JP2011515074A - インフルエンザ・ウイルスpaの発現精製及びpaのn末端及びpaのc末端とpb1のn末端ポリペプチド複合体の結晶構造 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図5
Description
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を設計することと;
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合可能なポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を捜すことと;
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或は捜したポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を上記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質に結合させ、更に結合状況を分析することと;及び
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或は捜したポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を上記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質に結合させ結晶し、タンパク質X線結晶構造解析方法にてポリペプチド及び化合物分子のタンパク質との結合状況を分析することと;
を含み、
上記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%の同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質と結合する上記ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子が候補化合物である応用を提供する。
(a)標識タンパク質遺伝子コードを融合した又は融合しないインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC第約201〜約301位アミノ酸から約650〜末端位アミノ酸をコードする遺伝子配列のベクターを構築し、このベクターを使い原核又は真核細胞を形質転換し、よって標識タンパク質が付いているPACを発現することと;
(b)PACの発現と似た方法で標識が付く又は付かない上記PB1Nを発現することと;
(c)(a)で取得されたインフルエンザ・ウイルスPACの発現細胞と(b)で取得されたインフルエンザ・ウイルスPB1のN末端48個のアミノ酸以内のアミノ酸PB1Nの発現細胞を一定比率で混合し、特異的に特異標識を識別する方法でこの混合タンパク質を分離し、酵素性分解で標識がつくポリペプチド中の標識タンパク質を取り去り、PACとPB1Nとの複合体を分離し、タンパク質の濃度を確定することと;
を含み、
その中で上記ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶三次元構造中の原子は表1の中で挙げた少なくとも40%の原子座標を持ち、又はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶三次元構造中の少なくとも40%のアミノ酸の主鎖炭素骨格の原子構造座標は表1中の座標との平均二乗偏差が1.7Å以下である、方法が提供される。
上記精製したPACとPB1N複合体のタンパク質濃度を5〜30mg/mlまで濃縮することと;
hanging−drop蒸気拡散法またはsitting−drop蒸気拡散法で結晶成長条件をスクリーニングすることと;
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶を得ることと、
を含む方法を提供する。
(a)PACを固定ベクターの表面に結合させることと;
(b)過剰量の標識付きPB1Nを上記の固定されたPACに接触させることと;
(c)溶出液で充分に溶出して、未結合の遊離PB1Nを取り除くことと;
(d)テスト化合物の溶液を(b)の項で記述した操作でPB1Nと結合したPACに接触させることと;
(e)記述した溶出液で充分に溶出して、テスト溶液を得ることと;
(f)上記テスト溶液中の標識つき遊離PB1Nの濃度を測定することと;
(g)テスト溶液中の標識つき遊離PB1Nの濃度を基に、候補化合物のPACとの結合能力を求めることと、
を含む方法を提供する。
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を設計することと;
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合可能なポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子をスクリーニングすることと;
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或はスクリーニングしたポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を上記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質に結合させ、更に結合状況を分析することと;
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或はスクリーニングしたポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を上記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質に結合させ結晶にし、よってタンパク質X線結晶構造解析方法にてポリペプチド及び化合物分子のタンパク質との結合状況を分析することと、
を含み、
その中、上記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%の同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質と結合する上記ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子が即ち候補化合物である。
鳥インフルエンザ由来ウイルス遺伝子A/goose/Guangdong/1/96、そのコードタンパク質配列はそれぞれ:
(1)PAタンパク質配列:
