JP2011148790A - 活性酸素産生抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】優れた活性酸素産生抑制剤を提供すること。
【解決手段】エルゴステロールを有効成分とする活性酸素産生抑制剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、活性酸素産生を抑制する活性酸素産生抑制剤及び酸化ストレス改善剤に関する。

生体内で産生される活性酸素は、生体調節、抗菌活性、抗ウイルス活性等の生体の恒常性維持に利用されるが、ストレス、紫外線被爆等によってその産生が過剰となると、核酸分解、タンパク質変性、脂質過酸化等を引き起こして細胞にダメージを与え、様々な病態を誘引する一因となってしまう。

体内で過剰な活性酸素が産生されることが発症や症状の進展に関与していると考えられている疾患には、循環器疾患、脳神経系疾患、消化器系疾患、腎疾患、呼吸器系疾患、代謝・内分泌疾患、アレルギー疾患、眼疾患、老化・老人性疾患等がある（非特許文献１）。

このため、過剰な活性酸素産生を抑制することは、上記のような疾患の予防、改善や治療につながると考えられ、活性酸素産生を抑制する物質に関する研究開発が進められている。

ところで、エルゴステロールは、キノコや酵母などの菌類に含有されるステロールの一種である。このエルゴステロール又はその配糖体は、ヒアルロン酸分解阻害効果（特許文献１）、発毛・育毛効果（特許文献２）、光老化により出現するシワ改善効果（特許文献３）、アディポネクチン分泌促進効果（特許文献４）を有することが知られている。また、エルゴステロールと類似の構造を持つ植物ステロールに、スーパーオキシド消去能があることが報告されている（特許文献５）。

しかしながら、エルゴステロールが、活性酸素産生抑制能を有することについては全く知られていない。

特開平１１−１０６３９６号公報 特開平７−１０９２９３号公報 特開２００５−２２００４３号公報 特開２００５−６８１２号公報 特開２００６−３４７４９２９号公報

板倉 弘重、Ｅｉｙｏ−Ｈｙｏｕｋａ Ｔｏ Ｔｉｒｙｏ．Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．３，２９３−２９８，２００２

本発明は、体内に過剰に産生される活性酸素を抑制する活性酸素産生抑制剤又は酸化ストレス改善剤を提供することにある。

本発明者は、活性酸素産生抑制作用を有する物質の検討を行なったところ、エルゴステロールがシトステロールやスティグマステロールなどエルゴステロールと構造が類似した植物ステロール類よりも際だって優れた活性酸素産生抑制作用を示し、活性酸素産生抑制効果を発揮する医薬品、食品、飲料等として又はこれらのための素材として有効であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、エルゴステロールを有効成分とする活性酸素産生抑制剤を提供するものである。

また、本発明は、エルゴステロールを有効成分とする抗酸化ストレス改善剤を提供するものである。

本発明の活性酸素産生抑制剤又は酸化ストレス改善剤は、体内で産生される活性酸素を抑制することができるので、循環器疾患、アレルギー疾患、老化・老人性疾患等の活性酸素過剰産生によって誘発又は助長される症状及び疾患の発症リスクの低下、予防、治療又は改善効果を発揮する食品、飲料、医薬品等に配合して用いる素材等として有用である。

エルゴステロール、シトステロール、スティグマステロールの各濃度における白血球画分を用いた際の活性酸素産生抑制効果を示す。コントロール（無添加）における活性酸素産生量を、活性酸素産生抑制率０％とした。 エルゴステロール、シトステロール、スティグマステロールの各濃度におけるキサンチンオキシダーゼによるスーパーオキシド産生に対する消去作用を示す。コントロール（無添加）におけるスーパーオキシド産生量を、スーパーオキシド産生抑制率０％とした。

