JP2011182644A - グルタチオンの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】デンプンを炭素源として酵母を培養することにより、グルタチオンを生産する方法を提供する。
【解決手段】グルタチオン生産能を有する酵母にアミラーゼの遺伝子を導入し、アミラーゼを発現させるようにしてデンプン資化性を付与することにより、デンプンを炭素源としてグルタチオンを生産することが可能となる。
【選択図】なし

Description

本発明は酵母によるデンプンからグルタチオンを製造する方法に関する。グルタチオンは、食品又は医薬品又は化粧品として有用であり、農業分野においても有用である。

グルタチオンは、システイン、グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物などの多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸の代謝など、生体にとって重要な化合物である。そのため医薬品、食品、化粧品産業で注目されている。また、近年、グルタチオンに植物の生長を促進する効果があることなどの知見も得られるなど、農業を含めたさまざまな分野での用途が期待されている。グルタチオンは、現在工業的には、酵母を用いた発酵法により生産されている。これまでにグルタチオン生産に使用する酵母への突然変異処理（特許文献１）、グルタチオンの合成に関与する酵素を遺伝子組換えにより導入することなどにより、酵母菌体中のグルタチオン含量を向上させることにより、生産性を向上させる試みがなされてきた。

グルタチオンの発酵生産においては、炭素源としては主にグルコースが使用されるが、製造コスト削減に向け、グルコースを含有する糖蜜など比較的安価な炭素源の利用が試みられている。その一方、近年、バイオマスベースのバイオリファイナリー社会への転換が必要とされる中で、デンプンなどの糖質系バイオマスの利用が注目されている。しかし、酵母は、デンプンを直接分解、資化できないため、デンプンを炭素源として、グルタチオンを生産することは出来ない。

尚、グルコアミラーゼやα−アミラーゼを酵母に発現させ、酵母にデンプンを分解し、資化可能なグルコースを生成する能力を付与することで、デンプンを炭素源として生育させ、エタノールを生産させた報告はある（特許文献２、３）。しかし、デンプンからグルタチオンが生産された報告はなく、微生物の代謝産物の多くは、炭素源を含めた培養条件により、その生産性が大きく影響を受けることが知られており、単にデンプンの資化性の付与により、デンプンを炭素源として培養した場合、グルタチオンが生産されるかは不明であった。たとえば、デンプンからのエタノール発酵では、嫌気的発酵により酵母にエタノールを生産させているが、グルタチオン発酵のような好気的発酵では嫌気的発酵よりもグルコースを資化し生育する速度が格段に大きく、アミラーゼによるデンプンの分解能が、好気的発酵条件における酵母の生育やグルタチオンの生産に十分であるかは不明であった。

特開２００４−１８０５０９号広報 国際公開第２００２／０４２４８３号 国際公開第２００３／０１６５２５号

本発明は、豊富に存在するバイオマス資源であるデンプンを炭素源として培養することによりグルタチオンを生産する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、グルタチオンの生産能を有する酵母に、α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ発現能を付与することにより、デンプンから直接グルタチオンを発酵生産できることを見出した。また、驚くことに、デンプンから直接グルタチオンを発酵生産した場合、グルコースを炭素源とした場合よりも、グルタチオンの生産量が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］アミラーゼ遺伝子を有しデンプンを資化できる酵母を用いて、デンプンを炭素源として培養する工程を含むグルタチオンの製造方法。
［２］前記アミラーゼがグルコアミラーゼである、［１］に記載のグルタチオンの製造方法。
［３］前記アミラーゼがグルコアミラーゼおよびα−アミラーゼである、［１］に記載のグルタチオンの製造方法。
［４］前記アミラーゼが前記酵母の細胞表層に提示される、［１］〜［３］のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法。
［５］前記アミラーゼが前記酵母の細胞外に分泌される、［１］〜［４］のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法。
［６］前記グルコアミラーゼが細胞表層に提示され、前記α−アミラーゼが細胞外に分泌される、［５］に記載のグルタチオンの製造方法。
［７］前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属又はＰｉｃｈｉａ属酵母である、［１］〜［６］のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法。
［８］Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、［７］に記載のグルタチオンの製造方法。

