JP2011518780A - 止血マイクロスフェア - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年4月3日に出願した米国特許出願第61/042,156号;および2009年2月6日に出願した米国特許出願第61/150,466号の恩典を主張し、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、トロンビンなどの止血剤および/または血漿を含み得る、多孔性架橋ゼラチンマイクロスフェアをはじめとする架橋ポリマーなどの止血組成物に関する。ある種の態様において、止血組成物は、止血の迅速でかつ信頼性のある開始を提供するために、一連のトロンビン濃度を包含するトロンビンの用量を含み得る。特定の態様において、止血組成物は、止血の迅速でかつ信頼性のある開始を提供するために、例えば1000 IU/mlまたはそれ以上といった高用量のトロンビンを含み得る。
手術または損傷の結果としての出血は、受動的な止血物質および/または止血剤によって制御され得る。受動止血物質は、圧力および吸収を通じて出血を機械的に制御するものであり、断片化されるかもしくはさもなくば機械的に破砕された、酸化再生セルロースまたは架橋ゼラチン製の粉末、ガーゼ、またはスポンジであってよい。多くの場合、受動止血物質は、トロンビンなどの能動止血物質と併用される。しかしながら、改良された止血組成物、特に優れた血塊形成を付与する止血組成物の必要性が依然として残っている。
本発明は、本明細書中に記載されている特定の方法、プロトコール、および試薬等に限定されず、したがって変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用した用語は特定の態様を説明する目的にのみ用いられ、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
熱ゲル化‐液体:10%(w/v)の濃度になるようにゼラチンを水中で加熱することにより、ゼラチンを溶解した。乳化剤(TWEEN(登録商標) 80、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート) 6 gを、ゲル化溶液100 mlに添加した。次に、乳化剤(SPAN(登録商標) 85、ソルビタントリオレエート) 30 gを含むトルエン500 mlを、その溶液中に撹拌した。初期量のトルエンは、添加されて、ゼラチン溶液中に液滴として分散される空洞形成化合物として作用した。さらなるトルエンを添加するにつれて、ゼラチン溶液はトルエン液滴で飽和していき、ゼラチン溶液がトルエン溶液中に分散された水性ゼラチン液滴となるように、最終的に十分なトルエンを添加する(例えば、500 ml)。所望のサイズのマイクロスフェアが形成されたならば、ゼラチンの凝固温度よりも低い温度になるまで分散物を冷却した。この過程により、トルエンの液滴で飽和されたゼラチンマイクロスフェアが形成される。次に、エタノールおよびアセトンでビーズを洗浄することにより、これらのトルエン液滴を除去するが、これに伴って、空洞で満たされたゼラチンマイクロスフェアが提供される。次に、安定性をさらに高めるために、ゼラチンビーズをグルタルアルデヒドで架橋する。
アクリルアミド(17 g)およびビスアクリルアミド(1.2 g)を、Tris緩衝液(100 ml、0.05 M、pH 7)中に溶解した。過硫酸アンモニウム(0.5 g/ml、0.25 ml)および乳化剤(TRITON X-100(商標)、6 g)を、単量体溶液に添加した。次に、乳化剤(SPAN(登録商標) 85 30 g)を含むトルエン500 mlを、系中に撹拌した。次に、TEMED(共触媒、1.3 ml)を系に添加した。重合過程の終了時に、エタノールおよびアセトンで有機溶媒を洗浄除去した。
ゼラチンを8% (w/v)の濃度で水中に溶解し、60℃で保持した。TWEEN(登録商標) 80(Atlas Chemie, Enschede, Netherlands)を含む溶液(6% w/v) 100 mlに、SPAN(登録商標) 85(Atlas Chemie)を含むトルエン(6% w/v)を連続して添加した。添加したトルエンは、混合速度に応じた液滴サイズで、飽和するまでゼラチン溶液中で液滴を形成した。最終量400 mlになるまで過剰なトルエンを添加することにより、トルエンの液滴を含むゼラチンマイクロスフェアが生成された。分散物を20℃未満に冷却した後、エタノール200 mlを添加した。次に、形成されたゼラチンマイクロスフェアをエタノールでさらに洗浄し、最後にアセトンで洗浄した後、室温で一晩乾燥させた。乾燥ゼラチンマイクロスフェアを篩過し、125μm〜180μmの画分を、pH7.0の0.1 Mリン酸緩衝液で膨潤させた後、グルタルアルデヒド(8.8% w/v)で15℃で30分間処理することにより架橋した。過剰なグルタルアルデヒドを除去した後、ゼラチンマイクロスフェアを121℃で20分間熱処理したが、これにより用量は約50%まで減少し、水およびアセトンで洗浄した後、最終的に60℃で一晩乾燥させた。
