JP2011189334A - ボツリヌス毒素除去用高分子基材、及び医療器具 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 分子内にメチレン基を有する中空糸膜等の高分子支持体に糖類が結合された高分子鎖がグラフト重合反応により結合した高分子基材、該固定化高分子基材を用いた医療器具を提供することにより課題を解決する。
【選択図】 図3
Description
本発明は、「平成18年度、新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、産業技術力強化法第19条の適用を受ける特許出願」(旧「平成18年度、新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究、産業活力再生特別措置法第30条の適用を受ける特許出願」)である。
開発の方向性は、患者の侵襲を軽減化させるため血漿成分吸着法から全血を用いた血液浄化用吸着法へ転換させるための改良研究、ならびに既存製品を用いて新たな対象疾患を探索することで適応拡大を目指した開発が行なわれている。
これらの吸着型の血液浄化装置の要求される仕様は、疾病を起こす原因となる因子に高い特異性を示すリガンドを用いること、また高効率に血液(血漿)から捕捉できる固定化基材を作製することが必要である。リガンドの選択と高分子基材への有効な固定法が必要となる。
(3)ボツリヌス菌のHA陽性毒素(L及び/又はLL毒素)とHA陰性毒素(M毒素)とを含む毒素の液をラクトースカラムに通すことにより、HA陽性毒素とHA陰性毒素とを分離することを特徴とする、ボツリヌス菌毒素の分離・精製法であって、ラクトースがβ−ラクトースである分離・精製法が記載されている(特許文献3)。
(4)特許文献4には、糖類としてグロボ多糖が固定化された高分子基材について、ベロ毒素除去作用があることが記載されている。
即ち、本発明によれば、安全性や血液適合性が高く、ボツリヌス毒素に対する吸着除去能の高い糖類が結合された高分子基材、その製造方法、医療器具、及びそれを用いたウイルス除去方法を提供することができる。
本発明の高分子基材について説明する。
本発明の高分子基材は、分子内にメチレン基を有する高分子支持体に、下記一般式(1)
次に、糖類が結合された高分子基材の製造方法について説明する。
本発明の糖類が結合された高分子基材の製造方法は、一般式(3)で表される繰り返し単位(C)
高分子支持体への繰り返し単位(C)の結合は、グラフト重合法により行うことができる。即ち、前記高分子支持体に、エチレン性不飽和結合を有する重合性化合物(以下、単に「重合性化合物」という)を接触させる工程(1)と、前記高分子支持体に前記重合性化合物を接触させた状態で電離放射線を照射する工程(2)とをこの順で、又は、前記高分子支持体に電離放射線を照射する工程(3)と、電離放射線を照射した前記高分子支持体に前記重合性化合物を接触させる工程(4)とをこの順で行うことにより、高分子支持体への結合を行うことができる。
本発明に用いる高分子支持体は、電離放射線照射によって発生したラジカルに、重合性化合物がグラフト重合することができ、かつ、血液適合性の高いものであれば、公知慣用の高分子素材を用いることができる。この様な高分子支持体として、分子内にメチレン基を有するような高分子化合物が挙げられる。本発明に用いる高分子支持体の具体例としては、例えば、オレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、スルホン系樹脂、アクリル系樹脂、ウレタン系樹脂、エステル系樹脂、エーテル系樹脂又はセルロースアセテートが挙げられ、より具体的にはポリエチレンテレフタレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ−4−メチルペンテン等を例示できる。
エチレン性不飽和結合を有する重合性化合物としては、血液適合性の高いものであれば特に限定することなく用いることができるが、好ましくはH2C=CR1R0(但し、R1は水素原子又はメチル基を表し、R0はカルボキシ基、活性エステル残基を表す。)で表されるエチレン性不飽和結合を有する重合性化合物が挙げられる。このうち、好ましい化合物の具体例としては、アクリル酸、メタクリル酸、活性エステル残基とアクリル酸の縮合物、活性エステル残基とメタクリル酸の縮合物などが挙げられ、ここで用いられる活性エステル残基としては、ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾールなど、後述するアミド化反応で挙げた慣用の活性エステルの残基を挙げることができる。上述した重合性化合物のうち、異なる重合性化合物を2種以上用いることもできる。