本発明の方法によれば、可溶性デンプン、さらには生デンプンからから直接グルタチオンを発酵生産することが可能となる。特に、好適な形態では、グルタチオンの生産性が、グルコースを炭素源として用いた場合に比べ良好である。本発明の方法により、グルタチオンの生産において糖質系バイオマスであるデンプンを利用することが可能となり、バイオマスベースのバイオリファイナリー社会への転換に貢献することができる。

本発明の実施例１に係る培養中の残存糖濃度および菌濃度の経時変化を示す図である。 本発明の実施例１に係る培養中のグルタチオン濃度の経時変化を示す図である。 本発明の実施例２に係る培養中の残存糖濃度の経時変化を示す図である。 本発明の実施例２に係る培養中のグルタチオン濃度の経時変化を示す図である。

本発明のグルタチオンの製造方法は、アミラーゼ遺伝子を有しデンプンを資化できる酵母を用いて、デンプンを炭素源として培養する工程を含む。

酵母はデンプンを直接分解、資化することが出来ないが、グルタチオン生産能を有する酵母にアミラーゼの遺伝子を導入し、アミラーゼを発現させるようにしてデンプンを資化できる性質を付与することにより、デンプンからグルタチオンを生産することが可能となる。

酵母としては、糖を資化して、グルタチオンを生産する酵母であれば特に制限はなく、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｐｉｃｈｉａ属の酵母が挙げられる。このうちでも、グルタチオンの生産性の観点から、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓが好ましい。

本発明において、アミラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼが挙げられる。

グルコアミラーゼとは、グルカン１，４−α−グルコシダーゼ、１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドラーゼ、エキソ１，４−α−グルコシダーゼ、γ−アミラーゼ、リソソーマルα−グルコシダーゼあるいはアミログルコシダーゼとも呼ばれ、デンプンの非還元末端の１，４−α結合を分解してグルコースを切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。このような活性を有していれば、その起源は限定されないが、微生物由来のグルコアミラーゼが好適に用いられ、例えば、ＲｈｉｚｏｐｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどのカビ由来のグルコアミラーゼが好ましい。

α−アミラーゼとは、１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドラーゼ、グリコゲナーゼデンプンとも呼ばれ、デンプンのα１，４−グルコシド結合を分解して多糖ないしオリゴ糖生成するエンド型の加水分解酵素である。この活性を有していれば、その起源は限定されず、例えば、動物（唾液、膵臓）、植物（麦芽など）、および微生物由来のα−アミラーゼが用いられる。その起源は特に限定されないが、微生物由来のα−アミラーゼが好適に用いられ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−アミラーゼが好ましい。

前記アミラーゼ遺伝子を有しデンプンを資化できる酵母としては、例えばアミラーゼをコードする遺伝子を導入して形質転換された酵母を使用することができる。また、細胞外に存在するデンプンを効率よく分解できる点で、アミラーゼを細胞表層に提示、または細胞外に分泌するように形質転換したグルタチオン生産能を有する酵母であることが好ましい。このような酵母は、アミラーゼを細胞表層に提示するように組換えられたＤＮＡ、またはアミラーゼを細胞外に分泌するように組換えられたＤＮＡを、グルタチオン生産能を有する酵母に導入することにより得られる。また、アミラーゼとして、グルコアミラーゼとα−アミラーゼを導入する場合、α−アミラーゼは細胞外に分泌されることが好ましく、更には、グルコアミラーゼとα−アミラーゼともに細胞外に分泌されることが好ましい。

本発明の製造方法で使用する酵母は、例えば、グルコアミラーゼを細胞表層に提示し、かつα−アミラーゼを分泌するように形質転換された酵母であってもよい。このような酵母は、グルコアミラーゼを細胞表層に提示するように組換えられたＤＮＡと、α−アミラーゼを分泌するように組換えられたＤＮＡとを酵母に導入することにより、得られる。