分散の均一性およびシリンジ通過性を改善するために、ゼラチンマイクロスフェアを湿潤剤と組み合わせた。ゼラチンマイクロスフェアは上記の通りに調製することができ、または例えばCultispher(登録商標)-Sマクロ多孔性ゼラチンマイクロスフェア(Percell Biolytica, Astorp, Sweden)のように購入することもできる。湿潤剤は乾燥粉末として入手可能であり、乾燥粉末であることで乾燥粉末マイクロスフェアとの混合が促進される。しかしながら、粉末がいずれも乾燥しているという必要はない。1つの態様において、湿潤剤は、ポロキサマー188、NF(Spectrum Chemicals, Gardena, CA, Cat. #P1169)などのポロキサマーである。Cultispher(登録商標)-Sマイクロスフェアおよそ1 g〜60 gをポロキサマー188 1 g〜3 gと混合し、均一な混合物が得られるまで乾燥粉末を共に混合する。混合は、当技術分野で公知の様々な技法および設備を用いて行うことができる。あるいは、湿潤剤は、ゼラチンマイクロスフェアを分散させるために用いられる希釈液の成分である。本態様において、湿潤剤は、約0.25% w/v〜5% w/vで希釈液中に存在する。湿潤剤を含む希釈液各1 mLに対して、Cultispher(登録商標)-Sマイクロスフェアおよそ125 mg〜175 mgを添加し、次に、例えばマイクロスフェアがペースト様の粘度になるまで混合されるまで、相互接続された2つのシリンジ間を行ったり来たりさせることにより、架橋ゼラチンマイクロスフェアと、湿潤剤を伴う希釈液を混合する。
分散の均一性およびシリンジ通過性を改善するために、ゼラチンマイクロスフェアを懸濁剤と組み合わせた。ゼラチンマイクロスフェアは、上記の通りに調製することができる。1つの態様において、ゼラチンマイクロスフェアはCultispher(登録商標)-Sマイクロスフェア(Percell Biolytica)であった。懸濁剤は乾燥粉末として入手可能であり、乾燥粉末であることで乾燥マイクロスフェアとの混合が促進される。しかしながら、粉末がいずれも乾燥しているという必要はない。1つの態様において、懸濁剤は、中間粘度カルボキシメチルセルロース(Spectrum, Cat. #CA192)などのカルボキシメチルセルロースである。ゼラチンマイクロスフェアと懸濁剤粉末を、均一な混合物が得られるまで共に混合する。混合は、当技術分野で公知の様々な技法および設備を用いて行うことができる。あるいは、懸濁剤は、ゼラチンマイクロスフェアを分散させるために用いられる希釈液の成分である。本態様において、湿潤剤は、約0.25% w/v〜5% w/vで希釈液中に存在する。懸濁剤を伴う希釈液各1 mLに対して、Cultispher-Sマイクロスフェアおよそ125 mg〜175 mgを添加し、次に、例えばマイクロスフェアがペースト様の粘度になるまで混合されるまで、相互接続された2つのシリンジ間を行ったり来たりさせることにより、架橋ゼラチンマイクロスフェアと、懸濁剤を伴う希釈液を混合する。
分散の均一性およびシリンジ通過性を改善するために、ゼラチンマイクロスフェアを湿潤剤および懸濁剤と組み合わせることができる。ゼラチンマイクロスフェアは、上記の通りに調製することができる。1つの態様において、ゼラチンマイクロスフェアはCultispher(登録商標)-Sマイクロスフェア(Percell Biolytica)である。カルボキシメチルセルロースである懸濁剤、およびポロキサマー188である湿潤剤はいずれも、乾燥粉末である。次に、ゼラチンマイクロスフェアを等量の懸濁剤および湿潤剤の粉末混合物と、均一な混合物が得られるまで混合する。あるいは、懸濁剤および湿潤剤はいずれも、ゼラチンマイクロスフェアを分散させるために用いられる希釈液の成分である。本態様では、ゼラチンマイクロスフェアと、懸濁剤/湿潤剤を伴う希釈剤を、例えばマイクロスフェアがペースト様の粘度になるまで混合されるまで、相互接続された2つのシリンジ間を行ったり来たりさせることにより混合する。
希釈液(生理食塩水、トロンビンを含む生理食塩水、または匹敵する媒体)を含む別のシリンジに連結された、基質を含むシリンジからなる流動性止血基質を調製した。基質は、ポロキサマー188またはカルボキシメチルセルロースなどの添加物を伴うまたは伴わない架橋ゼラチン粉末(Cultispher(登録商標)-Sマクロ多孔性ゼラチンマイクロスフェア)からなった。添加物を伴うまたは伴わない止血基質を秤量し、シリンジに移した。典型的には、組成物は、60:1 w/w〜3:1 w/w比(マイクロスフェア:添加物)の範囲の添加物を伴うまたは伴わないCultispher(登録商標)-Sマイクロスフェア675 mgを含んだ。蓋をしたシリンジ外筒(プランジャーは除去しておく)に成分を入れ、プランジャーを粉末の後方の位置に戻した。メス-メスルアー接続器を用いて、希釈液4.5 mLを含む別のシリンジを粉末シリンジに連結した。次に、20回通過させることにより、乾燥粉末と緩衝液を混合した。止血基質を60秒間水和させ、次に基質を分注した。Cultispher(登録商標)-Sマイクロスフェアのみを含む(添加物を伴わない)分注された調製物は、水分含量に関して不均一性を示した;すなわち、最初の分割量は後の分割量よりも「湿って」いた。この現象は、「スポンジングアウト」と称された。しかしながら、添加物として湿潤剤(例えば、ポロキサマー188)または懸濁剤(カルボキシメチルセルロース)を含めると、この現象は最小限に抑えられた。シリンジの全内容物を分注した場合に、添加物を含む基質を押し出すのに必要な力がより一貫しており、最小化されることも、シリンジ力計測器を用いて観察され、定量的に決定された。添加物を伴わないCultispher(登録商標)-Sマイクロスフェアの基質を、分注前にシリンジに取り付けた狭孔径投与チップを通して分注することは、実用的ではなかった。しかしながら、添加物として湿潤剤(すなわち、ポロキサマー188)または懸濁剤(カルボキシメチルセルロース)を含めると、この現象は最小限に抑えられ、シリンジの全内容物を狭孔径投与チップを通して最小限の力で分注することが可能となった。