上記方法で発現精製したPAC及びPB1Nポリペプチドの複合物を約5−30mg/ml濃度まで濃縮し、hanging−drop蒸気拡散法にて、結晶化試薬(Hampton Research)を使用して結晶成長条件をスクリーニングし、多種結晶化試薬の使用条件下でイニシャル結晶を得た。
FR−E X線回折機(Rigakuより)を使用し、1.5418Åの波長下でまずPA−PB1のN端25ペプチド複合体結晶の分解能2.9Åの母体データを一セット収集した。そして、アメリカ、シカゴのAPS(Advanced Photon Source)シンクロトロン放射光施設(synchrotron radiation facility)(ビームライン番号:SBC 19ID;ビームモニター:ADSC Q315)を利用して、波長0.9783Åと0.9785Åの下で、このタンパク質結晶の分解能が約3.3Åに到るpeakとedgeとした2セットのセレン化物結晶データを収集した。HKL2000(Otwinowski 1997)を利用して、得られた3セットのデータを処理し、それらの空間群が全てP4(1)2(1)2であることを発見した。多波長異常分散法(Hendrickson 1991)で位相を計算し、処理しで得たscaファイルよりSHELXD(Sheldrick 1998)でセレン原子を探した。タンパク質自身14個のメチオニンを含むが、本発明者らは合わせて14個のセレン原子を見つけ出し、セレン原子座標及び処理して得たPeakとEdge二セットのデータをautoSHARPプログラム(Vonrhein、Blancら、2007)にインプットして、位相計算と電子密度図の修飾を行なった。計算して得られた電子密度図より、幾つかの二次構造(一部のαへリックスとβシートを含む)がはっきりと見出せる。そして、プログラムCADを利用して位相拡張を行い、受け取った母体データを利用して位相を2.9Åまでを広げて構造モデルの構築を行なった。モデル構築に使ったプログラムはARP/wARP(Perrakis、Morrisら、1999)とPhenix(Adams、Grosse−Kunstleveら、2002)である。この二種のプログラムの自動モデル構築で全体構造の約60%が完成でき、残りの部分はプログラムCOOT(Emsley and Cowtan 2004)を利用して手動で構築した。
インフルエンザ・ウイルスPAとPB1ポリペプチドの発現方法:
本発明の一種の実施態様はPAを二段に分けて発現し、よってPAのN末端前256アミノ酸残基セグメント及び257−716個アミノ酸残基セグメントを別々に発現し、この二つのタンパク質ポリペプチドをコードする二つの遺伝子セグメントを別々に大腸菌発現ベクター上へクローン化し、細菌中でタンパク質の発現を行う。単独にPAのN末端(1−256アミノ酸)を発現する細菌中からPAのN端ポリペプチドを精製し、PAのN端ペプチドをタンパク質結晶に使用する。PAのN末端発現菌を遠心収集後、PB1のN端ポリペプチドとの共同精製に備える。
分子クローン技術を使用し、インフルエンザ・ウイルスPAのN末端(第1から256位アミノ酸)をpGEX−6pベクター(Amersham Pharmacia Inc.より)へクローン化し、そのクローン・サイトはBamHI及びXhoIであり得る。クローン化で得たPAのN末端遺伝子を含む発現プラスミドで大腸菌BL21を形質転換してタンパク質を発現し、よって細菌にPAタンパク質N端(N末端)にGST融合タンパク質が接続され発現すると同時にProScissionプロティナーゼ (Amersham Biosciences)によって切断可能な酵素切断サイトを含むためGSTタンパク質標識と標的タンパク質PAポリペプチドが分離できる。培養した大腸菌BL21細胞中で最終濃度が0.1−1mMあたりのIPTGを使用して大腸菌を触発し、当該タンパク質の発現菌を獲得する。使用されたベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含む。クローン化で構築した融合タンパク質発現プラスミドにて大腸菌、例えばBL21(Novagen)を形質転換した後、37度でLB等細菌培養器を使用し一晩細菌培養し、約12時間後1:100あたりで大量の培養器へ移し、37度温度下でODが1.0あたりまで培養し、そして0.1〜1mMのIPTGを加え発現誘導を行い、およそ3−6時間後遠心して細菌を収集し、収集した沈澱細菌は−20度から−80度の冷蔵庫で保存し、PAのN末端タンパク質の精製に備える。
分子クローン技術を通して、インフルエンザ・ウイルスPAのC末端(第257から第716アミノ酸)をpGEX−6pベクター(Amersham Pharmacia Inc.より)上へクローン化し、そのクローン遺伝子座はBamHI及びNotIである。クローン化したPAのC末端遺伝子を含む発現プラスミドを大腸菌BL21中で形質転換しタンパク質の発現を行い、よって細菌にタンパク質N端(N末端)にGST融合タンパク質が繋ぐのを発現させ、同時にProScissionプロティナーゼ(Amersham Biosciences)によって切断可能な酵素切断遺伝子座が含まれることによって、GSTタンパク質標識と標的タンパク質PAポリペプチドを分離する。培養した大腸菌BL21細胞に最終濃度が0.1−1mMあたりのIPTGを使用してタンパク質発現を誘導し、当該タンパク質の発現菌を獲得する。使用されたベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含む。クローン化で構築した融合タンパク質発現プラスミドにて大腸菌例えばBL21(Novagen)を形質転換した後、37度でLB等細菌培養器を使用し一晩細菌培養し、約12時間後1:100あたりで大量の培養器へ移し、37度温度下でODが1.0あたりまで培養し、それから培養温度を16度まで下げ、そして0.1−1mMのIPTGを加え触発発現を行い、およそ12−24時間後遠心して細菌を収集し、収集した沈澱細菌は−20度から−80度の冷蔵庫で保存するか、直接精製に使う。
PAC/PB1Nオリゴペプチド複合体の結晶
上記方法で発現精製したPAのN末端ポリペプチドの複合物を濃度約5−30mg/mLまで濃縮し、hanging−drop蒸気拡散法で結晶化試薬(Hampton Research社等よりのScreen Kit I/II、Index等の試薬キット)を使用して結晶成長条件をスクリーニングする。プライマリスクリーニングで、本発明者らは各種異なる結晶化試薬の使用条件下でイニシャル結晶を獲得する。
PAC/PB1Nオリゴペプチド複合体の結晶構造