また、本発明の製造方法で使用する酵母は、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼをともに分泌するように形質転換された酵母であってもよい。このような酵母は、グルコアミラーゼを分泌するように組換えられたＤＮＡと、α−アミラーゼを分泌するように組換えられたＤＮＡとを酵母に導入することにより、得られる。

細胞表層に酵素を提示する一般的な方法について説明する。細胞表層に酵素を提示する方法には、（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して酵素を細胞表層に提示する方法、および（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して酵素を細胞表層に提示する方法がある。１種の酵素を細胞表層に提示する場合は、（ａ）および（ｂ）のいずれの方法を用いてもよい。なお、２種の酵素を細胞表層に提示する場合は、（ｂ）の方法によって融合タンパク質と発現することが好ましい。

用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の凝集性タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン、ＦＬＯタンパク質（例えば、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０、およびＦＬＯ１１）、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。

（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法
ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ−ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元部が切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。

ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ−ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。

ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα−アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列が特に有用である。

従って、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的とする酵素の構造遺伝子の配列で置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的の酵素を細胞表層に提示する組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα−アグルチニンである場合、上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的の酵素遺伝子を導入することが好ましい。

この目的とする酵素の構造遺伝子として、グルコアミラーゼ遺伝子を用いると、ＧＰＩアンカーを介して細胞表層にグルコアミラーゼを提示する組換えＤＮＡが得られる。

（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法
細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。

上記（ａ）または（ｂ）の方法によって、細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）と目的の酵素とを結合することにより、細胞表層に酵素が提示される。目的の酵素の種類により、細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側に酵素を結合させる、（２）Ｃ末端側に酵素を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なる酵素を結合させることができる。

従って、例えば、
（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素の構造遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子、
（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素の構造遺伝子、
（３）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素の構造遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする他の酵素の構造遺伝子、
などのＤＮＡ配列を作製することにより、細胞表層に目的の酵素を提示する組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、存在してもよいし、存在しなくてもよい。

この目的とする酵素の構造遺伝子として、グルコアミラーゼ遺伝子を用いると、糖鎖結合タンパク質ドメインを利用して、細胞表層にグルコアミラーゼを提示する組換えＤＮＡが得られる。あるいは、糖鎖結合タンパク質ドメインのＮ末端およびＣ末端に、それぞれグルコアミラーゼ構造遺伝子とα−アミラーゼ構造遺伝子とを有する組換えＤＮＡが得られ、融合タンパク質として両酵素を細胞表層に発現することもできる。

上記組換えＤＮＡに用いられる分泌シグナル配列は、細胞表層局在タンパク質の分泌シグナル配列を用いてもよいし、発現した酵素を細胞外へ導くことができる他の分泌シグナル配列を用いてもよい。例えば、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列、酵母のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナル配列、リパーゼの分泌シグナル配列が好適に用いられる。酵素活性に影響を及ぼさないのであれば、細胞表層提示後に分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残ってもよい。

酵母にアミラーゼ類（グルコアミラーゼ、α−アミラーゼなど）を分泌させる場合、上記分泌シグナル配列をコードするＤＮＡに、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼなどの目的の酵素の構造遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作製し、酵母に導入する。

酵母においてアミラーゼを発現させるために使用するＤＮＡの合成は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。例えば、分泌シグナル配列とグルコアミラーゼあるいはα−アミラーゼの構造遺伝子との結合は、部位特異的突然変異法を用いて行うことができる。この方法を用いることにより、正確な分泌シグナル配列の切断および活性を有するグルコアミラーゼあるいはα−アミラーゼの発現が可能である。

上記の目的とする配列（組換えＤＮＡ）は、好ましくは、ベクターに組み込まれる。ＤＮＡの取得を容易にする点からは、大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましく、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製起点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製起点とを有し、さらに酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、ＴＲＰ、ＬＥＵ２など）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有することがさらに好ましい。

