JPH0532689A - 膜タンパク質の可溶化剤 - Google Patents
膜タンパク質の可溶化剤Info
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- JPH0532689A JPH0532689A JP19328791A JP19328791A JPH0532689A JP H0532689 A JPH0532689 A JP H0532689A JP 19328791 A JP19328791 A JP 19328791A JP 19328791 A JP19328791 A JP 19328791A JP H0532689 A JPH0532689 A JP H0532689A
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- thioglycoside
- group
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Abstract
(57)【要約】
【構成】一般式（Ｉ）
Ｇ−ＳＲ （Ｉ）
［式中、Ｇは２〜３個の糖残基からなるオリゴ糖を示
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるオリゴ糖のチオグリコシドを有効成分とする可
溶化剤およびその可溶化剤を用いた膜タンパク質の可溶
化、分離精製および人工膜の再構成方法。 【効果】可溶化能、取扱性に優れた可溶化剤およびその
可溶化剤を用いた膜タンパク質の可溶化、分離精製およ
び人工膜の再構成方法を提供できた。
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるオリゴ糖のチオグリコシドを有効成分とする可
溶化剤およびその可溶化剤を用いた膜タンパク質の可溶
化、分離精製および人工膜の再構成方法。 【効果】可溶化能、取扱性に優れた可溶化剤およびその
可溶化剤を用いた膜タンパク質の可溶化、分離精製およ
び人工膜の再構成方法を提供できた。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、膜タンパク質等の可溶
化に用いられるチオグリコシドに関する。
化に用いられるチオグリコシドに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、そのもの自身が安定で、タンパク
質の変性を伴うことの少ない膜タンパク質の可溶化剤と
して、オクチルチオグルコシド、ヘプチルチオグルコシ
ドなどが知られている（特開昭６１−７２８８号公報参
照）。
質の変性を伴うことの少ない膜タンパク質の可溶化剤と
して、オクチルチオグルコシド、ヘプチルチオグルコシ
ドなどが知られている（特開昭６１−７２８８号公報参
照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記オクチル
チオグルコシドは水に対する溶解性が低く、低温で結晶
化する等の問題があり、タンパク質の変性を回避するた
め低温での処理が必要な膜タンパク質の可溶化剤として
使用し難い不具合があった。また、ヘプチルチオグルコ
シドは吸湿性が強く、秤量中に吸湿する等取扱いが不便
であった。
チオグルコシドは水に対する溶解性が低く、低温で結晶
化する等の問題があり、タンパク質の変性を回避するた
め低温での処理が必要な膜タンパク質の可溶化剤として
使用し難い不具合があった。また、ヘプチルチオグルコ
シドは吸湿性が強く、秤量中に吸湿する等取扱いが不便
であった。
【０００４】本発明は、そのもの自身安定でタンパク質
の変性を伴うことの少ないという優れた性質を持ち、さ
らに、上記不具合のない膜タンパク質の可溶化剤を安価
に、大量に提供することを目的とする。
の変性を伴うことの少ないという優れた性質を持ち、さ
らに、上記不具合のない膜タンパク質の可溶化剤を安価
に、大量に提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するため鋭意検討を重ねた結果、オリゴ糖のアルキ
ルチオグリコシドがその目的に適合し得ることを見出
し、本発明を完成した。即ち、本発明は、一般式（Ｉ） Ｇ−ＳＲ （Ｉ） ［式中、Ｇは２〜３個の糖残基からなるオリゴ糖を示
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを有効成分とする可溶化剤を提
供するものである。
達成するため鋭意検討を重ねた結果、オリゴ糖のアルキ
ルチオグリコシドがその目的に適合し得ることを見出