FR−E X線回折機(Rigakuより)を使用し、1.5418Åの波長下でまずPA−PB1のN端25ペプチド複合体結晶の分解能2.9Åの母体データを一セット収集した。そして、アメリカ、シカゴのAPS(Advanced Photon Source)シンクロトロン放射光施設(synchrotron radiation facility)(ビームライン番号:SBC 19ID;ビーム・モニター:ADSC Q315)を利用して、波長0.9783Åと0.9785Åの下で、このタンパク質結晶の分解能が約3.3Åに到るpeakとedgeとした2セットのセレン化物結晶データを収集した。HKL2000(Otwinowski 1997)を利用して、得られた3セットのデータを処理し、これらの空間群が全てP4(1)2(1)2であることを発見した。多波長異常分散法(Hendrickson 1991)で位相を計算し、処理しで得たscaファイルよりSHELXD(Sheldrick 1998)でセレン原子を探した。タンパク質自身14個のメチオニンを含むが、本発明者らは合わせて14個のセレン原子を見つけ出し、セレン原子座標及び処理して得たPeakとEdge二セットのデータをautoSHARPプログラム(Vonrhein、Blancら、2007)にインプットして、位相計算と電子密度図の修飾を行なった。計算して得られた電子密度図より、幾つかの二次構造(一部のαへリックスとβシートを含む)がはっきりと見出せる。そして、プログラムCADを利用して位相拡張を行い、受け取った母体データを利用して位相を2.9Åまでを広げて構造モデルの構築を行なった。モデル構築に使ったプログラムはARP/wARP(Perrakis、Morrisら、1999)とPhenix(Adams、Grosse−Kunstleveら、2002)である。この二種のプログラムの自動モデル構築で全体構造の約60%が完成でき、残りの部分はプログラムCOOT(Emsley及びCowtan 2004)を利用して手動で構築した。
PAのN末端タンパク質結晶
上記方法で発現精製したPAのN末端ポリペプチドの複合物を濃度約5−30mg/mLまで濃縮し、hanging−drop蒸気拡散法で結晶化試薬(Hampton Research社等よりのScreen Kit I/II、Index等の試薬キット)使用して結晶成長条件をスクリーニングする。プライマリ・スクリーニングで、本発明者らは各種異なる結晶化試薬の使用条件下でイニシャル結晶を獲得する。
PB1Nと競合的にPACと結合する小分子のスクリーニング方法
PAC/PB1Nオリゴペプチド複合体を脱重合させる一種の小分子薬物のスクリーニング過程において、その中でPB1Nオリゴペプチドの遺伝子とGFP(緑色蛍光タンパク質)を発現する遺伝子を融合させ、GFP融合のPB1Nオリゴペプチド・タンパク質を発現し、小分子化合物脱重合タンパク質複合体の指示分子とする。分子クローン化方法でPB1オリゴペプチド遺伝子セグメントをGFP遺伝子断片上に繋ぎ、一つのN末端又はC末端に繋ぐGFPのPB1ペプチド融合タンパク質を発現する。
PAC/PB1Nの複合体の結晶三次元構造を利用した、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いる各種ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物の設計とスクリーニング方法
インフルエンザ・ウイルスポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶三次元構造を利用した、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いる各種ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物の設計とスクリーニングの具体的ステップは下記通りである:タンパク質三次元構造の座標に基づき、コンピューター・シミュレーションを通して特定位置に結合するポリペプチド及び化合物分子を設計し;タンパク質三次元構造の座標に基づき、コンピューター・シミュレーションを通して特定位置に結合する可能性のあるポリペプチド及び化合物分子を探索し;タンパク質三次元構造の座標に基づき、設計又は探索し出したポリペプチド及び化合物分子を、上記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%同じ配列を持つ任意亜型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質の中へ結合させ、更に結合状況の方法を分析し;タンパク質三次元構造の座標に基づき、設計又は探索し出したポリペプチド及び化合物分子を、上記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%同じ配列を持つ任意亜型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質の中へ結合させ、並びに結晶させ、よって結晶回折三次元構造分析方法でポリペプチド及び化合物分子とタンパク質の結合状況を分析する。
PAC/PB1Nの複合体の結晶三次元構造を利用した、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いるペプチドの設計とスクリーニング
実験による実証では、一種のM1、D2、V3、N4、P5、T6、L7、L8、F9、L10及びK11を含むオリゴペプチドはPAのC末端と結合する。発明者らはPB1Nから、第一座M1から第11座K11までを含むポリペプチド遺伝子をpFEX−6pベクター上へクローン化し、このGST−PB1N融合タンパク質を精製し、体外結合実験を通して、アフィニティ・ゲル・カラムに固定されたこの融合タンパク質で溶液中のPA−Cと結合させ、発明者らはこの融合タンパク質がPB1Nが持つPA−Cと結合する能力を所有していることを発見した。
PAC及びPB1Nタンパク質三次元構造に基づいた、タンパク質結合の化合物又はポリペプチドのスクリーニング方法は下記を含む:タンパク質結晶方法でPAC及びPB1Nタンパク質複合体結晶を取得し、当該タンパク質複合体結晶はP4(1)2(1)2の空間群を持ち、単位胞は約α=b=122Å、c=133Å、α=β=γ=90°である;X線回折結晶学技術で、PAC及びPB1Nタンパク質複合体の三次元構造座標を取得し;該三次元構造は、当該座標中の少なくとも40%アミノ酸残基の主鎖炭素骨格三次元座標と平均二乗偏差が1.7Å以下である構造を全て含む。
PAC及びPB1N複合体構造の原子座標は表1の通りである。
