过所谓的界面瞬时激励实现的。在此,激励光在临界角以上入射到界面上并且在测量基底内被全内反射。因此,在界面的样本侧(probeseite)上形成薄的激励层,通过该激励层,与表面结合的分子可以选择性地受激励发出荧光。但此方法在技术上成本过高并且提高了小型化的难度。
Ruckstuhl和Seeger描述了一种非常有效地在临界角以上收集荧光发射的方法(PCT/EP099/1548)。一种由玻璃或塑料制成的光学波导,该波导具有壳体表面(边界表面),该表面通过内反射对光进行校准。使用具有抛物面形状的壳体表面将荧光校准成平行的光束,并且利于对信号的进一步处理。被校准的荧光能够通过作为空间过滤器的光圈(Lochblende)被聚焦。所述光圈降低了基底内的检测容积并且过滤由其中的激励光引起的散射光/自发荧光。因此,瞄准仪实现了很高的信噪比,甚至允许检测各个分子。即使仅在临界角以上收集荧光,瞄准仪的收集效率也大于30%,这明显高于普通检测系统的值。基于光纤的荧光传感器实现的收集效率大约为1%。基于折射的单一透镜可以形成高达大约0.6的数值孔径(N.A.),并且实现至少5%的效率。然而传统透镜或透镜系统主要收集在临界角以下的荧光,因此不能实现表面选择性荧光收集。
在生物分析领域中,对于单一测试通常使用小型标准化反应器皿,例如试管或比色皿,对于具有更高能力的测试使用微量滴定板。在微量滴定板中,在7x11cm2的表面上以栅格形式布置多个反应器皿,即所谓的井,这默认允许进行96、384或1526个独立测量。所述井通常是被顺序选取,因此要求在测量之间将板快速移动。通过将用于朝临界荧光的瞄准仪集成到微量滴定板中,与传统的板相比,可以显著改善产生的信号。此外,可以实现对具有高吞吐量的结合反应进行实时测量。但是,为此,瞄准仪必须缩小到直径为数毫米。
瞄准仪的突出的光收集能力被限制在围绕光轴的有限范围内。随着从光轴到荧光发射的距离的增大,光束质量和收集效率恶化。这类似于荧光显微镜,在荧光显微镜中,具有高数值孔径的光透镜虽然达到了很高的收集效率和灵敏度,但限于对象空间中相对较小的范围内。为了充分利用瞄准仪的性能,在瞄准仪的光轴周围的表面上,激励光需要被聚成束。可使用的面积的大小以及激励光以光轴为中心的精度取决于瞄准仪的大小。瞄准仪的小型化导致可用面积缩小,从而提高了对精度的要求。这提高了对马达驱动的偏移装置的要求和成本,导致更多的时间需求并且可能对测量的稳定性和可复制性具有负面影响。
发明内容
本发明涉及在廉价的液体容器内在临界角以上的荧光收集的方法,其中,液体容器例如为试管和由塑料制成的微量滴定板(Mikrotiterplatte)。这通过新型瞄准仪以及通过将该单元集成在容器底部内实现。特别地,改进之一是将关于激励光的聚焦光学器件集成在容器的底部中。通过布置在被分析物与容器底部之间在界面以下的凸表面,激励光能够在瞄准仪的光轴附近被聚焦到界面上。这导致在将激励光以瞄准仪的光轴为中心时允许的容差显著增大。因此,具有以下优点:在顺序选取数个反应时,容器在检测系统上的偏移可以更小并且以更小的精度实现,但对测量灵敏度和可复制性不造成负面影响。因此,在两次测量之间对容器的手动或自动变换可以更快进行和/或通过更廉价的部件实现。
具体实施方式
图1示出本发明的实施例。所示瞄准仪1是液体容器的一部分。在瞄准仪的底面上集成有凸起形状的面2,以聚焦激励光。特别地,凸面2以关于瞄准仪的光轴可旋转对称的方式布置,并且优选是将该轴附近的光聚焦到对面的传感器表面3上,所述传感器表面3与液态被分析物接触。关于结合实验,传感器表面3可以被受体分子覆盖。以大角度发射到波导材料中的荧光被瞄准仪的壳体表面4反射并且在底面通过光出射面5离开瞄准仪。如果壳体表面被折射率小于1.1的介质(例如折射率为1.0的空气)包围,则壳体表面的瞄准可以基于全内反射。但是,所述壳体表面也可以是镜面化的金属。壳体表面优选是形成为凸起的形状,使得荧光在射出瞄准仪后关于光轴9汇成束。使用抛物面型壳体表面特别有利,因为由此荧光可以被瞄准成为几乎平行的光束。壳体表面4可以与光出射面5直接邻接,但是也可以与例如用于支撑该部件的另一表面6邻接。通过光不透光的光圈7可以阻止激励光在光入射面2之外进入瞄准仪1。因此,通过选择光圈7的外直径,可以将荧光收集的角度范围限制为向上。通过不透光光圈8,可以将荧光收集的角度范围限制为向下,以优选为在临界角αc以上。但是,在没有光圈8的情况下,例如通过适当选择壳体表面4的外直径,也可以将光收集的角度范围限制为向下。