JP2011506354A - 膜タンパク質の抽出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
特に好ましい態様において、生体サンプルの溶解を、界面活性剤、界面活性物質および/またはポア形成剤の添加により行う。
さらに好ましい態様において、線状両親媒性炭水化物ポリマーは非荷電である。
さらに好ましい態様において、線状両親媒性炭水化物ポリマーは線状ポリフルクトース骨格を有する。
さらに好ましい態様において、抽出溶液における線状両親媒性炭水化物ポリマーの濃度は、0.5〜10重量%である。
本発明はまた、生体サンプルから膜タンパク質を抽出するための、本発明のキットの使用に関する。
これらは好ましくはフルクタンまたはフルクタン誘導体である。
フルクタンは、1個または2個以上のフルクトース分子がスクロース分子に結合している事実により区別される。
1−ケストース: イヌリンにおいて、フルクトシル基は、β−2,1−結合によりスクロースのフルクトシル基に結合している。最も単純なイヌリンは、1−ケストトリオースまたはイソケトースである。
6−ケストース: フルクトシル基がスクロースのフルクトシル基にβ−2,6−結合により結合している場合、用語6−ケストトリオースまたはケトースが用いられる。このタイプのフルクタンは、場合によって、レバンまたはフレインとしても知られる。
ネオケストース: ネオケストースまたは6G−ケストースにおいて、フルクトシル基は、スクロースのグリコシル基のC6に結合する。
G(O−CO−NH−R1)a−[F(O−CO−NH−R2)b]n I
Gは、1個または2個以上のヒドロキシル基が、それぞれ独立して、式(O−CO−NH−R1)の基により誘導体化されてもよい、末端グリコシル基を表し、
R1は、非電荷基、特に直鎖状または分岐状、飽和または不飽和の、1〜25個の炭素原子を有する炭化水素基であり、
aは1〜4の数であり、
R2は、非電荷基、特に直鎖状または分岐状、飽和または不飽和の、1〜25個の炭素原子を有する炭化水素基であり、
bは、鎖中のフルクトシル基に関しては1〜3の数であり、末端フルクトシル基に関しては1〜4の数であり、
nは3〜500、好ましくは3〜100、特に好ましくは10〜50の数、特に20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30である。nは特に好ましくは24である。
− 固形の、
− 水、水混和性有機溶媒(例えばエタノール)または水性緩衝系中の高度に濃縮したスラリーの形態の、
− または上述の通り本発明の方法の実行下で、水性懸濁液の形態の、
線状両親媒性炭水化物ポリマーを典型的に含む。
HEK 293細胞からの本発明による膜タンパク質の抽出
洗浄緩衝液: 1X PBS
プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIII:
Calbiochem. Art. No.: 539134
抽出緩衝液I: 10 mM PIPES pH 6.8
0.02重量%のジギトニン
300 mM スクロース
15 mM NaCl
0.5 mM EDTA
抽出緩衝液Iは、細胞質タンパク質を前もって抽出するために、任意に用いることができる。
抽出緩衝液II: 10 mM PIPES pH 7.4
300 mM スクロース
15 mM NaCl
0.5 mM EDTA
・500μlのポリマー(エタノール中の懸濁液)をエッペンドルフ型カップに移す。
・5000gで3分間、遠心分離にかける。
・上澄みを捨て、ポリマーを1000μlの抽出緩衝液IIで洗浄する。
・5000gで3分間、遠心分離にかけ、上澄みを捨てる。
・2度繰り返す。
・最後に、およそ1:1スラリー(50%のポリマー/50%の緩衝液)を調製する。
・抽出のために、そこから、抽出緩衝液II中2%溶液(容積%)を調製する。
・例えばHEK 293細胞を含む、T75 ボトル(約90%覆われる)
・培地を捨てる
・10mlのPBS(4℃)で2度洗浄し、洗浄緩衝液を捨てる(0〜37℃)
・+10μlのプロテアーゼ阻害剤カクテル(任意)
・ボトル当たり1000μlの2.0%(容積%)のポリマー溶液を添加し、注意深く分配する。
・30分間4℃(10〜60分および0℃〜37℃)で放置する
・細胞を削り取り、16,000gで15分間4℃において遠心分離にかける
細胞内コンパートメントに加え、ポリマーも遠心分離により分離し、サンプルから除去する。
⇒タンパク質フラクションとして、上澄みをさらなる分析(例えば、直接的な質量分析調査、および膜タンパク質複合体の分析技術(例えばブルーネイティブゲル電気泳動)ならびに全ての未変性酵素的および免疫学的分析方法)に添加することができる。
Claims (14)
- 生体サンプルから膜タンパク質を抽出するための、少なくとも1種の線状両親媒性炭水化物ポリマーの使用。
- 0.5〜10重量%の少なくとも1種の線状両親媒性炭水化物ポリマーを含む水性懸濁液を抽出のために用いることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
- 生体サンプルが、組織、細胞、細胞培養物、体液、細菌、真菌、ウイルスおよび/または植物であることを特徴とする、請求項1または2に記載の使用。
- 生体サンプルから膜タンパク質を抽出するための方法であって、1種または2種以上の線状両親媒性炭水化物ポリマーを少なくとも含む混合物を生体サンプルに添加することを特徴とする、前記方法。
- 1種または2種以上の線状両親媒性炭水化物ポリマーを少なくとも含む混合物の添加の前に、生体サンプルを溶解することを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 存在する1種または2種以上の線状両親媒性炭水化物ポリマーが非荷電であることを特徴とする、請求項4または5に記載の方法。
- 存在する1種または2種以上の線状両親媒性炭水化物ポリマーが、イヌリンまたはその誘導体からなることを特徴とする、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 存在する1種または2種以上の線状両親媒性炭水化物ポリマーが、直鎖状のポリフルクトース骨格を有することを特徴とする、請求項4〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 抽出が4〜37℃の温度において行われることを特徴とする、請求項4〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 懸濁液または混合物における線状両親媒性炭水化物ポリマーの濃度が、0.5〜10重量%であることを特徴とする、請求項4〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 抽出後に、遠心分離、濾過、磁気分離、沈殿またはクロマトグラフ法により、1種または2種以上の線状両親媒性炭水化物ポリマーを除去することを特徴とする、請求項4〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 1種または2種以上の線状両親媒性炭水化物ポリマーが、磁粉に適用されることを特徴とする、請求項4〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 1種または2種以上の線状両親媒性炭水化物ポリマー、ならびに界面活性剤、界面活性物質および/またはポア形成剤の群から選択される少なくとも1種の溶解剤を少なくとも含むキット。
- 生体サンプルから膜タンパク質を抽出するための、請求項13に記載のキットの使用。
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