多孔性架橋ゼラチンマイクロスフェアと非多孔性(中実)架橋ゼラチンマイクロスフェアとの間で止血有効性を比較するための研究を設計した。マイクロスフェアは、150 mg/mLトロンビンの単回用量を両マイクロスフェア調製物に含めることを除き、上記の通りに調製した(プラセボは、トロンビンを伴わない多孔性Cultispher(登録商標)-Sマイクロスフェアである)。
公表されたアッセイに従って、トロンボエラストグラフィー(TEG)アッセイを行った。Roche et al., 96 Anesth. Analg 58-61 (2003)を参照されたい。貯蔵トロンビン溶液は、0.9%生理食塩水0.5 mLに溶解した組換えトロンビン(例えば、RECOTHROM(登録商標), ZymoGenetics, Inc., Seattle WA)の5000単位バイアルからなり、最終量600μlおよび濃度8333 IU/mLとした。10μl分割量によって、TEGアッセイにおける最終濃度が25 IU〜200 IU/mlになるように、生理食塩水+0.1% BSA中の貯蔵液から希釈物を作製した。トロンビン10μlを乾燥マイクロスフェア粉末に添加し、膨潤ゲルを生成した。これにより、血塊が発生する前に、トロンビンと血液のより均一な混合が可能になった。アッセイは2台のTEG 5000で行い、TAS 4.2.3(HAEMOSCOPE(商標) Corp., Niles, IL)などの市販のソフトウェアを用いてモニターした。
ヘパリンを添加する前に、ヘパリン前のTEGパラメータを決定するために、血液を再石灰化した。ヘパリンなしのアッセイの結果は、処置前のおよびクロピドグレル二硫酸塩処置した血液試料の両方に関して同様である。クロピドグレル二硫酸塩血液試料のいくつかは、速いR値を有し、それらが高凝固性であることが示唆される。これらの結果は、当技術分野で報告されている結果と一致する。
マイクロスフェアゲルの混合は、特定の方法を開発しながら改善することができる。例えば、ゲルを十分に膨潤させることにより1つのマイクロスフェアゲル調製物を作製し、次に0.9% NaCl中の1:1懸濁液になるよう調整した。アッセイの直前に、ゲルをTEGカップにピペットで入れた。
乾燥マイクロスフェア粉末(23.5 g)を、5000 IU/mL組換えトロンビン4.7 mLおよび0.9%生理食塩水56.9 mLと混合した。これにより、1 IUトロンビン/mg乾燥マイクロスフェア粉末を有する水和ゲルが得られた。同じゲル対生理食塩水比(1:2.6)を、トロンビンなしの対照として用いた。アッセイの直前に、スパチュラを用いて、様々な量の水和ゲルをTEGアッセイカップ中に量り入れた。
クロピドグレル二硫酸塩処置の全3日間にわたり、反応時間(R)、反応速度(K)、および最大振幅(MA)に及ぼすヘパリンのみおよびヘパリン+クロピドグレル二硫酸塩の効果を決定するために、ヘパリンを血液に添加した(1 IUヘパリン/mL血液)。3日目の最終血液試料は、AVシャントモデルの開始直前にウサギにヘパリンを注入して(ヘパリン「搭載」)、アッセイした。注入したヘパリンは、およそ1単位/mL血液である。このレベルのヘパリンは、>400秒のAPTTを得るのにまさに十分である。
アッセイの前に、蒸留USP灌注水1.5 mL中のマイクロスフェアゼラチンビーズ50 mgまたは100 mgいずれかの懸濁液を、振動により15分間膨潤させた。次に、ゼラチンビーズ懸濁液35μlを各アッセイカップに分注し、37℃で30分間乾燥させた。乾燥ゲルは、それぞれ1.21 mgまたは2.42 mg/カップのいずれかである。
血液をクエン酸中に採取し、カルシウム(11 mM)を加えて戻し、アッセイを開始した。これらの条件下では、強力な血塊を形成するための十分なトロンビンが、血液中のプロトロンビンから生成される。血液中に凝固阻害剤(「搭載」)がない場合、出血を止めるためにトロンビンを添加することの主な利点は、12〜21分から1分未満へと凝固時間が短縮することである。これは、約3 IUトロンビン/mLの血液で達成され得る(図1、マイクロスフェアおよびトロンビン)。
ウサギ血管吻合出血モデルを使用した。PTFE動脈静脈グラフトを4-0縫合針で4回穿刺し、直ちに吸収性ゼラチンスポンジ、USPで巻き、プラセボ(媒体)またはrトロンビン(1000 IU/mLまたは125 IU/mL)を含ませた。プラセボ、標準用量のヘパリンのみ、またはヘパリンとクロピドグレル二硫酸塩で処置した動物について、全体的な平均TTHを計算した。厳格な標準誤差推定値を伴う線形モデルを用いて、結果を解析した。
インビボ研究設計
様々な処置群を、異なるrトロンビン濃度に関して表1に示し、クロピドグレル二硫酸塩で前処置した動物に関して表2に示す。
AGS=吸収性ゼラチンスポンジ、USP、TTH=止血時間
対照目的で、ヘパリンなしでクロピドグレル二硫酸塩のみで処置したウサギに関しては、データを示していない。
体重2.0 kg〜3.8 kgのおよそ12週齢の雌ニュージーランド白ウサギ、ロット番号2525(Charles River Laboratories, Hollister CA)を、この研究に用いた。実験の7日〜10日前に動物を施設に順応させ、ZymoGenetics Vivariumにおいて良好な条件で維持した。研究プロトコールは、施設内動物実験委員会により認可された。
ゼラチンスポンジ(GELFOAM(登録商標)吸収性ゼラチン圧縮スポンジ、USP、Pharmacia & Upjohn Co., Kalamazoo, MI、サイズ100)を2×4×1 cmの条片に切り分け、試験物質(rトロンビンまたはプラセボ)と組み合わせた。