グルコアミラーゼあるいはα−アミラーゼ構造遺伝子を発現させるために、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列を含んでいることが望ましい。例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターとＧＡＰＤＨターミネーターとを含むプラスミドｐＹＧＡ２２７０またはｐＹＥ２２ｍ、あるいはＵＰＲ−ＩＣＬ（イソクエン酸リアーゼ上流領域）配列とＴｅｒｍ−ＩＣＬ（イソクエン酸リアーゼのターミネーター領域）配列とを含むプラスミドｐＷＩ３が挙げられる。

酵母の細胞表層に酵素を提示する場合、最も好適には、プラスミドｐＹＧＡ２２７０またはｐＹＥ２２ｍのＧＡＰＤＨプロモーターとＧＡＰＤＨターミネーターの配列の間に、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡと、アミラーゼの構造遺伝子配列を有する配列と、α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸をコードする配列とを結合した配列を挿入すれば、酵母に導入するためのベクターが製造される。

酵母菌体外に酵素を分泌する場合、最も好適には、プラスミドｐＧＫ４０６（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）のＰＧＫプロモーターとＰＧＫターミネーターの配列の間に、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡと、アミラーゼの構造遺伝子配列を有する配列とを結合した配列を挿入すれば、酵母に導入するためのベクターが製造される。

ベクターは、マルチコピー型および染色体組込み型がある。どの型のベクターにどの遺伝子を組込むかは、当業者が適宜決定すればよいが、目的とする配列（組換えＤＮＡ）は、酵母の染色体に組み込まれる方がプラスミドとして保持されるよりも安定である。また、コピー数が多い方が転写効率や翻訳効率が高いため、目的とする配列をベクター上でδ配列と結合させることがより好ましい。細胞表層に提示される酵素と分泌される酵素とは、同一のベクターに組込まれてもよく、それぞれ異なるベクターに組込まれてもよい。

宿主の酵母としては、糖を資化してグルタチオン発酵能を有する酵母であれば、どのような酵母でもよい。非凝集性および凝集性の酵母が用いられる。非凝集性の酵母としては、特に制限はないが、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＴ８−１などが挙げられる。凝集性の酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ６０７１５、同ＡＴＣＣ６０７１２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ１９５３、同ＣＧ１９４５、同ＨＦ７Ｃなどが挙げられる。本発明者らが取得した非凝集性酵母ＹＰＨ４９９／ｐδＷＧＰＳＢＡ，ｐδＵＰＧＧｌｕＲ株は、グルコアミラーゼ構造遺伝子およびα−アミラーゼ構造遺伝子にδ配列を結合させることで、染色体に当該遺伝子がマルチコピーで安定的に保持され、さらに発酵能が非常に高い。従って、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼを分泌するように組換えられた非凝集性酵母ＹＰＨ４９９／ｐδＷＧＰＳＢＡ，ｐδＵＰＧＧｌｕＲ株を用いた場合は、グルタチオンの生産性は非常に高くなる。

本発明のグルコアミラーゼを細胞表層に提示し、かつα−アミラーゼを分泌する酵母、あるいはグルコアミラーゼおよびα−アミラーゼを分泌する酵母（以下、これらをまとめて本発明の酵母という）は、上記それぞれの酵素をコードするＤＮＡを有する組換えＤＮＡ（ベクター）を、酵母に同時にまたは別々に導入することにより得られる。

ＤＮＡの導入の方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる形質転換方法、プロトプラスト法などがある。

組換えＤＮＡ（ベクター）が導入された酵母は、選択マーカー（例えばＴＲＰ、ＵＲＡ）で選択される。グルコアミラーゼが細胞表層に提示されていることは、細胞を洗浄した後に、例えば抗グルコアミラーゼ抗体とＦＩＴＣ標識抗体とを用いる免疫抗体法によって確認し得る。また、グルコアミラーゼあるいはα−アミラーゼが分泌されていることも、細胞を除去した培養液について、例えば抗グルコアミラーゼ抗体あるいは抗α−アミラーゼ抗体を用いる免疫抗体法によって確認し得る。