し、本発明を完成した。即ち、本発明は、一般式（Ｉ） Ｇ−ＳＲ （Ｉ） ［式中、Ｇは２〜３個の糖残基からなるオリゴ糖を示
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを有効成分とする可溶化剤を提
供するものである。
【０００６】また、本発明は、一般式（Ｉ）
Ｇ−ＳＲ （Ｉ）
［式中、Ｇは２〜３個の糖残基からなるオリゴ糖を示
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを用いることを特徴とする膜タ
ンパク質の可溶化方法を提供するものである。
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを用いることを特徴とする膜タ
ンパク質の可溶化方法を提供するものである。
【０００７】さらにまた、本発明は一般式（Ｉ）
Ｇ−ＳＲ （Ｉ）
［式中、Ｇは２〜３個の糖残基からなるオリゴ糖を示
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを用いることを特徴とする膜タ
ンパク質の分離精製方法を提供するものである。
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを用いることを特徴とする膜タ
ンパク質の分離精製方法を提供するものである。
【０００８】さらにまた、本発明は一般式（Ｉ）
Ｇ−ＳＲ （Ｉ）
［式中、Ｇは２〜３個の糖残基からなるオリゴ糖を示
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを用いて可溶化した膜タンパク
質の人工膜への再構成方法を提供するものである。
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを用いて可溶化した膜タンパク
質の人工膜への再構成方法を提供するものである。
【０００９】本発明において、炭素数６〜１０の中鎖ア
ルキル基とは、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、
ノニル基およびデシル基等のアルキル基を例示できる
が、好ましくはｎ−オクチル基またはｎ−ノニル基が良
い。
ルキル基とは、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、
ノニル基およびデシル基等のアルキル基を例示できる
が、好ましくはｎ−オクチル基またはｎ−ノニル基が良
い。
【００１０】本発明において、２〜３個の糖残基からな
るオリゴ糖としては、例えばマルトース、ラクトース、
トレハロース、セロビオース、イソマルトース、ゲンチ
ビオース、ラミナリビオース、キトビオース、キシロビ
オース、マンノビオース、マルトトリオース等が挙げら
れるが、好ましくはマルトース、キシロビオース等が良
い。
るオリゴ糖としては、例えばマルトース、ラクトース、
トレハロース、セロビオース、イソマルトース、ゲンチ
ビオース、ラミナリビオース、キトビオース、キシロビ
オース、マンノビオース、マルトトリオース等が挙げら
れるが、好ましくはマルトース、キシロビオース等が良
い。
【００１１】本発明の可溶化剤は、以下のようにして製
造できる。
造できる。
【００１２】すなわち、従来公知の方法により製造され
たアシル化オリゴ糖をヘテロポリ酸の存在下にチオール
類と反応させることにより得ることができる。ヘテロポ
リ酸としては、リンタングステン酸、リンモリブデン
酸、シリコタングステン酸等が用いられ、このヘテロポ
リ酸は、使用するアシル化オリゴ糖とチオール類の合計
量の０．１〜５重量％程度使用される。また、チオール
類は、アシル化オリゴ糖の１〜１０倍モル量程度使用さ
れる。アシル化オリゴ糖とチオール類との反応は、１〜
１２時間程度で終了し、反応溶媒としては、トルエン等
の芳香族炭化水素、クロロホルム等のハロゲン化炭化水
素、酢酸エチル等のエステル類などが挙げられる。
たアシル化オリゴ糖をヘテロポリ酸の存在下にチオール
類と反応させることにより得ることができる。ヘテロポ
リ酸としては、リンタングステン酸、リンモリブデン
酸、シリコタングステン酸等が用いられ、このヘテロポ
リ酸は、使用するアシル化オリゴ糖とチオール類の合計
量の０．１〜５重量％程度使用される。また、チオール
類は、アシル化オリゴ糖の１〜１０倍モル量程度使用さ
れる。アシル化オリゴ糖とチオール類との反応は、１〜
１２時間程度で終了し、反応溶媒としては、トルエン等
の芳香族炭化水素、クロロホルム等のハロゲン化炭化水
素、酢酸エチル等のエステル類などが挙げられる。