MAD方法を使用し、PAのC末端460アミノ酸及びPB1N末端25ペプチドの複合体結晶体構造を解析し、解析度は2.9Å、最終修正したR因子は23%,自由R因子は26%である。全体的に、構造を線状で表した場合、側面から見ると、PA部分はまるで狼の頭に喩えられ、伸び出す口先、その後ろの頭部と環状の首を有する(図4B)。PB1はまるでPAの口の中に骨を一本くわえているかのようである。PA部分は主に13個のαへリックス、一切れの小さい310へリックス、7つのβシート及びこれらを繋ぐ環(loop)より形成されている(図1、図4B及び図5)。構造から見ると、PAタンパク質部分は二つの構造領域と見なせ、一つはPB1ポリペプチドと結合する領域(構造域I、即ちPAのC末端構造の第一部分)、全部へリックス及び環で形成されており、へリックスは4、5、8、9、10、11、12及び13で狼の口と頬の部分を構成している。この構造域は狼頭部の天辺から見るとやや細く;もう一つの構造域(構造域II即ちPAのC末端構造の第二部分)は残りのへリックス及びβシートからなる狼頭部の後半部分で、天辺から見るとやや太く、下に大きい環が繋がっており、狼の頭部の首の部分に見える。PB1ポリペプチドのN端は狼の頭部の片面に位置しており、C末端はもう片方に位置し、狼の頭部の両方の頬の部分に位置することに値する。本発明者らの結晶体中のPAはPAのN端256残基を取り除いたポリペプチドで、ある報告ではN端はPAプロティナーゼの主な活性領域であり、もう一つの離れている活性遺伝子座Ser624は他の片方の頬に位置し、それによるとSer624はPAプロティナーゼ活性中心アミノ酸で、それはPAの取り除いた部分と共にプロティナーゼ活性領域を構成し、従ってPAのN端の取り除いた部分はもう片方の頬に位置する。狼の頭部の後半部分第二構造域は残りの多数のへリックス及びβシートによって形成されている。長さ、方向が異なる7つのβシートが波のある平面を構成し、構造域の中心部に位置しており、αへリックスはへリックス周辺に分布しており、共にRossmannフォールド構造を構成している。二つの構造域の交差する部分には大きな溝があり、下部の首環と直径約25Åの大きい環を形成する(図5)。
構造域IのPB1ポリペプチドに結合するへリックスはそれぞれへリックス4(406−415)、8(582−604aa)、10(633−650aa)、11(653−674aa)と13(698−714aa)であり、その中の三つのへリックス(8、11、13)は互いにほぼ平行に伸びだし、へリックス軸の方向から見るとほぼ三角形の形状になっており、四つ目のへリックス(10)は斜めに伸び出し、これらはPB1ポリペプチドを真ん中に挟む(図5及び図6)、へリックス4は側面でPB1N端ペプチド残基と相互に作用をする。四つのへリックスはPB1ポリペプチドと結合する領域で疎水性コアを形成し、これらの側鎖とPB1上の疎水アミノ酸残基は疎水相互作用及び水素相互作用で結合されている。電子雲密度上ではPB1ポリペプチドの第二位アスパラギン酸から15位グルタミンまでが見られ、この結果とは、Perez等の報告によるPB1N末端前12位アミノ酸はPB1とPA結合のキーアミノ酸であるという結果とほぼ一致している(Perez及びDonis 2001)。更に本発明者らはこれらアミノ酸残基とPA間の相互作用を分析した。Perez等(Perez及びDonis 2001)の文献での報告のPB1保存的LLFLペプチド断片は一つの短いへリックス上に存在し、PAが形成する疎水内核中間に浮いている。疎水性コアの形成に関与するPAアミノ酸残基はへリックス11上のLeu666、へリックス13のPhe710及びへリックス10上のIle633、Val636とLeu640等がある。PB1ポリペプチドとの結合に関与するPA中アミノ酸はへリックス13のTrp706、へリックス11のGln670等があり、その中でTrp706とPB1オリゴペプチド上のVal3、N4等アミノ酸は疎水又はファンデルワールス力等を通して相互に作用し、Gln670はPB1のF9、V12、P13及びA14とそれぞれ水素、疎水及びファンデルワールス力等を通して相互に作用する。へリックス10のT639はVal3との作用(ファンデルワールス力)に関与する。へリックス4上のQ408及びN412はPB1のVal3、D2との相互作用に関与する。それらとは別に、9と10の間に挟まれている緩い環もPB1との相互作用に関与し、その中でI621、G622とE623はD2、N5とそれぞれ相互に作用し、T618及びP620はそれぞれL8及びK11と相互に作用する。へリックス8とPB1ポリペプチドの距離が離れているため、主にファンデルワールス力が作用している。この結果は、文献報告でのPB1ポリペプチド上の残基結合に関与する作用とほぼ一致している。これらPAとの結合に関与するアミノ酸はA、B及びC型インフルエンザウイルスの中では全て保存的で;同様に、PB1ポリペプチドとの結合に関与するPA残基も大半は保存的である(図1)。PAとPB1結合方式の精細な三次元構造解析は、薬物設計でインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼの機能を阻害する為の有力な三次元構造情報のプラットフォームを提供した。
R2=−CH3,−CH2NH2,−CH(OH)CH3,−CH(CH3)2
予測Kd:8.64〜9.60。
R2=−COCH3,−CH2COCH3,−CO,−OCH2CH3
R3=−CH2NH2,−CH2(NH2)CH2CH3,−CH2(NH2)CH2CH2CH3
予測Kd:8.51〜9.65。
R2=−OH,−CO,−CONH2,−CONHCH3,COOH
R3=−COOH,−NH2,−C(NH2)2+
R4=−CH(OH)CH3,CONH2,CH(NH2)CH2OH
予測Kd:8.52〜8.96。
R2=−CH2(OH)CH3,−NHCH3,−CH2OH,−CH2NH2,−NH2,−C(NH2)2+
R3=−NH2,−C(NH2)2+,−CH2OH,−CO,−CH2CO,−NHCO
R4=−OH,−OCH3。
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Claims (43)