AVシャント術を行う前に、各動物に、20 mg/kg経口用量のクロピドグレル二硫酸塩を毎日、3日間投与した。75 mgクロピドグレル二硫酸塩錠剤を滅菌蒸留水3 mLに懸濁し、作業濃度25 mg/mLを得た。各動物に、胃管栄養により1日当たり1.6 2.2 mL の25 mg/mL溶液を投与した。
各ウサギの体重を量り、筋肉内注射による塩酸ケタミン(50 mg/kg)で固定化した。精密ガス麻酔気化器に鼻の円錐状頭部を接続した状態で、動物を手術台に乗せ、該気化器は、流速1%〜2% L/分O2で、誘導のための4%〜5%および麻酔の外科的水準を維持するための1%〜2%の麻酔(ISOFLO(登録商標)イソフルラン、USP、Abbott Labs., North Chicago, IL)蒸気濃度を送達した。実験中、37℃に維持したウォータージャケット加熱パッドに動物を乗せ、体温をモニターするために直腸熱プローブを挿入した。実験の間中、血圧、平均動脈圧、および体温を測定した。
グラフトのいずれかにおいて縫合孔を作製するのに先立って、およそ55 mm Hgの基線MAPが達成されなければならず、かつAPTT値は400秒を超えなければならなかった。縫合孔出血の評価は、PTFEグラフト部分の中央部分を、2 4-0 18インチ絹縫合針(逆三角針サイズP-3、Ethicon Inc., Somerville, NJ)で穿刺して、4つの針孔を作製する段階からなった。
ヘパリンのみで処置したウサギの一部、およびクロピドグレル二硫酸塩/ヘパリンで処置したウサギのすべてにおいて、TTHが達成されたという条件で、5分の実験の終了時に、縫合孔部位における血塊破裂を評価した。この手順は、グラフトからおよそ2 cm〜3 cm下流の頸静脈カテーテルへの血流を、10秒間クランプで締め付けて止める段階を含んだ。血流の完全な閉塞により、動脈流からの血圧が増加した。10秒間の間に血液がAGSを通して浸透する事象では、血塊破裂は陽性として記録した。漏出が認められない場合には、血管破裂は陰性として記録した。
止血時間の線形モデルは、Yが秒単位でのTTHであり、Xがカテゴリー変数としてのrトロンビン用量群であり、Zが、クロピドグレル二硫酸塩なしでは「0」、およびクロピドグレル二硫酸塩を伴う場合は「1」とコードされるクロピドグレル二硫酸塩処置である場合に与えられ、rトロンビン用量群とクロピドグレル二硫酸塩処置の間の相互作用である。
この研究の主要有効性エンドポイントは、止血時間(TTH)であった。TTH値は65秒〜300秒の範囲であり、各処置群について平均TTHを計算した(表3)。4つの濃度のrトロンビン対媒体/対照の比較から、TTHの濃度依存的減少が実証された。プラセボ+AGS(249±67.1)および31.25 IU/mL rトロンビン+AGS(213±39.3)と比較して、62.5 IU/mL、125 IU/mL、および1000 IU/mL rトロンビン+AGS(142±35.7、87±22.5、71±4.6)で処置したグラフトの間で、TTHの有意な減少(p<0.001)が認められた。
TEGアッセイの調製;ウサギAVモデルによる試料
AVシャントモデル法に詳述した通りに、クロピドグレル二硫酸塩処置の2時間後に血液を採取した。血液をクエン酸中に採取し、TEGアッセイプロトコールに従って、アッセイの直前に20μlの0.2 M CaCl2、0.9% NaCl,pH 7.4で再石灰化した。クロピドグレル二硫酸塩処置前のウサギによる試料および1日目試料に、1単位/mlヘパリンをインビトロで添加した。3日目のクロピドグレル二硫酸塩処置後のウサギによる試料は、ヘパリンがおよそ1 U/mL血液となるようにウサギに注入されたヘパリンを含んだ(動物は>400秒のAPTTを有した)。
標準TEGプロトコールに従って、クエン酸ウサギ血液を再石灰化した。Roche et al., 96 Anesth. Analg 58-61 (2003)を参照されたい。血液は、外因性トロンビンなしで、ウサギ血液の正常パラメータ内で凝固した。0.76〜6.1 IU/mL rトロンビンを直接添加すると、TEG測定を妨げる速度で血塊形成が開始した。10倍の範囲のトロンビン量を網羅するトロンビン添加Haemoscopeの改良法を、血塊発生に用いた。
TEGは、以下のものを測定する:血塊の発生に関する待ち時間、20-mm振幅という固定した血塊硬度の発生までの時間、
・角度(α)によって測定される血塊発生の動態
・血塊の最大振幅(MA)
・R値(反応時間)は、追跡の開始から、曲線が1 mm幅である時点まで測定される
・血塊強度(剪断弾性係数)は、G(ダイン/cm2)と定義される。
インビボウサギ実験(実施例11および実施例12)から、AVシャントモデルにおいて、漸増用量のrトロンビンによってTTHが減少し得ることが示された。図6に、AVシャントモデルに関して調製したウサギによる血塊の血塊強度G(ダイン/cm2)をプロットする。クロピドグレル二硫酸塩の投与の2時間後に、ウサギから血液を採取した。血液をクエン酸中に採取し、再石灰化し、TEGアッセイにおいて用いた。処置前および1日目クロピドグレル二硫酸塩処置ウサギからの試料は、1 U/mLヘパリンと共にインビトロでインキュベートし、3日目クロピドグレル二硫酸試料に関してはAVシャント手順中にヘパリンを添加した。