【００１３】得られたアシル化オリゴ糖チオグリコシド
の脱アシル化反応は、常法に従い、例えばアシル化糖に
対し０．００１〜０．５当量のナトリウムアルコキシド
を触媒とし、アルコール溶液中で行うことができる。
の脱アシル化反応は、常法に従い、例えばアシル化糖に
対し０．００１〜０．５当量のナトリウムアルコキシド
を触媒とし、アルコール溶液中で行うことができる。
【００１４】かくして得られたチオグリコシル化オリゴ
糖は、膜タンパク質の可溶化剤として有用である。
糖は、膜タンパク質の可溶化剤として有用である。
【００１５】本発明のチオグリコシドで可溶化される膜
タンパク質としては、膜内在性のタンパク質についてよ
り効果が大きいが、膜表在性のタンパク質についても十
分な可溶化効果がある。本発明のオリゴ糖のチオグリコ
シドによればタンパク質の変性を伴うことなく種々の膜
タンパク質の可溶化を図ることができる。
タンパク質としては、膜内在性のタンパク質についてよ
り効果が大きいが、膜表在性のタンパク質についても十
分な可溶化効果がある。本発明のオリゴ糖のチオグリコ
シドによればタンパク質の変性を伴うことなく種々の膜
タンパク質の可溶化を図ることができる。
【００１６】可溶化に用いられるチオグリコシドの量
は、可溶化すべきタンパク質の種類によっても変化する
が、通常用いられる濃度としては、その可溶化剤の臨界
ミセル濃度（ｃｍｃ）の１〜５０倍量程度で使用され、
好ましくはｃｍｃの３〜１０倍量程度の濃度で使用され
る。また、可溶化を行う際には他の界面活性剤や塩類を
加えることも可能である。可溶化を行う溶液のｐＨは、
通常６〜９の範囲であり、目的の膜タンパク質が最も安
定化するｐＨを選べば良い。可溶化の条件としては、上
記濃度の可溶化剤の存在下０〜４０℃の温度で５〜３０
分間静置またはインキュベートすることが挙げられる。
は、可溶化すべきタンパク質の種類によっても変化する
が、通常用いられる濃度としては、その可溶化剤の臨界
ミセル濃度（ｃｍｃ）の１〜５０倍量程度で使用され、
好ましくはｃｍｃの３〜１０倍量程度の濃度で使用され
る。また、可溶化を行う際には他の界面活性剤や塩類を
加えることも可能である。可溶化を行う溶液のｐＨは、
通常６〜９の範囲であり、目的の膜タンパク質が最も安
定化するｐＨを選べば良い。可溶化の条件としては、上
記濃度の可溶化剤の存在下０〜４０℃の温度で５〜３０
分間静置またはインキュベートすることが挙げられる。
【００１７】可溶化されたタンパク質の分離精製手段と
しては、超遠心、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、各種
フィルターによる膜分離などが挙げられるが、中でもゲ
ル濾過クロマトグラフィーがよく用いられる。
しては、超遠心、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、各種
フィルターによる膜分離などが挙げられるが、中でもゲ
ル濾過クロマトグラフィーがよく用いられる。
【００１８】可溶化した膜タンパク質を再構成するため
の人工膜としては、単分子膜、リポソーム、累積膜等が
挙げられる。好ましくは、リポソームが良いが、用途に
より他の物質上に再構成することも可能である。
の人工膜としては、単分子膜、リポソーム、累積膜等が
挙げられる。好ましくは、リポソームが良いが、用途に
より他の物質上に再構成することも可能である。
【００１９】膜タンパク質を再構成する方法としては公
知の各種の方法が使用できるが、好ましくは、可溶化し
た膜タンパク質および脂質の存在下透析による方法、あ
るいは、希釈による方法を用い可溶化剤の濃度を下げて
膜タンパク質を組み込んだリポソームを作成する方法が
挙げられる。
知の各種の方法が使用できるが、好ましくは、可溶化し
た膜タンパク質および脂質の存在下透析による方法、あ
るいは、希釈による方法を用い可溶化剤の濃度を下げて
膜タンパク質を組み込んだリポソームを作成する方法が
挙げられる。
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、以下のような優れた効
果が達せられる。
果が達せられる。
【００２１】（１）本発明の可溶化剤（オリゴ糖のチオ
グリコシド類）は、高純度のものが容易に得られる。
グリコシド類）は、高純度のものが容易に得られる。
【００２２】（２）本発明の可溶化剤は、製造コストが
安く低価格で大量に使用することができる。
安く低価格で大量に使用することができる。
【００２３】（３）本発明の可溶化剤は、水への溶解性
が高くしかも吸湿性がないため、取扱いが容易である。
