本発明の化合物は、特に本明細書に包含されている説明に照らして、化学分野でよく知られているものに類似したプロセスを含む合成経路によって合成することができる。出発物質は、一般にAldrich Chemicals(米国ウィスコンシン州Milwaukee)などの商業供給源から入手可能であり、または当業者によく知られている方法(例えば、Louis F.FieserおよびMary Fieser、Reagents for Organic Synthesis、1〜19巻、Wiley、New York(1967〜1999編)、もしくは補遺を含めたBeilsteins Handbuch der organischen Chemie、4、Aufl.編 Springer−Verlag、Berlin(Beilsteinオンラインデータベースによっても入手可能である)に一般に記載されている方法によって調製される)を用いて容易に調製される。
例示のために、以下に示した反応スキームは、本発明の化合物ならびに重要な中間体を合成するための潜在的な経路を提供する。個々の反応ステップのより詳細な説明については、以下の実施例の項を参照のこと。他の合成経路を使用して本発明の化合物を合成することができることが当業者には理解されよう。特定の出発物質および試薬をスキームに示し、以下で論じているが、他の出発物質および試薬と容易に置き換えて、種々の誘導体および/または反応条件を得ることができる。さらに、後述の方法によって調製した多くの化合物は、当業者によく知られている従来の化学的手法を用いて本開示に照らしてさらに修飾することができる。
本発明の化合物の調製では、中間体の離れた官能基(remote functionality)(例えば、第一級または第二級アミン)の保護が必要なこともある。このような保護の必要性は、離れた官能基の性質および調製方法の条件に応じて変わるものである。適当なアミノ保護基(NH−Pg)には、アセチル、トリフルオロアセチル、t−ブトキシカルボニル(BOC)、ベンジルオキシカルボニル(CBz)および9−フルオレニルメチレンオキシカルボニル(Fmoc)がある。同様に、「ヒドロキシ保護基」は、ヒドロキシ官能基を遮断または保護するヒドロキシ基の置換基を意味する。適当なヒドロキシル保護基(O−Pg)には、例えば、アリル、アセチル、シリル、ベンジル、パラメトキシベンジル、トリチル、などがある。このような保護の必要性は、当業者により容易に決定される。保護基およびそれらの使用の一般的な説明については、T.W.Greene、Protective Groups in Organic Synthesis、John Wiley & Sons、New York、1991を参照のこと。
中間体ヒドラゾン(1a)は、酢酸などの酸性環境において室温でメチルグリオキサール(SM−1)を所望のヒドラジン(SM−2)で処理することによって形成することができる。還流させた水性酢酸中でヒドラゾン(1a)を所望のα−ケトアルデヒド(SM−3)で処理することによって、1−(4−ヒドロキシ−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン中間体(1b)が得られる。あるいは、1H−ピラゾール中間体(1b)は、還流させた水性酢酸中で所望のα−ケトアルデヒド(SM−3)を所望のヒドラジンオキサレートで処理することによって直接形成することもできる。アミノ保護ピラゾロスピロケトン中間体(1c)は、アミン(好ましくは、ピロリジン)の存在下において室温でアミノ保護4−ピペリドン(好ましくは、BOC保護基)を1−(4−ヒドロキシ−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン中間体(1b)に加えることによって形成することができる。次いで保護基を除去して、ピラゾロスピロケトン中間体(1d)を得ることができる。アミノ保護基を除去するために使用した条件は、どの保護基を使用したかによって決まることになる。例えば、BOC保護基は、強酸(例えば、HCl)を用いた処理によって除去することができる。次いで最終化合物(I)は、所望のカルボン酸(R3CO2H)を用いた標準的なペプチドカップリング反応を使用することによって形成することができる。例えば、ピラゾロスピロケトン中間体(1d)およびカルボン酸(R3CO2H)は、例えばTHFおよび/またはDMFなどの適当な溶媒中に、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)などの活性化剤の存在下または不在下、およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)またはN−メチルモルフォリン(NMM)などの適当な塩基の存在下で、カルボン酸(R3CO2H)とO−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート(HATU)などのペプチドカップリング試薬とを接触させることによって、活性カルボン酸エステルを形成し、次いで活性カルボン酸エステルとピラゾロスピロケトン中間体(1d)とを接触させることによって結合させて、式(1)の化合物を形成することができる。あるいは、式(1)の化合物は、まず例えば塩化チオニルと反応させることによってカルボン酸(R3CO2H)を酸塩化物に転換し、次いで酸塩化物をピラゾロスピロケトン中間体(1d)と反応させて式(1)の化合物を形成することによって形成することができる。さらに別の代替法は、THFおよび/またはDMFなどの適当な溶媒中にN−メチルモルフォリンなどの適当な塩基の存在下で、カルボン酸(R3CO2H)を2−クロロ−4,6−ジメトキシトリアジンで処理することを伴う。活性エステルには、THFおよび/またはDMFなどの適当な溶媒に溶かしたピラゾロスピロケトン中間体(1d)とN−メチルモルフォリンなどの塩基の溶液を加える。
本発明の化合物は、そのままで、または薬学的に許容できるその塩の形態で単離し、使用することができる。本発明では、複数の塩基性窒素原子を有する化合物は、様々な当量数(「eq.」)の酸と塩を形成し得る。当業者であれば、このような塩の全てが、本発明の範囲内であることは理解するであろう。
本発明の化合物に関連して本明細書で使用される場合、薬学的に許容できる塩には、前記化合物の薬学的に許容できる無機塩および有機塩が包含される。これらの塩は、化合物の最終単離および精製の間にその場で、またはその化合物を適切な有機酸または無機酸と別に反応させ、こうして形成された塩を単離することにより調製することができる。代表的な塩には、これらに限られないが、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、ベシル酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、マロン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トシル酸塩、ギ酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプト酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などが包含される。これらにはまた、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ金属およびアルカリ土類金属をベースとするカチオン、さらに、これらに限られないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、エチルアンモニウムなどを包含する非毒性アンモニウム、第4級アンモニウムおよびアミンカチオンが包含され得る。追加の例については、例えば、Bergeら、J.Pharm.Sci.、66、1〜19(1977)を参照されたい。
ある種の本発明の化合物は、1つより多い結晶形で存在することがある。式(I)の化合物の多形およびその塩(溶媒和物および水和物を包含)は、本発明の一部を構成し、本発明の化合物を様々な条件下で結晶化させることにより調製することができる。例えば、再結晶化のために様々な溶媒または様々な溶媒混合物を使用すること、様々な温度で結晶化させること、結晶化の間の非常に急速な冷却から非常に緩徐な冷却までに及ぶ様々な冷却方法。多形をまた、本発明の化合物を加熱または溶融し、続いて、徐々に、または迅速に冷却することにより得ることができる。多形の存在は、固体プローブ核磁気共鳴(NMR)分光法、赤外(IR)分光法、示差走査熱分析、粉末X線回折または他のこのような技術により決定することができる。
本発明には、1個または複数個の原子を通常自然界に見られる原子量または質量数と異なる原子量または質量数を有する原子と置き換えていることを除けば、式(1)によって記述されたものと等しい、同位体的標識化合物も含まれる。本発明の化合物に取り込める同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄およびフッ素の同位体、例えばそれぞれ2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、36Cl、125I、129I、および18Fがある。いくつかの本発明の同位体的標識化合物、例えば3Hおよび14Cなどの放射性同位体を取り込んでいるものは、薬物および/または基質組織分布アッセイに有用である。トリチウム化(すなわち、3H)、および炭素−14(すなわち、14C)、同位体は、それらの調製の容易さおよび検出感度に関して特に好ましい。さらに、より重い同位体、例えば重水素(すなわち、2H)との置換は、より大きい代謝安定性の結果として生じるいくつかの治療的利点、例えばin vivo半減期の増大または必要投与量の低減をもたらす可能性があり、したがって、状況によっては好ましいこともある。本発明の同位体的標識化合物は、同位体的標識されていない試薬の代わりに容易に入手可能な同位体的標識された試薬を使用することにより、以下のスキームおよび/または実施例に開示されている手順を実施することによって、一般に調製することができる。
本発明の化合物は、不斉中心を含有することがある。これらの化合物は、鏡像異性体の混合物として、または純粋な鏡像異性体として存在し得る。化合物が不斉中心を含有する場合、当業者に知られている方法により、例えば、例えば結晶化により分離することができるジアステレオ異性体塩を形成することによるか、例えば結晶化、気液または液体クロマトグラフィーにより分離することができる立体異性体誘導体または錯体を形成することによるか、一方の鏡像異性体を鏡像異性体特異的試薬と選択的に反応させる、例えば、酵素によりエステル化させることによるか、またはキラル環境中で、例えば、キラル支持体、例えば、結合キラルリガンドを伴うシリカ上で、またはキラル溶媒の存在下での気液もしくは液体クロマトグラフィーにより、化合物を純粋な鏡像異性体に分割することができる。上記のいずれかの分離手順により所望の立体異性体を他の化学的実体に変換する場合、所望の鏡像異性体形態を遊離するためには、さらなるステップが必要であることは理解されるであろう。別法では、光学的に活性な出発物質を使用することによるか、光学的に活性な試薬、基質、触媒もしくは溶媒を使用する不斉合成によるか、または不斉変換により一方の立体異性体を他方に変換することにより、特定の立体異性体を合成することができる。
本発明のある種の化合物は、分離可能であり得る様々な安定な配座形態で存在し得る。不斉単結合の周囲で回転が限られることに起因する、例えば、立体障害または環歪みが原因のねじれ不斉により、様々な配座異性体を分離することが可能であり得る。本発明の化合物はさらに、式(1)の化合物の各配座異性体およびその混合物を包含する。
本発明の化合物は、アセチルCoAカルボキシラーゼ酵素(複数可)(特に、ACC1およびACC2)の阻害によって調節される疾患、状態および/または障害を治療するのに有用である。したがって、本発明の別の実施形態は、治療有効量の本発明の化合物および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物である。本発明の化合物(そこに使用した組成物およびプロセスを含む)は、本明細書に記載の治療用途のための医薬の製造に使用することもできる。
代表的な製剤は、本発明の化合物および担体、希釈剤または賦形剤を混合することによって調製する。適当な担体、希釈剤および賦形剤は、当業者によく知られており、炭水化物、蝋、水溶性および/または水膨潤性ポリマー、親水性または疎水性物質、ゼラチン、油、溶媒、水などの物質が含まれる。使用する特定の担体、希釈剤または賦形剤は、本発明の化合物を適用する手段および目的によって決まることになる。溶媒は、一般に哺乳動物に投与するのが安全と当業者によって認められた(GRAS)溶媒に基づいて選択される。一般に、安全な溶媒は、水などの非毒性水性溶媒および水に可溶性または混和性の他の非毒性溶媒である。適当な水性溶媒には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール(例えば、PEG400、PEG300)など、およびその混合物がある。製剤は、1種または複数のバッファー、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、平滑剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、酸化防止剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色剤、甘味料、芳香剤、矯味矯臭剤および薬物(すなわち、本発明の化合物またはその医薬組成物)の洗練された体裁を与える、または医薬品(すなわち、医薬)の製造に役立つ他の既知の添加剤も含んでいてよい。
製剤は、従来の溶解および混合手順を用いて調製することができる。例えば、原薬(すなわち、本発明の化合物または化合物の安定化形態(例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知の複合体形成剤との複合体))を、上記の1種または複数の賦形剤の存在下で適当な溶媒に溶解させる。低水溶性化合物の溶解速度は、参照により本明細書に組み込む、Takeuchi,H.らによって「Enhancement of the dissolution rate of a poorly water−soluble drug(tolbutamide) by a spray−drying solvent depostion method and disintegrants」J.Pharm.Pharmacol.、39、769〜773(1987)、および欧州特許第0901786B1号(米国特許出願公開第2002/009494号)に記載されているものなど、噴霧乾燥した分散体の使用によって高めることができる。本発明の化合物は、通常、容易に制御可能な薬物投与量を提供し、患者に洗練されかつ取り扱いやすい製品を与えるために、医薬剤形に製剤する。
医薬組成物には、本発明の化合物の溶媒和物および水和物も含まれる。「溶媒和物」という用語は、式(I)で表される化合物(その薬学的に許容できる塩を含む)と1種または複数の溶媒分子との分子複合体を意味する。かかる溶媒分子は、レシピエントに対して無害であることが知られている、製薬技術分野で一般に使用されているもの、例えば、水、エタノール、エチレングリコールなどである。「水和物」という用語は、溶媒分子が水である複合体を意味する。溶媒和物および/または水和物は、結晶形で存在することが好ましい。メタノール、メチルt−ブチルエーテル、酢酸エチル、酢酸メチル、(S)−プロピレングリコール、(R)−プロピレングリコール、1,4−ブチン−ジオールなど、他の溶媒は、より望ましい溶媒和物の調製における中間溶媒和物として使用することができる。
使用するための医薬組成物(または製剤)は、薬物を投与するために使用する方法に応じて種々の形に包装することができる。一般に、販売用の商品には、適切な形態の医薬製剤が入れられている容器が含まれる。適当な容器は、当業者によく知られており、ボトル(プラスチックおよびガラス)、サッシェ、アンプル、ビニール袋、金属シリンダーなどの材料が含まれる。容器は、包装の中身に不用心に近づくのを防ぐためにいたずら防止セットも含んでいてよい。その上、容器には、容器の中身を説明するラベルを付けている。ラベルは、適切な警告も含んでいてよい。
本発明は、かかる治療を必要とする動物に、治療有効量の本発明の化合物または有効量の本発明の化合物と薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、もしくは担体とを含む医薬組成物を投与することを含む、動物におけるアセチルCoAカルボキシラーゼ酵素(複数可)の阻害によって調節される疾患、状態および/または障害を治療する方法をさらに提供する。この方法は、アセチルCoAカルボキシラーゼ酵素(複数可)の阻害から恩恵を受ける疾患、状態および/または障害を治療するのに特に有用である。
肥満および過体重は一般に肥満度指数(BMI)によって定義され、これは全体脂肪と相関関係があり、疾患の相対危険度を推定する。BMIは、キログラム表示の体重を、メートル表示の身長の二乗で割って算出される(kg/m2)。過体重は通常、BMIが25〜29.9kg/m2と定義され、肥満は通常、BMIが30kg/m2と定義される。例えば、National Heart,Lung,and Blood Institute、Clinical Guidelines on the Identification,Evaluation,and Treatment of Overweight and Obesity in Adults、The Evidence Report、Washington,DC:U.S.Department of Health and Human Services、NIH publication no.98−4083(1998)を参照のこと。
本発明の別の態様は、糖尿病または1型(インスリン依存真性糖尿病、「IDDM」とも呼ばれる)および2型(非インスリン依存真性糖尿病、「NIDDM」とも呼ばれる)糖尿病、耐糖能障害、インスリン抵抗性、高血糖、ならびに糖尿病性合併症(アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、発作、末梢血管疾患、腎症、高血圧、神経障害、および網膜症など)を含めた糖尿病関連障害の進行または発症を治療または遅延するためである。
本発明のさらに別の態様では、代謝症候群などの肥満同時罹患状態(obesity comorbidities)の治療である。代謝症候群には、異脂肪血症、高血圧、インスリン抵抗性、糖尿病(例えば、2型糖尿病)、冠状動脈疾患および心不全などの疾患、状態または障害が含まれる。代謝症候群に関するより詳細な情報については、例えば、Zimmet,P.Z.ら、「The Metabolic Syndrome: Perhaps an Etiologic Mystery but Far From a Myth − Where Does the International Diabetes Federation Stand?」、Diabetes & Endocrinology、7(2)、(2005)、およびAlberti,K.G.ら、「The Metabolic Syndrome − A New Worldwide Definition」、Lancet、366、1059〜62(2005)を参照のこと。本発明の化合物の投与は、薬物を含有しないビヒクル対照と比較して、血漿レプチン、C反応性タンパク質(CRP)および/またはコレステロールの低下など少なくとも1種の心臓血管疾患危険因子で統計的に有意な(p<0.05)低減をもたらすことが好ましい。本発明の化合物の投与は、グルコース血清レベルでも統計的に有意な(p<0.05)低減をもたし得る。
体重が約100kgの正常な成人ヒトの場合、体重1キログラム当たり約0.001mg〜約10mgの範囲の投与量が通常十分であり、約0.01mg/kg〜約5.0mg/kgが好ましく、約0.01mg/kg〜約1mg/kgがより好ましい。しかしながら、治療対象の年齢および体重、意図される投与経路、投与される特定の化合物などよって、一般的な投与量範囲にいくらかの変動性が求められてもよい。特定の患者についての投与量範囲および最適投与量の決定は、本開示の利点を有する当業者の能力の十分に範囲内である。本発明の化合物は、徐放、制御放出、および遅延放出製剤に使用でき、その形態も当業者によく知られているという点にも留意されたい。
本発明の化合物は、本明細書に記載の疾患、状態および/または障害の治療のための他の薬剤と併用してもよい。したがって、本発明の化合物を他の薬剤と併せて投与することを含む治療の方法も提供している。本発明の化合物と併せて使用できる適当な薬剤には、抗肥満薬(食欲抑制薬を含む)、抗糖尿病薬、抗高血糖症薬、脂質低下剤、および抗高血圧剤がある。
適当な抗肥満薬には、11β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ−1(11β−HSD1型)阻害剤、ステアロイルCoAデサチュラーゼ−1(SCD−1)阻害剤、MCR−4アゴニスト、コレシストキニン−A(CCK−A)アゴニスト、モノアミン再取り込み阻害剤(シブトラミンなど)、交感神経様作用薬、β3アドレナリンアゴニスト、ドーパミンアゴニスト(ブロモクリプチンなど)、メラノサイト刺激ホルモン類似体、5HT2cアゴニスト、メラニン凝集ホルモンアンタゴニスト、レプチン(OBタンパク質)、レプチン類似体、レプチンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、リパーゼ阻害剤(テトラヒドロリプスタチン、すなわちオルリスタットなど)、食欲抑制薬(ボンベシンアゴニストなど)、ニューロペプチドYアンタゴニスト(例えば、NPY Y5アンタゴニスト)、PYY3−36(その類似体を含む)、甲状腺模倣剤、デヒドロエピアンドロステロンまたはその類似体、グルココルチコイドアゴニストまたはアンタゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−1アゴニスト、毛様体神経栄養因子(Regeneron Pharmaceuticals、Inc.、米国ニューヨーク州TarrytownおよびProcter&Gamble Company、米国オハイオ州Cincinnatiから入手可能なAxokine(商標)など)、ヒトアグーチ関連タンパク質(AGRP)阻害剤、グレリンアンタゴニスト、ヒスタミン3アンタゴニストまたはインバースアゴニスト、ニューロメジンUアゴニスト、MTP/ApoB阻害剤(例えば、ジルロタピドなどの消化管選択的MTP阻害剤)、オピオイドアンタゴニスト、オレキシンアンタゴニストなどがある。
本発明の組み合わせた態様で使用するのに好ましい抗肥満薬には、消化管選択的MTP阻害剤(例えば、ジルロタピド、ミトラタピドおよびインプリタピド、R56918(CAS番号403987)およびCAS番号913541−47−6)、CCKaアゴニスト(例えば、PCT公開番号WO2005/116034または米国特許出願公開第2005−0267100A1号に記載されているN−ベンジル−2−[4−(1H−インドール−3−イルメチル)−5−オキソ−1−フェニル−4,5−ジヒドロ−2,3,6,10b−テトラアザ−ベンゾ[e]アズレン−6−イル]−N−イソプロピル−アセトアミド)、5HT2cアゴニスト(例えば、ロルカセリン)、MCR4アゴニスト(例えば、米国特許第6,818,658号に記載されている化合物)、リパーゼ阻害剤(例えば、セチリスタット)、PYY3−36(本明細書では「PYY3−36」にはペグ化PYY3−36、例えば、米国特許出願公開第2006/0178501号に記載されているものなどの類似体が含まれる)、オピオイドアンタゴニスト(例えば、ナルトレキソン)、オレオイル−エストロン(CAS番号180003−17−2)、オビネピチド(obinepitide)(TM30338)、プラムリンチド(Symlin(登録商標))、テソフェンシン(NS2330)、レプチン、リラグルチド、ブロモクリプチン、オルリスタット、エクセナチド(Byetta(登録商標))、AOD−9604(CAS番号221231−10−3)およびシブトラミンがある。本発明の化合物および併用療法は、運動および堅実な食事と併せて投与することが好ましい。
適当な抗糖尿病薬には、ナトリウム−グルコース共輸送体(SGLT)阻害剤、ホスホジエステラーゼ(PDE)−10阻害剤、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)1または2阻害剤、スルホニル尿素(例えば、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、ジアビネース、グリベンクラミド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、グリクラジド、グリペンチド、グリキドン、グリソラミド、トラザミド、およびトルブタミド)、メグリチニド、α−アミラーゼ阻害剤(例えば、テンダミスタット、トレスタチンおよびAL−3688)、α−グルコシドヒドロラーゼ阻害剤(例えば、アカルボース)、α−グルコシダーゼ阻害剤(例えば、アジポシン、カミグリボース、エミグリテート、ミグリトール、ボグリボース、プラジミシン−Q、およびサルボスタチン)、PPARγアゴニスト(例えば、バラグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、イサグリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンおよびトログリタゾン)、PPARα/γアゴニスト(例えば、CLX−0940、GW−1536、GW−1929、GW−2433、KRP−297、L−796449、LR−90、MK−0767およびSB−219994)、ビグアナイド(例えば、メトホルミン)、グルカゴン様ペプチド1(GLP−1)アゴニスト(例えば、Byetta(商標)、エキセンディン−3およびエキセンディン−4)、タンパク質チロシンホスファターゼ−1B(PTP−1B)阻害剤(例えば、トロズスクエミン、ヒルチオサール抽出物、およびZhang,S.ら、Drug Discovery Today、12(9/10)、373〜381(2007)によって開示されている化合物)、SIRT−1阻害剤(例えば、レセルバトロール(reservatrol))、ジペプチジルペプチデアーゼIV(DPP−IV)阻害剤(例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチンおよびサクサグリプチン)、インスリン分泌促進物質、脂肪酸酸化阻害剤、A2アンタゴニスト、c−junアミノ末端キナーゼ(JNK)阻害剤、インスリン、インスリン様作用薬、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、VPAC2受容体アゴニストおよびグルコキナーゼ活性化剤がある。好ましい抗糖尿病薬は、メトホルミン、グルカゴン様ペプチド1(GLP−1)アゴニスト(例えば、Byetta(商標))およびDPP−IV阻害剤(例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチンおよびサクサグリプチン)である。
本明細書の以下に記載されている実施例は、例示的な目的のために過ぎない。本明細書において反映されている組成物、方法、および種々のパラメーターは、本発明の種々の態様および実施形態を例示するものに過ぎず、決して特許請求した発明の範囲を限定するものではない。
後述の化合物および中間体は、有機化学の命名法およびCAS索引規則に対するIUPAC(国際純正および応用化学連合)勧告に基づいて一般に命名した。特に指摘がない限り、全ての反応物は、商業的に得た。本明細書の以下に引用した全ての参考文献は、参照により組み込まれている。
フラッシュクロマトグラフィーは、Stillら、J.Org.Chem.、1978、43、2923によって記載されている方法に基づいて行った。
本明細書で論じている全てのBiotage(登録商標)精製は、KP−SILシリカ(40〜63μM、60オングストローム)を含有する40Mまたは40S Biotage(登録商標)カラム(Bioatge AB、Uppsala、スウェーデン)を用いて行った。
本明細書で論じている全てのCombiflash(登録商標)精製は、充填RediSep(登録商標)シリカカラムを利用したCombiFlash(登録商標)Companion system(Teledyne Isco、米国ネブラスカ州Lincoln)を用いて行った。
質量スペクトルは、Waters(Waters Corp.、米国マサチューセッツ州Milford)Micromass Platform II分光計で記録した。特に指定のない限り、質量スペクトルは、Waters(米国マサチューセッツ州Milford)Micromass Platform II分光計で記録した。