ゼラチン基質を用いて適用する場合に、組換えヒトトロンビン(rトロンビン)の止血活性が維持されることを確認するため、および基質の性能特性を評価するため、以前に確立された出血モデル、ラット半腎切除およびウサギ肝損傷を用いて、非GLP薬理学研究を行った。血管手術手技においてよく見られる種類の出血を表すさらなるモデルもまた用いて、rトロンビンゼラチン基質を評価した。動脈グラフト部位の針穿刺から出血を生じるこのモデルの重要な局面には、出血部位に存在するより高い圧力および流速、ならびに動物における抗凝固剤の使用が含まれる。まとめると、これら3つの出血モデルを用いて、目的の臨床用途を模倣する一連の条件下で、rトロンビンゼラチン基質の性能および止血活性を確認した。
いずれもゼラチン基質と共に適用したrトロンビンおよびプラセボを、ラット半腎切除モデルにおいて盲検様式で比較した(n=8/群)。簡潔に説明すると、このモデルは、矢状切断を生じ、腎臓量のおよそ18%を除去するための鋳型を用いて、腎臓に標準損傷を生成することを含む。試験物質(rトロンビンを含む溶液に懸濁したゼラチン基質)またはプラセボ(有効成分なしのrトロンビンの製剤を含む溶液に懸濁したゼラチン基質)を、シリンジにより切断面に適用し、2つのガーゼスポンジを試験物質上に置き、連続した指圧を30秒間加えた。30秒後、ガーゼスポンジを出血に関して視覚的に検査した。出血時間(TTH)が達成されなかった事象では、ガーゼスポンジを交換し、さらなる試験物質を適用した。最大時間10分までにTTHが達成されるまで、指圧と視覚的検査を10〜15秒おきに交互に行った。清潔なガーゼスポンジに染み込む、目で確認できる血液が見られなくなった時点で、止血時間を記載した。実験期間を通して、平均動脈圧および体温をモニターした。rトロンビンまたはプラセボで処置した個々の動物に関して、止血時間を図7Aに示す。ゼラチン基質を用いて適用したrトロンビンで処置した創傷において、同様の様式で適用したプラセボと比較して、群平均TTHの有意な減少(p<0.0001、t-検定)が認められた。プラセボ/ゼラチン処置でも、止血は最終的に達成された。しかしながら、この群ではrトロンビン/ゼラチン群よりも、平均TTHはおよそ3倍高かった。これらのデータから、このモデルにおける能動止血剤としてのrトロンビンの重要性が実証される。
いずれもゼラチン基質と共に適用したrトロンビンおよびプラセボを、ウサギ肝損傷モデルにおいて盲検様式で比較した(n=6/群)。簡潔に説明すると、このモデルは、直径およそ2 cmの切片を除去するための鋳型を用いて、肝左中葉の表面に標準損傷を生成することを含む。試験物質(rトロンビンを含む溶液に懸濁したゼラチン基質)またはプラセボ(有効成分なしのrトロンビンの製剤を含む溶液に懸濁したゼラチン基質)を、シリンジにより切断面に適用し、その後2つのガーゼスポンジを試験物質上に置き、連続した指圧を60秒間加えた。60秒後、ガーゼスポンジを出血に関して視覚的に検査した。TTHが達成されなかった事象では、ガーゼスポンジを交換し、さらなる試験物質を適用した。最大時間10分までにTTHが達成されるまで、指圧と視覚的検査を10〜15秒おきに交互に行った。清潔なガーゼスポンジに染み込む、目で確認できる血液が見られなくなった時点で、止血時間を記載した。実験期間を通して、平均動脈圧および体温をモニターした。rトロンビンまたはプラセボで処置した個々の動物に関して、止血時間を図7Bに示す。ゼラチン基質を用いて適用したrトロンビンで処置した創傷において、同様の様式で適用したプラセボと比較して、群平均TTHの有意な減少(p=0.0016、t-検定)が認められた。プラセボ/ゼラチン処置でも止血は最終的に達成されたが、この群ではrトロンビン/ゼラチン群と比較して、平均TTHは2倍超高かった。これらのデータから、このモデルにおける能動止血剤としてのrトロンビンの重要性が実証される。
血管手術設定で起こり得る出血を模倣するため、ウサギAVシャントモデルを開発した。簡潔に説明すると、このモデルは、カテーテルを接続するために約2 cm長のPTFEグラフト部分を用いて、左頸動脈と右頸静脈の血流を連結する動脈-静脈シャントを作製する段階を含む。ウサギを静脈内ヘパリン(100 U/kg静脈内ボーラスおよび50 U/kg/時間)で処置して、シャント開存性を維持した。実験期間を通して、平均動脈圧(MAP)、シャント内の血流速度、APTT、および体温をモニターした。グラフトのいずれかの穿刺に先立って、およそ55 mm Hgの基線MAPが達成された。縫合針(逆三角針サイズP-3)によるグラフト穿刺の直後に、ゼラチン基質群についてはシリンジ、および液体rトロンビン群については噴霧ポンプを用いて、試験物質またはプラセボを投与した。グラフトを直ちにガーゼスポンジで覆い、連続した指圧を60秒間加えた。噴霧適用プラセボで処置したグラフトでは、処置は直接の圧力のみの適用と本質的に同等であった。60秒後、ガーゼスポンジを出血に関して視覚的に検査した。TTHが達成されなかった事象では、ガーゼスポンジを交換し、さらなる試験物質を適用した。TTHが達成されるまで、指圧と視覚的検査を10〜15秒おきに交互に行った。清潔なガーゼスポンジに染み込む、目で確認できる血液が見られなくなった時点で、止血時間を記載した。TTHが5分の研究期間内に達成されない事象においては、研究を終了し、300秒と記録した。研究期間の終了時に、55 mm Hg MAP基準を満たしたという条件で、カテーテルをクランプで締め付け、生理食塩水で洗い流し、新たなPTFE部分を設置した。試験物質は、この研究に関して、24のグラフトの中で4つの異なる動物群にランダムに割り付けた。SAS(バージョン9.1.3)を用いて処置群間のTTH測定値を比較するために、一般化推定方程式モデルを用いた。
