JP2011105761A - 神経変性疾患を治療する方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】神経変性障害の治療のなどのためにα−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供すること。
【解決手段】ＳＮＣＡ遺伝子を標的とする本発明で特徴とされる抗ＳＮＣＡ剤は、神経細胞に優先的に分布するように修飾されていてもよい。１つの態様において、本発明は、ＳＮＣＡの発現を阻害する薬剤を投与することによって対象を治療する方法を特徴とする。好ましい実施形態において、対象はヒトなどの哺乳動物、例えば、神経変性障害を有するか、または神経変性障害を発症するリスクがあると診断された対象である。
【選択図】なし

Description

本発明は、神経変性疾患を治療するための方法および組成物に関し、より詳細には、シ
ヌクレノパシーの治療のためのα−シヌクレイン遺伝子のダウンレギュレーション（下方
制御）に関する。
［関連出願］
本願は、２００３年６月９日に出願された米国仮特許出願番号第６０／４７６，９４７
号の利益を主張する。この仮出願の内容はその全体を本願明細書に援用する。
［政府の支援］
本明細書に記載の研究は、米国国立環境衛生科学研究所（National Institute of Envi
ronmentalHealth Sciences ）によって授与された助成金番号ＥＳ１０７５１、ならびに
米国国立神経疾患卒中研究所（Neurological Disorders and Stroke ）によって授与され
た助成金番号ＮＳ３３９７８およびＮＳ４０２５６の下で、米国政府からの補助金を少な
くとも部分的に使用して実行された。それゆえに、米国政府は本発明において一定の権利
を有し得る。
［背景］
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が線虫に導入されると
遺伝子発現をブロックすることが可能であるという観察を説明するために、ファイア（Ｆ
ｉｒｅ）および共同研究者らによって最初に作られた用語である（非特許文献１）。短い
ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシング
をもたらし、かつ遺伝子の機能を研究するための新規なツールを提供してきた。
ＳＮＣＡ遺伝子の発現によりタンパク質α−シヌクレインが生じる。ＳＮＣＡ遺伝子の
突然変異およびＳＮＣＡ遺伝子の多重化は家族性パーキンソン病（ＰＤ）と関連付けられ
てきた。ＰＤ患者は、脳においてα−シヌクレインタンパク質が蓄積することを実証して
いる。同様の蓄積は、散発性ＰＤ、アルツハイマー病、多系統萎縮症、およびレーヴィ小
体痴呆を有すると診断された患者において観察される。
ファイアら（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．）、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ 第３９１巻、ｐ．８０６〜８１１
本発明の目的は、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）の発現を阻害するための組成物、およ
びこれらの組成物を使用する方法を提供することである。
本発明の態様は、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）の発現を阻害するための組成物、およ
びこれらの組成物を使用する方法に関する。１つの態様において、本発明は、ＳＮＣＡの
発現を阻害する薬剤を投与することによって対象を治療する方法を特徴とする。好ましい
実施形態において、対象はヒトなどの哺乳動物、例えば、神経変性障害を有するか、また
は神経変性障害を発症するリスクがあると診断された対象である。この阻害は、任意のレ
ベルで、例えば、転写レベル、翻訳レベル、または翻訳後修飾として実施可能である。Ｓ
ＮＣＡ発現を阻害する薬剤には、ＳＮＣＡ ＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤、リボザイム
、およびアンチセンス分子、ジンクフィンガータンパク質、ならびに抗体または天然に存
在するポリペプチドもしくは合成ポリペプチド、または低分子（好ましい実施形態におい
て、ＳＮＣＡタンパク質に結合しかつこれを阻害するもの）が含まれる。
特に好ましい実施形態において、阻害剤は、ＳＮＣＡ核酸、例えば、ＳＮＣＡ ＲＮＡ
を標的とするｉＲＮＡ剤である。このｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡ ＲＮＡのヌクレオチド配
列に相補的なアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖にハイブリダイズするために十分相補
的なセンス鎖とを有する。１つの実施形態において、このｉＲＮＡ剤は、生物学的試料中
でｉＲＮＡ剤を安定化する修飾を含む。例えば、修飾ｉＲＮＡ剤は、分解に対する感受性
がより低く、例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる切断に対する
感受性がより低い。このｉＲＮＡ剤は、例えば、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドであ
る少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチ
ド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリ
ジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２
’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−
ＣＡ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少
なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド、
または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−シチジン
−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドを含み得る。このｉＲＮＡ剤は、
該ジヌクレオチドを少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくと
も５個含み得る。１つの実施形態において、２’−修飾ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル
化ヌクレオチドである。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエートを含む
。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は配列番号６、１６、１
８、２０、２２、または２４のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、ｉＲＮ
Ａ剤のセンス鎖は配列番号５、１５、１７、１９、２１、または２３のヌクレオチド配列
を含む。なお別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、配列番号６、１６
、１８、２０、２２、または２４のヌクレオチド配列と部分的に一致し、例えば、少なく
とも１個、５個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、
１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、または２４個のヌクレオチドが一致
する。同様に、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、配列番号５、１５、１７、１９、２１、または
２３のヌクレオチド配列と部分的に一致可能であり、例えば、少なくとも１個、５個、１
０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２
０個、２１個、２２個、２３個、または２４個のヌクレオチドが一致可能である。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は野生型ＳＮＣＡ核酸を標的とし、さらに
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡの多型または突然変異を標的とす
る。例えば、本発明のｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡのオープンリーディングフレームのコドン
におけるＡ５３Ｔ変異、Ａ３０Ｐ変異、またはＥ４６Ｋ変異に対応する突然変異を標的と
し得る。ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡの３’ＵＴＲまたは５’
ＵＴＲを標的とする。ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡのスプライ
シングされたアイソフォームを標的とする。例えば、本発明のｉＲＮＡ剤は、１２８アミ
ノ酸のアイソフォームの発現をダウンレギュレーションするためにエキソン２とエキソン
４との間のスプライシングジャンクションを標的としてもよいし、またはｉＲＮＡ剤が１
１２アミノ酸のアイソフォームを標的とするためにエキソン４とエキソン６との間のスプ
ライシングジャンクションを標的としてもよい。
ある実施形態において、対象（例えば、ヒト）は、ＳＮＣＡ遺伝子の多重化（例えば、
二重化または三重化）、またはＰａｒｋｉｎ遺伝子もしくはユビキチンカルボキシ末端ヒ
ドロラーゼＬ１（ＵＣＨＬ１）遺伝子の遺伝的変異を有する。別の実施形態において、対
象はシヌクレイン症を有すると診断される。シヌクレイン症は、α−シヌクレインモノマ
ーの蓄積によって特徴付けられる。ｉＲＮＡ剤は、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイ
マー病、多系統萎縮症、レーヴィ小体痴呆、または網膜障害、例えば、網膜症を有すると
診断された患者に投与可能である。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は、少なくとも２１ヌクレオチド長であり
、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、アンチセンスＲＮＡ鎖は２５ヌク
レオチド長以下であり、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は１８〜２５ヌクレオチド長である。ｉ
ＲＮＡ剤は、１〜４対の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部をさらに含んで
もよく、この非対合ヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエート結合ジヌクレオ
チドを有してもよい。このヌクレオチド突出部は、例えば、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖
の３’末端にあってよい。
別の態様において、本発明は、ＳＮＣＡ核酸、例えば、ＳＮＣＡ ＲＮＡを標的とする
ｉＲＮＡ剤を特徴とする。ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡ ＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的
なアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖にハイブリダイズするために十分相補的なセンス
鎖とを有する。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は生物学的試料中でｉＲＮＡ剤を安
定化する修飾を含む。例えば、修飾ｉＲＮＡ剤は分解に対して感受性がより低く、例えば
、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性が低い。１つ
の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ホスホロチオエート、または２’−Ｏ−メチル化（
２’−Ｏ−Ｍｅ）ヌクレオチドを含む。ｉＲＮＡ剤は、例えば、ウリジンが２’−修飾ヌ
クレオチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’
）ジヌクレオチド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１
つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド、または５’
−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン
−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレ
オチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジ
ヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの
５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドを含み得る。ｉＲ
ＮＡ剤は、該ジヌクレオチドを少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、また
は少なくとも５個含み得る。１つの実施形態において、２’−修飾ヌクレオチドは２’−
Ｏ−メチル化ヌクレオチドである。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は少なくとも２１ヌクレオチド長であり、
センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、該アンチセンスＲＮＡ鎖は２５ヌク
レオチド長以下であり、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は１８〜２５ヌクレオチド長である。ｉ
ＲＮＡ剤は、１〜４対の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部をさらに含んで
もよく、この非対合ヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエート結合ジヌクレオ
チドを有してもよい。このヌクレオチド突出部は、例えば、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖
の３’末端にあってよい。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は配列番号６、１６、１
８、２０、２２、または２４のヌクレオチド配列を含む（表１を参照のこと）。別の実施
形態において、本発明のｉＲＮＡ剤のセンス鎖は配列番号５、１５、１７、１９、２１、
または２３のヌクレオチド配列を含む（表１を参照のこと）。さらに別の実施形態におい
て、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、配列番号６、１６、１８、２０、２２、または２４
のヌクレオチド配列と部分的に一致し、例えば、少なくとも１個、５個、１０個、１１個
、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個
、２２個、２３個、または２４個のヌクレオチドが一致する。同様に、ｉＲＮＡ剤のセン
ス鎖は、配列番号５、１５、１７、１９、２１、または２３のヌクレオチド配列と部分的
に一致可能であり、例えば、少なくとも１個、５個、１０個、１１個、１２個、１３個、
１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、
または２４個のヌクレオチドが一致可能である。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は野生型ＳＮＣＡ核酸を標的とし、さらに
別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡの多型または突然変異を標的とする。例
えば、ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡオープンリーディングフレームのコドンにおけるＡ５３Ｔ
変異、Ａ３０Ｐ変異、またはＥ４６Ｋ変異に対応する突然変異を標的とし得る（図１Ｂを
参照のこと）。ある実施形態において、ｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡの５’ＵＴＲまたは３’Ｕ
ＴＲを標的とする。ある実施形態において、ｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡのスプライシングされ
たアイソフォームを標的とする。例えば、ｉＲＮＡ剤は、１２８アミノ酸のアイソフォー
ムの発現をダウンレギュレーションするためにエキソン２とエキソン４との間のスプライ
シングジャンクションを標的としてもよいし、または１１２アミノ酸のアイソフォームを
標的とするためにエキソン４とエキソン６との間のスプライシングジャンクションを標的
としてもよい。
ＳＮＣＡ遺伝子は、神経変性疾患の治療方法のための標的であり得る。１つの実施形態
において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはジンクフィンガータン
パク質を使用して遺伝子発現を阻害することが可能であり、またはＳＮＣＡポリペプチド
を標的とするために抗体もしくは低分子を使用することも可能である。ＳＮＣＡの発現お
よび活性をダウンレギュレーションするために治療法を組み合わせて使用してもよい。
別の態様において、本発明は、薬学的組成物であって、本明細書に記載される阻害剤、
例えば、ＳＮＣＡ ＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤、リボザイム、またはアンチセンス核
酸、好ましくはＳＮＣＡタンパク質に結合しかつこれを阻害する抗体または天然ポリペプ
チドもしくは合成ポリペプチドあるいは低分子と、薬学的に許容可能な担体との組成物を
特徴とする。
特に好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、ＳＮＣＡ遺伝子を標的とす
るｉＲＮＡ剤および薬学的に許容可能な担体を含む。このｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡ ＲＮ
Ａのヌクレオチド配列に対して相補的なアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖にハイブリ
ダイズするために十分相補的なセンス鎖とを有する。１つの実施形態において、本発明の
薬学的組成物のｉＲＮＡ剤は、生物学的試料中でｉＲＮＡ剤を安定化する修飾を含む。例
えば、修飾ｉＲＮＡ剤は、分解に対して感受性がより低く、例えば、エキソヌクレアーゼ
またはエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性がより低い。ｉＲＮＡ剤は、例えば
、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン
−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレ
オチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジ
ヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの
５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウ
リジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３
’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチ
ドである少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌク
レオチドを含み得る。ｉＲＮＡ剤は、該ジヌクレオチドを少なくとも２個、少なくとも３
個、少なくとも４個、または少なくとも５個含み得る。１つの実施形態において、２’−
修飾ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドである。別の実施形態において、ｉ
ＲＮＡ剤はホスホロチオエートを含む。
別の実施形態において、本発明の薬学的組成物のｉＲＮＡ剤は、少なくとも２１ヌクレ
オチド長であり、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、該アンチセンスＲ
ＮＡ鎖は２５ヌクレオチド長以下であり、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は１８〜２５ヌクレオ
チド長である。該組成物のｉＲＮＡ剤は、１〜４対の非対合ヌクレオチドを有するヌクレ
オチド突出部をさらに含んでもよく、この非対合ヌクレオチドは少なくとも１つのホスホ
ロチオエート結合ジヌクレオチドを有してもよい。このヌクレオチド突出部は、例えば、
ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端にあってよい。
別の実施形態において、本発明の薬学的組成物のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は配列番
号６、１６、１８、２０、２２、または２４のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態に
おいて、薬学的組成物のｉＲＮＡ剤のセンス鎖は配列番号５、１５、１７、１９、２１、
または２３のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態において、このｉＲＮＡ剤の
アンチセンス鎖は、配列番号６、１６、１８、２０、２２、または２４のヌクレオチド配
列と部分的に一致し、例えば、少なくとも１個、５個、１０個、１１個、１２個、１３個
、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個
、または２４個のヌクレオチドが一致する。同様に、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、配列番号
５、１５、１７、１９、２１、または２３のヌクレオチド配列と部分的に一致可能であり
、例えば、少なくとも１個、５個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、
１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、または２４個のヌ
クレオチドが一致可能である。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は野生型ＳＮＣＡ核酸を標的とし、なお別
の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡの多型または突然変異を標的とする。例え
ば、ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡオープンリーディングフレームのコドンにおけるＡ５３Ｔ変
異、Ａ３０Ｐ変異、またはＥ４６Ｋ変異に対応する突然変異を標的とし得る。ある実施形
態において、ｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡの３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲを標的とする。ある実
施形態において、ｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡのスプライシングされたアイソフォームを標的と
する。例えば、ｉＲＮＡ剤は、１２８アミノ酸のアイソフォームの発現をダウンレギュレ
ーションするためにエキソン２とエキソン４との間のスプライシングジャンクションを標
的としてもよいし、または１１２アミノ酸のアイソフォームを標的とするためにエキソン
４とエキソン６との間のスプライシングジャンクションを標的としてもよい。別の態様に
おいて、本発明は、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物対象）の細胞中のＳＮＣＡまたは
ＳＮＣＡ ＲＮＡの量を低減する方法を特徴とする。この方法は、ＳＮＣＡの発現を阻害
する薬剤と細胞を接触させる工程を包含する。阻害は、任意のレベルで、例えば、転写レ
ベル、翻訳レベル、または翻訳後修飾として実施可能である。ＳＮＣＡ発現を阻害する薬
剤には、ＳＮＣＡ ＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤およびアンチセンス分子、ならびに抗
体または天然に存在するポリペプチドもしくは合成ポリペプチド、または低分子（好まし
い実施形態において、ＳＮＣＡタンパク質に結合しかつこれを阻害するもの）が含まれる
。
特に好ましい実施形態において、ＳＮＣＡ ＲＮＡは、対象の細胞をｉＲＮＡ剤と接触
させることによって低減される。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、生物学的試料
中でｉＲＮＡ剤を安定化する修飾を含む。例えば、修飾ｉＲＮＡ剤は分解に対して感受性
がより低く、例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる切断に対して
感受性がより低い。ｉＲＮＡ剤は、例えば、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少
なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド、
または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリジン
−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−
修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ
−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なく
とも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド、また
は５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである５少なくとも１つの’−シチジン−シ
チジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドを含み得る。ｉＲＮＡ剤は、該ジヌク
レオチドを少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個含
み得る。１つの実施形態において、２’−修飾ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル化ヌクレ
オチドである。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエートを含む。
別の実施形態において、本発明の薬学的組成物のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は配列番
号６、１６、１８、２０、２２、または２４のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態に
おいて、本発明の薬学的組成物のｉＲＮＡ剤のセンス鎖は配列番号５、１５、１７、１９
、２１、または２３のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態において、ｉＲＮＡ
剤のアンチセンス鎖は、配列番号６、１６、１８、２０、２２、または２４のヌクレオチ
ド配列と部分的に一致し、例えば、少なくとも１個、５個、１０個、１１個、１２個、１
３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２
３個、または２４個のヌクレオチドが一致する。同様に、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、配列
番号５、１５、１７、１９、２１、または２３のヌクレオチド配列と部分的に一致可能で
あり、例えば、少なくとも１個、５個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５
個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、または２４個
のヌクレオチドが一致可能である。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は野生型ＳＮＣＡ核酸を標的とし、なお別
の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡの多型または突然変異を標的とする。例え
ば、ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡのオープンリーディングフレームのコドンにおける変異Ａ５
３Ｔ、Ａ３０Ｐ、またはＥ４６Ｋ変異に対応する突然変異を標的とし得る。ある実施形態
において、ｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡの３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲを標的とする。ある実施
形態において、ｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡのスプライシングされたアイソフォームを標的とす
る。例えば、ｉＲＮＡ剤は、１２８アミノ酸のアイソフォームの発現をダウンレギュレー
ションするためにエキソン２とエキソン４との間のスプライシングジャンクションを標的
としてもよいし、または１１２アミノ酸のアイソフォームを標的とするためにエキソン４
とエキソン６との間のスプライシングジャンクションを標的としてもよい。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は少なくとも２１ヌクレオチド長であり、
センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、該アンチセンスＲＮＡ鎖は２５ヌク
レオチド長以下であり、このｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は１８〜２５ヌクレオチド長である
。本発明のｉＲＮＡ剤は、１〜４対の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を
さらに含んでもよく、この非対合ヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエート結
合ジヌクレオチドを有してもよい。このヌクレオチド突出は、例えば、ｉＲＮＡ剤のアン
チセンス鎖の３’末端にあってよい。
別の態様において、本発明は、ｉＲＮＡ剤を作製する方法を特徴とする。この方法は、
ＳＮＣＡ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列から１８〜２５ヌクレオチド長のヌクレオチド配
列を選択する工程と、ｉＲＮＡ剤を合成する工程とを包含する。ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は
、ＳＮＣＡ ＲＮＡから選択されたヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は該センス
鎖にハイブリダイズするために十分相補的である。１つの実施形態において、この方法は
、本明細書に記載されるように、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）にｉＲＮ
Ａ剤を投与する工程を包含する。
別の態様において、本発明は、ＳＮＣＡ発現を阻害する能力について、薬剤、例えば、
低分子（低分子とは、好ましくは分子量が３，０００ダルトン未満、より好ましくは２，
０００ダルトン未満、さらにより好ましくは１０００ダルトン未満）、アンチセンス、リ
ボザイム、ｉＲＮＡ剤、またはタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチド、例えば、
ジンクフィンガータンパク質などの本明細書に記載される種類の薬剤（例えば、ＳＮＣＡ
またはＳＮＣＡ核酸を標的とする薬剤）を評価する方法を特徴とする。本発明は、候補薬
剤を提供する工程と、その候補薬剤がＳＮＣＡ発現を変化させる（例えば、阻害する）か
否かを、例えば、本明細書に記載の試験系のうち１つまたは複数の使用によって決定する
工程とを包含する。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、第１の試験系において薬剤を評価する工
程と、所定のレベルの変化が観察される場合、第２の、好ましくは異なる試験系において
該候補剤を評価する工程とを包含する。特に好ましい実施形態において、この第２の試験
系は、動物に候補薬剤を投与する工程と、該動物におけるＳＮＣＡ発現に対する候補薬剤
の効果を評価する工程とを包含する。好ましい実施形態では、２つの試験系が使用され、
第１の試験系が高スループット系であり、例えば、このような実施形態において、第１ま
たは最初の試験は、第２の、好ましくは動物の系よりも、少なくとも１００倍、１，００
０倍、または１０，０００倍多くの化合物をスクリーニングするために使用される。
試験系は、標的分子（例えば、ＳＮＣＡ、ＳＮＣＡ核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ
））と候補薬剤を、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる工程と、相互作用、例えば
、標的への候補薬剤の結合または標的の修飾（例えば、標的内に共有結合を作製もしくは
標的内の共有結合を破壊することによる）が存在するか否かを決定する工程とを包含し得
る。修飾は、ＳＮＣＡ発現を変化させる能力と相関する。試験系は、細胞と候補薬剤を接
触させる工程と、ＳＮＣＡ発現の変化を評価する工程とを包含し得る。例えば、この試験
系は、ＳＮＣＡまたはＳＮＣＡ ＲＮＡを（内在性遺伝子または外来性構築物から）発現
し得る細胞と候補薬剤を接触させる工程と、ＳＮＣＡまたはＳＮＣＡ ＲＮＡのレベルを
評価する工程とを包含し得る。別の実施形態において、試験系は、ＳＮＣＡ制御領域（例
えば、マーカータンパク質（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質）などの異種配列に連
結されたＳＮＣＡ制御領域であって、その構築物は、染色体構築物でもエピソーム性構築
物のいずれでもよい）からＲＮＡまたはタンパク質を発現する細胞と、候補薬剤を接触さ
せる工程、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルに対する効果を決定する工程を含み得る。本
発明の試験系はまた、組織試料、例えば、脳組織試料（例えば、薄片もしくは切片）、眼
組織試料、または神経試料を含む他の試料を候補薬剤とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる工
程、およびＳＮＣＡまたはＳＮＣＡ ＲＮＡのレベルを評価する工程を包含し得る。本発
明の試験系は、動物にｉｎ ｖｉｖｏで候補薬剤を投与する工程、およびＳＮＣＡまたは
ＳＮＣＡ ＲＮＡのレベルを評価する工程を包含し得る。これらのいずれにおいても、Ｓ
ＮＣＡ発現に対する候補薬剤の効果は、ＳＮＣＡ遺伝子の発現を、所定の標準、例えば、
未処理の細胞、組織、または動物などの対照と比較する工程を包含し得る。ＳＮＣＡ遺伝
子の発現は、例えば、候補薬剤との接触の前後で比較可能である。本発明の方法は、ｉＲ
ＮＡ剤がＳＮＣＡ遺伝子の発現を阻害するために有用であるか否かを決定することを可能
にする。
１つの実施形態において、ＳＮＣＡ遺伝子の発現は、ＳＮＣＡのＲＮＡレベルを調べる
方法（例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＲＮＡｓｅ保護アッセイ）
またはＳＮＣＡのタンパク質レベルを調べる方法（例えば、ウェスタンブロット法）によ
って評価可能である。
１つの実施形態において、例えば、第２の試験として、本発明の薬剤を、哺乳動物、例
えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、またはヒト以外の霊長類に投与し、この動物を薬
剤の効果についてモニターする。例えば、脳組織または眼の組織などの動物の組織を、Ｓ
ＮＣＡ発現に対する薬剤の効果について調べる。該組織を、例えば、ＳＮＣＡ ＲＮＡお
よび／またはタンパク質の存在について調べてもよい。１実施形態では、この動物を観察
して、認知的症状の改善または安定化をモニターする。薬剤は、任意の方法によって、例
えば、経口的に、またはクモ膜下腔内もしくは実質への注射、例えば、脳への立体視によ
る注射によって動物に投与可能である。
特に好ましい実施形態において、本発明は、ＳＮＣＡ核酸を標的とするｉＲＮＡ剤、例
えば、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤を評価する方法を特徴とする。この方法は、ＳＮＣＡ
核酸（例えば、ＳＮＣＡ ＲＮＡ）を標的とするｉＲＮＡ剤を提供する工程と；ＳＮＣＡ
遺伝子を含み、かつ発現可能である細胞とｉＲＮＡ剤を接触させる工程と；ＳＮＣＡの発
現に対するｉＲＮＡ剤の効果を、例えば、ＳＮＣＡ遺伝子の発現を対照と比較することに
よって（例えば、細胞中で）評価する工程とを包含する。ＳＮＣＡ遺伝子の発現は、例え
ば、細胞とｉＲＮＡ剤を接触させる前後で比較可能である。この方法により、ｉＲＮＡ剤
がＳＮＣＡ遺伝子の発現を阻害するために有用であるか否かを決定することを可能となる
。例えば、ｉＲＮＡ剤が、例えば所定の基準値と比較して（例えば、細胞と該ｉＲＮＡ剤
を接触させる前のＳＮＣＡ ＲＮＡまたはタンパク質の量と比較して）、発現を所定の量
（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％）低減し得る場合、該ｉＲＮ
Ａ剤はＳＮＣＡ遺伝子の発現を阻害するために有用であると決定可能である。ＳＮＣＡ遺
伝子は内在的に発現されてもよいし外来性として発現されてもよい。
本発明の特徴である方法および組成物、例えば、本明細書に記載される神経変性障害を
治療するための方法およびｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される任意の投薬量および／ま
たは製剤で、かつ本明細書に記載される任意の投与経路を用いて使用可能である。
α−シヌクレインポリペプチドは、脳におけるその存在に加えて、網膜および視神経を
含む眼組織中において見出されている。したがって、本明細書に記載される組成物および
方法は、網膜症を含むがこれに限定されない眼または眼組織のシヌクレイン症を治療する
ために適している。
したがって、１つの態様において、本発明は、眼または眼組織におけるＳＮＣＡの発現
を阻害する薬剤を投与することによって対象を治療する方法を特徴とする。好ましい実施
形態において、この対象はヒトなどの哺乳動物、例えば、眼のシヌクレイン症（例えば、
網膜症）を有するか、または発症するリスクがあると診断された対象である。阻害は、任
意のレベルで、例えば、転写レベル、翻訳レベル、または翻訳後修飾としてもたらされる
ことが可能である。ＳＮＣＡ発現を阻害する薬剤は、ＳＮＣＡ ＲＮＡを標的とするｉＲ
ＮＡ剤およびアンチセンス分子、ならびに抗体または天然に存在するポリペプチドもしく
は合成ポリペプチド、または低分子（好ましい実施形態においては、ＳＮＣＡタンパク質
に結合しかつこれを阻害するもの）を含む。
特に好ましい実施形態において、阻害剤は、ＳＮＣＡ核酸、例えば、ＳＮＣＡ ＲＮＡ
を標的とするｉＲＮＡ剤である。該ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡ ＲＮＡのヌクレオチド配列
に相補的なアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖にハイブリダイズするために十分相補的
なセンス鎖とを有する。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、生物学的試料中でｉＲ
ＮＡ剤を安定化する修飾を含む。例えば、修飾ｉＲＮＡ剤は、分解に対して感受性がより
低く、例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性
がより低い。ｉＲＮＡ剤は、例えば、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくと
も１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド、または
５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−グア
ニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌ
クレオチドである少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’
）ジヌクレオチド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１
つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド、または５’
−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン
−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドを含み得る。ｉＲＮＡ剤は、該ジヌクレオチ
ドを少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個含み得る
。１つの実施形態において、２’−修飾ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド
である。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエートを含む。
別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は配列番号６、１６、１８、２０
、２２、または２４のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤のセ
ンス鎖は配列番号５、１５、１７、１９、２１、または２３のヌクレオチド配列を含む。
さらに別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、配列番号６、１６、１８
、２０、２２、または２４のヌクレオチド配列と部分的に一致し、例えば、少なくとも１
個、５個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個
、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、または２４個のヌクレオチドが一致する。
同様に、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、配列番号５、１５、１７、１９、２１、または２３の
ヌクレオチド配列と部分的に一致可能であり、例えば、少なくとも１個、５個、１０個、
１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、
２１個、２２個、２３個、または２４個のヌクレオチドが一致可能である。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は野生型ＳＮＣＡ核酸を標的とし、さらに
別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡの多型または突然変異を標的とする。例
えば、ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡのオープンリーディングフレームのコドンにおけるＡ５３
Ｔ変異、Ａ３０Ｐ変異、またはＥ４６Ｋ変異に対応する突然変異を標的とし得る。ある実
施形態において、ｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡの３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲを標的とする。あ
る実施形態において、ｉＲＮＡ剤はＳＮＣＡのスプライシングされたアイソフォームを標
的とする。例えば、ｉＲＮＡ剤は、１２８アミノ酸のアイソフォームの発現をダウンレギ
ュレーションするためにエキソン２とエキソン４との間のスプライシングジャンクション
を標的としてもよいし、１１２アミノ酸のアイソフォームを標的とするためにエキソン４
とエキソン６との間のスプライシングジャンクションを標的としてもよい。
ある実施形態において、対象（例えば、ヒト）は、ＳＮＣＡ遺伝子の多重化（例えば、
二重化または三重化）、またはＰａｒｋｉｎ遺伝子もしくはユビキチンカルボキシ末端ヒ
ドロラーゼＬ１（ＵＣＨＬ１）遺伝子の遺伝的変異を有する。別の実施形態において、対
象はシヌクレイン症を有すると診断される。シヌクレイン症は、α−シヌクレインモノマ
ーの蓄積によって特徴付けられる。ｉＲＮＡ剤は、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイ
マー病、多系統萎縮症、レーヴィ小体痴呆、および網膜障害（例えば、網膜症）を有する
と診断された患者に投与可能である。
別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は、少なくとも２１ヌクレオチド長であり
、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、該アンチセンスＲＮＡ鎖は２５ヌ
クレオチド長以下であり、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は１８〜２５ヌクレオチド長である。
ｉＲＮＡ剤は、１〜４対の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部をさらに含ん
でもよく、この非対合ヌクレオチドは少なくとも１つのホスホロチオエート結合ジヌクレ
オチドを有してもよい。このヌクレオチド突出部は、例えば、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス
鎖の３’末端にあってよい。
「実質的に同一な」配列は、標的遺伝子に対して十分相同な領域を含み、かつｉＲＮＡ
剤またはそのフラグメントが標的遺伝子のダウンレギュレーションを仲介可能なだけ十分
な長さのヌクレオチド数を有する。したがって、このｉＲＮＡ剤は、標的のＲＮＡ転写物
（例えば、ＳＮＣＡ転写物）に対して少なくとも部分的に、またはある実施形態において
は完全に相補的な領域であるか、またはそのような領域を含む。ｉＲＮＡ剤と標的との間
の完全な相補性が存在する必要性はないが、両者の一致は、ｉＲＮＡ剤またはその切断産
物が、例えば、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ切断による配列特異的サイレ
ンシングをもたらすために十分でなければならない。標的鎖との相補性、または相同性の
程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。完全な相補性が、特にアンチセンス鎖
において望まれることが多いのに対して、ある実施形態は、特にアンチセンス鎖において
、１つ以上であるが、好ましくは６、５、４、３、２個またはそれ未満の（標的ＲＮＡに
対する）ミスマッチを含み得る。特にアンチセンス鎖におけるこのミスマッチは、末端領
域において最も許容されやすく、存在する場合は、５’末端および／または３’末端から
例えば６、５、４、または３ヌクレオチド以内の末端領域中に特にあることが好ましい。
センス鎖は、分子の全体的な二本鎖の性質を維持するためにアンチセンス鎖と十分に相補
性でありさえすればよい。
「ＲＮＡ剤」は、本明細書において使用される場合、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、また
はヌクレオシド代用物であり、これらのすべてが本明細書において記載されている。多数
の修飾ＲＮＡおよびヌクレオシド代用物が記載されるが、好ましい例には、非修飾ＲＮＡ
よりもヌクレアーゼ分解に対して耐性の高いものが含まれる。好ましい例には、２’糖修
飾、一本鎖突出部（好ましくは３’一本鎖突出部）における修飾、または、特に一本鎖の
場合、１つまたは複数のリン酸基もしくは１つまたは複数のリン酸基アナログを含む５’
修飾を有するものが含まれる。
「ｉＲＮＡ剤」（「干渉ｉＲＮＡ剤」）は、本明細書において使用される場合、標的遺
伝子、好ましくは内在性または病原体の標的ＲＮＡの発現をダウンレギュレーション可能
なＲＮＡ剤である。理論によって束縛されることは望まないが、ｉＲＮＡ剤は、当該分野
においてＲＮＡｉと呼ばれることもある標的ｍＲＮＡの転写後切断、または転写前もしく
は翻訳前のメカニズムを含む多数のメカニズムのうち１つ以上によって作用する可能性が
ある。ｉＲＮＡ剤は、一本鎖を含んでもよいし、または二本以上の鎖を含んでもよく、例
えば、ｉＲＮＡ剤は二本鎖のｉＲＮＡ剤であってもよい。ｉＲＮＡ剤が一本鎖である場合
、１つまたは複数のリン酸基または１つまたは複数のリン酸基アナログを含む５’修飾を
含むことが特に好ましい。ｉＲＮＡ剤は、本明細書において短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ
）またはｄｓＲＮＡとも呼ばれる。
ＳＮＣＡ核酸を標的とするｉＲＮＡ剤は、抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤と呼ばれ得る。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明において示
される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、この説明から、および特許請求の範囲
から明らかである。本願は、すべての引用された参考文献、特許、および特許出願の全体
を、すべての目的のために本願明細書に援用する。
例えば、本発明は以下を提供する：
（項目１）
α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ＲＮＡのヌクレオチド配列に対して相補的なアンチセン
ス鎖、および該アンチセンス鎖に対してハイブリダイズするために十分に相補的なセンス
鎖からなる、ｉＲＮＡ剤。
（項目２）
生物学的試料中におけるｉＲＮＡ剤の安定性の増大を引き起こす修飾を含んでなる請求
項１に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目３）
ホスホロチオエートまたは２’−ＯＭｅ’修飾を含んでなる項目１に記載のｉＲＮＡ
剤。
（項目４）
ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン
−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレ
オチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジ
ヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの
５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウ
リジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３
’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチ
ドである少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌク
レオチドを含んでなる、項目１に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目５）
前記アンチセンス鎖が、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配
列番号２２、および配列番号２４からなる群から選択される配列を含んでなる、項目１
に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目６）
前記ｉＲＮＡ剤のセンス鎖が、配列番号５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１
９、配列番号２１、および配列番号２３から群から選択される配列を含んでなる、項目
１に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目７）
前記アンチセンス鎖がＳＮＣＡ ＲＮＡの多型に対して相補的である配列を含んでなる
、項目１に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目８）
前記アンチセンス鎖が、ＳＮＣＡ ＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴ
Ｒのヌクレオチド配列に対して相補的な配列を含んでなる、項目１に記載のｉＲＮＡ剤
。
（項目９）
前記ｉＲＮＡ剤が少なくとも２１ヌクレオチド長であり、かつ該ｉＲＮＡの二本鎖領域
が約１８〜２５ヌクレオチド長である、項目１に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１０）
ｄｓＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ鎖が２５ヌクレオチド長以下である、項目１に記載
のｉＲＮＡ剤。
（項目１１）
１〜４個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含んでなる、項目１に
記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１２）
前記ヌクレオチド突出部がｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端にある、項目１１
に記載のｉＲＮＡ剤。
（項目１３）
ヒトを治療する方法であって、
神経変性障害を有するか、または神経変性障害を発症するリスクがあると診断されたヒ
トを同定する工程、ならびに
α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ＲＮＡのヌクレオチド配列に対して相補的なアンチセン
ス鎖、および該アンチセンス鎖にハイブリダイズするために十分に相補的なセンス鎖から
なるｉＲＮＡ剤を投与する工程
からなる方法。
（項目１４）
前記ｉＲＮＡ剤が、生物学的試料中における該ｉＲＮＡ剤の安定性の増大を引き起こす
修飾を含んでなる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ｉＲＮＡ剤がホスホロチオエートまたは２’−ＯＭｅ修飾を含んでなる項目１３
に記載の方法。
（項目１６）
前記ｉＲＮＡ剤が、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−
ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド、または、５’−ウリジ
ンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（
５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドで
ある少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオ
チド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウ
リジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが
２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’
−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドを含んでなる、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記アンチセンス鎖が、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配
列番号２２、および配列番号２４からなる群から選択される配列を含んでなる、項目１
３に記載の方法。
（項目１８）
前記ｉＲＮＡ剤のセンス鎖が、配列番号５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１
９、配列番号２１、および配列番号２３からなる群から選択される配列を含んでなる、請
求項１３に記載の方法。
（項目１９）
前記ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖がＳＮＣＡ ＲＮＡの多型に対して相補的な配列を含
んでなる、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖がＳＮＣＡ ＲＮＡの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの
ヌクレオチド配列に対して相補的な配列を含んでなる、項目１３に記載の方法。
（項目２１）
前記ヒトがＰａｒｋｉｎ遺伝子またはユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（Ｕ
ＣＨＬ１）遺伝子中に遺伝子変異を有する、項目１３に記載の方法。
（項目２２）
前記ヒトがＳＮＣＡの遺伝子の多重化を有する、項目１３に記載の方法。
（項目２３）
ヒトがＳＮＣＡの遺伝子の二重化を有する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
ヒトがＳＮＣＡの遺伝子の三重化を有する、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記神経変性障害がシヌクレイン症である、項目１３に記載の方法。
（項目２６）
前記神経変性障害がパーキンソン病である、項目１３に記載の方法。
（項目２７）
前記神経変性障害がアルツハイマー病、多系統萎縮症、またはレーヴィ小体痴呆である
、項目１３に記載の方法。
（項目２８）
前記ｉＲＮＡ剤が少なくとも２１ヌクレオチド長であり、かつ該ｉＲＮＡ剤の二本鎖領
域が約１８〜２５ヌクレオチド長である、項目１３に記載の方法。
（項目２９）
前記ｉＲＮＡ剤のアンチセンスＲＮＡ鎖が２５ヌクレオチド長以下である、項目１３
に記載の方法。
（項目３０）
前記ｉＲＮＡ剤が１〜４個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含んで
なる、項目１３に記載の方法。
（項目３１）
前記ヌクレオチド突出部が前記ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端にある、項目
３０に記載の方法。
（項目３２）
α−シヌクレイン遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、および
薬学的に許容可能な担体
からなる薬学的組成物であって、
前記ｉＲＮＡ剤は、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ＲＮＡのヌクレオチド配列に対して
相補的なアンチセンス鎖、および該アンチセンス鎖に対してハイブリダイズするために十
分に相補的なセンス鎖からなることを特徴とする、薬学的組成物。
（項目３３）
前記ｉＲＮＡ剤が、生物学的試料中における該ｉＲＮＡ剤の安定性の増大を引き起こす
修飾をさらに含んでなる、項目３２に記載の薬学的組成物。
（項目３４）
前記ｉＲＮＡ剤がホスホロチオエートまたは２’−ＯＭｅ修飾をさらに含んでなる、請
求項３２に記載の薬学的組成物。
（項目３５）
前記ｉＲＮＡ剤が、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−
ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウリジン
が２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５
’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドであ
る少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチ
ド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリ
ジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２
’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−
ＣＣ−３’）ジヌクレオチドを含んでなる、項目３２に記載の薬学的組成物。
（項目３６）
前記ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番
号２０、配列番号２２、および配列番号２４からなる群から選択される配列を含んでなる
、項目３２に記載の薬学的組成物。
（項目３７）
前記ｉＲＮＡ剤のセンス鎖が、配列番号５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１