プロトンNMR化学シフトは、テトラメチルシランから低磁場に百万分率で示され、Varian Unity 400または500MHz(メガヘルツ)分光計(Varian Inc.、米国カリフォルニア州Palo Alto)で記録した。NMR化学シフトは、テトラメチルシラン(プロトンの場合)またはフルオロトリクロロメタン(フッ素の場合)から低磁場に百万分率で示される。
下記の調製を、次の実施例に例示されている化合物を合成する際に使用した。
鍵となる中間体および出発物質
ピラゾロスピロケトン出発物質
例示された化合物を調製するために使用されたピラゾロスピロケトンは、次のピラゾロスピロケトン調製1〜21のいずれかの方法を使用して調製した。
ピラゾロスピロケトン調製1
2’−フェニル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
フェニルヒドラジン(10.0g、92.5mmol)の水(30mL)溶液に、酢酸(8.8mL)を加え、続いて、水(400mL)中のピルブアルデヒド(16.7g、92.5mmol)を15分間にわたって滴下した。溶液を室温で一晩撹拌した。反応物を濾過し、生じた固体を水(2×30mL)で洗浄すると、2−オキソプロパナールフェニルヒドラゾンが黄色の固体(15.2g、101%)として得られた。
酢酸(60mL)中の2−オキソプロパナールフェニルヒドラゾン(5.00g、30.8mmol)に、40%グリオキサール水溶液(5.9g、4.6mL、30.8mmol)を加え、混合物を45分間加熱還流した。酢酸を減圧下で除去した。生じた混合物を酢酸エチル(100mL)で希釈し、NaHCO3および飽和NaCl水溶液で洗浄した。固体を濾過により除去し、濾液をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をCombiFlash(180gカラム、0〜20 EtOAc/ヘプタン勾配)により精製すると、1−(4−ヒドロキシ−1−フェニル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノンが黄色の固体(2.70g、43%)として得られた。
1−(4−ヒドロキシ−1−フェニル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(2.70g、13.4mmol)のメタノール(25mL)溶液に、Boc−4−ピペリドン(2.66g、13.3mmol)およびピロリジン(0.95g、1.1mL、13.3mmol)を加えた。混合物を室温で6日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗製物質をCombiFlash(80gカラム、CH2Cl2−ヘプタン(1:1)/メタノール勾配)により精製すると、tert−ブチル7’−オキソ−2’−フェニル−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレートが茶色の固体(1.33g、26%)として得られた。
tert−ブチル7’−オキソ−2’−フェニル−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(1.33g、3.47mmol)の溶液に、トリフルオロ酢酸(5mL)を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去すると、表題化合物が茶色のオイル(0.98g、71%)として得られた。
ピラゾロスピロケトン調製2
2’−イソプロピル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
塩酸イソプロピルヒドラジン(2.0g、18mmol)の水(100mL)溶液に、酢酸(1.7mL)を加え、続いて、水中のピルブアルデヒド(2.6g、14.5mmol)を滴下添加した。溶液を室温で一晩撹拌した。水性層をCH
2Cl
2(4×)で抽出し、合わせた有機抽出物を飽和NaHCO
3水溶液で洗浄した。有機抽出物をNa
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、2−オキソプロパナールイソプロピルヒドラゾン(1.3g、56%)が得られた。
40%ギオキサール(gyoxal)水溶液(1.47g、1.16mL、10.1mol)を、2−オキソプロパナールイソプロピルヒドラゾン(1.3g、10mmol)の水(90mL)溶液に加えた。混合物を2時間加熱還流し、室温に冷却し、CH2Cl2(4×)で抽出した。合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、1−(4−ヒドロキシ−1−イソプロピル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノンが黄色のオイル(1.40g、82%)として得られた。
1−(4−ヒドロキシ−1−イソプロピル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(1.40g、8.3mmol)のメタノール(13mL)溶液に、ピロリジン(0.59g、0.69mL、8.3mmol)を加えた。混合物を室温で2時間撹拌し、その後、Boc−4−ピペリドン(1.66g、8.32mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗製物質をCombiFlash(40gカラム、30〜50%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、tert−ブチル2’−イソプロピル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレートがコハク色の泡(1.08g、37%)として得られた。
tert−ブチル2’−イソプロピル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(1.08g、3.09mmol)のジオキサン(10mL)溶液に、ジオキサン中4MのHCl(7.7mL)を加え、混合物を室温で30分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、2−メチルテトラヒドロフランと共に摩砕した。固体を濾過し、2−メチルテトラヒドロフランで洗浄し、固体を空気乾燥させた。固体は吸湿性であり、この物質をCH2Cl2に入れ、濃縮した。生じた固体を減圧下で乾燥させると、表題化合物が茶色の泡(0.53g、68%)として得られた。
ピラゾロスピロケトン調製3
2’−エチル−3’−メチル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
メチルグリオキサール(ピルブアルデヒド)(40%、6.5mL、40mmol)の水溶液をシュウ酸エチルヒドラジン(1g、6.7mmol)および酢酸(0.57mL、10mmol)の水(11mL)溶液に加え、生じた混合物を3時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、EtOAc(3×)で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)により、ヘプタンからヘプタン:酢酸エチル(80:20)への勾配で溶離して精製すると、1−(1−エチル−4−ヒドロキシ−5−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン622mg(56%)が白色の固体として得られた。
1−(1−エチル−4−ヒドロキシ−5−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(1.93g、11.5mmol)のメタノール(20mL)溶液に、ピロリジン(0.82g、0.95mL、11.5mmol)を加えた。混合物を室温で2.5時間撹拌し、その後、Boc−4−ピペリドン(2.29g、11.5mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗製物質をCombiFlash(120gカラム、0〜50%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、tert−ブチル2’−エチル−3’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレートが黄色の泡(2.38g、59%)として得られた。
tert−ブチル2’−エチル−3’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(2.38g、6.81mmol)のジオキサン(17mL)溶液に、ジオキサン中4MのHCl(17mL)を加え、混合物を室温で20分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、2−メチルテトラヒドロフランおよび少量のエタノールと共に摩砕した。固体を濾過により単離し、2−メチルテトラヒドロフランで洗浄し、空気乾燥させると、表題化合物が黄色の固体(1.78g、92%)として得られた。
ピラゾロスピロケトン調製4
2’−エチル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
シュウ酸エチルヒドラジン(5.0g、33mmol)の水(50mL)溶液に、ピルブアルデヒド(4.80g、4.33mL、26.6mmol)の水(550mL)溶液を滴下添加した。溶液を室温で一晩撹拌した。水性層をCH
2Cl
2(4×)で抽出した。合わせた有機抽出物を飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。CombiFlash(40gカラム、0〜30%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、2−オキソプロパナールエチルヒドラゾンが黄色のオイル(1.83g、48%)として得られた。
40%グリオキサール水溶液(2.3g、1.8mL、16mmol)を2−オキソプロパナールエチルヒドラゾン(1.83g、16mmol)の水(90mL)溶液に加えた。混合物を1時間加熱還流した。反応物を室温に冷却し、CH2Cl2(4×)で抽出した。合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、1−(1−エチル−4−ヒドロキシ−1H−ピラゾール−3−イル)エタノンが黄色のオイル(2.16g、87%)として得られた。
1−(1−エチル−4−ヒドロキシ−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(2.16g、14mmol)のメタノール(20mL)溶液に、ピロリジン(1.0g、1.2mL、14mmol)を加えた。混合物を室温で2時間撹拌し、その後、Boc−4−ピペリドン(2.79g、14mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗製物質をCombiFlash(80gカラム、30〜50%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、tert−ブチル2’−エチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレートが黄色の泡(2.39g、51%)として得られた。
tert−ブチル2’−エチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(2.39g、7.13mmol)のジオキサン(18mL)溶液に、ジオキサン中4MのHCl(18mL)を加え、混合物を室温で45分間撹拌した。固体が溶液から沈殿し、これを、真空濾過により単離した。固体を真空濾過により単離し、続いて、2−メチルテトラヒドロフランおよび少量のエタノールに入れた。固体を濾過により単離し、2−メチルテトラヒドロフランで洗浄し、空気乾燥させると、表題化合物が黄色の固体(1.67g、76%)として得られた。
ピラゾロスピロケトン調製5
2’−(3−メトキシフェニル)−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
酢酸(1.7mL)を3−メトキシフェニルヒドラジン(3.0g、17mmol)の水(35mL)溶液に加えた。次いで、この混合物をピルブアルデヒド(3.1g、2.8mL、17mmol)の水(45ml)溶液に15分にわたって滴下した。混合物を2日間撹拌し、固体を濾過により除去し、水で洗浄すると、2−オキソプロパナール(3−メトキシフェニル)ヒドラゾンが黒色の固体(1.1g、33%)として得られた。
2−オキソプロパナール(3−メトキシフェニル)ヒドラゾン(2.88g、14.5mmol)、酢酸(20mL)およびグリオキサール(6.3g、5.0mL、43mmol)の混合物を一晩加熱還流した。反応物を室温に冷却し、EtOAcで希釈し、飽和NaCl水溶液で洗浄した。黒色のスラッジをデカンテーションにより除去し、濾液をさらなる飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。CombiFlash(80gカラム、0〜50%ヘプタン/EtOAc勾配)により精製すると、1−[4−ヒドロキシ−1−(3−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イル]エタノン(330mg、10%)が得られた。
1−[4−ヒドロキシ−1−(3−メトキシフェニル)−1H−ピラゾール−3−イル]エタノン(90mg、0.39mmol)のメタノール(2mL)溶液にピロリジン(32μL、0.39mmol)を加えた。混合物を室温で20分間撹拌し、その後、N−Boc−4−ピペリドン(77mg、0.39mmol)を加えた。生じた混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、CombiFlash(80gカラム、0〜5%CH2Cl2/メタノール勾配)により精製すると、tert−ブチル2’−(3−メトキシフェニル)−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(66mg、41%)が得られた。
tert−ブチル2’−(3−メトキシフェニル)−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(66mg、0.16mmol)のメタノール(1.5mL)溶液に、ジエチルエーテル中2MのHCl(1.2mL)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去すると、表題化合物が塩酸塩(60mg、107%)として得られた。
ピラゾロスピロケトン調製6
2’,3’−ジメチル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
酢酸(4.1mL)をメチルヒドラジン(2.0g、2.3mL、43mmol)の水(100mL)溶液に徐々に加えた。次いで、この混合物をピルブアルデヒド(6.26g、5.65mL、34.7mmol)の水(175mL)溶液に滴下添加した。生じた混合物を室温で2日間撹拌した。水相をCH
2Cl
2(4×)で抽出し、合わせた有機抽出物を飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、2−オキソプロパナールメチルヒドラゾン(3.4g、78%)が得られた。
40%ピルブアルデヒド水溶液(5.5mL、34mmol)に、2−オキソプロパナールメチルヒドラゾン(3.4g、34mmol)の水(100mL)溶液を加えた。混合物を2時間加熱還流し、その後、室温に冷却した。混合物をEtOAc(4×)で抽出した。合わせた有機抽出物をNaSO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、CombiFlash(40gカラム、0〜30%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、1−(4−ヒドロキシ−1,5−ジメチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(2.02g、39%)が得られた。
ピロリジン(0.93g、1.1mL、13mmol)を、1−(4−ヒドロキシ−1,5−ジメチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(2.02g、13mmol)のメタノール(20mL)溶液に加えた。混合物を室温で2.5時間撹拌し、その後、N−Boc−ピペリドン(2.61g、13mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、その後、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をCombiFlash(120gカラム、0〜50%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、tert−ブチル2’,3’−ジメチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(2.38g、54%)が得られた。
tert−ブチル2’,3’−ジメチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(2.38g、7.10mmol)のジオキサン(17mL)溶液に、ジオキサン中4MのHCl(17mL)を加えた。混合物を室温で20分間撹拌し、その後、乾燥するまで濃縮した。残渣を2−メチルテトラヒドロフランおよび少量のエタノールと共に摩砕した。固体を濾過により単離し、2−メチルテトラヒドロフランで洗浄し、空気乾燥させると、表題化合物が黄色の固体(1.70g、88%)として得られた。
ピラゾロスピロケトン調製7
2’−メチル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
40%グリオキサール水溶液(7.1mL、62mmol)に、2−オキソプロパナールメチルヒドラゾン(6.17g、61.6mmol)の水(300mL)溶液を加えた。混合物を1時間加熱還流し、その後、室温に冷却した。混合物をCH
2Cl
2(4×)で抽出した。合わせた有機抽出物をNaSO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、CombiFlash(120gカラム、30〜40%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、1−(4−ヒドロキシ−1−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(5.93g、69%)が得られた。
ピロリジン(3.0g、3.5mL、42mmol)を、1−(4−ヒドロキシ−1−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(5.93g、42.3mmol)のメタノール(50mL)溶液に加えた。混合物を室温で2時間撹拌し、その後、N−Boc−ピペリドン(8.43g、42.3mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、その後、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をCombiFlash(120gカラム、30〜50%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、未反応の出発物質を含有する所望の生成物が得られた。この物質を30%EtOAc/ヘキサンと共に摩砕し、固体を濾過し、空気乾燥させると、tert−ブチル2’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(6.8g、50%)が得られた。
tert−ブチル2’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(6.83g、21.3mmol)の1:1のトリフルオロ酢酸/CH2Cl2(全体積38mL)溶液を室温で15分間撹拌した。これに、1NのHClを加え、混合物をEtOAcで抽出した。水相を飽和NaHCO3水溶液で中和し、CH2Cl2で抽出した。固体がCH2Cl2抽出物中に生じ、真空濾過により単離すると、表題化合物が白色の固体(2.66g、43%)として得られた。水相をCHCl3(3×)で逆抽出し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、表題化合物の第2のバッチ(1.36g、29%)が得られた。1NのNaOHを用いて、水相をpH12まで塩基性にし、CHCl3(6×)で抽出し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、表題化合物の第3のバッチ(1.56g、33%)が得られた。
ピラゾロスピロケトン調製8
2’−プロピル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
酢酸(2.9mL、50mmol)をシュウ酸n−プロピルヒドラジン(5.0g、30mmol)の水(100mL)溶液に加えた。この混合物を、ピルブアルデヒド(4.39g、3.96mL、24.4mmol)の水(500mL)溶液に加えた。溶液を室温で一晩撹拌した。水相をCH
2Cl
2(4×)で抽出し、合わせた有機抽出物を飽和NaHCO
3水溶液で洗浄し、Na
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、2−オキソプロパナールプロピルヒドラゾン(3.74g、96%)が得られた。
40%グリオキサール水溶液(4.23g、3.35mL、29.2mmol)を2−オキソプロパナールプロピルヒドラゾン(3.74g、29.2mmol)の水(185mL)溶液に加えた。混合物を1時間加熱還流した。反応物を室温に冷却し、CH2Cl2(4×)で抽出した。合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、純度50%の1−[4−(ヒドロキシメチル)−1−プロピル−1H−ピラゾール−3−イル]エタノン(3.60g、73%)が得られた。
ピロリジン(1.52g、1.77mL、21.4mmol)を1−[4−(ヒドロキシメチル)−1−プロピル−1H−ピラゾール−3−イル]エタノン(3.6g、21mmol)のメタノール(33mL)溶液に加えた。混合物を室温で2時間撹拌し、その後、N−Boc−ピペリドン(4.26g、21.4mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、その後、乾燥するまで濃縮した。粗製物質をCombiFlash(80gカラム、30〜50%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、tert−ブチル7’−オキソ−2’−プロピル−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(1.93g、26%)が得られた。
tert−ブチル7’−オキソ−2’−プロピル−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(1.39g、3.98mmol)のジオキサン(10mL)溶液に加え、20分間撹拌した。混合物を濃縮し、2−メチルテトラヒドロフランおよび少量のエタノールと共に摩砕した。濾過により、固体を単離し、2−メチルテトラヒドロフランで洗浄し、一晩乾燥させると、表題化合物(853mg、86%)が得られた。
ピラゾロスピロケトン調製9
3’−メチル−2’−(2,2,2−トリフルオロエチル)−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
40%メチルグリオキサール水溶液(33.2g、184mmol)を水(100mL)中の70%トリフルオロエチルヒドラジン水溶液(10g、61mmol)に加えた。生じた混合物を2.5時間加熱還流した。反応物を室温に冷却し、EtOAcで抽出し、水、飽和NaHCO
3水溶液で洗浄し、Na
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をCombiFlash(80gカラム、EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、1−[4−ヒドロキシ−5−メチル−1−(2,2,2−トリフルオロエチル)−1H−ピラゾール−3−イル]エタノン(3.51g、25%)が得られた。
1−[4−ヒドロキシ−5−メチル−1−(2,2,2−トリフルオロエチル)−1H−ピラゾール−3−イル]エタノン(3.51g、15.8mmol)のメタノール(25mL)溶液に、N−Boc−4−ピペリドン(3.15g、15.8mmol)を、続いて、ピロリジン(1.12g、1.32mL、15.8mmol)を加えた。混合物を室温で6日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、CombiFlash(120gカラム、EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、tert−ブチル3’−メチル−7’−オキソ−2’−(2,2,2−トリフルオロエチル)−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(1.22g、16%)が得られた。
tert−ブチル3’−メチル−7’−オキソ−2’−(2,2,2−トリフルオロエチル)−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(1.22g、3.02mmol)のCH2Cl2(20mL)溶液に、トリフルオロ酢酸(8mL)を加えた。混合物を室温で4時間撹拌し、その後、濃縮すると、表題化合物の塩酸塩が得られた。
ピラゾロスピロケトン調製10
2’−ベンジル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
塩酸ベンジルヒドラジン(11.1g、57.1mmol)の水(100mL)溶液に、ピルブアルデヒド(10.3g、9.3mL、57.1mmol)の水(500mL)溶液を滴下添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をCH
2Cl
2(4×150mL)で希釈した。合わせた有機抽出物を飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、2−オキソプロパナールベンジルヒドラゾン(10.1g、100%)が得られた。
40%グリオキサール水溶液(8.28g、6.55mL、57.1mmol)に、2−オキソプロパナールベンジルヒドラゾン(10.1g、57.1mmol)の水(250mL)およびメタノール(25mL)中のスラリーを加えた。生じた混合物を3時間加熱還流し、その後、室温に冷却した。混合物をEtOAc(2×100mL)で抽出し、合わせた有機抽出物を水、飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をCombiFlash(120gカラム、0〜100%EtOAc/ヘプタン勾配)により精製すると、1−(1−ベンジル−4−ヒドロキシ−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(4.07g、33%)が得られた。
1−(1−ベンジル−4−ヒドロキシ−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(4.07g、18.8mmol)のメタノール(50mL)溶液に、N−Boc−4−ピペリドン(3.75g、18.8mmol)を、続いて、ピロリジン(1.34g、1.57mL、18.8mmol)を加えた。混合物を室温で6日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、CombiFlash(120gカラム、EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、tert−ブチル2’−ベンジル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(3.02g、40%)が得られた。
tert−ブチル2’−ベンジル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(1.22g、3.02mmol)のCH2Cl2(6mL)溶液に、トリフルオロ酢酸(3mL)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、その後、濃縮すると、表題化合物のトリフルオロ酢酸塩(311mg、100%)が得られた。
ピラゾロスピロケトン調製11
2−メトキシ−4−(3’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−2’−イル)ベンゾニトリル