ゼラチンマイクロスフェアを篩過し、特定のサイズ範囲の微粒子を得ることができる。CultiSpher(登録商標)-Sマクロ多孔性ゼラチンマイクロキャリアマイクロスフェアの場合、この材料を篩過して、直径約130μm〜380μmのサイズを含めることができる。バッチの作製中に、材料のおよそ半分は、直径約<130μmのマイクロスフェアの画分として失われ得る。直径<380μmのサイズを有する全ゼラチンマイクロスフェア材料を含む流動性トロンビン装置と、直径約130〜380μmのサイズを有するゼラチンマイクロスフェア材料を含む流動性装置の比較を行った。
Claims (106)
- 複数の架橋ゼラチンマイクロスフェアを含む止血組成物。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが包括的に約50μm〜約500μmの直径を有する、請求項1記載の止血組成物。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが包括的に約110μm〜約400μmの直径を有する、請求項3記載の止血組成物。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが孔をさらに含み、該孔が包括的に約15μm〜約25μmの孔径を有する、請求項1記載の止血組成物。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアがそれぞれ約50μm〜約500μmの直径を有し、かつ架橋ゼラチンマイクロスフェアが包括的に約15μm〜約25μmの直径を有する孔をさらに含む、請求項1記載の止血組成物。
- 湿潤剤をさらに含む、請求項1、請求項2、請求項3、請求項4、または請求項5記載の止血組成物。
- 湿潤剤がポロキサマーである、請求項6記載の止血組成物。
- 湿潤剤がポロキサマー188である、請求項7記載の止血組成物。
- 懸濁剤をさらに含む、請求項1、請求項2、請求項3、請求項4、または請求項5記載の止血組成物。
- 懸濁剤がカルボキシメチルセルロースである、請求項9記載の止血組成物。
- 乾燥粉末である、請求項1記載の止血組成物。
- 部分的に水和されたゲルである、請求項1記載の止血組成物。
- 完全に水和されたゲルである、請求項1記載の止血組成物。
- 血漿を含むかまたは血漿からなる希釈液で水和される、請求項12または13記載の止血組成物。
- トロンビンをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の止血組成物。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約1,000 IUの範囲内である、請求項15記載の止血組成物。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約700 IU〜約2,000 IUの範囲内である、請求項15記載の止血組成物。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約1,000 IU〜約5,000 IUの範囲内である、請求項15記載の止血組成物。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約50,000 IUの範囲内である、請求項15記載の止血組成物。
- ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、キトサン、アルギン酸、タンパク質、多糖、およびポリアクリルアミドからなる群より選択される少なくとも1つのポリマーを含む架橋ポリマーマイクロスフェア;
湿潤剤および懸濁剤からなる群より選択される少なくとも1つの添加物;ならびに
トロンビン
を含む、止血組成物。 - 架橋ポリマーがゼラチンである、請求項20記載の止血組成物。
- 架橋ポリマーが化学的に架橋されるか、脱水加熱的(dehydrothermally)に架橋されるか;または照射により架橋される、請求項20記載の止血組成物。
- 架橋ポリマーが架橋ゼラチンマイクロスフェアである、請求項19記載の止血組成物。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが孔をさらに含む、請求項23記載の止血組成物。
- 完全に水和された場合に、架橋ゼラチンマイクロスフェアが包括的に約50μm〜約500μmの直径を有する、請求項23記載の止血組成物。
- 完全に水和された場合に、架橋ゼラチンマイクロスフェアが包括的に約110μm〜約400μmの直径を有する、請求項23記載の止血組成物。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが孔をさらに含み、該孔が包括的に約15μm〜約25μmの孔径を有する、請求項24、請求項25、または請求項26記載の止血組成物。
- 乾燥粉末である、請求項20記載の止血組成物。
- 部分的に水和されたゲルまたは完全に水和されたゲルである、請求項20記載の止血組成物。
- 血漿を含むかまたは血漿からなる希釈液で水和される、請求項29記載の止血組成物。
- 湿潤剤がポロキサマー、ポリエチレングリコール、またはポリソルベートである、請求項20記載の止血組成物。
- 湿潤剤がポロキサマー188である、請求項20記載の止血組成物。
- 懸濁剤がカルボキシメチルセルロースである、請求項20記載の止血組成物。