９、配列番号２１、および配列番号２３からなる群から選択される配列を含んでなる、請
求項３２に記載の薬学的組成物。
（項目３８）
前記ｉＲＮＡ剤がホスホロチオエートまたは２’−ＯＭｅ修飾を含んでなる、項目３
２に記載の薬学的組成物。
（項目３９）
前記ｉＲＮＡ剤が少なくとも２１ヌクレオチド長であり、かつ該ｉＲＮＡ剤の二本鎖領
域が約１８〜２５ヌクレオチド長である、項目３２に記載の薬学的組成物。
（項目４０）
前記ｉＲＮＡ剤のアンチセンスＲＮＡ鎖が２５ヌクレオチド長以下である、項目３２
に記載の薬学的組成物。
（項目４１）
前記ｉＲＮＡ剤が１〜４個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含んで
なる、項目３２に記載の薬学的組成物。
（項目４２）
前記ヌクレオチド突出部が前記ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端にある、項目
４１に記載の薬学的組成物。
（項目４３）
対象の細胞中のＳＮＣＡ ＲＮＡの量を低減する方法であって、
α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ＲＮＡのヌクレオチド配列に対して相補的なアンチセン
ス鎖、および該アンチセンス鎖に対してハイブリダイズするために十分に相補的なセンス
鎖からなるｉＲＮＡ剤と細胞を接触させる工程を包含する方法。
（項目４４）
前記ｉＲＮＡ剤が、生物学的試料中における該ｉＲＮＡ剤の安定性の増大を引き起こす
修飾をさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ｉＲＮＡ剤がホスホロチオエートまたは２’−ＯＭｅ修飾をさらに含む、項目４
３に記載の方法。
（項目４６）
前記ｉＲＮＡ剤は、ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−
ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド、または５’−ウリジン
が２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５
’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドであ
る少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチ
ド、または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−ウリ
ジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド、または５’−シチジンが２
’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−
ＣＣ−３’）ジヌクレオチドをさらに含んでなる、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
前記ｉＲＮＡ剤が、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番
号２２、および配列番号２４からなる群から選択される配列を含んでなるアンチセンス鎖
を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４８）
前記ｉＲＮＡ剤が、配列番号５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番
号２１、および配列番号２３からなる群から選択される配列を含んでなるセンス鎖を含む
、項目４３に記載の方法。
（項目４９）
前記ｉＲＮＡ剤がＳＮＣＡ ＲＮＡの多型に対して相補的な配列を含んでなるアンチセ
ンス鎖を含む、項目４３に記載の方法。
（項目５０）
前記ｉＲＮＡ剤が少なくとも２１ヌクレオチド長であり、かつ該ｉＲＮＡ剤の二本鎖領
域が約１８〜２５ヌクレオチド長である、項目４３に記載の方法。
（項目５１）
前記ｉＲＮＡ剤のアンチセンスＲＮＡ鎖が２５ヌクレオチド長以下である、項目４３
に記載の方法。
（項目５２）
前記ｉＲＮＡ剤が１〜４個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含んで
なる、項目４３に記載の方法。
（項目５３）
前記ヌクレオチド突出部が前記ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端にある、項目
５２に記載の方法。
（項目５４）
ｉＲＮＡ剤を作製する方法であって、
ＳＮＣＡ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列から１８〜２５ヌクレオチド長のヌクレオチド
配列を選択する工程、および
ｉＲＮＡ剤のセンス鎖が選択されたヌクレオチド配列からなり、かつアンチセンス鎖が
該センス鎖にハイブリダイズするために十分に相補的であることを特徴とするｉＲＮＡ剤
を合成する工程
を含む方法。
（項目５５）
前記ｉＲＮＡ剤を対象に投与する工程をさらに含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記対象がシヌクレイン症を有すると診断される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記対象がパーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症、またはレーヴィ小体痴
呆を有すると診断される、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
前記対象がヒトである、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
ＳＮＣＡ核酸を標的とするｉＲＮＡ剤を評価する方法であって、
アンチセンス配列がＳＮＣＡ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に対して相補的であり、か
つセンス鎖が該アンチセンス鎖にハイブリダイズするために十分に相補的であるｉＲＮＡ
剤を供給する工程；
ＳＮＣＡ遺伝子を含む細胞に該ｉＲＮＡ剤を接触させる工程；
細胞に該ｉＲＮＡ剤を接触させる前と細胞に該ｉＲＮＡ剤を接触させた後のＳＮＣＡ遺
伝子の発現を比較する工程；ならびに
該ｉＲＮＡ剤がＳＮＣＡ遺伝子の発現を阻害するために有用であるか否かを決定する工
程であって、細胞中に存在するＳＮＣＡのＲＮＡまたはタンパク質の量が、細胞にｉＲＮ
Ａ剤を接触させる前の量よりも少ない場合に該ｉＲＮＡが有用であることを特徴とする工
程、
を含む方法。
（項目６０）
前記比較工程が、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＲＮ
Ａｓｅ保護アッセイからなる群から選択される方法を実行することからなる、項目５９
に記載の方法。
（項目６１）
ＳＮＣＡの発現を阻害する能力について薬剤を評価する方法であって、候補薬剤を供給
する工程、および該薬剤が動物におけるＳＮＣＡの発現を減少させるか否かを決定する工
程を含む方法。
（項目６２）
第１の試験系で薬剤を評価する前工程、および所定のレベルの変化が見られる場合には
、前記動物中で該候補薬剤を評価する工程を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
２つの試験系を使用し、第１の試験系が、第２の動物の系よりも少なくとも１００倍多
い化合物をスクリーニングするために使用される高スループット系である、項目６２に
記載の方法。
（項目６４）
第１の試験系が、
ＳＮＣＡ標的、ＳＮＣＡ ＲＮＡ標的、またはＤＮＡ標的と候補薬剤を接触させ、標的
との相互作用が存在するか否かを決定することを含む試験系；
細胞と候補薬物とを接触させ、ＳＮＣＡ発現の変化を評価することを含む試験系；
候補薬剤をｉｎ ｖｉｔｒｏで組織試料と接触させ、ＳＮＣＡまたはＳＮＣＡ ＲＮＡ
のレベルを評価することを含む試験系
から選択される、項目６２に記載の方法。
（項目６５）
前記第１の系が、ＳＮＣＡまたはＳＮＣＡ ＲＮＡを（内在性遺伝子または外来構築物
から）発現可能な細胞と前記候補薬剤を接触させる工程、およびＳＮＣＡまたはＳＮＣＡ
ＲＮＡのレベルを評価する工程を含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記第１の系が、ＳＮＣＡ制御領域からＲＮＡまたはタンパク質を発現可能な細胞と前
記候補薬剤を接触させる工程、およびＲＮＡまたはタンパク質のレベルに対する効果を決
定する工程を含む、項目６４に記載の方法。
（項目６７）
前記第１の系が、異種マーカータンパク質に結合したＳＮＣＡ制御領域からＲＮＡまた
はタンパク質を発現可能な細胞と前記候補薬剤を接触させる工程を含む、項目６４に記
載の方法。
（項目６８）
前記動物を薬剤の効果についてモニターする、項目６１に記載の方法。
（項目６９）
脳組織または眼組織をＳＮＣＡ発現に対する薬剤の効果について試験する、項目６８
に記載の方法。
（項目７０）
前記決定する工程が、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、および
ＲＮＡｓｅ保護アッセイからなる群より選択される方法を実行することを含む、項目６
１に記載の方法。
（項目７１）
前記薬剤が、低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはタンパク
質、ポリペプチド、もしくはペプチドである、項目６１に記載の方法。
ヒトＳＮＣＡの完全長ｍＲＮＡ（転写バリアントＮＡＣＰ１４０；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００３４５；配列番号１）の配列を示す図。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを太字の斜字体で示す。ｓｉＲＮＡであるＳＮＣＡ１、３、４、５、６、および９の標的配列に下線を付している。ｓｉＲＮＡであるＳＮＣＡ２、７、および８の配列に灰色で影を付けてある。ＳＮＣＡ１はヌクレオチド１９７〜２１７を標的とし；ＳＮＣＡ２はヌクレオチド２０５〜２２５を標的とし；ＳＮＣＡ３はヌクレオチド３０８〜３３０を標的とし；ＳＮＣＡ４はヌクレオチド２３１〜２５１を標的とし；ＳＮＣＡ５はヌクレオチド３５６〜３７６を標的とし；ＳＮＣＡ６はヌクレオチド２６１〜２７９を標的とし；ＳＮＣＡ７はヌクレオチド４０３〜４２１を標的とし；ＳＮＣＡ８はヌクレオチド４５１〜４６９を標的とし；ＳＮＣＡ９はヌクレオチド１３１１〜１３２９を標的とする。２つの代替的な内部エキソン（エキソン３および５）に隣接して括弧を付してある。 ヒトＳＮＣＡの完全長タンパク質（転写バリアントＮＡＣＰ１４０；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００３４５；配列番号２）の配列を示す図。 ＢＥ（２）−Ｍ１７ヒト神経芽細胞腫細胞中で発現されたＥＧＦＰタンパク質またはＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ融合タンパク質のウェスタンブロットを示す図。細胞を、ＥＧＦＰタンパク質を発現するベクター（ｖｅｃｔｏｒ）またはＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ融合タンパク質を発現するベクター（α−ｓｙｎ）、および表１に列挙されるｓｉＲＮＡで同時トランスフェクションした。この図において、ｓｉＲＮＡであるＭａｙｏｌ、Ｍａｙｏ２、Ｍａｙｏ３、Ｍａｙｏ４、Ｍａｙｏ５、Ｍａｙｏ６、Ｍａｙｏ７、Ｍａｙｏ８、およびＭａｙｏ９は、表１のｓｉＲＮＡ（それぞれ、ＳＮＣＡ１、ＳＮＣＡ２、ＳＮＣＡ３、ＳＮＣＡ４、ＳＮＣＡ５、ＳＮＣＡ６、ＳＮＣＡ７、ＳＮＣＡ８、およびＳＮＣＡ９）と等しい。対照実験は、ＥＧＦＰベクターおよびＥＧＦＰ／ＮＡＣＰベクターと、ｓｉＲＮＡ Ｍｒ対照ｄｓＲＮＡとの同時トランスフェクション（「ｓｉＲＮＡＭｒ」と標識されている「ｖｅｃｔｏｒ」レーンおよび「α−ｓｙｎ」レーン）、ｄｓＲＮＡを伴わないＥＧＦＰベクターおよびＥＧＦＰ／ＮＡＣＰベクターのトランスフェクション、ならびにトランスフェクションしていない細胞とした。ｓｉＲＮＡ Ｍｒの配列は表１に提供されている。 ＢＥ（２）−Ｍ１７ヒト神経芽細胞腫細胞中で発現させたＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ融合タンパク質を検出するウェスタンブロットの図。細胞は、ＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ融合タンパク質を発現するベクター、および様々な濃度（ｎＭ）のＭａｙｏ２、Ｍａｙｏ７、またはＭａｙｏ８ ｓｉＲＮＡで同時トランスフェクションした。これらのｓｉＲＮＡは、それぞれ、表１のｓｉＲＮＡ ＳＮＣＡ２、ＳＮＣＡ７、およびＳＮＣＡ８と同じである。ウェスタンブロット分析物は、サンプル間でタンパク質が等量装荷されたことを確認するために、抗ＧＦＰ抗体を取り除いて抗チューブリン抗体で再検査した。 ＢＥ（２）−Ｍ１７ヒト神経芽細胞腫細胞中で発現させたＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ融合タンパク質を検出するウェスタンブロットの図。細胞は、ＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ融合タンパク質を発現するベクター、および５０ｎＭのＭａｙｏ２、Ｍａｙｏ７、またはＭａｙｏ８ ｓｉＲＮＡで同時トランスフェクションした。これらのｓｉＲＮＡは、それぞれ、表１のｓｉＲＮＡ ＳＮＣＡ２、ＳＮＣＡ７、およびＳＮＣＡ８と同じである。「対照」実験では、ｓｉＲＮＡは融合構築物とともにトランスフェクションしなかった。タンパク質発現を、６日間にわたってモニターした。ウェスタンブロット分析物は、サンプル間でタンパク質が等量装荷されたことを確認するために、抗ＧＦＰ抗体を取り除いて抗チューブリン抗体で再検査した。細胞は分裂していなかった。 ウェスタンブロット分析によってアッセイされた相対的α−シヌクレインレベルを示すグラフ。神経芽細胞腫細胞は、Ｍａｙｏ２、Ｍａｙｏ７、またはＭａｙｏ８ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。内在性α−シヌクレインタンパク質の発現を、３日間にわたってモニターした。「トランスフェクションなし」の実験では、ｓｉＲＮＡはトランスフェクションされず、これらのサンプル中のタンパク質レベルを１００％の正常な発現として設定した。 内在性α−シヌクレインＲＮＡのレベルに対するＭａｙｏ２、Ｍａｙｏ７、およびＭａｙｏ８ ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフ。 ヒトおよびマウスのα−シヌクレイン／ＥＧＦＰ複合体の発現に対するｓｉＲＮＡの活性を示すグラフ。ＢＥ（２）−Ｍ１７ヒト神経芽細胞腫細胞を、ＥＧＦＰをコードするプラスミド（ベクター）またはヒトもしくはマウスのいずれかのα−シヌクレインと複合体化したＥＧＦＰをコードするプラスミド、およびＭａｙｏ２、Ｍａｙｏ７、もしくはＭａｙｏ８で同時トランスフェクションした。発現は、チューブリンの免疫反応を使用して均等化し、プラスミドのみの場合のＥＧＦＰの免疫反応性（対照）の発現に対する比率として測定した。 Ｍａｙｏ７（ＡＬ−ＤＵＰ−１４７７とも呼ばれる）ｓｉＲＮＡおよびＭａｙｏ８（ＡＬ−ＤＵＰ−１４７８とも呼ばれる）ｓｉＲＮＡにおける切断部位のＴ１マッピング実験を示すポリアクリルアミドゲルの図。レーン１は対照であり、Ｔ１緩衝液中でインキュベートしたｓｉＲＮＡを表す；レーン２は１×Ｔ１ ＲＮＡｓｅ中でインキュベートしたｓｉＲＮＡを表す；レーン３は０．１×Ｔ１ ＲＮＡｓｅ中でインキュベートしたｓｉＲＮＡを表す；レーン４はアルカリラダーである；レーン５は、それぞれ４時間ヒト血清中でインキュベートしたＭａｙｏ７およびＭａｙｏ８である；レーン６は、それぞれヒト血清中でインキュベーションする前のＭａｙｏ７およびＭａｙｏ８である。＊ｓは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−３２Ｐ−ＡＴＰとともにインキュベートすることによってｓｉＲＮＡのセンス鎖が５’３２Ｐ−標識されていることを示す。 Ｔ１ ＲＮＡｓｅアッセイ後のｓｉＲＮＡ切断部位を示す図。この切断部位は、Ｔ１切断の部位（Ｇの３’）およびヒト血清中のヌクレアーゼによる切断部位を含む。 神経芽細胞腫細胞株中で発現されたＥＧＦＰタンパク質またはＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ融合タンパク質のウェスタンブロットの図。細胞は、ＥＧＦＰを発現するプラスミド、またはＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ融合タンパク質を発現するプラスミドのいずれかと、表１に列挙されるｓｉＲＮＡとで同時トランスフェクションした。この図において、ｓｉＲＮＡであるＭａｙｏ２、Ｍａｙｏ７、Ｍａｙｏ７ｓ、Ｍａｙｏ８、Ｍａｙｏ８ｓ１、およびＭａｙｏ８ｓ２は表１のｓｉＲＮＡ（それぞれ、ＳＮＣＡ２、ＳＮＣＡ７、ＳＮＣＡ７ｓ、ＳＮＣＡ８、ＳＮＣＡ８ｓ１、およびＳＮＣＡ８ｓ２）と同じである。対照実験では、ｓｉＲＮＡを、ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ−ＮＡＣＰのベクターとともに細胞にトランスフェクションしなかった。ウェスタンブロット分析物は、サンプル間でタンパク質が等量装荷されたことを確認するために、抗ＧＦＰ抗体を取り除いて抗チューブリン抗体で再検査した。 ＥＧＦＰ／α−シヌクレインタンパク質発現に対する、図９Ａに記載のｄｓＲＮＡの効果を示すグラフ。ｙ軸は、対照の非トランスフェクション実験（ｕｎｔｒｎ）と比較したＥＧＦＰ免疫反応性（ＩＲ）の割合（％）を表す。 ＳＮＣＡ８ ｓｉＲＮＡ（表１を参照のこと）の安定性を実証するポリアクリルアミドゲルの図。ゲル中のＲＮＡはＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌ（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ）を用いて検出される。レーン１はＳＮＣＡ８ ｓｉＲＮＡ二本鎖である。レーン２は０時間の時点におけるＰＢＳ対照中のＳＮＣＡ８ ｓｉＲＮＡである。レーン３は２４時間の時点におけるＰＢＳ対照中のＳＮＣＡ８ ｓｉＲＮＡである。レーン４は０時間の時点におけるヒト血清中のＳＮＣＡ８ ｓｉＲＮＡである。レーン５は３０分間インキュベーション後のヒト血清中のＳＮＣＡ８ ｓｉＲＮＡである。レーン６は４時間インキュベーション後のヒト血清中のＳＮＣＡ８ ｓｉＲＮＡである。レーン７は２４時間インキュベーション後のヒト血清中のＳＮＣＡ８ ｓｉＲＮＡである。 ＳＮＣＡ８ ｓｉＲＮＡ（表１を参照のこと）の安定性を実証するポリアクリルアミドゲルの図。ゲル中のＲＮＡはＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌ（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ）を用いて検出される。レーン１はＳＮＣＡ８ｓ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖である。レーン２は０時間の時点におけるＰＢＳ対照中のＳＮＣＡ８ｓ１ ｓｉＲＮＡである。レーン３は２４時間の時点におけるＰＢＳ対照中のＳＮＣＡ８ｓ１ ｓｉＲＮＡである。レーン４は０時間の時点におけるヒト血清中のＳＮＣＡ８ｓ１ ｓｉＲＮＡである。レーン５は３０分間インキュベーション後のヒト血清中のＳＮＣＡ８ｓ１ ｓｉＲＮＡである。レーン６は４時間インキュベーション後のヒト血清中のＳＮＣＡ８ｓ１ ｓｉＲＮＡである。レーン７は２４時間インキュベーション後のヒト血清中のＳＮＣＡ８ｓ１ ｓｉＲＮＡである。 ＳＮＣＡ８ ｓｉＲＮＡ（表１を参照のこと）の安定性を実証するポリアクリルアミドゲルの図。ゲル中のＲＮＡはＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌ（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ）を用いて検出されている。レーン１はＳＮＣＡ８ｓ２ ｓｉＲＮＡ二本鎖である。レーン２は０時間の時点におけるＰＢＳ対照中のＳＮＣＡ８ｓ２ ｓｉＲＮＡである。レーン３は２４時間の時点におけるＰＢＳ対照中のＳＮＣＡ８ｓ２ ｓｉＲＮＡである。レーン４は０時間の時点におけるヒト血清中のＳＮＣＡ８ｓ２ ｓｉＲＮＡである。レーン５は３０分間インキュベーション後のヒト血清中のＳＮＣＡ８ｓ２ ｓｉＲＮＡである。レーン６は４時間インキュベーション後のヒト血清中のＳＮＣＡ８ｓ２ ｓｉＲＮＡである。レーン７は２４時間インキュベーション後のヒト血清中のＳＮＣＡ８ｓ２ ｓｉＲＮＡである。 Ｍａｙｏ２の遺伝子特異性を実証するグラフ。
二本鎖（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる過程を通してｍＲＮ
Ａの配列特異的サイレンシングをもたらす。この過程は、哺乳動物および他の脊椎動物を
含めた、広範な種々の生物に存在する。
ｄｓＲＮＡの２１〜２３ｎｔフラグメントが、例えば、ＲＮＡの分解を引き起こすこと
によるＲＮＡサイレンシングの配列特異的メディエーターであることが実証されてきた。
理論によって束縛されることは望まないが、これらの２１〜２３ｎｔフラグメント中に存
在する、特定の長さのフラグメントにすぎない分子シグナルが、ＲＮＡｉを仲介する細胞
因子を発動している可能性がある。本明細書に記載されるものは、これらの２１〜２３ｎ
ｔフラグメントおよび他のｉＲＮＡ剤を調製および投与するための方法、ならびに遺伝子
の機能、および特にＳＮＣＡ遺伝子の機能を特異的に不活性化するための、前記２１〜２
３ｎｔフラグメントおよび他のｉＲＮＡ剤の使用についてである。ｉＲＮＡ剤（または同
一もしくは類似の性質を有する組換え生産もしくは化学合成されたオリゴヌクレオチド）
の使用により、哺乳動物細胞中でサイレンシングするために特定のｍＲＮＡを標的とする
ことが可能となる。さらに、より長いｄｓＲＮＡフラグメントも、例えば以下に記載され
るように使用可能である。
哺乳動物細胞において、長いｄｓＲＮＡは、有害であることの多いインターフェロン応
答を誘導し得るが、短いｄｓＲＮＡ（ｓＲＮＡ）は、少なくとも細胞および宿主に対して
有害なほどはインターフェロン応答を誘発しない。特に、ｓＲＮＡ剤中のｉＲＮＡ剤の鎖
の長さは、例えば、有害なインターフェロン応答を誘導しないように十分に短く、３１、
３０、２８、２５、または２３ｎｔ未満であり得る。したがって、哺乳動物細胞へのｓＲ
ＮＡ剤の組成物（例えば、本明細書に記載されるように製剤化された組成物）の投与は、
インターフェロン応答を回避しながら標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用
され得る。さらに、個別の種類のｉＲＮＡ剤の使用により、例えば、対立遺伝子について
ヘテロ接合の対象において、標的遺伝子の一方の対立遺伝子を選択的に標的とすることが
可能である。
さらに、１つの実施形態において、哺乳動物細胞は、インターフェロン応答の構成成分
（例えば、ｄｓＲＮＡで活性化されるプロテインキナーゼＰＫＲ）を破壊するｉＲＮＡ剤
で処理される。このような細胞は、標的ＲＮＡに相補的な配列を含み、前記処理がなけれ
ばインターフェロン応答を誘発しうる長さを有する第２のｉＲＮＡ剤で処理することがで
きる。
代表的な実施形態において、対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ
、または霊長類などの哺乳動物である。より好ましい実施形態において、対象はヒトであ
り、例えば、健常人、あるいは疾患もしくは障害を有するか、疾患もしくは障害を有する
と診断されるか、または疾患もしくは障害を有する素因がある人である。特に、ヒトはＳ
ＮＣＡ遺伝子の過剰発現と関連した疾患もしくは障害、またはα−シヌクレインタンパク
質の凝集によって特徴付けられる疾患もしくは障害を有し得る。
ｉＲＮＡ剤によって仲介されるサイレンシングは、ｉＲＮＡ剤組成物の投与後数日間持
続し得るので、多くの場合において、組成物の投与は１日当たり１回未満の頻度とするこ
とが可能であり、また場合によっては、治療計画全体について１回のみとすることが可能
である。
α−シヌクレイン
α−シヌクレインタンパク質は主として細胞質中に見出されるが、核へも局在化してい
る。ドーパミン作動性ニューロンにおいては、α−シヌクレインは膜結合型である。この
タンパク質は、軸索のシナプス前部領域に通常局在している可溶性モノマーである。この
タンパク質は、神経変性シヌクレイン症における細胞内容物の主要な成分であるフィラメ
ント状凝集物を形成し得る。
α−シヌクレインタンパク質は、シヌクレイン症によって特徴付けられる多数の疾患と
関連がある。３つの点突然変異（Ａ５３Ｔ、Ａ３０Ｐ、およびＥ４６Ｋ）、ならびにＳＮ
ＣＡの二重化現象および三重化現象は、常染色体優性のパーキンソン病（家族性ＰＤ、Ｆ
ＰＤとも呼ばれる）と関連がある。Ａ５３Ｔ変異およびＡ３０Ｐ変異は、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏにおけるプロトフィブリル形成を促進するＳＮＣＡタンパク質の立体構造の変化を引き
起こす。三重化現象は、ＳＮＣＡタンパク質の２倍の過剰発現を生じる。α−シヌクレイ
ンは、ＦＰＤおよび特発性ＰＤに特徴的な細胞質内容物であるレーヴィ小体の主要な線維
成分であり、そしてパーキンソン病の脳の黒質は、線維状のα−シヌクレインを特徴とし
ている。アルツハイマー病患者においては、ＳＮＣＡペプチドは、アルツハイマー病を有
する患者の脳におけるアミロイドプラークの主要な成分である。
細胞の細胞質におけるα−シヌクレインの凝集は、該タンパク質の過剰発現、タンパク
質分解の阻害、または該タンパク質の構造に影響を与える突然変異を含む多数のメカニズ
ムによって引き起こされる可能性があり、このタンパク質が自己会合する傾向を増大させ
ている。
ＳＮＣＡ遺伝子産物は、ＰＤなどの神経変性疾患の治療方法のための標的であり得る。
この治療方法は、ｉＲＮＡ剤を用いてＳＮＣＡ核酸を標的とすることを含み得る。代替例
として、または加えて、遺伝子発現を阻害するためにアンチセンスＲＮＡを使用してもよ
いし、または抗体もしくは低分子を使用してＳＮＣＡ核酸を標的としてもよい。一般的に
、アンチセンスＲＮＡ、抗ＳＮＣＡ抗体、または低分子は、例えば、本明細書に記載され
る任意の方法または組成物によって、ｉＲＮＡ剤の代わりに使用可能である。ＳＮＣＡの
発現および活性を下方制御するための治療の組み合わせも使用可能である。
ＳＮＣＡ遺伝子の配列決定から、プロモーター内にジヌクレオチド反復配列（ＲＥＰ１
）を含む共通のバリアントが明らかになった。ＲＥＰ１は集団間で長さが異なり、かつ特
定の対立遺伝子バリアントはＰＤのリスクの増加と関連している（クルーガーら（Ｋｒｕ
ｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．第４５巻、６１１〜７ページ、１９
９９年）。ＳＮＣＡのＲＥＰ１遺伝子座は、正常な遺伝子発現のために必要である（タッ
チマンら（Ｔｏｕｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．第１１巻、７８
〜８６ページ、２００１年）。異なるＲＥＰ１の対立遺伝子間のＳＮＣＡ遺伝子発現のレ
ベルは、３倍の範囲にわたって有意に変化し、このことは、特定の遺伝子型とＰＤのリス
ク増加との関連性がＳＮＣＡの遺伝子の過剰発現の結果である可能性があることを示唆し
ている（チバ−ファレック（Ｃｈｉｂａ−Ｆａｌｅｋ）およびヌスバウム（Ｎｕｓｓｂａ
ｕｍ）、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．第１０巻、３１０１〜９ページ、２００１年）。
ＳＮＣＡ遺伝子のＲＥＰ１遺伝子座における対立遺伝子内バリエーションの機能的分析は
、対立遺伝子の全体の長さが転写調節において主要な役割を果たすことを暗示し；配列が
不均一性であっても、長さにより規定される対立遺伝子に基づく遺伝学的関連研究を混乱
させることはなさそうである（チバ−ファレックら（Ｃｈｉｂａ−Ｆａｌｅｋ ｅｔ ａ
ｌ．）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．第１１３巻、４２６〜３１ページ、２００３年）。ＰＤの
まれな原因としてのＳＮＣＡ遺伝子三重化という最近の発見は、該遺伝子のプロモーター
中の多型が、遺伝子の過剰発現の同じメカニズムを介して感受性を付与するという観察と
一致している（シングレトンら（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ
第３０２巻、８４１ページ、２００３年）。
３つのＳＮＣＡスプライシングバリアントが同定されている（図１Ａを参照のこと）。
全長１４０アミノ酸型のタンパク質が最も豊富である。１２８アミノ酸型はエキソン３を
欠き、そして１１２アミノ酸型はエキソン５を欠く。本発明のｉＲＮＡは、ＳＮＣＡのあ
らゆるアイソフォームを標的とし得る。ｉＲＮＡは、すべての既知のアイソフォームを効
果的に標的とするために共通のエキソン（例えば、エキソン２、４、６、または７）を標
的とし得る。ｉＲＮＡ剤はスプライシングジャンクションを標的としてもよいし、または
特定のアイソフォームを標的とするために選択的スプライシングを受けるエキソンを標的
としてもよい。例えば、１１２アミノ酸のアイソフォームを標的とするために、ｉＲＮＡ
剤は、エキソン４／エキソン６のスプライシングジャンクションと部分的に一致するｍＲ
ＮＡ配列を標的とし得る。１２８アミノ酸のタンパク質アイソフォームを標的とするため
に、ｉＲＮＡ剤は、エキソン２／エキソン４ジャンクションと部分的に一致するｍＲＮＡ
配列を標的とし得る。
パーキンソン病の治療
ＰＤ（または任意の他のα−シヌクレイン関連障害）を有する任意の患者が、本明細書
に記載される方法または組成物を用いる治療のための候補である。好ましくは、患者は末
期ではなく（例えば、患者は２年間以上の平均余命を有する）、そして好ましくは、患者
はパーキンソン病の最終段階（すなわち、ホーン（Ｈｏｅｈｎ）およびヤール（Ｙａｈｒ
）の段階５）には達していない。
前駆症状を有する対象もまた、抗ＳＮＣＡ剤（例えば、抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤、アン
チセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ジンクフィンガータンパク質、抗体、または
低分子）を用いる治療のための候補であり得る。１つの実施形態において、前駆症状を有
する候補は、リスク−要因プロファイリングおよび機能的神経画像化（例えば、フルオロ
ドーパおよびポジトロン放出断層撮影による）のいずれかまたは両方によって同定される
。例えば、この候補は、リスク−要因プロファイリング、その後の機能的神経画像化によ
って同定可能である。
任意の遺伝子型を有する個体が治療のための候補である。ある実施形態において、患者
は、その患者がＰＤを発症するリスクを増大させる特定の遺伝子変異を有する。例えば、
ＳＮＣＡ遺伝子多重化（例えば、ＳＮＣＡ遺伝子の二重化または三重化）を有する個体は
、ＰＤを発症するリスクが増大しており、ｉＲＮＡ剤を用いる治療のための候補である。
さらに、ＳＮＣＡにおける機能獲得性突然変異（gain-of-function mutation ）は、個体
がＰＤを発症するリスクを増大させ得る。ＳＮＣＡ ＲＥＰ１遺伝子型（例えば、ＲＥＰ
１「＋１対立遺伝子」のヘテロ接合またはホモ接合の遺伝子型）を有する個体は、このよ
うな治療のための候補であり得る。ＲＥＰ１＋１対立遺伝子についてホモ接合の個体はＳ
ＮＣＡを過剰発現する。ＵＣＨＬ−１、ｐａｒｋｉｎ、またはＳＮＣＡの遺伝子における
突然変異を有する個体は、ＰＤのリスクが増大しており、かつ抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤を
用いる治療のための候補であり得る。特に、ＵＣＨＬ−１遺伝子またはｐａｒｋｉｎ遺伝
子における突然変異は、遺伝子またはタンパク質の活性の減少を引き起こす。Ｔａｕ遺伝
子型（例えば、Ｔａｕ遺伝子における突然変異）またはＴａｕハプロタイプ（例えば、Ｈ
１ハプロタイプなど）を有する個体もまた、ＰＤを発症するリスクを有している。他の遺
伝的なリスク因子には、遺伝子ＭＡＰＴ、ＤＪ１、ＰＩＮＫ１、およびＮＵＲＲ１におけ
る突然変異、および遺伝子ＳＮＣＡ、ｐａｒｋｉｎ、ＭＡＰＴ、およびＮＡＴ２を含むい
くつかの遺伝子における多型が含まれる。
ＰＤの非遺伝性の（例えば、環境的な）リスク要因には、年齢（例えば、３０歳、３５
歳、４０歳、４５歳、または５０歳を超える年代）、性別（男性は一般的に女性よりも高
いリスクを有する）、除草剤への曝露、重金属への曝露、および頭部の外傷が含まれる。
一般的に、ユビキチンプロテアソーム経路を破壊する、もしくはより特異的にプロテアソ
ームを阻害する、またはミトコンドリア機能を破壊する、または酸化的ストレスを生じる
、またはα−シヌクレインの凝集および繊維化を促進する内在性および外因性の因子が、
ヒトがＰＤを発症するリスクを増大させる可能性があり、かつＰＤの病因に寄与し得る。
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤はＰＤを有する対象において野生型ＳＮＣＡを標
的とするために使用可能である。
他の神経変性障害の治療
シヌクレイン症によって特徴付けられる任意の疾患（多系統萎縮症、レーヴィ小体痴呆
、およびアルツハイマー病を含む）が、本明細書に記載される阻害剤（例えば、ＳＮＣＡ
を標的とする薬剤）を用いて治療可能である。あらゆる遺伝子型の個体が治療のための候
補である。ある実施形態において、患者は、シヌクレイン症発症リスクを増大させる特定
の遺伝子突然変異を有する。
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、神経変性障害を有する対象中で野生型ＳＮＣ
Ａを標的とするために使用可能である。
個体が、特定の環境因子の結果としてシヌクレイン症を発症する可能性がある。例えば
、酸化的ストレス、特定の除草剤（例えば、２４Ｄおよびオレンジ剤）、細菌感染、およ
び頭部外傷は、ＰＤを発症するリスクの増加と関連付けられており、シヌクレイン症につ
いての個体のリスクを決定する決定要因であり得る。これらの要因（および本明細書に開
示される他の要因）は、抗ＳＮＣＡ治療についての候補対象のリスクプロファイルを評価
する際に考慮されうる。
ｉＲＮＡ剤の設計および選択
候補ｉＲＮＡ剤は、遺伝子ウォーキング分析を実行することによって設計可能である。
転写される領域の全体または一部に対応する、重複し、隣接し、または近接しているが間
隔のあいた複数の候補薬剤を作製し試験することが可能である。各ｉＲＮＡ剤について、
標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションする能力に関して試験および評価することが
可能である（後述する「候補ｉＲＮＡ剤の評価」を参照のこと）。
ｉＲＮＡ剤は、配列情報および所望の特徴に基づいて合理的に設計可能である。例えば
、ｉＲＮＡ剤は、候補二重鎖の相対的融解温度に従って設計可能である。一般的に、二重
鎖は、アンチセンス鎖の３’末端よりもアンチセンス鎖の５’末端において低い融解温度
を有することになる。合理的設計についてのこの要素および他の要素は、以下においてよ
り詳細に議論される（例えば、「パリンドローム」「非対称性」および「Ｚ−Ｘ−Ｙ」、
ならびに「二本鎖末端安定性の差次的修飾」および「ワトソン−クリック以外の対合」と
記された節を参照のこと）。
ＳＮＣＡ ＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤は、表１のｓｉＲＮＡのうちいずれかの配列
を有し得る。特に、ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡ２、７（もしくは７ｓ）、または８（もしく
は８ｓ１もしくは８ｓ２）の配列を有するとよいが、これらは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉ
ｎ ｖｉｔｒｏにおいてＳＮＣＡ遺伝子をサイレンシングするために最も有効であること
が見出された。
候補ｉＲＮＡ剤の評価
抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤候補は、ＳＮＣＡ遺伝子の発現をダウンレギュレーションする
能力について評価可能である。例えば、候補ｉＲＮＡ剤が提供され、かつＳＮＣＡ遺伝子
を発現する細胞と接触させることが可能である。候補ｉＲＮＡ剤との接触の前後のＳＮＣ
Ａ遺伝子の発現レベルが比較可能である。標的ＳＮＣＡ遺伝子は、細胞中の、内在性遺伝
子でも外来遺伝子でもよい。ＳＮＣＡ遺伝子から発現されるＲＮＡまたはタンパク質の量
がｉＲＮＡ剤との接触後に低くなることが測定されれば、該ｉＲＮＡ剤がＳＮＣＡ遺伝子
の発現をダウンレギュレーションすると結論付けることができる。細胞中のＳＮＣＡ Ｒ
ＮＡまたはタンパク質のレベルは、所望される任意の方法によって決定可能である。例え
ば、ＳＮＣＡ ＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応と共役
した逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＲＮＡｓｅ保護アッセイによって決定可能であ
る。タンパク質のレベルはウェスタンブロット分析によって決定可能である。
ｉＲＮＡ剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系およびｉｎ ｖｉｖｏの系のうち少なくともいず
れかにおいて試験可能である。例えば、標的遺伝子またはそのフラグメントを、プラスミ
ド上のレポーター遺伝子に融合させることが可能である。このプラスミドで、ｉＲＮＡ剤
候補とともに細胞をトランスフェクションすればよい。ｉＲＮＡ剤の効力は、レポーター
遺伝子の発現をモニターすることによって評価可能である。このレポーター遺伝子は、例
えば、蛍光またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などによってｉｎ ｖｉｖｏ
でモニター可能である。例示的な蛍光レポーター遺伝子には、緑色蛍光タンパク質および
ルシフェラーゼが含まれるがこれらに限定されない。レポーター遺伝子の発現は、上記の
ような、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、またはウェスタン
ブロット分析によってモニターすることもできる。
抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤の効力は、哺乳動物の細胞株（例えば、哺乳動物の神経細胞株
）、例えばヒト神経芽細胞腫の細胞株などにおいて試験可能である。例えば、抗ＳＮＣＡ
ｉＲＮＡ剤の効力を試験するために有用な細胞株は、ニューロン性の表現型を有するも
の（神経芽細胞腫、ニューロンに分化した褐色細胞腫、および初代ニューロン培養物）ま
たは非ニューロン性の細胞株（例えば、腎臓、筋肉、または卵巣の細胞）である。神経芽
細胞腫の細胞株には、ＢＥ（２）−Ｍ１７、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（いずれもヒト）、およびＮ
２ａ（マウス）が挙げられる。ＢＥ（２）−Ｍ１７細胞は、α−シヌクレイン症に罹患し
たヒト脳のドーパミン作動性ニューロンを生化学的に模倣する。
対照には、
（１）例えば、内在性または外来の、標的ではない（オフターゲットの）ＲＮＡまたは
タンパク質の発現と比較することによって、標的遺伝子の発現の減少についてアッセイし
、ｉＲＮＡの効力および特異性を試験すること；および
（２）「非機能性の」ｉＲＮＡ剤を投与することによって、標的遺伝子の発現に対する
効果の特異性を試験すること
が含まれる。
非機能性の対照ｉＲＮＡ剤は、
（ａ）細胞中で発現されない遺伝子を標的とするもの；
（ｂ）ナンセンス配列（例えば、試験ｉＲＮＡを乱雑化（スクランブル）したもの）で
あるもの；または
（ｃ）標的遺伝子に対して相補的な配列を有するが、遺伝子発現をサイレンシングする
能力を欠くことが事前の実験によってわかっているもの
であってよい。
アッセイには、ｉＲＮＡ剤によるサイレンシング効果の安定性および時間をモニターす
るための、かつ分裂中の細胞と分裂していない細胞とを比較してモニターするための経時
的実験が含まれる。おそらく、分裂中の細胞においては、ｄｓＲＮＡは時間の経過ととも
に希釈され、したがってサイレンシング効果の期間が減少する。この意味するところは、
ｉｎ ｖｉｖｏでは投薬量を調整しなければならないこと、および／またはサイレンシン
グ効果を維持するためにｉＲＮＡ剤をより頻繁に投与しなければならないことである。分
裂していない細胞をモニターするためには、血清の使用を中止して細胞を分裂停止させれ
ばよい。ニューロンは分裂終了細胞であり、したがって神経細胞は、神経系の障害（例え
ば、神経変性障害）の治療のための治療用組成物において使用するためのｉＲＮＡ剤（例
えば、抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤）の安定性をアッセイするために適している。
ｉＲＮＡ剤候補を、種間の交差反応性について評価することも可能である。例えば、異
なる種（例えば、マウス対ヒト）から誘導された細胞株、または異なる種から単離された
生物学的試料（例えば、血清または組織抽出物）を、標的ｉＲＮＡ剤および候補ｉＲＮＡ
剤でトランスフェクションすることが可能である。異なる種由来の細胞についてｉＲＮＡ
剤の効力を決定すればよい。
ｉＲＮＡ剤の安定性試験、修飾、および再試験
候補のｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤が対象の身体に導入される場合などの、エンドヌク
レアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断に対する感受性に関して評価することがで
きる。修飾、特に切断（例えば、対象の体内に見出される成分による切断）に感受性を有
する部位を同定するための方法を利用可能である。この成分（例えば、エキソヌクレアー
ゼまたはエンドヌクレアーゼ）は、特定の組織、器官、または体液（例えば、血液、血漿
、または血清）などの身体の特定の領域に特異的であり得る。身体の特定の領域における
エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断のいずれかに感受性を有する、
ｉＲＮＡ剤中の部位は、身体の他の領域における切断に対しては耐性である可能性がある
。例示的な方法には：
（１）対象の体内に存在する物質、および好ましくは治療用ｄｓＲＮＡが導入される身
体のコンパートメント（治療剤が直接導入されるコンパートメント（例えば、循環系）な
らびに治療剤が最終的に標的とするコンパートメントがあるが、場合によっては（例えば
、眼および脳）、２つのコンパートメントは同じである））中に存在する成分が、ｄｓＲ
ＮＡ（例えば、ｉＲＮＡ剤）を切断する時点を決定する工程、および
（２）ｄｓＲＮＡ中の、（例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、または
その両方による）１つまたは複数の切断部位を同定する工程
が含まれる。任意選択で、この方法はさらに、このような部位における切断を阻害するた
めに修飾されたＲＮＡを提供する工程を包含する。
これらの工程は、以下のアッセイのうち１つ以上を使用することによって達成可能であ
る。
（ｉ）（ａ）候補のｄｓＲＮＡ剤（例えば、ｉＲＮＡ剤）を試験物質（例えば、生体物
質）と接触させる工程、
（ｂ）サイズに基づくアッセイ（例えば、ゲル電気泳動）を使用して、ｉＲＮＡ剤が
切断されるか否かを決定する工程。好ましい実施形態では、経時変化が測定され、異なる
時間インキュベートされた多数の試料がサイズに基づくアッセイに供される。好ましい実
施形態では、候補のｄｓＲＮＡは標識されない。この方法は、「全体を染色する（ｓｔａ
ｉｎｓ ａｌｌ）」方法であり得る。
（ｉｉ）（ａ）放射標識された候補ｄｓＲＮＡ（例えば、ｉＲＮＡ剤）を供給する工程
；
（ｂ）試験物質と候補ｄｓＲＮＡを接触させる工程、
（ｃ）サイズに基づくアッセイ（例えば、ゲル電気泳動）を使用して、ｉＲＮＡ剤が
切断されるか否かを決定する工程。好ましい実施形態では、経時変化が測定されるが、そ
の場合は多数の試料が異なる時間インキュベートされてサイズに基づくアッセイに供され
る。好ましい実施形態において、測定は、フラグメント中に存在するヌクレオチド数の決
定が可能な条件下でなされる。例えば、インキュベートされた試料は、切断産物の長さを
決定可能にするマーカーを有するゲルで泳動される。このゲルは、「ラダー」状の消化物
である標準品を含んでもよい。センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを標識してもよ
い。好ましくは、一方の鎖のみが特定の実験において標識される。標識は、５’末端、３
’末端、または内部の位置に組み込むことが可能である。フラグメントの長さ（およびし
たがって切断部位）は、上記のラダー、およびＲＮＡｓｅ Ｔ１などの部位特異的エンド
ヌクレアーゼを用いたマッピングに基づくフラグメントのサイズから決定可能である。
（ｉｉｉ）任意の方法（例えば、上記のうちの１つ）によって生じたフラグメントは質
量分析法によって分析可能である。試験物質とｉＲＮＡ剤を接触させた後、ｉＲＮＡ剤を
、例えば、フェノール−クロロホルム抽出とその後の沈殿処理によって精製（例えば、部
分精製）可能である。次いで、液体クロマトグラフィーを使用してフラグメントを分離可
能であり、そして質量分析法を使用して各フラグメントの分子量を決定することができる
。このことにより、切断のメカニズム、例えば、５’または３’エキソヌクレアーゼ切断
などの直接的なリン酸の切断によるか、または環状リン酸の形成を介して２’ＯＨによっ
て仲介されるかを決定することができる。
２つ以上のｄｓＲＮＡ（例えば、抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤）を評価することが可能であ
る。この評価を用いて、治療用ｉＲＮＡ剤に使用する配列を選択することが可能である。
例えば、評価することによって、対象の体内の関連するコンパートメント中に存在する物
質（例えば、酵素）によって切断される最適な（通常最小の）数の部位を有する配列を選
択することが可能になる。最適化された配列を選択するために、２つ以上のｄｓＲＮＡ候
補を評価すればよい。例えば、２つ以上の候補を評価し、最適な特性を有するもの（例え
ば、切断部位がより少ないもの）を選択することが可能である。
切断部位に関する情報は、修飾（例えば、切断を減少させるための修飾）のためのバッ
クボーンの原子、糖、または塩基を選択するために使用可能である。
例示的な修飾には、本明細書に記載される修飾などの、エンドヌクレアーゼによる分解
を阻害する修飾が含まれる。特に好ましい修飾には：２’−修飾、例えば、センス鎖また
はアンチセンス鎖（とりわけセンス鎖）のＵへの２’ＯＭｅ部分の付与；バックボーンの
修飾、例えば、リン酸バックボーン内のＯのＳへの置換を伴う修飾、例えば、特にアンチ
センス鎖のＵまたはＡまたはその両方へのホスホロチオエート修飾の付与；ＵからＣ５ア
ミノリンカーへの置換；ＡからＧへの置換（配列の変化はセンス鎖上に配置されアンチセ
ンス鎖上には配置されないことが好ましい）；および２’位、６’位、７’位、または８
’位の修飾、が含まれる。好ましい実施形態は、これらの修飾のうち１つ以上がセンス鎖
上に存在するがアンチセンス鎖上には存在しない実施形態、またはアンチセンス鎖が有す
るこのような修飾がより少ない実施形態である。
例示的な修飾には、エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾も含まれる。エキソ
ヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は本明細書において見出され得る。特に好ま
しい修飾には：２’−修飾、例えば、３’突出部の例えば３’末端（３’末端とは、文脈
から示されるように、分子の３’位の原子または最も３’側の構成部分、例えば最も３’
側のＰまたは２’位を意味する）への２’ＯＭｅ部分の付与；バックボーンの修飾、例え
ば、ＰからＳへの置換を伴う修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾の付与、または３’
突出部の例えば、３’末端におけるメチル化Ｐの使用；２’−修飾の組み合わせ、例えば
、２’ＯＭｅ部分およびバックボーンの修飾（例えば、ＰからＳへの置換を伴う修飾、例
えば、ホスホロチオエート修飾の供給、または３’突出部の例えば３’末端におけるメチ
ル化Ｐの使用）の付与；３’アルキルを用いる修飾；３’突出部の例えば３’末端におけ
る脱塩基ピロリジンを用いる修飾；ナプロキセン、イブプロフェン、または分解を阻害す
る他の部分を用いる３’末端の修飾、が挙げられる。
これらの方法は、治療用の抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤を選択およびまたは最適化するため
に使用可能である。
該方法は、修飾されていない候補ｄｓＲＮＡ、または修飾（例えば、分解を阻害する修
飾、ｄｓＲＮＡ分子を標的化する修飾、またはハイブリダイゼーションを調節する修飾）
を含む候補ｄｓＲＮＡ（例えば、候補ｉＲＮＡ剤）を評価するために使用可能である。こ
のような修飾は本明細書に記載されている。切断アッセイは、修飾または非修飾候補の標
的をサイレンシングする能力を決定するためのアッセイと組み合わせることが可能である
。例えば、標的（または標的でない配列）をサイレンシングする能力を評価するために候
補を（任意選択で）試験してもよいし、切断に対する感受性を評価してもよいし、修飾候
補を作製するために候補ｄｓＲＮＡを（例えば、本明細書に記載されるように、例えば、
分解を阻害するために）修飾してもよいし、サイレンシング能力および分解に抵抗する能
力のうち一方または両方について修飾体を試験してもよいであろう。この手法を繰り返し
ても良い。修飾は、一度に１つ導入してもよいし、まとめて導入してもよい。ｉＲＮＡ剤
がサイレンシングする能力をモニターするために、細胞を用いる方法を使用することもで
きる。これに続いて、活性を確認するために、異なる方法、例えば、動物全体を用いる方
法を実施可能である。
試験物質とは、生体物質、例えば、生物学的試料、組織抽出物もしくは調製物、血清、
ｄｓＲＮＡを修飾（例えば、切断）することが知られている既知の酵素またはその他の分
子（例えば、エンドヌクレアーゼ）をいう。試験物質は、ＲＮＡｉ剤が曝露されることに
なる体内コンパートメントに存在し得る。例えば、神経組織に（例えば、脳または脊髄に
）直接的に投与されるｉＲＮＡ剤については、試験物質は脳組織抽出物または脊髄液であ
り得る。眼に直接的に供給されるｉＲＮＡ剤は、眼の抽出物とともにインキュベートすれ
ばよい。
ｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＳＮＣＡ遺伝子の発現を阻害することができると同定されたｉＲＮＡ剤は、動物モデル
（例えば、マウスまたはラットなどの哺乳動物のモデル）においてｉｎ ｖｉｖｏでの機
能性について試験可能である。例えば、ｉＲＮＡ剤を動物に投与して、該ｉＲＮＡ剤の生
体内分布、安定性、およびＳＮＣＡ遺伝子の発現を阻害する能力に関して評価可能である
。
ｉＲＮＡ剤は、例えば注射によって標的組織に直接投与されてもよいし、またはヒトに
投与されるのと同じ様式で動物モデルに投与されてもよい。例えば、ｉＲＮＡ剤が脳の標
的領域に（例えば、皮質、黒質、淡蒼球、または海馬に）直接注射され、一定時間の後に
脳が採取され組織薄片が薬剤の分布について試験されてもよい。
ｉＲＮＡ剤はまた、その細胞内分布についても評価可能である。この評価は、ｉＲＮＡ
剤が細胞に取り込まれたか否かを決定することを包含し得る。この評価は、ｉＲＮＡ剤の
安定性（例えば、半減期）を決定することを包含し得る。ｉｎ ｖｉｖｏでのｉＲＮＡ剤
の評価は、追跡可能なマーカー（例えば、フルオレセイン［その他］などの蛍光マーカー
；３２Ｐ、３３Ｐ、もしくは３Ｈなどの放射活性標識；金粒子；または免疫組織化学法の
ための抗原粒子）と複合体化されたｉＲＮＡ剤の使用によって容易となりうる。
生体内分布をモニターするために有用なｉＲＮＡ剤は、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子サイ
レンシング活性を欠いていてもよい。例えば、ｉＲＮＡ剤は、その動物には存在しない遺
伝子を標的としてもよく（例えば、マウスに注射されるｉＲＮＡ剤がルシフェラーゼを標
的としていてもよい）、またはｉＲＮＡ剤がいかなる遺伝子も（例えば、内在性のいかな
る遺伝子も）標的としないナンセンス配列を有していてもよい。
ｉＲＮＡの局在化／生体内分布は、ｉＲＮＡ剤に結合された追跡可能な標識、例えば、
上記の追跡可能な薬剤などによってモニター可能である。
ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡ発現をダウンレギュレーションする能力に関して評価可能であ
る。ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＮＣＡ発現のレベルは、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションによって、またはｉＲＮＡ剤に曝露させる前後に組織からＲＮＡを単離すること
によって測定可能である。ＳＮＣＡ ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、また
はＲＮＡａｓｅ保護アッセイを含むがこれらに限定されない任意の所望の方法によって検
出可能である。代替として、または追加として、ＳＮＣＡ遺伝子の発現を、抗ＳＮＣＡ
ｉＲＮＡ剤で処理された組織抽出物についてウェスタンブロット分析を実行することによ
ってモニターすることが可能である。
抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤は、マウスのＰＤモデルで試験することが可能であり、該モデ
ルは、例えば、ヒトＳＮＣＡ遺伝子の野生型コピーを有するマウス（マスリアら（Ｍａｓ
ｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２８７巻、１２６５〜１２６９ページ、
２０００年）、または変異型ヒトＳＮＣＡを有するマウス（リッチフィールドら（Ｒｉｃ
ｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．第１７５巻、３５〜４８ページ
、２００２年；ジアソンら（Ｇｉａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｅｕｒｏｎ 第３４巻
、５２１〜５３３ページ、２００２年；リーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９９巻、８９６８〜８９７３ページ、２００２年）である
。上記変異型マウスは、Ａ５３Ｔ変異、Ａ３０Ｐ変異、またはＥ４６Ｋ変異を発現するヒ
トＳＮＣＡ遺伝子を有していてもよい。治療処理されたマウスモデルを、ＰＤに関連する
症状の減少について観察すればよい。
ｉＲＮＡの化学
ＲＮＡｉを仲介する単離ｉＲＮＡ剤（例えば、ＲＮＡ分子（二本鎖；一本鎖））が本明
細書中に記載される。このｉＲＮＡ剤は、対象者の内在性ＳＮＣＡ遺伝子に関連するＲＮ
Ａｉを好適に仲介する。
ｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤またはそのフラグメントが標的遺伝子のダウンレギュレー
ションを仲介することが可能であるように、標的遺伝子に対して十分な相同性の領域を含
み、かつヌクレオチドの長さが十分であるべきである。（説明を簡略化するために、本明
細書中では、用語ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、ＲＮＡ剤の１つ以上のモノマ
ーサブユニットを指すために使用されることがある。本明細書中において、用語「リボヌ
クレオチド」または「ヌクレオチド」を使用するとき、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代
用物の場合においては、修飾ヌクレオチド、または１つ以上の位置での代用物で置換した
部分をも意味し得ることが本明細書中で理解されよう。）したがって、ｉＲＮＡ剤は、少
なくとも部分的に、およびある実施形態においては完全に、標的ＲＮＡに相補的な領域で
あるか、またはその領域を含む。ｉＲＮＡ剤と標的との間の完全な相補性が存在すること
は必ずしも必要ではないが、その一致は、ｉＲＮＡ剤またはその切断産物が、例えば、標
的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ切断によって、配列特異的に発現を抑制するこ
とを可能にするために十分でなくてはならない。
標的鎖との相補性、または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重大である。
特に、アンチセンス鎖における完全な相補性が望ましいことが多いが、ある実施形態は、
特にアンチセンス鎖において、１つ以上であるが好ましくは６個、５個、４個、３個、２
個、またはそれより少ないミスマッチ（標的ＲＮＡに関して）を含むことが可能である。
特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域において最も寛容性が高く、存在す
る場合、好ましくは末端領域において、例えば、５’末端および／または３’末端の６ヌ
クレオチド以内、５ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、または３ヌクレオチド以内
である。センス鎖は、該分子の二本鎖全体の性質を維持するために十分なだけのアンチセ
ンス鎖との相補性があればよい。
ｉＲＮＡ剤の一本鎖領域は、修飾されるかまたはヌクレオシド代用物を含むことが多く
、例えば、ヘアピン構造の対合していない領域（例えば、２つの相補性領域をつなぐ領域
）は、修飾またはヌクレオシド代用物を有し得る。ｉＲＮＡ剤の３’末端もしくは５’末
端のうち一方または両方を、例えば、エキソヌクレアーゼに対して安定化するために修飾
すること、またはアンチセンスｓＲＮＡ剤をＲＩＳＣに優先的に入れるための修飾するこ
とも好ましい。修飾は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリ
ンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチド性スペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１
２、無塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特殊なビオチン、
あるいは、ホスホルアミダイトとして提供され、かつ別のＤＭＴ保護されたヒドロキシル
基を有し、ＲＮＡ合成の際に複数のカップリングを可能にするフルオレセイン試薬を含む
ことが可能である。本明細書中の他所で議論するように、ｉＲＮＡ剤は修飾されるか、ま
たはヌクレオチド代用物に加えてリボース置換モノマーサブユニット（ＲＲＭＳ）を含む
ことが多いであろう。ＲＲＭＳはリボヌクレオチドのリボース糖を、別の部分、例えば糖
質以外の（好ましくは環式の）担体で置換する。ＲＲＭＳについては後に詳細に説明する
。
ｉＲＮＡ剤には以下のものが含まれる：インターフェロン応答を誘発するために十分に
長い分子（これはダイサー（Ｄｉｃｅｒ、ベルンシュタインら（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅ
ｔ ａｌ．）、２００１．Ｎａｔｕｒｅ、４０９：３６３〜３６６）によって切断され、
ＲＩＳＣ（ＲＮＡｉ誘導性サイレンシング複合体）に入る）；およびインターフェロン応
答を誘発しないために十分に短い分子（この分子もまたＤｉｃｅｒによって切断されるこ
とが可能であり、かつ／またはＲＩＳＣに入る）、例えば、ＲＩＳＣに入ることを可能に
するサイズである分子、例えば、Ｄｉｃｅｒ切断産物に類似する分子。インターフェロン
応答を誘発しない十分に短い分子は、本明細書中では、ｓＲＮＡ剤または短いｉＲＮＡ剤
と呼ばれる。「ｓＲＮＡ剤または短いｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、ｉ
ＲＮＡ剤、例えば、ヒト細胞において有害なインターフェロン応答を誘導しない十分に短
い二本鎖ＲＮＡ剤または一本鎖ＲＮＡ剤をいい、例えば、同ＲＮＡ剤は、６０ヌクレオチ
ド対未満、しかし好ましくは、５０、４０、または３０ヌクレオチド対未満の二本鎖領域
を有する。このｓＲＮＡ剤またはその切断産物は、例えば、標的ＲＮＡ（好ましくは、内
在性または病原性の標的ＲＮＡ）に関してＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子
をダウンレギュレーションすることが可能である。
ｓＲＮＡ剤の各々の鎖は、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオ
チド長以下であり得る。鎖は、好ましくは、少なくとも１９ヌクレオチド長である。例え
ば、各々の鎖は２１から２５の間のヌクレオチド長であり得る。好ましいｓＲＮＡ剤は、
１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二本鎖
、および１つ以上の突出部、好ましくは２〜３ヌクレオチドの１つまたは２つの３’突出
部を有する。
標的ＲＮＡに対する相同性および標的遺伝子をダウンレギュレーションする能力に加え
て、ｉＲＮＡ剤は好ましくは以下の特性の１つ以上を有する：
（１）以下の「ＲＮＡ剤」の節において示される式１、２、３、または４のものである
；
（２）一本鎖である場合、１つ以上のリン酸基または１つ以上のリン酸基アナログを含
む５’修飾を有する；
（３）非常に多数またはすべてのヌクレオシドが修飾されているにもかかわらず、正確
な塩基対を形成可能であり、例えば標的ＲＮＡの切断によって標的のダウンレギュレーシ
ョンを可能にするために十分な、相同な標的ＲＮＡとの二本鎖構造を形成することが可能
なように、正しい三次元構造にある塩基（または修飾塩基）を提供することが可能なアン
チセンス鎖を有する；
（４）非常に多数またはすべてのヌクレオシドが修飾されているにもかかわらず、なお