4−フルオロ−2−メトキシベンゾニトリル(100g、0.662mol)のエタノール(0.66L)溶液に、ヒドラジン一水和物(331g、0.321L、6.62mol)を加えた。混合物を一晩加熱還流した。反応物を室温に冷却し、水(750mL)で希釈し、1.5時間撹拌し、生じた固体を濾過により集めた。固体を水(2×250mL)ですすぎ、3時間空気乾燥させた。次いで、固体を真空炉中、45℃で乾燥させた。物質をジオキサン(2L)に溶かし、HClガスを30分間気泡導入した。生じた固体を濾過し、メチルtert−ブチルエーテル(2×1L)で洗浄した。固体を1時間空気乾燥させ、生じた固体を真空炉中、45℃で乾燥させると、−ヒドラジノ−2−メトキシベンゾニトリルヒドロクロリド(115.6g、87.5%)が得られた。
塩酸2−メトキシベンゾニトリル(1.00g、5.00mmol)の酢酸(20mL)およびメチルグリオキサール(1.80g、1.63mL、25.0mmol)混合物を一晩加熱還流した。混合物を室温に冷却し、EtOAcおよび飽和NaCl水溶液で希釈した。固体を濾過により除去し、有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。有機抽出物をMgSO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をCombiFlash(40gカラム、0〜10 CH2Cl2/MeOH勾配)により精製すると、4−(3−アセチル−4−ヒドロキシ−5−メチル−1H−ピラゾール−1−イル)−2−メトキシベンゾニトリル(47mg、4%)が得られた。
4−(3−アセチル−4−ヒドロキシ−5−メチル−1H−ピラゾール−1−イル)−2−メトキシベンゾニトリル(47mg、0.17mmol)のメタノール(2mL)溶液に、N−Boc−4−ピペリドン(34mg、0.17mmol)を、続いて、ピロリジン(12mg、14μL、0.17mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、CombiFlashにより精製すると、tert−ブチル2’−(4−シアノ−3−メトキシフェニル)−3’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(74mg、95%)が得られた。
tert−ブチル2’−(4−シアノ−3−メトキシフェニル)−3’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(74mg、0.16mmol)のメタノール(1mL)および濃HCl(0.82mL)溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去すると、表題化合物の塩酸塩(70mg、110%)が得られた。
ピラゾロスピロケトン調製12
3’−エチル−2’−メチル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
2−オキソプロパナールメチルヒドラゾン(3.0g、30mmol)の水150mL)溶液に、2−オキソブチルアルデヒド(4.0g、46mmol)を加えた。混合物を2時間加熱還流し、その後、室温に冷却した。混合物をCH
2Cl
2(4×)で抽出し、合わせた有機抽出物をNa
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質は、1−(5−エチル−4−ヒドロキシ−1−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(2.93g、37%)を未反応の2−オキソプロパナールメチルヒドラゾンと共に含有し、この物質を、さらに精製することなくそのまま使用した。
1−(5−エチル−4−ヒドロキシ−1−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(2.93g、17.4mmol)のメタノール(27mL)溶液に、ピロリジン(1.24g、1.44mL、17.4mmol)を加え、混合物を2時間撹拌した。この混合物に、N−Boc−4−ピペリドン(3.47g、17.4mmol)を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、CombiFlash(80gカラム、30〜50%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、tert−ブチル3’−エチル−2’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(376mg、6.2%)が得られた。
tert−ブチル3’−エチル−2’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(376mg、1.08mmol)のジオキサン(4mL)溶液に、ジオキサン中4MのHCl(2.7mL)を加えた。混合物を室温で30分間撹拌し、その後、濃縮した。粗製物質を2−メチルテトラヒドロフランおよび少量のエタノールと共に摩砕した。固体を濾過により集め、2−メチルテトラヒドロフランで洗浄し、空気乾燥させると、表題化合物の塩酸塩(242mg、90%)が得られた。
ピラゾロスピロケトン調製13
2’−ピリジン−2−イル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
2−ピリジルヒドラジン(10.0g、91.6mmol)の水(30mL)溶液に、酢酸(8.7mL)を加えた。次いで、この混合物を、ピルブアルデヒド(16.5g、14.9mL、91.6mmol)の水(400mL)溶液に加えた。混合物を室温で3日間撹拌した。混合物をNaHCO
3(固体)で中和すると、黄色の沈殿物が形成する。濾過により、固体を単離し、次いで、水(30mL)で洗浄した。固体を高真空下で乾燥させると、2−オキソプロパナールピリジン−2−イルヒドラゾンが黄色の固体(6.12g、41%)として得られた。
2−オキソプロパナールピリジン−2−イルヒドラゾン(6.12g、37.5mmol)およびグリオキサール(16.3g、12.9mL、113mmol)の水(50mL)およびメタノール(10mL)溶液を一晩加熱還流した。混合物を室温に冷却し、EtOAcで希釈し、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で順次洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をシリカゲルプラグに、ヘプタン/EtOAc(1:2、300mL)で溶離して通過させると、1−(4−ヒドロキシ−1−ピリジン−2−イル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(199mg、2.6%)が得られた。
1−(4−ヒドロキシ−1−ピリジン−2−イル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(199mg、0.98mmol)のメタノール(5mL)溶液に、N−Boc−4−ピペリドン(195mg、0.98mmol)およびピロリジン(70μL、0.98mmol)を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、EtOAcで希釈し、NaHCO3(1×)、飽和NaCl水溶液(3×)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、エナミンtert−ブチル2’−ピリジン−2−イル−7’−ピロリジン−1−イル−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(198mg、56%)が得られた。
tert−ブチル2’−ピリジン−2−イル−7’−ピロリジン−1−イル−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(198mg、0.52mmol)のCH2Cl2(10mL)溶液に、トリフルオロ酢酸(4mL)および水(0.5mL)を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去すると、表題化合物のトリフルオロ酢酸塩が得られた。
ピラゾロスピロケトン調製14
2’−(テトラヒドロフラン−3−イル)−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
酢酸(1.7mL)を塩酸テトラヒドロフラン−3−イルヒドラジン(2.50g、18.0mmol)(Bacon,E.R.;Singh,B.;およびLesher,G.Y.により米国特許第5,294,612号に記載されている通りに調製)の水(30mL)溶液に徐々に添加した。次いで、この混合物を、ピルブアルデヒド(2.59g、2.34mL、14.4mmol)の水(240mL)溶液に滴下添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を分離漏斗に注ぎ、NaClを加え、水相に溶かし、次いで、CH
2Cl
2(6回)で抽出した。合わせた有機抽出物をNa
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、粗製物質が得られ、これを、オイルをSiO
2に予備吸着させ、続いて、クロマトグラフィー(Isco、80g RediSepカラム)により0〜80%EtOAc/ヘプタン勾配で80分にわたって溶離して精製した。フラクションを分析すると、2−オキソプロパナールテトラヒドロフラン−3−イルヒドラゾン(1.19g、53%)の単離が生じた。
40%グリオキサール水溶液(0.83g、0.65mL、5.7mmol)を水(50mL)中の2−オキソプロパナールテトラヒドロフラン−3−イルヒドラゾン(0.89g、5.7mmol)に加えた。混合物を1時間加熱還流し、室温に冷却し、一晩撹拌した。混合物をCH2Cl2(4回)で抽出し、合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、高真空下で乾燥させると、粗製物質が得られた。粗製オイルをSiO2に予備吸着させ、続いて、クロマトグラフィー(Isco CombiFlash 100、40g RediSepカラム)により25〜55%EtOAc/ヘプタン勾配で40分にわたり、55%で10分保持して溶離することにより、精製を達成すると、1−[4−ヒドロキシ−1−(テトラヒドロフラン−3−イル)−1H−ピラゾール−3−イル]エタノン(1.12g、19%)および1−[4−ヒドロキシ−5−メチル−1−(テトラヒドロフラン−3−イル)−1H−ピラゾール−3−イル]エタノン(1.20g、8.4%)が得られた。
1−[4−ヒドロキシ−1−(テトラヒドロフラン−3−イル)−1H−ピラゾール−3−イル]エタノン(210mg、1.07mmol)のメタノール(3mL)溶液に、ピロリジン(76mg、88μL、1.07mmol)を加えた。この混合物を室温で2時間撹拌し、その後、N−Boc−4−ピペリドン(213mg、1.07mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、その後、濃縮した。粗製物質をSiO2に予備吸着させ、10〜50%EtOAc/ヘプタン勾配で50分にわたって溶離してクロマトグラフィー処理すると(Isco CombiFlash 100、12g RediSepカラム)、tert−ブチル7’−オキソ−2’−(テトラヒドロフラン−3−イル)−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(404mg、36%)が得られた。
tert−ブチル7’−オキソ−2’−(テトラヒドロフラン−3−イル)−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(144mg、0.38mmol)の1,4−ジオキサン(2mL)溶液に、ジオキサン中4MのHCl(0.96mL)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌し、その後、乾燥するまで濃縮した。ジエチルエーテルおよび少量のエタノールと共に摩砕した。固体を真空濾過により集め、ジエチルエーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させると、2’−(テトラヒドロフラン−3−イル)−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン(49mg、41%)が得られた。
ピラゾロスピロケトン調製15
3’−メチル−2’−(テトラヒドロフラン−3−イル)−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
1−[4−ヒドロキシ−5−メチル−1−(テトラヒドロフラン−3−イル)−1H−ピラゾール−3−イル]エタノン(ピラゾロスピロケトン調製14に記載されている通りに調製)(304mg、1.45mmol)のメタノール(4.5mL)溶液に、ピロリジン(103mg、120μL、1.45mmol)を加えた。この混合物を室温で2時間撹拌し、その後、N−Boc−4−ピペリドン(288mg、1.45mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、その後、濃縮した。粗製物質をSiO
2に予備吸着させ、10〜50%EtOAc/ヘプタン勾配で50分にわたって溶離して、クロマトグラフィー処理すると(Isco CombiFlash 100、12g RediSepカラム)、tert−ブチル3’−メチル−7’−オキソ−2’−(テトラヒドロフラン−3−イル)−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(299mg、53%)が得られた。
tert−ブチル3’−メチル−7’−オキソ−2’−(テトラヒドロフラン−3−イル)−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(295mg、0.75mmol)の1,4−ジオキサン(4mL)溶液に、ジオキサン中4MのHCl(1.9mL)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌し、その後、乾燥するまで濃縮した。ジエチルエーテルおよび少量のエタノールと共に摩砕した。固体を真空濾過により集め、ジエチルエーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させると、3’−メチル−2’−(テトラヒドロフラン−3−イル)−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン(106mg、43%)が得られた。
ピラゾロスピロケトン調製16
2’−tert−ブチル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
200L反応器に:水(72L)および一塩酸(1,1−ジメチルエチル)ヒドラジン(13.4kg、108モル)を投入した。溶液を23℃で15分間撹拌し(全ての固体が溶けるまで)、次いで、2−オキソ−プロパナール(14.8kg、82.1モル)を加え、少なくとも4時間保持した。反応溶液をMTBE(54L)で2回抽出した。合わせた有機層を1NのNaOH(32L)で2回、水(32L)で1回洗浄し、最小撹拌体積まで濃縮(220mmHg、30℃)した。この濃縮物に、水(72L)、エタンジアール(グリオキサルデヒド)(27.3kg、188モル)を加え、反応物を95℃に加熱し、残渣MTBEを留去させて、所望の温度を達成した。1.5時間後に、混合物を周囲温度に冷却し(1時間にわたって)、MTBE(54L)で2回抽出した。合わせた有機層を1NのNaOH(34L)で2回洗浄した。合わせた水性層を5℃に冷却し、水中33〜40wt/wt%のHCl(6L)を用いてpH3に酸性化し、次いで、MTBE(54L)で2回抽出した。合わせた有機層を水(36L)で洗浄し、最小撹拌体積まで濃縮した(200mmHg、30℃)。濃縮物に、メタノール(109L)、N−BOC−4−ピペリドン(16.7kg、84モル)およびピロリジン(1.4L、16モル)を加えた。反応物を68℃に24時間加熱し、50℃に冷却し、真空にして、最小撹拌体積まで蒸留した。真空を外し、酢酸エチル(45L)を加え、蒸留して(大気圧)僅かな撹拌体積にし、次いで、MTBE(72L)を加えた。溶液を穏やかな還流まで戻し、次いで、周囲温度に3時間にわたって冷却している間に、n−ヘプタン(82L)を30分にわたって加えた。Nutsche Filterで固体を濾過し、1:1.1のMTBE/n−ヘプタン(50L)で洗浄し、真空下、50℃で12時間乾燥させた。tert−ブチル2’−tert−ブチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート10.0kg(27.5モル、全体で33%)が白色の結晶質固体として単離された。
200L反応器に、tert−ブチル2’−tert−ブチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(8.3kg、22.8モル)、酢酸エチル(89L)およびメタノール(24L)を投入した。溶液を0℃に冷却し、塩化アセチル(11.0L、155モル)を30分にわたって加えた。添加の後に、反応物を周囲温度に加温し、4時間反応させた。溶液を加熱して、41Lの反応体積まで蒸留し、内部温度が72℃に達するまで、酢酸エチル(約22L)を徐々に再充填した。3時間にわたって周囲温度まで冷却し、Nutsche Filterで固体を濾過し、酢酸エチル(5.3L)で洗浄し、真空下、50℃で12時間乾燥させた。2’−tert−ブチル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン6.6kg(22.0モル、96%)が白色の結晶質固体として単離された。
ピラゾロスピロケトン調製17
2’−シクロヘキシル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
酢酸(3.15mL、54.8mmol)をシクロヘキシルヒドラジン HClのH
2O(60mL)溶液に徐々に加えた。次いで、生じた溶液をピルブアルデヒド(4.78g、26.6mmol)のH
2O(540mL)溶液に滴下添加した。この溶液を室温で一晩撹拌した。水性層をCH
2Cl
2(4×)で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、減圧下で濃縮した。次いで、粗製生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介して、100%ヘキサンからヘキサン:酢酸エチルの70:30混合物への勾配で溶離して精製すると、2−オキソプロパナールシクロヘキシル−ヒドラゾン2.54g(45%)がコハク色のオイルとしてもたらされた。
40%グリオキサール水溶液(1.73mL、15.1mmol)をH2O(125mL)中の2−オキソプロパナールシクロヘキシル−ヒドラゾン(2.54g、15.1mmol)に加えた。次いで、混合物を加熱還流した。1時間後に、混合物を室温に冷却し、CH2Cl2(4×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(Na2SO4)、減圧下で濃縮すると、1−(4−ヒドロキシ−1−シクロヘキシル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン3.22gが黄色のオイルとして得られた。次いで、粗製生成物をさらに精製することなく、次のステップで使用した。
ピロリジン(1.10g、15.5mmol)を1−(4−ヒドロキシ−1−シクロヘキシル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(3.22g、15.5mmol)のMeOH(25mL)溶液に加えた。暗赤色の溶液を室温で2時間撹拌した。次いで、1−(N−Boc)−4−ピペリドン(3.08g、15.5mmol)を溶液に加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、混合物を減圧下で濃縮した。次いで、粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介して酢酸エチル:ヘキサン(30:70から50:50へ)の勾配で溶離して精製すると、黄色物が得られた。次いで、この黄色のオイルをヘキサンで1時間摩砕すると、白色の固体が得られた。固体を濾過し、ヘキサンで洗浄し、一晩空気乾燥させた。tert−ブチル2’−シクロヘキシル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート372mg(6%)が白色の固体として得られた。
tert−ブチル2’−シクロヘキシル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(372mg、0.955mmol)の1,4−ジオキサン(4mL)溶液に室温で、HCl溶液(1,4−ジオキサン中4M、2.39mL、9.55mmol)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで濃縮し、2−メチルテトラヒドロフランおよび少量のEtOH中で約1時間摩砕した。固体を真空濾過により集めると、表題化合物223mg(80%)がオフホワイト色の固体として得られた。
ピラゾロスピロケトン調製18
2’−シクロペンチル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
酢酸(1.39mL、24.2mmol)をシクロペンチルヒドラジンHCl(2.0g、15mmol)のH
2O(24mL)溶液に徐々に加えた。次いで、生じた溶液をピルブアルデヒド(40%、1.90mL、11.7mmol)のH
2O(200mL)溶液に滴下添加した。この溶液を室温で一晩撹拌した。水性層をCH
2Cl
2(4×)で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、減圧下で濃縮した。次いで、粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介して100%ヘキサンからヘキサン:酢酸エチルの70:30混合物への勾配で溶離して精製すると、2−オキソプロパナールシクロペンチルヒドラゾン1.53g(68%)がコハク色のオイルとしてもたらされた。
40%グリオキサール水溶液(1.88mL、16.4mmol)をH2O(125mL)中の2−オキソプロパナールシクロペンチルヒドラゾン(2.53g、16.4mmol)に加えた。次いで、混合物を加熱還流した。1時間後に、混合物を室温に冷却し、CH2Cl2(4×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(Na2SO4)、減圧下で濃縮すると、1−(4−ヒドロキシ−1−シクロペンチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン1.68g(53%)が黄色のオイルとして得られた。次いで、粗製生成物を、さらに精製することなく次のステップで使用した。
ピロリジン(0.615g、8.65mmol)を1−(4−ヒドロキシ−1−シクロペンチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(1.68g、8.65mmol)のMeOH(15mL)溶液に加えた。暗赤色の溶液を室温で2時間撹拌した。次いで、1−(N−Boc)−4−ピペリドン(1.72g、8.65mmol)を溶液に加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、混合物を減圧下で濃縮した。次いで、粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介して酢酸エチル:ヘキサン(30:70から50:50へ)の勾配で溶離して精製すると、黄色物が得られた。次いで、この黄色のオイルをヘキサンで1時間摩砕すると、白色の固体が得られた。固体を濾過し、ヘキサンで洗浄し、一晩空気乾燥させた。tert−ブチル2’−シクロペンチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート811mg(25%)が黄色の固体として得られた。
tert−ブチル2’−シクロペンチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(811mg、2.16mmol)の1,4−ジオキサン(9mL)溶液に室温で、HCl溶液(1,4−ジオキサン中4M、5.40mL、21.6mmol)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで濃縮し、2−メチルテトラヒドロフランおよび少量のEtOH中で約1時間摩砕した。固体を真空濾過により集めると、表題化合物378mg(64%)がオフホワイト色の固体として得られた。
ピラゾロスピロケトン調製19
2’−シクロブチル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
酢酸(2.32mL、40.4mmol)をシクロブチルヒドラジンHCl(3.0g、24mmol)のH
2O(35mL)溶液に徐々に加えた。次いで、生じた溶液をピルブアルデヒド(40%、3.18mL、19.6mmol)のH
2O(300mL)溶液に滴下添加した。この溶液を室温で一晩撹拌した。水性層をCH
2Cl
2(4×)で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、減圧下で濃縮した。次いで、粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介して100%ヘキサンからヘキサン:酢酸エチルの70:30混合物への勾配で溶離して精製すると、2−オキソプロパナールシクロブチルヒドラゾン1.38g(40%)がコハク色のオイルとしてもたらされた。
40%グリオキサール水溶液(1.13mL、9.84mmol)を2−オキソプロパナールシクロブチルヒドラゾン(1.38g、9.84mmol)のH2O(70mL)に加えた。次いで、混合物を加熱還流した。1時間後に、混合物を室温に冷却し、CH2Cl2(4×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(Na2SO4)、減圧下で濃縮すると、1−(4−ヒドロキシ−1−シクロブチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン1.53g(86%)が黄色のオイルとして得られた。次いで、粗製生成物をさらに精製することなく次のステップで使用した。
ピロリジン(0.604g、8.49mmol)を1−(4−ヒドロキシ−1−シクロブチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(1.53g、8.49mmol)のMeOH(15mL)溶液に加えた。暗赤色の溶液を室温で2時間撹拌した。次いで、1−(N−Boc)−4−ピペリドン(1.69g、8.49mmol)を溶液に加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、混合物を減圧下で濃縮した。次いで、粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介して酢酸エチル:ヘキサン(30:70から50:50へ)の勾配で溶離して精製すると、黄色のオイルがもたらされた。次いで、この黄色のオイルをヘキサンで1時間摩砕すると、白色の固体が得られた。固体を濾過し、ヘキサンで洗浄し、一晩空気乾燥させた。tert−ブチル2’−シクロブチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート812mg(27%)が黄色の固体として得られた。
tert−ブチル2’−シクロブチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(812mg、2.25mmol)の1,4−ジオキサン(9mL)溶液に室温で、HCl溶液(1,4−ジオキサン中4M、5.62mL、22.5mmol)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで濃縮し、2−メチルテトラヒドロフランおよび少量のEtOH中で約1時間摩砕した。固体を真空濾過により集めると、表題化合物332mg(57%)がオフホワイト色の固体として得られた。
ピラゾロスピロケトン調製20
2’−シクロプロピル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
酢酸(1.71mL、29.9mmol)をシクロプロピル−ヒドラジン・HCl(2.5g、18.1mmol)のH
2O(30mL)溶液に徐々に加え、次いで、ピルブアルデヒド(40%、2.36mL、14.5mmol)のH