が高くしかも吸湿性がないため、取扱いが容易である。
【００２４】（４）本発明の可溶化剤は、膜タンパク質
の可溶化効果が高く、従って、可溶化自体およびその後
の分離精製も容易に行うことができる。
の可溶化効果が高く、従って、可溶化自体およびその後
の分離精製も容易に行うことができる。
【００２５】（５）本発明の可溶化剤は、タンパク質を
ほとんど変性させず且つ透析等による除去が容易である
ため、膜タンパク質の分離精製および人工膜への再構成
も容易に行うことができる。
ほとんど変性させず且つ透析等による除去が容易である
ため、膜タンパク質の分離精製および人工膜への再構成
も容易に行うことができる。
【００２６】（６）本発明の可溶化剤は、２８０ｎｍ付
近のＵＶ吸収がほとんどないため、タンパク質の定量に
影響を及ぼさない。
近のＵＶ吸収がほとんどないため、タンパク質の定量に
影響を及ぼさない。
【００２７】
【実施例】以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説
明する。
明する。
【００２８】
【実施例１】オクタアセチル−Ｄ−マルトース２０ｇ
（０．０２９モル）、オクタンチオール２０ｇ（０．１
３モル）及びトルエン５０ｍｌに、シリコタングステン
酸０．５ｇをシリカゲル（メルク社、シリカゲル６０）
７．５ｇに担持したものを加え、窒素気流下にて９０℃
に加熱しながら３時間反応させた。反応液を濾過し、濾
液を４％炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで水で洗浄し
た後、減圧下に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー（溶離液：トルエン〜トルエン
／酢酸エチル（１／２）の勾配溶離法）にて精製しオイ
ル状のオクチル−β−Ｄ−チオマルトシド ヘプタアセ
テートを分離した。これを２００ｍｌのメタノールに溶
解し、室温で攪拌しながら、ナトリウムメチラートのメ
タノール溶液（２８％）を５ｍｌ添加し、脱アセチル化
反応を３時間行った。反応液を酢酸で中和し、濃縮する
とキャラメル状の物質が得られた。これを、シリカゲル
カラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル〜酢酸
エチル／メタノール（１／２）の勾配溶離法）にて精製
し、白色粉末状のオクチル−β−Ｄ−チオマルトシド１
０．６ｇ（収率７６％）を分離した。
（０．０２９モル）、オクタンチオール２０ｇ（０．１
３モル）及びトルエン５０ｍｌに、シリコタングステン
酸０．５ｇをシリカゲル（メルク社、シリカゲル６０）
７．５ｇに担持したものを加え、窒素気流下にて９０℃
に加熱しながら３時間反応させた。反応液を濾過し、濾
液を４％炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで水で洗浄し
た後、減圧下に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー（溶離液：トルエン〜トルエン
／酢酸エチル（１／２）の勾配溶離法）にて精製しオイ
ル状のオクチル−β−Ｄ−チオマルトシド ヘプタアセ
テートを分離した。これを２００ｍｌのメタノールに溶
解し、室温で攪拌しながら、ナトリウムメチラートのメ
タノール溶液（２８％）を５ｍｌ添加し、脱アセチル化
反応を３時間行った。反応液を酢酸で中和し、濃縮する
とキャラメル状の物質が得られた。これを、シリカゲル
カラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル〜酢酸
エチル／メタノール（１／２）の勾配溶離法）にて精製
し、白色粉末状のオクチル−β−Ｄ−チオマルトシド１
０．６ｇ（収率７６％）を分離した。
【００２９】
【実施例２，３：比較例１，２】実施例１と同様にし
て、それぞれノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル基
を持つメルカプタンをオクタアセチルマルトースと反応
させ、その後、脱アセチル化し、カラム精製することに
より表１に示す条件で各種のアルキル β−Ｄ−チオマ
ルトシドを得た（すべて、白色粉末状であった）。
て、それぞれノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル基
を持つメルカプタンをオクタアセチルマルトースと反応
させ、その後、脱アセチル化し、カラム精製することに
より表１に示す条件で各種のアルキル β−Ｄ−チオマ
ルトシドを得た（すべて、白色粉末状であった）。