前記高分子支持体と前記重合性化合物との接触方法は、前記重合性化合物を水系溶媒に溶解させて水溶液とした上で、上記高分子支持体と接触させればよい。本発明においては、前記高分子支持体表面におけるグラフト重合を優先的に進行させることから、水溶液中の前記重合性化合物の濃度は低い方が好ましい。あまり高い濃度、例えば20質量%以上では、ラジカルが溶液中に拡散し溶液中で重合反応が同時進行する場合がある。具体的には、使用する重合性化合物各々の溶解度により上限が限定されるが、概ね0.1質量%以上、好ましくは0.1〜20質量%、より好ましくは0.1〜15質量%の範囲である。
前記高分子支持体に電離放射線を照射して発生させたラジカルにより、前記重合性化合物が有するエチレン性不飽和結合部位を高分子支持体にグラフト重合させる。グラフト重合に際して用いる電離放射線としては、α線、β線、γ線、加速電子線、X線等があげられ、実用的にはγ線、加速電子線が望ましい。
また、繰り返し単位(C)の単位面積当たりの導入量はグラフトモノマー換算で0.01μmol/cm2以上とすることが好ましく、一方、重合性化合物の結合量の過剰な増加は素材内部からのグラフト重合進行による変形や変質をもたらし、洗浄を困難にすることから、0.1〜5μmol/cm2とすることがより好ましい。
上述の方法などで得られた一般式(3)で表される繰り返し単位(C)が結合している高分子支持体に、一般式(4)で表される化合物を接触させ、アミド化反応する。アミド化反応の方法は、例えば、活性エステルによるアミド化、縮合剤によるアミド化、これらの併用、混合酸無水物法、アジド法、酸化還元法、DPPA法、ウッドワード法など、ペプチド合成などで用いられている公知慣用のアミド化反応を行えばよい。
本発明で用いる下記一般式(4)
ッカライド)、ガラクトシルガラクトース(Gb2)などの糖類を挙げることができる。
これらの糖類の高分子基材への固定化は、公知慣用の方法で行うことができる(例えば、特開2009−287011号公報に記載の方法を参照)。
本発明の糖類が結合された高分子基材の製造方法は高分子支持体の材質や形態に関して広範囲に適用できることから、目的や用途に応じて種々の高分子基材を得ることが可能である。よって本発明の器材や器具は、前記ボツリヌス毒素吸着除去以外にもボツリヌス毒素の精製や分離など広範な用途に利用することができる。
本発明の高分子基材で吸着されるボツリヌス毒素は、ボツリヌス菌によって産生され、種々の型を有する神経毒素である。ボツリヌス毒素には、AからGまでの型があり、型に応じて様々な複合体を形成することが知られている。
本発明の高分子基材を備えてなる医療器具の形態としては、前記用途に適用可能な形状であれば特に限定されるものではないが、例えば中空糸モジュールや濾過カラム、フィルターなどが挙げられる。中空糸モジュールや濾過カラムにおいて、容器の形状及び材質は特に限定されないが、体液(血液)の体外循環に適用する場合、内部容量が10〜400mLで外径が2〜10cm程度の筒状容器とすることが好ましく、内部容量が20〜200mLで外径が2.5〜4cm程度の筒状容器とすることがより好ましい。
本発明の医療器具の一例を図3に示す。
(1)本発明の高分子基材としての中空糸を有するモジュールを用意し、該モジュールにボツリヌス毒素を含む液を通過させる方法
(2)流出口に液は通過できるが本発明の高分子基材は通過できないフィルターを装着し、内部に該器材を充填したカラム様容器を用意し、これにボツリヌス毒素を含む液を通過させる方法
(3)貯留バッグ等の容器を用意し、これにボツリヌス毒素を含む液と本発明の高分子基材を加えて混合した後、上澄み液を回収する方法
(1)や(2)の方法は操作が簡便である点で好ましく、体外循環回路に組み込むことにより患者の体液から効率よくインラインでボツリヌス毒素を除去することが可能である。このうち、さらに好ましい方法として(1)の方法が挙げられる。(2)や(3)の方法では、例えば血液を扱う場合、その凝固を防止するため血液を血球と血漿に分離した上で血漿のみを処理する必要があるが、(1)の方法ではこのような工程を必要とせず、操作が最も簡便でかつ患者への負担が少なくて済む。
アクリル酸モノマー5gをメタノール100mLに溶解して5[g/dL]メタノール溶液とし、窒素ガスを溶液中に導入してメタノール溶液中の溶存酸素を除去した。次にポリ−4−メチルペンテン−1製の中空糸束(中空糸面積:240cm2、DIC(株)製)をガラス製試験管に入れ、ゴム栓にて密封し、試験間内部を窒素置換した。その後、4.8MeVの加速エネルギーで90kGyの電子線を照射した。
特開2009−287011号公報(実施例1)に記載の方法に従って糖類(Gb3)固定化高分子基材を調整した。