2O(240mL)溶液に迅速に滴下添加した。この溶液を室温で一晩撹拌した。水性層を塩処理し、CH
2Cl
2(4×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(Na
2SO
4)、減圧下で濃縮すると、粗製生成物1.04gが赤色がかったオイルとして得られた。粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介して酢酸エチル/ヘキサン(25:75から50:50へ)の勾配で溶離して精製すると、2−オキソプロパナールシクロプロピルヒドラゾン637mg(35%)が黄色の固体として得られた。
40%グリオキサール水溶液(0.44mL、3.84mmol)をH2O(30mL)中の2−オキソプロパナールシクロプロピルヒドラゾン(485mg、3.84mmol)に加えた。次いで、混合物を加熱還流した。1時間後に、混合物を室温に冷却し、CH2Cl2(4×)で抽出した。層を分離し、有機層を除去した。ブラインを水性層に加え、これをCH2Cl2(2×)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ(Na2SO4)、減圧下で濃縮した。次いで、粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介して酢酸エチル/ヘプタン(10:90から50:50へ)の勾配で溶離して精製すると、1−(4−ヒドロキシ−1−シクロプロピル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン370mg(58%)が黄色のオイルとしてもたらされた。
ピロリジン(0.154g、2.16mmol)を1−(4−ヒドロキシ−1−シクロプロピル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(360mg、2.17mmol)のMeOH(3mL)溶液に加えた。暗赤色の溶液を室温で2時間撹拌した。次いで、1−(N−Boc)−4−ピペリドン(431mg、2.16mmol)をこの溶液に加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。追加量の1−(N−Boc)−4−ピペリドン(50mg)を加えた。反応混合物をさらに4時間撹拌した。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、生じた粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介して酢酸エチル:ヘプタン(10:90から50:50へ)の勾配で溶離して精製すると、tert−ブチル2’−シクロプロピル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート488mg(65%)が得られた。
tert−ブチル2’−シクロプロピル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(475mg、1.37mmol)の1,4−ジオキサン(5mL)溶液に室温で、HClの溶液(1,4−ジオキサン中4M、3.42mL、13.7mmol)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで濃縮し、ジエチルエーテルおよび少量のEtOH中で一晩摩砕した。固体を真空濾過により集め、Et2Oで洗浄し、高真空下で乾燥させると、表題化合物360mg(93%)が緑色の固体として得られた。
ピラゾロスピロケトン調製21
2’−イソプロピル−3’−メチル−2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−7’(6’H)−オン
ピルブアルデヒド(40%、7.3g、41mmol)をシュウ酸エチルヒドラジン(1g、10mmol)および重炭酸ナトリウム(2.27g、27.0mmol)の水(10mL)溶液に加え、生じた混合物を2日間加熱還流した。反応物を室温に冷却し、酢酸エチル(3×)で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ(Na
2SO
4)、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介してヘキサン:酢酸エチル(80:20)で溶離して精製すると、1−(1−i−プロピル−4−ヒドロキシ−5−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン800mg(30%)が明茶色のオイルとして得られた。
ピロリジン(312mg、4.40mmol)を1−(1−i−プロピル−4−ヒドロキシ−5−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)エタノン(800mg、4mmol)のMeOH(10mL)溶液に加えた。暗赤色の溶液を室温で2時間撹拌した。次いで、1−(N−Boc)−4−ピペリドン(875mg、4.40mmol)を溶液に加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、混合物を減圧下で濃縮した。次いで、粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル)を介して酢酸エチル:ヘキサン(30:70から50:50へ)の勾配で溶離して精製すると、tert−ブチル2’−イソプロピル−3’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート542mg(30%)が黄色のオイルとしてもたらされた。
tert−ブチル2’−イソプロピル−3’−メチル−7’−オキソ−6’,7’−ジヒドロ−1H,2’H−スピロ[ピペリジン−4,5’−ピラノ[3,2−c]ピラゾール]−1−カルボキシレート(542mg、1.49mmol)の1,4−ジオキサン(5mL)溶液に室温で、HCl溶液(1,4−ジオキサン中4M、3.73mL、14.9mmol)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで濃縮し、2−メチルテトラヒドロフランおよび少量のEtOH中で摩砕した。固体を真空濾過により集めると、表題化合物303mg(77%)が黄褐色の固体として得られた。
カルボン酸出発物質
次の市販のカルボン酸を使用して、本発明の例示化合物を調製した:4−メトキシ−7−メチル−1H−インドール−2−カルボン酸(Ambinter、Paris、France)、2−オキソ−1,2,3,4−テトラヒドロキノリン−6−カルボン(Ryan Scientific、Mt.Pleasant、SC)、1H−インダゾール−5−カルボン酸(Tyger Scientific,Inc.、Ewing、NJ)、4−エトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(Ryan Scientific、Mt.Pleasant、SC)、4−クロロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Ryan Scientific、Mt.Pleasant、SC)、4,6−ジメトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(Tyger Scientific、Ewing、NJ)、7−メトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(Matrix Scientific、Columbia、SC)、4,6−ジクロロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Oakwood Products,Inc、West Columbia、SC)、7−クロロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Aurora Fine Chemicals、Austria)、7−クロロ−4−メトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(Ambinter、Paris、France)、6,7−ジメトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(MicroChemistry Ltd、Russia)、6−クロロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Matrix Scientific、Columbia、SC)、5−プロポキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(Princeton BioMolecular Research,Inc.、Monmouth Junction、NJ)、6−クロロ−4−フルオロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Ambinter、France)、6−エチル−1H−インドール−2−カルボン酸(Ryan Scientific,Inc.、Mt.Pleasant、SC)、6−フルオロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Ryan Scientific,Inc.、Mt.Pleasant、SC)、3−エチル−1H−インドール−2−カルボン酸(ChemBridge Corp.、San Diego、CA)、5−メトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(ASDI Inc.、Newark、DE)、3−フルオロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Ryan Scientific,Inc.、Mt.Pleasant、SC)、7−(トリフルオロメチル)−1H−インドール−2−カルボン酸(Matrix Scientific、Columbia、SC)、5−フルオロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Ryan Scientific,Inc.、Mt.Pleasant、SC)、5−クロロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Alfa Aesar、Ward Hill、MA)、4,6−ジフルオロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Ryan Scientific,Inc.、Mt.Pleasant、SC)、インドール−2−カルボン酸(ASDI Inc.、Newark、DE)、6−メトキシ−1−メチル−1H−インドール−2−カルボン酸(Matrix Scientific、Columbia、SC)、1−メチル−1H−インドール−2−カルボン酸(ASDI Inc.、Newark、DE)、6−メチル−1H−インドール−2−カルボン酸(Ryan Scientific,Inc.、Mt.Pleasant、SC)、6−イソプロピル−1H−インドール−2−カルボン酸(Ryan Scientific,Inc.、Mt.Pleasant、SC)、5−エチル−1H−インドール−2−カルボン酸(Wako Chemicals USA,Inc.、Richmond、VA)、3−(1H−ピラゾール−3−イル)安息香酸(Maybridge. Cornwall、UK)、7−メチル−1H−ベンズイミダゾール−2−カルボン酸(Advanced Quality Scitech USA,Inc.、Conshohocken、PA)、2−ナフトエ酸(Alfa Aesar、Ward Hill、MA)、5−メトキシ−4,7−ジメチル−1H−インドール−2−カルボン酸(ASDI Inc.、Newark、DE)、3,6−ジメチル−1H−インドール−2−カルボン酸(ASDI Inc.、Newark、DE)、7−メチル−1H−ベンズイミダゾール−2−カルボン酸(Advanced Quality Scitech USA,Inc.、Conshohocken、PA)、1H−ベンズイミダゾール−6−カルボン酸(Affinitis Pharma LLC、New Haven、CT)、3−(1H−ピラゾール−3−イル)安息香酸(3B Scientific Corp、Libertyville、IL)、2−ナプトエ酸(napthoic acid)(Sigma− Sigma−Aldrich、Milwaukee、WI)、ベンズイミダゾール−5−カルボン酸(Sigma−Aldrich、Milwaukee、WI)、1,3−ベンゾオキサゾール−5−カルボン酸(Bosche Scientific,LLC、New Brunswick、NJ)、7−メチル−1H−ベンズイミダゾール−5−カルボン酸(Chemstep、Carbon Blanc、France)、4−メチル−1H−ベンズイミダゾール−2−カルボン酸(Chemstep、Carbon Blanc、France)、5,6−ジメトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(3B Scientific Corporation、Libertyville、IL) 6−メトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(3B Scientific Corporation、Libertyville、IL)、7−フルオロ−1H−インドール−2−カルボン酸(Matrix Scientific、Columbia、SC)、4−(トリフルオロメチル)−1H−インドール−2−カルボン酸(Bosche Scientific,LLC、New Brunswick、NJ)、1−オキソ−2,3,4,9−テトラヒドロ−1H−beta−カルボリン−6−カルボン酸(J & W PharmaLab,LLC、Levittown、PA)、3−アミノ−1,2−ベンズイソチアゾール−5−カルボン酸(Chemstep、Carbon Blanc、France)、ベンゾ[d]チアゾール−6−カルボン酸(ASDI Inc.、Newark、DE)、6−メトキシ−2−ナフトエ酸(Sigma−Aldrich、Milwaukee、WI)、ベンゾフラン−5−カルボン酸(Apollo、Cheshire、UK)、キノリン−5−カルボン酸(Synthonix、Wake Forest、NC)、2−ナフトエ酸(Sigma−Aldrich、Milwaukee、WI)、2−メチルベンゾ[d]チアゾール−5−カルボン酸(ASDI Inc.、Newark、DE)、7−メトキシ−2−ナフトエ酸(3M、St.Paul、MN)、2−オキソ−2,3−ジヒドロベンゾ[d]オキサゾール−6−カルボン酸(ASDI Inc.、Newark、DE)、2−ヒドロキシ−1−メチル−1H−ベンゾ[d]イミダゾール−5−カルボン酸(ASDI Inc.、Newark、DE)、1−メチル−1H−インドール−6−カルボン酸(Ryan Scientific,Inc.、Mt.Pleasant、SC)、キノリン−6−カルボン酸(TCI America、Portland、OR)、7−キノリンカルボン酸(Princeton BioMolecular Research,Inc.、Monmouth Junction、NJ)および6−クロロ−3−メチル−1H−インドール−2−カルボン酸(ASDI Inc.、Newark、DE)。
次のカルボン酸(下記の実施例に記載されている化合物を調製するために使用された)を、既に出版された方法により調製した:6−フルオロ−5−メトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(米国特許第5489593号、実施例92);3,7−ジメチル−1H−インドール−5−カルボン酸(Knepper,K.;Braese,S. Org.Lett.2003、5、2829〜2832);3−メチル−1H−インダゾール−6−カルボン酸(米国特許第6303600号、実施例45);5−メトキシ−4−メチル−1H−インドール−2−カルボン酸(米国特許第4060626号);6−メトキシ−3−メチル−1H−インドール−2−カルボン酸(Gan,T.ら、J.Org.Chem.1997、62、9298〜9304);2−ビニル−1H−インドール−2−カルボン酸(米国特許出願公開第2005/0026987号、化合物151);8−メチル−2−オキソ−1,2−ジヒドロキノリン−6−カルボン酸(J.Med.Chem.、2003、46(14)、3033〜3044と同様);2−オキソ−1,2,3,4−テトラヒドロキノリン−7−カルボン酸(Chem.Pharm.Bull.1986、34(2)、682〜93);3−アミノベンゾ[d]イソチアゾール−5−カルボン酸(J.Med.Chem.2008、51(5)、1231〜1241);2−メチルキノリン−6−カルボン酸(J.Med.Chem.2002、45(21)、4647〜4654);3−オキソ−3,4−ジヒドロ−2H−ベンゾ[b][1,4]オキサジン−7−カルボン酸(J.Med.Chem.2005、48(9)、3110〜3113);5−メトキシ−2−ナフトエ酸(Org.Lett.2008、10(15)、3359〜3362に見られるエステルの加水分解により調製);3−オキソ−3,4−ジヒドロ−2H−ベンゾ[b][1,4]オキサジン−6−カルボン酸(J.Med.Chem.2005、48(9)、3110〜3113);および5−フルオロ−6−メトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸(PCT公開WO9109849)。3−アミノ−1H−インダゾール−5−カルボン酸は、5−ブロモ−1H−インダゾール−3−アミン(Apollo、Cheshire、UK)をカルボニル化することにより調製することができる。1−オキソ−1,2−ジヒドロイソキノリン−6−カルボン酸は、6−ブロモイソキノリン−1(2H)−オン(PharmLab、Levittown、Pa)をカルボニル化することにより調製することができる。1−オキソ−1,2−ジヒドロイソキノリン−7−カルボン酸は、6−ブロモイソキノリン−1(2H)−オン(Alfa Aesar、Ward Hill、MA)をカルボニル化することにより調製することができる。
下記のカルボン酸出発物質(下記の実施例に記載されている化合物を調製するために使用された)を、下記の通りに調製した。
酸調製1
3−メチル−7−メトキシ−1H−インダゾール−5−カルボン酸
セミカルバジドHCl(20g、175mmol)、アセトン(11.1g、192mmol)の水(400mL)溶液に、酢酸ナトリウム(21.5g、262mmol)を室温で加え、18時間維持した。反応混合物を濾過し、得られた固体をエーテル(2×25mL)で洗浄し、70℃で20時間乾燥させると、アセトンセミカルバゾール(15g、75%)が白色の固体として得られた。
1H NMR (CDCl
3) δ 7.95 (br, 1H), 5.9-5.1 (br, 2H), 1.95 (s,
3H), 1.85 (s, 3H).
0℃の冷たいDMF(65mL)に、POCl3(39mL)を30分間滴下添加し、0℃で1時間維持した。混合物にアセトンセミカルバゾール(13g、114mmol)を0℃で滴下添加し、70℃で4時間維持した。混合物を粉砕氷(500g)に注ぎ、10%NaOH溶液を使用して中和し、酢酸エチル(3×150mL)を使用して抽出した。合わせた有機層を水(2×100mL)、飽和NaCl水溶液(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濃縮すると、粗製生成物が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー(60〜120メッシュシリカゲル)によりクロロホルム中2〜4%のメタノールを溶離剤として使用して精製すると、3−メチル−1H−ピラゾール−4−カルボアルデヒド(4g、32%)が固体として得られた。1H NMR (CDCl3) δ
9.96 (s, 1H), 8.0 (s, 1H), 2.6 (s, 3H)。
3−メチル−1H−ピラゾール−4−カルボアルデヒド(9g、82mmol)およびコハク酸ジエチル(57g、327mmol)のt−ブタノール(50mL)溶液に、t−BuOK(37.3g、245mmol)のt−ブタノール(40mL)溶液を加え、混合物を80℃に4時間加熱した。混合物を濃縮し、得られた残渣を水(50mL)に溶かし、6NのHClを使用して酸性化し(pH約2)、酢酸エチル(2×50mL)で抽出した。合わせた有機層をNaHCO3水溶液(2×50mL)で洗浄した。合わせた水性層を酸性化(pH約2)し、酢酸エチル(2×100mL)で抽出した。合わせた酢酸エチル層を飽和NaCl水溶液(25mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濃縮すると、3−(エトキシカルボニル)−4−(3−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)ブト−3−エン酸(20g、100%)がゴムとして得られた。1H NMR (CDCl3) δ 7.85 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 4.3 (t, 2H), 3.65
(s, 2H), 4.4 (s, 3H), 1.3 (t, 3H).
3−(エトキシカルボニル)−4−(3−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)ブト−3−エン酸(20g、84mmol)の無水酢酸(80mL)溶液に、酢酸ナトリウム(13.8g、168mmol)を室温で加え、混合物を4時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、NaHCO3水溶液を使用して塩基性にし(pH約9)、酢酸エチル(2×100mL)で抽出した。合わせた有機層を水(50mL)、飽和NaCl水溶液(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濃縮すると、粗製生成物が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー(100−200メッシュシリカゲル)により石油エーテル中6〜8%の酢酸エチルを溶離剤として使用して精製すると、エチル3−メチル−7−ヒドロキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(10g、40%)がオレンジ色の固体として得られた。1H NMR (CDCl3) δ 8.25 (s, 1H), 7.9 (s, 1H), 4.4 (q, 2H),
2.75 (s, 3H), 2.6 (s, 3H), 2.4 (s, 3H), 1.4 (t, 3H).
0℃のエチル3−メチル−7−ヒドロキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(0.84g、3.8mmol)のDMF(25mL)溶液に、NaHの60%オイル分散液(152mg、3.81mmol)を加えた。0℃で1時間撹拌した後に、ヨードエタン(595mg、0.31mL、3.81mmol)のDMF(3mL)溶液を加えた。混合物を0℃で数時間維持した後に、混合物を、一晩撹拌しながら室温に加温した。EtOAcで希釈し、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和NaCl水溶液で洗浄し、有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をCombiFlash(80gカラム、0〜30%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、エチル7−メトキシ−3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(516mg、55%)が得られた。
エチル7−メトキシ−3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(516mg、2.08mmol)のTHF(17mL)溶液に、1MのLiOH(4.2mL、4.2mmol)を加え、混合物を一晩加熱還流した。分析により、少量の未反応の出発物質の存在が示されたので、少量のエタノールを加えて、物質の可溶化を促進した。さらに2時間、加熱を継続し、その後、乾燥するまで濃縮した。残渣を1NのHClで摩砕し、固体を濾過により単離し、水で洗浄し、一晩空気乾燥させると、表題化合物がオフホワイト色の固体(417mg、91%)として得られた。
酸調製2
3−エチル−7−メトキシ−1H−インダゾール−5−カルボン酸
セミカルバジドHCl(61.2g、534mmol)、エチル−メチルケトン(35g、0.49mol)の水(525mL)溶液に、酢酸ナトリウム(79.7g、972mmol)を室温で加え、18時間維持した。反応混合物を濾過し、得られた固体をエーテル(2×25mL)で洗浄し、70℃で20時間乾燥させると、ブタン−2−オンセミカルバゾン(45g、72%)が白色の固体として得られた。
1H NMR (CDCl
3) δ 7.9 (br, 1H), 5.0-6.0 (br, 2H), 2.3 (q,
2H), 1.82 (s, 3H), 1.1 (t, 3H).
0℃の冷たいDMF(50mL)に、POCl3(30mL)を30分にわたって滴下添加し、0℃で1時間維持した。混合物に、ブタン−2−オンセミカルバゾン(10g、78mmol)を少量ずつ0℃で加え、70℃で4時間維持した。混合物を粉砕氷(700g)に注ぎ、10%NaOH溶液を使用して中和し、酢酸エチル(3×100mL)を使用して抽出した。合わせた有機層を水(2×80mL)、飽和NaCl水溶液(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濃縮すると、粗製生成物が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー(60〜120メッシュシリカゲル)によりクロロホルム中3〜5%のメタノールを溶離剤として使用して精製すると、3−エチル−1H−ピラゾール−4−カルボアルデヒド(1.5g、16%)が固体として得られた。1H NMR (CDCl3) δ
9.95 (s, 1H), 8.0 (s, 1H), 3.0 (q, 2H), 1.35 (t, 3H).
3−エチル−1H−ピラゾール−4−カルボアルデヒド(2.2g、18mmol)およびコハク酸ジエチル(12.3g、71.0mmol)のt−ブタノール(15mL)溶液に、t−BuOK(8.08g、53.2mmol)のt−ブタノール(10mL)溶液を加えた。混合物を80℃に3時間加熱し、その後、混合物を濃縮した。得られた残渣を水(30mL)に溶かし、6NのHClを使用して酸性化し(pH約2)、酢酸エチル(2×30mL)で抽出した。合わせた有機層をNaHCO3水溶液(2×50mL)で洗浄した。合わせた水性層を酸性化(pH約2)し、酢酸エチル(2×75mL)で抽出した。合わせた酢酸エチル層を飽和NaCl水溶液(25mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濃縮すると、エチル2−[(3−エチル−1H−ピラゾール−4−イル)メチレン]−4−オキソペンタノエート(4g、100%)がゴムとして得られ、これを、そのまま、次のステップに入れた。
粗製のエチル2−[(3−エチル−1H−ピラゾール−4−イル)メチレン]−4−オキソペンタノエート(4g、15.8mmol)の無水酢酸(10mL)溶液に、酢酸ナトリウム(2.6g、32mmol)を室温で加え、混合物を4時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、NaHCO3水溶液を使用して塩基性(pH約9)にし、酢酸エチル(2×50mL)で抽出した。合わせた有機層を水(25mL)、飽和NaCl水溶液(25mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濃縮すると、粗製生成物が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー(60−120メッシュシリカゲル)により石油エーテル中2〜3%の酢酸エチルを溶離剤として使用して精製すると、エチル1−アセチル−7−(アセチルオキシ)−3−エチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(1.7g、34%)が茶色の固体として得られた。1H NMR (CDCl3) δ 8.44 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 4.58 (q,
2H),3.2 (s, 3H), 2.9 (s, 3H), 2.58 (s, 3H), 1.6 (t, 3H).