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造であって、前記インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACは前記インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAの約201〜約301位アミノ酸から約650〜末端のアミノ酸までであり、前記PB1のN末端PB1Nは前記インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPB1のN末端PB1Nの48個以内のアミノ酸のオリゴペプチドであり、前記結晶体三次元構造中の原子は表1中で挙げた少なくとも40%の原子座標を持ち、又はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造中少なくとも40%のアミノ酸の主鎖炭素骨格の原子構造座標と表1中の座標の平均二乗偏差が1.7Å以下である、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- 前記インフルエンザ・ウイルスはA、B、C型インフルエンザ・ウイルスより選択され、好ましくは、前記インフルエンザ・ウイルスはA型インフルエンザ・ウイルス株:A/goose/Guangdong/1/96、A/Brevig Mission/1/1918;B型インフルエンザ・ウイルス株:B/Ann Arbor/1/1966又はC型インフルエンザ・ウイルス株:C/JJ/1950より選択される、請求項1に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- 前記複合体の結晶体はP4(1)2(1)2の空間群を持ち、格子定数は約α=b=122Å、c=133Å、α=β=γ=90°である、請求項1又は2に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- 前記A型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACはインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼPAのC末端PAC中のαへリックス4、即ち406−414位を含むアミノ酸領域、αへリックス5、即ち440−450位を含むアミノ酸領域、αへリックス8、即ち583−603位を含むアミノ酸領域、αへリックス9、即ち608−613位を含むアミノ酸領域、αへリックス10、即ち633−649位を含むアミノ酸領域、αへリックス11、即ち653−673位を含むアミノ酸領域、αへリックス12、即ち683−691位を含むアミノ酸領域、とαへリックス13、即ち698−714位を含むアミノ酸領域、及び二つのβシート:βシート8とβシート9、それぞれ619−623位を含むアミノ酸領域と628−631位を含むアミノ酸領域、がPAのC末端PACの第一部分を構成し、A型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACは主要なβシート折り畳み断片より成り、これらのβシートにはβシート1、即ち290−292位を含むアミノ酸領域、βシート2、即ち317−324位を含むアミノ酸領域、βシート3、即ち480−491位を含むアミノ酸領域、βシート4、即ち496−506位を含むアミノ酸領域、βシート5、即ち517−526位を含むアミノ酸領域、βシート6、即ち541−550位を含むアミノ酸領域、βシート7、即ち557−571位を含むアミノ酸領域などが含まれ、これらのβシートが共同でPAのC末端PAC第二部分の折り畳みシート層の主な部分を構成し、前記A型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACはαへリックス1、即ち303−311位を含むアミノ酸領域、αへリックス2、即ち331−349位を含むアミノ酸領域、αへリックス3、即ち364−369位を含むアミノ酸領域、αへリックス6、即ち454−475位を含むアミノ酸領域及びαへリックス7、即ち572−578位を含むアミノ酸領域、がPAのC末端PAC第二部分の前記折り畳みβシート層の周囲を囲い、その中、B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、請求項2に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- A型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACは主にαへリックス8、αへリックス10、αへリックス11とαへリックス13を通してPB1のN末端PB1N相互作用に関与し、好ましくは、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACのαへリックス11のLeu666、αへリックス13のPhe710、αへリックス10のVal636、Leu640、αへリックス13のTrp706、αへリックス11のGln670から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸をインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPB1との相互作用に関与させ、B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、請求項2に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- 前記A型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC中のαへリックス9とαへリックス10の間の環状ペプチド・セグメントのIle621、Gly622、Glu623、Thr618とPro620から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPB1との相互作用に関与させ、B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、請求項2に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC中のAsn647、Gln408、Cys584、Gln587、Gln591、Lys643、Asn647、Ser659、Lys663、Trp699、Asn703から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACのインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPB1Nと結合する「袋状」のアミノ・サイトを構成し、前記B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、請求項2に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC中のTrp406、Glu410、Lys461、Glu524、Phe525、Ser526、Lys536、Lys539、Tyr540、Leu563、Tyr564、Arg566及びLys574から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸はヌクレオチド、RNA若しくはその他小分子又はタンパク質と結合するPAC中の主溝及びチャンネルの形成に関与し、前記B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、請求項2に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- 