アミラーゼを発現する酵母を使用することにより、デンプンを炭素源として培養し、グルタチオンを製造することができる。酵母の培養を行う際は、まず、好気的条件下でグルコースを炭素源として酵母を培養し、その数を増加させる。培地は、選択培地であっても非選択培地であってもよい。

次いで、本発明の酵母を、好気的条件下でデンプンを炭素源として発酵させて、グルタチオンを生産させる。好気的条件下での培養で使用する培地成分としては、炭素源として、デンプンが使用される。培地中のデンプン濃度は特に限定されず、酵母の生育速度、培養時間に応じた濃度とすればよい。デンプンは炭素源として培地に含まれていればよく、他の炭素源と共に含まれていてもよいし、唯一の炭素源として含まれていてもよい。前記他の炭素源としては、通常の酵母の培養に用いられるグルコース、蔗糖、エタノール、糖蜜などが挙げられる。本発明の酵母は、デンプンを炭素源として生育可能であり、培養時の培地中のデンプン濃度は、約１〜約５０ｇ／ｌ、好ましくは約２〜約４０ｇ／ｌ、さらに好ましくは約１０〜約２０ｇ／ｌである。
デンプンを炭素源として培養する工程で使用する培地には、無機塩類、窒素源などが含まれてもよい。無機塩類としては、カリウム、マグネシウム、亜鉛、銅、マンガン、鉄などが挙げられる。無機塩の具体例として、リン酸カリウム、リン酸アンモニウムなどのリン酸成分が挙げられる。窒素源として、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機塩類、および酵母エキス、ペプトン、カゼイン、コーンスティープリカーなどの含窒素有機物などからなる群より選ばれる１種又は２種以上が使用される。

培養時の培地のｐＨは、好ましくは約３．０〜約８．０、より好ましくは約４．０〜約６．０、最も好ましくは約５．０である。好気的培養時の培地への通気量は、培地１Ｌに対し、好ましくは０．２Ｌ／分以上、より好ましくは０．５Ｌ／分以上、さらに好ましくは１Ｌ／分以上である。また、２Ｌジャーファーメンターを使用して培養する場合、好気的培養としては、上記通気量に加え、攪拌数は、好ましくは２００ｒｐｍ以上、より好ましくは３００ｒｐｍ以上、さらに好ましくは４００ｒｐｍ以上である。また、培養時の温度は、約２０〜約４５℃、好ましくは約２５〜約３５℃、最も好ましくは約３０℃である。培地中の初期細胞濃度（仕込み濃度）は、酵母の種類、培地中のデンプン濃度などにより異なるが、初期ＯＤ_６００は、０．０１〜２．０、好ましくは、０．０２〜１．０、より好ましくは０．１〜０．４である。

発酵の進行とともに上記の発酵条件が変化するので、これらを一定の範囲に調節することが好ましい。発酵の経時変化は、例えば、ＨＰＬＣなどの当業者が通常用いる手段でモニターすればよい。

以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（製造例１：α−アミラーゼを分泌し、グルコアミラーゼを細胞表層提示する酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９／ｐＩＵ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡの作製）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ由来のα−アミラーゼを分泌し、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼを細胞表層に提示する活性を酵母に付与するプラスミドｐＩＵ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡは、非特許文献Ａ（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００９）４４：３４４−３４９）に記載のものを用いた。ｐＩＵ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡを制限酵素ＳｔｕＩにて消化した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９を宿主酵母株とし、形質転換を行った。得られた形質転換体ＹＰＨ４９９／ｐＩＵ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡをα−アミラーゼのハローアッセイによるスクリーニングを行った。α−アミラーゼのハローアッセイでは、得られた形質転換体をブルーデンプンプレート（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製）、２０ｇ／Ｌ寒天（ナカライテスク（株）製）、２．５ｇ／Ｌレマゾールブリリアントブルーデンプン（ナカライテスク（株）製））にスポット化し、３０℃、１日間培養し、ハローを観察した。最も大きなハローを形成した菌体を最優秀株として選抜した。