1−アセチル−7−(アセチルオキシ)−3−エチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(4.0g、13mmol)のエタノール(450mL)溶液に、60%NaH(0.50g、12.6mmol)を徐々に加えた。混合物を1時間撹拌し、その後、濃縮し、大部分のエタノールを除去した。残渣をEtOAcに入れ、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。水相をEtOAc(2×)で逆抽出した。合わせた有機抽出物を飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。固体をCH2Cl2で摩砕すると、エチル3−エチル−7−ヒドロキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレートがオフホワイト色の固体(29g、87%)として得られた。
エチル3−エチル−7−ヒドロキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(2.47g、10.5mmo)のDMF(40mL)溶液を0℃に冷却した。この混合物に、60%NaH(0.42g、10.5mmol)を加え、1時間撹拌した。これに、0℃のヨードメタン(1.50g、0.66mL、10.5mmol)のDMF(10mL)溶液を加えた。混合物を0℃で数時間維持し、その後、室温で一晩撹拌した。混合物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO3水溶液および飽和NaCl水溶液の混合物で、続いて、飽和NaCl水溶液で洗浄した。有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。CombiFlash(80gカラム、0〜30%EtOAc/ヘキサン勾配)により精製すると、エチル3−エチル−7−メトキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(2.62g、40%)が得られた。
3−エチル−7−メトキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(1.05g、4.23mmol)のTHF(35mL)溶液に、1MのLiOH(8.46mL、8.46mmol)を加え、混合物を一晩加熱還流した。混合物を濃縮し、残渣を1NのHClと共に摩砕した。沈殿物を水で洗浄し、空気乾燥させた。次いで、固体を温メタノールに入れ、濾過し、濃縮し、高真空下で一晩乾燥させると、表題化合物がオフホワイト色の固体(849mg、91%)として得られた。
酸調製3
7−メトキシ−1H−インダゾール−5−カルボン酸
3−ブロモピラゾール(50g、0.34mol)をTHF(310mL)に溶かし、テトラヒドロピラン(310ml、3.4mol)およびDDQ(7.7g、0.034mol)を加えた。反応混合物を1時間加熱還流し、蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン、1:6)により精製すると、4−ブロモ−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾール(61g、78%)が得られた。
4−ブロモ−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾール(61g、0.264mol)をTНF(400mL)に溶かした。次いで、1.6Mのn−BuLi(181mL)を、−95℃の溶液に加えた。反応混合物を同じ温度で45分間にわたって撹拌した。次いで、DMF(22.4mL、0.29mol)を加えた(同じ温度を維持した)。混合物を室温まで加熱し、その後、水(100mL)を加えた。有機層を分離し、水相をエーテル(3×50mL)で抽出した。合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン、1:4)により精製すると、1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−カルボアルデヒド(29g、57%)が得られた。
t−BuOK(49g、0.51mol)のt−BuOH(300mL)溶液を1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−カルボアルデヒド(29g、0.16mol)およびコハク酸ジエチル(121mL、0.72mol)の混合物に加えた。得られた溶液を5時間にわたって加熱還流し、水(300mL)に注いだ。生じた混合物をEtOAcで洗浄した。水性層をpH2に酸性化し、EtOAc(3×50mL)で抽出した。溶媒を蒸発させた。得られた(3E)−3−(エトキシカルボニル)−4−[1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル]ブト−3−エン酸(45g)のオイルを、さらに精製することなく、次のステップで使用した。
粗製(3E)−3−(エトキシカルボニル)−4−[1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル]ブト−3−エン酸(45g)を無水酢酸(500mL)およびNaOAc(12g、0.146mol)と混合した。反応混合物を5時間にわたって加熱還流し、蒸発させた。残渣をNa2CO3水溶液でpH8〜9にアルカリ化した。生成物をEtOAc(5×50mL)で抽出した。合わせた抽出物を乾燥させ、蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン、1:4)により精製すると、エチル7−(アセチルオキシ)−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(13g、25%)が得られた。
エチル7−(アセチルオキシ)−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(6g、0.018mol)をEtOH(100mL)に溶かし、K2CO3(7g、0.05mol)を加えた。反応混合物を6時間にわたって加熱還流し、蒸発させた。残渣を水(150mL)で処理し、生成物をEtOAc(3×50mL)で抽出した。合わせた抽出物を蒸発させ、残渣をクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン、1:4)により精製すると、エチル7−ヒドロキシ−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(4g、85%)が得られた。
K2CO3(760mg、5.50mmol)を含有するエチル7−ヒドロキシ−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(1.45g、5.0mmol)のアセトン(20mL)溶液に、ヨードメタン(781mg、0.34mL、5.5mmo)を加えた。混合物をN2下で一晩加熱還流した。混合物を室温に冷却し、濾過し、蒸発させ、EtOAcと水に分配した。水相を追加のEtOAcで抽出した。合わせた有機抽出物を飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、粗製生成物が得られた。粗製物質をクロマトグラフィー(Isco、0〜40%EtOAc/ヘプタン)により精製すると、物質が得られ、これを、高真空下で一晩乾燥させると、エチル7−メトキシ−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(1.40g、92%)が得られた。
エチル7−メトキシ−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(980mg、4.45mmol)のTHF(10mL)、水(10mL)およびLiOH(560mg、13.4mmol)混合物を40℃で3時間加熱し、次いで、室温で一晩撹拌した。反応が完了しなかったので、混合物を45℃に加熱し、一晩加熱した。次いで、混合物を乾燥するまで濃縮し、濃HClを用いてpH6に酸性化し、EtOAcと水に分配した。生じた固体を真空濾過により集め、EtOAcですすぎ、高真空下で乾燥させると、白色の固体が得られた。有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、オフホワイト色の固体が得られた。白色の固体の両方のバッチを合わせると、表題化合物(642mg、75%)が得られた。
酸調製4
7−フルオロ−4−メトキシ−1H−インドール−2−カルボン酸
2−メトキシ−5−フルオロベンズアルデヒド(1.00g、6.49mmol)およびアジド酢酸エチル(14.0g、32.4mmol)のEtOH(20mL)溶液に−20℃(アセトニトリル/ドライアイス)で、酢酸ナトリウムのEtOH溶液を20分にわたって加えた。添加が完了したら、反応物を0℃に徐々に加温し、そこで、これを2時間維持した。次いで、懸濁液を氷および固体NH
4Clの混合物に注ぎ、全ての氷が溶けるまで撹拌し、生成物を集めた。粗製生成物をCH
2Cl
2に溶かし、MgSO
4を加えた。懸濁液をシリカゲルの小さなプラグで濾過し、CH
2Cl
2で洗浄した。濃縮すると、エチル2−アジド−3−(5−フルオロ−2−メトキシフェニル)アクリレートが黄色の固体として得られ、これを、さらに精製することなく使用した(1.68g、98%)。
加熱還流されたキシレン(150mL)に、エチル2−アジド−3−(5−フルオロ−2−メトキシフェニル)アクリレート(1.50g、5.66mmol)のキシレン(50mL)溶液を加えた。混合物を4時間加熱還流し、室温に冷却し、元の体積の約1/5まで濃縮した。溶液を−20℃に2時間冷却し、固体を真空濾過により集めた。固体を冷たいキシレンで洗浄し、真空下で乾燥させると、エチル7−フルオロ−4−メトキシ−1H−インドール−2−カルボキシレートが得られた。母液を濃縮すると、追加の生成物が得られた。固体を合わせると、最終生成物(0.75g、56%)が得られた。
エチル7−フルオロ−4−メトキシ−1H−インドール−2−カルボキシレート(1.00g、4.22mmol)のエタノール溶液に、KOH(473mg、8.43mmol)を加えた。反応物を室温で12時間撹拌し、0℃に冷却し、1NのHClで酸性化した。混合物をEtOAcおよびCH2Cl2で抽出した。合わせた有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、表題化合物(550mg、62%)が得られた。
酸調製5
3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
0℃に冷却された3−ブロモベンズアルデヒド(42.5g、209mmol)のTHF(300mL)溶液に、MeMgCl(17.2g、230mmol)を加え、混合物を2時間撹拌した。反応混合物を飽和NH
4Cl溶液(100mL)でクエンチし、ジエチルエーテル(2×250mL)で抽出した。合わせた有機層を水(2×100mL)、飽和NaCl水溶液(100mL)で洗浄し、無水Na
2SO
4上で乾燥させ、濃縮すると、1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−エタノール(17g、37%)がオイルとして得られた。
1H NMR (CDCl
3): δ 7.6-7.7 (d, 1H), 7.3-7.4 (m, 1H), 6.8-6.9
(t, 1H), 5.1-5.2 (m, 1H), 1.8-1.9 (br, 1H), 1.46-1.55 (d, 3H).
1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−エタノール(37g、168mmol)のCH2Cl2(400mL)溶液および重クロム酸ピリジニウム(127g、337mmol)に、分子ふるい(10g)を加えた。混合物を室温で20時間撹拌した。混合物を珪藻土で濾過し、CH2Cl2(3×100mL)で洗浄し、濃縮した。粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー(60−120メッシュシリカゲル)により石油エーテル中10%の酢酸エチルを使用して精製すると、1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−エタノン(23g、63%)が淡茶色オイルとして得られた。1H NMR (CDCl3): δ 7.9-8.1 (d, 1H), 7.5-7.7 (m, 1H), 6.95-7.1
(t, 1H), 2.6-2.7 (d, 3H).
1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−エタノン(10g、46mmol)のヒドラジン水和物(80mL)溶液を20時間加熱還流した(130℃)。反応混合物を室温に冷却し、過剰のヒドラジン水和物を除去し、粗製残渣を、カラムクロマトグラフィー(60−120メッシュシリカゲル)により石油エーテル中10%の酢酸エチルを溶離剤として使用して精製すると、5−ブロモ−3−メチル−1H−インダゾール(7.09g、73%)が固体として得られた。1H NMR (CDCl3): δ 10.2-10.6 ( br, 1H), 7.8-7.9 (s, 1H),
7.4-7.5 (d, 1H), 7.2-7.4 (d, 1H),2.5-2.7 (s, 3H).
5−ブロモ−3−メチル−1H−インダゾール(10g、47.6mmol)のMeOH(160mL)溶液に、PdCl2・dppf(5.57g、7.62mmol)、NaOAc(11.7g、142.85mmol)およびDMF(5mL)を加え、脱ガスした(N2ガスを3回使用して)。混合物を密閉し、COガス(60psi)を充填し、80℃で20時間加熱した。反応混合物を濃縮すると、残渣が得られ、これを、水(100mL)で希釈し、10%クエン酸水溶液で酸性化し、酢酸エチル(3×200mL)を使用して抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、1H−インダゾール−5−カルボン酸メチルエステル(7.23g、80%)が固体として得られた。1H NMR (CDCl3): δ 9.6-10.2 ( br, 1H), 8.4-8.6 (s, 1H),
8.0-8.2 (d, 1H), 7.4-7.5 (d, 1H), 3.9-4.05 (s, 3H), 2.55-2.7 (s, 3H).
1H−インダゾール−5−カルボン酸メチルエステル(8g、42.1mmol)、LiOH(5.05g、211mmol)のメタノール(100mL)および水(35mL)溶液を室温で20時間撹拌した。この時間の終了時に、反応混合物を濃縮し、水性残渣を、10%クエン酸水溶液(150mL)を使用して酸性化し(pH約6)、固体を濾過すると、粗製生成物が得られ、これを、水(3×30ml)で洗浄し、よく乾燥させると、表題化合物(7g、95%)が淡茶色の固体として得られた。1H NMR (CDCl3): δ 8.5(s, 1H), 8.0-8.1 (d, 1H), 7.45-7.55 (d,
1H), 2.5-2.66 (s, 3H),
酸調製6
3−プロピル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
Mg(0.236g、9.83mmol)のジエチルエーテル(10mL)懸濁液に、I
2(1スパチュラ)、臭化n−プロピル(0.72g、0.53mL、5.9mmol)を室温で加えた。ヨウ素の色が消失したら、エーテル中の残りの臭化n−プロピルを反応混合物に加え、室温で10分間撹拌した。このグリニャール試薬に、エーテル中の5−ブロモ−2−フルオロベンズアルデヒド(1.00g、4.92mmol)を冷却条件下で加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物をNH
4Cl溶液でクエンチし、エーテルで抽出した。エーテル層を無水Na
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−ブタン−1−オール(1.14g、92.6%)が得られた。
1H NMR (CDCl
3): δ 7.6 (m, 1H), 7.3-7.4 (m, 1H), 6.9 (t, 1H),
5.0 (brs, 1H), 2.0 (brs, 1H), 1.6-1.7 (m, 2H), 1.3-1.5 (m, 2H), 1.0 (t, 3H).
1−(5−ブロモ−2−フルオロ−フェニル)−ブタン−1−オール(6.2g、25mmol)の無水CH2Cl2(60mL)溶液に、重クロム酸ピリジニウム(19.0g、50.3mmol)および分子ふるい粉末(1.24g)を室温で加え、一晩撹拌した。反応混合物を珪藻土で濾過し、ジエチルエーテル(200mL)で洗浄した。合わせたCH2Cl2およびエーテル層を無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、粗製生成物が得られ、これを、カラムクロマトグラフィーにより5%酢酸エチル/石油エーテルを溶離剤として使用して精製すると、1−(5−ブロモ−2−フルオロフェニル)ブタン−1−オン(4.6g、75%)がシロップとして得られた。1H NMR (CDCl3): δ 8.0 (m, 1H), 7.5-7.6 (m, 1H), 7.0 (t, 1H),
2.9-3.0 (m, 2H), 1.7 (q, 2H), 1.0 (t, 3H).
THF中の1−(5−ブロモ−2−フルオロフェニル)ブタン−1−オン(2.0g、8.1mmol)に、THF中の無水ヒドラジン(11mL)を加え、5〜6時間加熱還流した(60〜70℃)。キシレンを反応混合物に加え、20〜24時間加熱還流した。反応混合物を濃縮すると、粗製生成物が得られ、これを、カラムクロマトグラフィーにより15%酢酸エチル/石油エーテルを溶離剤として使用して精製すると、5−ブロモ−3−プロピル−1H−インダゾール(1.02g、52.3%)が固体として得られた。1H NMR (CDCl3): δ 7.9
(s, 1H), 7.4 (d, 1H), 7.3 (d, 1H), 2.9 (t, 2H), 1.8 (q, 2H), 1.0 (t, 3H).
ジエチルエーテル(60mL)中の5−ブロモ−3−プロピル−1H−インダゾール(1.00g、4.18mmol)に、ペンタン中1.3Mのt−BuLi(10.9mL、14.2mmol)を−78℃、N2雰囲気下で徐々に加えた。1時間後に、CO2ガスを反応混合物に−78℃で1時間通過させ、室温に徐々に加温する。反応混合物を飽和NH4Cl溶液でクエンチし、エーテル層を分離した。水性層を2NのHClで酸性化し、酢酸エチルで抽出すると、表題化合物(350mg、40.8%)がオフホワイト色の固体として得られた。1H NMR (DMSO-d6): δ 11.8-13.0 (br, 1H), 8.4 (s, 1H), 7.9 (d,
1H), 7.5 (d, 1H), 3.0 (q, 2H), 1.8 (q, 2H), 0.9 (t, 3H). mp: 296-299℃.
酸調製7
3−エチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
5−ブロモ−2−フルオロベンズアルデヒド(10g、49mmol)のジエチルエーテル(20mL)溶液に15℃で、EtMgBr(7.22g、54.2mmol)を15℃で滴下添加した。混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物を冷水およびNH
4Cl溶液でクエンチした。これをジエチルエーテルで抽出し、エーテル層を飽和NaCl水溶液で洗浄し、無水Na
2SO
4上で乾燥させ、真空下で濃縮すると、1−(5−ブロモ−2−フルオロフェニル)プロパン−1−オール(12.1g、98%)がシロップとして得られた。
1H NMR (CDCl
3): δ 7.6-7.7 (m, 1H), 7.2-7.3 (m, 1H), 6.9 (t,
1H), 4.9 (brs, 1H), 1.8 (m, 2H), 1.0 (t, 3H).
CH2Cl2(100mL)中の1−(5−ブロモ−2−フルオロフェニル)プロパン−1−オール(12.1g、64.8mmol)に、重クロム酸ピリジニウム(73.2g、194mmol)および粉末化分子ふるいを加えた。混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物を珪藻土パッドで濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。合わせたエーテルおよびCH2Cl2層を集め、真空下で濃縮すると、1−(5−ブロモ−2−フルオロフェニル)プロパン−1−オン(12.6g、98%)がシロップとして得られた。1H NMR (CDCl3): δ
7.9-8.0 (m, 1H), 7.5-7.6 (m, 1H), 7.0 (t, 1H), 3.0-3.1 (m, 2H), 1.2 (t, 3H).
1−(5−ブロモ−2−フルオロフェニル)プロパン−1−オン(10g、43mmol)に、無水ヒドラジン(53mL)を加え、2日間加熱還流した(70〜75℃)。過剰のヒドラジンを真空下で、反応混合物から留去した。これに、キシレン(60mL)を加え、混合物を3日間145〜150℃に加熱した。キシレンを真空下で完全に濃縮すると、粗製生成物が得られ、これを、カラムクロマトグラフィーにより8%酢酸エチル/石油エーテルを溶離剤として使用して精製すると、5−ブロモ−3−エチル−1H−インダゾール(4g、40%)が固体として得られた。1H NMR (CDCl3): δ 9.6-10.0 (br, 1H), 7.9 (s, 1H), 7.5 (d,
1H), 7.3 (d, 1H), 3.0 (q, 2H), 1.4 (t, 3H).
−78℃の5−ブロモ−3−エチル−1H−インダゾール(5g、22mmol)のジエチルエーテル(150mL)溶液に、t−BuLi(4.84g、75.6mmol)を加えた。混合物を−78℃で1時間撹拌した。無水CO2ガスを反応混合物に−78℃で1時間通過させ、温度を室温まで徐々に2時間上昇させた。反応混合物を室温で1時間撹拌し、飽和NH4Cl溶液でクエンチした。エーテル層を分離し、濃縮して、未反応の出発物質を回収した。水性層のpHを、2NのHClを用いて酸性にし、これを濾過すると、表題化合物(2g、47%)が淡茶色の固体として得られた。1H NMR (DMSO-d6): δ 12.6-13.0 (br, 2H), 8.4 (s, 1H), 7.9 (d,
1H), 7.5 (d, 1H), 3.0 (q, 2H), 1.4 (t, 3H).