前記A型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACの370から405位アミノ酸残基が一つの大環状を構成し、前記B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、請求項2に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- 前記A型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACのαへリックス12、αへリックス13をその他タンパク質の相互作用に関与させ、好ましくは、αへリックス12及αへリックス13中のIle690、Glu691、Glu692、Cys693、Asn696から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、その他タンパク質との相互作用に関与させ、前記B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、請求項4に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- 前記A型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACのLys506、Gly507、Arg508、Ser509、His510、Leu511、Arg512、Asn513及びAsp514から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、その他タンパク質との相互作用に関与させ、His510はポリメラーゼ複合体RNaseの一部分を構成し、前記B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、請求項4に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC中のαへリックス8、αへリックス10、αへリックス11とαへリックス13から構成される群より選択される少なくとも一つのメンバーと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物であって、前記インフルエンザ・ウイルスはA、B、C型インフルエンザ・ウイルスより選択され、好ましくは、前記インフルエンザ・ウイルスはA型インフルエンザ・ウイルス株:A/goose/Guangdong/1/96、A/Brevig Mission/1/1918;B型インフルエンザ・ウイルス株:B/Ann Arbor/1/1966又はC型インフルエンザ・ウイルス株:C/JJ/1950より選択され、好ましくは、前記ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物は前記A型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACのαへリックス11のLeu666、αへリックス13のPhe710、αへリックス10のVal636、Leu640、αへリックス13のTrp706、αへリックス11のGln670から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物であり、前記B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC中のαへリックス9とαへリックス10との間の環状ペプチド・セグメントのA型インフルエンザ・ウイルスIle621、Gly622、Glu623、Thr618とPro620から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACでA型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC中のAsn647、Gln408、Cys584、Gln587、Gln591、Lys643、Asn647、Ser659、Lys663、Trp699、Asn703から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACでA型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC中のTrp406、Glu410、Lys461、Glu524、Phe525、Ser526、Lys536、Lys539、Tyr540、Leu563、Tyr564、Arg566及びLys574から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACでA型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACの370から405位より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC中αへリックス12、αへリックス13と結合し、好ましくはA型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACのαへリックス12及αへリックス13中Ile690、Glu691、Glu692、Cys693、Asn696から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC中シートβ4とシートβ5との間の環状領域内でA型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACのLys506、Gly507、Arg508、Ser509、His510、Leu511、Arg512、Asn513及びAsp514から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼPB1と競合的にPACと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