「ＲＮＡ様の」特性を有する。すなわち、リボヌクレオチドに基づく含量では独占的でな
く、または部分的でさえあるにも関わらす、ＲＮＡ分子の全体的な構造、化学的特性およ
び物理的特性を有する。例えば、ｉＲＮＡ剤は、例えば、すべてのヌクレオチド糖が２’
ヒドロキシルの代わりに例えば２’フルオロを含むセンス鎖および／またはアンチセンス
鎖を含むことが可能である。このデオキシリボヌクレオチド含有剤は、なおＲＮＡ様の特
性を示すことが予測されうる。理論によって束縛されることを望まないが、電気的に陰性
のフッ素は、リボースのＣ２’位に結合されたときに軸方向に配向する傾向がある。この
フッ素の空間的な優先傾向は、ひいては、糖のＣ３’内部にくぼみを形成させる。これは
、ＲＮＡ分子中で観察されるのと同じくぼみ形成様式であり、ＲＮＡに特徴的なＡファミ
リー型ヘリックスを生じる。さらに、フッ素は良好な水素結合のアクセプターであるので
、ＲＮＡ構造を安定化させることが知られている水分子と同じ水素結合相互作用に関与す
ることが可能である。一般的には、糖の２’位で修飾された部分は、デオキシリボヌクレ
オチドのＨ部分よりも、リボヌクレオチドのＯＨ部分により特徴的であるＨ結合に入るこ
とができることが好ましい。好ましいｉＲＮＡ剤は：その糖の全体、またはその糖の少な
くとも５０、７５、８０、８５、９０、または９５％において、Ｃ３’内部にくぼみを示
し；ｉＲＮＡ剤の十分量の糖においてＣ３’内部のくぼみを示し、ＲＮＡに特徴的なＡフ
ァミリー型ヘリックスを生じることが可能であり；Ｃ３’内部のくぼみ構造ではない２０
個、１０個、５個、４個、３個、２個、または１個以下の糖を有する。これらの制限はア
ンチセンス鎖において特に好ましい；
（５）修飾の性質にかかわらず、およびＲＮＡ剤が、特に突出部または他の一本鎖領域
内にデオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含むことが可能であるとし
ても、ＤＮＡ分子、あるいは、分子中のヌクレオチドの５０、６０、もしくは７０％より
多く、または二本鎖領域のヌクレオチドの５０、６０、または７０％より多くがデオキシ
リボヌクレオチド、あるいは２’位がデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドであ
る任意の分子は、ＲＮＡ剤の定義から除外することが好ましい。
「一本鎖ｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、単一の分子から作られている
ｉＲＮＡ剤である。これは、鎖内の対合によって形成される二本鎖領域を含んでもよく、
例えば、該領域はヘアピン構造またはパン−ハンドル構造であってもよいし、これを含ん
でもよい。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、標的分子に関してアンチセンスであることが好ましい。
好ましい実施形態において、一本鎖ｉＲＮＡ剤は５’がリン酸化されるか、または５’プ
ライム末端にホスホリルアナログを含む。５’リン酸修飾は、ＲＩＳＣが仲介する遺伝子
サイレンシングと適合性であるものを含む。適切な修飾には以下が含まれる：５’一リン
酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（Ｈ
Ｏ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−
Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’グアノシンキャップ（７−メチル化または非メ
チル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（Ｈ
Ｏ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾また
は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（
Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’一チオリン酸（ホスホロチオエート；
（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ
）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−
５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（
例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’ホスホルアミデ
ート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５
’アルキルホスホン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、
例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’
アルキルエーテルホスホン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２‐
）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）。（これらの修飾
はまた、二本鎖ｉＲＮＡのアンチセンス鎖とともに使用されることも可能である。）
一本鎖ｉＲＮＡ剤は、該一本鎖ｉＲＮＡ剤がＲＩＳＣに入ることが可能であり、かつＲ
ＩＳＣの仲介による標的ｍＲＮＡの切断に関与することが可能であるように、十分に長く
あるべきである。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１４ヌクレオチド長、およびより好ま
しくは、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、または５０ヌクレオチド長で
ある。一本鎖ｉＲＮＡ剤は好ましくは、２００、１００、または６０ヌクレオチド長未満
である。
ヘアピンｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２
５ヌクレオチド対に等しいか、または少なくとも１７、１８、１９、２９、２１、２２、
２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二本鎖領域を有する。この二本鎖領域の長さは
、好ましくは、２００、１００、または５０ヌクレオチド対以下である。二本鎖領域の好
ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対
長である。ヘアピンは、好ましくは、一本鎖突出部または末端（好ましくはヘアピンのア
ンチセンス側の好ましくは３’末端）の非対合領域を有する。好ましい突出部は２〜３ヌ
クレオチド長である。
「二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、鎖間のハイブリダイ
ゼーションにより二本鎖構造を形成することが可能である、１本より多くの鎖、好ましく
は２本の鎖を含むｉＲＮＡ剤である。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、
２９、４０、または６０ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６
、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長であるべきである。
これは、２００、１００、または５０ヌクレオチド長以下であるべきである。好ましい範
囲は、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、
４０、または６０ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長であるべきである。これは
、２００、１００、または５０ヌクレオチド長以下であるべきである。好ましい範囲は、
１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。
二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１
、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド対長に等しいか、また
は少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２
５、２９、４０、または６０ヌクレオチド対長であるべきである。これは、２００、１０
０、または５０ヌクレオチド対長以下であるべきである。好ましい範囲は、１５〜３０、
１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対長である。
多くの実施形態において、ｄｓ ｉＲＮＡ剤は、内在性分子によって（例えば、ダイサ
ー（Ｄｉｃｅｒ）によって）切断されてより小さなｄｓ ｉＲＮＡ剤（例えば、ｓＲＮＡ
剤）を生じることが可能であるように十分に大きい。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方を修飾することが
望ましい可能性がある。ある場合において、これらの鎖は同じ修飾または同じクラスの修
飾を有するが、他の場合において、センス鎖およびアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、
例えば、ある場合において、センス鎖のみが修飾されることが望ましい。センス鎖のみを
、例えばセンス鎖を不活性化するために修飾することが望ましい可能性があり、例えば、
センス鎖は、センス鎖を不活性化し、かつ活性なｓＲＮＡ／タンパク質またはＲＩＳＣの
形成を妨害するために修飾されることが可能である。これは、センス鎖の５’リン酸化を
妨害する修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いる修飾によっ
て達成されることが可能である（ニーケネンら（Ｎｙｋａｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．）、（
２００１）「ATPrequirements and small interfering RNA structure in the RNA inte
rferencepathway. 」Ｃｅｌｌ １０７、３０９〜３２１を参照のこと）。例えば、単に
５’ＯＨをＯ−ＭｅではなくＨによって置換する、リン酸化を妨害する他の修飾もまた使
用可能である。代替例として、大きなかさ高い基が５’リン酸基に付加され、これがホス
ホジエステル結合に転換されてもよいが、これは、ホスホジエステラーゼがこのような結
合を切断し、かつ機能的ｓＲＮＡ５’末端を遊離することが可能であるので、より望まし
くない可能性がある。アンチセンス鎖修飾は、５’リン酸化ならびに本明細書中で議論さ
れる他の５’修飾のいずれか、特に単鎖ｉＲＮＡ分子に関する節において上記に議論され
た５’修飾を含む。
ｄｓ ｉＲＮＡ剤が分子の一方または両方の末端で一本鎖領域または不対合領域を含む
ように、センス鎖およびアンチセンス鎖が選択されることが好ましい。したがって、ｄｓ
ｉＲＮＡ剤は、好ましくは突出部（例えば、１つまたは２つの５’または３’突出部で
あるが好ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出）を含むように対合したセンス鎖および
アンチセンス鎖を含む。多くの実施形態は３’突出部を有する。好ましいｓＲＮＡ剤は一
本鎖突出部、好ましくは、各々の末端に１ヌクレオチド長または好ましくは２もしくは３
ヌクレオチド長の３’突出部を有する。この突出部は、ある鎖が他の鎖よりも長い結果で
あってもよいし、または、ずれを有する同じ長さの２つの鎖の結果であってもよい。５’
末端は好ましくはリン酸化される。
二本鎖領域についての好ましい長さは、例えば、上記に議論したｓＲＮＡ剤の範囲にお
いて、１５から３０の間のヌクレオチド長、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２
２、および２３ヌクレオチド長である。ｓＲＮＡ剤は、長さおよび構造が、長いｄｓＲＮ
Ａからの天然のＤｉｃｅｒ処理産物に類似する可能性がある。ｓＲＮＡ剤の２つの鎖が結
合される（例えば、共有結合される）実施形態もまた含まれる。ヘアピン、または必要と
される二本鎖領域を提供する他の一本鎖構造物、および好ましくは３’突出部もまた、本
発明の範囲内にある。
ｄｓ ｉＲＮＡ剤およびｓＲＮＡ剤を含む、本明細書に記載される単離ｉＲＮＡ剤は、
標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイ
レンシングを仲介することが可能である。便宜上、このようなｍＲＮＡは、本明細書中で
はサイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ばれる。このような遺伝子はまた、標的遺伝子と
もいわれる。一般的に、サイレンシングされるＲＮＡは内在性遺伝子、例えばＳＮＣＡ遺
伝子である。
本明細書中で使用される場合、語句「ＲＮＡｉを仲介する」とは、配列特異的な様式で
、標的ＲＮＡをサイレンシングする能力をいう。理論によって束縛されることを望まない
が、サイレンシングは、ＲＮＡｉの機構またはプロセスおよびガイドＲＮＡ（例えば、２
１〜２３ヌクレオチドのｓＲＮＡ剤）を使用すると考えられる。
本明細書中で使用される場合、「特異的にハイブリダイズ可能である」および「相補的
」は、安定かつ特異的な結合が本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子の間に起こるような、十
分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的結合は、特異的結合が望ま
しい条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合においては生理学
的条件下で、またはインビトロアッセイの場合においてはそのアッセイが実行される条件
下で、オリゴマー化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相
補性を必要とする。非標的配列は、一般的には、少なくとも５ヌクレオチド異なる。
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤が標的ｍＲＮＡによってコードさ
れるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的ＲＮＡ（例えば、標的ＳＮＣＡ
のｍＲＮＡ）に「十分に相補的」である。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、標的Ｒ
ＮＡに対して「厳密に相補的」であり（ＲＲＭＳ含有サブユニットを除外する）、例えば
、標的ＲＮＡおよびｉＲＮＡ剤は、好ましくは、厳密に相補的な領域におけるワトソン−
クリック塩基対から独占的に構成されるハイブリッドを形成するようにアニールする。「
十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに厳密に相補的である内部領域（例えば、少
なくとも１０ヌクレオチドの領域）を含み得る。さらに、ある実施形態において、ｉＲＮ
Ａ剤は、単一ヌクレオチドの違いを特異的に区別する。この場合において、ｉＲＮＡ剤は
、厳密な相補性が単一ヌクレオチドの違いの領域（例えば、７ヌクレオチド以内の領域）
において見出される場合のみにＲＮＡｉを仲介する。
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、核酸分子（ＲＮＡまた
はＤＮＡ）、好ましくは、１００、２００、３００、または４００未満の長さのヌクレオ
チドをいう。
本明細書中で議論されるＲＮＡ剤は、その他の点では未修飾のＲＮＡ、ならびに、例え
ば、効力を改善するために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオシド代用物のポリマーを含
む。未修飾のＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天
然に存在する、好ましくは人体において天然に存在するのと同じかまたは実質的に同じで
ある分子をいう。当該分野では、修飾ＲＮＡのような、まれなまたは一般的でないが天然
に存在するＲＮＡについて言及されており、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ ｅ
ｔ ａｌ．）、（１９９４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３〜
２１９６を参照されたい。しばしば修飾ＲＮＡと呼ばれる（明らかに一般的には転写後修
飾の結果によるからである）、このようなまれなまたは一般的でないＲＮＡは、本明細書
中で使用される場合には用語「非修飾ＲＮＡ」の範囲内にある。修飾ＲＮＡは、本明細書
中で使用される場合、１つ以上の核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分
が、天然に存在するものと異なる、好ましくは人体において存在するものと異なる分子を
いう。これらは修飾「ＲＮＡ」と呼ばれるが、当然、修飾されているのでＲＮＡではない
分子を含むことになる。ヌクレオシド代用物は、リボリン酸バックボーンが、塩基が正し
い空間的関連において提示されることを可能にする非リボリン酸構築物で置き換えられて
いる分子であり、その結果、ハイブリダイゼーションは、リボリン酸バックボーンの場合
に見られるのと実質的に同様である（例えば、リボリン酸バックボーンの非荷電模倣物）
。上記のすべての例が本明細書中で議論される。
以下の議論の多くが一本鎖分子に言及する。本発明の多くの実施形態において、二本鎖
ｉＲＮＡ剤（例えば、部分的に二本鎖のｉＲＮＡ剤）が必要とされるかまたは好ましい。
したがって、以下に記載される一本鎖構造から作られる二本鎖構造（例えば、２つの別々
の分子が接触して二本鎖領域を形成する場合、または二本鎖領域が分子内対合（例えば、
ヘアピン構造）によって形成される場合）は本発明の範囲内に含まれることが理解される
。好ましい長さは本明細書中の他の箇所に記載される。
核酸は、サブユニットまたはモノマーのポリマーであるので、以下に記載される修飾の
多くが核酸内で反復される位置に存在する（例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリ
ン酸部分の非結合Ｏの修飾）。ある場合において、修飾は、核酸中の対象の位置のすべて
に存在するが、しかし、多くの場合および実際上大部分においてはそうではない。例とし
て、修飾は、３’または５’末端にのみ存在する可能性があり、末端領域（例えば、末端
ヌクレオチドの位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド）にの
み存在する可能性がある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方において存在す
る可能性がある。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域中にのみ存在する可能性もあるし、または
ＲＮＡの一本鎖領域にのみ存在する可能性もある。例えば、非結合Ｏ位置のホスホロチオ
エート修飾が、一方の末端にのみもしくは両方の末端に存在してもよいし、末端領域（例
えば、末端ヌクレオチド上の位置に、または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌ
クレオチド）にのみ存在してもよいし、または二本鎖および一本鎖の領域、特に末端に存
在することも可能である。５’末端（一方または両方）がリン酸化されることも可能であ
る。
ある実施形態において、一本鎖突出部（例えば、５’もしくは３’突出部、もしくはそ
の両方）において、例えば、安定性を増強すること、突出部に特定の塩基を含ませること
、または修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが特に好ましい。例
えば、突出部にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがあり得る。ある実施形
態において、３’または５’の突出部における塩基のすべてまたはいくつかの塩基が、例
えば、本明細書中に記載される修飾を用いて修飾される。修飾は、例えば、リボース糖の
２’ＯＨ基での修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌ
クレオチド（例えば、デオキシチミジン）の使用、およびリン酸基中での修飾（例えば、
ホスホチオエート修飾）が含まれうる。突出部は、標的配列と相同である必要はない。
修飾およびヌクレオチド代用物は以下に議論される。
式１において上記に提示されるバックボーンはリボ核酸の部分を表す。基本成分はリボ
ース糖、塩基、末端リン酸、およびヌクレオチド間リン酸リンカーである。塩基は天然に
存在する塩基（例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、またはシトシン）であり、糖は
非修飾２’ヒドロキシルリボース糖（示されているとおり）、およびＷ、Ｘ、およびＺは
すべてＯであり、式１は天然に存在する非修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。
非修飾オリゴリボヌクレオチドは、ある適用においては最適には満たない可能性があり
、例えば、非修飾オリゴリボヌクレオチドは、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受
ける傾向があり得る。ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解することが
可能である。しかし、上記のＲＮＡ成分の１つ以上への化学修飾は改善された特性を付与
することが可能であり、例えば、オリゴリボヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安
定性にすることが可能である。未修飾のオリゴリボヌクレオチドはまた、ｉＲＮＡ剤にリ
ガンドまたは他の部分を結合するためのつなぎ止め部分を提供するという観点で最適に満
たない可能性がある。
修飾核酸およびヌクレオチド代用物は、以下の１つ以上を含むことが可能である：
（ｉ）変化、例えば、非結合リン酸酸素（ＸおよびＹ）の一方もしくは両方の置換、お
よび／または結合リン酸酸素（ＷおよびＺ）の１つ以上の置換（リン酸が末端位置にある
場合、位置ＷまたはＺの１つは、天然に存在するリボ核酸中ではさらなるエレメントにリ
ン酸を結合しない。しかし、用語の単純化のために、他に注記される場合以外は、核酸の
５’末端のＷ位置および核酸の３’末端のＺ位置は、本明細書中で使用される用語「結合
リン酸酸素」の範囲内にある）；
（ｉｉ）変化、例えば、リボース糖の構成成分（例えば、リボース糖上の２’ヒドロキ
シル）の置換、またはリボース糖の、リボース以外の構造（例えば、本明細書中に記載さ
れるようなもの）による大規模置換；
（ｉｉｉ）リン酸部分（括弧Ｉ）の、「リンを含まない（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リン
カーによる大規模置換；
（ｉｖ）天然に存在する塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボース−リン酸バックボーン（括弧ＩＩ）の置換または修飾；
（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾
、もしくは置換、または構成部分の結合（例えば、ＲＮＡの３’末端または５’末端のい
ずれかへの蛍光標識部分の結合）。
用語「置換」、「修飾」、「変化」などは、この文脈で使用される場合、任意の工程の
限定を意味するものではなく、例えば、修飾とは、標準のまたは天然に存在するリボ核酸
を用いて開始しかつそれを修飾して修飾リボ核酸を産生しなくてはならないことを意味す
るものではなく、「修飾された」とは、単に天然に存在する分子との違いを意味する。
当然のことであるが、ある化学的実体の実際の電子的構造を、たった１つの標準的な型
（すなわち、ルイス構造）によって十分に表すことは可能ではない。理論によって束縛さ
れることを望まないが、実際の構造は、その代わりに、共鳴型または共鳴構造として集合
的に知られる、２つ以上の標準的な型のある混合物または加重平均であり得る。共鳴構造
は、個別の化学的実体ではなく、紙の上でのみ存在する。これらは、特定の化学的実体に
ついての結合電子および非結合電子の配置または「局在」においてのみ、互いに異なる。
１つの共鳴構造が他よりもより高い程度でハイブリッドに寄与することが可能であり得る
。したがって、本発明の実施形態について記載かつ図示される説明は、特定の種類の実体
についての主要な共鳴型として当該分野で認識されているものに関してなされる。例えば
、任意のホスホロアミデート（非結合酸素の窒素による置換）が、上記の図においてはＸ
＝ＯおよびＹ＝Ｎによって表される。
リン酸基の置換
リン酸基は、リン酸以外のものを含む接続部によって置換されることが可能である（上
記の式１中の括弧Ｉを参照のこと）。理論によって束縛されることを望まないが、荷電し
たホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、この基を中性の構造
模倣物で置換することは、ヌクレアーゼ安定性の増強を付与するはずであると考えられて
いる。この場合も理論によって束縛されることを望まないが、ある態様において、荷電し
たリン酸基が中性部分によって置換される変化を導入することが望ましい可能性がある。
リン酸基を置換することが可能である部分の例には以下が含まれる：シロキサン、カー
ボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイ
ドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール
、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメ
チルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ。好ましい置換には、メチレンカルボ
ニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が含まれる。
候補修飾は以下のように評価されることが可能である。
リボリン酸バックボーンの置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオ
チドの代用物によって置換されるオリゴヌクレオチド模倣バックボーンを構築することも
可能である（上記の式１の括弧ＩＩを参照のこと）。理論によって束縛されることを望ま
ないが、反復して荷電したバックボーンが存在しなければ、ポリアニオンを認識するタン
パク質（例えば、ヌクレアーゼ）への結合が減少すると考えられている。再度、理論によ
って束縛されることを望まないが、ある態様において、塩基が中性の代用バックボーンに
よって連結される変化を導入することが望ましい可能性がある。
例には、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）など
のヌクレオシド代用物が含まれる。好ましい代用物はＰＮＡ代用物である。
候補修飾は以下に記載されるように評価されることが可能である。
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端が修飾されることが可能である。このよ
うな修飾は、分子の３’末端、５’末端、または両方の末端においてなされ得る。該修飾
は、末端のリン酸全体または末端リン酸基の１つ以上の原子の修飾または置換を含むこと
が可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端が、他の機能的分
子実体、例えば標識部分（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素も
しくはＣｙ５色素などの蛍光団）または保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、もしく
はエステルを含む基など）に複合体化することが可能である。前記機能的分子実体は、リ
ン酸基および／またはスペーサーを介して糖に結合することが可能である。スペーサーの
末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のＣ−３’もしくはＣ−５’のＯ、Ｎ、Ｓ、も
しくはＣ基を接続または置換することが可能である。代替的には、スペーサーは、ヌクレ
オチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子を接続または置換することが可能である。こ
れらのスペーサーまたはリンカーは、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、
−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（
例えば、ｎ＝３または６）、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オ
キシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリ
ノなど、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を含み得る。「スペーサー／リン
酸‐機能的分子実体−スペーサーリン酸」という配列構造が、ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間
に介在するとき、この配列構造は、ヘアピン型ＲＮＡ剤中のヘアピンＲＮＡループの代わ
りに機能することが可能である。３’末端は−ＯＨ基であり得る。理論に束縛されること
を望まないが、特定の部分の複合体化は、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性に
ついての特性を改善することが可能であると考えられている。再度、理論に束縛されるこ
とを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の変化を導入することが望ましい可能
性がある。末端修飾の他の例には、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、
架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフ
ィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナ
ジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステ
ロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，
３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシル
グリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基
、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイ
ル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例
えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、
メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミ
ノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン
）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアー
ゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、
アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）が含まれる。
末端修飾は、本明細書中の他の箇所で議論される理由を含む多くの理由のために、活性
を調節するために、または分解に対する耐性を調節するために、加えられることが可能で
ある。活性を調節するために有用である末端修飾には、リン酸またはリン酸アナログによ
る５’末端の修飾が含まれる。例えば、好ましい態様において、ｉＲＮＡ剤、とりわけア
ンチセンス鎖は、５’リン酸化されてもよいし、または５’プライム末端にリン酸基アナ
ログを含んでもよい。５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣ介在性の遺伝子サイレンシングと適
合可能であるものが含まれる。適切な修飾には以下が含まれる：５’一リン酸（（ＨＯ）
２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−
Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ
）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（
７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）
−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾
ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−
Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’一チオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）
２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ
）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）
；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば
、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホルアミデート
（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−
アルキルホスホン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例
えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’−ア
ルキルエーテルホスホン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２）、
エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’）。
末端修飾はまた、分布をモニターするためにも有用でありうるが、このような場合にお
いて、付加される好ましい基には、蛍光団（例えば、フルオレセイン）またはＡｌｅｘａ
色素（例えば、Ａｌｅｘａ ４８８）が含まれる。末端修飾はまた、取り込みを増強する
ために有用でありうるが、このために有用な修飾にはコレステロールが含まれる。末端修
飾はまた、ＲＮＡ剤を別の部分に架橋するために有用でありうるが、このための有用な修
飾にはマイトマイシンＣが含まれる。
ｉＲＮＡ剤の評価
ｉＲＮＡ剤候補（例えば、修飾されたｉＲＮＡ剤）を評価することが可能である。一般
的な手法について以下に説明するが、ＳＮＣＡのｉＲＮＡ剤により特異的な方法について
は本明細書中の他所において議論する。一般に、そのＲＮＡ剤または修飾分子および対照
分子を適切な条件に曝露すること、ならびに選択された特性の存在について評価すること
によって、選択された特性を試験することが可能である。例えば、分解剤に対する耐性は
以下のようにして評価されることが可能である。候補修飾ＲＮＡ（および好ましくは対照
分子、通常は非修飾型）は、分解的な条件、例えば、分解剤（例えば、ヌクレアーゼ）を
含む環境に曝露されることが可能である。例えば、生物学的試料を使用することが可能で
あり、該試料は、例えば、治療的使用、例えば、血液または細胞画分（例えば、無細胞ホ
モジネートまたは破砕された細胞）において遭遇しうる環境と類似の生物学的試料である
。次いで、候補および対照を、多数のアプローチのいずれかによって、分解に対する耐性
について評価することが可能である。例えば、候補および対照を、例えば、放射性標識も
しくは酵素標識または蛍光標識（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５など）を用いて、好まし
くは、曝露の前に標識することが可能である。対照ＲＮＡおよび修飾されたＲＮＡを、分
解剤、および場合によっては対照（例えば、不活化された（例えば、熱不活化された）分
解剤）とともにインキュベートすることが可能である。次いで、物理学的パラメータ（例
えば、修飾分子および対照分子のサイズ）を決定する。これらは、物理学的方法によって
（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイズ分画カラムによって）、その分
子がその元々の長さを維持していたかを評価するために決定してもよいし、または機能的
に評価することも可能である。代替的には、ノーザンブロット分析を使用して、未標識の
修飾分子の長さをアッセイすることが可能である。
機能的アッセイもまた、候補剤を評価するために使用することが可能である。機能的ア
ッセイは、修飾が、遺伝子発現をサイレンシングする分子の能力を変化させるか否かを決
定するために、最初に、または初期の非機能的アッセイ（例えば、分解に対する耐性につ
いてのアッセイ）の後で適用することが可能である。例えば、細胞（例えば、マウスまた
はヒトの細胞などの哺乳動物細胞）を、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）を発現するプ
ラスミドおよびその蛍光タンパク質をコードする転写物に相同である候補ＲＮＡ剤で同時
トランスフェクトすることが可能である（例えば、国際公開公報第００／４４９１４号パ
ンフレットを参照されたい）。例えば、ＧＦＰ ｍＲＮＡに相同である修飾ｄｓＲＮＡは
、トランスフェクションに候補ｄｓＲＮＡを含めなかった対照細胞（例えば、ＲＮＡ剤を
加えられなかった対照、および／または非修飾ＲＮＡを加えられなかった対照）と比較し
て、細胞の蛍光の減少についてモニターすることによって、ＧＦＰ発現を阻害する能力に
ついてアッセイすることが可能である。遺伝子発現に対する候補剤の効力は、修飾ｄｓＲ
ＮＡ剤および非修飾ｄｓＲＮＡ剤の存在下での細胞の蛍光を比較することによって評価可
能である。
標的ＲＮＡレベルに対する修飾ＲＮＡ剤の効果は、陰性対照と比較して、標的ｍＲＮＡ
のレベルの減少についてアッセイするノーザンブロットによって、または標的タンパク質
のレベルの減少についてアッセイするウエスタンブロット分析によって確認可能である。
対照は、ＲＮＡ剤が添加されない細胞、および／または非修飾ＲＮＡが添加される細胞を
含むことが可能である。
好ましいｉＲＮＡ剤
好ましいＲＮＡ剤は以下の構造を有する（以下の式２を参照のこと）：
上記の式２を参照すると、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立して、Ｈ（すなわち、
脱塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チ
ミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−
アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデ
ニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび
５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウ
ラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）
、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−ア
ミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、およ
び他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウ
ラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン
およびＮ−２，Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）
、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デア
ザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニ
ン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジ
メチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチ
ルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、
３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシ
カルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメ
チル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミ
ノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ
４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチル
アデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、また
はＯ−アルキル化塩基である。
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、各々独立して、ＯＲ８、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２Ｃ
Ｈ２ＯＲ８；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ９、Ｈ；ハロ；ＮＨ２；ＮＨＲ８
；Ｎ（Ｒ８）２；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ９；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８
；シアノ；メルカプト；ＳＲ８；アルキル−チオ−アルキル；アルキル、アラルキル、シ
クロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル（これらの各々は、
場合により、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル
、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジア
ルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールア
ミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバ
モイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、ア
ルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルスルホ
ンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、またはウレイドで置換されても
よい）であるか；または、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、Ｒ７と一緒に組み合わさって、糖
の２’位および４’位の炭素の間の［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。
Ａ１は
；Ｈ；ＯＨ；ＯＣＨ３；Ｗ１；脱塩基ヌクレオチドであるか；または存在せず、
（好ましいＡ１は、とりわけアンチセンス鎖に関して、以下の：５’一リン酸（（ＨＯ）
２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−
Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ
）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（
７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）
−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾
ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−
Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’一チオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）
２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ
）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）
；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば
、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホルアミデート
（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−
アルキルホスホン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例
えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’−
アルキルエーテルホスホン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−
）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）から選択される）
。
Ａ２は
であり、Ａ３は
であり；かつＡ４は
；Ｈ；Ｚ４；逆向きのヌクレオチド；脱塩基ヌクレオチドであるか；または存在しない。
Ｗ１は、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎＲ１０、（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１０、（ＣＨ２）ｎＯＲ１０
、（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２
）ｎＮＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ
（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０；
ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｓ（Ｃ
Ｈ２）ｎＮＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２
Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ１０；Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；ＮＨ（
ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；Ｑ−Ｒ１０、Ｏ−Ｑ−Ｒ１０、Ｎ−Ｑ−
Ｒ１０、Ｓ−Ｑ−Ｒ１０、または−Ｏ−である。Ｗ４は、Ｏ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＳで
ある。
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、各々独立して、ＯまたはＳである。
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、各々独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ８、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ
Ｈ３ −、Ｈ、ＮＨＲ９、Ｎ（Ｒ９）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリー
ル、またはヘテロアリールであり、これらの各々が場合によっては置換されてもよい。
Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３は、各々独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＳである。Ｚ４
は、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎＲ１０、（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１０、（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、（Ｃ
Ｈ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ
Ｒ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ
２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０；ＮＨ（
ＣＨ２）ｎＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）
ｎＮＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ
ＣＨ２ＣＨ２ＯＲ１０；Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２
ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；Ｑ−Ｒ１０、Ｏ−Ｑ−Ｒ１０、Ｎ−Ｑ−Ｒ１０
、Ｓ−Ｑ−Ｒ１０である。
ｘは、本明細書中に記載されるＲＮＡ剤の長さを満足するように選択され、５〜１００
である。
Ｒ７はＨであるか、またはＲ４、Ｒ５、またはＲ６と一緒に組み合わさって糖の２’位
および４’位の炭素の間に［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。
Ｒ８は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロ
アリール、アミノ酸、または糖であり；Ｒ９は、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルア
ミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジ
ヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり；およびＲ１０はＨ；蛍光団（例えば、ピ
レン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素）；硫黄、ケイ素、
ホウ素、もしくはエステルの保護基；インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋
剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリ
ン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン
）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（コレステロール、コー
ル酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ
（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール
、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン
酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸
、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテ
ナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、
ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ；アルキル
、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール；放射線標識マーカー、酵素
、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ
、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミ
ン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環の
Ｅｕ３＋複合体）；またはＲＮＡ剤である。ｍは０〜１，０００，０００であり、かつｎ
は０〜２０である。Ｑは、脱塩基性の糖（ａｂａｓｉｃ ｓｕｇａｒ）、アミド、カルボ
キシ、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホン
アミドもしくはモルホリノ、ビオチン、またはフルオレセイン試薬からなる群より選択さ
れるスペーサーである。
リン酸基全体が置換されている好ましいＲＮＡ剤は以下の構造を有する（以下の式３を
参照のこと）：
式３を参照すると、Ａ１０−Ａ４０はＬ−Ｇ−Ｌであり；Ａ１０およびＡ４０のうち少
なくともいずれかは存在しなくてもよい。ここでＬはリンカーであり、一方または両方の
Ｌは存在していても存在していなくてもよく、かつＣＨ２（ＣＨ２）ｇ；Ｎ（ＣＨ２）ｇ
；Ｏ（ＣＨ２）ｇ；Ｓ（ＣＨ２）ｇからなる群より選択される。Ｇは、シロキサン、カー
ボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイ
ドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール
、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメ
チルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノからなる群より選択される官能基であ
る。
Ｒ１０、Ｒ２０、およびＲ３０は、各々独立して、Ｈ（すなわち、脱塩基ヌクレオチド
）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、
ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニン、ア
デニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニン
の２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、
５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシ
トシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル
、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル
、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデ
ニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシ
ン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２，Ｎ
−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニル
ウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシト
シン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキル
シトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、
２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル置換１
，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール
、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウ
ラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラ
シル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシ
プロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシ
ン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチ
ルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩
基である。
Ｒ４０、Ｒ５０、およびＲ６０は、各々独立して、ＯＲ８、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣ
Ｈ２ＣＨ２ＯＲ８；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ９、Ｈ；ハロ；ＮＨ２；Ｎ
ＨＲ８；Ｎ（Ｒ８）２；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２Ｒ９；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ
８；；シアノ；メルカプト；ＳＲ７；アルキル−チオ−アルキル；アルキル、アラルキル
、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル（これらの各々
は、場合により、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカ
リル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、
ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリー
ルアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカ
ルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル
、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルス
ルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、またはウレイド基で置換さ
れてもよい）であり；または、Ｒ４０、Ｒ５０、およびＲ６０は、Ｒ７０と一緒に組み合
わさって、糖の２’位および４’位の炭素の間の［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成
する。
ｘは、本明細書中に記載されるＲＮＡ剤の長さを満足するように選択され、５〜１００
である。
Ｒ７０はＨであるか、またはＲ４０、Ｒ５０、またはＲ６０と一緒に組み合わさって、
糖の２’位および４’位の炭素の間の［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。
Ｒ８は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロ
アリール、アミノ酸、または糖であり；Ｒ９は、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルア
ミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジ
ヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸である、ｍは０〜１，０００，０００であり、ｎ
は０〜２０であり、かつｇは０〜２である。
好ましいヌクレオシド代用物は以下の構造を有する（以下の式４を参照のこと）：
Ｓは、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸からなる群より選
択される。Ｌはリンカーであり、かつＣＨ２（ＣＨ２）ｇ；Ｎ（ＣＨ２）ｇ；Ｏ（ＣＨ２
）ｇ；Ｓ（ＣＨ２）ｇ；−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−からなる群より選択されるか、または
存在していなくてもよい。Ｍは、アミド結合；スルホンアミド；スルフィン酸；リン酸基
；本明細書中に記載されるような修飾リン酸基であるか；または存在していなくてもよい
。
Ｒ１００、Ｒ２００、およびＲ３００は、各々独立して、Ｈ（すなわち、脱塩基ヌクレ
オチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサン
チン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニ
ン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグ
アニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシト
シン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−
アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウ
ラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウ
ラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置
換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよび
シトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２
，Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピ
ニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザ
シトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アル
キルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニ
ン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル置
換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロ
ール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチ
ルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ
ウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボ
キシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシ
トシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−
メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル
化塩基である。
ｘは、本明細書中に記載されるＲＮＡ剤の長さを満足するように選択され、５〜１００
であり；ｇは０〜２である。
ヌクレアーゼ耐性モノマー
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤に、ヌクレアーゼ耐性モノマー（ＮＲＭ）を組み入れること
が可能である。例えば、本発明は、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤、例えばパリンドローム
構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書に記載の遺伝子、例え
ばＳＮＣＡ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書に記載の構成様式もしくは構造を有
するｉＲＮＡ剤、本明細書に記載の両親媒性送達剤と結合したｉＲＮＡ剤、本明細書に記
載の薬剤送達モジュールと結合したｉＲＮＡ剤、本明細書に記載のように投与されるｉＲ
ＮＡ剤、または本明細書に記載のように製剤化されたｉＲＮＡ剤であって、ＮＲＭも取り
込むｉＲＮＡ剤を含む。
ｉＲＮＡ剤は、例えば、対象の体内に見られるヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアー
ゼまたはエキソヌクレアーゼ）による分解を阻害するように修飾されたモノマーを含みう
る。これらのモノマーをここではＮＲＭ、またはヌクレアーゼ耐性促進モノマーもしくは
ヌクレアーゼ耐性促進修飾体と称する。多くの場合、これらの修飾は、ｉＲＮＡ剤の他の
特性、例えばタンパク質（例えば輸送タンパク質（例えば血清アルブミン））もしくはＲ
ＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレシング複合体）の構成メンバーと相互作用する能力、または最
初の配列と２番目の配列が相互に二本鎖を形成もしくは別の配列、例えば標的分子と二本
鎖を形成する能力という特性も同様に調節する。
理論に縛られることは望まないが、ｉＲＮＡ剤の糖、塩基および／またはリン酸バック
ボーンの修飾体は、エンドヌクレアーゼ耐性およびエキソヌクレアーゼ耐性を増強し、さ
らに輸送タンパク質およびＲＩＳＣ複合体の１つまたは複数の機能的要素との相互作用を
亢進すると考えられる。好ましい修飾体は、エキソヌクレアーゼ耐性およびエンドヌクレ
アーゼ耐性を高め、したがって、ＲＩＳＣ複合体と相互作用する前のｉＲＮＡ剤の半減期
を延長するが、同時に、ＲＩＳＣ複合体におけるエンドヌクレアーゼの活性に対してはｉ
ＲＮＡ剤を耐性にしない修飾体である。繰り返すが、いかなる理論にも縛られることは望
まないが、上記修飾をアンチセンス鎖の３’末端および／もしくは５’末端またはこれら
の近くに配置することにより、上記に描写される好ましいヌクレアーゼ耐性の基準を満た
すｉＲＮＡ剤が生じると考えられる。やはり繰り返すが、いかなる理論にも縛られること
は望まないが、修飾を、例えばセンス鎖の中央に配置することにより、オフターゲットの
可能性が比較的低いｉＲＮＡ剤が作製可能と考えられる。
本明細書に記載の修飾を、例えばｉＲＮＡ剤などの、本明細書に記載の任意の二本鎖Ｒ
ＮＡおよびＲＮＡ様分子へ組み込むことが可能である。ｉＲＮＡ剤はハイブリッド形成し
たセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる二本鎖を含むことができ、この場合アンチセン
ス鎖および／またはセンス鎖は、本明細書に記載される１つまたは複数の修飾を含むこと
が可能である。アンチセンス鎖は、３’末端および／もしくは５’末端、ならびに／また
は鎖のいずれかの末端から１〜６ヌクレオチド、例えば１〜５、１〜４、１〜３、１〜２
ヌクレオチドにある１つもしくは複数の位置に修飾を含むことが可能である。センス鎖は
、３’末端および／もしくは５’末端、ならびに／または鎖の両末端の間にある介入位置
のいずれか１つに修飾を含むことが可能である。また、ｉＲＮＡ剤は、ハイブリッド形成
した２つのアンチセンス鎖からなる二本鎖を含むことが可能である。第１および／または
第２のアンチセンス鎖は、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾を含むことが可能であ
る。したがって、１つおよび／または両方のアンチセンス鎖は、３’末端および／もしく
は５’末端、ならびに／または鎖のいずれかの末端から１〜６ヌクレオチド、例えば１〜
５、１〜４、１〜３、１〜２ヌクレオチドにある１つもしくは複数の位置に修飾を含むこ
とが可能である。以降に特定の構造について述べる。
上記により描写される好ましいヌクレアーゼ耐性の基準を満たすｉＲＮＡ剤を作製する
ために有用と考えられる修飾は、以下に記すような、糖、塩基および／またはリン酸バッ
クボーンについての１つまたは複数の化学的および／または立体化学的修飾を含むことが
可能である：
（ｉ）キラル（Ｓｐ）チオエート。したがって、好ましいＮＲＭは、通常は酸素によっ
て占められる非架橋位置、例えば位置ＸのＳｐまたはＲｐにヘテロ原子を含む特定のキラ
ル型の修飾リン酸基について富化された、または前記修飾リン酸基について純粋なヌクレ
オチド二量体を含む。また、Ｘの原子にはＳ、Ｓｅ、Ｎｒ２またはＢｒ３が考えられる。
ＸがＳならば、富化された、またはキラル型について純粋なＳｐとの結合が好ましい。富
化とは好ましい型が少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％であることを意味す
る。そのようなＮＲＭについては以下により詳細に記載する；
（ｉｉ）糖、塩基および／またはリン酸バックボーン部分もしくは修飾リン酸バックボ
ーン部分のリン原子への１つまたは複数のカチオン基の結合。したがって、好ましいＮＲ
Ｍは、末端にカチオン基で誘導体化されたモノマーを含む。アンチセンス配列の５’末端
は、末端−ＯＨまたはリン酸基を有する必要があるので、前記のＮＲＭは、アンチセンス
配列の５’末端では使用されないことが好ましい。このカチオン基は、水素結合形成およ
びハイブリッド形成との干渉を最少化する塩基上の位置、例えばもう一方の鎖の相補的塩
基と相互作用する面から離れた位置（例えばピリミジンの５’位またはプリンの７位）で
結合しなければならない。これらについては以下により詳細に述べる；
（ｉｉｉ）末端での非リン酸結合。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば切断に対す
る耐性がリン酸結合よりも大きくなる４原子の結合などの、非リン酸結合を含む。例とし
て、３’ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−５’および３’ＣＨ２−ＮＨ−（Ｏ＝）−ＣＨ
２−５’が挙げられる。
（ｉｖ）３’架橋チオリン酸塩および５’架橋チオリン酸塩。したがって、好ましいＮ
ＲＭは前記の構造を含むことが可能である。
（ｖ）Ｌ−ＲＮＡ、２’−５’結合、逆向きの結合、α−ヌクレオシド。したがって、
他の好ましいＮＲＭに含まれるものは、ＬヌクレオシドおよびＬ−ヌクレオシド由来のヌ
クレオチド二量体；２’−５’リン酸塩、非リン酸塩および修飾リン酸塩の結合、例えば
チオリン酸塩、ホスホルアミデートおよびホウ素化リン酸塩；逆向きの結合、例えば３’
−３’または５’−５’結合を有する二量体；糖の１’位にα結合を有するモノマー、例
えば本明細書に記載のα結合を有する構造が挙げられる；
（ｖｉ）結合基。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば標的結合部分、または、例え
ば糖、塩基もしくはバックボーンを通してモノマーと結合する、本明細書に記載の結合リ
ガンドを含むことが可能である。
（ｖｉ）脱塩基結合。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば本明細書に記載されるよ
うな脱塩基モノマー（例えば核酸塩基のないモノマー）、本明細書に記載されるような芳
香族モノマーもしくは複素環式モノマー、または多複素環式芳香族モノマーを含むことが
可能である；
（ｖｉｉ）５’−ホスホネートおよび５’−ホスフェート型プロドラッグ。したがって
、好ましいＮＲＭは、好ましくは末端部位（例えば５’位）に、リン酸基の１つまたは複
数の原子が保護基により誘導体化されているモノマーを含み、この１つまたは複数の保護
基は、対象の体内成分、例えばカルボキシエステラーゼまたは対象の体内に存在する酵素
の作用により除去される。例えば、カルボキシエステラーゼが保護分子を切断する結果チ
オエートアニオンが生じ、チオエートアニオンがリン酸塩のＯに隣接する炭素を攻撃する
結果として保護されていないリン酸塩が生じるリン酸プロドラッグ。
１つまたは複数の異なるＮＲＭ修飾をｉＲＮＡ剤またはｉＲＮＡ剤の配列中に導入する
ことが可能である。ＮＲＭ修飾は、配列またはｉＲＮＡ剤に２回以上使用することが可能
である。一部のＮＲＭはハイブリッド形成を妨げるので、取り込む総数は、許容可能なレ
ベルのｉＲＮＡ剤の二本鎖形成が維持されるものでなければならない。
一部の実施形態において、ＮＲＭ修飾は、対象の所望の配列または遺伝子を標的としな
い配列（センス鎖またはセンス配列）の末端切断部位または切断領域へ導入される。この
ことによりオフターゲットによるサイレンシングを低減しうる。
キラルＳｐチオエート
修飾は、１つもしくは両方の非結合（ＸおよびＹ）リン酸酸素および／または１つもし
くは複数の結合（ＷおよびＺ）リン酸酸素の変更（例えば置換）を含みうる。下記の式Ｘ
は２つの糖／糖代用物‐塩基部分（ＳＢ１およびＳＢ２）が結合しているリン酸塩部分を
表す。
特定の実施形態において、リン酸バックボーン部分の非結合リン酸酸素（ＸおよびＹ）
の１つは次のいずれか１つ：Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは水素、アルキル、アリールなど）、
Ｃ（すなわち、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは水素、アルキル、アリ
ールなど）、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリール）と置換可能である。非修飾リン
酸基のリン原子はアキラルである。しかし、非結合酸素の１つを上記の原子または原子群
の１つと置換することにより、リン原子がキラル化される。いいかえれば、このように修
飾されたリン酸基内のリン酸原子は立体中心である。立体中心のリン原子は「Ｒ」配置（
ここではＲｐ）または「Ｓ」配置（ここではＳｐ）を有することが可能である。したがっ
て、立体中心のリン原子の６０％がＲｐ配置を有するとき、残る４０％の立体中心のリン
原子はＳｐ配置を有することになる。
一部の実施形態において、リン酸非結合酸素が他の原子または原子群で置換されている
リン酸基を有するｉＲＮＡ剤は、立体中心の原子の少なくとも約５０％（例えば立体中心
の原子の少なくとも約６０％、同原子の少なくとも約７０％、同原子の少なくとも約８０
％、同原子の少なくとも約９０％、同原子の少なくとも約９５％、同原子の少なくとも約
９８％、同原子の少なくとも約９９％）がＳｐ配置を有する立体中心リン原子の集団を含
むことが可能である。あるいは、リン酸非結合酸素が他の原子または原子群で置換されて
いるリン酸基を有するｉＲＮＡ剤は、立体中心の原子の少なくとも約５０％（例えば立体
中心の原子の少なくとも約６０％、同原子の少なくとも約７０％、同原子の少なくとも約
８０％、同原子の少なくとも約９０％、同原子の少なくとも約９５％、同原子の少なくと
も約９８％、同原子の少なくとも約９９％）がＲｐ配置を有する立体中心リン原子の集団
を含むことが可能である。他の実施形態において、立体中心リン原子の集団がＳｐ配置を
有し、かつＲｐ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。さ
らに他の実施形態において、立体中心リン原子の集団がＲｐ配置を有し、かつＳｐ配置を
有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。本明細書では、「Ｒｐ配
置を有する立体中心リン原子を実質的に含まない」という句は、Ｒｐ配置を有する立体中
心リン原子を含む部分が当技術分野で公知の従来の方法（キラルＨＰＬＣ、キラルシフト
試薬を使用した１Ｈ ＮＭＲ分析など）により検出できないことを意味する。本明細書で
は、「Ｓｐ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まない」という句は、Ｓｐ配置を
有する立体中心リン原子を含む部分が当技術分野で公知の従来の方法（キラルＨＰＬＣ、
キラルシフト試薬を使用した１Ｈ ＮＭＲ分析など）により検出できないことを意味する
。
好ましい実施形態において、修飾ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエート基、すなわちリン酸
の非結合酸素がイオウ原子と置換されているリン酸基を含む。特に好ましい実施形態にお
いて、ホスホロチオエートの立体中心リン原子の集団はＳｐ配置を有し、かつＲｐ配置を
有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。
ホスホロチオエートを、二量体（例えば式Ｘ−１および式Ｘ−２）
を使用してｉＲＮＡ剤に組み込むことが可能である。前者は、鎖の３’末端にホスホロチ
オエートを導入するために使用することができ、後者は鎖の５’末端または例えばいずれ
かの末端から１、２、３、４、５または６つ目のヌクレオチドの位置に修飾を導入するた
めに使用する。上記の式で、Ｙは２−シアノエトキシでよく、ＷおよびＺはＯでよく、Ｒ
２’は、例えば糖にＣ−３末端構造を付与しうる置換基、例えばＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３でよ
く、ＤＭＴはジメトキシトリチルであり、「塩基」は天然の塩基でも、通常でない塩基で
も、または普遍的な塩基でもよい。
Ｘ−１およびＸ−２は、キラル試薬を使用して、または基本的にＲｐ配置だけを有する
（すなわち、実質的にＳｐ配置を含まない）もしくはＳｐ配置だけを有する（すなわち、
実質的にＲｐ配置を含まない）立体中心リン原子の集団を有するホスホロチオエート含有
二量体を生じさせることが可能な配位性制御基を使用して調製可能である。あるいは、二
量体が、約５０％がＲｐ配置を有し、原子の約５０％がＳｐ配置を有する立体中心リン原
子の集団を有するように調整することが可能である。Ｒｐ配置の立体中心リン原子を有す
る二量体を特定し、例えば酵素的分解および／または通常のクロマトグラフィ法を使用し
てＳｐ配置の立体中心リン構造を有する二量体から分離することが可能である。
カチオン基
また、修飾は、糖、塩基および／またはリン酸バックボーン部分もしくは修飾リン酸バ
ックボーン部分のリン原子への１つまたは複数のカチオン基の結合を含むことも可能であ
る。カチオン基は、天然の塩基、通常でない塩基または普遍的な塩基上で置換可能な任意
の原子に結合可能である。好ましい位置は、ハイブリッド形成を妨げない、すなわち塩基
対形成に必要な水素結合の相互作用を妨げない位置である。カチオン基は、例えば糖のＣ
２’位、または環状もしくは非環状の糖代用物中の類似の位置を介して結合することが可
能である。カチオン基は、例えばＯ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ
、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリ
ールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）由来のプロ
トン化アミノ基、例えばＯ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えばＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキ
ルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘ
テロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノなど
）のアミノアルコキシ、アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘ
テルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロア
リールアミノまたはアミノ酸）、またはＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭ
ＩＮＥ（例えばＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリ
ル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリール
アミノ）を含むことが可能である。
非リン酸結合
また、修飾は鎖の５’末端および３’末端のうち少なくともいずれかに非リン酸結合を
組み込むことが可能である。リン酸基を置換することが可能な非リン酸結合の例には、メ
チルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸、カルボキシメチル、カルバミ
ン酸、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸、スルホンアミド
、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチ
ルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイ
ミノを含む。好ましい置換体は、メチルホスホン酸基およびヒドロキシルアミノ基を含む
。
３’架橋チオリン酸および５’架橋チオリン酸塩；ロックトＲＮＡ、２’−５’結合、
逆向きの結合、α−ヌクレオシド；結合基；脱塩基結合；ならびに５’ホスホン酸および
５’リン酸プロドラッグ
上記の式Ｘについて言及すると、修飾はリン酸バックボーン部分の架橋または結合リン
酸酸素（ＷおよびＺ）のうちの１つの置換体を含むことが可能である。ＸまたはＹのうち
１つだけを変更する状況とは違い、ホスホロジチオエートのリン原子の中心はアキラルで
あり立体中心リン原子を含むｉＲＮＡ剤の形成を妨げる。
また、修飾は、１番目の糖の２’位と２番目の糖の５’位を経るリン酸基または修飾リ
ン酸基を介して２つの糖を結合することを含むことが可能である。同様に考えられるのは
、１番目の糖と２番目の糖がそれぞれの３’位を通してそれぞれ結合する逆向きの結合で
ある。また、修飾ＲＮＡは、Ｃ−１’で核酸塩基を欠く「脱塩基性の」糖を含むことも可
能である。糖基は、リボースにおける対応する炭素とは反対の立体化学的配置を有する炭
素を１つまたは複数含むことも可能である。したがって、修飾ｉＲＮＡ剤は、糖として、
例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含むことが可能である。上記修飾のもう１つの
サブセットでは、天然の塩基、通常でない塩基または普遍的な塩基はα−配置を有するこ
とが可能である。また、修飾体は、Ｌ−ＲＮＡを含むことが可能である。
また、修飾は例えばＰ（Ｏ）（Ｏ−）２−Ｘ−Ｃ５’−糖（Ｘ＝ＣＨ２、ＣＦ２、ＣＨ
Ｆなど）の５’−ホスホン酸および例えばＰ（Ｏ）［ＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｒ］２Ｃ
Ｈ２Ｃ５’−糖などの５’ホスホン酸プロドラッグを含むことが可能である。後者の場合
、プロドラッグ基は、最初にカルボキシエステラーゼで始まる作用を介して分解される可
能性がある。分子内ＳＮ２置換を介した残るエチルチオレート基は、エピスルフィドとし
て分離され、非誘導体化リン酸基を生じることが可能である。
また、修飾は、本明細書の他の場所に記載した結合基を追加することも含むことが可能
であり、結合基は結合可能な任意のアミノ基を介してｉＲＮＡ剤へ結合されることが好ま
しい。
ヌクレアーゼ耐性の修飾には、末端のみに配置することが可能な修飾といかなる位置で
も配置可能な修飾とがある。通常、ハイブリッド形成を抑制することが可能な修飾は、末
端領域でのみ使用することが好ましく、対象の配列または遺伝子を標的とする配列の切断
部位または切断領域では使用しないことが好ましい。ｉＲＮＡ剤の２つの配列間で十分な
ハイブリッド形成が維持されるという条件であれば、センス配列のどの位置においても使
用することが可能である。一部の実施形態では、オフターゲットのサイレンシングを最小
化することが可能なため、対象の配列または遺伝子を標的としない配列の切断位置または
切断領域にＮＲＭを配することが望ましい。
さらに、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤の他方の配列と二本鎖構造を形成
しない突出部を有することが可能である。これは突出部ではあるが、それ自体と、または
ｉＲＮＡ剤のもう一方の配列以外の別の核酸と、ハイブリッド形成する。
ほとんどの場合、ヌクレアーゼ耐性促進修飾は、その配列が対象の配列を標的にするか
（多くの場合、アンチセンス配列と呼ばれる）、対象の配列を標的にしないか（多くの場
合、センス配列と呼ばれる）により配置が異なる。配列が対象の配列を標的にするならば
、エンドヌクレアーゼによる切断を妨害または阻害する修飾は、ＲＩＳＣの仲介による切
断を受ける領域、例えば切断部位または切断領域に挿入すべきではない（エルバッシャー
ら［Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．］、２００１年、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．１
５：１８８［参照により本願に援用］に記載されるとおりである）。標的の切断は、およ
そ２０もしくは２１ｎｔのガイドＲＮＡのほぼ中央またはガイド配列に相補的な最初のヌ
クレオチドの１０もしくは１１ヌクレオチド上流で起きる。本明細書では、切断部位とは
、標的上または標的とハイブリッド形成するｉＲＮＡ剤の鎖上の、切断部位の両側のヌク
レオチドを指す。切断領域は、切断部位のヌクレオチドとその両方向の１、２または３ヌ
クレオチドを意味する）。
そのような修飾は、対象の配列を標的とする配列または標的としない配列の末端領域、
例えば末端、または末端の２、３、４もしくは５位の位置へ導入することが可能である。
ｉＲＮＡ剤は以下から選択した第１鎖および第２鎖を有することが可能である。
配列を標的とせず、かつ３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１
、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、かつ５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１
、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、かつ３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１
、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、
２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置に
ＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾を有し、かつ、３’末端から
１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位
置のＮＲＭ修飾と、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、
３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾と、あるいは３’末端および５’末端の
両方から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位
以内の位置のＮＲＭ修飾とのうち１つまたは複数を有する第１鎖と、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、
３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、
３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖（５’末端の修飾は、末
端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が
好ましい）、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、
３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３
、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ
修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾が存在しない第２鎖
、
配列を標的とし、切断部位または切断領域のＮＲＭ修飾、ならびに、３’末端から１、
２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置の
ＮＲＭ修飾、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４
、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、あるいは３’末端および５’末端の両方から
１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位
置のＮＲＭ修飾のうち１つまたは複数が存在しない第２鎖（５’末端の修飾は、末端より
むしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好まし
い）。
また、ｉＲＮＡ剤は２つの配列を標的とすることも可能であり、次から選択される第１
鎖および第２鎖を有することが可能である。
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、
３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とし、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、
３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖（５’末端の修飾は、末
端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が
好ましい）、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、
３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３
、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ
修飾を有する第１鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾が存在しない第１鎖
、
配列を標的とし、切断部位または切断領域のＮＲＭ修飾、ならびに、３’末端から１、
２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置の
ＮＲＭ修飾、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４
、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、あるいは３’末端および５’末端の両方から
１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位
置のＮＲＭ修飾のうち１つまたは複数が存在しない第１鎖（５’末端の修飾は、末端より
むしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好まし
い）と、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、
３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、
３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖（５’末端の修飾は、末
端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が
好ましい）、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、
３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３
、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ
修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾が存在しない第２鎖
、
配列を標的にし、切断部位または切断領域のＮＲＭ修飾、ならびに、３’末端から１、
２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置の
ＮＲＭ修飾、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４
、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、あるいは３’末端および５’末端の両方から
１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位
置のＮＲＭ修飾のうち１つまたは複数が存在しない第２鎖（５’末端の修飾は、末端より
むしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好まし
い）。
リボース模倣体
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤に、リボース模倣体を組み込むことが可能である。さらに本
発明は、リボース模倣体および本願明細書に記載する他の構成要素を有するｉＲＮＡ剤を
含む。例えば本発明は、本願明細書に記載するｉＲＮＡ剤、例えばパリンドローム構造の
ｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する遺伝子、例えば
ＳＮＣＡ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する構成様式または構造を有
するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する両親媒性送達物質と結合したｉＲＮＡ、本願明細
書に記載する薬剤送達モジュールと結合したｉＲＮＡ、本願明細書に記載するように投与
されるｉＲＮＡ剤、または本願明細書に記載するように製剤化されたｉＲＮＡ剤であって
、リボース模倣体も組み込まれたｉＲＮＡ剤を含む。
したがって、本発明の１態様は、効率を増大させ、かつ／あるいはｉＲＮＡ剤にヌクレ
アーゼ耐性を与えることが可能である、第２ヒドロキシル基を含むｉＲＮＡ剤を特徴とす
る。ヌクレアーゼ、例えば細胞ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解
し、核酸の部分的または完全な分解をもたらすことが可能である。第２ヒドロキシル基は
、この修飾を欠くｉＲＮＡと比べて、ｉＲＮＡ剤がヌクレアーゼ分解を受ける傾向を低下
させることによって、ｉＲＮＡ剤にヌクレアーゼ耐性を与える。理論によって縛られるこ
とは望まないが、ｉＲＮＡ剤上の第２ヒドロキシル基の存在が３’リボースのヒドロキシ
ル基の構造上の模倣体として働くことによって、ｉＲＮＡ剤が分解を受けにくくなると考
えられる。
第２ヒドロキシル基は、２つの他の炭素および水素によって置換された炭素原子と結合
している「ＯＨ」基を指す。上記のようにヌクレアーゼ耐性を与える第２ヒドロキシル基
は、任意の非環式炭素含有基の一部であってもよい。ヒドロキシル基は、任意の環式炭素
含有基の一部であってもよく、以下の条件、すなわち（１）ヒドロキシル基と末端リン酸
基の間にリボース部分が存在しないこと、または（２）該ヒドロキシル基は塩基と結合し
た糖部分には存在しないこと、のうち１つまたは複数に見合うことが好ましい。ヒドロキ
シル基は、ｉＲＮＡ剤の末端リン酸基のリンから、少なくとも２結合（化学結合２個）の
位置にある（例えば、少なくとも３結合離れて、少なくとも４結合離れて、少なくとも５
結合離れて、少なくとも６結合離れて、少なくとも７結合離れて、少なくとも８結合離れ
て、少なくとも９結合離れて、少なくとも１０結合離れている）。好ましい実施形態では
、末端リン酸基のリンと第２ヒドロキシル基の間に５つの介在結合が存在する。
末端リン酸基のリンと第２ヒドロキシル基の間に５つの介在結合を有する、好ましいｉ
ＲＮＡ剤送達モジュールは、以下の構造を有する（以下の式Ｙを参照）：
式Ｙに言及すると、ＡはｉＲＮＡ剤であり、本明細書に記載する任意のｉＲＮＡ剤を含
む。ｉＲＮＡ剤は、リン酸基の「Ｗ」と直接的あるいは間接的に（例えばスペーサーまた
はリンカーを介して）結合することが可能である。これらのスペーサーまたはリンカーは
、例えば−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎ
Ｓ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、脱塩基性
の糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジス
ルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬および
フルオレセイン試薬を含むことが可能である。
ｉＲＮＡ剤は、非修飾状態（例えば、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺがＯである）の末端リン酸
基または修飾されている末端リン酸基を有し得る。修飾されているリン酸基では、Ｗおよ
びＺは独立にＮＨ、ＯまたはＳであってよく；ＸおよびＹは独立にＳ、Ｓｅ、ＢＨ３ −、
Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｈ、Ｏ、Ｏ−、アルコキシまたはアミノ（
アルキルアミノ、アリールアミノなどを含む）であってよい。Ｗ、ＸおよびＺがＯであり
、ＹがＳであることが好ましい。
Ｒ１およびＲ３はそれぞれ独立に、水素；またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１
〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置
換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿
入されていてもよい。
Ｒ２は水素；またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選
択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるい
は任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく；あるい
はｎが１であるとき、Ｒ２がＲ４またはＲ６と合わさって５〜１２原子の環を形成しても
よい。
Ｒ４は水素；またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選
択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるい
は任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく；あるい
はｎが１であるとき、Ｒ４がＲ２またはＲ５と合わさって５〜１２原子の環を形成しても
よい。
Ｒ５は水素、またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選
択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるい
は任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく；あるい
はｎが１であるとき、Ｒ５がＲ４と合わさって５〜１２原子の環を形成してもよい。
Ｒ６は水素、またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選
択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるい
は任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく、あるい
はｎが１であるとき、Ｒ６がＲ２と合わさって６〜１０原子の環を形成してもよい。
Ｒ７は水素、Ｃ１〜Ｃ１００アルキル、またはＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）ＮＨＲ９
であり；Ｔは水素または官能基であり；ｎおよびｑはそれぞれ独立に１〜１００であり；
Ｒ８はＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ６〜Ｃ１０アリールであり；かつＲ９は水素、Ｃ１
〜Ｃ１０アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたは固形支持体物質である。
好ましい実施形態は、以下のｉＲＮＡ剤送達モジュールのサブセットの１つまたは複数
を含むことが可能である。
ＲＮＡｉ剤送達モジュールの１つのサブセットでは、Ａは該ＲＮＡ剤の末端３’または
５’リボース糖の炭素を介して、直接的あるいは間接的に結合することが可能である。
ＲＮＡｉ剤送達モジュールの他のサブセットでは、Ｘ、ＷおよびＺがＯであり、ＹがＳ
である。
ＲＮＡｉ剤送達モジュールのさらに他のサブセットでは、ｎは１であり、Ｒ２とＲ６が
合わさって６原子を含む環を形成し、Ｒ４とＲ５が合わさって６原子を含む環を形成する
。環系はトランス−デカリンであることが好ましい。例えば、このサブセットのＲＮＡｉ
剤送達モジュールは、式（Ｙ−１）の化合物を含むことが可能である：
官能基は例えば、標的化（ターゲティング）基（例えばステロイドまたは糖質）、レポ
ーター基（例えばフルオロフォア）、または標識（同位元素で標識された部分）であって
よい。標的化基は、タンパク質結合物質、内皮細胞標的化基（例えばＲＧＤペプチドおよ
び模倣体）、癌細胞標的化基（例えば葉酸ビタミンＢ１２、ビオチン）、骨細胞標的化基
（例えばビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸）、多価マンノース
（例えばマクロファージ試験用）、ラクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクト
サミン、モノクローナル抗体、糖タンパク質、レクチン、メラノトロピン、またはチロト
ロピンをさらに含むことが可能である。
当業者によって理解され得るように、本明細書中の式の化合物を合成する方法は当業者
には明らかであろう。合成した化合物を反応混合物から分離し、カラム・クロマトグラフ
ィ、高速液体クロマトグラフィ、または再結晶化などの方法によってさらに精製すること
が可能である。さらに、様々な合成工程を他の順序または順番で行って、所望の化合物を
与えることも可能である。本明細書に記載した化合物を合成する際に有用な、合成化学変
換および保護基に関する方法（保護および脱保護）は当分野で知られており、例えばアー
ル ラロック（Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ）、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；ティ
ー ダブリュー グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびピー エム ジー ワッツ（
Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉ
ｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９
１）；エル ファイザー（Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ）およびエム ファイザー（Ｍ．Ｆｉｅｓｅ
ｒ）、「Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇ
ａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４
）；およびエル パクエッテ（Ｌ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ）、ｅｄ．、「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅ
ｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、ならびにその後続版に記載された
ものなどを含む。
リボース置換モノマーサブユニット
ｉＲＮＡ剤の１つまたは複数の特性を最適化することが可能ないくつかの方法で、ｉＲ
ＮＡ剤を修飾することが可能である。ＲＮＡ物質、例えばｉＲＮＡ剤はリボース置換モノ
マーサブユニット（ＲＲＭＳ）、例えば本明細書中に記載されたＲＲＭＳなどを含むこと
が可能である。さらに、ｉＲＮＡ剤は、ＲＲＭＳおよび本願明細書に記載する他の構成要
素を有することができる。例えば本発明は、本願明細書に記載のｉＲＮＡ剤、例えばパリ
ンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載の
遺伝子、例えば腎臓中で活性がある遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載の
構成様式または構造を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載の両親媒性送達物質と結合し
たｉＲＮＡ、本願明細書に記載の薬剤送達モジュールと結合したｉＲＮＡ、本願明細書に
記載のように投与されるｉＲＮＡ剤、または本願明細書に記載のように製剤化されるｉＲ
ＮＡ剤であって、ＲＲＭＳも取り込むｉＲＮＡ剤、を含む。
ｉＲＮＡ剤の１つまたは複数のリボヌクレオチド・サブユニットのリボース糖は、他の
構成部分、例えば非糖質の（好ましくは環式の）担体で置換することが可能である。サブ
ユニットのリボース糖がこのように置換されているリボヌクレオチド・サブユニットを、
本願明細書ではＲＲＭＳと呼ぶ。環式担体は炭素環系（すなわち、すべての環原子が炭素
原子）であってもよいし、あるいはヘテロ環系（すなわち、１つまたは複数の環原子がヘ
テロ原子、例えば窒素、酸素、イオウ）であってもよい。環式担体は単環系であってよく
、あるいは２つ以上の環、例えば縮合環を含むことも可能である。環式担体は完全に飽和
な環系であってよく、あるいはそれは１つまたは複数の二重結合を含むことも可能である
。
担体はさらに、（ｉ）少なくとも２つの「バックボーン結合点」および（ｉｉ）少なく
とも１つの「連結部結合点」を含む。本願明細書で使用する「バックボーン結合点」は、
官能基、例えばヒドロキシル基、または一般的に、バックボーン（例えばリボ核酸のリン
酸バックボーンまたはイオウを含むなどの修飾リン酸バックボーン）への担体の取り込み
に利用可能かつ好適な結合を指す。本願明細書で使用する「連結部結合点」は、環式担体
の構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（バックボーン結合点を提供する原子と
は異なるもの）であって、選択した構成部分と結合する原子を指す。選択した構成部分は
、例えばリガンド（例えば標的化部分または送達成分）、またはｉＲＮＡ剤の物理的性質
（例えば親油性）を変える構成部分であってよい。場合によっては、選択した成分は、介
在する連結部によって環式担体と結合する。したがって選択した成分は、官能基（例えば
アミノ基）を含むか、または一般的に、他の化学的実体（例えば該構成環に対するリガン
ド）の取り込みまたは連結に適した結合を与えることになる。
本願明細書に記載する１つまたは複数のＲＲＭＳを、ＲＮＡ剤（例えばｉＲＮＡ剤）中
へ取り込むことによって、特に適切な実体と連結された場合、１つまたは複数の新しい性
質を該ＲＮＡ剤に与え、かつ／あるいは該ＲＮＡ分子の１つまたは複数の既存の性質を変
化させ、高め、あるいは調節することが可能である。例えば、親油性またはヌクレアーゼ
耐性のうち１つまたは複数を変化させることが可能である。本願明細書に記載する１つま
たは複数のＲＲＭＳをｉＲＮＡ剤中へ取り込むことによって、特にＲＲＭＳが適切な実体
と連結された場合、標的ｍＲＮＡに対するｉＲＮＡ剤の結合親和性を調節する（例えば増
大させる）ことが可能であり、ｉＲＮＡ剤の二重らせん形の形状を変化させることが可能
であり、分布を変化させることや、ｉＲＮＡ剤を身体の特定部分に向けることが可能であ
り、あるいは（例えばＲＩＳＣ形成時および鎖の分離時の）核酸結合タンパク質との相互
作用を改変することが可能である。
したがって、１態様では、本発明は、好ましくは第１鎖および第２鎖を含むｉＲＮＡ剤
であって、式（Ｒ−１）を有する少なくとも１つのサブユニットが前記鎖のうち少なくと
も１つの中に取り込まれているｉＲＮＡ剤を特徴とする。
式（Ｒ−１）を参照すると、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７またはＣＨ２であり；ＹはＮ
Ｒ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であるかまたは存在せず、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２であるか
または存在しない。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれは独立にＨ、ＯＲａ、ＯＲｂ
、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、
Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０の少なくとも１つはＯＲａまたはＯＲｂであり、かつＲ１、Ｒ
２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０の少なくとも１つは（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（
ＣＨ２）ｎＯＲｂであり（ＲＲＭＳが末端に存在するとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ
９、およびＲ１０の１つはＲａを含み、かつ１つはＲｂを含み；ＲＲＭＳが内部に存在す
るとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち２つがそれぞれＲｂを含む
）；さらに、ＯＲａは（ＣＨ２）ｎＯＲｂとともにのみ存在し、（ＣＨ２）ｎＯＲａはＯ
Ｒｂとともにのみ存在することが好ましいものとする。
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは独立にＨ、任意選択で１〜３個のＲ１
３で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であり；あるいは、Ｒ５お
よびＲ１１が一体となって、任意選択でＲ１４により置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキ
ルをなす。
Ｒ７はＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ８はＣ１〜Ｃ６アルキ
ルであり；Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；かつＲ１４
はＮＲｃＲ７である。
Ｒａは
であり；かつ
Ｒｂは
である。
ＡとＣのそれぞれは独立にＯまたはＳである。
ＢはＯＨ、Ｏ−、または
である。
ＲｃはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；ＲｄはＨまたはリガンドであり；ｎは１〜
４である。
好ましい実施形態では、リボースはピロリン骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７
またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺは存在しない。
他の好ましい実施形態では、リボースはピペリジン骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ
）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
他の好ましい実施形態では、リボースはピペラジン骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ
）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＮＲ８であり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
他の好ましい実施形態では、リボースはモルホリノ骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ
）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＯであり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
他の好ましい実施形態では、リボースはデカリン骨格で置換され、かつＸはＣＨ２であ
り；ＹはＣＲ９Ｒ１０であり；かつＺはＣＲ１１Ｒ１２であり；かつＲ５およびＲ１１は
一体となってＣ６シクロアルキルをなす。
他の好ましい実施形態では、リボースはデカリン／インダン骨格で置換され、かつＸは
ＣＨ２であり；ＹはＣＲ９Ｒ１０であり；かつＺはＣＲ１１Ｒ１２であり；かつＲ５およ
びＲ１１は一体となってＣ５シクロアルキルをなす。
他の好ましい実施形態では、リボースはヒドロキシプロリン骨格で置換される。
本願明細書に記載するＲＲＭＳは、本願明細書に記載する任意の二本鎖ＲＮＡ様分子、
例えばｉＲＮＡ剤に取り込ませることが可能である。ｉＲＮＡ剤は、ハイブリダイズした
センス鎖とアンチセンス鎖とからなる二本鎖を含むことが可能であり、このときアンチセ
ンス鎖および／またはセンス鎖は、本願明細書に記載する１つまたは複数のＲＲＭＳを含
むことが可能である。ＲＲＭＳは、二本鎖ｉＲＮＡ剤の一方または両方の鎖の中の１つま
たは複数の個所に導入することが可能である。ＲＲＭＳは、センス鎖の３’または５’端
またはその近く（１、２、または３位以内）に配置されてもよいし、あるいはアンチセン
ス鎖の３’端またはその近く（２または３位以内）に配置されてもよい。いくつかの実施
形態では、ＲＲＭＳはアンチセンス鎖の５’端またはその近く（１、２、または３位以内
）にはないことが好ましい。ＲＲＭＳは内部に存在してもよく、アンチセンスが標的と結
合するのに重要ではない領域中に位置することが好ましいであろう。
１実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’端（または３’端から１、２、
もしくは３位以内）にＲＲＭＳを有することが可能である。１実施形態では、ｉＲＮＡ剤
は、アンチセンス鎖の３’端（または３’端から１、２、もしくは３位以内）およびセン
ス鎖の３’端（または３’端から１、２、もしくは３位以内）に、ＲＲＭＳを有すること
が可能である。１実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’端（または３’端
から１、２、または３位以内）にＲＲＭＳを、およびセンス鎖の５’端にＲＲＭＳを有す
ることが可能であり、この場合両方のリガンドがｉＲＮＡ剤の同じ端に位置する。
いくつかの実施形態では、２つのリガンドが連結され、好ましくは、それぞれの鎖上の
リガンドは疎水性の構成部分である。理論によって縛られることは望まないが、疎水性リ
ガンドが対になることにより、分子間のファン−デル−ワールス相互作用によって、ｉＲ
ＮＡ剤を安定化させることが可能であると考えられる。
１実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’端（または３’端から１、２、
または３位以内）にＲＲＭＳを、かつセンス鎖の５’端にＲＲＭＳを有することが可能で
あり、この場合両方のＲＲＭＳが、各ＲＲＭＳとリガンド上の別々の位置との結合によっ
て、同じリガンド（例えばコール酸）を共有することが可能である。２つの隣接するＲＲ
ＭＳ間で共有されるリガンドを、本願明細書では「ヘアピン・リガンド」と呼ぶ。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’端にＲＲＭＳを、かつセンス鎖の内
部位置にＲＲＭＳを有することが可能である。ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の内部位置にＲＲ
ＭＳを有することが可能であり；あるいはアンチセンス鎖の内部位置にＲＲＭＳを有する
ことが可能であり；あるいはセンス鎖の内部位置にＲＲＭＳを、かつアンチセンス鎖の内
部位置にＲＲＭＳを有することも可能である。
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は第１配列および第２配列を含み、該配列は同じ鎖
上に位置する２つの配列ではなく２つの別個の分子であり、例えば生理的条件下、例えば
ヘリカーゼまたは他の巻き戻し酵素と接触しない生理的条件下でハイブリダイズする（お
よびそれによって二本鎖領域を形成する）ために互いに十分な相補性を有することが好ま
しい。
ｄｓ ｉＲＮＡ剤が分子の一端または両端に一本鎖領域または非対合領域を含むように
、第１配列および第２配列を選択することが好ましい。したがって、ｄｓ ｉＲＮＡ剤は
、好ましくは突出部を含むように対合した第１配列および第２配列を含み、該突出部は例
えば１つまたは２つの５’または３’突出部であり、ただし好ましくは２〜３ヌクレオチ
ドの３’突出部である。大部分の実施形態は３’突出部を有する。好ましいｓＲＮＡ剤は
、それぞれの端に１ヌクレオチド長あるいは好ましくは２または３ヌクレオチド長の一本
鎖突出部、好ましくは３’突出部を有する。これらの突出部は、１本の鎖が他方より長い
結果でもよいし、あるいは同じ長さの２本の鎖がずれた結果でもよい。５’端はリン酸化
されていることが好ましい。
連結されるもの
広く様々なもの（実体）を、ｉＲＮＡ剤に、例えばＲＲＭＳの担体に連結させることが
可能である。以下にＲＲＭＳと関連付けて実施例を記載するが、該ＲＲＭＳは単に好まし
いものであるにすぎず、実体は他の地点においてｉＲＮＡ剤に結合させることも可能であ
る。好ましい実体は、神経細胞、例えばＳＮＣＡを発現している神経細胞を標的とする実
体である。
好ましい構成部分はリガンドであり、リガンドはＲＲＭＳの担体と、好ましくは共有結
合により、直接的あるいは介在する連結部を介して間接的に結合される。好ましい実施形
態では、リガンドは介在する連結部を介して担体に結合される。前に論じたように、リガ
ンドまたは連結部に連結されたリガンドは、ＲＲＭＳモノマーが伸長する鎖に取り込まれ
るときにＲＲＭＳモノマー上に存在していてもよい。いくつかの実施形態では、「前駆体
」ＲＲＭＳモノマーを伸長する鎖に取り込ませた後に、「前駆体」ＲＲＭＳにリガンドを
取り込ませることが可能である。例を挙げれば、例えばアミノ末端を有する連結部を備え
た（すなわちリガンドが結合していない）ＲＲＭＳモノマー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）
ｎＮＨ２を、伸長するセンスまたはアンチセンス鎖に取り込ませることが可能である。後
の操作において、すなわち前駆体モノマーを鎖に取り込ませた後、続いて、求電子基（例
えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基）を有するリガンドを、リガン
ドの求電子基と前駆体ＲＲＭＳの連結部の末端求核基とのカップリングによって、前駆体
ＲＲＭＳと結合させることが可能である。
好ましい実施形態では、リガンドは、同リガンドが取り込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標
的指向性または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのよう
なリガンドが存在しない分子種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞または細
胞種、コンパートメント、例えば細胞または器官のコンパートメント、組織、器官または
身体の領域に関する高い親和性をもたらす。例えば、好ましい実施形態では、リガンドに
より脳内などの神経細胞に対する選択性が向上することになる。好ましいリガンドは、二
本鎖の核酸における二本鎖の対合には関与しないであろう。
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性を向上させること
が可能であり、生成する天然または修飾オリゴリボヌクレオチド、または本願明細書に記
載するモノマーおよび／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含ん
でなるポリマー分子の、ヌクレアーゼ耐性を向上させることも可能である。
一般的なリガンドとしては、例えば取り込みを増大させるための治療用調節物質；例え
ば分布を調べるための診断用化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐
性を与える構成部分が挙げられる。一般例には、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タン
パク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体がある。
リガンドには、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；糖質（例えば、デ
キストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアル
ロン酸）；または脂質などが挙げられる。リガンドは、合成ポリマー、例えば合成ポリア
ミノ酸などの、組換え分子または合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例には、ポリ
リシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マ
レイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエー
テル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコ
ポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（Ｐ
ＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−アクリル酸エチル）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドポリマー、またはポリホスファジンがある。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン
、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−
ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン
、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、また
はαらせん状ペプチドがある。
リガンドは、標的化基、例えば細胞または組織を標的とする物質、例えばレクチン、糖
タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば神経細胞などの特定の細胞種と結合する抗体
も含み得る。
リガンドの他の例には、染料、インターカレート剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例
えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフ
ィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エ
ンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸
、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘ
キサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボ
ルネオール、メンソール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、
ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジ
メトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチド複合体（例えば、アンテナ
ペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、Ｐ
ＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置
換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進物
質（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾ
ール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾ
ール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、また
はＡＰがある。１実施形態では、リガンドによりｉＲＮＡ剤が血液脳関門を通り抜けやす
くなる可能性がある。
リガンドはタンパク質（例えば糖タンパク質）またはペプチドであってよく、例えば共
通のリガンドに関する特異的親和性を有する分子、または抗体（例えば神経細胞などの特
定の細胞種と結合する抗体）であってよい。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体
も含み得る。リガンドは、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、補因子、多価ラクトース、
多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マ
ンノース、または多価フコースなどの、非ペプチドの分子種も含み得る。
リガンドは、例えば細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば細胞の微小管、マ
イクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、細胞
内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させることが可能な物質、例えば薬物であってよい。
薬物は例えば、タキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラ
シン、ノコダゾール、ジャプラキノライド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランク
リンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、
またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であってよい。
リガンドは、例えば炎症応答を活性化させることによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取
り込みを増大させることが可能である。このような効果を有すると思われる例示的なリガ
ンドには、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフ
ェロンがある。
１態様では、リガンドは脂質または脂質系分子である。このような脂質または脂質系分
子は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することが好ましい
。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば肝臓以外の標的組織に、本発明の複合
体を分布させることが可能である。好ましくは、標的組織は脳である。ＨＳＡと結合する
ことが可能である他の分子も、リガンドとして使用することが可能である。例えば、ネプ
ロキシンまたはアスピリンを使用することが可能である。脂質または脂質系リガンドは、
（ａ）複合体の分解に対する耐性を増大させること、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標
的指向性または輸送を増大させることが可能であり、かつ／あるいは（ｃ）血清タンパク
質、例えばＨＳＡとの結合を調節するために使用することが可能である。
脂質系リガンドを使用して、本発明の複合体と標的組織の結合を調節する、例えば制御
することが可能である。例えば、ＨＳＡとさらに強く結合する脂質または脂質系リガンド
は、肝臓に対する標的指向性が低くなると思われ、したがって身体から除去されにくくな
ると思われる。
好ましい実施形態では、脂質系リガンドはＨＳＡと結合する。リガンドは、本発明の複
合体が好ましくは非腎臓組織に分布するような十分な親和性で、ＨＳＡと結合することが
好ましい。しかしながら、その親和性は、ＨＳＡとリガンドとの結合が不可逆的であるほ
ど強くはないことが好ましい。
他の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞によって取り込まれる構成部分
、例えばビタミンである。これらのリガンドは、望ましくない細胞増殖、例えば悪性また
は非悪性型の細胞増殖、例えば癌細胞の増殖によって特徴付けられる疾患を治療するのに
非常に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫがある。他の例示
的なビタミンには、Ｂビタミン、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリド
キサール、あるいは癌細胞によって取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素がある。
ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
他の態様では、リガンドは、細胞透過性物質、好ましくはらせん状の細胞透過性物質で
ある。該物質は両親媒性であることが好ましい。例示的な物質は、ｔａｔまたはアンテナ
ペディアなどのペプチドである。該物質がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、イン
バートマー、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含めて
、該ペプチドを改変することが可能である。らせん状物質は、親油性および撥油性の相を
好ましくは有する、αらせん状物質であることが好ましい。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であってよい。ペプチド模倣体（本願明細
書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ぶ）は、天然のペプチドと類似した一定の３次元構造
にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体と、ｉＲＮＡ剤が
結合することによって、細胞の認識および吸収を高めることなどにより、ｉＲＮＡの薬物
動態学的分布に影響を与えることが可能である。ペプチドまたはペプチド模倣体の構成部
分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０
、４５、または５０アミノ酸長であってよい（例えば表３を参照）。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、
両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅか
ら構成される）であってよい。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、制約型（ｃｏｎ
ｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドまたは架橋ペプチドであってよい。ペプチド部分は、Ｌ−ペ
プチドでもＤ−ペプチドでもよい。他の代替例では、ペプチド部分は、疎水性の膜移行配
列（ＭＴＳ）を含むことが可能である。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸
配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号４６）を有するＲＦＧＦである。疎水
性ＭＴＳを含むＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番
号４７））も、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド
、およびタンパク質を含めた大きな極性分子を、細胞膜を横切って運ぶことができる「送
達」ペプチドであってよい。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲ
ＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号４８））、およびショウジョウバエのアンテナペディア・タ
ンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４９））は、送達ペ
プチドとして機能しうることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファ
ージ・ディスプレイ・ライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリ
アル・ライブラリーから同定されたペプチドなど、ＤＮＡのランダムな配列によってコー
ドされてもよい（ラムら（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２〜８４
、１９９１）。取り込まれたモノマーユニットを介してｉＲＮＡ剤と連結したペプチドま
たはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、ま
たはＲＧＤ模倣体などの、細胞標的化ペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長
さは、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸の範囲であってよい。ペプチド部分は、安定性を増
大させるため、あるいは立体構造上の特性を得るためなどの、構造的改変を有し得る。以
下に記載する任意の構造的改変を、使用することが可能である。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えばヒト細胞などの哺乳動物の細胞を透過するこ
とが可能である。細胞透過性ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をも含み得る。例
えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０
大型Ｔ抗原のＮＬＳとに由来するＭＰＧなどの、２部分の両親媒性ペプチドであってよい
（シメオニら（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１
：２７１７〜２７２４、２００３）。
１実施形態では、ＲＲＭＳに連結される標的化ペプチドは、両親媒性のαらせん状ペプチドであってよい。例示的な両親媒性のαらせん状ペプチドには、セクロピン、ライコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシディン、セラトトキシン、Ｓ．ｃｌａｖａペプチド、メクラウナギ腸管の抗菌性ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、ダーマセプチン、メリチン、プレウロシディン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルのペプチド、エスカレンチン−１、およびカエリンがあるが、これらだけには限られない。らせんの安定性を完全に保つために、いくつかの要因を考慮することが好ましいであろう。例えば、らせん安定化残基を最大数使用し（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）、らせん不安定化残基を最小数とする（例えばプロリン、または環状モノマーユニット）。キャップ構造の残基も考えられる（例えば、ＧｌｙはＮキャップ構造残基の例であり、かつ／あるいはＣ末端アミド化を使用して、らせんを安定化させるための特別なＨ結合を与えることが可能である）。ｉ±３、あるいはｉ±４位離れた、正反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって、安定性をもたらす可能性がある。例えば、リシン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチンまたはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性の残基、グルタミン酸またはアスパラギン酸と、塩架橋を形成することが可能である。
ペプチドおよびペプチド模倣体のリガンドには、天然または修飾ペプチド、例えばＤま
たはＬペプチド；α、β、またはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つまたは複数のアミドを有するペプチド、すなわち１つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で置換されたペプチド結合；または環状ペプチドを有するリガンドがある。
ｉＲＮＡ剤を作製するための方法
ｉＲＮＡ剤は、修飾塩基または非天然塩基、例えば本願明細書に記載の塩基を含むこと
が可能である。さらに、ｉＲＮＡ剤は、修飾または非天然塩基および本願明細書に記載す
るその他の要素を有することができる。例えば本発明は、本願明細書に記載するｉＲＮＡ
剤、例えばパリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本願
明細書に記載する遺伝子、例えばＳＮＣＡ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、本願明細書に
記載する構成様式または構造を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する両親媒性送達物
質と結合したｉＲＮＡ、本願明細書に記載する薬剤送達モジュールと結合したｉＲＮＡ、
本願明細書に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、または本願明細書に記載するように
製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、修飾または非天然塩基も取り込むｉＲＮＡ剤を含む。
オリゴヌクレオチドペプチド複合体の合成および精製は、確立されている方法によって
実施することが可能である。例えば、テゥルーフェルトら（Ｔｒｕｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ
．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５２：３００５、１９９６；およびＭａｎｏｈａｒａｎ
、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、
ｅｄ中、エス ティー クルーク、マルセル デッカー、インコーポレイティッド社（Ｓ
．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、２００１を参照のこと
。
本発明の１実施形態では、ペプチド模倣体を修飾して、明確で特異的な好ましい立体構
造をとる制約型ペプチドを作製することが可能であり、該立体構造によってペプチドの効
力および選択性を増大させることが可能である。例えば、制約型ペプチドはアザペプチド
であってよい（Ｇａｎｔｅ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、４０５〜４１３、１９８９）。アミノ
酸側鎖の構造を変えずに、アミノ酸のα−炭素を窒素原子で置換することによって、アザ
ペプチドが合成される。例えば、ヒドラジンを「カルボニル・ドナー」、例えばクロロギ
酸フェニルと反応させることなどによって、伝統的なペプチド合成カップリング法におい
てヒドラジンを使用することによって、アザペプチドを合成することが可能である。
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結さ
れるペプチドまたはペプチド模倣体）は、Ｎ−メチルペプチドであってよい。Ｎ−メチル
ペプチドはＮ−メチル・アミノ酸から構成されるが、Ｎ−メチル・アミノ酸はペプチドの
バックボーン中に追加のメチル基を与えることによってタンパク質分解酵素による切断に
対する他の耐性手段を与える可能性がある。Ｎ−メチルペプチドは、当分野で知られてい
る方法によって合成することが可能である（例えば、リンドグレンら（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ
ｅｔ ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：９９、２０００
；Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌａｎｇｅｌ、ｅｄ．、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、２００２；フィッシェら（Ｆｉｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．１２：８２５、２００１；ワンダーら（Ｗａｎｄｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４：１３３８２、２００２を参照）
。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、Ｎ−メチルペプチドであってもよい
。
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結さ
れるペプチドまたはペプチド模倣体）は、β−ペプチドであってよい。β−ペプチドは、
溶液中でらせん、プリーツ・シート、ターンおよびヘアピンなどの安定した２次構造を形
成する。β−ペプチドの環状誘導体は、固体状態で折りたたまれてナノチューブになりう
る。β−ペプチドは、タンパク質分解酵素による分解に対して耐性がある。β−ペプチド
は、当分野で知られている方法によって合成することが可能である。例えば、Ａｎｔペプ
チドまたはＴａｔペプチドは、β−ペプチドであってもよい。
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結さ
れるペプチドまたはペプチド模倣体）は、オリゴカルバメートであってよい。オリゴカル
バメートペプチドは、カルバメートトランスポーターによって促進される輸送経路により
細胞内に内在化する。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、オリゴカルバメ
ートであってもよい。
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結さ
れるペプチドまたはペプチド模倣体）は、ペプチド模倣体のアミド結合が尿素部分で置換
されているオリゴ尿素複合体（またはオリゴチオ尿素複合体）であってよい。アミド結合
の置換によって、タンパク質分解酵素、例えば胃腸間内でのタンパク質分解酵素による分
解に対する高い耐性が与えられる。１実施形態では、オリゴ尿素複合体を、経口送達にお
いて使用するためにｉＲＮＡ剤と連結させる。オリゴ尿素ペプチド模倣体のそれぞれの繰
り返しユニット中のバックボーンは、天然アミノ酸と比較して１炭素原子だけ広がる可能
性がある。１炭素原子の広がりによって、例えばペプチドの安定性および親油性が増大す
る可能性がある。したがってオリゴ尿素ペプチドは、ｉＲＮＡ剤が細菌細胞壁の通過を目
的とするとき、あるいは神経障害の治療などのためにｉＲＮＡ剤が血液−脳関門を横断し
なければならないときに、有利である可能性がある。１実施形態では、受容体との高い親
和性を生み出すために、水素結合ユニットをオリゴ尿素ペプチドに結合させる。例えば、
ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、オリゴ尿素複合体（またはオリゴチオ尿素複合
体）であってもよい。
本発明のｄｓＲＮＡペプチド複合体は、ｉＲＮＡ剤上の様々な位置に存在するＲＲＭＳ
と関連付ける、例えば連結させることが可能である。例えばペプチドを、センス鎖上また
はアンチセンス鎖上のいずれかにおいて末端に結合させてもよいし、ペプチドをビス結合
（１つのペプチドが各端で連結され、一端がセンス鎖に結合し、一端がアンチセンス鎖に
結合する）。他の選択肢では、ペプチドは、短いヘアピン構造のｉＲＮＡ剤のループ中な
ど、内部に結合し得る。さらに他の選択肢では、ペプチドはペプチド−担体複合体などの
複合体と関連付けられてもよい。
ペプチド−担体複合体は、（生体系および／または細胞に送達するためなどの）１つま
たは複数のｉＲＮＡ剤を内包しうる少なくとも１つの担体分子と、担体複合体を特定の組
織または細胞種に対して指向させるためなどの、前記担体分子の外側に連結されたペプチ
ド部分とから構成される。担体複合体は、該複合体の外側に追加の標的化分子、または細
胞への送達を助ける細胞融合剤を担持することも可能である。担体内に被包される１つま
たは複数のｉＲＮＡ剤を、担体の内部への物質の送達を助けることが可能な親油性分子と
結合させてもよい。
担体分子または担体構造物は、例えばミセル、リポソーム（例えばカチオン性リポソー
ム）、ナノ粒子、ミクロスフェア、または生分解性ポリマーであってよい。ペプチド部分
は、ジスルフィド結合、酸不安定結合、ペプチド系結合、オキシアミノ結合またはヒドラ
ジン結合などの様々な結合によって、担体分子と連結することが可能である。例えば、ペ
プチド系結合はＧＦＬＧペプチドであってよい。いくつかの結合は個々の利点を有し、そ
の利点（または欠点）を、標的組織または目的とする用途に応じて考慮することが可能で
ある。例えば、ペプチド系結合は血流中では安定性があるが、リソソーム中では酵素によ
る切断を受けやすい。
定義
用語「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素の任意の基を指す。
用語「アルキル」は、示した数の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す
。例えば、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルとは、該基が１個〜１２個の炭素原子をその中に有する
ことが可能であることを示す。用語「ハロアルキル」は、１つまたは複数の水素原子がハ
ロによって置換されているアルキルを指し、すべての水素がハロによって置換されている
アルキル部分（例えばペルフルオロアルキル）を含む。アルキルおよびハロアルキル基は
、任意選択でＯ、Ｎ、またはＳが挿入されていてもよい。用語「アラルキル」は、アルキ
ル水素原子がアリール基によって置換されているアルキル部分を指す。アラルキルは、２
つ以上の水素原子がアリール基によって置換されている基を含む。「アラルキル」の例に
は、ベンジル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基がある。
用語「アルケニル」は、２〜８個の炭素原子を含み１つまたは複数の二重結合を有する
ことを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。典型的なアルケニルの例には
、アリル、プロペニル、２−ブテニル、３−ヘキセニルおよび３−オクテニル基があるが
、これらだけには限られない。用語「アルキニル」は、２〜８個の炭素原子を含み１つま
たは複数の三重結合を有することを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。
典型的なアルキニルのいくつかの例は、エチニル、２−プロピニル、および３−メチルブ
チニル、およびプロパルギルである。ｓｐ２およびｓｐ３炭素が、任意選択で、それぞれ
アルケニル基およびアルキニル基の結合点として作用してもよい。
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を指す。用語「アミノアルキル」は、アミノ
で置換されたアルキルを指す。用語「メルカプト」は、−ＳＨ基を指す。用語「チオアル
コキシ」は、−Ｓ−アルキル基を指す。
用語「アルキレン」は、２価アルキル（すなわち−Ｒ−）、例えば−ＣＨ２−、−ＣＨ
２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を指す。用語「アルキレンジオキソ」は、構
造−Ｏ−Ｒ−Ｏ−（Ｒはアルキレンを表す）の２価の分子種を指す。
用語「アリール」は、置換可能な任意の環原子を置換基によって置換することが可能な
、芳香族単環、２環、または３環炭化水素環系を指す。アリール部分の例には、フェニル
、ナフチル、およびアントラセニルがあるが、これらだけには限られない。
本願明細書で使用する用語「シクロアルキル」は、置換可能な任意の環原子を置換基に
よって置換することが可能な、３〜１２個の炭素を有する飽和環状、２環、３環、または
多環炭化水素基を含む。本願明細書に記載するシクロアルキル基は、縮合環も含み得る。
縮合環は、共通の炭素−炭素結合を共有する環である。シクロアルキル部分の例には、シ
クロヘキシル、アダマンチル、およびノルボルニルがあるが、これらだけには限られない
。
用語「ヘテロシクリル」は、非芳香族３〜１０員の単環、８〜１２員の２環、または１
１〜１４員の３環の環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子、２環の場合１〜６
個のヘテロ原子、または３環の場合１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がＯ、
Ｎ、またはＳから選択されることを特徴とする環系（例えば炭素原子と、単環、２環、ま
たは３環である場合、Ｎ、ＯまたはＳのヘテロ原子それぞれ１〜３個、１〜６個、または
１〜９個）であり、置換可能な任意の環原子を置換基によって置換することが可能な環系
を指す。本願明細書に記載するヘテロシクリル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通
の炭素−炭素結合を共有する環である。ヘテロシクリルの例には、テトラヒドロフラニル
、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピロリニルおよびピロリジニルが
あるが、これらだけには限られない。
用語「ヘテロアリール」は、芳香族５〜８員の単環、８〜１２員の２環、または１１〜
１４員の３環の環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子、２環の場合１〜６個の
ヘテロ原子、または３環の場合１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、
またはＳから選択されることを特徴とする環系（例えば炭素原子と、単環、２環、または
３環である場合、Ｎ、ＯまたはＳのヘテロ原子それぞれ１〜３個、１〜６個、または１〜
９個）であり、置換可能な任意の環原子を置換基によって置換することが可能な環系を指
す。
用語「オキソ」は、炭素と結合している場合はカルボニルを形成し、窒素と結合してい
る場合はＮ−オキシドを形成し、イオウと結合している場合はスルホキシドまたはスルホ
ンを形成する酸素原子を指す。
用語「アシル」は、いずれも置換基によってさらに置換することが可能な、アルキルカ
ルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル
、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指す。
用語「置換基」は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシク
リル、ヘテロシクロアルケニル、シクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリール基
上で該基の任意の原子について「置換された」基を指す。適切な置換基には、制限を設け
るものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ
、シアノ、ニトロ、アミノ、ＳＯ３Ｈ、硫酸、リン酸、ペルフルオロアルキル、ペルフル
オロアルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、カルボキシル、オキソ、チオオ
キソ、イミノ（アルキル、アリール、アラルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎアルキル（ｎは０〜２）
、Ｓ（Ｏ）ｎアリール（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロアリール（ｎは０〜２）、Ｓ（
Ｏ）ｎヘテロシクリル（ｎは０〜２）、アミン（モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキ
ル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、エステル（アルキル、ア
ラルキル、ヘテロアラルキル）、アミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロ
アラルキル、およびこれらの組合せ）、スルホンアミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラ
ルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、非置換アリール、非置換ヘテロア
リール、非置換ヘテロシクリル、および非置換シクロアルキルがある。１態様では、基上
の置換基は独立に、前述の置換基のいずれか１つ、またはいずれかのサブセットである。
用語「アデニニル、シトシニル、グアニニル、チミニル、およびウラシリル」などは、
アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルの基を指す。
本願明細書で使用する「通常でない」核酸塩基は、以下のいずれか１つを含むことが可
能である：
２−メチルアデニニル、
Ｎ６−メチルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデニニル、
Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニニル、
３−メチルシトシニル、
５−メチルシトシニル、
２−チオシトシニル、
５−ホルミルシトシニル、
Ｎ４−メチルシトシニル、
５−ヒドロキシメチルシトシニル、
１−メチルグアニニル、
Ｎ２−メチルグアニニル、
７−メチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアニニル、
Ｎ２，７−ジメチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアニニル、
１−メチルグアニニル、
７−シアノ−７−デアザグアニニル、
７−アミノメチル−７−デアザグアニニル、
プソイドウラシリル、
ジヒドロウラシリル、
５−メチルウラシリル、
１−メチルプソイドウラシリル、
２−チオウラシリル、
４−チオウラシリル、
２−チオチミニル
５−メチル−２−チオウラシリル、
３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシリル、
５−ヒドロキシウラシリル、
５−メトキシウラシリル、
ウラシリル５−オキシ酢酸、
ウラシリル５−オキシ酢酸メチルエステル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリルメチルエステル、
５−メトキシカルボニルメチルウラシリル、
５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシリル、
５−アミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチルウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−セレノウラシリル、
５−カルバモイルメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
３−メチルウラシリル、
１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウラシリル、
５−カルボキシメチルウラシリル、
５−メチルジヒドロウラシリル、または
３−メチルプソイドウラシリル。
パリンドローム
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、本願明細書に記載するパリンドローム構造を有すること
が可能である。例えば、本発明のｉＲＮＡ剤は、２つ以上のＲＮＡ領域を標的とすること
が可能である。例えばｉＲＮＡ剤は、互いにハイブリダイズするのに十分相補的な第１配
列および第２配列を含むことが可能である。第１配列はＳＮＣＡのＲＮＡの第１の標的配
列と相補的であってよく、第２配列はＳＮＣＡのＲＮＡの第２の標的配列と相補的であっ
てよい。第１の標的配列と第２の標的配列は、少なくとも１ヌクレオチド異なっていると
よい。ｉＲＮＡ剤の第１配列および第２配列が異なるＲＮＡ鎖上にあり、かつ第１配列と
第２配列の間のミスマッチを、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または
１％未満とすることができる。ｉＲＮＡ剤の第１配列および第２配列が同じＲＮＡ鎖上に
あり、かつ関連実施形態では、該ｉＲＮＡ剤の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％
、９５％より多く、あるいは１％が、２分子の形態であってもよい。ｉＲＮＡ剤の第１配
列と第２配列が、互いに完全に相補的であってもよい。
第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、第１配列および第２配列の変異体、
例えばＳＮＣＡ遺伝子の第１および第２の対立遺伝子によってコードされる転写物上に存
在してもよい。配列の変異は、例えば突然変異、または多型性であってよい。第１の標的
ＲＮＡ領域が、第２の標的ＲＮＡ領域と比べてヌクレオチドの置換、挿入、または欠失を
含むことも可能であり、あるいは第２の標的ＲＮＡ領域が、第１の標的領域の突然変異体
または変異体であることも可能である。
本発明の組成物は、ｉＲＮＡ剤分子の混合物を含むことが可能である。例えば、１つの
ｉＲＮＡ剤は、互いにハイブリダイズするのに十分相補的な第１配列および第２配列を含
むことが可能であり、さらに第１配列は第１の標的ＲＮＡ領域と相補的であり、第２配列
は第２の標的ＲＮＡ領域と相補的である。この混合物は、互いにハイブリダイズするのに
十分相補的な第３配列および第４配列を含む、少なくとも１つの他の種類のｉＲＮＡ剤を
含むことも可能であり、この場合第３配列は第３の標的ＲＮＡ領域と相補的であり、第４
配列は第４の標的ＲＮＡ領域と相補的である。さらに、第１配列または第２配列は、第３
配列または第４配列と、互いにハイブリダイズすることが可能であるほど十分相補的であ
ってもよい。第１配列と第２配列は同じＲＮＡ鎖上に存在しても異なるＲＮＡ鎖上に存在
してもよく、第３配列と第４配列は同じＲＮＡ鎖上に存在しても異なるＲＮＡ鎖上に存在
してもよい。
ｉＲＮＡ剤は、ＳＮＣＡの第１の変異体ＲＮＡ標的領域と相補的な第１配列、およびＳ
ＮＣＡの第２の変異体ＲＮＡ標的領域と相補的な第２配列を含むことが可能である。第１
および第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、標的ＳＮＣＡ遺伝子の対立遺伝子変異、突然変異
（例えば点突然変異）、または多型を含んでいてもよい。標準的なワトソン−クリック以
外の二本鎖構造。
標準的なワトソン−クリック以外の二本鎖構造
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、別のモノマー、例えば別の鎖上のモノマーと標準的なワ
トソンクリック以外の対合を形成することができるモノマーを包含することができる。二
本鎖のモノマー間の「標準的なワトソン−クリック以外の対合」の使用は、二本鎖のすべ
て又は一部の融解を制御（多くの場合は促進）するのに使用することができる。ｉＲＮＡ
剤は、選択された位置又は制約された位置にモノマーを包含することができ、その結果、
ｉＲＮＡ剤二本鎖における（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤の２つの別個の分子間での）第１
のレベルの安定性、及びｉＲＮＡ剤の配列と別の配列分子（例えば、対象者における標的
配列又はオフターゲット（標的ではない）配列）との間の二本鎖における第２のレベルの
安定性をもたらす。場合によっては、第２の二本鎖は、例えばｉＲＮＡ剤のアンチセンス
配列と標的ｍＲＮＡとの間の二本鎖において、比較的高いレベルの安定性を有する。この
場合、１つ又はそれ以上のモノマー、ｉＲＮＡ剤におけるモノマーの位置、及び標的配列
（本明細書中では、選択パラメータ又は制約パラメータと称することもある）の選択は、
ｉＲＮＡ剤二本鎖が比較的低い会合の自由エネルギーを有する（メカニズム又は理論によ
り拘束されることを望まないが、このことはＲＩＳＣに関しては二本鎖ｉＲＮＡ剤の解離
を促進することにより有効性に寄与すると考えられる）一方で、標的指向性のアンチセン
ス配列とその標的配列との間で形成される二本鎖が、比較的高い会合の自由エネルギーを
有する（メカニズム又は理論により拘束されることを望まないが、このことはアンチセン
ス配列と標的ＲＮＡとの会合を促進することにより有効性に寄与すると考えられる）よう
になされる。
他の場合では、第２の二本鎖は、例えばｉＲＮＡ剤のセンス配列とオフターゲットｍＲ
ＮＡとの間の二本鎖において、比較的低いレベルの安定性を有する。この場合、１つ又は
それ以上のモノマー、ｉＲＮＡ剤におけるモノマーの位置、及びオフターゲット配列の選
択は、ｉＲＮＡ剤二本鎖が比較的高い会合の自由エネルギーを有する一方で、標的指向性
のセンス配列とそのオフターゲット配列との間で形成される二本鎖が、比較的低い会合の
自由エネルギーを有する（メカニズム又は理論により拘束されることを望まないが、セン
ス鎖とオフターゲット配列から形成される二本鎖の解離を促進することにより、オフター
ゲット配列をサイレンシングするレベルを低減すると考えられる）ようになされる。
したがって、ｉＲＮＡ剤内の二本鎖に関する第１の安定性、ならびにｉＲＮＡ剤由来の
配列と別のＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡとの間で形成される二本鎖に関する第２の安定性
を有するという特性は、ｉＲＮＡ剤の構造において固有のものである。上述のように、こ
の特性は、選択された位置又は制約された位置の１つ又はそれ以上のモノマーの慎重な選
択、選択された位置又は制約された位置を設定するための二本鎖における位置の選択、及
び標的配列の配列（例えば、標的とされるべき標的遺伝子の特定の領域）の選択により達
成され得る。これらの要件を満たすｉＲＮＡ剤配列は、本明細書中では制約配列と称する
こともある。制約パラメータ又は選択パラメータは、例えば、検査により、あるいはコン
ピュータ支援方法により達成することができる。パラメータの使用により、例えば二本鎖
の安定性又は相対安定性に関して所望の結果が得られるように、標的配列及び特定のモノ
マーを選択することができる。
したがって、別の態様では、本発明は、第１の標的領域を標的とする第１の配列及び第
２の標的領域を標的とする第２の配列を包含するｉＲＮＡ剤を特徴とする。第１の配列及
び第２の配列は、例えば生理学的条件下で（例えば、生理学的条件下であるが、ヘリカー
ゼ又は他の巻き戻し酵素とは接触しない条件下で）互いにハイブリダイズするのに十分な
相補性を有する。ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域では、選択された位置又は制約された位置で、
第１の標的領域が第１のモノマーを有し、第２の標的領域が第２のモノマーを有する。第
１のモノマー及び第２のモノマーは、相補的位置又は対応する位置を占める。一方のモノ
マー、及び好ましくは両方のモノマーが、第１の配列と第２の配列との間での二本鎖に寄
与するモノマーの対合の安定性が、第１の配列又は第２の配列と標的配列との間での対合
の安定性と異なるように選択される。
通常、モノマーは、ｉＲＮＡ剤配列と標的ＲＮＡ二本鎖との間の二本鎖におけるモノマ
ーとその相補的モノマーとの対合により保有されるであろう解離の自由エネルギー及びＴ
ｍよりも、低い解離の自由エネルギー及び低いＴｍを有するｉＲＮＡ剤二本鎖における対
合をモノマーが形成するように選択される（標的配列の選択も同様に要求され得る）。
モノマーに与えられる制約は、選択部位に、あるいは２個以上の選択部位に適用され得
る。例えば、ｉＲＮＡ剤二本鎖において、２個以上であるが、３個未満、４個未満、５個
未満、６個未満又は７個未満の部位に制約が適用され得る。
制約部位又は選択部位は、ｉＲＮＡ剤二本鎖の多数の位置に存在することができる。例
えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の配列の３’末端又は５’末端の一方から３位、
４位、５位又は６位以内の位置に存在することができる。制約部位又は選択部位は、二本
鎖領域の中央に存在することもでき、例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の領域の
末端から４位以上、５位以上、６位以上又は７位以上の位置であり得る。
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、選択部位又は制約部位（単数又は
複数）のほかに、ミスマッチを有する。好ましくは、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、標準的
なワトソン−クリック対を形成しないか、又はハイブリダイズしない１個以下、２個以下
、３個以下、４個以下又は５個以下の塩基を有する。突出部については、本明細書中の他
の箇所で詳述しているが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされ
る遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、又は他の配列でもよい。ＴＴは、突出部
の好ましい配列である。第１のｉＲＮＡ剤配列及び第２のｉＲＮＡ剤配列はまた、例えば
ヘアピンを形成するための追加の塩基により、あるいは他の非塩基リンカーにより連結さ
せることもできる。
モノマーは、第１のモノマー及び第２のモノマーが天然に存在するリボヌクレオチド又
は天然に存在する塩基を有する修飾リボヌクレオチドであるように、かつ、相補的部位を
占有する場合、対合もせず実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は非標準的ワトソン−
クリック対合を形成して非標準的なＨ結合のパターンを形成する（通常、標準的なワトソ
ン−クリック対合で見られるよりも低い解離の自由エネルギーを有するか、あるいはそう
でなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、例えば標準的な対合の
会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーとなるように対合する）ように選
択することができる。ｉＲＮＡ剤の配列の一方（又は両方）が標的と二本鎖を形成する場
合、第１の（又は第２の）モノマーは、標的上の相補的位置にある塩基と標準的なワトソ
ン−クリック対合を形成するか、あるいはｉＲＮＡ剤における対合で見られるよりも高い
解離の自由エネルギー及び高いＴｍを有する非標準的なワトソン−クリック対を形成する
。古典的なワトソン−クリック対は、以下の通りである：Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ及びＡ−Ｕ。非
標準的なワトソン−クリック対合は、当該技術分野で既知であり、Ｕ−Ｕ、Ｇ−Ｇ、Ｇ−
Ａトランス、Ｇ−Ａシス及びＧＵを挙げることができる。
配列の一方又は両方におけるモノマーの選択は、モノマーが対合をしないか、あるいは
他方の配列の対応するモノマーとの対を形成し、その対が安定性を最小限にする（例えば
、一方の配列の選択部位のモノマーと他方の配列の対応する部位のモノマーとの間で形成
されるＨ結合は、一方（又は両方）の配列のモノマーと各々の標的配列とにより形成され
るＨ結合よりも安定性が劣る）ようになされる。一方又は両方の鎖のモノマーの選択はま
た、鎖とその標的配列により作製される二本鎖の一方又は両方における安定性を促進する
ように為される。例えば、１つ又はそれ以上のモノマー及び標的配列の選択は、選択位置
又は制約位置で、ｉＲＮＡ剤二本鎖中でＨ結合が形成されないか、もしくは非標準的な対
合が形成されるか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満
であるか、又は例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネル
ギーを付与するように対合するが、一方（又は両方の）配列が各々の標的と二本鎖を形成
する場合は、選択部位又は制約部位での対合は標準的なワトソン−クリック対であるよう
にすることができる。
このようなモノマーを含むことにより、以下の１つ又はそれ以上の効果、すなわち：ｉ
ＲＮＡ剤二本鎖を不安定化すること、センス配列と意図されない標的配列（オフターゲッ
ト配列と称することもある）との間の相互作用を不安定化すること、配列と意図される標
的との間の相互作用は不安定化されないこと、を有することになる。
天然に存在しないモノマー又は修飾モノマー（単数又は複数）の選択は、天然に存在し
ないモノマー又は修飾モノマーがｉＲＮＡ剤の選択位置又は制約位置に配置される場合は
第１の解離の自由エネルギーを示し、かつそれらの一方（又は両方）が天然に存在するモ
ノマーと対合する場合は、対が第２の解離の自由エネルギーを示す（通常、第２の解離の
自由エネルギーは、第１のモノマーと第２のモノマーの対合の解離の自由エネルギーより
も高い）ように実施することができる。例えば、第１のモノマー及び第２のモノマーが相
補的位置を占める場合、第１のモノマー及び第２のモノマーは、対合もせず、実質的レベ
ルのＨ結合も有さないか、又は、該モノマーの一方が天然に存在するモノマーと形成する
よりも弱い結合を形成して、その二本鎖の安定性を低減するが、その二本鎖が解離すると
、少なくとも一方の鎖は標的と二本鎖を形成し、標的との二本鎖においては、選択モノマ
ーは安定性を促進する（例えばモノマーは、標的配列中の天然に存在するモノマーと、ｉ
ＲＮＡ剤において形成される対合よりも安定な対を形成する）。
このような対の例は、２−アミノＡ、及びＵ又はＴの２−チオピリミジン類縁体のいず
れかである。
ｉＲＮＡ剤の相補的位置に配置される場合、これらのモノマーはほとんど対合せず、安
定性は最小限となる。しかしながら、２−アミノＡと天然に存在する標的のＵとの間で二
本鎖が形成されるか、あるいは、２−チオＵと天然に存在する標的のＡとの間、又は２−
チオＴと天然に存在する標的のＡとの間で二本鎖が形成され、比較的高い解離の自由エネ
ルギーを有し、かつより安定となる。
「標準的なワトソン−クリック以外の対合」という用語は、本明細書中で使用する場合
、二本鎖の第１の配列の第１のモノマーと第２の配列の対応する位置の第２のモノマーと
の間での対合であって、下記のうち１つまたはそれ以上が事実であるものを指す：（１）
該２つのモノマーの間に本質的に対合が存在しない、例えばモノマー間に有意なレベルの
Ｈ結合が存在しないか、あるいはモノマー間の結合が二本鎖の安定性に対していかなる有
意な寄与もしていない、（２）該モノマーが、天然に存在する塩基を有する非標準的なモ
ノマー対である、すなわち、Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕ又はＧ−Ｃ以外であり、かつ該モノマーは、
モノマー間のＨ結合を形成するが、概して形成されるＨ結合パターンは、標準的な対合に
より形成される結合よりも弱い、あるいは（３）該モノマーの少なくとも１つは天然に存
在しない塩基を包含し、かつモノマー間で形成されるＨ結合は、好ましくは、標準的な対
合すなわちＡ−Ｔ、Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃのうち１つ又はそれ以上により形成される結合よりも
弱い。
「オフターゲット」という用語は、本明細書中で使用する場合、サイレンシングされる
べき配列以外の配列を指す。
普遍的塩基：「ワイルドカード」；形状に基づいた相補性
（「ジフルオロトルエンとアデニンとの間の塩基対の、二本鎖の多重部位における複製
：「逆」シーケンシングによる確認（Bi-stranded, multisite replication of a base p
air betweendifluorotoluene and adenine: confirmation by 'inverse' sequencing.）
」、リウ、ディー；モラン、エス；クール、イー．ティー（Ｌｉｕ，Ｄ．；Ｍｏｒａｎ，
Ｓ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、第４巻、９１９〜９２
６ページ）
（「ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片による３’末端プルーフリーディングにおけ
る末端塩基対水素結合の重要性（Importance of terminal base pair hydrogen-bonding
in 3'-endproofreading by the Klenow fragment of DNA polymerase I.）」、モラレス
、ジェー．シー；クール、イー．ティー（Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｊ．Ｃ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．
）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、第３９巻、２６２６〜２６３２ページ）
（「水素結合を伴わない選択的かつ安定なＤＮＡ塩基対合（Selective and stable DNA
basepairing without hydrogen bonds. ）」、マトレイ、ティー、ジェー；クール、イ
ー、ティー（Ｍａｔｒａｙ，Ｔ．Ｊ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，１９９８年、第１２０巻、６１９１〜６１９２ページ）
（「チミンに関する無極性同配体であるジフルオロトルエンは、ＤＮＡ複製において特
異的かつ効率的にアデニンをコードする（Difluorotoluene, a nonpolar isostere for t
hymine, codesspecifically and efficiently for adenine in DNA replication.）」、
モラン、Ｓ；レン、アール．エックス．−エフ；ラムネイ アイブイ、エス；クール、イ
ー．ティー（Ｍｏｒａｎ，Ｓ．Ｒｅｎ，Ｒ．Ｘ．−Ｆ；Ｒｕｍｎｅｙ ＩＶ，Ｓ；Ｋｏｏ
ｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９７年、第１１９巻、２０５６〜
２０５７ページ）
（「デオキシアデノシンに関する複製可能な無極性同配体の構造及び塩基対特性（Stru
cture and basepairing properties of replicable nonpolar isostere for deoxyadeno
sine. ）」、グクキアン、ケー．エム；モラレス、イー．ティー（Ｇｕｃｋｉａｎ，Ｋ．
Ｍ．；Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９
８年、第６３巻９６５３〜９６５６ページ）
（「ハイブリダイゼーション、複製及び鎖終結用の普遍的塩基（Universal bases for
hybridization,replication and chain termination. ）」、バーガー、エム；ウー．ワ
イ．；オガワ、エー．ケー．；マクミン、ディー．エル．；シュルツ、ピー．ジー．；ロ
メスベルグ、エフ．イー．（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；
ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０００年、第２８巻、２９１１〜２９１４
ページ）
（１．「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：非天然の疎水性塩基対による
情報保存及び複製（Effortstoward expansion of the genetic alphabet: Information
storage andreplication with unnatural hydrophobic base pairs.）」、オガワ、エー
．ケー．；ウー．ワイ．；マクミン、ディー．エル．；リウ、ジェー．；シュルツ、ピー
．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｗｕ．Ｙ．；ＭｃＭｉ
ｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．
Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、３２７４〜３２８７
ページ。２．「動力学的選択性の増大による非天然塩基対の合理的設計（Rational desig
n of anunnatural base pair with increased kinetic selectivity. ）」、オガワ、エ
ー．ケー．；ウー．ワイ．；バーガー、エム；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、
エフ．イー．（Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．；Ｓｃｈｕｌｔ
ｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０
００年、第１２２巻、８８０３〜８８０４ページ）
（「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：３つの塩基対によるＤＮＡの複製
（Effortstoward expansion of the genetic alphabet: replication of DNA with thre
e base pairs. ）」、タエ、イー．エル．；ウー．ワイ．；キシア、ジー．；シュルツ、
ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｔａｅ，Ｅ．Ｌ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｘｉａ，
Ｇ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．、２００１年、第１２３巻、７４３９〜７４４０ページ）
（１．「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：塩基間疎水性相互作用の最適
化（Effortstoward expansion of the genetic alphabet: Optimization of interbase
hydrophobicinteractions. ）」、ウー．ワイ．；オガワ、エー．ケー．；バーガー、エ
ム；マクミン、ディー．エル．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．
（Ｗｕ．Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．；ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；
Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．、２０００年、第１２２巻、７６２１〜７６３２ページ。２．「遺伝子アルファベ
ットの拡大に対する取り組み：非常に安定な自己対合疎水性塩基のＤＮＡポリメラーゼ認
識（Effortstoward expansion of the genetic alphabet: DNA polymerase recognition
of ahighly stable, self-pairing hydrophobic base. ）」、マクミン、ディー．エル
．；オガワ、エー．ケー．；ウー．ワイ．；リウ、ジェー．；シュルツ、ピー．ジー．；
ロメスベルグ、エフ．イー．（ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｗｕ．
Ｙ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９９年、第１２１巻、１１５８５〜１１５８６ページ
）
（「非水素結合及び非形状相補的塩基対を含有する安定なＤＮＡ二本鎖：安定性決定因
子としての鎖間スタッキング（A stable DNA duplex containing a non-hydrogen-bondin
g and non-shapecomplementary base couple: Interstrand stacking as the stability
determiningfactor.）」、ボロッツチー、シー．；ハベルリー、エー．；ロイマン、シ
ー（Ｂｒｏｔｓｃｈｉ，Ｃ．；Ｈａｒｂｅｒｌｉ，Ａ．；Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｃ、Ｊ．）、
Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００１年、第４０巻、３０１２〜３０１４ペ
ージ）
（「２，２’−ビピリジンリガンドシド：二本鎖内金属錯体によりＤＮＡを修飾するた
めの新規構成単位（2,2'-BipyridineLigandoside: A novel building block for modify
ing DNA withintra-duplex metal complexes.）」、ワイツマン、エイチ．；トル、ワイ
（Ｗｅｉｚｍａｎｎ，Ｈ．；Ｔｏｒ，Ｙ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００１
年、第１２３巻、３３７５〜３３７６ページ）
（「副溝の水和は、ＤＮＡ二本鎖の安定性に重要である（Minor groove hydration is
critical to thestability of DNA duplexes.）」、ラン、ティー．；マクロウグリン、
エル．ダブリュ（Ｌａｎ，Ｔ．；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｌ．Ｗ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、６５１２〜６５１３ページ）
（「隣接天然塩基の選択性に対する普遍的塩基である３−ニトロピロールの影響（Effe
cts of theUniversal base 3-nitropyrrole on the selectivity of neighboring natur
al bases. ）」、オリバー、ジェー．エス．；パーカー、ケー．エー．；サッグス、ジェ
ー．ダブリュ．（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｊ．Ｓ．；Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ａ．；Ｓｕｇｇｓ，Ｊ．
Ｗ）、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．、２００１年、第３巻、１９７７〜１９８０ページ。
２．「ＤＮＡ二本鎖及び三本鎖の安定性に対する１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフ
ラノシル）−３−ニトロピロール残基の影響（Effects of the 1-(2'-deoxy- β-D-ribof
uranosyl)-3-nitropyrrolresidue on the stability of DNA duplexes and triplexes.