【００３０】これらの元素分析値並びにｃｍｃの測定値
を表２に示す。
を表２に示す。
【００３１】また、ノニル−β−Ｄ−チオマルトシドの
ＩＲチャートを図１に示すが、他のチオマルトシドの場
合にもほとんど同様のチャートが得られる。それぞれの
化合物のＮＭＲ分析結果を表３に示す。
ＩＲチャートを図１に示すが、他のチオマルトシドの場
合にもほとんど同様のチャートが得られる。それぞれの
化合物のＮＭＲ分析結果を表３に示す。
【００３２】
【表１】
表 １ 各 種 チ オ マ ル ト シ ド の 合 成
反応時の仕込量 チオマルトシド アルキル基 ＯＡＭ／ｇ メルカプタン／ｇ 収量ｇ（収率％）
実施例１ オクチル基 ２０ ２０ １１（７６）
実施例２ ノニル基 ２３ ３０ １１（６７）
実施例３ デシル基 ２３ ３０ １２（７２）
比較例１ ウンデシル基 ２３ ３０ １２（７０）比較例２ ドデシル基 ６８ １００ ３８（７２）
【００３３】
【表２】
表 ２ 各 種 チ オ マ ル ト シ ド の 分 析 値
アルキル基 臨界ミセル濃度 元 素 分 析 値 （／ｍＭ） Ｃ Ｈ Ｓ
オクチル基 3.1 50.8(51.05) 8.2(8.14) 6.7(6.81)
ノニル基 1.4 51.1(52.05) 8.4(8.32) 6.5(6.62)
デシル基 0.30 52.0(52.99) 8.5(8.49) 6.3(6.43)
ウンデシル基 0.18 52.5(53.89) 8.8(8.65) 6.1(6.25) ドデシル基 0.06 53.7(54.73) 8.9(8.80) 5.9(6.09)
なお、（ ）内は、計算値を示す。
【００３４】
【表３】
表 ３ 各 種 チ オ マ ル ト シ ド の Ｎ Ｍ Ｒ 分 析 値
アルキル基 ケミカルシフト値（δ／ｐｐｍ） 1Ｈ−ＮＭＲ（アノマー水素） 13Ｃ−ＮＭＲ（アノマー炭素）
オクチル基 5.15(d), 4.33(d) 102.9, 87.2
ノニル基 5.16(d), 4.32(d) 103.0, 87.3
デシル基 5.15(d), 4.33(d) 102.8, 87.0
ウンデシル基 5.15(d), 4.35(d) 102.9, 87.3 ドデシル基 5.16(d), 4.35(d) 103.1, 87.5
【００３５】
【実施例４】ノニルチオマルトシドについて、膜タンパ
ク質の可溶化の能力を測定した。
ク質の可溶化の能力を測定した。
【００３６】まず、腸炎ビブリオ菌の膜小胞を従来公知
の方法であるフレンチプレス法を用いて作成した。これ
を、５０ｍＭモップス緩衝液中（ｐＨ７．５）１ｍｇタ
ンパク質／ｍｌに調製し、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、
１ｍＭジチオスレイトール、７．５％グリセロールの存
在下、種々の濃度のノニルチオマルトシドと混和し、４
℃で１５分間保温した。これを、超遠心分離機にかけ
（１０５０００ｇ、１時間）、可溶化された成分と不溶
性成分とに分離した。両者について、タンパク質の定量
を行い、全膜タンパク質中の可溶化されたタンパク質の
割合を求めた。また、上清中に可溶化されたＡＴＰアー
ゼならびに５´−ヌクレオチダーゼの活性をそれぞれ測
定した。図２により、ノニルチオマルトシドによる膜タ
ンパク質の可溶化には、約１０ｍＭの濃度が最適である
ことがわかった。
の方法であるフレンチプレス法を用いて作成した。これ
を、５０ｍＭモップス緩衝液中（ｐＨ７．５）１ｍｇタ
ンパク質／ｍｌに調製し、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、
１ｍＭジチオスレイトール、７．５％グリセロールの存
在下、種々の濃度のノニルチオマルトシドと混和し、４
℃で１５分間保温した。これを、超遠心分離機にかけ
（１０５０００ｇ、１時間）、可溶化された成分と不溶
性成分とに分離した。両者について、タンパク質の定量
を行い、全膜タンパク質中の可溶化されたタンパク質の
割合を求めた。また、上清中に可溶化されたＡＴＰアー
ゼならびに５´−ヌクレオチダーゼの活性をそれぞれ測
定した。図２により、ノニルチオマルトシドによる膜タ
ンパク質の可溶化には、約１０ｍＭの濃度が最適である
ことがわかった。
【００３７】
【実施例５】前述の方法により得られたオクチルチオマ
ルトシド、デシルチオマルトシド、ウンデシルチオマル
トシドならびに従来既知の膜タンパク質可溶化剤である
ヘプチルチオグルコシドについて、実施例４と同じ方法
を用いて、膜タンパク質の可溶化能力を比較した。結果
を図３に示す。