传感器表面3区域至少在被光源激励的区域内是平坦的。特别地,所述平坦区域具有大于100微米的直径。瞄准仪的大小优选是适于被分析物容器的相应大小。通常直径在2毫米到15毫米之间。如果选择了抛物面形壳体表面4,则其焦距优选是在0.4毫米至3毫米的范围内。抛物面形壳体表面的焦点于是优选是位于传感器表面上,使得入射到壳体表面上的荧光被瞄准成大体平行的光束。凸起的光入射面至传感器表面的距离优选为2毫米至20毫米。光入射面2的直径通常小于壳体表面4的内直径并且优选是在0.5毫米至6毫米范围内。对于瞄准仪的低成本量产,可注塑成型的光学级塑料如PMMA、PC、PS、Zeonor或Zeonex是特别适合的。
图2示出具有被集成在容器底部内的瞄准仪1的、用于荧光测量的分析装置的可能实施例。光源10发射出具有适于荧光激励的波长的光。所述光通过光学部件11被充分瞄准,并形成合适的光束直径。这些部件可以包括光学透镜、光纤、镜以及光圈(Blende)。所述光通过波长滤波器12在光谱上被进行滤波。激励光沿光轴方向射入瞄准仪内。在临界角以上发射的荧光以环形形式射出瞄准仪成为光束。但是,瞄准仪也从凸面2收集荧光。在围绕光轴的该角度范围内的荧光也可由未与界面3结合的分子发射。因此,对于表面选择性测量,从凸面2收集的荧光必须被完全阻隔。为此,反射器元件14被布置在瞄准仪下面,该反射器元件14将轴附近发射的荧光与超临界荧光分离。在所示情况下,反射器元件14将激励光13引至瞄准仪的光轴上,同时,将凸面2所收集的荧光完全反射出检测光束通道。在另一实施例中,反射器元件可以被构造成反射超临界发射的荧光,同时让激励光和在轴附近收集的荧光通过。在检测光束通道内,设置有光学部件15,所述光学部件15将超临界荧光聚焦通过光圈16并且将所述荧光投射到检测器17的感光表面上。所述光圈在此用作空间过滤并被构建为使得瞄准仪内的散射光和产生的自发荧光被基本阻隔,同时让来自所述表面的荧光通过。在检测光束通道内优选包括波长滤波器18。
在本发明的一个实施例中,凸面2具有非球面形状。该表面的曲率可被选择成使得激励光在波导材料内被衍射限定地聚焦。如图3所示,此非球面体的焦距可被选择成使得焦点位于传感器表面3以下或以上。通过这种方式,可以在界面上产生具有限定直径的激励盘,其优选具有小于300微米的直径。
在本发明的一个实施例中,凸面2的直径被选择为小于被瞄准的激励光束13的横截面(图4)。激励光束中在所述凸面之外入射到瞄准仪的部分被不透光的光圈7阻隔在瞄准仪处。如果激励光束具有均匀的强度横截面,也就是说,在整个横截面上具有不变的强度,则在瞄准仪的光轴与激励光束之间的特定横向偏移对传感器表面3的激励横截面没有影响。由此,在瞄准仪的表面结合的荧光能够在不需要高精度横向调节瞄准仪的情况下被可复制地选取。这对于数个瞄准仪的快速顺序选取是特别有利的。传感器表面3优选在光轴附近的一定范围内被激励,所述范围优选具有小于300微米的直径。直径为数毫米的更小的瞄准仪当然要求激励光束更加精确地集中到光轴上。通过将凸面2集成在容器的底部中,即使被瞄准的激励光束13相对于瞄准仪的光轴偏移数百微米。也能够使入射到传感器表面的激励光更加精确地集中到光轴上。
在本发明的一个实施例中,凸面2的直径大于被瞄准的激励光束的横截面(图5)。即使瞄准仪和激励光束具有特定的横向偏移,光也能够以非常轴向居中地到达瞄准仪的传感器表面3。
在本发明的一个实施例中,在容器底部中优选是集成有由塑料或玻璃(例如显微镜保护玻璃)制成的透明、优选为平坦的基底,。这如图6所示。此基底19可通过光学粘合剂20与瞄准仪结合。所述基底、光学粘合剂以及瞄准仪1优选具有相似的折射率。选择所述结构,使得荧光在基底的上侧被激励以及收集,也就是说,传感器表面3位于基底上。使用所述平坦基底具有以下优点:第一,显微镜保护玻璃允许测量荧光具有很小的背景;第二,这样的玻璃可量产并且成本低;第三,所述基底避免含水试样与壳体表面4接触。壳体表面4的气态环境21通过全内放射实现无损失的瞄准;第四,玻璃特别适合于是受体分子固定。在所示实例中,瞄准仪被集成在试管22内。
图7示出本发明的另一实施例。这里,液体容器仅包括两个部件:容器壁和作为容器底部的瞄准仪。所述容器壁被构造成与传感器表面3邻接。通过这种方式,能够避免被分析物液体与壳体表面接触。所述容器壁优选是横向包围瞄准仪。由此可保护光学壳体表面4不被污染,例如不被使用者的指纹污染。此外,通过使用不透光的容器壁,可以阻止周围的光通过壳体表面进入瞄准仪。此构造的优点为:极大降低了制造成本以及降低了黏贴表面的数量,所述黏贴表面的数量可引发质量波动。