（実施例１：可溶性デンプンからのグルタチオン生産）
製造例１で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐＩＵ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡをＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌグルコース）５ｍｌで３０℃、１６時間振盪培養し、次にＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））３０ｍｌにＯＤ_６００＝０．１となるよう植菌し、３０℃、２２時間振盪することにより種母培養を行った。次いで、可溶性デンプンを単一炭素源とするＹＰＳＳ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌ可溶性デンプン（和光純薬（株）製））１Ｌを含む２Ｌジャーファーメンター（ＢＭＪ−０２ＰＩ，Ｂｉｏｔｔ Ｃｏｒｐ．、東京）に、ＯＤ_６００＝０．１となるよう植菌し、３０℃、攪拌４００ｒｐｍ、通気２Ｌ／ｍｉｎの条件で培養を行った。培養液を経時的にサンプリングして、グルタチオン濃度、菌濃度（ＯＤ_６００）、培養液中の全糖濃度を測定した。

培養液中の残存糖濃度および菌濃度（ＯＤ_６００）を図１に示す。

培養中の培養液中のグルタチオン濃度（ｍｇ／Ｌ）を図２に示す。

図１、図２からわかるように、α−アミラーゼ遺伝子およびグルコアミラーゼ遺伝子をグルタチオン生産能を有する酵母に導入することにより、デンプンを直接資化し、増殖し、培養９６時間でグルタチオン６３ｍｇ／Ｌが生産された。

（グルタチオン濃度測定法）
サンプリングした培養液１０ｍｌを遠心分離により上清を除去した後、蒸留水で沈殿した菌体を懸濁、再遠心することにより洗浄した。本洗浄操作を２回繰返した後、遠心分離後に沈殿する菌体を−８０℃で冷凍保管し、凍結乾燥後、得られる凍結乾燥物に５ｍｌ（移動層 ３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．２０％（ｗ／ｖ）１−ヘプタンスルホン酸Ｎａ，９６．８％リン酸二水素カリウム緩衝液（ｐＨ ２．８））を添加、懸濁し、その１ｍｌを８５℃で５分間熱処理後に遠心分離し、その上清中のグルタチオンを高速液体クロマトグラフィーにて分析した。

（糖濃度測定法）
サンプリング液を蒸留水にて２００倍に希釈し、得られた希釈液２００μｌに５ｗｔ％フェノール２００μｌを添加後、濃硫酸１ｍｌを素早く加え、攪拌し、室温で１０分、３０℃で２０分静置後、波長４９０ｎｍでの吸光度を測定し、スタンダードの吸光度と比較し、糖濃度を算出した。

（菌体濃度）
菌体濃度は６００ｎｍの吸光度を測定することによって求めた。

（製造例２：α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼを分泌する酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９／ｐδＷＧＰＳＢＡ，ｐδＵＰＧＧｌｕＲの作製）
まず、非特許文献Ｂ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）８５：１４９１−１４９８）に記載のグルコアミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＩＵＰＧＧｌｕＲＡＧをテンプレートとし、プライマーとして５’−ＴＡＴＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧ−３’（配列番号１）および５’−ＴＡＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号２）を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化して約１８６０ｂｐのグルコアミラーゼ遺伝子ＥｃｏＲＩ―ＮｈｅＩ断片を得た。この断片は、グルコアミラーゼ構造遺伝子のＮ末端にグルコアミラーゼの分泌シグナル配列を含む。この断片を非特許文献Ｃ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＥｃｏＲＩ―ＮｈｅＩ消化部位に連結し、グルコアミラーゼ分泌シングルコピープラスミドｐＩＵＰＧＧｌｕＲを得た。次にｐＩＵＰＧＧｌｕＲをＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化してグルコアミラーゼ遺伝子ＮｏｔＩ―ＸｈｏＩ断片を得た。この断片は、グルコアミラーゼ構造遺伝子のＮ末端にグルコアミラーゼの分泌シグナル配列を含む。この断片を非特許文献Ｂ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）８５：１４９１−１４９８）に記載のｐδＵのＮｏｔＩ―ＳａｌＩ消化部位に連結し、グルコアミラーゼ分泌マルチコピープラスミドｐδＵＰＧＧｌｕＲを得た。