ルトシド、デシルチオマルトシド、ウンデシルチオマル
トシドならびに従来既知の膜タンパク質可溶化剤である
ヘプチルチオグルコシドについて、実施例４と同じ方法
を用いて、膜タンパク質の可溶化能力を比較した。結果
を図３に示す。
【００３８】なお、以下の図３〜図５中の略号は、以下
のものを表す。
のものを表す。
【００３９】ＯＴＭ：オクチル β−Ｄ−チオマルトシ
ド ＮＴＭ：ノニル β−Ｄ−チオマルトシド ＤＴＭ：デシル β−Ｄ−チオマルトシド ＵＴＭ：ウンデシル β−Ｄ−チオマルトシド ＨＴＧ：ヘプチル β−Ｄ−チオグルコシド ＤｏＴＭ：ドデシル β−Ｄ−チオマルトシド 図３の結果から、デシルチオマルトシドとウンデシルチ
オマルトシドの場合には、どちらも１０ｍＭ程度以上の
濃度において、約４０％の膜タンパク質が可溶化される
ことがわかった（不要なタンパク質まで可溶化しないた
めには、４０％程度の可溶化が最適であることが知られ
ている）。また、オクチルチオマルトシドの場合には、
約２０ｍＭ以上で同程度の可溶化能を示したが、ヘプチ
ルチオグルコシドの場合には４０ｍＭ以上の可溶化剤濃
度が必要であることもわかった。すなわち、新規可溶化
剤であるアルキルチオマルトシドの場合、従来より用い
られてきたヘプチルチオグルコシドに比べて１／４程度
の濃度でも十分な膜タンパク質の可溶化が行われること
がわかった。
ド ＮＴＭ：ノニル β−Ｄ−チオマルトシド ＤＴＭ：デシル β−Ｄ−チオマルトシド ＵＴＭ：ウンデシル β−Ｄ−チオマルトシド ＨＴＧ：ヘプチル β−Ｄ−チオグルコシド ＤｏＴＭ：ドデシル β−Ｄ−チオマルトシド 図３の結果から、デシルチオマルトシドとウンデシルチ
オマルトシドの場合には、どちらも１０ｍＭ程度以上の
濃度において、約４０％の膜タンパク質が可溶化される
ことがわかった（不要なタンパク質まで可溶化しないた
めには、４０％程度の可溶化が最適であることが知られ
ている）。また、オクチルチオマルトシドの場合には、
約２０ｍＭ以上で同程度の可溶化能を示したが、ヘプチ
ルチオグルコシドの場合には４０ｍＭ以上の可溶化剤濃
度が必要であることもわかった。すなわち、新規可溶化
剤であるアルキルチオマルトシドの場合、従来より用い
られてきたヘプチルチオグルコシドに比べて１／４程度
の濃度でも十分な膜タンパク質の可溶化が行われること
がわかった。
【００４０】
【実施例６】前述の方法により得られたオクチルチオマ
ルトシド、デシルチオマルトシド、ウンデシルチオマル
トシドならびに従来既知の膜タンパク質可溶化剤である
オクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシドについ
て、実施例４と同じ方法を用いて、腸炎ビブリオ菌の膜
に存在するＡＴＰアーゼの可溶化を行い、その変性／失
活の度合いを調べた。結果を図４に示す。なお、オクチ
ルグルコシドでは、この酵素が失活した。
ルトシド、デシルチオマルトシド、ウンデシルチオマル
トシドならびに従来既知の膜タンパク質可溶化剤である
オクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシドについ
て、実施例４と同じ方法を用いて、腸炎ビブリオ菌の膜
に存在するＡＴＰアーゼの可溶化を行い、その変性／失
活の度合いを調べた。結果を図４に示す。なお、オクチ
ルグルコシドでは、この酵素が失活した。
【００４１】図４の結果から、使用するアルキルチオマ
ルトシドによって、最適濃度に若干の差があるものの、
ノニルチオマルトシド、デシルチオマルトシドなどによ
り、高い活性を保持した形でＡＴＰアーゼが可溶化され
ること、すなわち、酵素活性の失活が起こっていないこ
とがわかった。また、可溶化されたＡＴＰアーゼの諸性
質は、膜に結合している状態のものと同じであることも
確認された。すなわち、酵素の変性も起こっていないも
のと考えられる。図４から明らかなように、従来公知の
可溶化剤であるヘプチルチオグルコシドでこの酵素を可
溶化した場合、ノニルチオマルトシドの場合に比べ活性
が１／２程度に減少する。これらの実験結果より、アル
キルチオマルトシドは、従来既知の膜タンパク質可溶化
剤であるオクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド
よりも膜タンパク質の変性・失活を起こしにくく、優れ
た可溶化剤であることが分かった。
ルトシドによって、最適濃度に若干の差があるものの、
ノニルチオマルトシド、デシルチオマルトシドなどによ
り、高い活性を保持した形でＡＴＰアーゼが可溶化され
ること、すなわち、酵素活性の失活が起こっていないこ