- 主にPAC中αへリックス8、αへリックス11、αへリックス13、αへリックス10が形成する疎水性コアと相互に作用し、好ましくはA型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC中αへリックス8中のMet595、αへリックス11中のLeu666、αへリックス13中のTrp706とPhe710、及びαへリックス10中のVal636とVal640と相互に作用し、B型又はC型インフルエンザ・ウイルスにおけるA型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図1Aと図1B及び図1C及び図10Aと図10Bに示すとおりである、請求項19に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼPB1と競合的にPACと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
- 前記ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列における、野生型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼPB1のN末端PB1N残基5から10位Pro5、Thr6、Leu7、Leu8、Phe9とLeu10が形成する短へリックス領域を含む短PTLLFLモチーフの中の少なくとも三つは、該モチーフとのポリペプチド配列対比において対応する位置のアミノ酸が同じである、請求項19に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼPB1と競合的にPACと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
- 請求項12〜21のいずれか一項に記載のポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を含む組成物であって、キャリア又は賦形剤を選択的に含む、組成物。
- インフルエンザ・ウイルスによる病気の治療薬物の製薬における、請求項22に記載の組成物の応用。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の発現と精製方法であって、
(a)標識タンパク質遺伝子を融合した又は融合していないインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PAC約201〜約301位アミノ酸から約650〜末端位アミノ酸をコードする遺伝子配列のベクターを構築し、該ベクターを使って原核又は真核細胞を形質転換し、よって標識タンパク質がついているPACを発現することと;
(b)PACの発現と似た方法で標識が付く又は付かないPB1Nを発現することと;
(c)(a)で取得されるインフルエンザ・ウイルスPACを発現する細胞と(b)で取得されるインフルエンザ・ウイルスPB1のN末端48個のアミノ酸以内のアミノ酸PB1Nを発現する細胞を一定比率で混合し、特異標識を特異的に識別する方法でこの混合タンパク質を分離し、酵素性分解で標識がつくポリペプチド中の標識タンパク質を取り去り、PACとPB1Nとの複合体を分離し、タンパク質の濃度を確定することと、
を含み、
前記ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造中の原子は表1中で挙げた少なくとも40%の原子座標を持ち、又はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造中の少なくとも40%のアミノ酸の主鎖炭素骨格の原子構造座標は表1中の座標と平均二乗偏差が1.7Å以下である、方法。 - 前記標識タンパク質はGST、Flag−tag、Myc−tag、MBP−tag、特異性抗体より選ばれ;前記ベクターは選択性標識遺伝子を含み、ステップ(c)中での一定比率とは標識タンパク質−PACと標識タンパク質−PB1Nのタンパク質総量のモル比が0.1:1〜1:0.1となるものであり、好ましくは標識タンパク質−PACと標識タンパク質−PB1Nのタンパク質総量のモル比を0.5:1〜1:0.5にさせ、更に好ましくは標識タンパク質−PACと標識タンパク質−PB1のタンパク質総量のモル比を1:1に近づかせ、更に好ましくは標識タンパク質はGSTであり、特異標識を識別する前記方法はアフィニティ・カラムを使用し、標識を取り除く前記方法はプロティナーゼ酵素性分解を使用し、前記PACとPB1Nとの複合体の分離方法はゲル濾過法又はイオン交換クロマトグラフィーで行い、前記タンパク質の濃度確定はゲル電気泳動法で行う、請求項24に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の発現と精製方法。
- 前記原核細胞は大腸菌である、請求項25に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の発現と精製方法。
- インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の共結晶方法であって、
精製したPACとPB1N複合体のタンパク質濃度を5〜30mg/mlまで濃縮することと;
hanging−drop蒸気拡散法またはsitting−drop蒸気拡散法で結晶体成長条件を選別することと;
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体を得ることと
を含む、方法。 - PAのN末端1〜約50位アミノ酸から約200〜約300位アミノ酸までであるPANの野生型又は変異型タンパク質の発現方法であって、標識タンパク質遺伝子を融合した又は融合していないインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのN末端PANの1〜約50位アミノ酸から約200〜約300位アミノ酸までをコードする遺伝子配列の発現ベクターを構築し、該ベクターで真核又は原核細胞を形質転換し、よって標識タンパク質を持つ又は持たないPANを発現し、前記PAのN末端PAN中のアミノ酸配列は図1C中の少なくとも40%のアミノ酸と同じである、方法。
- 前記原核細胞は大腸菌である、請求項28に記載のPAのN末端PANの野生型又は変異型タンパク質の発現方法。
- PB1Nと競合的にPACと結合する候補化合物の選別方法であって、
(a)PACを固定ベクターの表面に結合させることと;
(b)過剰量の標識付きPB1Nを前記固定したPACに接触させることと;
(c)溶出液で充分に溶出して、未結合のPB1Nを取り除くことと;
(d)テスト化合物の溶液を(b)の項で記述した固定され且つPB1Nと結合したPACに接触させることと;
(e)前記溶出液で充分に溶出して、テスト溶液を取得することと;
(f)前記テスト溶液中の標識つき遊離PB1Nの濃度を測定することと;
(g)テスト溶液中の標識つき遊離PB1Nの濃度を基に、候補化合物のPACとの結合能力を求めることと