酸調製8
7−クロロ−3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
1−(2−アミノ−5−ブロモフェニル)エタノン(200mg、0.93mmol)のCH2Cl2(5mL)溶液に、N−クロロスクシンイミド(125mg、0.93mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。分析により、反応が完了していないことが示されたので、追加のN−クロロスクシンイミド(125mg、0.93mmol)を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をCombiFlash(40gカラム、0〜10%EtOAc/ヘプタン)により精製すると、1−(2−アミノ−5−ブロモ−3−クロロフェニル)エタノン(206mg、89%)が得られた。
0℃の1−(2−アミノ−5−ブロモ−3−クロロフェニル)エタノン(206mg、0.83mmol)の50%濃H2SO4水溶液中の溶液に、NaNO2(73mg、1.0mmol)を徐々に加えた。冷却浴を外し、続いて、NaNO2を加え、室温で1時間撹拌し、次いで、0℃に再冷却し、その後、SnCl2・2H2O(573mg、2.49mmol)を加えた。混合物を0℃で1時間撹拌し、その後、水で希釈した。固体を真空濾過により集めると、5−ブロモ−7−クロロ−3−メチル−1H−インダゾール(130mg、64%)が得られた。
マイクロ波管に5−ブロモ−7−クロロ−3−メチル−1H−インダゾール(610mg、2.48mmol)、ジオキサン(5mL)、Hermann触媒(119mg、0.12mmol)および炭酸ナトリウム(790mg、7.46mmol)の水(10mL)溶液を投入した。混合物を20秒間撹拌し、マイクロ波反応器中、非常に高い吸収設定で、165℃で30分間加熱した。反応物を、取り扱い前にガス抜きした。混合物を珪藻土で濾過し、EtOAcで洗浄した。濾液を濃縮し、残渣を水に溶かし、濃HClでpH約3に酸性化した。固体を濾過により集め、乾燥させると、表題化合物(420mg、82%)が得られた。
酸調製9
3−エチル−7−メトキシ−1−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
0℃のエチル3−エチル−7−ヒドロキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(酸調製2に記載されている通りに調製)(50mg、0.21mmol)のDMF(1mL)溶液に、60%NaHオイル分散液(8.5mg、0.21mmol)を加えた。この混合物を30分間撹拌し、その後、ヨードメタン(0.011mL、0.17mmol)を加えた。反応物を0℃で2時間維持し、その後、一晩撹拌しながら室温に徐々に加温した。反応物をEtOAcおよび飽和NaHCO
3水溶液で希釈した。有機相を単離し、水相をEtOAc(2×)で逆抽出した。合わせた有機抽出物を飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製生成物をCombiFlash(12gカラム、0〜30%EtOAc/ヘキサン)により精製すると、3−エチル−7−メトキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(22mg、41%)およびエチル3−エチル−7−メトキシ−1−メチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(46mg、60%)が得られた。
エチル3−エチル−7−メトキシ−1−メチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(52mg、0.20mmol)のTHF(1.5mL)溶液に、1MのLiOH(0.36mL、0.36mmol)を加えた。混合物を一晩加熱還流した。反応物を室温に冷却し、濃縮し、1NのHClで摩砕し、次いで、濾過された固体を水で洗浄し、空気乾燥させると、表題化合物(46mg、94%)が得られた。
酸調製10
7−エトキシ−3−エチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
0℃のエチル3−エチル−7−ヒドロキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(酸調製2に記載されている通りに調製)(932mg、3.98mmol)のDMF(28mL)溶液に、60%NaHオイル分散液(159mg、3.98mmol)を加えた。この混合物を0℃で1時間撹拌し、その後、ヨードエタン(0.32mL、3.98mmol)のDMF(3mL)溶液を滴下添加した。混合物を0℃で数時間維持し、その後、冷却浴を外し、一晩撹拌しながら反応物を室温に加温した。反応物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO
3水溶液、飽和NaCl水溶液で洗浄し、次いで、有機抽出物をNa
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。CombiFlash(80gカラム、0〜30%EtOAc/ヘキサン)により精製すると、エチル7−エトキシ−3−エチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(389mg、37%)およびエチル7−エトキシ−1,3−ジエチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(202mg)が得られた。
エチル7−エトキシ−3−エチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(389mg、1.48mmol)のTHF(13mL)溶液に、1MのLiOH(3.0mL、3.0mmol)を加えた。混合物を一晩加熱還流した。反応物に、痕跡量のエタノールを加えて、物質の溶解を促進した。加熱還流をさらに2時間継続した。反応物を室温に冷却し、濃縮し、1NのHClで摩砕し、次いで、濾過された固体を水で洗浄し、空気乾燥させると、表題化合物(347mg、97%)が得られた。
酸調製11
1−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
撹拌されている60%NaHオイル分散液(87mg、2.2mmol)のDMF(4mL)懸濁液に、メチル1H−インダゾール−5−カルボキシレート(264mg、1.50mmol)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌し、その後、ヨードメタン(0.11mL、1.8mmol)を滴下添加した。混合物を室温で2時間撹拌し、濃縮し、残渣をBiotageクロマトグラフィー(40Sカラム、15%アセトン/ヘプタン)により精製すると、メチル1−メチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(107mg、38%)が得られた。
メチル1−メチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(107mg、0.56mmol)のメタノール/水(V:V、1:1、4mL)溶液に、LiOH(48mg)を加えた。溶液を40℃で3時間加熱し、その後、室温に冷却した。混合物を水で希釈し、KHSO4でpH3.5〜4に酸性化した。固体が沈殿し、濾過により単離し、真空下で乾燥させると、表題化合物が黄色の固体(70mg、71%)として得られた。
酸調製12
2,7−ジメチル−2H−インダゾール−5−カルボン酸
7−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸(356mg、2.0mmol)のDMF(6mL)溶液に、K
2CO
3(0.85g、6.2mmol)およびヨードメタン(0.45mL、7.2mmol)を加えた。混合物を室温で4時間撹拌し、次いで、50℃で一晩加熱した。反応物を室温に冷却し、EtOAcで希釈し、飽和NaCl水溶液で洗浄した。有機抽出物を濃縮し、Biotageクロマトグラフィー(40S カラム、25〜50%EtOAc/ヘプタン)により精製すると、メチル1,7−ジメチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(91mg、22%)およびメチル2,7−ジメチル−2H−インダゾール−5−カルボキシレート(141mg、35%)が得られた。
メチル2,7−ジメチル−2H−インダゾール−5−カルボキシレート(140mg、0.69mmol)のメタノール/水(V:V 1:1、2mL)溶液に、LiOH(38mg、1.6mmol)を加えた。溶液を50℃で1時間加熱し、室温に冷却し、濃縮し、KHSO4でpH2に酸性化した。固体物質を濾過により単離すると、表題化合物が白色の固体(140mg、107%)として得られた。
酸調製13
2−メチル−2H−インダゾール−5−カルボン酸
メチル1H−インダゾール−5−カルボキシレート(2.5g、14mmol)のDMF(45mL)溶液に、K
2CO
3(4.90g、35.5mmol)を、続いて、ヨードメタン(1.77mL、28.4mmol)を加えた。混合物を室温で2時間撹拌し、次いで、50℃で一晩加熱した。混合物を濃縮し、EtOAcに溶かし、飽和NaCl水溶液で洗浄した。有機抽出物をNa
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をCombiFlash(80gカラム、25〜45%EtOAc/ヘプタン)により精製すると、メチル1−メチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(1.07g、40%)およびメチル2−メチル−2H−インダゾール−5−カルボキシレート(227mg、8.4%)が得られた。
メチル2−メチル−2H−インダゾール−5−カルボキシレート(210mg、1.10mmol)のメタノール(5mL)溶液に、1.0MのLiOH(1.2mL、1.2mmol)を加えた。混合物を40℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後に、1NのHCl(1.17mL、1.1当量)を加えた。溶液を冷却し、固体を濾過により単離した。固体を真空炉中、50℃で乾燥させると、表題化合物(147mg、76%)が得られた。
酸調製14
3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
2−フルオロ−4−メトキシアクトフェノン(methoxyactophenone)(2.0g、12mmol)のヒドラジン水和物(30mL)溶液を2日間加熱還流した。混合物を室温に冷却し、水に注ぎ、EtOAc(3×)で抽出した。有機抽出物を濃縮し、最小量のCH
2Cl
2に溶かし、濾過すると、6−メトキシ−3−メチル−1H−インダゾール(370mg、19%)が得られた。濾液を再濾過すると、追加の生成物(250mg、13%)が得られた。
氷冷された6−メトキシ−3−メチル−1H−インダゾール(620mg、3.82mmol)のCH2Cl2(25mL)溶液に、BBr3のCH2Cl2(1M、17mL)溶液を加えた。氷浴を外し、反応物を室温に加温し、一晩撹拌した。氷冷された飽和NaHCO3水溶液に徐々に注ぐことにより、溶液を慎重にクエンチした。相を分離し、水相をEtOAc(3×)で抽出した。合わせた有機抽出物を濃縮し、粗製物質をBiotage(40Sカラム、45〜60%アセトン/ヘプタン)により精製すると、3−メチル−1H−インダゾール−6−オール(458mg、81%)が得られた。
3−メチル−1H−インダゾール−6−オール(458mg、3.1mmol)のTHF(30mL)溶液を、60%NaHオイル分散液(0.50g、13mmol)で処理した。当初の泡立ちの後に、溶液を50℃で1時間加熱し、その後、室温に冷却した。これに、N−フェニルトリフルオロメタンスルホンイミド(2.50g、7.00mmol)を加え、混合物を室温で2時間撹拌し、その後、水に注いだ。水相をEtOAc(3×)で抽出し、合わせた有機抽出物を濃縮した。粗製生成物をBiotage(40Mカラム、12%アセトン/ヘプタン)により精製し、続いて、Biotage(40Sカラム、10%EtOAc/ヘプタン)により再精製すると、3−メチル−1−[(トリフルオロメチル)スルホニル]−1H−インダゾール−6−イルトリフルオロメタンスルホネート(1.13g、89%)が得られた。
3−メチル−1−[(トリフルオロメチル)スルホニル]−1H−インダゾール−6−イルトリフルオロメタンスルホネート(0.61g、1.5mmol)のDMF(6mL)溶液を、COで5分間フラッシュした。溶液を酢酸パラジウム(68mg、0.30mmol)、1,1’−ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン(167mg、0.30mmol)、トリエチルアミン(0.33g、0.45mL、3.2mmol)およびメタノール(4mL)で処理した。混合物を室温でCO(1atm)下で撹拌した。溶液を水に注ぎ、EtOAc(3×)で抽出した。合わせた有機抽出物を濃縮し、Biotage(40Sカラム、8%EtOAc/ヘプタン)により精製すると、メチル3−メチル−1−[(トリフルオロメチル)スルホニル]−1H−インダゾール−6−カルボキシレート(330mg、69%)が得られた。
メチル3−メチル−1−[(トリフルオロメチル)スルホニル]−1H−インダゾール−6−カルボキシレート(590mg、1.83mmol)のメタノール/水(3:1、72mL)溶液に、K2CO3(1.01g、7.31mmol)を加え、混合物を2時間加熱還流した。反応物を室温に冷却し、メタノールを減圧下で除去した。水溶液をKHSO4でpH3〜3.5に酸性化した。固体を濾過により単離し、EtOAcに溶かし、水で洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、表題化合物(259mg、80%)が得られた。
酸調製15
3−メチル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−5−カルボン酸
2−ブロモマロンアルデヒド(4.0g、30mmol)およびメチル−1H−ピラゾール−5−アミン(2.57g、26.5mmol)の酢酸(40mL)溶液を116℃に2.5時間加熱した。次いで、反応物を室温で2日間撹拌した。溶液を濃縮し、残渣をメタノールに入れ、珪藻土で濾過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(2〜5%CH
2Cl
2/メタノール)により精製すると、5−ブロモ−3−メチル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン(515mg、9%)が得られた。
マイクロ波管に、5−ブロモ−3−メチル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン(515mg、2.43mmol)、ジオキサン(2mL)、Hermann触媒(72.1mg、0.12mmol)および炭酸ナトリウム(772mg、7.29mmol)の水(5mL)溶液を投入した。混合物を20秒間撹拌し、マイクロ波反応器中、非常に高い吸収設定で、165℃で15分間加熱した。反応物を、取り扱い前にガス抜きした。混合物をEtOAcで希釈し、5分間撹拌し、その後、珪藻土で濾過すると、表題化合物(124mg、29%)が得られた。
酸調製16
3,7−ジメチル−1H−インドール−5−カルボン酸
4−ブロモ−2−メチルアニリン(2.00g、10.8mmol)を濃HCl(10mL)に溶かし、80℃に30分間加熱した。次いで、反応物を5℃に冷却し、NaNO
2(781mg、10.8mmol)の水(4mL)溶液を10分にわたって加えた。生じた混合物を5℃で30分間撹拌し、その後、濃HCl(8mL)中のSnCl
2(15.3g、80.6mmol)を10分にわたって加えた。混合物を室温で45分間撹拌し、その後、50%NaOH水溶液を加えた。生じた沈殿物を濾過により単離し、濾液をCH
2Cl
2で抽出した。合わせた有機相をMgSO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、(4−ブロモ−2−メチルフェニル)ヒドラジン(1.08g、50%)が得られた。
(4−ブロモ−2−メチルフェニル)ヒドラジン(1.44g、7.16mmol)のエタノール(10mL)懸濁液に、プロピオンアルデヒド(0.68mL、9.3mmol)を加えた。溶液は透明になり、その混合物を室温で45分間撹拌した。溶媒を除去し、無水ZnCl2(1.07g、7.88mmol)を加え、混合物を170℃で30分間加熱した。混合物を室温に冷却し、10%HClで希釈し、CH2Cl2で抽出し、有機抽出物をMgSO4上で乾燥させた。濾過および濃縮の後に、残渣をCombiFlash(0〜10%EtOAc/ヘプタン)により精製すると、5−ブロモ−3,7−ジメチル−1H−インドール(317mg、20%)が得られた。
マイクロ波管に、5−ブロモ−3,7−ジメチル−1H−インドール(317mg、1.42mmol)、ジオキサン(3mL)、Hermann触媒(42.1mg、0.07mmol)および炭酸ナトリウム(450mg、4.24mmol)の水(6mL)溶液を投入した。混合物を20秒間撹拌し、マイクロ波反応器中、非常に高い吸収設定で、165℃で15分間加熱した。反応物を、取り扱い前にガス抜きした。混合物を珪藻土で濾過し、EtOAcで洗浄した。濾液を濃縮し、残渣を水に溶かした。溶液をpH3に酸性化し、固体を集めると、表題化合物(250mg、93%)が得られた。
酸調製17
7−クロロ−3−エチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
三つ口丸底フラスコにN
2下で、AlCl
3(775mg、5.81mmol)を投入し、次いで、トルエン5.00mLを加えた。スラリーを−10℃に冷却し、4−ブロモアニリン(1.0g、5.81mmol)を1回で加えた。これに、BCl
3(キシレン中1.0Mの溶液6.4mL)を混合物に−10℃で徐々に加え、煙がもう生じなくなるまで、混合物をN
2でパージした。プロピオイトリル(Propioitril)(1.88mL、25.6mmol)を加え、温度を45℃以下まで上昇させた。反応物を63℃で10分間加熱し、63℃で5分間維持すると、均一な溶液が得られた。さらなるトルエン4.0mLを別の三つ口フラスコに加え、N
2下で加熱還流した。先のフラスコからの溶液をトルエンに還流で10分にわたって加えた。混合物をさらに4時間加熱還流し、その間、反応物をN
2でパージし続けた。このプロセスの間に、トルエンが失われ、必要な場合にはさらなるトルエンを混合物に加えた。反応物を室温に冷却し、水10mLを十分な撹拌下に約30分間加えた。混合物を55℃に加熱し、15分間撹拌し、その後、2層に分離した。有機相を水で洗浄し、MgSO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、粗製の固体が得られた。残渣をカラムクロマトグラフィー(0〜50%EtOAc/ヘプタン勾配)により精製すると、1−(2−アミノ−5−ブロモ−フェニル)−プロパン−1−オンが黄色の固体(144.0mg、10.9%)として得られた。
1−(2−アミノ−5−ブロモ−フェニル)−プロパン−1−オン(144.0mg、0.63mmol)をCH2Cl2(10.0mL)に溶かし、N−クロロスクシンイミド(168.0mg、1.26mmol)をこの溶液に加えた。生じた混合物を45℃で一晩撹拌した。反応物を室温に冷却し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製すると、1−(2−アミノ−5−ブロモ−3−クロロ−フェニル)−プロパン−1−オンが固体(130.0mg、76.1%)として得られた。
50%H2SO4水溶液(2.5mL)およびNaNO2(43.1mg、0.59mmol)に溶かした1−(2−アミノ−5−ブロモ−3−クロロ−フェニル)−プロパン−1−オン(130.0mg、0.50mmol)をこの混合物に0℃で徐々に加えた。次いで、混合物を室温で1時間撹拌した。次いで、SnCl2・2H2O(342.0mg、1.48mmol)を加え、混合物を0℃で1時間撹拌し、次いで、水で希釈した。白色の固体が生じ、濾過により集め、乾燥させると、5−ブロモ−7−クロロ−3−エチル−1H−インダゾールが固体(127.0mg、98.8%)として得られた。
マイクロ波管に、ジオキサン(1.0mL)に溶かした5−ブロモ−7−クロロ−3−エチル−1H−インダゾール(127.0mg、0.49mmol)を加えた。Hermann触媒((トランス−ビス(アセタト)ビス[o−(ジ−o−トリルホスフィノ)ベンジル]ジパラジウム(II)))(23.0mg、0.024mmol)およびモリブデンヘキサカルボニル(64.4mg、0.244mmol)を、続いて、炭酸ナトリウム(156mg、1.47mmol)の水(2.0mL)溶液を加えた。容器内で分離が生じる。混合物を20秒間撹拌し、次いで、混合物を、マイクロ波照射下、非常に高い吸収設定で、165℃に15分間加熱した。反応を止め、取り扱い前に、容器をガス抜きした。混合物を濾過し、EtOAcで洗浄した。濾液を濃縮し、残渣を水に再溶解させた。次いで、溶液をpH約3に酸性化させた。固体を集め、乾燥させると、7−クロロ−3−エチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸が固体(95.0mg、86.4%)として得られた。
酸調製18
2,4−ジメチル−1H−ベンズイミダゾール−6−カルボン酸
5−ブロモ−3−メチルベンゼン−1,2−ジアミン(201mg、1.00mmol)のEtOH(15mL)溶液に、5NのHCl(4mL)を加えた。混合物を加熱還流し、その後、2,4−ペンタンジオン(200mg、0.21mL、2.0mmol)を加えた。加熱を45分間継続し、その後、分析により、反応が完了したことが示された。反応物を室温に冷却し、飽和NaHCO
3水溶液で中和し、CHCl
3で抽出した。有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄し、MgSO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、乾燥させると、6−ブロモ−2,4−ジメチル−1H−ベンズイミダゾール(217mg、96%)が得られた。
6−ブロモ−2,4−ジメチル−1H−ベンズイミダゾール(200mg、0.90mmol)の脱ガスジオキサン(2mL)溶液に、((トランス−ビス(アセタト)ビス[o−(ジ−o−トリルホスフィノ)ベンジル]ジパラジウム(II)))(30mg、0.05mmol)、モリブデンヘキサカルボニル(120mg、0.45mmol)およびNa2CO3(283mg、2.67mmol)の脱ガス水(2.4ml)溶液を加えた。混合物を20秒間撹拌し、次いで、マイクロ波反応器中、165℃で15分間加熱し、20分間の非常に高い吸収設定を伴った。反応容器をガス抜きし、珪藻土で濾過した。溶液をEtOAcで抽出し、水相をさらなるEtOAc(2×)で逆抽出した。合わせた有機抽出物を除去した。水(5mL)を水性抽出物に加え、次いで、0.5MのHClでpH3に酸性化した。生じた固体を空気乾燥させると、表題化合物(97mg、57%)が得られた。
酸調製19
4−メチル−1H−ベンズイミダゾール−6−カルボン酸
5−ブロモ−3−メチルベンゼン−1,2−ジアミン(2.02g、10mmol)の溶液に、水(10mL)を、続いて、ギ酸(1.16mL、30mmol)を加えた。混合物を100℃で6時間撹拌し、その後、室温に冷却した。固体が溶液から沈殿し、室温で2日間放置した。次いで、この混合物に、1NのKOH(35mL)を加え、固体を真空濾過により単離した。固体を空気乾燥させ、CHCl
3(70mL)から再結晶化させると、6−ブロモ−4−メチル−1H−ベンズイミダゾール(0.82mg、39%)が得られた。生成物のさらなるバッチが、CHCl
3母液から得られた(1.01g、48%)。
6−ブロモ−4−ジメチル−1H−ベンズイミダゾール(100mg、0.47mmol)の脱ガスジオキサン(2mL)溶液に、((トランス−ビス(アセタト)ビス[o−(ジ−o−トリルホスフィノ)ベンジル]ジパラジウム(II)))(16mg、0.03mmol)、モリブデンヘキサカルボニル(64mg、0.24mmol)およびNa2CO3(150mg、1.42mmol)の脱ガス水(2.4ml)溶液を加えた。混合物を20秒間撹拌し、次いで、マイクロ波反応器中、165℃で15分間加熱し、20分間の非常に高い吸収設定を伴った。反応容器をガス抜きし、SPEカートリッジで濾過した。水溶液をEtOAc(3×)で抽出した。有機抽出物を合わせ、濃縮した。残渣を水に溶かし、pH3に酸性化し、冷蔵庫で一晩貯蔵した。水性物質に、水(3mL)を加え、pH3。固体が溶液から沈殿し、濾過により単離した。固体を水で洗浄し、空気乾燥させると、生成物(44mg、53%)が得られた。放置すると、固体が母液から沈殿して、追加の生成物(34mg、41%)が得られた。
酸調製20
7−エチル−3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
7−エチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸(500mg、2.63mmol)のMeOH(15mL)溶液に、濃H
2SO
4(0.25mL)を加えた。混合物を一晩加熱還流した。溶媒を減圧下で除去すると、黄褐色の固体が得られ、これを、フラッシュクロマトグラフィー(40gカラム)により15〜30%EtOAc/ヘプタンを使用して精製すると、メチル7−エチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(252mg、47%)が得られた。
メチル7−エチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(252mg、1.23mmol)のDMF(10mL)溶液に、K2CO3(550mg、3.98mmol)およびI2(370mg、1.46mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、これに5%NaHSO3(10mL)を、続いて、1:1のEtOAc/THF(50mL)を加えた。有機層を単離し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。固体をCH2Cl2に懸濁させ、濾過により集め、乾燥させると、メチル7−エチル−3−ヨード−1H−インダゾール−5−カルボン酸(298mg、73%)が得られた。
メチル7−エチル−3−ヨード−1H−インダゾール−5−カルボン酸(100mg、0.30mmol)のDME(2.5mL)中の脱ガス溶液に、脱ガスされたボロキシン溶液(50%、0.28mL)を、続いて、パラジウムテトラキストリフェニルホスフィン(3.5mg、0.003mmol)および2MのNa2CO3(0.57mL)を加えた。混合物をマイクロ波反応器(非常に高い吸収設定)中、125℃で10分間次いで、165℃で10分間加熱した。反応物をEtOAcで抽出し、飽和NaCl水溶液で洗浄した。有機抽出物を減らし、粗製物質を、シリカゲルクロマトグラフィー(40gカラム)により0〜40%EtOAc/ヘプタンを使用して精製すると、メチル7−エチル−3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸(18mg、27%)が得られた。
メチル7−エチル−3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸(240mg、1.10mmol)のEtOH(13mL)溶液に、1MのLiOH(2.2mL)を加えた。混合物を一晩加熱還流し、室温に冷却した。溶媒を減圧下で除去し、生じた物質を1NのHClに懸濁させた。固体を真空濾過により単離し、水で洗浄し、45℃、真空下で乾燥させると、デスメチル物質約10%を含有する表題化合物(154mg、69%)が得られた。
酸調製21
3−クロロ−1H−インダゾール−5−カルボン酸
1H−インダゾール−5−カルボン酸(155mg、0.96mmol)のCH
3CN(8mL)懸濁液に、N−クロロスクシンイミド(142mg、1.06mmol)を加えた。混合物を一晩加熱還流し、その後、濃縮した。固体を水およびチオ硫酸ナトリウム水溶液に懸濁させ、1NのHClで酸性化し、固体を濾過により単離した。次いで、固体を水で洗浄し、真空下、50℃で乾燥させると、表題化合物がオフホワイト色の固体(157mg、84%)として得られた。
酸調製22
3−クロロ−7−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
7−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸(180mg、1.01mmol)のCH
3CN(10mL)懸濁液に、N−クロロスクシンイミド(150mg、1.12mmol)を加えた。混合物を一晩加熱還流し、その後、濃縮した。固体を水およびチオ硫酸ナトリウム水溶液に懸濁させ、1NのHClで酸性化し、固体を濾過により単離した。次いで、固体を水で洗浄し、乾燥させると、表題化合物が黄褐色の固体(208mg、98%)として得られた。
酸調製23
7−エトキシ−1H−インダゾール−5−カルボン酸
濃H
2SO
4(0.34mL)を含有する7−ヒドロキシ−1H−インダゾール−5−カルボン酸(1.08g、6.06mmol)のEtOH(50mL)溶液を一晩加熱還流した。混合物をEtOAcで希釈し、飽和NaHCO
3水溶液で洗浄した。水相をEtOAc(3×)で逆抽出した。合わせた有機抽出物を飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、エチル7−ヒドロキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(918mg、73%)が得られた。
エチル7−ヒドロキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(918mg、4.45mmol)のDMF(35mL)溶液に0℃で、NaHの60%オイル分散液(178mg、4.45mmol)を加えた。混合物を0℃で1時間エージングさせ、その後、ヨードエタン(694mg、0.36mL、4.45mmol)のDMF(15mL)溶液を滴下添加した。混合物を0℃で数時間エージングさせ、その後、氷浴を外した。反応物を室温に加温し、一晩エージングさせた。混合物をEtOAcで希釈し、水、飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー(40gカラム)により0〜30%EtOAc/ヘキサン勾配で溶離して精製すると、エチル7−エトキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(400mg、38%)が得られた。
エチル7−エトキシ−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(400mg、1.71mmol)の溶液に、1MのLiOH(3.4mL)を加えた。混合物を一晩加熱還流した。反応物を乾燥するまで濃縮し、固体を1NのHClと共に摩砕した。固体を水で洗浄し、空気乾燥させると、表題化合物がオフホワイト色の固体(350mg、99%)として得られた。
酸調製24
7−メトキシ−3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
エチル7−ヒドロキシ−3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(Anti−Cancer Drug Design 1997、12、555)のDMF(25mL)溶液に0℃で、NaHの60%オイル分散液(152mg、3.81mmol)を加えた。混合物を1時間撹拌し、その後、ヨードメタン(0.54g、0.24mL、3.8mmol)のDMF(3mL)溶液を滴下添加した。混合物を0℃で数時間維持し、その後、混合物を室温に加温し、一晩撹拌した。反応物をEtOAc、飽和NaHCO
3水溶液、水および飽和NaCl水溶液で希釈した。有機抽出物をNa
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。物質を、シリカゲルクロマトグラフィー(80gカラム)により0〜30%EtOAc/ヘキサン勾配で溶離して精製すると、エチル7−メトキシ−3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(294mg、33%)が得られた。
エチル7−メトキシ−3−メチル−1H−インダゾール−5−カルボキシレート(294mg、1.26mmol)のEtOH(11mL)溶液に、1MのLiOH(2.5mL)を加えた。混合物を4時間加熱還流し、室温に冷却し、濃縮した。粗製物質を1NのHClで摩砕し、固体を濾過により単離し、水で洗浄した。固体を一晩空気乾燥させると、表題化合物(235mg、91%)が得られた。
酸調製25
7−メチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
5−ブロモ−7−メチルインダゾール(PharmaLab、Morrisville、PAから購入)(2.00g、9.47mmol)の無水THF(50mL)溶液に、NaH(570mg、14.25mmol;鉱油中60%懸濁液)を室温で加えた。20分後に、混合物を−78℃に冷却し、sec−ブチルリチウム(シクロヘキサン中1.4M、17mL;23.8mmol)を滴下添加し、生じた混合物を4時間撹拌した。次いで、無水CO
2を反応混合物に1時間気泡導入し、その間、室温に加温した。次いでこれを、室温で一晩撹拌した。1NのHClを加え、溶液をEtOAcで抽出した。有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄し、乾燥させ(MgSO
4)、次いで、濾過し、濃縮した。残渣をMeOHに再溶解し、濾過し、次いで、濃縮すると、生成物が茶色の固体(1.445g、86.6%)として得られた。
1H NMR (DMSO-d
6) δ 8.23 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 2.46 (s, 3H). LC/MS ES+ 177 (MH+).