）」、アモソバ、オー，；ジョージ ジェー．；フレスコ、ジェー．アール．（Ａｍｏｓ
ｏｖａ，Ｏ．；Ｇｅｏｒｇｅ Ｊ．；Ｆｒｅｓｃｏ，Ｊ．Ｒ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９７年、第２５巻、１９３０〜１９３４ページ。３．「普遍的ヌ
クレオシド：１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロールに
よる合成、構造及びデオキシリボ核酸シーケンシング（Synthesis, structure and deoxy
ribonucleicacid sequencing with a universal nucleosides: 1-(2'-deoxy-β-D-ribof
uranosyl)-3-nitropyrrol.）」、バーグストロム、ディー．イー．；ツァング、ピー．；
トマ、ピー．エイチ．；アンドリュース、ピー．シー．；ニコルズ、アール．（Ｂｅｒｇ
ｓｔｏｒｍ，Ｄ．Ｅ．；Ｚｈａｎｇ，Ｐ．；Ｔｏｍａ，Ｐ．Ｈ．；Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．
Ｃ．；Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｒ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５年、第１１７
巻、１２０１〜１２０９ページ）
（「一般的な三本鎖ＤＮＡ認識スキームを対象とするモデル研究：有機溶媒中でＣＧ塩
基対を結合する新規ＤＮＡ塩基（Mod el studies directed toward a general triplex D
NA recognitionscheme: a novel DNA base that binds a CG base-pair in an organic
solvent. ）」、ジマーマン、エス．シー．；シュミット、ピー．（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ
，Ｓ．Ｃ．；Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｐ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５年、第
１１７巻、１０７６９〜１０７７０ページ）
（「普遍的光切断ＤＮＡ塩基：ニトロピペロニル２’−デオキシリボシド（A universa
l,photocleavable DNA base: nitropiperonyl 2'-deoxyriboside.）」、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ
ｈｅｍ．、２００１年、第６６巻、２０６７〜２０７１ページ）
（「２−アシルアミノ−１，８−ナフチリジンによる単一グアニンバルジの認識（Reco
gnition of asingle guanine bulge by 2-acylamino-1,8-naphthyridine. ）」、ナカタ
ニ、ケー．；サンド、エス．；サイトー、アイ．（Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｋ．；Ｓａｎｄｏ
，Ｓ．；Ｓａｉｔｏ，Ｉ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻
、２１７２〜２１７７ページ。ｂ．「ＧＣダブレットの光酸化により明らかであるような
単一グアニンバルジへの２−アミノ−１，８−ナフチリジンの特異的結合（Specific bin
ding of2-amino-1,8- naphthyridine into single guanine bulge as evidenced by pho
tooxidation ofGC doublet.）」、ナカタニ、ケー．；サンド、エス．；ヨシダ、ケー．
；サイトー、アイ．（Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｋ．；Ｓａｎｄｏ，Ｓ．；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ
．；Ｓａｉｔｏ，Ｉ．）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００１年、
第１１巻、３３５〜３３７ページ）
他の普遍的塩基は、下記式を有することができる：
（式中、
Ｑは、Ｎ又はＣＲ４４であり、
Ｑ’は、Ｎ又はＣＲ４５であり、
Ｑ”は、Ｎ又はＣＲ４７であり、
Ｑ’’’は、Ｎ又はＣＲ４９であり、
Ｑｉｖは、Ｎ又はＣＲ５０であり、
Ｒ４４は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又
はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリー
ル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルであるか、あるいはＲ４５と一体となって−ＯＣＨ２Ｏ−
を形成し、
Ｒ４５は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又
はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリー
ル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルであるか、あるいはＲ４４又はＲ４６と一体となって−Ｏ
ＣＨ２Ｏ−を形成し、
Ｒ４６は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又
はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリー
ル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルであるか、あるいはＲ４５又はＲ４７と一体となって−Ｏ
ＣＨ２Ｏ−を形成し、
Ｒ４７は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又
はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリー
ル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルであるか、あるいはＲ４６又はＲ４８と一体となって−Ｏ
ＣＨ２Ｏ−を形成し、
Ｒ４８は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又
はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリー
ル、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルであるか、あるいはＲ４７と一体となって−ＯＣＨ２Ｏ−
を形成し、
Ｒ４９、Ｒ５０、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４、Ｒ５７、Ｒ５８、Ｒ５９、Ｒ６０
、Ｒ６１、Ｒ６２、Ｒ６３、Ｒ６４、Ｒ６５、Ｒ６６、Ｒ６７、Ｒ６８、Ｒ６９、Ｒ７０
、Ｒ７１及びＲ７２はそれぞれ独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロ
キシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル
、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、Ｎ
Ｃ（Ｏ）Ｒ１７、又はＮＣ（Ｏ）Ｒ０から選択され、
Ｒ５５は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又
はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ
６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１７、又はＮＣ（
Ｏ）Ｒ０であるか、あるいはＲ５６と一体となって縮合芳香環を形成し、該縮合芳香環は
任意選択で置換されていてもよく、
Ｒ５６は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又
はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ
６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１７、又はＮＣ（
Ｏ）Ｒ０であるか、あるいはＲ５５と一体となって縮合芳香環を形成し、該縮合芳香環は
任意選択で置換されていてもよく、
Ｒ１７は、ハロ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、又はＮＲｂＲｃであり、
Ｒｂは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル又は窒素保護基であり、
ＲＣは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ０は、任意選択でハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、ＮＨ２、ＮＨＲｂ、
又はＮＲｂＲｃ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、
Ｃ６〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１７、又はＮＣ
（Ｏ）Ｒ０で置換されたアルキルである。）
普遍的塩基の例として以下のものが挙げられる：
非対称的な修飾
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載するように、かつ２００４年３月８日
付けで出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（これは、参照により本明
細書に援用される）に記載されるように、非対称的に修飾することができる。
さらに、本発明は、非対称的な修飾及び本明細書中に記載する別の構成要素を有するｉ
ＲＮＡ剤を包含する。例えば、本発明は、本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤、例えば、パ
リンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載
する遺伝子（例えば、ＳＮＣＡ遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する
構成様式又は構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する薬物送達モジュールと結合
されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に
記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、非対称的な修飾も取り入れるｉＲＮＡ
剤を包含する。
非対称的に修飾されたｉＲＮＡ剤とは、鎖が他方の鎖上に存在しない修飾を有するｉＲ
ＮＡ剤である。非対称的な修飾とは、一方の鎖上に見られるが、他方の鎖上には見られな
い修飾である。任意の修飾、例えば本明細書中に記載する任意の修飾は、非対称的な修飾
として存在し得る。非対称的な修飾により、修飾に伴う任意の望ましい特性、例えば本明
細書中で論述した特性を付与することができる。例えば、非対称的な修飾は、分解に対す
る耐性、半減期の変更をもたらすこともできるし、ｉＲＮＡ剤に特定の標的（例えば、特
定の組織）を指向させることもできるし、鎖のその相補体又は標的配列に対する親和性を
調節（例えば、増大又は低減）することもできるし、あるいは末端部分の修飾（例えば、
キナーゼ又はＲＩＳＣ機構の経路に関与する他の酵素による修飾）を妨害又は促進するこ
ともできる。ある修飾について１つの特性を有するものとして指定しても、該修飾が他の
特性を有していないことを意味するわけではない（例えば、安定化を促進する修飾として
言及される修飾が、標的化も増強することもありうる）。
理論又はいかなる特定の機構モデルによっても拘束されることは望まないが、非対称的
な修飾は、ｉＲＮＡ剤をセンス鎖及びアンチセンス鎖の異なるすなわち「非対称的」機能
という観点で最適化させることが可能であると考えられる。例えば、両方の鎖がヌクレア
ーゼ耐性を増大するように修飾されてもよいが、変更によってはＲＩＳＣ活性が阻害され
得るため、これらの変更をセンス鎖に関して選択してもよい。さらに、一部の修飾、例え
ば標的化部分は、例えばＲＩＳＣ複合体の切断活性を妨害しうる大きな嵩高い基を付加す
ることができるので、そのような修飾はセンス鎖に配置されることが好ましい。したがっ
て、標的化部分、特に嵩高い標的化部分（例えば、コレステロール）は、センス鎖に優先
的に付加される。一実施形態では、バックボーンのリン酸をＳで置換する非対称的修飾、
例えばホスホロチオエート修飾がアンチセンス鎖に存在し、かつ２’修飾、例えば２’Ｏ
Ｍｅがセンス鎖に存在する。標的化部分は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の５’又は３’末端の
いずれか（又は両方）に存在し得る。好ましい例では、アンチセンス鎖においてはバック
ボーンのＰがＳで置き換えられ、２’ＯＭｅがセンス鎖に存在し、標的化部分がｉＲＮＡ
剤のセンス鎖の５’又は３’末端のいずれかに付加される。
好ましい実施形態では、非対称的に修飾されたｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖上では見
られない修飾をセンス鎖上に有し、アンチセンス鎖は、センス鎖上では見られない修飾を
有する。
鎖はそれぞれ、１つ又はそれ以上の非対称的修飾を包含し得る。例を挙げると、一方の
鎖は、ｉＲＮＡ剤に対して第１の特性を付与する第１の非対称的修飾を包含することがで
き、他方の鎖は、ｉＲＮＡに対して第２に特性を付与する第２の非対称的修飾を有するこ
とができる。例えば、一方の鎖、例えばセンス鎖は、ｉＲＮＡ剤が組織を標的とするよう
な修飾を有することができ、他方の鎖、例えばアンチセンス鎖は、標的遺伝子配列とのハ
イブリダイゼーションを促進する修飾を有する。
幾つかの実施形態では、両方の鎖が同じ特性を最適化するように、例えば核酸分解に対
する耐性を増大させるように修飾することができるが、例えば修飾がさらに他の特性に影
響を及ぼすという理由で、センス鎖及びアンチセンス鎖に関して異なる修飾が選ばれる。
例えば、一部の変更は、ＲＩＳＣ活性に影響を及ぼし得るため、これらの修飾はセンス鎖
について選ばれる。
ある実施形態では、一方の鎖は、非対称的な２’修飾、例えば２’ＯＭｅ修飾を有し、
他方の鎖は、リン酸バックボーンの非対称的修飾、例えばホスホロチオエート修飾を有す
る。したがって、一実施形態では、アンチセンス鎖が非対称的な２’ＯＭｅ修飾を有し、
センス鎖が非対称的なホスホロチオエート修飾を有する（あるいは、その逆でもよい）。
特に好ましい実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、センス鎖上に非対称的な２’−Ｏア
ルキル、好ましくは２’−ＯＭｅ修飾を、アンチセンス鎖には非対称的なバックボーンの
Ｐ修飾、好ましくはホスホロチオエート修飾を有する。１つ又は多数の２’−ＯＭｅ修飾
が存在することができ、例えば、センス鎖の少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個
のサブユニットを２’−ＯＭｅ修飾することができる。１つ又は多数のホスホロチオエー
ト修飾が存在することができ、例えば、アンチセンス鎖の少なくとも２個、３個、４個、
５個又は６個のサブユニットをホスホロチオエート修飾することができる。センス鎖上に
多数の２’−ＯＭｅ修飾及びアンチセンス鎖上に多数のホスホロチオエート修飾が存在す
るｉＲＮＡ剤を有することが好ましい。一方又は両方の鎖上のすべてのサブユニットを前
記のように修飾することもできる。両方の鎖上の多数の非対称的修飾の特に好ましい実施
形態は、長さが約２０〜２１サブユニット、好ましくは１９サブユニットの二本鎖領域、
及び長さが約２サブユニットの１個又は２個の３’突出部を有する。
非対称的な修飾は、ヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼによる分解に対する耐性
を促進するのに有用である。ｉＲＮＡ剤は、分解に対する耐性を促進する１つ又はそれ以
上の非対称的修飾を包含することができる。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖上の
修飾は、標的のサイレンシングを妨害しない修飾、例えば標的の切断を妨害しない修飾で
ある。鎖上のすべてではないにしても、ほとんどの部位が、エンドヌクレアーゼによる分
解に対してある程度弱い。相対的に弱い部位を特定し、分解を阻害する非対称的修飾を挿
入することができる。多くの場合、ｉＲＮＡ剤におけるＵＡ部位の非対称的修飾を提供す
ることが望ましく、場合によっては、両方の鎖上のＵＡ配列に非対称的修飾を提供するこ
とが望ましい。エンドヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書中に見出
すことができる。特に好適な修飾としては、２’位修飾（例えば特にセンス鎖上のＵへの
２’ＯＭｅ部分の付与）、バックボーンの修飾（例えば、特にアンチセンス鎖上のＵ若し
くはＡ又はその両方についてリン酸バックボーンのＯをＳで置き換えること（例えば、ホ
スホロチオエート修飾の提供）による修飾）、ＵをＣ５アミノリンカーで置き換えること
、ＡをＧで置き換えること（配列の変更は、センス鎖上に位置し、アンチセンス鎖上には
位置しないことが好ましい）、及び２’、６’、７’又は８’位の修飾が挙げられる。好
ましい実施形態は、１つ又はそれ以上のこれらの修飾がセンス鎖上に存在するが、アンチ
センス鎖上には存在しない実施形態、あるいはアンチセンス鎖のほうがこのような修飾の
数が少ない実施形態である。
非対称的な修飾は、エキソヌクレアーゼによる分解を阻害するために使用することがで
きる。非対称的な修飾としては、一方の鎖のみが修飾されるもの、ならびに両方が修飾さ
れるものを挙げることができる。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖上の修飾は、標
的のサイレンシングを妨害しない修飾、例えば標的の切断を妨害しない修飾である。幾つ
かの実施形態は、センス鎖上、例えば３’突出部の例えば３’末端に、及びアンチセンス
鎖上、例えば３’突出部の例えば３’末端に、非対称的修飾を有する。修飾により異なる
サイズの構成部分が導入される場合、大きいほうがセンス鎖上に存在することが好ましい
。修飾により異なる電荷の構成部分が導入される場合、より大きな電荷を有する部分がセ
ンス鎖上に存在することが好ましい。
エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書中に見出すことができ
る。特に好適な修飾としては、２’位修飾（例えば３’突出部の例えば３’末端への２’
ＯＭｅ部分の提供（３’末端とは、文脈により示されるように、分子の３’位の原子、又
は最も３’側の構成部分、例えば最も３’側のＰ又は２’位を意味する））、例えばＰを
Ｓで置き換えること（例えば、ホスホロチオエート修飾の提供）もしくは３’突出部の例
えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用によるバックボーンの修飾、２’位修飾の組合せ
（例えば、２’ＯＭｅ部分の提供と、例えばＰをＳで置き換えること（例えば、ホスホロ
チオエート修飾の提供）もしくは３’突出部の例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用
によるバックボーンの修飾との組合せ）、３’アルキルによる修飾、３’突出部の例えば
３’末端における脱塩基ピロリジンによる修飾、ナプロキセン、イブプロフェン又はその
他の分解を阻害する構成部分による３’末端の修飾が挙げられる。好ましい実施形態は、
１つ又はそれ以上のこれらの修飾がセンス鎖上に存在するが、アンチセンス鎖上には存在
しないもの、あるいはアンチセンス鎖のほうがこのような修飾の数が少ない実施形態であ
る。
標的化に影響を及ぼす修飾、例えば本明細書中に記載する修飾を、非対称的修飾として
提供することが可能である。例えば標的の切断を阻害することにより、サイレンシングを
阻害し得る標的化修飾は、センス鎖の非対称的修飾として提供され得る。体内分布を変化
させる構成部分（例えばコレステロール）は、センス鎖における１つ又はそれ以上（例え
ば、２つ）の非対称的修飾として提供され得る。比較的大きな分子量（例えば４００、５
００又は１，０００ダルトンを上回る分子量）を有する構成部分を導入する標的化修飾、
あるいは電荷を有する構成部分（例えば、２つ以上の正電荷又は１つの負電荷を有する構
成部分）を導入する標的化修飾は、センス鎖上に配置させることができる。
鎖のその相補体又は標的に対する親和性を調節する（例えば、増大又は低下させる）修
飾、例えば本明細書中に記載する修飾は、非対称的修飾として提供され得る。これらの修
飾としては、５メチルＵ、５メチルＣ、プソイドウリジン、ロックト核酸、２チオＵ及び
２−アミノ−Ａが挙げられる。幾つかの実施形態では、これらの１つ又はそれ以上がアン
チセンス鎖上に提供される。
ｉＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する規定構造を有し、多くの場合例え
ば２又は３ヌクレオチドの短い一本鎖の突出部が、一方又は両方の３’末端に存在する。
非対称的な修飾を、例えばｉＲＮＡ内に選択的に位置させることにより、このような構造
の活性を最適化するのに使用することができる。例えば、センス鎖の５’末端及びアンチ
センス鎖の３’末端により規定されるｉＲＮＡ剤の末端領域は、機能にとって重要である
。この領域は、末端の２個、３個又は４個のヌクレオチド対と任意の３’突出部とを含む
ことができる。好ましい実施形態では、以下、すなわち：センス鎖のキナーゼ活性化を阻
害するセンス鎖５’末端の修飾（例えば、キナーゼ分子を標的とする複合体の結合、又は
５’エキソヌクレアーゼによる分解に対して保護的に作用する修飾の使用など）、又はセ
ンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合を増強することにより分子のこの末端にある「緊密
な」構造を促進する、いずれか一方の鎖、好ましくはセンス鎖の修飾、のうち１つ又はそ
れ以上をもたらす非対称的修飾が使用される。
センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端により規定されるｉＲＮＡ剤の末端
領域もまた機能にとって重要である。この領域は、末端の２個、３個又は４個のヌクレオ
チド対と任意の３’突出部とを含むことができる。好ましい実施形態は、センス鎖とアン
チセンス鎖との間の結合を減少させることにより分子のこの末端にある「開放的な」構造
を促進する、いずれか一方の鎖、好ましくはセンス鎖の非対称的修飾を包含する。このよ
うな修飾としては、分子を標的とする複合体を配置すること、あるいはセンス鎖のこの領
域におけるヌクレアーゼ耐性を促進する修飾が挙げられる。キナーゼ活性化を阻害するア
ンチセンス鎖の修飾は、好ましい実施形態では回避される。
センス鎖に非対称的に配置される例示的な修飾としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）バックボーン修飾（例えば、バックボーンのＰの修飾）であって、ＰをＳで置き
換えること、又はアルキル若しくはアリル（例えば、Ｍｅ）で置換されたＰ、及びジチオ
エート（Ｓ−Ｐ＝Ｓ）を含む；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するのに使用す
ることができる；
（ｂ）２’−Ｏアルキル（例えば、２’−ＯＭｅ）、３’−Ｏアルキル（例えば、３’
−ＯＭｅ）（末端及び内部位置の少なくともいずれかを修飾）；これらの修飾は、ヌクレ
アーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を増強するために使
用することができ、３’位修飾は、ＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセン
ス鎖の５’末端で使用することができる；
（ｃ）２’〜５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅによるもの、及びＰ＝
Ｏ又はＰ＝Ｓによるもの）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はア
ンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲ
ＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもでき
る；
（ｄ）Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを有する２’Ｌ−リボー
ス、Ｌ−アラビノース）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアン
チセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲＩ
ＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる
；
（ｅ）修飾糖（例えば、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）及びシク
ロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ））；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又
はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるい
はＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することも
できる；
（ｆ）核酸塩基修飾（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾
プリン、Ｎ−６修飾プリン）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、又
はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を促進するために使用することができる；
（ｇ）カチオン基及び双性イオン基（末端にあることが好ましい）；これらの修飾は、
ヌクレアーゼ耐性を促進するために使用することができる；
（ｈ）複合体基（末端位置にあることが好ましい）、例えば、ナプロキセン、ビオチン
、コレステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質；これらの修飾は、ヌクレ
アーゼ耐性を促進するため、又は分子を標的化するために使用することもできるし、ある
いはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用すること
もできる。
アンチセンス鎖に非対称的に配置される例示的な修飾としては、以下のものが挙げられ
る：
（ａ）バックボーン修飾（例えば、バックボーンのＰの修飾）であって、ＰをＳで置き
換えること、又はアルキル若しくはアリル（例えば、Ｍｅ）で置換されたＰ、及びジチオ
エート（Ｓ−Ｐ＝Ｓ）を含む；
（ｂ）２’−Ｏアルキル（例えば、２’−ＯＭｅ）（末端位置を修飾）；
（ｃ）２’〜５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅによるもの（例えば、
３’末端での末端修飾）；Ｐ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによる好ましくは３’末端の修飾）；これら
の修飾は、キナーゼ活性のようなＲＩＳＣ酵素活性を妨害し得るため、５’末端領域から
は排除されることが好ましい；
（ｄ）Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを有するＬ−リボース、
Ｌ−アラビノース）；例えば、３’末端での末端修飾；例えばＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによる好
ましくは３’末端の修飾；これらの修飾は、キナーゼ活性を妨害し得るため、５’末端領
域から排除されることが好ましい；
（ｅ）修飾糖（例えば、ＬＮＡ、ＨＮＡ及びＣｅＮＡ）；これらの修飾は、センス鎖と
アンチセンス鎖との間の対合の望ましくない増強に寄与し得るが、多くの場合は５’領域
において「緩い」構造を有することが好ましいので、さらに該修飾はキナーゼ活性を妨害
し得るので、５’末端領域からは排除されることが好ましい；
（ｆ）核酸塩基修飾（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾
プリン、Ｎ−６修飾プリン）；
（ｇ）カチオン基及び双性イオン基（末端にあることが好ましい）；
糖の２’位、糖の３’位にあるカチオン基及び双性イオン基；核酸塩基修飾（例えば、
Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾プリン、Ｎ−６修飾プリン）とし
てのカチオン基及び双性イオン基；
複合体基（末端位置にあることが好ましい）、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレ
ステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質であって、但し、嵩高い基又は概
してＲＩＳＣ活性を阻害する基はあまり好ましくないはずである。
アンチセンス鎖の５’−ＯＨは、活性を促進するように遊離型に保たれるべきである。
幾つかの好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を促進する修飾は、３’末端、特に３
’突出部に包含されるべきである。
別の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤を最適化する方法、例えば安定化する方法を特徴
とする。該方法は、活性を有する配列を選択すること、該配列に１つ又はそれ以上の非対
称的な修飾を導入することを包含し、非対称的な修飾の導入によりｉＲＮＡ剤の特性が最
適化されるが、活性の減少はもたらされない。
活性の減少とは、予め選択されたレベルの減少よりも小さい減少とすることができる。
好ましい実施形態では、活性の減少とは、修飾が導入されないこと以外は同じｉＲＮＡと
比較した場合に、５％、１０％、２０％、４０％又は５０％未満の減少であることを意味
する。活性は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができ、い
ずれにおける結果も、所要の活性維持を実証するのに十分である。
最適化される特性は、本明細書中に記載する任意の特性、特に本明細書中の非対称的な
修飾に関するセクションで論述する特性であり得る。修飾は、任意の非対称的な修飾、例
えば、本明細書中の非対称的な修飾に関するセクションで記載する非対称的な修飾であり
得る。特に好ましい非対称的な修飾は、特にセンス配列における２’−Ｏアルキル修飾（
例えば２’−ＯＭｅ修飾）、及びアンチセンス鎖におけるバックボーンのＯの修飾、特に
ホスホロチオエート修飾である。
好ましい実施形態では、センス配列が選択されて非対称的な修飾が付与される一方で、
他の実施形態ではアンチセンス配列が選択されて非対称的な修飾が付与される。幾つかの
実施形態では、センス配列及びアンチセンス配列がともに選択され、それぞれ１つ又はそ
れ以上の非対称的な修飾が付与される。
多数の非対称的な修飾が、センス配列及びアンチセンス配列の一方又は両方に導入され
得る。配列は、少なくとも２個、４個、６個、８個又はそれ以上の修飾を有することがで
き、配列のすべてのモノマー又は実質的にすべてのモノマーを修飾することができる。
Ｚ−Ｘ−Ｙ構成様式
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載するようなＺ−Ｘ−Ｙ構成様式又は構
造を有することができる。さらに、ｉＲＮＡ剤は、Ｚ−Ｘ−Ｙ構造及び本明細書中に記載
する別の構成要素を有することができる。例えば、本発明は、本明細書中に記載するｉＲ
ＮＡ剤、例えばパリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、
本明細書中に記載する遺伝子（例えば、ＳＮＣＡ遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本明
細書中に記載する両親媒性送達剤と結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載する薬物送達
モジュールと結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、
又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、Ｚ−Ｘ−Ｙ構築様式
も取り入れるｉＲＮＡ剤を包含する。
したがって、ｉＲＮＡ剤は、第１のセグメントであるＺ領域、第２のセグメントである
Ｘ領域、及び任意選択で第３の領域であるＹ領域：
Ｚ−Ｘ−Ｙ
を有することができる。
一方ではＺ及び／又はＹの一方又は両方、かつ他方ではＸにおけるサブユニットを修飾
することが望ましい場合がある。場合によっては、サブユニットは、同じ修飾又は同じ種
類の修飾を有するが、Ｚ及び／又はＹにおいて施される修飾は、Ｘにおいて施される修飾
と異なる場合のほうが多い。
Ｚ領域は通常、ｉＲＮＡ剤の末端を包含する。Ｚ領域の長さは多様であり得るが、通常
２〜１４個、より好ましくは２〜１０個のサブユニットの長さである。通常、Ｚ領域は一
本鎖状である（すなわちＺ領域は、別の鎖の塩基と塩基対合しない）が、幾つかの実施形
態では、自己会合して、例えばループ構造を形成し得る。このような構造は、鎖の末端が
折り返して鎖内二本鎖を形成することにより形成され得る。例えば、通常２個又はそれ以
上の対合しないサブユニットでできた折り返し領域又は接続領域を有する２個、３個、４
個、５個又はそれ以上の鎖内塩基対が生じ得る。これは、鎖の一方の末端で生じてもよい
し両末端で生じてもよい。Ｚ領域の典型的な実施形態は、一本鎖突出部、例えば本明細書
の他の箇所に記載する長さの突出部である。したがって、Ｚ領域は、３’又は５’末端の
一本鎖でもよいし、又は３’又は５’末端の一本鎖を包含していてもよい。Ｚ領域はセン
ス鎖でもアンチセンス鎖でもよいが、アンチセンスである場合には、領域は３−突出部で
あることが好ましい。Ｚ領域における典型的なサブユニット間結合としては、Ｐ＝Ｏ、Ｐ
＝Ｓ、Ｓ−Ｐ＝Ｓ、Ｐ−ＮＲ２及びＰ−ＢＲ２が挙げられる。キラルＰ＝Ｘ（式中、Ｘは
、Ｓ、Ｎ又はＢである）のサブユニット間結合もまた存在することができる。他の好まし
いＺ領域サブユニット修飾（同様に本明細書中の他の箇所で論述）としては、３’−ＯＲ
、３’ＳＲ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ及び２’ＯＨ修飾ならびに構成部分、α立体配
置の塩基、ならびに２’アラビノ修飾を挙げることができる。
Ｘ領域は多くの場合、一本鎖ｉＲＮＡ剤の場合には一本鎖の対応する領域とともに、あ
るいは二本鎖のｉＲＮＡ剤の場合には他方の鎖の対応する領域とともに、二本鎖状をなし
ている。Ｘ領域の長さは多様であり得るが、通常１０〜４５個、より好ましくは１５〜３
５個のサブユニットである。特に好ましい領域Ｘは、１７個、１８個、１９個、２９個、
２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のヌクレオチド対を包含するが、他の適切な
長さは、本明細書中の他の箇所で記載されており、それらを使用することができる。典型
的なＸ領域のサブユニットとしては、２’−ＯＨサブユニットが挙げられる。典型的な実
施形態では、サブユニット間リン酸結合が好ましい一方で、ホスホロチオエート又は非リ
ン酸結合は存在しない。Ｘ領域において好ましい他の修飾としては、結合を改善するため
の修飾（例えば、核酸塩基修飾）、カチオン性核酸塩基修飾、及びＣ−５修飾ピリミジン
（例えば、アリルアミン）が挙げられる。幾つかの実施形態は、４個又はそれ以上の連続
した２’ＯＨサブユニットを有する。ホスホロチオエートの使用は好ましくないこともあ
るが、４個未満の連続した２’ＯＨサブユニットを結合する場合に使用することもできる
。
Ｙ領域は概して、Ｚ領域に関して記載されたパラメータに準ずる。しかしながら、Ｘ領
域及びＺ領域は同じである必要はなく、異なる種類及び異なる数の修飾が存在することが
でき、実際、一方は通常３’突出部であり、一方は通常５’突出部である。
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２’ＯＨが例えば２’−ＯＭｅ又は他のアルキ
ルで置換されたリボヌクレオシドをそれぞれが有するＹ及び／又はＺ領域、ならびに２’
−ＯＨが非置換のままである少なくとも４個の連続したリボヌクレオシドサブユニットを
含むＸ領域を有する。
ｉＲＮＡ剤のサブユニット結合（サブユニット間の結合）は、例えば分解に対する耐性
を促進するために修飾されてもよい。このような修飾の数多くの例が本明細書中に開示さ
れており、その一例がホスホロチオエート結合である。これらの修飾は、領域Ｘ、Ｙ及び
Ｚのいずれかのサブユニット間に付与することができる。しかしながら、それらの修飾は
最小限に抑えられることが好ましく、特に連続した修飾結合は回避されることが好ましい
。
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２’ＯＨが例えば２’−ＯＭｅで置換されたリ
ボヌクレオシドをそれぞれが有するＹ及びＺ領域、ならびに２’−ＯＨが非置換のままで
ある少なくとも４個の連続したサブユニット（例えば、リボヌクレオシドサブユニット）
を含むＸ領域を有する。
上述のように、ｉＲＮＡ剤のサブユニット結合は、例えば分解に対する耐性を促進する
ために修飾されてもよい。これらの修飾は、領域Ｙ、Ｘ及びＺのいずれかのサブユニット
間に付与することができる。しかしながら、修飾は最小限に抑えられることが好ましく、
特に連続した修飾結合は回避されることが好ましい。
したがって、好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤のサブユニット結合のすべてが修飾さ
れるわけではなく、より好ましくは、ホスホジエステル結合以外の結合により連結された
連続サブユニットの最大数は、２個、３個又は４個である。特に好ましいｉＲＮＡ剤は、
サブユニットがそれぞれ修飾結合（すなわちＲＮＡ及びＤＮＡで天然に見られるホスホジ
エステル結合と比較した場合に分解に対して結合を安定化するように修飾された結合）に
より結合された４個又はそれ以上の連続したサブユニット、例えば２’−ヒドロキシルリ
ボヌクレオシドサブユニットを持たない。
領域Ｘにおける上記修飾を最小限に抑えることが特に好ましい。したがって、好ましい
実施形態では、Ｘにおけるヌクレオシドサブユニット結合のそれぞれがホスホジエステル
結合であるか、あるいは領域Ｘのサブユニット結合が修飾される場合、このような修飾は
最小限に抑えられる。例えば、Ｙ及び／又はＺ領域は、分解に対して安定化されたサブユ
ニット間結合を包含することができるが、このような修飾はＸ領域では最小限に抑えられ
、特に連続した修飾は最小限に抑えられる。したがって、好ましい実施形態ではホスホジ
エステル結合以外で結合される連続したサブユニットの最大数は、２個、３個又は４個で
ある。特に好ましいＸ領域は、サブユニットがそれぞれ修飾結合（すなわちＲＮＡ及びＤ
ＮＡで天然に見られるホスホジエステル結合と比較した場合に分解に対して結合を安定化
するように修飾された結合）により結合された４個又はそれ以上の連続したサブユニット
、例えば２’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを持たない。
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺは、ホスホロチオエート結合を含まないが、一
方又は両方が他の修飾、例えばサブユニット結合の他の修飾を含有してもよい。
好ましい実施形態では、領域Ｘ、あるいは場合によっては全ｉＲＮＡ剤が、同一の２’
部分を有する３個以下又は４個以下のサブユニットを有する。
好ましい実施形態では、領域Ｘ、あるいは場合によっては全ｉＲＮＡ剤が、同一のサブ
ユニット結合を有する３個以下又は４個以下のサブユニットを有する。
好ましい実施形態では、１つ又はそれ以上のホスホロチオエート結合（又はサブユニッ
ト結合の他の修飾）がＹ及び／又はＺ中に存在するが、このような修飾結合は、２’位修
飾（例えば、２’−Ｏ−アルキル部分）を有する隣接した２つのサブユニット（例えばヌ
クレオシド）を結合しない。例えば、Ｙ及び／又はＺにおけるすべての隣接した２’−Ｏ
−アルキル部分は、ホスホロチオエート結合以外の結合により接続される。
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺのそれぞれが独立して、２’位修飾を有する隣
接したヌクレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）の
間に１つだけホスホロチオエート結合を有する。Ｙ及び／又はＺにおいて、２’修飾を有
する隣接したヌクレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシ
ド）がもう１組存在する場合、この第２の組は、ホスホロチオエート結合以外の結合、例
えばホスホロチオエート結合以外の修飾結合により接続される。
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺのそれぞれが独立して、２’位修飾を有するヌ
クレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）の隣接した
対を結合する２個以上のホスホロチオエート結合を有するが、２’位修飾を有するヌクレ
オシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）の隣接したサブ
ユニットのうち少なくとも１対は、ホスホロチオエート以外の結合、例えばホスホロチオ
エート結合以外の修飾結合により結合される。
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺにおける隣接したサブユニットに関する上述の
制限の１つが、Ｘにおけるサブユニットに関する制限と組み合わされる。例えば、１つ又
はそれ以上のホスホロチオエート結合（又はサブユニット結合の他の修飾）がＹ及び／又
はＺ中に存在するが、このような修飾結合は、２’修飾（例えば、２’−Ｏ−アルキル部
分）を有するヌクレオシドなど、２つの隣接したサブユニットを結合しない。例えば、Ｙ
及び／又はＺのあらゆる隣接した２’−Ｏ−アルキル部分は、ホスホロチオエート結合以
外の結合により接続される。さらに、Ｘ領域は、３個以下又は４個以下の同一のサブユニ
ット（例えば同一の２’部分を有するサブユニット）を有するか、あるいはＸ領域は、３
個以下又は４個以下の同一のサブユニット結合を有するサブユニットを有する。
Ｙ領域及び／又はＺ領域は、少なくとも１個、好ましくは２個、３個又は４個の本明細
書中に開示する修飾を包含することができる。このような修飾は、独立して、本明細書中
に記載する任意の修飾（例えば、ヌクレアーゼ耐性サブユニット、修飾塩基を有するサブ
ユニット、修飾サブユニット間結合を有するサブユニット、修飾糖を有するサブユニット
、及び別の構成部分（例えば、標的化部分）に連結されたサブユニット）から選ぶことが
できる。好ましい実施形態では、２個以上のこのようなサブユニットが存在し得るが、幾
つかの実施形態では、１個以下、２個以下、３個以下又は４個以下のこのような修飾が行
われるか、又は連続して行われることが好ましい。好ましい実施形態では、修飾の頻度は
、Ｙ及び／又はＺとＸとの間で異なり、例えば、修飾は、Ｙ及び／又はＺとＸとのうち一
方に存在し、他方には存在しない。
Ｘ領域は、本明細書中に開示する少なくとも１個、好ましくは２個、３個又は４個の修
飾を包含することができる。このような修飾は、独立して、本明細書中に記載する任意の
修飾から（例えば、ヌクレアーゼ耐性サブユニット、修飾塩基を有するサブユニット、修
飾サブユニット間結合を有するサブユニット、修飾糖を有するサブユニット、及び別の構
成部分（例えば、標的化部分）に連結されたサブユニットから）選ぶことができる。好ま
しい実施形態では、２個以上のこのようなサブユニットが存在し得るが、幾つかの実施形
態では、１個以下、２個以下、３個以下又は４個以下のこのような修飾が行われるか、又
は連続して行われることが好ましい。
ＲＲＭＳ（本明細書中の他の箇所に記載する）は、二本鎖のｉＲＮＡ剤の一方又は両方
の鎖の１つ又はそれ以上の部位に導入することができる。ＲＲＭＳは、Ｙ及び／又はＺ領
域においては、センス鎖の３’若しくは５’末端又はその付近（末端から１、２又は３位
以内）に、あるいはアンチセンス鎖の３’末端又はその付近（末端から２又は３位以内）
に配置させることができる。幾つかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端又はその
付近（５’末端から１、２又は３位以内）にＲＲＭＳを有していないことが好ましい。Ｒ
ＲＭＳをＸ領域に配置することも可能であり、好ましくはセンス鎖に、あるいは標的に対
するアンチセンス鎖の結合に重要でないアンチセンス鎖の領域に配置されることになる。
末端における二本鎖の安定性の差次的修飾
一態様では、本発明は、末端における二本鎖の安定性の差次的修飾（ＤＭＴＤＳ）を有
することができるｉＲＮＡ剤を特徴とする。
さらに、本発明は、ＤＭＴＤＳ及び本明細書中に記載する別の構成要素を有するｉＲＮ
Ａ剤を包含する。例えば、本発明は、本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤、例えば、パリン
ドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する
遺伝子（例えば、ＳＮＣＡ遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する構成
様式又は構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する両親媒性送達剤と結合されたｉ
ＲＮＡ、本明細書中に記載する薬物送達モジュールと結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に
記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉ
ＲＮＡ剤であって、ＤＭＴＤＳも取り入れるｉＲＮＡ剤を包含する。
ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖二本鎖の５’末端の領域において、該二本鎖が解離又は
融解する傾向を増大させること（二本鎖の会合の自由エネルギーを減少させること）によ
り最適化することができる。このことは、例えば、アンチセンス鎖の５’末端の領域に、
二本鎖が解離又は融解する傾向を増大させるサブユニットを含めることにより達成するこ
とができる。また、５’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を増大させるリガ
ンドを結合することにより達成することもできる。理論により拘束されることを望まない
が、その効果は、ヘリカーゼのような酵素の作用を促進すること、例えばアンチセンス鎖
の５’末端に近接した酵素の作用を促進することに起因し得る。
本発明者等はまた、アンチセンス鎖二本鎖の３’末端の領域において、該二本鎖が解離
又は融解する傾向を減少させること（二本鎖の会合の自由エネルギーを増大させること）
により最適化することができることも発見した。このことは、例えばアンチセンス鎖の３
’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を減少させるサブユニットを含めること
により達成することができる。また、５’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向
を減少させるリガンドを結合することにより達成することもできる。
二本鎖の５’末端が解離する傾向を増大させる修飾は、単独で、あるいは本明細書中に
記載する他の修飾と、例えば二本鎖の３’末端が解離する傾向を減少させる修飾と併用し
て使用することができる。同様に、二本鎖の３’末端が解離する傾向を減少させる修飾は
、単独で、あるいは本明細書中に記載する他の修飾と、例えば二本鎖の５’末端が解離す
る傾向を増大させる修飾と併用して使用することができる。
二本鎖のＡＳ ５’末端の安定性の減少
サブユニット対は、解離又は融解を促進するそれらの傾向に基づいて順位付けすること
ができる（例えば、特定の対の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も簡単なアプ
ローチは、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同様の分析もまた使
用することができる）。解離を促進するという観点では、
Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく、
Ｇ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく、
Ｉ：Ｃは、Ｇ：Ｃよりも好ましく（Ｉ＝イノシン）；
ミスマッチ、例えば非標準的な対合すなわち標準的対合以外の対合（本明細書中の他の
箇所に記載するようなもの）は、標準的な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対よりも好ましく
；
普遍的塩基を含む対合は、標準的な対合よりも好ましい。
典型的なｄｓ ｉＲＮＡ剤は、以下の通りに図示することができる：
Ｓはセンス鎖を示し、ＡＳはアンチセンス鎖を示し、Ｒ１は任意選択の（かつ好ましく
ない）５’センス鎖突出部を示し、Ｒ２は任意選択の（しかし、好ましい）３’センス突
出部を示し、Ｒ３は任意選択の（しかし、好ましい）３’アンチセンス突出部を示し、Ｒ
４は任意選択の（かつ好ましくない）５’アンチセンス突出部を示し、Ｎはサブユニット
を示し、［Ｎ］は、さらなるサブユニット対が存在し得ることを示し、Ｐｘは、センス鎖
のＮｘとアンチセンス鎖のＮｘとの対を示す。突出部は、Ｐ図では示していない。幾つか
の実施形態では、本明細書中の他の箇所に記載するように、３’ＡＳ突出部は領域Ｚに相
当し、二本鎖領域は領域Ｘに相当し、３’Ｓ鎖突出部は領域Ｙに相当する。（図は、最大
又は最小の長さを暗に示すことを意味するものではなく、長さに関するガイダンスは、本
明細書中の他の箇所に提供される）。
二本鎖を形成する傾向を減少させる対合が、ＡＳ鎖の５’末端で二本鎖の１個又はそれ
以上の位置において使用されることが好ましい。末端の対（ＡＳ鎖に関しては最も５’側
の対）は、Ｐ−１と称され、それに続く二本鎖内の対合の位置（ＡＳ鎖から見ると３’方
向に向かっていく）は、Ｐ−２、Ｐ−３、Ｐ−４、Ｐ−５等と称される。二本鎖形成を調
節する修飾を施すための好ましい領域は、Ｐ−５〜Ｐ−１、より好ましくはＰ−４〜Ｐ−
１、さらに好ましくはＰ−３〜Ｐ−１である。Ｐ−１の修飾は特に好ましく、単独でも、
あるいは他の位置（複数可）（例えば、上記に同定された位置のいずれか）の修飾（複数
可）との併用でもよい。上述の領域の１つに存在する少なくとも１個、より好ましくは２
個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群：
Ａ：Ｕ
Ｇ：Ｕ
Ｉ：Ｃ
ミスマッチな対、例えば非標準的な対、すなわち標準的な対以外の対、あるいは普遍的
塩基を含む対合
から選ばれることが好ましい。
好ましい実施形態では、解離を促進する対合を達成するのに必要とされるサブユニット
の変更はセンス鎖で行われるが、幾つかの実施形態では、該変更がアンチセンス鎖で行わ
れる。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対が、解離
を促進する対である。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ａ：
Ｕである。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ：
Ｕである。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｉ：
Ｃである。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、ミス
マッチな対、例えば、非標準的な対、すなわち標準的な対以外の対である。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、普遍
的塩基を含む対である。
二本鎖のＡＳ ３’末端の安定性の増大
サブユニット対は、安定性を促進し、かつ解離又は融解を阻害するそれらの傾向に基づ
いて順位付けすることができる（例えば、特定の対合の会合又は解離の自由エネルギーに
関して、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同
様の分析もまた使用することができる）。二本鎖の安定性を促進するという観点では、
Ｇ：Ｃは、Ａ：Ｕよりも好ましく、
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）は、非標準的な対合、すなわち
標準的な対合以外の対合よりも好ましく、
安定性を増大させる類縁体は、ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）
よりも好ましく、
２−アミノ−Ａ：Ｕは、Ａ：Ｕよりも好ましく、
２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａは、Ｕ：Ａよりも好ましく、
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣの類縁体）：Ｇは、Ｃ：Ｇよりも好ましく、
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇは、Ｃ：Ｇよりも好ましく、
プソイドウリジン：Ａは、Ｕ：Ａよりも好ましく、
結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）は、
非修飾部分よりも好ましく、二本鎖の安定性を増強するために一方又は両方の鎖上に存在
することができる。二本鎖を形成する傾向を増大させる対合が、二本鎖の１つ又はそれ以
上の位置でＡＳ鎖の３’末端で使用されることが好ましい。末端の対（ＡＳ鎖から見て最
も３’側の対）は、Ｐ１と称され、これに続く二本鎖の対合の位置（ＡＳ鎖から見て５’
方向に向かっていく）は、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５等と称される。二本鎖形成を調節する
修飾を施すための好ましい領域は、Ｐ５〜Ｐ１、より好ましくはＰ４〜Ｐ１、さらに好ま
しくはＰ３〜Ｐ１である。Ｐ１での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（
複数可）（例えば、上記に同定された位置のいずれか）の修飾（複数可）と併用されても
よい。上述の領域に存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個
の対は、独立して、以下の群：
Ｇ：Ｃ
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）を上回って安定性を増大させる
類縁体を有する対
２−アミノ−Ａ：Ｕ
２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣの類縁体）：Ｇ
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ
プソイドウリジン：Ａ
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、
２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）を有する対
から選ばれることが好ましい。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、二本
鎖の安定性を促進する対である。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ：Ｃで
ある。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、ワトソン
−クリックの対合を上回って安定性を増大させる類縁体を有する対である。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、２−アミ
ノ−Ａ：Ｕである。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、２−チオ
Ｕ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａである。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ−クラ
ンプ：Ｇである。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、グアニジ
ニウム−Ｇ−クランプ：Ｇである。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、プソイド
ウリジン：Ａである。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、一方又は
両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、Ｅ
ＮＡ又はＬＮＡ）を有する対である。
Ｇ−クランプ及びグアニジニウムＧ−クランプについては、以下の参照文献で論述され
ている。ホルムズ及びガイト（Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｇａｉｔ）、「２’−Ｏ−メチル
Ｇ−クランプ含有オリゴヌクレオチドの合成及びＨＩＶ−１ Ｔａｔ−ＴＡＲ相互作用の
それらの阻害(TheSynthesis of 2'-O-Methyl G-Clamp Containing Oligonucleotides an
d TheirInhibition of the HIV-1 Tat-TAR Interaction)」、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、第２２巻：１２５９〜１２６２
ページ、２００３年、ホルムズら（Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．）、「２’−Ｏ−メチル
Ｇ−クランプリボヌクレオシド類縁体を含有するオリゴヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでの及び細胞におけるヒト免疫不全ウイルス１型Ｔａｔ依存性トランス活性化の立体
阻害(Stericinhibition of human immunodeficiency virus type-1 Tat-dependent tran
s-activationin vitro and in cells by oligonucleotides containing 2'-O-methyl G
-clampribonucleoside analogues)」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
、第３１巻：２７５９〜２７６８ページ、２００３年、ワイルズら（Ｗｉｌｄｓ，ｅｔ
ａｌ．）、「合成三環式シトシン類縁体：グアニジニウムＧ−クランプによるグアノシン
の認識に関する構造基盤 (Structural basis for recognition of guanosine by a synth
etic tricycliccytosine analogue:Guanidinium G-clamp) 」、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃ
ｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、第８６巻：９６６〜９７８ページ、２００３年、ラジェエエフ
ら（Ｒａｊｅｅｖ，ｅｔ ａｌ．）、「三環式シトシン類縁体を含有する高親和性ペプチ
ド核酸オリゴマー(High-AffinityPeptide Nucleic Acid Oligomers Containing Tricycl
ic CytosineAnalogues)」、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻：４３９５〜４３
９８ページ、２００２年、アウシンら（Ａｕｓｉｎ，ｅｔ ａｌ．）、「アミノ−及びグ
アニジノ−Ｇ−クランプＰＮＡモノマーの合成(Synthesis of Amino- and Guanidino-G-C
lamp PNAMonomers)」、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻：４０７３〜４０７５
ページ、２００２年、マイヤーら（Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．）、「三環式シトシン類縁
体フェノキサジン及び９−（２−アミノエトキシ）フェノキサジン（「Ｇ−クランプ」）
を含有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性及びそれらのヌクレアーゼ耐性特性の
由来(Nucleaseresistance of oligonucleotides containing the tricyclic cytosine a
naloguesphenoxazine and 9-(2-aminoethoxy)-phenoxazine ("G-clamp") and originso
f theirnuclease resistance properties) 」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４１巻：
１３２３〜７ページ、２００２年、フラナガンら（Ｆｌａｎａｇａｎ，ｅｔ ａｌ．）、
「アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する増強された効力を付与するシトシン類縁体(A
cytosineanalog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides) 」
、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
、第９６巻：３５１３〜８ページ、１９９９年。
二本鎖のＡＳ ５’末端の安定性の減少と二本鎖のＡＳ ３’末端の安定性の増大とを
同時に行うこと
上述のように、ｉＲＮＡ剤は、二本鎖のＡＳ ５’末端の安定性を減少させ、かつ二本
鎖のＡＳ ３’末端の安定性を増大させるように修飾することができる。このことは、二
本鎖のＡＳ ５’末端における１つ又はそれ以上の安定性を減少させる修飾を、二本鎖の
ＡＳ ３’末端における１つ又はそれ以上の安定性を増加させる修飾と組み合わせること
により達成することができる。したがって、好ましい実施形態は、Ｐ−５〜Ｐ−１、より
好ましくはＰ−４〜Ｐ-1、さらに好ましくはＰ-3〜Ｐ-1における修飾を包含する。Ｐ-1で
の修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（例えば、上記に同定された位置）
との併用でもよい。二本鎖領域のＡＳ ５’末端の上述の領域の１つに存在する少なくと
も１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群から選ばれ
ることが好ましい：
Ａ：Ｕ
Ｇ：Ｕ
Ｉ：Ｃ
ミスマッチな対、例えば非標準的な対合、すなわち標準的な対合以外の対合、あるいは
普遍的塩基を含む対合、及び
Ｐ５〜Ｐ１、より好ましくはＰ４〜Ｐ１、さらに好ましくはＰ３〜Ｐ１での修飾。Ｐ１
での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（例えば、上記に同定された位置
）との併用でもよい。二本鎖領域のＡＳ ３’末端の上述の領域の１つに存在する少なく
とも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群：
Ｇ：Ｃ