を含む、方法。 - 前記ステップ(a)のPACを固定表面上に結合させることは、共有結合性架橋又はPACをアフィニティ・マトリックスと結合させることにより実現され、前記アフィニティ・マトリックスは、固定表面上にそのアフィニティ・マトリックスが結合できる結合基を有する、請求項30に記載の方法。
- 前記アフィニティ・マトリックスはGST、Flag−tag、Myc−tag、MBP−tag、特異性抗体から選択され、固定表面上は対応アフィニティ・マトリックスの結合基を有する、請求項31に記載の方法。
- 前記標識付きPB1Nポリペプチドは同位体又はその他の化学分子で標識したタンパク質より選択され、好ましくは、その他の化学分子での標識は緑色蛍光タンパク質、各種融合ポリペプチドより選び使用される、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固定表面はアフィニティ・クロマトカラムである、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体の結晶体三次元構造の、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いる各種ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物の設計と選別における応用であって、
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を設計することと;
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合可能なポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子をスクリーニングすることと;
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或はスクリーニングしたポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を前記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼタンパク質に結合させ、更に結合状況を分析することと;
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或はスクリーニングしたポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を前記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%同じ配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質に結合させ結晶にし、よってタンパク質X線結晶構造解析方法にてポリペプチド及び化合物分子のタンパク質との結合状況を分析することと
を含み、
前記PAC及びPB1N配列と少なくとも50%の同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質と結合する前記ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子が即ち候補化合物である、応用。 - 任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼの三つのサブユニットPA、PB1、PB2又はPA、PB1とPB2複合体の構造であって、その中に含まれる一つのタンパク質又はそのある一領域は、前記PACタンパク質と少なくとも40%同配列を持つ、任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼの三つのサブユニットPA、PB1、PB2又はPA、PB1とPB2複合体の構造。
- 任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPA、PB1、PB2又はPA、PB1とPB2複合体の三次元構造であって、含まれる一つのタンパク質又はそのある一領域の主鎖三次元構造座標は、前記PACタンパク質と、前記PACタンパク質配列の少なくとも40%の主鎖炭素骨格の原子と三次元座標の平均二乗偏差が1.7Å以下である、任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPA、PB1、PB2又はPA、PB1とPB2複合体の三次元構造。
- 任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPA、PB1、PB2又はPA、PB1とPB2複合体の構造であって、含まれる一箇所のタンパク質領域は前記PB1Nポリペプチドのアミノ酸1−11領域と20%の配列の相同性を持ち、好ましくは40%の配列の相同性を有する、任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPA、PB1、PB2又はPA、PB1とPB2複合体の構造。
- 前記インフルエンザ・ウイルスPAサブユニット上の任意アミノ酸と相互作用を持つことを特徴とするポリペプチド又は小分子。
- 請求項36〜38のいずれか一項に記載の構造の、薬物選別及び薬物設計方面における応用。
- PAC及びPB1Nタンパク質三次元構造に基づくタンパク質と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物の選別方法であって、タンパク質結晶方法でPACを含む結晶体を取得し、又はPAC及びPB1Nタンパク質複合体結晶体の三次元構造座標を取得することを含み;前記三次元構造は、この座標における少なくとも40%のアミノ酸残基を含有する主鎖炭素骨格原子の三次元座標との平均二乗偏差が1.7Å以下である構造を全て含む、方法。
- インフルエンザ・ウイルス亜型PAサブユニット・タンパク質の発現精製方法であって、PAを分けて細菌又は真核発現システムで発現し、該方法で、含有するあらゆるタンパク質からある一箇所の断片が前記配列相応領域と同じアミノ酸配列を40%持つタンパク質を発現し精製する、方法。
- 請求項5に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットPAのC末端PACとPB1のN末端PB1Nとの複合体構造中のαへリックス8、10、11、13中任意領域と少なくとも40%同じアミノ酸を有するタンパク質のアミノ酸残基と相互に作用するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
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