- シリンジの外筒内に存在する、請求項20記載の止血組成物。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約1,000 IUの範囲内である、請求項20記載の止血組成物。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約700 IU〜約2,000 IUの範囲内である、請求項20記載の止血組成物。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約1,000 IU〜約5,000 IUの範囲内である、請求項20記載の止血組成物。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約50,000 IUの範囲内である、請求項20記載の止血組成物。
- シリンジを含む止血組成物送達装置であって、該シリンジが請求項1〜38のいずれか一項記載の止血組成物を含む、止血組成物送達装置。
- 止血組成物が乾燥粉末である、請求項39記載の止血組成物送達装置。
- 第2シリンジおよび希釈液をさらに含む、請求項39記載の止血組成物送達装置。
- トロンビンが希釈液中に存在する、請求項41記載の止血組成物送達装置。
- 希釈液が血漿であるかまたは血漿を含む、請求項41または42記載の止血組成物送達装置。
- 第2シリンジと、止血組成物を含むシリンジとが相互接続される、請求項41記載の止血組成物送達装置。
- シリンジ同士がオス/メスルアーロックシステムによって相互接続される、請求項44記載の止血組成物送達装置。
- 以下の段階を含む、止血組成物を調製する方法:
(a) ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、キトサン、アルギン酸、タンパク質、多糖、およびポリアクリルアミドからなる群より選択される少なくとも1つのポリマーを含む架橋ポリマーマイクロスフェアを得る段階;
(b) 該架橋ポリマーマイクロスフェアを、湿潤剤および懸濁剤からなる群より選択される少なくとも1つの添加物と混合する段階。 - 以下の段階をさらに含む、請求項46記載の方法:
架橋ポリマーマイクロスフェアを希釈液と混合する段階。 - 架橋ポリマーマイクロスフェアがゼラチンである、請求項46記載の方法。
- 架橋ポリマーが化学的に架橋されるか、脱水加熱的に架橋されるか、または照射により架橋される、請求項46記載の方法。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが孔をさらに含む、請求項48記載の方法。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが、包括的に約50μm〜約500μmの直径を有する、請求項48記載の方法。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが、包括的に約110μm〜約400μmの直径を有する、請求項48記載の方法。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが、包括的に約15μm〜約25μmの孔径を有する孔を有する、請求項48記載の方法。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが孔をさらに含み、該孔が包括的に約15μm〜約25μmの孔径を有する、請求項51記載の方法。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが孔をさらに含み、該孔が包括的に約15μm〜約25μmの孔径を有する、請求項52記載の方法。
- 湿潤剤がポロキサマー、ポリエチレングリコール、またはポリソルベートである、請求項46記載の方法。
- 湿潤剤がポロキサマー188である、請求項56記載の方法。
- 懸濁剤がカルボキシメチルセルロースである、請求項50記載の方法。
- 止血組成物がシリンジの外筒内に存在する、請求項46記載の方法。
- 希釈液がシリンジの外筒内に存在する、請求項47記載の方法。
- 止血組成物がシリンジの第1外筒内に存在し、かつ希釈液がシリンジの第2外筒内に存在し、該止血組成物と該希釈液とが、該外筒同士を相互接続し、該外筒の内容物を行ったり来たりさせることによって混合される、請求項47記載の方法。
- 希釈液が血漿を含むかまたは血漿からなる、請求項47、請求項60、または請求項61記載の方法。
- トロンビンを段階(a)のマイクロスフェアまたは段階(b)の混合物に添加する段階をさらに含む、請求項46〜62のいずれか一項記載の方法。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約1,000 IUの範囲内である、請求項63記載の方法。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約700 IU〜約2,000 IUの範囲内である、請求項63記載の方法。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約1,000 IU〜約5,000 IUの範囲内である、請求項63記載の方法。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約50,000 IUの範囲内である、請求項63記載の方法。
- 以下の段階を含む、止血を必要とする哺乳動物の身体の部位に止血組成物を送達する方法:
ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、キトサン、アルギン酸、タンパク質、多糖、およびポリアクリルアミドからなる群より選択される架橋ポリマーマイクロスフェアを含む止血組成物を提供する段階であって、該組成物が、湿潤剤および懸濁剤からなる群より選択される少なくとも1つの添加物もまた含む、止血組成物を提供する段階;ならびに