とがわかった。また、可溶化されたＡＴＰアーゼの諸性
質は、膜に結合している状態のものと同じであることも
確認された。すなわち、酵素の変性も起こっていないも
のと考えられる。図４から明らかなように、従来公知の
可溶化剤であるヘプチルチオグルコシドでこの酵素を可
溶化した場合、ノニルチオマルトシドの場合に比べ活性
が１／２程度に減少する。これらの実験結果より、アル
キルチオマルトシドは、従来既知の膜タンパク質可溶化
剤であるオクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド
よりも膜タンパク質の変性・失活を起こしにくく、優れ
た可溶化剤であることが分かった。
【００４２】
【実施例７】可溶化した膜タンパク質を精製してその性
質を調べたり、人工膜に組み込んで機能を解析したりす
る場合、可溶化剤を除く必要がある。可溶化剤の透析に
よる除去は、その中でも最も簡便・迅速でしかも経済的
な方法である。アルキルチオマルトシドについて透析に
よる除去が可能であるかどうか調べた。１０ｍＭの（膜
タンパク質の可溶化に最も適した濃度）の可溶化剤を透
析膜に入れ、１０００倍量の５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）に対し４℃で透析を行い、一定時間
毎に透析膜中の液の可溶化剤濃度を定量した。結果を図
５に示す。図５の結果から、オクチルチオマルトシドと
ノニルチオマルトシドが使いやすく、デシルチオマルト
シドも使用可能であることがわかった。ところが、ウン
デシルチオマルトシドおよびドデシルチオマルトシドの
場合には、他の方法で除去する必要があることがわかっ
た。
質を調べたり、人工膜に組み込んで機能を解析したりす
る場合、可溶化剤を除く必要がある。可溶化剤の透析に
よる除去は、その中でも最も簡便・迅速でしかも経済的
な方法である。アルキルチオマルトシドについて透析に
よる除去が可能であるかどうか調べた。１０ｍＭの（膜
タンパク質の可溶化に最も適した濃度）の可溶化剤を透
析膜に入れ、１０００倍量の５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）に対し４℃で透析を行い、一定時間
毎に透析膜中の液の可溶化剤濃度を定量した。結果を図
５に示す。図５の結果から、オクチルチオマルトシドと
ノニルチオマルトシドが使いやすく、デシルチオマルト
シドも使用可能であることがわかった。ところが、ウン
デシルチオマルトシドおよびドデシルチオマルトシドの
場合には、他の方法で除去する必要があることがわかっ
た。
【図１】本発明の可溶化剤の一例であるノニル−β−Ｄ
−チオマルトシドのＩＲチャートを示す。
−チオマルトシドのＩＲチャートを示す。
【図２】本発明の可溶化剤であるノニル−β−Ｄ−チオ
マルトシドを用いた膜タンパク質の可溶化と膜中に存在
する酵素（ＡＴＰアーゼならびに５´−ヌクレオチダー
ゼ）の可溶化能の測定結果を示す。
マルトシドを用いた膜タンパク質の可溶化と膜中に存在
する酵素（ＡＴＰアーゼならびに５´−ヌクレオチダー
ゼ）の可溶化能の測定結果を示す。
【図３】本発明の各種可溶化剤を用いた場合の腸炎ビブ
リオ菌の膜タンパク質の可溶化能の比較を示す。
リオ菌の膜タンパク質の可溶化能の比較を示す。
【図４】本発明の各種可溶化剤を用いた場合の腸炎ビブ
リオ菌の膜中のＡＴＰアーゼの可溶化能の比較を示す。
リオ菌の膜中のＡＴＰアーゼの可溶化能の比較を示す。
【図５】本発明の各種可溶化剤の透析による除去速度の
比較を示す。
比較を示す。
ＯＴＭ：オクチル β−Ｄ−チオマルトシド
ＮＴＭ：ノニル β−Ｄ−チオマルトシド
ＤＴＭ：デシル β−Ｄ−チオマルトシド
ＵＴＭ：ウンデシル β−Ｄ−チオマルトシド
ＨＴＧ：ヘプチル β−Ｄ−チオグルコシド
ＤｏＴＭ：ドデシル β−Ｄ−チオマルトシド
Claims (4)
- 【請求項１】一般式（Ｉ） Ｇ−ＳＲ （Ｉ） ［式中、Ｇは２〜３個の糖残基からなるオリゴ糖を示
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを有効成分とする可溶化剤。 - 【請求項２】一般式（Ｉ） Ｇ−ＳＲ （Ｉ） ［式中、Ｇは２〜３個の糖残基からなるオリゴ糖を示
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを用いることを特徴とする膜タ
ンパク質の可溶化方法。 - 【請求項３】一般式（Ｉ） Ｇ−ＳＲ （Ｉ） ［式中、Ｇは２〜３個の糖残基からなるオリゴ糖を示
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを用いることを特徴とする膜タ