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）を上回って安定性を増大させる
類縁体を有する対
２−アミノ−Ａ：Ｕ
２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣの類縁体）：Ｇ
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ
プソイドウリジン：Ａ
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、
２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）を有する対
から選ばれることが好ましい。
本発明はまた、ＤＭＴＤＳを有するｉＲＮＡ剤を選択及び作製する方法を包含する。例
えば、ｉＲＮＡ剤として使用するための候補配列に関して標的配列をスクリーニングする
場合、本明細書中に記載するＤＭＴＤＳ特性を有する配列、及び、所望のレベルのＤＭＴ
ＤＳを付与するために好ましくはできる限り少ない変更で特にＡＳ鎖に対して修飾を施す
ことができる配列を選択することができる。
本発明はまた、ｉＲＮＡ剤候補配列を提供すること、ならびにＤＭＴＤＳ ｉＲＮＡ剤
を提供するために、Ｐ−５〜Ｐ−１における少なくとも１個のＰ及び／又はＰ５〜Ｐ1 に
おける少なくとも１個のＰを修飾することを包含する。
ＤＭＴＤＳ ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する任意の方法において、例えばＳＮＣ
ＡのＲＮＡをサイレンシングするために、本明細書中に記載する任意の障害（例えば、神
経変性障害）を治療するために、本明細書中に記載する任意の製剤中で、ならびに通常は
本明細書中の他の箇所に記載する方法及び組成物において、または本明細書中の他の箇所
に記載する方法及び組成物とともに使用することができる。ＤＭＴＤＳ ｉＲＮＡ剤は、
本明細書中に記載する他の修飾、例えば標的化剤を結合すること又は安定性を増強する修
飾を含めること、例えばヌクレアーゼ耐性モノマーを含めることもしくは自己会合して鎖
内二本鎖構造を形成する一本鎖突出部（例えば、３’ＡＳ突出部及び／又は３’Ｓ鎖突出
部）を含めること、を取り入れることができる。
好ましくは、これらのｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する構成様式を有する。
その他の実施形態
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、例えば細胞へ送達される外来ＤＮＡの鋳型から、ｉｎ
ｖｉｖｏで細胞において産生され得る。例えば、該ＤＮＡ鋳型をベクターに挿入して、遺
伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注
射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）により、あるいは定位注射（例えば、
チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
第９１巻：３０５４〜３０５７ページ、１９９４年を参照）により対象へ送達すること
ができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクタ
ーを含むこともできるし、あるいは遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放性マトリックス
を含むこともできる。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写ユニット（ｉＲＮＡ剤の鎖の上
部を包含する転写物を産生するもの、及びｉＲＮＡ剤の下部を包含する転写物を産生する
もの）を包含することができる。鋳型が転写されると、ｉＲＮＡ剤が産生され、プロセシ
ングを受けて遺伝子サイレンシングを仲介するｓＲＮＡ剤断片となる。
ｉｎ ｖｉｖｏ送達
ｉＲＮＡ剤は、対象（例えば、ヒトのような哺乳類）へｉＲＮＡ剤を効率的に送達する
ためのポリマーに結合、例えば非共有結合させることができる。ｉＲＮＡ剤は、例えばシ
クロデキストリンと複合体形成させることができる。シクロデキストリンは、治療用化合
物の送達ビヒクルとして使用されている。シクロデキストリンは、シクロデキストリンの
疎水性キャビティ内へ収まることが可能な薬物と包接複合体を形成することができる。他
の例では、シクロデキストリンは、オリゴヌクレオチド及びそれらの誘導体のような他の
生物学的に活性な分子と非共有結合を形成する。シクロデキストリンの使用により、水溶
性の薬物送達複合体が創出され、該複合体は標的指向性の基又は他の官能基で修飾するこ
とができる。米国特許第５，６９１，３１６号（これは、参照により本明細書に援用され
る）に記載されるオリゴヌクレオチド用のシクロデキストリン細胞送達系は、本発明の方
法における使用に適している。この系では、オリゴヌクレオチドはシクロデキストリンと
非共有結合的に複合体形成されるか、あるいはオリゴヌクレオチドがアダマンチンに共有
結合され、続いてアダマンチンがシクロデキストリンと非共有結合的に結合される。
送達分子には、線状シクロデキストリンコポリマー又は線状酸化シクロデキストリンコ
ポリマーであってシクロデキストリンコポリマーに少なくとも１つのリガンドが結合され
たものを挙げることができる。米国特許第６，５０９，３２３号（参照により本明細書に
援用される）に記載されるような送達系は、本発明における使用に適している。ｉＲＮＡ
剤は、線状シクロデキストリンコポリマー及び／又は線状酸化シクロデキストリンコポリ
マーに結合させることができる。シクロデキストリンコポリマー又は酸化シクロデキスト
リンコポリマーの一方又は両方を、別のポリマーに架橋させることもでき、かつ／又はリ
ガンドに結合させることもできる。
ｉＲＮＡ送達用組成物は、付加物の特徴的な構造を有する分子化合物である「包接複合
体」を使用することができる。この構造では、「ホスト分子」が、送達ビヒクル中の別の
化合物の少なくとも１部を空間的に封入する。封入される化合物（「ゲスト分子」）は、
ホスト分子のフレームワーク構造に影響を及ぼすことなくホスト分子のキャビティに配置
される。「ホスト」は、好ましくはデキストリンであるが、米国特許公報第２００３／０
００８８１８号（参照により本明細書に援用される）で提唱される任意の分子であり得る
。
シクロデキストリンは、各種のイオン及び分子と相互作用することができ、生じた包接
化合物は、「ホスト−ゲスト」複合体の種類に属する。ホスト−ゲストの関係内で、ホス
ト分子及びゲスト分子の結合部位は、立体電子的意味合いで相補的であるべきである。本
発明の組成物は、少なくとも１つのポリマー及び少なくとも１つの治療薬を、通常はポリ
マー及び治療薬（例えば、ｉＲＮＡ剤）の粒子状複合物の形態で含有することができる。
ｉＲＮＡ剤は、１つ又はそれ以上の複合化剤を含有することができる。粒子状複合物の少
なくとも１つのポリマーは、ホスト−ゲスト又はゲスト−ホスト相互作用で複合化剤と相
互作用して、ポリマーと複合化剤との間で包接複合体を形成することができる。より具体
的には、ポリマー及び複合化剤は、組成物に機能性を導入するのに使用することができる
。例えば、粒子状複合物の少なくとも１つのポリマーはホスト機能を有し、ゲスト機能を
有する複合化剤と包接複合体を形成する。別例として、粒子状複合物の少なくとも１つの
ポリマーはゲスト機能を有し、ホスト機能を有する複合化剤と包接複合体を形成する。粒
子状複合物のポリマーはまた、ホスト機能及びゲスト機能の両方を含有し、ゲストの複合
化剤及びホストの複合化剤と包接複合体を形成することもできる。機能性を有するポリマ
ーは、例えば細胞標的化及び／又は細胞との接触（例えば、神経細胞に対する標的化又は
神経細胞との接触）、細胞間輸送、ならびに細胞への流入及び細胞からの放出のうち少な
くともいずれか）を促進することができる。
粒子状複合物を形成する際、ｉＲＮＡ剤は、その生物学的又は治療的活性を維持しても
よいし、あるいは維持しなくてもよい。治療用組成物から、具体的には粒子状複合物のポ
リマーから放出されると、ｉＲＮＡ剤の活性は回復する。したがって、粒子状複合物は好
適には、例えば分解に起因する活性の損失からｉＲＮＡ剤を保護し、生物学的利用性を増
強する。したがって、組成物は、ｉＲＮＡ剤又は任意の活性な化学物質に安定性、特に貯
蔵中又は溶液中の安定性を提供するのに使用することができる。ｉＲＮＡ剤は、粒子状複
合物又は治療用組成物を形成する前又は後に、リガンドでさらに修飾されてもよい。リガ
ンドは、さらなる機能性を提供することができる。例えば、リガンドは、標的化部分であ
り得る。
生理学的影響
本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤は、治療上の毒性の決定が、該ｉＲＮＡ剤と、ヒト配
列および非ヒト動物配列の両方との相補性によってより容易になされるように設計するこ
とができる。これらの方法では、ＲＮＡ剤は、ヒト由来の核酸配列及び少なくとも１種類
の非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類（例えば、げっ歯類、反すう類又は霊長類）由来の核
酸配列に完全に相補的である配列から構成され得る。例えば、非ヒト哺乳類は、マウス、
ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ピグミーチンパンジー、ナミチンパン
ジー、アカゲザル又はカニクイザルであり得る。ｉＲＮＡ剤の配列は、非ヒト哺乳類及び
ヒトの相同遺伝子、例えば発がん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子内の配列に相補的であり得る
。非ヒト哺乳類におけるｉＲＮＡ剤の毒性を決定することにより、ヒトにおけるｉＲＮＡ
剤の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験のためには、ｉＲＮＡ剤を、ヒト
及び２種類以上（例えば２種類又は３種類又はそれ以上）の非ヒト動物に対して相補的と
することができる。
本明細書中に記載する方法は、ヒトに対するｉＲＮＡ剤の任意の生理学的作用、例えば
毒性作用のような任意の望ましくない作用、又は任意の好ましい作用、すなわち所望の作
用と相関させるのに使用することができる。
送達モジュール
ＲＮＡ、例えば本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤は、例えば、本明細書中に記載する薬
物送達複合体又はモジュールとともに使用することができる。さらに、本明細書中に記載
のｉＲＮＡ剤、例えば、パリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲ
ＮＡ剤、本明細書中に記載する遺伝子（例えば、ＳＮＣＡ遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ
剤、本発明に記載する化学修飾（例えば、分解に対する耐性を増強する修飾）を有するｉ
ＲＮＡ剤、本明細書中に記載する構成様式又は構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記
載するように投与されるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉＲ
ＮＡ剤は、そのような薬物送達複合体又はモジュールと組み合わされ、結合され、かつそ
のような薬物送達複合体又はモジュールにより送達されうる。
ｉＲＮＡ剤は、モジュラー複合体を特徴とする送達剤に複合体形成させることができる
。複合体は、（ａ）縮合剤（例えば、核酸を例えばイオン相互作用又は静電相互作用によ
り誘引（例えば、結合）することが可能な作用物質）、（ｂ）融合剤（例えば、細胞膜（
例えば、エンドソーム膜）と融合すること、及び／又は該膜を通過して輸送されることが
可能な作用物質）、及び（ｃ）標的化基、例えば、細胞又は組織を標的とする物質（例え
ば、脳内の神経細胞のような特定の細胞種に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質又は
タンパク質（例えば抗体）、のうち１つ又はそれ以上（好ましくは２つ又はそれ以上、よ
り好ましくは３つすべて）に連結させた担体物質を包含することができる。
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤は、モジュラー複
合体に連結（例えばカップリング又は結合）させることができる。ｉＲＮＡ剤は、複合体
の縮合剤と相互作用することができ、複合体は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉ
ｖｏで、ｉＲＮＡ剤を細胞へ送達するのに使用することができる。例えば、複合体は、ｉ
ＲＮＡ剤の送達を必要とする対象へｉＲＮＡ剤を送達するために、例えば障害（例えば、
神経変性疾患又は神経変性障害のような本明細書中に記載する障害）を有する対象へｉＲ
ＮＡ剤を送達するために使用することができる。
融合剤及び縮合剤は、異なる作用物質であってもよいし、又は１つの同じ作用物質であ
ってもよい。例えば、ポリアミノ鎖、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、融合剤及
び／又は縮合剤であり得る。
送達剤は、モジュラー複合体であり得る。例えば、複合体は、以下の：
（ａ）縮合剤（例えば、核酸を例えばイオン相互作用により誘引（例えば、結合）する
ことが可能な作用物質）、
（ｂ）融合剤（例えば、細胞膜（例えば、エンドソーム膜）と融合すること及び／又は
該膜を通過して輸送されることが可能な作用物質）、及び
（ｃ）標的化基、例えば、細胞又は組織を標的とする物質（例えば、脳内の神経細胞な
どの神経細胞のような特定の細胞種に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパ
ク質（例えば抗体）のうち１つ又はそれ以上（好ましくは２つ又はそれ以上の、より好ま
しくは３つすべて）に連結させた担体物質を包含することができる。標的化基は、甲状腺
刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタント
プロテインＡ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクト
サミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリ
アミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸
、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミン
Ｂ１２、ビオチン、ネプロキシン（Neproxin) 、又はＲＧＤペプチド若しくはＲＤＧペプ
チド擬似体であり得る。
担体物質
本明細書中に記載するモジュラー複合体の担体物質は、縮合剤、融合剤及び標的化基の
うち１つ又はそれ以上を結合するための基剤であり得る。担体物質は内因性の酵素活性を
欠いていることが好ましい。担体物質は好ましくは、生体分子、好ましくは高分子である
。高分子の生物学的担体が好ましい。担体分子は生分解性であることもまた好ましい。
担体物質は、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパ
ク質（ＬＤＬ）又はグロブリン）、糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キ
トサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）、又は脂質のような天然に存
在する物質であり得る。担体分子はまた、合成ポリマー（例えば、合成ポリアミノ酸）の
ような組換え分子又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（Ｐ
ＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物
コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マ
レイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマ
ー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）
、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリ
マー、又はポリホスファジン（polyphosphazine)が挙げられる。他の有用な担体分子は、
日常的な方法により同定することができる。
担体物質は、（ａ）サイズが少なくとも１Ｄａであること、（ｂ）少なくとも５個の荷
電基、好ましくは５〜５，０００個の荷電基を有すること、（ｃ）少なくとも１：１の担
体物質対融合剤の比で複合体中に存在すること、（ｄ）少なくとも１：１の担体物質対縮
合剤の比で複合体中に存在すること、（ｅ）少なくとも１：１の担体物質対標的化剤の比
で複合体中に存在すること、のうち１つ又はそれ以上を特徴とすることができる。
融合剤
本明細書中に記載するモジュラー複合体の融合剤は、ｐＨ環境に応答性である、例えば
ｐＨ環境に応じて電荷を変化させる作用物質であり得る。エンドソームのｐＨに遭遇する
と、融合剤は、物理的変化、例えばエンドソーム膜を崩壊するか、又はエンドソーム膜の
浸透性を増大する浸透圧特性の変化を引き起こすことができる。好ましくは、融合剤は、
生理学的範囲未満のｐＨで、電荷を変化させる（例えば、プロトン化されるようになる）
。例えば、融合剤は、ｐＨ４．５〜６．５でプロトン化されるようになり得る。融合剤は
、複合体が例えばエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれた後、細胞の細胞質へｉ
ＲＮＡ剤を放出するように作用することにより、細胞内のｉＲＮＡ剤の細胞内濃度を増大
させることができる。
一実施形態では、融合剤は、特定のｐＨ範囲に暴露されると、例えば電荷の変化（例え
ばプロトン化）を受ける構成部分（例えば、アミノ基）を有することができる。融合剤の
電荷の変化は、小胞、例えば細胞内小胞（例えば、エンドソーム）の変化（例えば、浸透
圧変化）を誘発することができる。例えば、融合剤は、エンドソームのｐＨ環境に暴露さ
れると、エンドソーム膜の多孔性を増大するのに（好ましくは、破裂させるのに）実質的
に十分な溶解性又は浸透圧変化を引き起こす。
融合剤は、ポリマー、好ましくはポリアミノ鎖（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ
））であり得る。ＰＥＩは、直鎖状でも、分岐状でも、合成でも天然でもよい。ＰＥＩは
、例えばアルキル置換されたＰＥＩでもよいし脂質置換されたＰＥＩでもよい。
他の実施形態では、融合剤は、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポ
リプロピレンイミン、メリチン又はポリアセタール物質（例えば、カチオン性ポリアセタ
ール）であり得る。幾つかの実施形態では、融合剤は、αらせん構造を有することができ
る。融合剤は、膜崩壊剤（例えばメリチン）であり得る。
融合剤は、１つ又はそれ以上の以下の特徴を有することができる：（ａ）サイズが少な
くとも１Ｄａであること、（ｂ）少なくとも１０個の荷電基、好ましくは１０〜５，００
０個の荷電基、より好ましくは５０〜１，０００個の荷電基を有すること、（ｃ）少なく
とも１：１の融合剤対担体物質の比で複合体中に存在すること、（ｄ）少なくとも１：１
の融合剤対縮合剤の比で複合体中に存在すること、（ｅ）少なくとも１：１の融合剤対標
的化剤の比で複合体中に存在すること。
他の適切な融合剤は、専門家により試験及び同定され得る。化合物の、ｐＨ環境に応答
する（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷を変化させる）能力は、日常的な方法により、例え
ば細胞アッセイにおいて試験することができる。例えば、試験化合物を細胞と組み合わせ
るか、又は細胞と接触させて、例えばエンドサイトーシスにより細胞に試験化合物を取り
込ませる。続いて、接触させた細胞からエンドソーム調製物を作製することができ、該エ
ンドソーム調製物を対照細胞由来のエンドソーム調製物と比較することができる。接触処
理した細胞由来のエンドソーム画分の対照細胞に対する変化（例えば、減少）は試験化合
物が融合剤として機能することができることを示す。あるいは、接触処理した細胞及び対
照細胞を、例えば顕微鏡法により（例えば、光学顕微鏡法又は電子顕微鏡法により）評価
して、細胞におけるエンドソーム集団の差を決定することができる。試験化合物を標識し
てもよい。別のタイプのアッセイでは、本明細書中に記載するモジュラー複合体は、１つ
又はそれ以上の試験融合剤又は推定融合剤を用いて構築される。モジュラー複合体は、ｉ
ＲＮＡの替わりに標識された核酸を用いて構築することもできる。２工程アッセイも実施
することができ、該アッセイでは、第１のアッセイが試験化合物単独のｐＨ環境に応答す
る（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷を変化させる）能力を評価し、第２のアッセイが、試
験化合物を含むモジュラー複合体のｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷
を変化させる）能力を評価する。
縮合剤
本明細書中に記載するモジュラー複合体の縮合剤は、ｉＲＮＡ剤と相互作用（例えば、
ｉＲＮＡ剤を誘引、保持又はｉＲＮＡ剤に結合）することができ、（ａ）ｉＲＮＡ剤を縮
合（例えば、ｉＲＮＡ剤のサイズ又は電荷を低減）させ、かつ／又は（ｂ）ｉＲＮＡ剤を
保護（例えば、分解に対してｉＲＮＡ剤を保護）するように作用することができる。縮合
剤は、例えばイオン性相互作用により、核酸（例えば、ｉＲＮＡ剤）と相互作用すること
ができる構成部分（例えば、荷電基）を包含することができる。縮合剤は好ましくは、荷
電ポリマー（例えば、ポリカチオン鎖）である。縮合剤は、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペ
ルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリ
アミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質
、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩又はαらせん状ペプチドであり得る。
縮合剤は、以下の特徴を有することができる：（ａ）サイズが少なくとも１Ｄａである
こと、（ｂ）少なくとも２個の荷電基、好ましくは２〜１００個の荷電基を有すること、
（ｃ）少なくとも１：１の縮合剤対担体物質の比で複合体中に存在すること、（ｄ）少な
くとも１：１の縮合剤対融合剤の比で複合体中に存在すること、（ｅ）少なくとも１：１
の縮合剤対標的化剤の比で複合体中に存在すること。
その他の適切な縮合剤は、専門家により、例えば、核酸（例えば、ｉＲＮＡ剤）と相互
作用する試験剤の能力を評価することにより、試験及び同定され得る。試験剤の、核酸（
例えば、ｉＲＮＡ剤）と相互作用する（例えば、ｉＲＮＡ剤を縮合又は保護する）能力は
、日常的な技法により評価することができる。１つのアッセイでは、試験剤を核酸と接触
させて、接触させた核酸のサイズ及び／又は電荷を、分子の質量及び／又は電荷の変化を
検出するのに適した技法により評価する。このような技法としては、非変性ゲル電気泳動
、免疫学的方法（例えば、免疫沈降）、ゲル濾過、イオン相互作用クロマトグラフィ等が
挙げられる。試験剤は、対照と比較して、接触させた核酸の質量及び／又は電荷（好まし
くは、両方）を変化させる場合に、縮合剤として同定される。２工程アッセイもまた実施
することができ、該２工程アッセイでは、第１のアッセイが試験化合物単独の核酸と相互
作用する（例えば、核酸に結合する（例えば、核酸の電荷及び／又は質量を縮合する））
能力を評価し、第２のアッセイが、試験化合物を含むモジュラー複合体の、核酸と相互作
用する（例えば、核酸に結合する（例えば、核酸の電荷及び／又は質量を縮合する））能
力を評価する。
両親媒性送達剤
ＲＮＡ、例えば本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する両親媒性送
達複合体又はモジュールとともに使用することができる。さらに、ｉＲＮＡ剤、例えば、
パリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記
載する遺伝子（例えば、ＳＮＣＡ遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載す
る化学修飾（例えば、分解に対する耐性を増強する修飾）を有するｉＲＮＡ剤、本明細書
中に記載する構成様式又は構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載するように投与さ
れるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤は、このよう
な両親媒性送達複合体と組み合わされ、結合され、かつこのような両親媒性送達複合体に
より送達されうる。
両親媒性分子は、疎水性領域及び親水性領域を有する分子である。このような分子は、
脂質（例えば、細胞の脂質二重層）と相互作用する（例えば、浸透又は破壊する）ことが
できる。したがって、両親媒性分子は、会合された（例えば、結合された）ｉＲＮＡ（例
えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）の送達剤として作用することができ
る。本明細書中に記載する組成物（例えば、本明細書中に記載する両親媒性ｉＲＮＡ構築
物）で使用されるべき好ましい両親媒性分子は、ポリマーである。該ポリマーは、二次構
造、例えば反復性の二次構造を有し得る。
両親媒性ポリマーの一例は、両親媒性ポリペプチド、例えばポリペプチドが親水面及び
疎水面を有するような二次構造を有するポリペプチドである。両親媒性ペプチド構造（例
えば、αらせん状ポリペプチド）の設計は、当業者には日常的である。例えば、以下の参
照文献にガイダンスが提供されている：グレルら（Ｇｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）（２００
１年）、Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ 第７（３）巻：１４６〜５１ページ；チェンら（Ｃｈｅ
ｎ ｅｔ ａｌ．）（２００２年）、Ｊ Ｐｅｐｔ Ｒｅｓ 第５９（１）巻：１８〜３
３ページ；イワタら（Ｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．）（１９９４年）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ
ｅｍ 第２６９（７）巻：４９２８〜３３ページ；コーナットら（Ｃｏｒｎｕｔ ｅｔ
ａｌ．）（１９９４年）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ 第３４９（１）巻：２９〜３３ページ；
ネグレートら（Ｎｅｇｒｅｔｅ ｅｔ ａｌ．）（１９９８年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃ
ｉ 第７（６）巻：１３６８〜７９ページ。
両親媒性ポリマーの別の例は、２つ又はそれ以上の両親媒性サブユニット、例えば環状
部分（例えば、１つ又はそれ以上の親水性基及び１つ又はそれ以上の疎水性基を有する環
状部分）を含有する２つ又はそれ以上のサブユニットから構成されるポリマーである。例
えば、サブユニットは、ステロイド（例えばコール酸）又は芳香族部分を含有してもよい
。このような構成部分は、それらがポリマー構造中にある場合、対向する親水面及び疎水
面を形成することができるように、アトロプ異性を示すことができることが好ましい。
推定上の両親媒性分子の、脂質膜（例えば、細胞膜）と相互作用する能力は、日常的な
方法により、例えば無細胞アッセイ又は細胞アッセイにおいて試験することができる。例
えば、試験化合物を、合成脂質二重層、細胞膜分画又は細胞と組み合わせるか、あるいは
接触させて、試験化合物が、脂質二重層、細胞膜又は細胞と相互作用し、細胞膜又は細胞
に浸透し、あるいは細胞膜又は細胞を破壊するその能力に関して評価する。試験化合物を
、脂質二重層、細胞膜又は細胞との相互作用を検出するために標識することもできる。別
のタイプのアッセイでは、試験化合物をレポーター分子又はｉＲＮＡ剤（例えば、本明細
書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）に連結させて、レポーター分子又はｉＲＮＡ剤が
脂質二重層、細胞膜又は細胞に浸透する能力を評価する。２工程アッセイもまた実施する
ことができ、該２工程アッセイでは、第１のアッセイが、試験化合物単独の、脂質二重層
、細胞膜又は細胞と相互作用する能力を評価し、第２のアッセイが、試験化合物及びレポ
ーター又はｉＲＮＡ剤を含む構築物（例えば、本明細書中に記載する構築物）の、脂質二
重層、細胞膜又は細胞と相互作用する能力を評価する。
本明細書中に記載する組成物において有用な両親媒性ポリマーは、少なくとも２個、好
ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、２５個、５０個、１００個
、２００個、５００個、１，０００個、２，０００個、５０，０００個又はそれ以上のサ
ブユニット（例えば、アミノ酸又は環状サブユニット）を有する。１つの両親媒性ポリマ
ーを、１つ又はそれ以上、例えば２個、３個、５個、１０個又はそれ以上のｉＲＮＡ剤（
例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ剤）に連結させることができる。幾
つかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、アミノ酸及び環状サブユニット（例えば、芳
香族サブユニット）の両方を含有することができる。
本発明は、両親媒性分子と関係付けられたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載する
ｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）を包含する組成物を特徴とする。このような組成物は、本明細書
中では「両親媒性ｉＲＮＡ構築物」とも呼ばれる。このような組成物及び構築物は、ｉＲ
ＮＡ剤の送達又は標的化、例えばｉＲＮＡ剤を細胞へ送達又は標的化するのに有用である
。理論により拘束されることを望まないが、このような組成物及び構築物は、例えばｉＲ
ＮＡ剤の細胞への進入が可能となるように、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）の多孔性
を増大させる（例えば、浸透又は崩壊させる）ことができる。
一態様では、本発明は、両親媒性分子に連結されたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に
記載するｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤）を含む組成物に関する。ｉＲＮＡ剤及び両親媒性分
子は、共有結合又は非共有結合のいずれかにより、互いに持続的に接触した状態に保持さ
れていてもよい。
該組成物又は構築物の両親媒性分子は、リン脂質以外、例えばミセル、膜又は膜断片以
外であることが好ましい。
組成物又は構築物の両親媒性分子は、好ましくはポリマーである。該ポリマーは、２つ
又はそれ以上の両親媒性サブユニットを含んでもよい。１つ又はそれ以上の親水性基及び
１つ又はそれ以上の疎水性基がポリマー上に存在してもよい。ポリマーは、反復性の二次
構造ならびに第１の面及び第２の面を有してもよい。反復性の二次構造に沿った親水性基
及び疎水性基の分布は、ポリマーの一方の面が親水面であり、かつポリマーの他方の面が
疎水面であるような分布であり得る。
両親媒性分子は、ポリペプチド、例えばその二次構造としてα−らせん構造を含むポリ
ペプチドであり得る。
一実施形態では、両親媒性ポリマーは、１つ又はそれ以上の環状部分（例えば、１つ又
はそれ以上の親水性基及び／又は１つ又はそれ以上の疎水性基を有する環状部分）を含有
する１つ又はそれ以上のサブユニットを包含する。一実施形態では、ポリマーは、環状部
分が交互に疎水性基及び親水性基を有するように環状部分を有するポリマーである。例え
ば、サブユニットは、ステロイド（例えば、コール酸）を含有してもよい。別の例では、
サブユニットは、芳香族部分を含有してもよい。芳香族部分は、アトロプ異性を示すこと
ができるもの、例えば２，２’−ビス（置換）−１，１’−ビナフチル又は２，２’−ビ
ス（置換）ビフェニルであり得る。サブユニットは、式（Ｍ）：
を有する芳香族部分を含んでもよい。
本発明は、両親媒性分子と関連付けられたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載する
ｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）を包含する組成物を特徴とする。このような組成物は、本明細書
中では「両親媒性ｉＲＮＡ構築物」と称し得る。このような組成物及び構築物は、ｉＲＮ
Ａ剤の送達又は標的化、例えば細胞へのｉＲＮＡ剤の送達又は標的化において有用である
。理論により拘束されることを望まないが、このような組成物及び構築物は、例えばｉＲ
ＮＡ剤の細胞への進入が可能となるように、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）の多孔性
を増大させる（例えば浸透又は破壊する）ことができる。
式Ｍに関して、Ｒ１は、任意選択でアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ又
はハロで置換されるか、かつ／又は任意選択でＯ、Ｓ、アルケニル又はアルキニルが挿入
されるＣ１〜Ｃ１００アルキル、Ｃ１〜Ｃ１００ペルフルオロアルキル、又はＯＲ５であ
る。
Ｒ２は、ヒドロキシ、ニトロ、サルフェート、リン酸、リン酸エステル、スルホン酸、
ＯＲ６、又は任意選択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニル若しくはアル
キルスルフィニル、アリールスルホニル若しくはアルキルスルホニル、サルフェート、ス
ルホン酸、リン酸、リン酸エステル、置換若しくは非置換アリール、カルボキシル、カル
ボン酸、アミノカルボニル又はアルコキシカルボニルで置換されるか、かつ／又は任意選
択でＯ、ＮＨ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ
１００アルキルである。
Ｒ３は、水素であるか、又はＲ４と一体となって融合フェニル環を形成する。
Ｒ４は、水素であるか、又はＲ３と一体となって融合フェニル環を形成する。
Ｒ５は、任意選択でアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ又はハロで置換さ
れるか、かつ／又は任意選択でＯ、Ｓ、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ
１００アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ１００ペルフルオロアルキルであり、Ｒ６は、任意選
択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニル若しくはアルキルスルフィニル、
アリールスルホニル若しくはアルキルスルホニル、サルフェート、スルホン酸、リン酸、
リン酸エステル、置換若しくは非置換アリール、カルボキシル、カルボン酸、アミノカル
ボニル又はアルコキシカルボニルで置換されるか、かつ／又は任意選択でＯ、ＮＨ、Ｓ、
Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ１００アルキルであ
る。
ｄｓＲＮＡの細胞取り込みの増大
本発明の方法は、ｉＲＮＡ剤、ならびにｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みに影響を及ぼす
薬物の投与を包含し得る。該薬物は、ｉＲＮＡ剤が投与される前に、ｉＲＮＡ剤が投与さ
れた後に、あるいはｉＲＮＡ剤が投与されると同時に投与され得る。薬物はｉＲＮＡ剤と
共有結合され得る。薬物は、細胞に対する一過性の影響を有し得る。
薬物は、例えば細胞の細胞骨格を崩壊させることにより、例えば細胞の微小管、ミクロ
フィラメント及び／又は中間フィラメントを崩壊させることにより、ｉＲＮＡ剤の細胞へ
の取り込みを増大させることができる。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビ
ンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノライド（japlakinolide ）
、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライド(swinholide)Ａ、インダノシン（
indanocine）又はミオセルビン（myoservin）であり得る。
ｉＲＮＡ複合体
ｉＲＮＡ剤は、第２の作用物質にカップリング（例えば、共有結合）させることができ
る。例えば、特定の障害を治療するのに使用されるｉＲＮＡ剤は、第２の治療薬、例えば
ｉＲＮＡ剤以外の作用物質にカップリングさせることができる。第２の治療薬は、同じ障
害の治療を対象とするものであり得る。例えば、α‐シヌクレインの蓄積を特徴とする障
害（例えば、ＰＤ）を治療するのに使用されるｉＲＮＡの場合では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＤ
の治療に有用な第２の作用物質にカップリングさせることができる。
ｉＲＮＡの生産
ｉＲＮＡは、例えば大量に、各種方法により生産することができる。例示的な方法とし
ては、有機合成及びＲＮＡ切断（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断）が挙げられる。
有機合成
ｉＲＮＡは、二本鎖のＲＮＡ分子の各々の鎖を別個に合成することにより作製すること
ができる。次に、構成成分の鎖をアニーリングさせることができる。
大きなバイオリアクター（例えば、ファルマシア バイオテックＡＢ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃ ＡＢ）（スウェーデンウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）所在）のＯｌｉ
ｇｏＰｉｌｏｔ（商標）ＩＩ）を用いて、所定のｉＲＮＡ用の特定のＲＮＡ鎖を大量に生
産することができる。ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔＩＩリアクターは、１．５Ｍ過剰のホスホロ
アミダイトヌクレオチドのみを使用して、効率的にヌクレオチドをカップリングすること
ができる。ＲＮＡ鎖を作製するためには、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。標
準的なモノマー添加サイクルを使用して、ｉＲＮＡ用の２１〜２３ヌクレオチド鎖を合成
することができる。通常、２つの相補的な鎖を別個に生産した後、例えば固体支持体から
の放出及び脱保護の後にアニーリングさせる。（アルナイラムへの関連はあるか）。
有機合成を使用して、別個のｉＲＮＡ種を生産することができる。特定の標的遺伝子に
対する該ｉＲＮＡ種の相補性を、正確に指定することができる。例えば、該ｉＲＮＡ種は
、多型、例えば一塩基多型を含む領域に相補的であり得る。さらに、多型の位置は、正確
に規定され得る。幾つかの実施形態では、多型は、内部領域、例えば末端の一方又は両方
から少なくとも４、５、７又は９ヌクレオチドの位置にある。
ｄｓＲＮＡ切断
ｉＲＮＡはまた、より大きなｄｓ ｉＲＮＡを切断することにより作製することができ
る。切断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実現され得る。例えば、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでの切断によりｉＲＮＡを生産するために、以下の方法を使用することができる：
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写。 ｄｓＲＮＡは、両方向に核酸（ＤＮＡ）セグメントを転写す
ることにより生産される。例えば、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）ＲＮＡｉ転写キット（ニュ
ー イングランド バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））は、ベ
クターと、両側にＴ７プロモーターが隣接する位置で該ベクターにクローニングされた核
酸セグメントに関してｄｓＲＮＡを生産する方法とを提供する。別個の鋳型が、ｄｓＲＮ
Ａ用の２つの相補鎖のＴ７転写用に生成される。該鋳型は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの添
加によりｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され、ｄｓＲＮＡが生産される。ＰＣＲ及び／又は他の
ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３ポリメラーゼ又はＳＰ６ポリメラーゼ）を用いた同様
の方法もまた使用することができる。一実施形態では、この方法により生成されるＲＮＡ
は、組換え酵素の調製物に混入し得るエンドトキシンを除去するように慎重に精製される
。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断。 ｄｓＲＮＡは、例えばＤｉｃｅｒ又は匹敵するＲＮＡアーゼ
ＩＩＩベースの活性を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで切断されてｉＲＮＡとなる。例えば、
ｄｓＲＮＡは、ショウジョウバエ由来のｉｎ ｖｉｔｒｏ抽出物中で、あるいは精製され
た成分（例えば、精製ＲＮＡアーゼ又はＲＩＳＣ複合体（ＲＮＡ誘導性サイレンシング複
合体））を用いてインキュベートすることができる。例えば、ケッテイングら（Ｋｅｔｔ
ｉｎｇ ｅｔ ａｌ．） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００１年１０月１５日、第１５（２０
）巻：２６５４〜９ページ及びハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１
年８月１０日；第２９３（５５３２）巻：１１４６〜５０ページを参照されたい。
ｄｓＲＮＡの切断により、概して複数のｉＲＮＡ種が生産され、それぞれがもとのｄｓ
ＲＮＡ分子の特定の２１〜２３ｎｔフラグメントである。例えば、もとのｄｓＲＮＡ分子
のオーバーラッピング領域及び隣接領域に相補的な配列を含むｉＲＮＡが存在し得る。
合成方法にかかわらず、ｉＲＮＡ調製物は、製剤化に適した溶液（例えば、水溶液及び
／又は有機溶液）中で調製することができる。例えば、ｉＲＮＡ調製物は、純粋な二重に
蒸留した蒸留水中で沈殿及び再溶解され、凍結乾燥され得る。続いて、乾燥させたｉＲＮ
Ａは、意図される製剤化プロセスに適した溶液中に再懸濁させることができる。
修飾ｉＲＮＡ剤及びヌクレオチド代用物のｉＲＮＡ剤の合成は後述する。
製剤化
本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤は、対象への投与用に製剤化することができる。
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ
剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のｉＲＮＡ剤
、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつそのような実施は本発明の範囲内に
あることが理解されるべきである。
製剤化されたｉＲＮＡ組成物は、様々な状態であると仮定することができる。幾つかの
例では、組成物は、少なくとも部分的に結晶性、一様に結晶性、かつ／又は無水（例えば
、水分が８０％未満、５０％未満、３０％未満、２０％未満又は１０％未満）である。別
の例では、ｉＲＮＡは、水相中に、例えば水を含む溶液中に存在する。
水相組成物又は結晶性組成物は、例えば送達ビヒクル、例えばリポソーム（特に水相に
関して）又は粒子（例えば、結晶性組成物に関して適切であり得るような微粒子）に組み
込むことができる。概して、ｉＲＮＡ組成物は、意図される投与方法と適合性の様式で製
剤化される。
特定の実施形態では、組成物は、以下の方法：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、
流動床乾燥（fluidbed drying）又はこれらの技法の組合せ、あるいは液体を用いた超音
波処理、フリーズドライ、凝縮及び他の自己集合、の少なくとも１つにより調製される。
ｉＲＮＡ調製物は、別の作用物質、例えば別の治療薬又はｉＲＮＡを安定化する作用物
質（例えば、ｉＲＮＡと複合体形成してｉＲＮＰを形成するためのタンパク質）と組み合
わせて製剤化することができる。さらに別の作用物質としては、例えばＥＤＴＡなどのキ
レート化剤（例えば、Ｍｇ２＋のような二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡアー
ゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎのような広域特異性のＲＮＡアーゼ阻害剤）等が挙げら
れる。
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、別のｉＲＮＡ剤、例えば第２の遺伝子または同じ
遺伝子に関してＲＮＡｉを仲介することができる第２のｉＲＮＡを包含する。さらに別の
調製物は、少なくとも３個、５個、１０個、２０個、５０個若しくは１００個又はそれ以
上の異なるｉＲＮＡ種を包含することができる。このようなｉＲＮＡは、同様の数の異な
る遺伝子に関してＲＮＡｉを仲介することができる。
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、少なくとも第２の治療薬（例えば、ＲＮＡ又はＤ
ＮＡ以外の作用物質）を包含する。例えば、神経変性疾患（例えば、ＰＤ）の治療用のｉ
ＲＮＡ組成物は、既知のＰＤ治療剤（例えば、レバドーパ（levadopa）又はデプロニル（
depronil））を含んでもよい。
標的化
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮ
Ａ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮ
Ａ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内に
あることが理解されるべきである。
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例
えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるい
は、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆
体をコードするＤＮＡ）は、特定の細胞を標的とする。例えば、ｉＲＮＡを包含するリポ
ソームもしくは粒子または他の構造は、標的細胞上の特定の分子を認識する標的化部分を
包含することもできる。標的化部分は、標的細胞に関して特異的な親和性を有する分子で
あり得る。標的化部分には、標的細胞の表面上に見られるタンパク質に対する抗体、ある
いは標的細胞の表面上に見られる分子に関するリガンドまたはリガンドの受容体結合部分
を挙げることができる。
ｉＲＮＡを脳内の神経細胞に対して標的化するために抗原を使用することも可能である
。
一実施形態では、標的化部分はリポソームに結合される。例えば、米国特許第６，２４
５，４２７号は、タンパク質またはペプチドを用いてリポソームを標的化する方法につい
て記載している。別の例では、リポソームのカチオン性脂質成分が、標的化部分で誘導体
化される。例えば、国際公開公報第９６／３７１９４号は、Ｎ−グルタリルジオレオイル
ホスファチジルエタノールアミンをＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルに変換す
ることについて記載している。該生成物は続いてＲＧＤペプチドにカップリングされた。
抗体
本明細書に記載される組成物は、例えば、シヌクレインの活性を妨害するため、および
／またはシヌクレインの凝集を阻害するために、シヌクレインポリペプチドを標的とする
抗体を含み得る。抗体は、抗体またはそのフラグメント、例えば、抗体の抗原結合部分で
あってよい。本明細書において使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも１つ、お
よび好ましくは２つの重鎖（Ｈ鎖）可変領域（本明細書ではＶＨという略号を使用する）
、ならびに少なくとも１つ、および好ましくは２つの軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（本明細書で
はＶＬという略号を使用する）を含むタンパク質をいう。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、「
相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変領域にさらに分割可能であり、超可変
領域にはより保存性の高い「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在してい
る。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に決定されている（カバトら（Ｋａｂ
ａｔ ｅｔ ａｌ．）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、米国保健社会福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、
ＮＩＨ出版第９１−３２４２号、１９９１年、およびショチアら（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ
ａｌ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１９６巻、９０１〜９１７ページ、１９８７年を
参照のこと、これらは本願明細書に援用する）。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび
４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって次の順番：ＦＲ１
、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配列されている。
抗体はさらに重鎖および軽鎖の定常領域を含んでいてもよく、それによってそれぞれ重
鎖および軽鎖の免疫グロブリン鎖を形成し得る。１つの実施形態において、抗体は、２つ
の免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖のテトラマーであり、ここで、免
疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖は、例えばジスルフィド結合によって、鎖間
で結合されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３か
ら構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。重鎖および軽鎖
の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、一般に宿主
の組織または因子、例えば、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古
典的な補体系の最初の成分（Ｃ１ｑ）などに対する抗体の結合を仲介する。
用語、抗体の「抗原結合フラグメント」（または単に「抗体部分」または「フラグメン
ト」）とは、本明細書で使用される場合、抗原（例えば、ＳＮＣＡ核酸によってコードさ
れるポリペプチド）に特異的に結合する能力を保持している、抗体全長のうちの１つまた
は複数のフラグメントをいう。用語、抗体の「抗原結合フラグメント」に含まれる結合フ
ラグメントの例には：（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１
ドメインからなる１価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域にお
いてジスルフィド結合で連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントで
あるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからな
るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインから
なるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインで構成されるｄＡｂフラグメント（ワードら
（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ 第３４１巻、５４４〜５４６ページ、１９
８９年）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、
Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の核酸によってコードされ
ているが、組換え技法を使用して、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対となり１価の分子を形成
する単一のタンパク質鎖として作製されうるような合成リンカーによって連結されてもよ
い（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、バードら（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．
）、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２４２巻、４２３〜４２６ページ、１９８８年、およびヒュース
トンら（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ 第８５巻、５８７９〜５８８３ページ、１９８８年を参照のこと）。このような単鎖
抗体もまた、用語、抗体の「抗原結合フラグメント」の中に含まれることが意図される。
これらの抗体フラグメントは、当業者に公知である従来の技術を使用して入手され、該フ
ラグメントは、完全な抗体と同様にして有用性についてスクリーニングされる。用語「モ
ノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用される場合
、特定のエピトープと免疫反応しうる抗原結合部位を１種類だけ含む抗体分子の集団をい
う。したがって、モノクローナル抗体組成物は、一般には、免疫反応する相手の特定のタ
ンパク質について単一の結合親和性を示す。
抗−タンパク質／抗−ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的なプロトコ
ールを使用して本明細書に記載されるように作製可能である（例えば「Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレ
ーン（Ｌａｎｅ）編、コールドスプリングハーバー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８８年を参照のこと）。
本明細書に記載されるタンパク質、例えば、α−シヌクレインポリペプチドを免疫原と
して使用して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技
術を使用して、該成分に結合する抗体を作製することが可能である。完全長の成分タンパ
ク質を使用してもよいし、または代替として該成分の抗原性ペプチドフラグメントを免疫
原として使用してもよい。
典型的には、ペプチドを使用して、適切な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、また
は他の哺乳動物）を該免疫原で免疫することによって、抗体を調製する。適切な免疫原性
調製物は、例えば、組換え型の本明細書に記載されるタンパク質、例えば、α−シヌクレ
インポリペプチドを含み得る。例えば、米国特許第５，４６０，９５９号；ならびに同時
係属の米国特許出願第０８／３３４，７９７号；同第０８／２３１，４３９号；同第０８
／３３４，４５５号；および同第０８／９２８，８８１号（これらはその全体を明確に本
明細書に援用する）を参照のこと。α−シヌクレインのヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列は公知である。この調製物はさらに、フロイントの完全アジュバントもしくは不完全
アジュバントなどのアジュバント、または同様の免疫刺激剤をさらに含み得る。本明細書
に記載の免疫原性タンパク質（例えば、α−シヌクレインポリペプチド）またはフラグメ
ントの調製物を用いて適切な対象を免疫することにより、ポリクローナル抗体応答が誘導
される。
さらに、遺伝子操作方法によって作製された抗体、例えば、標準的な組換えＤＮＡ技術
を使用して作製可能な、ヒト部分と非ヒト部分の両方を含んでなるキメラモノクローナル
抗体およびヒト化モノクローナル抗体などを使用可能である。このようなキメラモノクロ
ーナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野において公知の標準的なＤＮＡ
操作方法を用いる遺伝子操作により作製可能である。使用されうる方法は、例えば、ロビ
ンソンら（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２
２６９号；アキラら（Ａｋｉｒａ ｅｔ ａｌ．）、欧州特許出願第１８４，１８７号；
タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ），Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号；モリソンら
（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、欧州特許出願第１７３，４９４号；ノイバーガー
ら（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第８６／０１５３３号；キャビ
リーら（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第４，８１６，５６７号；キャビリ
ーら（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．）、欧州特許出願第１２５，０２３号；ベターら（
Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２４０巻、１０４１〜１０４３ペー
ジ、１９８８年；リューら（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ 第８４巻、３４３９〜
３４４３ページ、１９８７年；リューら（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．第１３９巻、３５２１〜３５２６ページ、１９８７年；サンら（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．
）、ＰＮＡＳ 第８４巻、２１４〜２１８ページ、１９８７年；ニシムラら（Ｎｉｓｈｉ
ｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．第４７巻、９９９〜１００５ページ、１
９８７年；ウッドら（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ 第３１４巻、４４６〜
４４９ページ、１９８５年；およびショーら（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｎａｔｌ
． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．第８０巻、１５５３〜１５５９ページ、１９８８年）；モ
リソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ），Ｓ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２２９巻、１２０２〜１２
０７ページ、１９８５年；オイら（Ｏｉ ｅｔ ａｌ．）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
第４巻、２１４ページ、１９８６年；ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）米国特許第５，２２
５，５３９号；ジョーンズら（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ 第３２１巻
、５５２〜５２５ページ、１９８６年；バーホーエンら（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａ
ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２３９巻、１５３４ページ、１９８８年；およびバイドラー
ーら（Ｂｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４１巻、４０５３〜
４０６０ページ、１９８８年に記載されている。
さらに、本明細書に記載のタンパク質、例えば、α−シヌクレインタンパク質に対する
ヒトモノクローナル抗体を、標準的な技術を使用して作製可能である。例えば、ヒトモノ
クローナル抗体は、トランスジェニックマウス、または抗体を産生するヒト細胞を移植し
た免疫不全マウスにおいて生産可能である。このようなマウスを生成する方法は、例えば
、以下の文献に記載されている：ウッドら（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第
９１／００９０６号；クチャラパチら（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．）、国
際公開公報第９１／１０７４１号；ロンバーグら（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．）、国
際公開公報第９２／０３９１８；ケイら（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９２
／０３９１７号；ケイら（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９３／１２２２７号
；ケイら（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９４／２５５８５；ラジュースキー
ら（Ｒａｊｅｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９４／０４６６７号；ジチュー
リオら（Ｄｉｔｕｌｌｉｏ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９５／１７０８５号；ロン
バーグら（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ 第３６８巻、８５６〜８５
９ページ、１９９４年；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅ
ｎｅｔ．第７巻、１３〜２１ページ、１９９４年；モリソンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８１巻、６８５１〜６
８５５ページ、１９９４年；ブラグマンら（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｙｅ
ａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ 第７巻、３３〜４０ページ、１９９３年；チョイら（Ｃｈｏｉ
ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．第４巻、１１７〜１２３ページ、１９９３
年；ツアリオンら（Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ 第９０巻、３７２０