在本发明的一个实施例中,平坦基底是微量滴定板的底部,通过该微量滴定板检测荧光(图8)。各个井在底侧设置有瞄准仪。在此,瞄准仪可单独与微量滴定板的底部相连或者可以被集成在光学元件上,所述光学元件包括布置在一平面上的多个瞄准仪。各瞄准仪可具有所述井的栅距,但是也可以被布置得更密集,这使得可以在一个井的多个位置进行测量。例如通过将具有瞄准仪的微量滴定板垂直于光轴移动的偏移单元24,顺序执行瞄准仪的选取。可替选地,可以平移激励光束。
Claims (24)
1.一种液体容器,包括用于支撑液体的底部和侧壁,
其中,所述底部包括:
a)在所述容器注入液体时与液体接触的平的传感器表面;
b)位于所述传感器表面以下的光入射面,所述光入射面用于将光聚焦在所述传感器表面上;
c)光出射面;
d)以及壳体表面,该壳体表面被构造成使得从所述传感器表面反射的光通过所述光出射面射出。
2.一种用于在根据权利要求1所述的液体容器内在质量或数量上确定被分析物的方法,其中,激励光通过光入射面被聚焦在传感器表面上,从而激励表征所述被分析物的发光标记,并且,所产生的荧光在壳体表面被反射并在通过光出射面射出后被检测到。
3.一种分析装置,包括:
a)用于支撑根据权利要求1所述的液体容器的支撑器;
b)光源,所述光源被布置成使得所述光源的光能够通过光入射面聚焦在所述液体容器的传感器表面上;以及
c)检测器,该检测器被布置成能够检测从所述液体容器的光出射面射出的光。
4.根据权利要求1所述的液体容器在结合实验中的用途。
5.根据权利要求1所述的液体容器,其特征在于,所述光入射面被形成为凸面形状。
6.根据权利要求1至5之一所述的液体容器,其特征在于,所述光入射面被形成为非球面形状。
7.根据权利要求1至5之一所述的液体容器,其体征在于,所述光入射面被形成为球面形状。
8.根据权利要求1所述的液体容器,其特征在于,所述光入射面被形成为圆柱形。
9.根据权利要求1所述的液体容器,其特征在于,所述光入射面是菲涅耳透镜。
10.根据权利要求1所述的液体容器,其特征在于,在光入射面上的衍射结构用于将光聚焦在所述传感器表面上。
11.根据权利要求1.4至10之一所述的液体容器,其特征在于,在底部集成有不透光的光圈,通过所述光圈,能够横向限制在所述光入射面周围的光进入。
12.根据权利要求1、4至11之一所述的液体容器,包括在外侧的凹入部,所述凹入部用于将所述液体容器固定在分析装置中。
13.根据权利要求1、4至11之一所述的液体容器,包括在外侧的凸出结构,所述凸出结构用于将所述液体容器固定在分析装置中。
14.根据权利要求1所述的液体容器,其中,所述底部被粘贴在所述容器中。
15.根据权利要求1所述的液体容器,其中,所述底部在不使用粘合物的情况下被插入所述容器内。
16.根据权利要求1所述的液体容器,其中,在所述底部中集成有透明、平坦的基底。
17.根据权利要求1所述的液体容器,被用作试管。
18.根据权利要求1所述的液体容器,被用作微流体芯片。
19.多个根据权利要求1和4至18所述的液体容器被布置在一平面上。
20.根据权利要求1、4至16以及19所述的液体容器的布置,所述液体容器凹入在微量滴定板中。
21.根据权利要求2所述的用于在根据权利要求1、4至20之一所述的液体容器内确定被分析物的方法,其中,激励光完全照射光入射面并且通过不透光的光圈横向限制光的入射。
22.根据权利要求2所述的用于在根据权利要求1、4至20之一所述的液体容器内确定被分析物的方法,其中,激励光被全部引导到光入射面上。
23.根据权利要求2所述的用于在根据权利要求1、4至20之一所述的液体容器内确定被分析物的方法,其中,以大于临界角从所述传感器表面射出的光通过所述光出射表面。
24.根据权利要求3所述的分析装置,其中,扫描装置允许所述液体容器偏移。
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PB01 | Publication | ||
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Application publication date: 20101208 |