本発明に用いるエルゴステロールは、

で表される化合物である。当該エルゴステロールは、シイタケやマイタケ等の担子菌類や酵母等の子嚢菌類などの菌類に含まれるものである。また、当該エルゴステロールは、エルゴステロールの３位の水酸基と１〜５糖のヘミアセタール又はヘミケタール性水酸基との脱水縮合で生成されたエルゴステロール配糖体であってもよい。さらに、エルゴステロールの３位の水酸基に脂肪酸がエステル結合したエルゴステロール脂肪酸エステルであってもよい。ここで、エステル結合した脂肪酸としては、担子菌類や子嚢菌類などの菌類に含まれる脂肪酸であれば特に制限されず、炭素数１４〜２２の飽和又は不飽和の直鎖の脂肪酸等が挙げられる。

本発明に用いるエルゴステロールには、公知の化学合成法により得られるものや、エルゴステロールを含有する菌類等から抽出や精製により得られるもの等も包含される（特許文献１〜５参照）。また、エルゴステロールとして、市販品、化学合成品、抽出物やその精製物を使用することもできる。

菌類等からエルゴステロールを抽出するための抽出溶剤としては、極性や非極性溶剤の何れを用いてもよいが、例えば、水；メタノール、エタノール、ブタノール、酢酸エチル等の水溶性有機溶剤；ヘキサン、ジエチルエーテル等の疎水性有機溶剤等を用いるのが好ましく、このうち疎水性有機溶剤を用いるのが回収率向上の点から好ましい。これらを単独で又は２種以上組み合わせて用いてもよい。また、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する方法を併用してもよい。

抽出手段は、例えば、エルゴステロールを含有する菌類等１質量部に対して１〜５０質量部の溶剤を用い、０（好ましくは２０℃）〜溶媒の沸点の範囲で１時間〜３日間浸漬又は５分〜２時間加熱還流するのが好ましい。

分離精製手段としては、例えば、活性炭処理、液液分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、精密蒸留等が挙げられる。

本発明のエルゴステロールは、後記実施例に示すとおりエルゴステロールに、シトステロール、スティグマステロールなどの植物ステロール類よりも、白血球から産生される活性酸素を強く抑制する作用、すなわち優れた活性酸素産生抑制作用が認められたことから、活性酸素産生抑制剤又は酸化ストレス改善剤（以下、「活性酸素産生抑制剤等」とする。）として使用することができ、更にこの製剤を製造するために使用することができる。このとき、当該活性酸素産生抑制剤等には、当該エルゴステロールを単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。

当該活性酸素産生抑制剤等は、生体内において活性酸素によって誘発又は助長される疾患、例えば動脈硬化、糖尿病、高脂血症及び癌等の生活習慣病の発症リスクの低下、予防、改善又は治療のための食品、機能性食品、医薬部外品、医薬品、飼料等の有効成分として配合して使用可能である。また、活性酸素産生抑制剤等は、生活習慣病予備軍（生活習慣病には至っていないがその状態に近い（境界領域）の集団）に対しても有用である。さらに、当該食品は、活性酸素産生抑制、生活習慣病等の発症リスクの低下、予防、改善や治療をコンセプトとして、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。

ここで、「生体内において活性酸素によって誘発又は助長される疾患」としては循環器疾患、脳神経系疾患、消化器系疾患、腎疾患、呼吸器系疾患、代謝・内分泌疾患、アレルギー疾患、眼疾患、老化・老人性疾患等が挙げられる（非特許文献１）。

また、「酸化ストレス」とは、生体内の活性酸素産生系と消去系とのバランスが崩れ、過剰な活性酸素が産生されるようになった、生体にとって好ましくない状態を云う。「酸化ストレスを改善する」と云うのは、この崩れたバランスを正常の状態に戻すことを主として云う。酸化ストレスの指標の例には、過酸化脂質、８−ＯＨｄＧ、イソプラスタン、ヒドロペルオキシドなどがあり、酸化ストレス状態としては、生体内でこれらが上昇している状態が挙げられる。