酸調製26
7−エチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
2−エチル−6−メチルアニリン(2.03g、15mmol)のDMF(50mL)溶液に0℃で、N−ブロモスクシンイミド(2.66g、14.9mmol)を加えた。混合物を室温で10分間撹拌し、その後、飽和NaCl水溶液を加えた。混合物をEtOAcで抽出し、有機相を飽和NaCl(2×)水溶液で洗浄し、濃縮し、粗製物質を、Biotageクロマトグラフィー(40M、15%EtOAc/ヘプタン)により精製すると、4−ブロモ−2−エチル−6−メチルベンゼンアミンが赤茶色の液体(3.21g、100%)として得られた。
4−ブロモ−2−エチル−6−メチルベンゼンアミン(3.21g、15mmol)の酢酸(50mL)溶液を3時間撹拌し、その後、2Mの亜硝酸ナトリウム溶液(11mL、22.5mmol)を加えた。生じた混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を濃縮し、固体をEtOAcに溶かし、飽和NaCl水溶液(3×)で洗浄した。有機抽出物をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質をBiotageクロマトグラフィー(40M、15〜30%EtOAc/ヘプタン)により精製すると、5−ブロモ−7−エチル−1H−インダゾール(1.11g、33%)および5−ブロモ−3,7−ジメチル−1H−インダゾール(0.84g、25%)が得られた。
5−ブロモ−7−エチル−1H−インダゾール(225mg、1.00mmol)のジオキサン(1.5mL)溶液に、ヘキサカルボニルモリブデン(132mg、0.50mmol)、Herrmann触媒(トランス−ビス(アセタト)ビス[o−(ジ−o−トリルホスフィノ)ベンジル]ジパラジウム)(46.9mg、0.05mmol)および炭酸ナトリウム(318mg、3.00mmol)の水(2mL)溶液を加えた。懸濁液を密閉し、マイクロ波中165℃で15分間照射した(高吸収設定)。バイアルをガス抜きし、珪藻土で濾過し、EtOAcで洗浄し、濃縮すると、表題化合物(140mg、74%)が得られた。
酸調製27
7−クロロ−1H−インダゾール−5−カルボン酸
4−アミノ−3−クロロ−5−メチルベンゾニトリル(3.00g、18.0mmol)のCHCl
3(50mL)溶液に、無水酢酸(3.9mL、41.4mmol)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、5時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、酢酸カリウム(530mg、5.40mmol)および亜硝酸イソアミル(5.28mL、39.6mmol)を加えた。混合物を3日間加熱還流した。反応混合物を飽和NaHCO
3水溶液で洗浄し、Na
2SO
4上で乾燥させ、濃縮した。これに、メタノールを、続いて、水(25mL)および38%HCl(25mL)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、pHを約7に調節した。固体を濾過により単離し、次いで、水(2×30mL)およびヘプタン(2×30mL)で洗浄した。Biotageクロマトグラフィー(CH
2Cl
2−ヘプタン(1:1)/MeOH勾配により精製すると、7−クロロ−1H−インダゾール−5−カルボニトリルが得られ、これを、白色の固体(585mg、18%)として単離した。
7−クロロ−1H−インダゾール−5−カルボニトリル(250mg、1.41mmol)のエタノール/水(3:1の比、15mL)溶液に、水酸化カリウム(395mg、7.04mmol)を加え、混合物を加熱還流した。3時間後に、大部分のエタノールを留去し、追加の水酸化カリウム(614mg)を加え、加熱を一晩続けた。反応混合物を室温に冷却し、Et2O(3×20mL)で洗浄し、有機抽出物を1NのHClで酸性化した。生じた沈殿物を真空濾過により単離し、水(約15mL)およびヘプタン(約15mL)で洗浄し、室温/0.5mmHgで乾燥させると、表題化合物(221mg、79.7%)が得られた。
酸調製28
3,7−ジメチル−1H−インダゾール−5−カルボン酸
再精製された5−ブロモ−3,7−ジメチル−1H−インダゾール(酸調製26で記載された通りに調製、285mg、1.27mmol)のジオキサン(1.3mL)溶液を含有する反応容器に、ヘキサカルボニルモリブデン(264mg、1.0mmol)、Herrmann触媒(93mg、0.1mmol)およびNa
2CO
3の水溶液(水2mL中636mg)を加えた。懸濁液をマイクロ波中、165℃で15分間加熱した(高吸収)。バイアルをガス抜きし、1NのHCl(pH2まで)酸性化した。反応混合物を珪藻土で濾過し、EtOAcで洗浄し、有機層を飽和NaCl水溶液(3×)で洗浄した。有機抽出物を濃縮すると、表題化合物がピンク色の固体(65mg、17%)として得られた。
酸調製29
2−オキソ−1,2,3,4−テトラヒドロキノリン−6−カルボン酸
(J of Med Chem、46(14)、3033〜3044;2003と同様に)
ステップ1:6−(2−クロロアセチル)−3,4−ジヒドロキノリン−2(1H)−オン
機械式撹拌機を備えた10Lの4つ口フラスコにN
2下で、AlCl
3(408g、3.06mol)および無水CH
2Cl
2(2.7L、18体積)を加えた。次いで、塩化クロロアセチル(89mL、1.22mol)を付加漏斗から、15分にわたって徐々に室温で加えた。生じた大部分透明な溶液をこの温度で30分間維持すると、泥状の混合物になった。3,4−ジヒドロキノリン−2(1H)−オン(150g、1.02mol)およびCH
2Cl
2(0.3L、2体積)の溶液を、内部温度が30℃未満に維持されるような速度で1.5時間にわたって加えた。生じた茶色の混合物をこの温度で2時間撹拌し、次いで、40℃でさらに2時間加熱し、次いで、室温で一晩撹拌し続けた。反応混合物を氷浴中で冷却し、HClガストラップに接続した。次いで、氷冷H
2O(全部で3L)を、内部温度が30℃未満に維持されるような速度で1.5時間にわたって加えた。生じた混合物を室温で1時間撹拌し、次いで、40〜50℃で加熱して、CH
2Cl
2を除去した。この混合物に、THF(1L)を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。固体を濾過により集めた。黄色のケーキをH
2O(500mL)、THF(200mL)およびヘキサン(1L×2)で洗浄し、これを、真空炉中で乾燥させると(50℃で1日)、6−(2−クロロアセチル)−3,4−ジヒドロキノリン−2(1H)−オン(221g、97%)が得られた。
1H NMR (270 MHz, d-DMSO) δ 10.48 (s, 1 H), 7.86-7.77 (m, 2 H), 6.96
(d, J = 8.2 Hz, 1 H), 5.08 (s, 2 H), 2.96 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.51 (t, J =
7.6 Hz, 2 H)
ステップ2:2−オキソ−1,2,3,4−テトラヒドロキノリン−6−カルボン酸
6−(2−クロロアセチル)−3,4−ジヒドロキノリン−2(1H)−オン(50.0g、0.22mol)をピリジン190mlに加えた。混合物を90℃で2.5時間加熱し、次いで、室温に冷却した。ピリジニウム塩を濾過により集め、フィルターケーキをエタノールで洗浄した。固体を真空炉中で一晩乾燥させた。無水塩を0.5Mの水酸化ナトリウム水溶液630mLに加え、80℃で1時間加熱した。反応物を室温に冷却し、12NのHCl(30mL)で酸性化し、固体を濾過により集めた。集めた固体を2:1の水/DMFと共に撹拌し、濾過して生成物を淡黄色の固体として集めた。集めた固体を真空炉中で一晩乾燥させると、2−オキソ−1,2,3,4−テトラヒドロキノリン−6−カルボン酸38.77g(92%)が淡黄色の固体として得られた。1H NMR (300 MHz, d-DMSO) δ 12.63 (br, 1 H), 10.40 (s, 1 H), 7.75-7.72
(m, 2 H), 6.92 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 2.96-2.91 (m, 2 H), 2.51-2.46 (m, 2 H).
酸調製30
3,7−ジメチルインドール−5−カルボン酸
4−ブロモ−2−メチルアニリン(2.0g)を濃HCl(10mL)に溶かし、80℃に30分間加熱した。反応物を5℃に冷却し、亜硝酸ナトリウム溶液(水4.0mL中の781.0mg)を10分にわたって加えた。次いで、生じた混合物を5℃で30分間撹拌した。塩化スズ(II)の溶液(濃HCl8mL中の15.3g)を10分にわたって加え、生じた溶液を室温で45分間撹拌した。反応物を50%NaOH溶液で塩基性にすると、白色の沈殿物が形成した。固体を濾過し、濾液をジクロロメタンで抽出した。有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、1−(4−ブロモ−2−メチルフェニル)ヒドラジン1.08g(50%)が白色の固体として得られた。LC-MS @ 201.1 (M+1)
1−(4−ブロモ−2−メチルフェニル)ヒドラジン200mgをEtOH10.0mLに懸濁させ、プロピオンアルデヒド(678μL)を加えた。プロピオンアルデヒドを添加した後に、反応物は透明になった。次いで、生じた溶液を室温で45分間撹拌した。反応物を濃縮し、塩化亜鉛(II)(1070.0mg)を加え、混合物を170℃で30分間加熱した。次いで、溶融した混合物を室温に冷却し、10%HCl溶液で希釈した。次いで、溶液をジクロロメタンで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー処理すると(0〜10%EtOAc/ハプタン(Haptane)勾配)、5−ブロモ−3,7−ジメチル−1H−インドール317.0mgが得られた。LC-MS @ 222.1 (M-1)
25mLマイクロ波反応管に、ジオキサン3Lに溶かした5−ブロモ−3,7−ジメチル−1H−インドール317mgを投入した。トランス−ビス(アセタト)ビス[o−(ジ−o−トリルホスフィノ)ベンジル]ジパラジウム(II)42mgおよびモリブデンヘキサカルボニル187mgを、続いて、水6mLに溶かした炭酸ナトリウム450mgを加えた。バイアルを密閉し、マイクロ波反応器中、165℃で20分間加熱した。反応物を冷却し、次いで、セライトで濾過し、フィルターケーキをEtOAcで洗浄した。濾液を濃縮し、生じたオイルを水に再溶解した。溶液をpH3に酸性化し、沈殿物を濾過により集めると、3,7−ジメチルインドール−5−カルボン酸250.0mg(93%)が得られた。LC-MS @ 188.1 (M-1)
酸調製31
ベンゾ[d]イソチアゾール−5−カルボン酸
5−ブロモ−2−フルオロベンズアルデヒド(4.06g)の2−プロパノール(20.0mL)溶液に、2−メチル−2−プロパンチオール(2.26mL)およびK
2CO
3(3.04g)を加え、一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、水50.0mLに注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー処理すると(3%EtOAc/ハプタン)、5−ブロモ−2−(tert−ブチルチオ)ベンズアルデヒド1.97g(36%)が透明なオイルとして得られた。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 1.30 (s, 9 H) 7.51 (d, J=8.05 Hz, 1 H)
7.70 (dd, J=8.29, 2.20 Hz, 1 H) 8.12 (d, J=2.20 Hz, 1 H) 10.70 (s, 1 H).
塩酸ヒドロイルアミン(1.5g)を水25mLに溶かし、2Nの水酸化ナトリウム水溶液10.8mLで処理した。この溶液を5−ブロモ−2−(tert−ブチルチオ)ベンズアルデヒド(1.97g)のエタノール25mL溶液に室温で20分にわたって滴下添加した。混合物を2時間加熱還流し、次いで、室温に冷却した。反応混合物を水(150.0mL)に注ぎ、EtOAcで抽出した。有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。有機相を濾過し、濃縮した。残渣をポリリン酸(105.0g)で処理し、100℃に2時間加熱した。次いで、反応混合物を氷水(400.0mL)に注ぎ、5NのNaOH水溶液で氷冷下に中和し、次いで、EtOAcで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー処理すると(3%EtOAc/ハプタン)、5−ブロモベンゾ[d]イソチアゾール1.51g(98%)が白色の固体として得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δδ ppm 7.61 (dd, J=8.58, 1.76 Hz, 1 H) 7.83
(d, J=8.58 Hz, 1 H) 8.20 (d, J=1.37 Hz, 1 H) 8.84 (s, 1 H), LC-MS @ 214.0,
216.0 (M+2).
小さなParrボトル中の5−ブロモベンゾ[d]イソチアゾール1.51gおよび1,1’−シス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)825.0mgのメタノール35mL溶液に、酢酸ナトリウム(1.74g)およびDMF(543μL)を加えた。混合物を窒素で複数回脱ガスし、次いで、CO雰囲気(40psi)下、50度で18時間振盪した。溶液を濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー処理すると(0〜20%EtOAc/ハプタン勾配)、メチルベンゾ[d]イソチアゾール−5−カルボキシレート61.0mg(5%)が白色の固体として得られた。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 3.96 (s, 3 H) 8.17 (d, J=0.98 Hz, 2 H)
8.84 (s, 1 H) 9.08 (s, 1 H); LC-MS @ 194.1 (M+1).
メチルベンゾ[d]イソチアゾール−5−カルボキシレート61mgをメタノール1.26mLに溶かし、10%水酸化ナトリウム水溶液1.26mLで処理した。混合物を室温で18時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、次いで、水で希釈した。pH約3に酸性化し、濾過により沈殿物を集めた。フィルターケーキを水で洗浄した。次いで、固体を高真空下で乾燥させると、ベンゾ[d]イソチアゾール−5−カルボン酸48mgが白色の固体として得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δδ ppm 8.08 (dd, J=8.49, 1.46 Hz, 1 H) 8.31
(d, J=8.58 Hz, 1 H) 8.79 (s, 1 H) 9.24 (d, J=0.78 Hz, 1 H).
酸調製32
7−メチルベンゾ[d]イソチアゾール−5−カルボン酸
撹拌されている5−ブロモ−2−フルオロ−1,3−ジメチルベンゼン(5.0g、25mmol)の四塩化炭素(100.0mL)溶液に、N−ブロモスクシンイミド(4.11g、23.1mmol)および過酸化ベンゾイル(100.0mg、0.017mmol)を加えた。反応物を7時間加熱還流した。反応物を濾過し、濾液を2NのHCl、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、水およびブラインで洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー処理すると(5%EtoAc/ハプタン)、5−ブロモ−1−(ブロモメチル)−2−フルオロ−3−メチルベンゼン6.56gがオイル生成物として得られた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.22 - 2.36 (s, 3 H) 4.42 (d, J=0.98
Hz, 2 H) 7.21 - 7.37 (m, 2 H)
撹拌されている5−ブロモ−1−(ブロモメチル)−2−フルオロ−3−メチルベンゼン(6.56g、23.3mmol)のアセトン(150.0mL)溶液に、重炭酸ナトリウム(2.44g、29.1mmol)および水(250.0mL)を加えた。反応物を一晩還流させた。反応物を室温に冷却し、酢酸エチルで3回抽出した。有機抽出物を合わせ、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。生じたオイルをフラッシュクロマトグラフィー処理すると(80gシリカ、5〜10%酢酸エチル/ヘキサン勾配)、(5−ブロモ−2−フルオロ−3−メチルフェニル)メタノール2.5gが白色の固体として得られた。
撹拌されているクロロクロム酸ピリジニウム(3.77g、17.1mmol)およびシリカゲルのジクロロメタン25ml中の懸濁液に、(5−ブロモ−2−フルオロ−3−メチルフェニル)メタノールのジクロロメタン25mL溶液を加えた。反応物を室温で30分間撹拌した。追加のシリカゲルを加え、濃縮して、反応生成物をシリカゲルに吸着させた。フラッシュクロマトグラフィー処理すると(80gシリカ、5〜10%酢酸エチル/ヘキサン勾配)、5−ブロモ−2−フルオロ−3−メチルベンズアルデヒド2.1gが白色の固体として得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm
2.31 (d, J=2.15 Hz, 3 H) 7.42 - 7.63 (m, 1 H) 7.77 (dd, J=5.46, 2.34 Hz, 1 H)
10.27 (s, 1 H).
7−メチルベンゾ[d]イソチアゾール−5−カルボン酸の合成を、酸調製31に記載されたカルボニル化方法と同様に完了した。
酸調製33
6−ブロモ−4−フルオロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾール
5−ブロモ−3−フルオロベンゼン−1,2−ジアミン(0.2g、0.975mmol)を水1mlと、続いて、ギ酸(0.1mL、3mmol)と混合した。暗茶色の混合物を100℃で6時間撹拌した。反応物を室温に冷却し、1NのKOH(冷)3mLで処理し、沈殿した固体を濾過により集め、一晩空気乾燥させると、6−ブロモ−4−フルオロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾール162mgが明ピンク色の固体として得られた。LC/MS @ 215 (M+H).
6−ブロモ−4−フルオロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾールの合成を、酸調製31に記載されたカルボニル化方法と同様に完了した。
酸調製34
7−メトキシ−2−メチルベンゾ[d]オキサゾール−5−カルボン酸
激しく撹拌されている4−ヒドロキシ−3−メトキシ−5−ニトロベンズアルデヒド(47.0g、238mmol)のEtOAc(450mL)懸濁液に、室温で、無水塩化アルミニウム(38.1g、286mmol)を1回で加えた。次いで、ピリジン(77mL、954mmol)を45〜50℃で30分間滴下添加した。反応混合物を2時間還流させ、60℃に冷却した。反応混合物を氷/濃HCl混合物(265mL)に慎重に注いだ。50℃で1時間撹拌した後に、反応混合物を0℃に冷却した。形成した沈殿物を濾過により分離し、水で洗浄し、真空乾燥させると、3,4−ジヒドロキシ−5−ニトロベンズアルデヒド(29.4g、161mmol、収率67.3%)が得られた。
亜塩素酸ナトリウム(47.6g、526mmol)の水(350mL)溶液を、3,4−ジヒドロキシ−5−ニトロベンズアルデヒド(68.8g、376mmol)およびリン酸二水素ナトリウム(45.1g、376mmol)のDMSO/H2O混合(375mL/150mL)溶液に室温で1.5時間滴下添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、5%NaHCO3溶液(500mL)を含有する分離漏斗に注いだ。生成物をジクロロメタン(3×100mL)で抽出した。水層を濃HClでpH約1まで酸性化し、エーテル(3×250mL)で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し(200mL)、Na2SO4上で乾燥させ、蒸発させると、3,4−ジヒドロキシ−5−ニトロ安息香酸(70.3g、353mmol、収率94%)が得られた。
塩化チオニル(6.07mL、83mmol)を、撹拌されている3,4−ジヒドロキシ−5−ニトロ安息香酸(14.4g、72.3mmol)のMeOH(70mL)溶液に室温で1時間滴下添加した。反応混合物を3時間還流させ、回転蒸発器を使用して濃縮した。残渣を水から再結晶化させ、真空乾燥させると、3,4−ジヒドロキシ−5−ニトロ安息香酸メチルエステル(11.0g、51.6mmol、収率71.4%)が得られた。
撹拌されている3,4−ジヒドロキシ−5−ニトロ安息香酸メチル(11.9g、55.8mmol)のEtOH(200mL)溶液に、ジオキサン中4MのHCl(13.96mL、55.8mmol)および炭素上10%のパラジウム(4.0g、3.76mmol)を加えた。反応混合物を大気圧のH2で3時間水素化した(TLC監視)。生じた混合物を濾過し、回転蒸発器を使用して濃縮した。残渣をエーテル(100mL)と共に摩砕した。沈殿物を濾別し、真空乾燥させると、メチル3−アミノ−4,5−ジヒドロキシベンゾエートヒドロクロリド(12.0g、54.6mmol、収率98%)が得られた。
撹拌されているオルト酢酸トリエチル(35.0mL、190mmol)に、3−アミノ−4,5−ジヒドロキシベンゾエートヒドロクロリド(6.00g、27.3mmol)を加えた。撹拌されている懸濁液を20分間還流させ、室温に冷却した。反応混合物をヘキサン(200mL)に注いだ。形成した沈殿物を濾過により分離し、真空乾燥させると、ベンゾオキサゾールメチル7−ヒドロキシ−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−5−カルボキシレート(4.98g、24.04mmol、収率88%)が得られた。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ
10.74 (br. s, 1H), 7.66 (d, J=1.4 Hz, 1H), 7.43 (d, J=1.4 Hz, 1H), 3.85 (s,
3H), 2.62 (s, 3H).