得られたｐδＵＰＧＧｌｕＲおよび非特許文献Ｂ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）８５：１４９１−１４９８）に記載のαアミラーゼ分泌マルチコピープラスミドｐδＷＧＰＳＢＡを制限酵素ＡｓｃＩにて消化した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９を宿主酵母株とし、形質転換を行った。得られた形質転換体ＹＰＨ４９９／ｐδＷＧＰＳＢＡ，ｐδＵＰＧＧｌｕＲをα−アミラーゼ活性およびグルコアミラーゼ活性の強い形質転換体のハローアッセイによるスクリーニングを行った。ハローアッセイでは、得られた形質転換体をブロモクレゾールパープルプレート（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製）、２０ｇ／Ｌ寒天（ナカライテスク（株）製）、０．０４ｇ／Ｌブロモクレゾールパープル（ナカライテスク（株）製））にスポット化し、３０℃、１日間培養し、ハローを観察した。最も大きなハローを形成した菌体を最優秀株として選抜した。

（実施例２：生デンプンからのグルタチオン生産）
（比較例１：グルコースからのグルタチオン生産）
製造例２で取得した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ｐδＷＧＰＳＢＡ，ｐδＵＰＧＧｌｕＲをＬ−トリプトファンおよびウラシルを含まない適切なアミノ酸および塩基を補充したＳＤ−Ｕ，Ｗ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２％グルコース、０．０２ｇ／Ｌ硫酸アデニン、０．０２ｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ、０．０３ｇ／Ｌ Ｌ−ロイシン、０．０２ｇ／Ｌ Ｌ−リジン）５ｍｌに植菌し、３０℃、１５時間、振盪培養し、次にＳＤ−Ｕ，Ｗ培地６０ｍｌにＯＤ_６００＝０．２となるよう植菌し、３０℃、２４時間振盪することにより種母培養を行った。

次いで、生デンプンを単一炭素源とするＹＰＲＳ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌ生デンプン（和光純薬（株）製））１Ｌを含む２Ｌジャーファーメンター（ＢＭＪ−０２ＰＩ，Ｂｉｏｔｔ Ｃｏｒｐ．、東京）、および、グルコースを単一炭素源とするＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース）１Ｌを含む２Ｌジャーファーメンター（同上）に、それぞれＯＤ_６００＝０．２となるように植菌し、３０℃、攪拌４００ｒｐｍ、通気 ２Ｌ／ｍｉｎの条件にて培養した。培養液を経時的にサンプリングして、グルタチオン濃度、糖濃度を測定した。

培養液中の残存糖濃度を図３、グルタチオン濃度を図４に示す。α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼを組込んだ酵母は生デンプンを効率的に資化した。また、グルコースを炭素源にした場合と比べ生デンプンを炭素源とした方がグルタチオンの生産量は高く、４８時間目に７４ｍｇ／Ｌのグルタチオンを生産した（グルコースを炭素源とした場合、グルタチオン生産量は４８時間目で４２ｍｇ／Ｌ）。

Claims (8)

1. アミラーゼ遺伝子を有しデンプンを資化できる酵母を用いて、デンプンを炭素源として培養する工程を含むグルタチオンの製造方法。
2. 前記アミラーゼがグルコアミラーゼである請求項１に記載のグルタチオンの製造方法。
3. 前記アミラーゼがグルコアミラーゼおよびα−アミラーゼである請求項１に記載のグルタチオンの製造方法。
4. 前記アミラーゼが前記酵母の細胞表層に提示される、請求項１〜３のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法。
5. 前記アミラーゼが前記酵母の細胞外に分泌される、請求項１〜４のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法。
6. 前記グルコアミラーゼが細胞表層に提示され、前記α−アミラーゼが細胞外に分泌される、請求項５に記載のグルタチオンの製造方法。
7. 前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属又はＰｉｃｈｉａ属酵母である、請求項１〜６のいずれかに記載のグルタチオンの製造方法。
8. Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項７に記載のグルタチオンの製造方法。

Images