本発明の活性酸素産生抑制剤等を、医薬品の有効成分として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば、経口、経腸、経粘膜、経皮、注射等が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。また非経口投与のものとしては、例えば、静脈内注射剤、筋肉注射剤、座剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。

また、斯かる製剤では、本発明の活性酸素産生抑制剤等を単独で、又は他の薬学的に許容され得る担体とを適宜組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。

これらの投与形態のうち、経口投与が好ましく、経口投与剤として用いる場合の該製剤中の本発明の血圧低下剤の有効成分であるエルゴステロールの含有量は、通常乾燥物換算で、製剤全質量の０．０１〜１００質量％であるのが好ましく、０．０５〜５０質量％であるのがより好ましく、０．１〜３０質量％であるのが更に好ましく、０．５〜２０質量％であるのがより更に好ましい。

上記製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当りの１日の投与量は、通常乾燥物換算で、有効成分エルゴステロールとして３〜３００ｍｇであるのが好ましく、１０〜２００ｍｇであるのがより好ましく、２０〜１００ｍｇであるのが更に好ましい。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与させ得るが、１日１回〜数回投与するのが好ましく、その投与間隔は３〜１８時間が好ましく、４〜６時間がより好ましい。

本発明の活性酸素産生抑制剤等を、食品の有効成分として用いる場合、当該食品の形態は、固形、半固形又は液状でもよい。食品の例としては、パン類、麺類、菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、澱粉加工製品、加工肉製品、その他加工食品、飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、及びそれらの原料が挙げられる。また、上記経口投与製剤と同様のように、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。

種々の形態の食品を調製するには、本発明の活性酸素産生抑制剤等を単独で、またはこれと食品に許容され得るもの、例えば他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油脂、乳化剤、防腐剤、香料、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて使用してもよい。

また、食品中の本発明の血圧低下剤の有効成分であるエルゴステロールの含有量は、通常乾燥物として、飲料等の液状形態の場合、飲料中、０．０１〜１０質量％であるのが好ましく、０．０１〜１０質量％であるのがより好ましく、０．０５〜２質量％であるのが更に好ましく、０．１〜０．５質量％であるのがより更に好ましい。また、錠剤や加工食品等の固形又は半固形形態の場合、全組成物中、０．０１〜５０質量％であるのが好ましく、０．０５〜２５質量％であるのがより好ましく、０．１〜１０質量％であるのが更に好ましく、０．３〜５質量％であるのがより更に好ましい。

また、本発明の活性酸素産生抑制剤等を飼料の有効成分として用いる場合には、当該飼料としては、例えば牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。

尚、飼料を製造する場合には、エルゴステロールの含有量の他に、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を必要に応じて配合し、常法により当該飼料を加工製造することができる。

また、飼料中におけるエルゴステロールの含有量は、その使用形態により異なるが、通常、通常０．００１〜５０質量％であり、０．０１〜１０質量％が好ましく、０．０５〜１質量％がより好ましい。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１：エルゴステロールの活性酸素産生抑制試験

試料として、エルゴステロール（東京化成工業社製）を用いた。比較試料として、植物ステロール類のシトステロール（ＡＣＲＯＳ社製）、スティグマステロール（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。

動物は、ＳＤラット（１０〜１６週齢、雄）を使用した。当該ＳＤラットから、イソフルラン（アボットジャパン社製）麻酔下で、頚動脈採血を行った。この血液サンプルを、血球分離用試薬（ＳＩＧＭＡ社製）に重層して遠心分離した後、白血球画分を回収した。