次に、高分子支持体への高分子鎖の導入方法の異なる下記合成例を行った後に、下記試験例を行った。
即ち、先ず、下記化学式で示される6−[2−(N−Acryloylamino)ethylthio]hexyl β−D−galactopyranosyl−(1→4)−β−D−glucopyranoside(5)(以下、ラクトースモノマーという)の合成を行った。
1H−NMR(300MHz,D2O)δ6.32−6.15(m,2H),5.76(dd,1H),4.47(d,1H),4.43(d,1H),3.99−3.62(m,12),3.48(t,2H),3.30(t,1H),2.74(t,2H),2.59(t,2H),1.70−1.50(m,4H),1.40−1.30(m,4H)
13C−NMR(75MHz,D2O)δ169.4,130.8,128.3,103.8,102.9,79.4,76.2,75.6,75.36,73.7,73.4,71.8,71.4,69.4,61.9,61.4,61.0,39.7,31.9,31.2,29.5,28.5,25.4
ボツリヌス毒素の吸着能は、固定化中空糸に4℃で一夜浸漬させた上清中に残存した毒素をウサギ抗16S毒素抗体によるウエスタンブロッティングによる方法及び50,000〜100,000[LD50/mL]になるように濃度調整した毒素を一定量マウスに静脈注射し、死亡時間から吸着せずに残った毒素量を算出する方法(マウス接種法)で行った。
また、吸着試験後の溶液をマウス接種法により毒素吸着量を定量した。
本結果から、ラクトース固定化中空糸は対照の(処理前)に比し、毒素液を浸漬させた後の上清中の毒素量は、90%以上の減少が確認された。結果を表1に示す。
試験例1と同様にして、電子線を照射した中空糸に直接、アクリルアミドを重合末端に持つ糖類モノマー(5)を加えて固定化した中空糸のボツリヌス毒素に対する吸着効果を確認した。結果を、図1のウエスタンブロッティングに示すが、吸着の効果は認められなかった。図1にウエスタンブロッティングによる吸着効果を示す。
実施例2で得られたGb3固定化中空糸を用いて、ウサギ抗ボツリヌス16S毒素抗体の替わりに、ウサギ抗ボツリヌス12S毒素抗体を用いる他は、試験例1と同様にウエスタンブロッティングで確認を行った(図2)。
更に、試験例1と同様にして、吸着試験後の溶液をマウス接種法によりボツリヌス毒素吸着量の測定試験を行った。本結果から、Gb3固定化中空糸は対照の(処理前)に比し、毒素液を浸漬させた後の上清中の毒素量は、80%以上の減少が確認された。結果を表2に示す。
2:アクリル酸のみを固定化した中空糸で処理を行った上清中のボツリヌス毒素のウエスタンブロッティング
3:比較例1で作製した中空糸で処理を行ったボツリヌス毒素のウエスタンブロッティング
4:実施例1で作製した中空糸で処理を行ったボツリヌス毒素のウエスタンブロッティング
5:分子量マーカー
6:処理前の上清中のボツリヌス毒素のウエスタンブロッティング
7:実施例1で作製したアクリル酸ポリマー固定化中空糸で処理を行った上清中のボツリヌス毒素のウエスタンブロッティング
8:実施例1で作製したラクトース固定化中空糸で処理を行った上清中のボツリヌス毒素のウエスタンブロッティング
9:実施例2で作製したGb3固定化中空糸で処理を行った上清中のボツリヌス毒素のウエスタンブロッティング
10:流出口
11:流入口
12:糖類
13:中空糸
14:容器
15:隔壁
Claims (8)
- 前記高分子支持体が、オレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、スルホン系樹脂、アクリル系樹脂、ウレタン系樹脂、エステル系樹脂、エーテル系樹脂又はセルロースアセテートである請求項1に記載のボツリヌス毒素除去用高分子基材。
- 前記オレフィン系樹脂が、4−メチル−1−ペンテンの重合体である請求項2記載のボツリヌス毒素除去用高分子基材。
- 前記高分子支持体が中空糸膜又はビーズ状成型物である請求項1〜3のいずれかに記載のボツリヌス毒素除去用高分子基材。
- 前記糖類が、ラクトース、又はグロボ多糖である請求項1〜4の何れかに記載のボツリヌス毒素除去用高分子基材。
- 前記グロボ多糖が、ガラクトシルラクトース、又はガラクトシルガラクトースである請求項5に記載のボツリヌス毒素除去用高分子基材。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のボツリヌス毒素除去用高分子基材を備えてなるボツリヌス毒素除去用医療器具。
- 請求項7に記載の医療器具を用いるボツリヌス毒素を含む液から該ボツリヌス毒素を除去する方法。
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