メチル7−メトキシ−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−5−カルボキシレート(365mg)をエタノール16mLに溶かし、1Mの水酸化リチウム3.3mLを加えた。反応物を60℃で一晩加熱した。揮発性物質を真空下で除去し、残渣を水に溶かし、1MのHClでpH3に酸性化した。黄褐色の固体を濾過により集め、水で洗浄した。空気乾燥させると、7−ヒドロキシ−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−5−カルボン酸221mg(65%)が得られた。LC/MS = 208 (M+H).
DMF(10mL)中のメチル7−ヒドロキシ−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−5−カルボキシレート(400mg、2.07mmol)に、摩砕炭酸カリウム(570mg、4.14mmol)およびヨウ化メチル(0.142mL、2.28mmol)を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、メチル7−メトキシ−2−メチル−1,3−ベンゾオキサゾール−5−カルボキシレート368mg(73%)がオフホワイト色の固体として得られた。LC/MS = 222 (M+H).
酸調製35
7−メトキシ−2−メチルベンゾ[d]オキサゾール−5−カルボン酸
7−メトキシ−2−メチルベンゾ[d]オキサゾール−5−カルボン酸の合成を、酸調製31に記載されている加水分解法を使用して完了することができる。
(実施例)
下記の表1〜25に例示されている式(1)の化合物を、下記の方法のいずれかにより、適切なカルボン酸およびスピロ環式ケトンを使用して調製した:
方法A:フラスコに、適切なアミンまたは塩酸アミン(1当量)、DMF、DMSOまたはCH2Cl2(約0.1M)、カルボン酸、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(4〜6当量)またはトリエチルアミン(TEA)(4〜6当量)および2−(7−アザ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)(1〜1.3当量)または1−エチル−3−(3’−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCI)(1当量)を、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(1当量)と共に、またはそれを伴わずに加えた。LC/MSにより決定して反応が完了するまで、混合物を室温で撹拌した。混合物を酢酸エチルまたはCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液(2×)またはNaOH水溶液(0.5M溶液)で、次いで、飽和NaCl水溶液で洗浄した。有機抽出物をMgSO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質を液体クロマトグラフィーにより精製すると、生成物が得られた。
方法B:カルボン酸(1当量)、2−クロロ−4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン(1当量)およびN−メチルモルホリン(NMM)(1当量)のDMFおよび/またはTHF混合物を室温で1時間撹拌し、その後、アミン(1当量)を、さらに追加のNMM(1当量)を加えた。生じた混合物を室温で一晩撹拌した。溶液をEtOAcで希釈し、飽和NH4Cl水溶液で洗浄した。層を分離し、水性層をEtOAcで洗浄した。合わせた有機抽出物をMgSO4上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製物質をクロマトグラフィーにより精製した。
方法C:CH2Cl2(0.1M)中のカルボン酸(1.5当量)に、N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド(1.5当量)およびヒドロキシベンゾトリアゾール(1.5当量)を加えた。約5分間撹拌した後に、アミン(1当量)のCH2Cl2(0.1M)溶液およびトリエチルアミン(1.5当量)を加えた。LC/MSにより決定して反応が完了するまで、混合物を室温で撹拌した。反応物を水、飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物質を液体クロマトグラフィーにより精製すると、生成物が得られた。
方法D:カルボン酸(125μmol)を含有する反応バイアルに、THF(0.5mL)中のDMF(0.5mL)および2−クロロ−4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン(125μmol)を、続いて、NMM(2当量)を加えた。バイアルを音波処理し、ボルテックス処理して、物質の可溶化を保証した。バイアルを室温で1.75時間振盪し、その時間の後、3:1のDMF/THF中のアミン塩(1当量)懸濁液を、続いて、NMMを加えた。混合物を室温で一晩振盪させた。溶媒を減圧下で除去した。残渣に、EtOAc(2.5mL)および飽和NH4Cl水溶液(1mL)を加えた。バイアルをボルテックス処理し、遠心分離した。有機相を予め秤量したバイアルに移し、次いで、溶媒を減圧下で除去した。試料を、HPLCによりSymmetry C8 4.6×50mm 3.5μm粒径カラムを備えたWatersシステムを使用して精製した。
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析条件:
方法LC−1:カラム:Waters ACQUITY Ultra Performance LC(登録商標)BEH C18カラム、2.1×30mm、1.7μm、0.05%TFA 95/5から5/95 水/アセトニトリルへ、流速:1.3mL/分、ラン時間:1.1分。
方法LC−2:カラム:Waters XTerra(登録商標)C18 4.6×50mm、3.5μmカラム。溶媒AおよびBは、それぞれ、0.1%TFAを伴う水および0.1%TFAを伴うアセトニトリルである。9分の全体方法時間で、5.83分にわたって5%Bから95%Bへ。質量スペクトルデータを、180〜850amuから、エレクトロスプレーポジティブモードで得た。流速2.0mL/分。
方法LC−3:カラム:HALO(登録商標)C18 3.0×30mm、2.7μm HPLCカラム。溶媒AおよびBは、それぞれ0.05%TFAを伴う水および0.05%TFAを伴うアセトニトリルである。2.5分の全体方法時間で、2.30分にわたって5%Bから95%Bへ、次いで、95%Bで0.2分間保持。質量スペクトルデータを、160〜650amuから、エレクトロスプレーポジティブモードで得た。流速1.5mL/分。
薬理学的データ
生物学的プロトコル
動物、特に哺乳動物(例えば、ヒト)における疾患(例えば本明細書において詳述しているもの)の治療における本発明の化合物の有用性は、後述のin vitroおよびin vivoアッセイを含めた当業者に既知の従来のアッセイにおけるその活性によって実証することができる。かかるアッセイは、それによって本発明の化合物の活性が他の既知の化合物の活性と比較できる手段も提供する。
ACC1およびACC2の活性の直接阻害
本発明の化合物のACC阻害活性を標準手順に基づく方法によって実証した。例えば式(1)の化合物に関するACC活性の直接阻害を、ラット肝臓ACCおよび組換えヒトACC2の調製物を用いて決定した。
[1]ラット肝臓ACCの調製。標準手順、例えばThampyおよびWakil(J.Biol.Chem.260:6318〜6323;1985)によって記載されているものに基づいて以下の方法を用いてラット肝臓からラット肝臓ACCを得た。
重さが150〜200gの雄CDラットを18〜24時間絶食させ、その後高スクロース食餌(AIN−76Aげっ歯類食餌、Cat#D10001、Research Diets Inc.、米国ニュージャージー州New Brunswick)を3日間与え、その時点でそれらをCO2窒息によって殺した。肝臓を取り出し、氷冷リン酸緩衝溶液(PBS)中ですすぎ、Waring(登録商標)ブレンダー中の5倍の体積量の均質化バッファー(50mMリン酸カリウム、pH7.5、10mM EDTA、10mM 2−メルカプトエタノール、2mMベンズアミジン、0.2mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)、各5mg/Lのロイペプチン、アプロチニン、および抗トリプシン)中で、1分間4℃でホモジナイズした。後続の全ての操作を4℃で実施した。50%PEG溶液を加えることによってポリエチレングリコール(PEG)に対してホモジネートを3%とし、20,000xgで15分間遠心分離した。50%PEG溶液を加えて得られた上清を5%PEGに調節し、5分間撹拌した。20,000×gで20分間の遠心分離によってペレット(ACC活性を含有する)を捕集し、氷冷二重蒸留水ですすいで過剰PEGを除去し、均質化バッファーを用いて元のホモジネート体積の4分の1に再懸濁させた。硫酸アンモニウム(200g/リットル)を撹拌しながらゆっくり加えた。45分後、20,000×gで30分間の遠心分離によって酵素を捕集し、10mLの50mM HEPES、pH7.5、0.1mM DTT、1.0mM EDTA、および10%グリセリン中に再懸濁させ、同じバッファーで平衡化したSephadex(商標)G−25カラム(2.5cm×50cm)(Pharmacia、米国ニュージャージー州Piscataway現GE Healthcare)上で脱塩する。脱塩した酵素調製物をアリコート中に−70℃で保管した。即時使用の前に冷凍ラット肝臓ACCアリコートを解凍し、50mM HEPES、pH7.5、10mM MgCl2、10mMクエン酸三カリウム、2.0mMジチオスレイトール(DTT)、および0.75mg/mLの脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン(BSA)を含有するバッファー中に500μg/mLまで希釈し、37℃で30分間プレインキュベートした。
[2]ラット肝臓ACC阻害の測定。ACC活性の測定およびACC阻害の評価のために、試験化合物をジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解し、アリコート1μLをクリアボトム、96穴プレート(Perkin−Elmer PN#1450−514)に加えた。対照穴は、DMSO単独1μLまたは高阻害化合物1μLを含有する。上記のようにラット肝臓から得た酵素を、酵素バッファー中37℃で30分間活性化させてから化合物プレートに加えた。全穴に、50mM HEPES、pH7.5、7.5mM MgCl2、7.5mMクエン酸三カリウム、2mM DTT、50mg/mL BSAを含有するバッファーに溶かした活性酵素(1.33X)75μLを与える。活性酵素を化合物と一緒に10分間プレインキュベートしてから、50mM HEPES、pH7.5、7.5mM MgCl2、7.5mMクエン酸三カリウム、2mM DTT、50mg/mL BSA、120μMアセチルCoA、8.0mM ATP、38.4mM KHCO3、および1.6mM NaH[14C]O3(100μCi/μL)を含有する基質溶液25μLを加えることによって反応を開始した。反応中の最終基質濃度は、30μMアセチルCoA、9.6mM KHCO3、0.4mM NaH[14C]O3、および2mM ATPであった。3N HCl 25μLを加えることによって10分後に反応を停止させ、プレートを50℃で最低20時間乾燥させた。水30μLを乾燥させたプレートに加え、5分間混合した。Optiphase Supermix液体シンチレーション流体(Perkin Elmer、米国マサチューセッツ州Waltham)95μLを加え、プレートを20分間混合する。Wallac Trilux 1450 Microbeta LSCルミネセンスカウンターを用いてMCoA中への14Cの取り込みを測定した。
[3]ヒトACC2阻害の測定。精製した組換えヒトACC2(hrACC2)を用いてヒトACC2阻害を測定した。簡単に言えば、ACC2の完全長CytomaxクローンをCambridge Bioscience Limitedから購入し、配列決定し、PCDNA5 FRT TO−TOPO(Invitrogen、米国カリフォルニア州Carlsbad)中にサブクローニングした。テトラサイクリン誘導によってACC2をCHO細胞中で発現させ、1μg/mLテトラサイクリン(Invitrogen、米国カリフォルニア州Carlsbad)を含む、グルタミン、ビオチン、ハイグロマイシンおよびブラストサイジンを含んだDMEM/F12 5リットル中に回収した。次いでACC2を含有するならし培地をSoftlink Soft Release Avidinカラム(Promega、米国ウィスコンシン州Madison)に加え、5mMビオチンで溶離した。ACC2 4mgを濃度0.05mg/mL(A280によって決定した)、推定純度95%(A280によって決定した)で溶離した。精製したACC2を50mMトリス、200mM NaCl、4mM DTT、2mM EDTA、および5%グリセリン中で透析した。プールしたタンパク質を凍結し、融解時に活性の損失なしに−80℃で保管した。ACC2活性の測定およびACC2阻害の評価のために、試験化合物をDMSO中に溶解し、最終DMSO濃度1%の5倍ストックとしてrhACC2酵素に加えた。50μM ATP反応のための製造条件を用いたTranscreener ADP検出FPアッセイキット(Bellbrook Labs、米国ウィスコンシン州Madison)を使用して、rhACC2をCostar#3767(Costar、米国マサチューセッツ州Canbridge)384穴プレート中で検定した。アッセイの最終条件は、50mM HEPES、pH7.5、5mM MgCl2、5mMクエン酸三カリウム、2mM DTT、0.5mg/mL BSA、30μMアセチルCoA、50μM ATP、および8mM KHCO3であった。通常、10μL反応を室温で1時間実施し、10μlのTranscreener停止および検出バッファーを加え、さらに1時間インキュベートした。620励起Cy5 FPジェネラルデュアルミラー、620励起Cy5 FPフィルター、688発光(S)および688(P)発光フィルターを用いたEnvision Fluorescenceリーダー(Perkinelmer)上でデータを取得した。
上記ラット肝臓ACC放射酵素アッセイおよび組換えhACC2 transcreenerアッセイを用いた結果を、上記実施例で例示した式(I)の化合物に関して以下の表にまとめて示す。
実験動物におけるACC阻害の急性in vivo評価
本発明の化合物のACC阻害活性は、治療した動物からの肝臓および筋肉組織のマロニルCoAレベルを低減させるそれらの能力の評価によってin vivoで確認することができる。
実験動物におけるマロニルCoA生成阻害の測定。この方法では、適宜の標準固形飼料および水で維持した雄スプレーグ・ドーリーネズミ(225〜275g)を、研究する前に無作為化した。動物は、実験を開始する18時間前に餌を与えるか、または絶食させた。明期に入って2時間後に、動物に5mL/kgの体積(0.5%メチルセルロース、ビヒクル)または適切な化合物(ビヒクル中で調製)を経口投与した。ビヒクルを与えた対照は、ベースライン組織マロニルCoAレベルを決定するために含め、一方絶食した動物は、マロニルCoAレベルに対して絶食が与えた影響を決定するために含めた。化合物投与の1時間後、動物をCO2で窒息させ、組織を取り出した。特に、血液を心臓穿刺によって捕集し、EDTAを含有するBD Microtainerチューブ中に入れ(BD Biosciences、米国ニュージャージー州)、混合し、氷上に置いた。血漿を用いて薬物曝露を決定した。肝臓および四頭筋を取り出し、直ちに凍結クランプし、金属箔で包み、液体窒素中で保管した。
組織を液体N2下で微粉砕して、サンプリングにおける均一性を確保した。FastPrep FP120(Thermo Scientific、速度=5.5、45秒間)中のLysing Matrix A(MP Biomedicals、PN 6910)に溶かした5倍体積量の10%トリカルボン酸を用いて組織(150〜200mg)からマロニルCoAを抽出した。15000×gで30分間遠心分離(Eppendorf Centrifuge 5402)した後にマロニルCoAを含有する上清を細胞片から取り出した。分析が完了するまで試料を−80℃で安定して凍結させた。
肝臓および筋肉組織中のマロニルCoAレベルの分析は、以下の方法論を用いて評価することができる。
この方法は、以下の物質を利用する:Isotec(米国オハイオ州Miamisburg)から購入したマロニルCoAテトラリチウム塩およびマロニル−13C3−CoAトリリチウム塩、過塩素酸ナトリウム(Sigma、cat no.410241)、トリクロロ酢酸(ACROS、cat no.42145)、リン酸(J.T.Baker、cat no.0260−01)、ギ酸アンモニウム(Fluka、cat no.17843)、メタノール(HPLCグレード、J.T.Baker、cat no.9093−33)、および水(HPLCグレード、J.T.Baker、4218−03)を使用して必要とする移動相を作成した。Strata−Xオンライン固相抽出カラム、25μm、20mm×2.0mm I.D(cat no.00M−S033−B0−CB)をPhenomenex(米国カリフォルニア州Torrance)から得た。SunFire C18逆相カラム、3.5μm、100mm×3.0mm I.D.(cat no.186002543)をWaters Corporation(米国マサチューセッツ州Milford)から購入した。
この方法は、以下の装備を利用して行うことができる。Agilent 1100バイナリーポンプ、Agilent 1100クォータナリーポンプおよび2個のValco Cheminert 6ポート2位置弁を用いた二次元クロマトグラフィー。10℃で保持したPeltier冷却スタックおよび20μLサンプリングループを備えたLEAP HTC PALオートサンプラーによって試料を導入した。オートサンプラーのためのニードル洗浄溶液は、Wash 1が10%トリクロロ酢酸水溶液(w/v)であり、Wash 2が90:10 メタノール:水である。MicroTech Scientific Micro−LC Column Ovenを用いて分析用カラム(Sunfire)を35℃で保持した。Turbo Ion Sprayを備えたABI Sciex API3000三連四重極質量分析計で溶離液を分析した。
オンライン固相抽出および逆相クロマトグラフィーに関して異なる勾配溶離条件を用いて同時に二次元クロマトグラフィーを行った。この方法の一般的な計画は、第1次元をサンプル洗浄および目的の分析物の捕捉のために利用し、続いて第1次元から第2次元上への溶離のために両方の次元を短時間カップリングするようなものであった。両次元を続いて脱共役させて、定量化のために第2次元から分析物を勾配溶離させ、同時に配列中の次の試料のために第1次元を調製した。両次元を簡単に連結した場合、第1次元中の移動相の流れを第2次元上への分析物溶離のために逆流させて、最適ピーク幅、ピーク形状、および溶離時間を可能にする。
HPLC系の第1次元は、Phenomenex strata−Xオンライン固相抽出カラムと溶媒Aが100mM過塩素酸ナトリウム/0.1%(v/v)リン酸および溶媒Bがメタノールからなる移動相とを利用した。
HPLC系の第2次元は、Waters SunFire C18逆相カラムと溶媒Aが100mMギ酸アンモニウムおよび溶媒Bがメタノールからなる移動相とを利用した。勾配の初期条件を2分間保持し、この間に分析物を分析用カラムに移した。分析用で維持している間、オンラインSPEカラムから分析物を溶離するのに初期条件は十分な強度であったことが重要であった。その後、洗浄および再平衡ステップの前に4.5分で74.5%Aまで勾配が直線的に上がった。
質量分析は、HPLCと連結すると、複雑な基質中の分析物を定量的に測定する場合に高選択的および高感度な方法になり得るが、依然として干渉および抑制を受ける。二次元HPLCを質量分析計と連結することによって、これらの干渉は著しく減少する。さらに、三連四重極質量分析計の多重反応モニタリング(MRM)特色を利用することによって、信号対雑音比が著しく改善した。
このアッセイでは、質量分析計を、TurbolonSpray電圧2250Vで陽イオンモードにおいて操作した。噴霧ガスを450℃まで加熱した。デクラスタリング電位(DP)、集束電位(FP)、および衝突エネルギー(CE)を、それぞれ60、340、および42Vに設定した。四重極1(Q1)分解能をユニット分解能に設定し、四重極3(Q3)を低に設定した。CADガスを8に設定した。モニターしたMRM転移は、停止時間200msでのマロニルCoA:854.1→347.0m/z(L.Gaoら(2007)J.Chromatogr.B 853、303〜313)、およびマロニル−13C3−CoA:857.1→350.0m/zに関してであった。溶離液を、予想した分析物の溶離時間付近で質量分析計に分流し、他の場合には、供給源の保持および器械使用の頑健性の向上を助けるために廃棄した。得られたクロマトグラムを、Analystソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて組み込んだ。マロニルCoAの組織濃度を、10%トリクロロ酢酸水溶液で調製した標準曲線から計算した。
組織抽出物中のマロニルCoAの定量化のための標準曲線を含む試料を10%(w/v)トリクロロ酢酸(TCA)で調製し、0.01〜1pmol/μLの範囲であった。マロニル−13C3−CoA(最終濃度0.4pmol/μL)を各標準曲線成分および試料に内部標準として加えた。
アッセイ内品質対照を6個調製した。絶食させた動物から調製したプールした抽出物から3個、および餌を与えた動物から作製したプールから3個。これらは、0、0.1または0.3pmol/μLの12C−マロニルCoAならびにマロニル−13C3−CoA(0.4pmol/μL)を加えた別々の試料として実行した。各アッセイ内品質対照は、水性組織抽出物を85%含有し、残りの部分が内部標準(0.4pmol/μL)および12C−マロニルCoAによって占められていた。アッセイ間対照を各実験に含めた。それらは1個の絶食させたおよび1個の餌を与えたプールした四頭筋の試料および/または1個の絶食させたおよび1個の餌を与えたプールした肝臓の試料で構成される。かかる全ての対照に、マロニル−13C3−CoA(0.4pmol/μL)を加えている。
下記に示されているある種の式(I)の化合物を、上記のin vivo試験で使用して、肝臓および筋肉組織におけるマロニルCoAレベルに対するその作用を決定した。結果を以下の表に示す。