回収した白血球画分に、エルゴステロール、シトステロール、スティグマステロールをそれぞれ１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬとなるよう加え、室温で１時間反応させた。その後、蛍光試薬１０μＭ ５−（および６−）クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン・ジアセテート、アセチルエステル（５，６−ＣＭ−Ｈ₂ＤＣＦＤＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を室温で２０分作用させてから、１０容量％（ｖ／ｖ）固定試薬（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加し室温で２０分作用させた。蛍光試薬添加から固定試薬添加までの間に白血球細胞内で産生された活性酸素量を、Ｆｌｏｗｃｙｔｅｍｅｔｏｒｙ（フローサイトメーター：機種名 ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にて測定した。

試料無添加にて上記と同様にして細胞内の活性酸素を測定し、無添加（コントロール）における活性酸素産生量を、活性酸素産生抑制率０％とした。白血球から産生される活性酸素の抑制能について検討することにより、ＳＯＤ様活性のようにスーパーオキシドを直接消去するだけでなく、活性酸素産生酵素の発現を抑制する、活性酸素消去酵素の発現を亢進する、活性酸素産生酵素の構造に作用し活性を抑制する、活性酸素消去酵素の構造に作用し活性を亢進するような素材も検出することが可能である。

図１に示すように、エルゴステロールを１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬで白血球画分に添加したとき、いずれも産生される活性酸素を抑制した。これら各濃度の活性酸素産生抑制率は、コントロールの活性酸素産生抑制率を０％とした場合、１μｇ／ｍＬで１６．５％、１０μｇ／ｍＬで３０．６％、１００μｇ／ｍＬで２９．７％であり、何れの濃度でも産生される活性酸素が有意に抑制された。これに対し、シトステロール、スティグマステロールを添加したときの活性酸素産生抑制率は、１μｇ／ｍＬでは、それぞれ８．５％、６．７％；１０μｇ／ｍＬでは、それぞれ−５．５％、３．３％；１００μｇ／ｍＬでは、それぞれ１１．２％、８．０％であった。

実施例２：エルゴステロールのスーパーオキシド産生抑制試験

エルゴステロール、シトステロール、スティグマステロールを反応液２００μＬ中で終濃度１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ２０μＬずつ９６ｗｅｌｌプレートに分注した。５０μＭ Ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製）を２０μＬ（終濃度５μＭ）添加し、３７℃で１０分間静置後、２２ｍＵ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ（ＷＡＫＯ社製）を２０μＬ（終濃度２．２ｍＵ／ｍＬ）加えた。反応は５００μＭ Ｘａｎｔｉｎｅ−１００μＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液中で行い、５分間のスーパーオキシド産生量を測定した（ＢＥＲＴＨＯＬＤ ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０、ベルトールドジャパン株式会社製）。結果は、コントロールに対するスーパーオキシド産生抑制率（％）で示した。

図２に示すように、いずれの剤においても１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬではスーパーオキシドを抑制しなかった。エルゴステロールとスティグマステロール２００μｇ／ｍＬでは、コントロールと比べてスーパーオキシドを１５．５％、６．１％抑制した。

よって、エルゴステロールには、構造が類似しているシトステロール及びスティグマステロールなどの植物ステロールよりも、はるかに強い活性酸素産生抑制作用が認められた。エルゴステロール、スティグマステロール、シトステロールのうち、エルゴステロールのみが強い活性酸素産生抑制能を示したが、この濃度付近におけるスーパーオキシド産生抑制活性についてはそれぞれ同程度であったことから、エルゴステロールは白血球細胞を用いるような生体反応を反映した条件で植物ステロールよりも効果を有すると考えられた。しかも、エルゴステロールは、食経験の豊富なキノコ類等の食品に含まれているので安全性が高く、これを有効成分とする製剤は、過剰な活性酸素の産生が発症の一因であるといわれている虚血性心疾患、腎疾患や老化等の多くの疾病や症状等を予防、改善又は治療するための飲食品、医薬部外品、医薬品等の有効成分として又は素材として使用することができる。

Claims (2)

1. エルゴステロールを有効成分とする活性酸素産生抑制剤。
2. エルゴステロールを有効成分とする抗酸化ストレス改善剤。

Images