〜３７２４ページ、１９９３年；ブラグマンら（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．）、
Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ 第２１巻、１３２３〜１３２６ページ、１９９１年；ジュ
コサールら（Ｄｕｃｈｏｓａｌ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９３／０５７９６号；
米国特許第５，４１１，７４９号；マックーンら（ＭｃＣｕｎｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ 第２４１巻、１６３２〜１６３９ページ、１９８８年；カメル−レイドら（
Ｋａｍｅｌ− Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２４２巻、１７０６ペー
ジ、１９８８年；スパノポロウ（Ｓｐａｎｏｐｏｕｌｏｕ）、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ 第８巻、１０３０〜１０４２ページ、１９９４年；およびシンカイら（
Ｓｈｉｎｋａｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｅｌｌ 第６８巻、８５５〜８６８ページ、１９９
２年。ヒト抗体トランスジェニックマウス、またはヒト抗体を産生する細胞もしくは組織
を移植した免疫不全マウスを、本明細書に記載のタンパク質、例えば、α−シヌクレイン
タンパク質、またはその抗原性ペプチドで免疫し、次いで、これらの免疫マウス由来の脾
細胞を、ハイブリドーマ作製のために使用することができる。ハイブリドーマの作製方法
は周知である。
本明細書に記載のタンパク質（例えば、α−シヌクレインタンパク質）に対するヒトモ
ノクローナル抗体はまた、対象のリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製された免疫グロブ
リンの軽鎖および重鎖のｃＤＮＡを使用して、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブ
ラリー、例えば、ＦａｂファージディスプレイライブラリーまたはｓｃＦｖファージディ
スプレイライブラリーなどを構築することによって調製可能である。例えば、マッカファ
ーティーら（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９２／０１０４７
号；マークスら（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２２２巻、５
８１〜５９７ページ、１９９１年；およびグリフィスズら（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ
ａｌ．）、ＥＭＢＯ Ｊ 第１２巻、７２５〜７３４ページ、１９９３年を参照のこと。
さらに、既知のヒト抗体を変異させることによって抗体可変領域のコンビナトリアルライ
ブラリーを作製可能である。例えば、本明細書に記載されるタンパク質に結合することが
知られているヒト抗体の可変領域を、例えば、ランダムに変化するように変異誘発させた
オリゴヌクレオチドを使用することによって変異させ、変異を有する可変領域のライブラ
リーを作製することが可能であり、次いで該ライブラリーを、本明細書に記載のタンパク
質（例えば、α−シヌクレイン）への結合についてスクリーニングすることができる。免
疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ領域中でランダムな変異誘発を誘導する
方法、ランダムに変異させた重鎖および軽鎖を相互に組み合わせて対を形成させる方法、
ならびにスクリーニング方法は、例えば、バーバスら（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．）、
国際公開公報第９６／０７７５４号；およびバーバスら（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．）
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８９巻、４４５７〜４４６１ペ
ージ、１９９２年において見出され得る。
免疫グロブリンライブラリーは、抗体ディスプレイライブラリーを形成するために、好
ましくは繊維状ファージ由来のディスプレイパッケージの集団によって発現させることが
可能である。抗体ディスプレイライブラリーを作製する際に特に使用しやすい方法および
試薬の例は、例えば、ラドナーら（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）の米国特許第５，２２
３，４０９号；カンら（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９２／１８６１９号
；ダウアーら（Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９１／１７２７１号；ウィ
ンターら（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９２／２０７９１号；マーク
ランドら（Ｍａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９２／１５６７９号；ブ
ライトリングら（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９３／０１２８
８号；マックファーティーら（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第
９２／０１０４７号；ギャラードら（Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第
９２／０９６９０号；ラドナーら（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、国際公開公報第９０
／０２８０９号；フッチスら（Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ 第９巻、１３７０〜１３７２ページ、１９９１年；ヘイら（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．
）、Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ 第３巻、８１〜８５ページ、１９
９２年；フセら（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２４６巻、１２７５〜
１２８１ページ、１９８９年；グリフィスズら（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．）、
１９９３年、前出；ホーキンスら（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ 第２２６巻、８８９〜８９６ページ、１９９２年；クラックソンら（Ｃｌａｃｋｓ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ 第３５２巻、６２４〜６２８ページ、１９９１年
；グラムら（Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ 第８９巻、３５７６〜３５８０ペー
ジ、１９９２年；ギャラードら（Ｇａｒｒａｄ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ 第９巻、１３７３〜１３７７ページ、１９９１年；フーゲンブームら（Ｈｏｏ
ｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ 第１９巻、４１３３〜４
１３７ページ、１９９１年；およびバーバスら（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡ
Ｓ 第８８巻、７９７８〜７９８２ページ、１９９１年において見出され得る。ディスプ
レイパッケージ（例えば、繊維状ファージ）の表面に提示（ディスプレイ）させた上で、
該抗体ライブラリーを、本明細書に記載のタンパク質、例えば、α−シヌクレインポリペ
プチドに結合する抗体を発現するパッケージを同定および単離するためにスクリーニング
する。好ましい実施形態では、ライブラリーの一次スクリーニングでは、本明細書に記載
の固定化タンパク質を用いるパニングが実施され、本明細書に記載の固定化タンパク質に
結合する抗体を発現しているディスプレイパッケージが選択される。
アンチセンス核酸配列
本明細書に記載のタンパク質、例えば、α−シヌクレインポリペプチドをコードするヌ
クレオチドに対してアンチセンスである核酸分子は、該タンパク質の発現を阻害する薬剤
として使用することも可能である。「アンチセンス」核酸は、該成分をコードする「セン
ス」核酸に対して相補的である、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的である
か、またはｍＲＮＡ配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、ア
ンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合を形成可能である。アンチセンス核酸は、コー
ド鎖または非コード鎖の一部分に対して相補的であってもよい。
α−シヌクレインタンパク質をコードするコード鎖の配列は公知である。コード鎖の配
列（例えば、ｃＤＮＡ分子のセンス鎖の配列）が与えられると、ワトソン−クリック塩基
対合の規則に従ってアンチセンス核酸を設計することができる。アンチセンス核酸分子は
、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部分に対して相補的であってもよい。例
えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺の領域（例えば
、５’ＵＴＲ）に対して相補的であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例
えば、長さが約１０〜２５ヌクレオチド（例えば、長さが１１、１２、１３、１４、１５
、１６、１８、１９、２０、または２４ヌクレオチド）であり得る。
アンチセンス核酸は、当該分野において公知の手順を使用する、化学合成および酵素に
よるライゲーションを使用して構築可能である。例えば、アンチセンス核酸（例えば、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または、該分子の生
物学的安定性を高めるために、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成され
る二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された様々な修飾を有するヌクレオチドを使
用して、化学的に合成可能であり、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン
置換ヌクレオチドを使用可能である。アンチセンス核酸を作製するために使用可能な修飾
ヌクレオチドの例には：２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、５−フルオロウラシル、５−
ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチ
ン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カル
ボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラ
シル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペン
テニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン
、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン
、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキ
シアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカ
ルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニ
ルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、
クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４
−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラ
シル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−
Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリ
ンが含まれる。代替的には、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクロー
ニングされている発現ベクターを使用して生物学的に生産可能である（すなわち、挿入さ
れた核酸から転写されるＲＮＡは、対象とする標的核酸に対してアンチセンス方向となる
）。
アンチセンス剤は、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ（例えば、
オリゴデオキシヌクレオチド）、またはデオキシリボヌクレオチド配列とリボヌクレオチ
ド配列の両方を含み得る。例えば、リボヌクレオチドのみからなるアンチセンス剤は、相
補的なＲＮＡ（例えば、α−シヌクレインＲＮＡ）にハイブリダイズし、この標的ＲＮＡ
転写物に対する翻訳装置の接近を妨害することによって、タンパク質合成を妨害すること
ができる。デオキシリボヌクレオチドのみを含むアンチセンス分子、またはデオキシリボ
ヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含むアンチセンス分子（例えば、５’末端および
３’末端にＲＮＡ配列が隣接しているＤＮＡ配列のアンチセンス剤）は、相補的ＲＮＡに
ハイブリダイズ可能であり、続いて該標的ＲＮＡは酵素（例えば、ＲＮＡｓｅＨ）によっ
て切断されうる。該標的ＲＮＡの分解により翻訳が阻止される。この隣接ＲＮＡ配列は２
’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、およびホスホロチオエート結合を含んでもよく、内側の
ＤＮＡは、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含んでもよい。ＲＮＡｓｅＨ活性
の標的としたい場合、内側のＤＮＡ配列の長さは少なくとも約５ヌクレオチドであること
が好ましい。
ヌクレアーゼ耐性の向上のために、アンチセンス剤を、３’−３’結合で３’末端のヌ
クレオシドを反転させることにより、さらに修飾することができる。別の代替例において
、３’末端をアミノアルキル基でブロックすることもできる。
ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）
ジンクフィンガータンパク質技術を用いて、標的候補遺伝子、例えば、ＳＮＣＡ遺伝子
の転写をダウンレギュレーションすることが可能である。例えば、ＳＮＣＡ遺伝子特異的
なＤＮＡ結合ドメインを、ＳＮＣＡ遺伝子の発現をダウンレギュレーションするためにリ
プレッサードメインに融合させることができる。様々な特異性を有する様々な多数のジン
クフィンガードメインを使用してジンクフィンガータンパク質を構築し、新規な配列を認
識するのみならず、様々な長さの配列も認識するＤＮＡ結合タンパク質を提供することが
できる。遺伝子発現の調節のためのジンクフィンガー結合タンパク質については、例えば
、米国特許第６，６０７，８８２号および同第６，５３４，２６１号に記載されている。
ＺＦＰによって認識される標的部位は、ＺＦＰ（任意選択で調節ドメインに連結されて
いる）による遺伝子発現の抑制が可能となるような、標的遺伝子（例えば、ＳＮＣＡ遺伝
子）中の任意の適切な部位であってよい。好ましい標的部位には、転写開始部位の下流ま
たは上流に隣接する領域が含まれる。さらに、標的部位は、エンハンサー領域、リプレッ
サー部位、ＲＮＡポリメラーゼ休止部位、および特異的調節部位（例えば、ＲＥＰ１部位
）に位置してもよく、ｃＤＮＡコード領域内の部位、または発現配列タグ（ＥＳＴ）コー
ド領域内に位置してもよい。典型的には、各フィンガーは２〜４塩基対を認識し、２フィ
ンガーのＺＦＰは４〜７ｂｐの標的部位に結合し、３フィンガーのＺＦＰは６〜１０塩基
対の部位に結合し、そして６フィンガーのＺＦＰは各々約６〜１０塩基対の２つの隣接す
る標的部位に結合する。
典型的には、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、調節ドメイン、例えば、Ｋｒｕ
ｅｐｐｅｌ結合ボックス（ＫＲＡＢ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、または
ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）などの転写因子リプレッサードメインに連結され
る。遺伝子発現を抑制するためには、一般に、該遺伝子の発現を、約２０％低減し（すな
わち、ＺＦＰの調節を受けていない発現の８０％とし）、より好ましくは約５０％低減し
（すなわち、ＺＦＰの調節を受けていない発現の５０％とし）、より好ましくは約７５〜
１００％低減する（すなわち、ＺＦＰの調節を受けていない発現の２５〜０％とする）。
ジンクフィンガータンパク質を低分子に応答するように人為操作して、該低分子により
ジンクフィンガータンパク質の活性を調節可能とすることができる。１つの実施形態にお
いて、細胞は２つのジンクフィンガータンパク質を含む。これらのジンクフィンガータン
パク質は２つの異なる候補遺伝子を標的とし得る。例えば、１つのＺＦＰがＳＮＣＡ遺伝
子を標的として発現を阻害し、第２のＺＦＰがプロテアソーム機構の成分をコードする遺
伝子を標的として、例えば発現を増強してもよい。別例として、第２のＺＦＰが、α−シ
ヌクレインの凝集表現型に寄与する第２の遺伝子の発現を標的とし、かつ阻害してもよい
。別例として、ジンクフィンガータンパク質が、同じ候補遺伝子上の２つの異なる標的部
位を標的としてもよい。各ジンクフィンガータンパク質の発現が低分子（例えば、２つの
異なる低分子）の制御下にあり、遺伝子発現の抑制の程度を変動可能にすることもできる
。
「低分子」とは、本明細書で使用される場合、例えば、細胞中で特定のタンパク質また
は核酸、例えば、ＳＮＣＡタンパク質または核酸の活性を調節することによって、細胞ま
たは生物の表現型に影響を与え得る化学化合物である。低分子は、タンパク質と直接的に
相互作用することによって、またはタンパク質の発現もしくは活性をもたらす生化学カス
ケードの上流もしくは下流に作用する分子と相互作用することによって、細胞に影響を与
え得る。典型的には、低分子の分子量は、約３０００Ｄａ未満、好ましくは約２０００Ｄ
ａ未満、より好ましくは約１０００Ｄａ未満、約９００Ｄａ未満、約８００Ｄａ未満、約
７００Ｄａ未満、または約６００Ｄａ未満である。
治療方法および送達経路
以下の議論は、ｉＲＮＡ剤を用いる治療に関する。しかしながら、本発明は、本明細書
に開示される他の阻害剤、例えば、ＳＮＣＡ ＲＮＡを標的とするアンチセンス分子およ
びリボザイム、ジンクフィンガータンパク質、および抗体、ならびに、好ましい実施形態
においてＳＮＣＡタンパク質に結合しかつこれを阻害する合成ポリペプチドおよび天然に
存在するポリペプチドまたは低分子を使用または具体化する類似の方法および組成物を含
むと理解されるものである。α−シヌクレインを標的とする組成物、例えば、リボザイム
、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｉＲＮＡ剤、抗体、低分子、またはジンクフィンガ
ータンパク質を含む組成物は、種々の経路によって対象に送達可能である。例示的な経路
には、クモ膜下腔内、（例えば、脳内の）実質、静脈内、鼻、および眼への送達が含まれ
る。好ましい送達経路は、脳への直接送達である。抗ＳＮＣＡ剤は、投与に適した薬学的
組成物に組み込まれ得る。例えば、組成物は、１種以上のｉＲＮＡ剤および薬学的に許容
可能な担体を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」と
は、薬学的投与に適した任意のあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤
、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためにこの
ような媒体および薬剤を使用することは、当該分野において周知である。任意の従来の媒
体または薬剤は、該活性化合物とは相容れない場合を除き、本発明の組成物中における使
用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込み可能である。
本発明の薬学的組成物は、局所治療が所望されるか全身治療が所望されるかにより、ま
た治療すべき領域により、多数の方法で投与可能である。投与は、局所（点眼、鼻内投与
、経皮投与など）でも、経口または非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内点滴、
皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射、またはクモ膜下腔内もしくは脳室内の投与を含む
。
送達の経路は、患者の障害によって変わりうる。例えば、ＰＤと診断された対象に、抗
ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤を、脳に直接的に、例えば、脳の黒質に直接的に（例えば、黒質内
の線条体のドーパミン領域に）投与可能である。多系統萎縮症と診断された対象には、脳
に直接的に、例えば、脳の線条体および黒質の領域に、および脊髄にｉＲＮＡ剤を投与可
能である。レーヴィ小体痴呆と診断された対象には、脳に直接的に、例えば、脳の皮質に
直接的にｉＲＮＡ剤を投与可能であり、そして投与は拡散可能である。ＳＮＣＡ発現を阻
害する薬剤、例えば、抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤に加えて、患者に、第２の治療、例えば、
緩和治療および／または疾患特異的な治療を施しても良い。緩和治療は、ドーパミン作動
薬治療、例えば、メチルドーパまたはコエンザイムＱ１０などであり得る。
ある実施形態において、例えば、パーキンソン病の治療のために、第２の治療は、例え
ば、対症的治療（例えば、症状を緩和するため）、神経を保護する治療（例えば、疾患の
進行を遅延または停止させるため）、または回復治療（例えば、疾患の過程を逆行させる
ため）であり得る。対症的治療は、薬物カルビドーパ／レボドーパ、エンタカポン、トル
カポン、プラミペキソール、ロピネロール（ｒｏｐｉｎｅｒｏｌｅ）、ペルゴリド、ブロ
モクリプチン、セレゲリン、アマンタジン、および数種の抗コリン作用剤を含む。脳深部
刺激手術ならびに定位的脳手術もまた、対症的軽減をもたらす可能性がある。神経を保護
する治療には、例えば、カルビドーパ／レボドーパ、セレゲリン、ビタミンＥ、アマンタ
ジン、プラミペキソール、ロピネロール、コエンザイムＱ１０、およびＧＤＮＦが含まれ
る。回復治療には、例えば、幹細胞の外科的移植が含まれ得る。
抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤は、脳の神経細胞に送達可能である。組成物が血液脳関門を通
過する必要のない送達方法が利用可能である。例えば、ｉＲＮＡ剤を含む薬学的組成物を
、α−シヌクレイン凝集物を含む領域への直接的な注射によって患者に送達可能である。
例えば、薬学的組成物を、脳への直接的注射によって送達可能である。この注射は、脳の
特定の領域（例えば、黒質、皮質、海馬、または淡蒼球）への定位的な注射であり得る。
ｉＲＮＡ剤は、中枢神経系の複数の領域に（例えば、脳の複数の領域に、および／または
脊髄に）送達可能である。ｉＲＮＡ剤は、脳の広範な領域に送達可能である（例えば、脳
の皮質への拡散性送達）。
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、組織、例えば、脳（例えば、脳の黒質、海馬
、または淡蒼球）に一端が移植されたカニューレまたは他の送達デバイスによって送達可
能である。カニューレはｉＲＮＡ剤のリザーバーに接続可能である。フローまたは送達は
、ポンプ、例えば、浸透圧ポンプまたはミニポンプによって調節可能である。１つの実施
形態において、ポンプまたはリザーバーは組織から離れた領域に、例えば、腹部に移植さ
れ、送達は、ポンプまたはリザーバーから放出部位まで通じている導管によってもたらさ
れる。脳への送達のためのデバイスは、例えば、米国特許第６，０９３，１８０号および
同第５，８１４，０１４号に記載されている。
ｉＲＮＡ剤は、血液脳関門を通過できるように修飾可能である。例えば、ｉＲＮＡ剤は
、該薬剤が血液脳関門を通過できるようにする分子と複合体化されてもよい。このような
修飾ｉＲＮＡ剤は、任意の所望の方法によって、例えば、脳室内もしくは筋肉内注射によ
って、または肺送達によって投与可能である。
抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤は、例えば、網膜の障害（例えば、網膜症）を治療するために
眼に投与可能である。例えば、薬学的組成物は、眼の表面または周辺組織、例えば、瞼の
内部に施用可能である。該組成物は、局所的に、例えば、噴霧することによって、点眼と
して、眼洗浄液として、または軟膏として施用可能である。軟膏および滴下可能な液体は
、当該分野で既知の眼への送達系、例えば、アプリケーターまたは点眼器によって送達さ
れてもよい。このような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、もしくはポリ（ビニルアルコール）などの粘膜模倣物、ソルビン
酸、ＥＤＴＡ、またはベンジルクロミウムクロライドなどの保存剤、ならびに通常の量の
希釈剤および／または担体を含み得る。薬学的組成物はまた、眼の内部に投与可能であり
、かつ選択された領域または構造に組成物を導入することが可能な針または他の送達デバ
イスによって導入可能である。ｉＲＮＡ剤を含む組成物はまた、眼用パッチを介して施用
可能である。
投与は、投与対象者によって為されても良いし、または別のヒト、例えば、別の介護者
によって為されても良い。介護者は、ヒトを介護することに関与する任意の存在であり得
る：例えば、病院、ホスピス、医院、外来診察室；医師、看護師、もしくは他の実務者な
どの医療従事者；または配偶者もしくは保護者（例えば、親）などである。投薬は、測定
された用量で、または測定された用量を送達するディスペンサーで供給可能である。
対象を、浮腫または脳内出血などの治療に対する反応についてモニターすることが可能
である。例えば、患者をＭＲＩによって、例えば、注射後毎日または毎週、または注射後
定期的な時間間隔でモニター可能である。
対象を、疾患の症状の改善または安定化についてモニターすることも可能である。この
ようなモニタリングは、例えば、経時的な臨床評価（例えば、統合パーキンソン病評価尺
度を使用して）、または機能的神経画像化によって達成可能である。モニタリングはまた
、未治療の対象から収集した規準データに対して治療した対象を比較する、線条体ドーパ
ミン作動性機能の経時的な定量測定値（例えば、フルオロドーパおよびポジトロン放出断
層撮影）を含み得る。別の成果尺度には、生存ならびに緩和治療および診療所への入所な
しでの生存を含み得る。治療した対象および未治療の対象についてのこれらの測定値およ
び成果における統計学的に有意な違いは、治療効力の証拠である。
抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤を含む薬学的組成物は、シヌクレイン症などの神経変性障害を
有するか、または発症するリスクがあると診断された任意の患者に投与可能である。１つ
の実施形態において、患者は神経変性障害を有すると診断され、その患者は他の点では一
般的に良好な健康状態にある。例えば、この患者は末期症状にはなく、この患者は、診断
後少なくとも２年、３年、５年、または１０年またはそれ以上生存すると思われる。患者
は診断後すぐに治療されてもよいし、またはより衰弱させる症状（例えば、ＰＤ患者にお
ける動揺性動作障害および運動障害）を患者が経験するまで治療を遅延してもよい。別の
実施形態において、患者は疾患の重症な段階に達しておらず、例えば、患者は、ホーン（
Ｈｏｅｈｎ）およびヤール（Ｙａｈｒ）のＰＤの段階５に達していない（ホーン（Ｈｏｅ
ｈｎ）およびヤール（Ｙａｈｒ）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ 第１７巻、４２７〜４４２ペー
ジ、１９６７年）。別の実施形態において、患者は末期症状ではない。一般的に、抗ＳＮ
ＣＡ ｉＲＮＡ剤は、任意の適切な方法によって投与可能である。本明細書において使用
される場合、局所送達とは、身体の任意の表面（眼、粘膜、体腔の表面、または任意の内
部表面）へのｉＲＮＡ剤の直接的施用を指すことが可能である。局所投与のための製剤に
は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点眼剤、スプレー、およびリキッ
ド剤が含まれうる。従来の薬学的担体、水性、粉末、または油性の基剤、増粘剤などが必
要であるか、または望ましい場合がある。局所投与は、対象の表皮もしくは真皮、または
表皮もしくは真皮の特定の層、または下層組織にｉＲＮＡ剤を選択的に送達するための手
段としても使用可能である。 クモ膜下腔内投与または脳室内投与のための組成物は滅菌
水性溶液を含んでもよく、該水性溶液はさらに緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加剤
を含んでもよい。
非経口投与のための製剤は滅菌水性溶液を含んでもよく、該水性溶液はさらに緩衝剤、
希釈剤、および他の適切な添加物を含んでもよい。脳室内注射は、例えばリザーバーに連
結された脳室内カテーテルによって容易に実施可能である。静脈内で使用するためには、
溶質の全体の濃度を調節して、調製物を等張にするべきである。
抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤は、肺送達によって対象に投与されてもよい。肺送達組成物は
、患者が分散物を吸入することによって、分散物中の組成物、好ましくはｉＲＮＡが肺に
到達可能となり、肺において肺胞領域を介して血液循環中に直接容易に吸収されうるよう
に送達することができる。肺送達は、全身への送達、および肺の疾患を治療するための局
所送達のいずれにおいても有効であり得る。１つの実施形態において、肺送達によって投
与される抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤は、血液脳関門を通過可能であるように修飾されている
。
肺送達は、霧状、エアロゾル状、ミセル状、および乾燥粉末状の製剤の使用など、種々
の手法によって達成可能である。送達は、液体噴霧器、エアロゾルベースの吸入器、およ
び乾燥粉末分散物用デバイスを用いて達成可能である。計量式デバイスが好ましい。アト
マイザーまたは吸入器を使用する利点の１つは、デバイスが内蔵型であるために夾雑物混
入の可能性が最小化されることである。乾燥粉末分散物用デバイスは、例えば、乾燥粉末
として容易に製剤化可能な薬物を送達する。ｉＲＮＡ組成物は、単独で凍結乾燥粉末もし
くは噴霧乾燥粉末として、または適切な粉末担体と組み合わせて安定に保存可能である。
吸入用組成物の送達は投薬調節要素を介して行うことも可能であり、該投薬調節要素には
、デバイスに組み込まれたときに、エアロゾル医薬の投与時における用量の追跡、服薬の
監視、および／または患者への投薬開始を可能にする、タイマー、用量計測器、時間測定
デバイス、または時間表示器が含まれ得る。
用語「治療有効量」は、治療される対象において期待の生理学的応答を生じさせる所望
の薬物レベルを提供するために必要な、組成物中に存在する量である。
用語「生理学的有効量」は、所望の緩和効果または治癒効果を与えるために対象に送達
される量である。
用語「薬学的に許容可能な担体」とは、その担体が、肺に対して有意な毒性副作用を伴
わずに肺に取り込まれ得ることを意味する。
担体として有用である医薬賦形剤の種類には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安
定剤、糖質、アミノ酸、およびポリペプチドなどの充填剤；ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩
化ナトリウムなどの塩；その他が含まれる。これらの担体は、結晶型でもアモルファス型
でもよく、またはその２つの混合物であってもよい。
特に有用な充填剤には、共用可能な糖質、ポリペプチド、アミノ酸、またはそれらの組
み合わせが含まれる。適切な糖質には、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど
の単糖；ラクトース、トレハロースなどの二糖；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデ
キストリンなどのシクロデキストリン；およびラフィノース、マルトデキストリン、デキ
ストランなどの多糖；マンニトール、キシリトールなどのアルジトールが含まれる。好ま
しい糖質の群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、お
よびマンニトールが含まれる。適切なポリペプチドにはアスパルテームが含まれる。アミ
ノ酸には、アラニンおよびグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。
適切なｐＨ調整剤または緩衝剤には、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム
などの有機酸および有機塩基から調製した有機塩が含まれ；クエン酸ナトリウムが好まし
い。
抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤は、経口および経鼻送達によって投与可能である。例えば、こ
れらの膜を通して投与される薬物は、作用開始が迅速であり、治療的な血漿レベルを提供
し、肝代謝の初回通過効果を回避し、かつ敵対的な胃腸（ＧＩ）環境に対する薬物の曝露
を回避する。さらなる利点には、薬物が容易に適用、局在化、および除去されうるように
膜部位へ接近しやすいことが含まれる。１つの実施形態において、経口または経鼻送達に
よって投与される抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤は、血液脳関門を通過可能であるように修飾さ
れている。
１つの実施形態において、ｉＲＮＡを含む組成物の単位用量または測定された用量が、
移植されたデバイスによって投薬される。このデバイスは、対象の体内のパラメータをモ
ニターするセンサーを含み得る。例えば、このデバイスは、浸透圧ポンプなどのポンプ、
および場合により、関連する電子部品を備え得る。
ｉＲＮＡ剤は、ウイルスの天然のカプシドにパッケージングされてもよいし、化学的も
しくは酵素的に作製された人工のカプシドまたはそこから誘導される構造物にパッケージ
ングされてもよい。
投薬量。抗ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ剤は、体重１ｋｇ当たり約１．４ｍｇ未満の単位用量、
または体重１ｋｇ当たり１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．
００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００
００１ｍｇ未満の単位用量で投与可能であり、体重１ｋｇ当たり２００ナノモル（例えば
、約４．４×１０１６コピー）のＲＮＡ剤、または体重１ｋｇ当たり１５００、７５０、
３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．
０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ナノモルのＲＮ
Ａ剤の単位用量で投与可能である。この単位用量を、例えば、注射（例えば、静脈内注射
もしくは筋肉内注射、クモ膜下腔内注射、または脳への直接的な注射）、吸入投薬、また
は局所的施用によって投与可能である。特に好ましい投薬量は、体重１ｋｇあたり２、１
、または０．１ｍｇ未満である。
器官への直接的な（例えば、脳への直接的な）ｉＲＮＡ剤の送達は、器官当たり約０．
００００１ｍｇ〜約３ｍｇ、または好ましくは器官当たり約０．０００１〜０．００１ｍ
ｇ、器官当たり約０．０３〜３．０ｍｇ、眼当たり約０．１〜３．０ｍｇ、または器官当
たり約０．３〜３．０ｍｇのオーダーの投薬量であり得る。
投薬量は、疾患または障害、例えば、シヌクレイン症と関連する疾患または障害を治療
または予防するために有効な量であり得る。
１つの実施形態において、単位用量は、１日に１回未満の頻度で、例えば、２日毎、４
日毎、８日毎、または３０日毎に１回未満の頻度で投与される。別の実施形態において、
単位用量は、一定の頻度で投与されない（例えば、不規則的な投与頻度）。例えば、単位
用量が単回投与されてもよい。
１つの実施形態において、有効用量が他の伝統的な治療様式と一緒に投与される。１つ
の実施形態において、対象はＰＤを有し、該治療様式はｉＲＮＡ剤以外、例えば、二本鎖
ｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤以外の治療剤である。この治療様式は、例えば、レバドーパ
またはデプロニルであり得る。
１つの実施形態において、対象に、初回用量および１回以上の維持用量のｉＲＮＡ剤、
例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、プロセシング
されてｓＲＮＡ剤になる大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ
剤、またはｓＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体）をコードするＤＮＡ）を投与する。維持
用量は、一般的に初回用量よりも少なく、例えば、初回用量の半分である。維持投薬計画
は、１日当たり体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１．４ｍｇの範囲、例えば、１日当たり
体重１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇ
の用量で対象を治療することを包含し得る。維持用量は、５日、１０日、または３０日毎
に１回以下投与されることが好ましい。さらに、治療計画の継続期間は、特定の疾患の性
質、その重症度、および患者の全身状態に依存して変化しうる。好ましい実施形態におい
て、投薬量は、１日に１回以下、例えば、２４時間、３６時間、４８時間、またはそれ以
上の時間当たりで１回以下、例えば、５日毎または８日毎に１回以下送達してもよい。治
療後、患者の状態の変化について、および疾患状態の症状の緩和について患者をモニター
してもよい。化合物の投薬量は、患者が現在の投薬量レベルに対して有意に応答しない場
合には増加してもよいし、疾患状態の症状の緩和が観察される場合、疾患状態が除去され
た場合、もしくは望ましくない副作用が観察される場合には用量を減少してもよい。
有効用量は特定の状況下で所望される、または適切と考えられるような、単回投与また
は２回以上の投与で投与可能である。反復または頻繁な注入を容易にすることが所望され
る場合、送達デバイス（例えば、ポンプ、半透過性ステント（例えば、静脈内、腹腔内、
槽内、または嚢内）、またはリザーバーの移植が推奨されることがある。
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤の薬学的組成物は、複数種のｉＲＮＡ剤を含む。
別の実施形態において、複数種の該ｉＲＮＡ剤の配列は、天然に存在する標的配列に関し
て別の種類のｉＲＮＡ剤と重複せず、かつ隣接しない。別の実施形態において、複数種の
ｉＲＮＡ剤は、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。別の実施形態において
、ｉＲＮＡは対立遺伝子特異的である。
治療に成功した後、疾患状態の再発を予防するために、患者に維持治療を受けさせるこ
とが望ましいことがある。該維持治療において、本発明の化合物は、体重１ｋｇ当たり０
．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で投与される（米国特許第６，１０７，０９４号
を参照のこと）。
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、疾患の治療もしくは予防に有効であるために十分な量、ま
たはヒトにおける生理学的状態を調節するために十分な量である。投与されるｉＲＮＡ剤
の濃度または量は、薬剤について決定されるパラメータ、および投与方法（例えば、鼻、
口腔、または肺）に依存する。例えば、点鼻用製剤は、鼻腔の刺激および炎症を回避する
ために、一部の成分を非常に低濃度とする必要がある傾向を有する。適切な点鼻用製剤を
提供するために、経口製剤を１０〜１００倍まで希釈することが望ましいことがある。
疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康、および／または年齢、な
らびに存在する他の疾患など（これらに限定されない）の特定の要因は、対象を有効に治
療するために必要な投薬量に影響を与える可能性がある。さらに、治療有効量のｉＲＮＡ
剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、プロセシ
ングされてｓＲＮＡ剤となりうる大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤（例えば、二本鎖
ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体）をコードするＤＮＡ）を用いる
対象の治療は、単一の治療も、好ましくは、一連の治療を含み得る。当然のことながら、
治療のために使用されるｉＲＮＡ剤（例えば、ｓＲＮＡ剤）の有効投薬量が特定の治療の
過程にわたって増加または減少されてもよい。投薬量の変化は、本明細書に記載されるよ
うな診断アッセイの結果に起因することもあり、かつ該結果から明らかとなることもある
。例えば、ｉＲＮＡ剤組成物の投与後に対象をモニター可能である。モニタリングからの
情報に基づいて、付加的な量のｉＲＮＡ剤組成物を投与することができる。
投薬は、治療される疾患状態の重症度および応答性に依存し、治療の期間は数日から数
カ月まで続くか、または治癒がもたらされるまで、もしくは疾患状態の減少が達成される
までである。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物の蓄積の測定から計算
可能である。当業者は、最適な投薬量、投薬方法論、および反復の程度を容易に決定可能
である。最適投薬量は、個々の化合物の相対的効力に依存して変化する可能性があり、一
般的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの動物モデルにおいて有効であること
が見出されたＥＣ５０に基づいて推定することができる。ある実施形態において、動物モ
デルは、ヒト遺伝子（例えば、標的ＲＮＡ（例えば、ＳＮＣＡ ＲＮＡ）を産生する遺伝
子）を発現するトランスジェニック動物を含む。トランスジェニック動物は、対応する内
在性ＲＮＡが欠損していてもよい。別の実施形態において、試験のための組成物は、動物
モデル中の標的ＲＮＡとヒト中の標的ＲＮＡとの間で保存されている配列に対して、少な
くとも内部領域において相補的であるｉＲＮＡ剤を含む。
キット。特定の他の態様において、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤
、またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、プロセシングされてｓＲＮＡ剤になりう
る大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓＲＮＡ剤
、またはそれらの前駆体）をコードするＤＮＡ）の医薬製剤を含む適切な容器を含むキッ
トを提供する。特定の実施形態において、医薬製剤の個々の成分は１つの容器中で提供さ
れ得る。別例として、医薬製剤の成分を２つ以上の容器中で別々に提供することが望まし
い場合もある。例えば、前記２つ以上の容器のうち１つの容器はｉＲＮＡ剤調製物のため
であり、および少なくとももう１つの容器は担体化合物のためである。キットは、多数の
異なる構成として（例えば、単一の箱の中に１つまたは複数の容器などの構成として）パ
ッケージすることが可能である。異なる成分を、例えば、キットとともに提供される指示
書に従って組み合わせることが可能である。成分は、例えば、薬学的組成物を調製および
投与するために、本明細書に記載の方法に従って組み合わせることが可能である。キット
はまた、送達デバイスを含み得る。
本発明を以下の実施例によってさらに例証するが、実施例はさらなる限定と解釈される
べきではない。
［ＳＮＣＡを標的とするｉＲＮＡ剤の設計］
表１に記載される配列を有する二本鎖ＲＮＡを合成した。図１Ａは、完全長のＳＮＣＡ
ｍＲＮＡの配列、およびｄｓＲＮＡ ＳＮＣＡ１〜９（表１）の標的部位を示す。
ＳＮＣＡ６、７、８、および９の配列を、ホワイトヘッドインスチチュート（Ｗｈｉｔ
ｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）［米国マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ）所在］で開発され、オンラインで自由に利用可能なｄｓＲＮＡ選択ツールを使
用して設計した。該ｄｓＲＮＡ選択ツールを使用することによって、（ａ）４つ以上連続
するＡ、Ｔ、またはＧ残基を含む任意の配列、および（ｂ）１列に８つ以上の連続するＧ
Ｃ対を有する任意の配列を除く、３０％から７０％の間のＧＣ含量を有するすべての可能
なｓｉＲＮＡを選択した。全体で２３７種の候補ｓｉＲＮＡがこの判断基準に合致した。
次いで、この２３７種の候補ｓｉＲＮＡを、ヒトα−シヌクレインにのみ合致した配列を
有するｓｉＲＮＡを同定するために、ＵｎｉＧｅｎｅデータベース（ポンチウスら（Ｐｏ
ｎｔｉｕｓ ｅｔ ａｌ．）「Ｔｈｅ ＮＣＢＩ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．」の「ＵｎｉＧｅ
ｎｅ：ａ ｕｎｉｆｉｅｄ ｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．」
、米国メリーランド州ベテスダ所在のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；２００３年）に対してスクリーニング
した。このスクリーニングは、ＢＬＡＳＴ検索技術（アルチュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ
ｅｔ ａｌ．）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２５巻、３３８９〜３４０２
ページ、１９９７年）を使用して実行した。同定されたｓｉＲＮＡのサブセットを、マウ
スのα−シヌクレイン遺伝子にのみ合致する配列を有するｓｉＲＮＡを同定するためにＢ
ＬＡＳＴを使用してマウスＵｎｉＧｅｎｅに対してスクリーニングした。１３個の配列が
同定され、重複部分を含まない４個の二本鎖（ＳＮＣＡ６、７、８、および９）を、以下
に記載するアッセイにおける使用のために選択した。
［ＳＮＣＡ ｄｓＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてタンパク質発現を減少させた］
神経芽細胞腫細胞（ＢＥ（２）−Ｍ１７）を、５０ｎＭ ｄｓＲＮＡ、およびＥＧＦＰ
またはα−シヌクレイン−ＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ）融合タンパク質のいずれかを
発現するプラスミドで同時にトランスフェクションした（本明細書において使用されるよ
うに、ＮＡＣＰはＳＮＣＡの遺伝子産物と同義である）。ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ／ＮＡ
ＣＰ融合タンパク質の発現をウェスタンブロット分析によってアッセイした（図２）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞アッセイは、表１の試験用ｄｓＲＮＡがＳＮＣＡ ＲＮＡの発
現をダウンレギュレーションする能力をモニターする。これらの実験におけるＳＮＣＡ標
的ＲＮＡはＥＧＦＰ ＲＮＡに融合されている。ＥＧＦＰに対する抗体は、ＲＮＡから翻
訳されたＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ融合タンパク質の検出を容易にする。
このアッセイにおいて使用される対照実験には、ルシフェラーゼＲＮＡを標的とするｄ
ｓＲＮＡ（図２の「ｓｉＲＮＡ Ｍｒ」と記されたレーンを参照のこと）、およびｓｉＲ
ＮＡでトランスフェクションされていない細胞の使用を含めた。αチューブリンに対する
抗体を、各レーンに装荷された全タンパク質の量をモニターするための対照として使用し
た。対照実験は、ＥＧＦＰタンパク質およびＥＧＦＰ／ＮＡＣＰタンパク質が、抗ＳＮＣ
Ａ ｄｓＲＮＡの非存在下ではほぼ等量で発現されていることを示した。観察されたＥＧ
ＦＰ／ＮＡＣＰ発現のダウンレギュレーション効果が最大であったのは、Ｍａｙｏ２、Ｍ
ａｙｏ７、およびＭａｙｏ８ ｄｓＲＮＡであった（本明細書において使用される場合、
ＭａｙｏＸ ｓｉＲＮＡは、ＳＮＣＡＸ ｄｓＲＮＡと同義である）。Ｍａｙｏ１、Ｍａ
ｙｏ６、およびＭａｙｏ９ ｄｓＲＮＡでは、それより弱い効果が観察された。ｓｉＲＮ
Ａ Ｍｒは、ベクター由来のＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ複合体の両方の発現に影
響を与え、このアッセイの適合性を実証した。
最も有効なｄｓＲＮＡ（Ｍａｙｏ２、Ｍａｙｏ７、およびＭａｙｏ８）の阻害効果を、
様々なｄｓＲＮＡ濃度において２４時間インキュベーションとして試験した（図３）。Ｉ
Ｃ５０値は１ｎＭ未満と決定された。
最も有効なｓｉＲＮＡの阻害効果を、低濃度の血清を用いる培養中のゆっくりと分裂し
ている神経芽細胞腫細胞中で試験した。ＢＥ（２）−Ｍ１７細胞を、ＥＧＦＰ／ＮＡＣＰ
融合タンパク質を発現するプラスミド単独でトランスフェクションするか（対照）、また
はｄｓＲＮＡ Ｍａｙｏ２、Ｍａｙｏ７、もしくはＭａｙｏ８とともに同時トランスフェ
クションした。ＥＧＦＰ／ＮＡＣＰタンパク質の発現を、６日間にわたってモニターした
。融合タンパク質の発現は、少なくとも３日間有効にサイレンシングされることが観察さ
れた（図４）。ｄｓＲＮＡはまた、少なくとも３日間、同様の細胞において内在性タンパ
ク質の発現も阻害した（図５）。Ｍａｙｏ２、Ｍａｙｏ７、およびＭａｙｏ８ ｓｉＲＮ
Ａはまた、ゆっくりと分裂している細胞中の内在性α−シヌクレインＲＮＡの発現も阻害
した（図６）。６日後、Ｍａｙｏ２およびＭａｙｏ８は、内在性ＳＮＣＡ発現を有効に阻
害し続けていた。細胞中のα−シヌクレインｍＲＮＡのレベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲの
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）法によって、１８Ｓ ｒＲＮＡ発現レベルに対して標準化して
測定した。ＳＮＣＡの３’ＵＴＲを標的とするＭａｙｏ９は、内在性α−シヌクレインＲ
ＮＡの発現を阻害しなかった。
Ｍａｙｏ２、７、および８のｄｓ ＲＮＡの効力を、マウスＳＮＣＡに対して試験した
。細胞を、ｄｓＲＮＡ、およびＥＧＦＰのみをコードするプラスミド（ベクター）または
ヒトもしくはマウス由来のＥＧＦＰ−ＮＡＣＰをコードするプラスミドを用いて同時トラ
ンスフェクションした。ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ−ＮＡＣＰの発現を、ウェスタンブロッ
トによってアッセイした。３種すべてのｄｓＲＮＡがヒトＥＧＦＰ−ＮＡＣＰの発現を阻
害したのに対して、Ｍａｙｏ２のみがマウスＥＧＦＰ−ＮＡＣＰの発現を阻害した（図７
）。ヒトおよびマウスのｍＲＮＡ配列はＭａｙｏ２遺伝子座においては同一であるが、Ｍ
ａｙｏ７およびＭａｙｏ８の各遺伝子座においては、２つのヌクレオチドが相違している
。
ＳＮＣＢ（β−シヌクレイン）は、Ｍａｙｏ２遺伝子座においてα−シヌクレインと配
列類似性を共有しているが、配列中４つのヌクレオチドが異なっている。Ｍａｙｏ２の効
力を、ＳＮＣＢに対して試験した。ＢＥ（２）−Ｍ１７細胞を、ｄｓＲＮＡ Ｍａｙｏ２
またはＭａｙｏ９を発現するプラスミドでトランスフェクションした。内在性のＳＮＣＡ
およびＳＮＣＢのＲＮＡの発現を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）法による定量的ＲＴ−ＰＣ
Ｒでアッセイした。Ｍａｙｏ２はＳＮＣＡの発現を阻害したが、ＳＮＣＢの発現を阻害し
なかった（図１１）。予測されたように、Ｍａｙｏ９はＳＮＣＢまたはＳＮＣＡの発現を
阻害しなかった。
［ＳＮＣＡ ｓｉＲＮＡの安定性］
ＳＮＣＡ ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の安定性を、９０％マウス血清
または９０％ヒト血清中で、およびマウス脳組織中で試験した。安定性アッセイを実行す
るために、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖を放射活性標識した（両方の鎖を
、血清および脳組織中での安定性についてアッセイした）。タンパク質抽出物をマウス脳
から調製し、１００ｎＭのｓｉＲＮＡ二本鎖を、該抽出物とともに３７℃でインキュベー
トした。４〜５時間にわたって経時的に、試料を取り出してポリアクリルアミド変性ゲル
で分析した。
Ｍａｙｏ２、７、および８の安定性を、マウスの血清および脳抽出物中で試験した。さ
らに、Ｍａｙｏ７およびＭａｙｏ８の切断部位を、Ｔ１分析によってマッピングした（図
８Ａおよび８Ｂ）。ＲＮＡｓｅ Ｔ１はＧヌクレオチドの３’を切断するので、既知の配
列を有するＲＮＡのＴ１消化により、ＲＮＡｓｅ Ｔ１以外の切断部位を検出するための
方向および比較の基準が得られる。Ｔ１を、Ｍａｙｏ７（ＳＮＣＡ７、またはＡＬ−ＤＵ
Ｐ−１４７７とも呼ばれる）およびＭａｙｏ８（ＳＮＣＡ８、またはＡＬ−ＤＵＰ−１４
７８とも呼ばれる）の各ｓｉＲＮＡの切断部位をマッピングするために使用した（それぞ
れ図８Ａおよび８Ｂ、ならびに表１）。Ｍａｙｏ７および８のセンス鎖を３２Ｐで５’末
端標識し、そしてＲＮＡｓｅ Ｔ１消化を４時間実行した。試料を電気泳動によって分析
した。Ｍａｙｏ７は、Ｕ１６およびＵ１７の３’エンドヌクレアーゼ切断に対して感受性
であることが見出された。Ｍａｙｏ８は、Ｕ１６の３’エンドヌクレアーゼ切断に対して
感受性であることが見出された。
Ｍａｙｏ７およびＭａｙｏ８ ｓｉＲＮＡの安定性を増大させるために、ヌクレオチド
を２’−Ｏ−Ｍｅ基またはホスホロチオエート連結で修飾し、Ｍａｙｏ７ｓ、Ｍａｙｏ８
ｓ１、およびＭａｙｏ８ｓ２を作製した（表１）。該修飾ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）を、Ｅ
ＧＦＰ−ＮＡＣＰベクターとともに、上記のように細胞に同時トランスフェクションした
。トランスフェクションしていない細胞は対照とした。遺伝子発現を、ウェスタンブロッ
ト分析によってモニターした。３種の修飾ｓｉＲＮＡの各々が、ＥＧＦＰ−ＮＡＣＰ構築
物の発現を阻害した（図９Ａおよび９Ｂ）。
修飾および非修飾のＭａｙｏ８ ｓｉＲＮＡを、Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ（商品名、カタ
ログ番号Ｅ９３７９、米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ（Ｓｉｇｍａ））によっ
て分析し、分析は以下のようにして実行した。すべての溶液を、ヌクレアーゼを含まない
水（カタログ番号９９３０、米国テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）所在のアンビヨ
ン（Ａｍｂｉｏｎ））中で、ヌクレアーゼを含まない試薬を使用して調製した。安定性ア
ッセイにおいて使用するためのｄｓＲＮＡの５０μＭストックを、１×ＰＢＳ中で、５０
μＭのセンス鎖ＲＮＡおよび５０μＭのアンチセンス鎖を混合することによって調製した
。この混合物を９０℃で２分間インキュベートして核酸を変性させ、次いでアニーリング
のために３７℃で１時間インキュベートした。
安定性アッセイを実行するために、凝血させたＡＢ型男性の全血由来のヒト血清（カタ
ログ番号Ｈ１５１３、米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ）を使用した。血清を氷
上で融解し、ｄｓＲＮＡと混合して終濃度約４．５μＭとした（すなわち、約４．２μｇ
、または約３００ピコモルのｄｓＲＮＡ）。「０」の時点で、１つの対照試料をｄｓＲＮ
Ａの血清への添加直後にドライアイス上で凍結し、この試料を−８０℃で保存した。他の
時点については（ヒト血清中、１５分、３０分、６０分、１２０分、および２４０分）、
試料をサーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ）［ドイツ、ハンブルク所在］）中で３７℃にてインキュベートした。各々の終了時点
において、試料をドライアイス上で凍結し、−８０℃で保存した。
血清からＲＮＡを抽出するために、試料を氷上で融解し、次いで０．５Ｍ ＮａＣｌ（
ヌクレアーゼを含まないもの；カタログ番号９７６０、米国テキサス州オースチン（Ａｕ
ｓｔｉｎ）所在のアンビヨン（Ａｍｂｉｏｎ））を試料に加えて、終濃度を約０．４５Ｍ
ＮａＣｌとした。この試料を短時間（約５秒間）渦流混合し、次いで、調製しかつ冷却
したＰｈａｓｅ−Ｌｏｃｋ−Ｇｅｌ−Ｅｐｐｉｓ（商品名、ドイツ国ハンブルク所在のエ
ッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））に移した。５００μｌのフェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）および３００μＬのクロロホルムを加えて
混合した。試料を３０秒間手短に渦流混合し、次いで１３，２００ｒｐｍで１５分間、４
℃にて遠心分離した。
水相を清浄なエッペンドルフチューブに移し、３Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ５．２を、約
０．１Ｍ ＮａＯＡｃの最終濃度まで加えた。この溶液を約２０秒間渦流混合し、次いで
、１μＬのＧｌｙｃｏ Ｂｌｕｅ（商品名、米国テキサス州オースチン所在のアンビヨン
）を加えた。溶液を手短にかつ穏やかに渦流混合し、次いで、１ｍＬの氷冷１００％エタ
ノールを加えた。この溶液を約２０秒間渦流混合し、次いで、ＲＮＡを沈殿させるために
−８０℃で１時間、または−２０℃で一晩保存した。沈殿後、この混合物を１３，２００
ｒｐｍで３０分間、４℃にて遠心分離し、そしてＲＮＡペレットを５００μＬの７０％エ
タノールで洗浄した。このペレットを風乾し、次いで３０μＬのゲルローディング緩衝液
（９５％ホルムアミド、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、キシレンシアノール、ブロモフェノールブ
ルー）を加えて混合し、そしてこの混合物を２分間渦流混合して再懸濁させた。
ＲＮＡ試料を、２０ｃｍ×２０ｃｍ×０．８ｍｍ（高さ×幅×厚さ）の２０％ポリアク
リルアミドゲルで分析した。このゲルを作製するために、２４ｇの８Ｍ尿素、２５ｍＬの
４０％（１９：１）アクリルアミド、および８ｍＬのホルムアミドを、１×ＴＢＥ中で混
合して５０ｍＬの溶液とした。重合は、５０μＬのＴｅｍｅｄおよび２００μＬの１０％
ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）によって活性化した。ゲルは１×ＴＢＥ中で泳動した。ゲ
ルを４０ｍＡで３０分間予備泳動した。試料を１００℃で５分間加熱し、次いで、すぐに
氷上で冷却した。対照実験のために、２μＬのｄｓＲＮＡを、８μＬのゲルローディング
緩衝液と混合した。試料を１３，２００ｒｐｍで（２０秒間、４℃）遠心分離し、１０μ
Ｌをゲルに装荷した。このゲルを４０ｍＡで約１時間泳動した。
ＲＮＡを可視化するために、ゲルをＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌ溶液（カタログ番号Ｅ９３７
９、米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ）（１００ｍｇのＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌを
８００ｍＬのホルムアミド：水（１：１ ｖ／ｖ）に溶解）で３０分間染色した。必要に
応じて、ゲルを３０〜６０分間、水中で脱色した。次いで、ゲルをスキャナー上で画像化
して分析した。
安定性アッセイの結果を図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示す。比較により、非修飾
のＳＮＣＡ８ ｄｓＲＮＡが急速に分解され、部分的に修飾されたｄｓＲＮＡ（ＳＮＣＡ
８ｓ１）が部分的に安定化され、そしてさらに修飾されたＳＮＣＡ８ｓ２がこれら３種の
二本鎖中では最も安定であることが示されている。
［ｓｉＲＮＡの生体内分布のｉｎ ｖｉｖｏ分析］
ｓｉＲＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで神経細胞に送達され得るか否かを測定するために、ルシ
フェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−ＤＰ−３０００）（表１）をフルオレセイ
ン標識と複合体化し、定位的注射によってマウス脳の個別の領域に投与した（表２）。Ａ
ＬＮ−ＤＰ−３０００を、脳の皮質、海馬、および淡蒼球の領域に注射した。注射後の異
なる時点において、脳組織を採取し、その切片を作製し、蛍光標識されたｓｉＲＮＡの局
在を顕微鏡で調べた。試験したすべての脳組織（皮質、海馬、および淡蒼球）において、
および注射後のすべての時点において、ｓｉＲＮＡは細胞外空間ならびに細胞内に局在し
ていることが見出された。
［シヌクレイン症と診断された患者を治療する方法］
シヌクレイン症と診断された患者には、ＳＮＣＡ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む
薬学的組成物を投与することができる。この組成物は、浸透圧ポンプおよび小型カニュー
レを備え、患者に左右対称に移植されたデバイスによって脳に直接送達することができる
。
このデバイスの移植の前に、定位固定用フレームを用いて患者にＭＲＩを実施する。脳
へのカニューレの送達のためにコンピュータ補助軌道を使用する。小型ポンプデバイスを
腹部に移植し、次いで、出血についてモニターするために患者を２〜３日入院させる。
ポンプ移植の約２週間後、患者にＭＲＩを実施して移植デバイスをチェックするとよい
。このヒトが十分に治癒しており、かつデバイス移植の結果として合併症が起こっていな
ければ、抗ＳＮＣＡ組成物をポンプに、そしてカニューレに注入することができる。治療
計画の開始の前に試験用量の抗ＳＮＣＡ剤を投与することができる。
最初の治療の３カ月、６カ月、および１年後に得たＭＲＩを使用して、デバイスの状態
、ならびにデバイスに対する患者の反応およびｉＲＮＡ剤を用いる治療をモニターするこ
とができる。臨床医は、浮腫および炎症性応答の発生に注意すべきである。治療開始の１
年後に、必要に応じてＭＲＩを実施することができる。
治療の過程を通して、疾患の症状の改善または安定化について患者をモニターすること
ができる。モニタリングには、連続的な臨床的評価および機能的神経画像化（例えば、Ｍ
ＲＩによる）が含まれうる。
［その他の実施形態］
本発明のいくつかの実施形態に関して説明してきた。しかしながら、本発明の思想およ
び範囲を逸脱することなく種々の変更を施すことが可能であることは理解されよう。従っ
て、その他の実施形態は添付の特許請求の範囲に包含される。

Claims (1)

  1. 本明細書中に記載される発明。
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