止血を必要とする哺乳動物の身体の部位に該止血組成物を適用する段階。 - 架橋ポリマーマイクロスフェアがゼラチンである、請求項68記載の方法。
- 架橋ポリマーマイクロスフェアが化学的に架橋されるか、脱水加熱的に架橋されるか、または照射により架橋される、請求項68記載の方法。
- 架橋ポリマーが架橋ゼラチンマイクロスフェアである、請求項68記載の方法。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが孔をさらに含む、請求項68記載の方法。
- 完全に水和された場合に、架橋ゼラチンマイクロスフェアが直径約50μm〜約500μmを有する、請求項72記載の方法。
- 完全に水和された場合に、架橋ゼラチンマイクロスフェアが直径約110μm〜約400μmを有する、請求項73記載の方法。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアが孔をさらに含み、該孔が包括的に約15μm〜約25μmの孔径を有する、請求項70〜74のいずれか一項記載の方法。
- 前記組成物が乾燥粉末である、請求項68記載の方法。
- 前記組成物が部分的に水和されたペーストである、請求項68記載の方法。
- 前記組成物が完全に水和されたペーストである、請求項68記載の方法。
- 前記組成物が、血漿を含む希釈液で水和される、請求項77または78記載の方法。
- 湿潤剤がポロキサマー、ポリエチレングリコール、またはポリソルベートである、請求項68記載の方法。
- 懸濁剤がカルボキシメチルセルロースである、請求項68記載の方法。
- 止血組成物がシリンジの外筒内に存在する、請求項68記載の方法。
- 投与前または投与時にトロンビンを止血組成物に添加する段階をさらに含む、請求項68〜75のいずれか一項記載の方法。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約1,000 IUの範囲内である、請求項76記載の方法。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約700 IU〜約2,000 IUの範囲内である、請求項76記載の方法。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約1,000 IU〜約5,000 IUの範囲内である、請求項76記載の方法。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約50,000 IUの範囲内である、請求項76記載の方法。
- 以下を含む、止血組成物を含むキット:
ポリマーが、ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、キトサン、アルギン酸、タンパク質、多糖、およびポリアクリルアミドからなる群より選択される、架橋ポリマーマイクロスフェア;
湿潤剤および懸濁剤からなる群より選択される少なくとも1つの添加物。 - 少なくとも1つのシリンジをさらに含む、請求項81記載のキット。
- トロンビンをさらに含む、請求項81記載のキット。
- 希釈液をさらに含む、請求項81記載のキット。
- トロンビンをさらに含む、請求項84記載のキット。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約1,000 IUの範囲内である、請求項83または請求項85記載のキット。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約700 IU〜約2,000 IUの範囲内である、請求項83または請求項85記載のキット。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約1,000 IU〜約5,000 IUの範囲内である、請求項83または請求項85記載のキット。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約50,000 IUの範囲内である、請求項83または請求項85記載のキット。
- 架橋ゼラチンマイクロスフェアを含むキット。
- 湿潤剤および懸濁剤からなる群より選択される少なくとも1つの添加物をさらに含む、請求項90記載のキット。
- トロンビンをさらに含む、請求項90記載のキット。
- 希釈液をさらに含む、請求項90記載のキット。
- トロンビンを含む架橋ゼラチンマイクロスフェアが綿撒糸に圧縮され、かつ乾燥されている、請求項90または92記載のキット。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約1,000 IUの範囲内である、請求項92または請求項94記載のキット。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約700 IU〜約2,000 IUの範囲内である、請求項92または請求項94記載のキット。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約1,000 IU〜約5,000 IUの範囲内である、請求項92または請求項94記載のキット。
- トロンビン濃度が、再水和マイクロスフェアゲル1ml当たり包括的に約125 IU〜約50,000 IUの範囲内である、請求項92または請求項94記載のキット。
- 請求項1〜45のいずれか一項記載の止血組成物のいずれかを含むキット。
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