ンパク質の分離精製方法。 - 【請求項４】一般式（Ｉ） Ｇ−ＳＲ （Ｉ） ［式中、Ｇは２〜３個の糖残基からなるオリゴ糖を示
し、Ｒは、炭素数６〜１０の中鎖アルキル基を示し、Ｇ
とＳＲ基との結合は、β−グリコシド結合である。］で
表されるチオグリコシドを用いて可溶化した膜タンパク
質の人工膜への再構成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19328791A JPH0532689A (ja) | 1991-08-01 | 1991-08-01 | 膜タンパク質の可溶化剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19328791A JPH0532689A (ja) | 1991-08-01 | 1991-08-01 | 膜タンパク質の可溶化剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0532689A true JPH0532689A (ja) | 1993-02-09 |
Family
ID=16305413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19328791A Pending JPH0532689A (ja) | 1991-08-01 | 1991-08-01 | 膜タンパク質の可溶化剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0532689A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6461629A (en) * | 1987-08-17 | 1989-03-08 | Jr 3 Inc | Power-moment sensor unit and manufacture thereof |
| WO1998022487A1 (en) * | 1996-11-15 | 1998-05-28 | Synsorb Biotech, Inc. | Combinatorial synthesis of carbohydrate libraries |
| WO2010013423A1 (ja) | 2008-07-28 | 2010-02-04 | 花王株式会社 | 皮膚外用剤及びシワ改善剤 |
| JP2011506354A (ja) * | 2007-12-15 | 2011-03-03 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 膜タンパク質の抽出方法 |
| WO2012133695A1 (ja) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | クニミネ工業株式会社 | タンパク質結晶化条件探索剤及びタンパク質結晶化条件探索方法 |
-
1991
- 1991-08-01 JP JP19328791A patent/JPH0532689A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6461629A (en) * | 1987-08-17 | 1989-03-08 | Jr 3 Inc | Power-moment sensor unit and manufacture thereof |
| WO1998022487A1 (en) * | 1996-11-15 | 1998-05-28 | Synsorb Biotech, Inc. | Combinatorial synthesis of carbohydrate libraries |
| JP2011506354A (ja) * | 2007-12-15 | 2011-03-03 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 膜タンパク質の抽出方法 |
| WO2010013423A1 (ja) | 2008-07-28 | 2010-02-04 | 花王株式会社 | 皮膚外用剤及びシワ改善剤 |
| WO2012133695A1 (ja) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | クニミネ工業株式会社 | タンパク質結晶化条件探索剤及びタンパク質結晶化条件探索方法 |
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