JP2011105761A - 神経変性疾患を治療する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】SNCA遺伝子を標的とする本発明で特徴とされる抗SNCA剤は、神経細胞に優先的に分布するように修飾されていてもよい。1つの態様において、本発明は、SNCAの発現を阻害する薬剤を投与することによって対象を治療する方法を特徴とする。好ましい実施形態において、対象はヒトなどの哺乳動物、例えば、神経変性障害を有するか、または神経変性障害を発症するリスクがあると診断された対象である。
【選択図】なし
Description
ヌクレノパシーの治療のためのα−シヌクレイン遺伝子のダウンレギュレーション(下方
制御)に関する。
本願は、2003年6月9日に出願された米国仮特許出願番号第60/476,947
号の利益を主張する。この仮出願の内容はその全体を本願明細書に援用する。
本明細書に記載の研究は、米国国立環境衛生科学研究所(National Institute of Envi
ronmentalHealth Sciences )によって授与された助成金番号ES10751、ならびに
米国国立神経疾患卒中研究所(Neurological Disorders and Stroke )によって授与され
た助成金番号NS33978およびNS40256の下で、米国政府からの補助金を少な
くとも部分的に使用して実行された。それゆえに、米国政府は本発明において一定の権利
を有し得る。
RNA干渉または「RNAi」は、二本鎖RNA(dsRNA)が線虫に導入されると
遺伝子発現をブロックすることが可能であるという観察を説明するために、ファイア(F
ire)および共同研究者らによって最初に作られた用語である(非特許文献1)。短い
dsRNAは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシング
をもたらし、かつ遺伝子の機能を研究するための新規なツールを提供してきた。
突然変異およびSNCA遺伝子の多重化は家族性パーキンソン病(PD)と関連付けられ
てきた。PD患者は、脳においてα−シヌクレインタンパク質が蓄積することを実証して
いる。同様の蓄積は、散発性PD、アルツハイマー病、多系統萎縮症、およびレーヴィ小
体痴呆を有すると診断された患者において観察される。
びこれらの組成物を使用する方法を提供することである。
びこれらの組成物を使用する方法に関する。1つの態様において、本発明は、SNCAの
発現を阻害する薬剤を投与することによって対象を治療する方法を特徴とする。好ましい
実施形態において、対象はヒトなどの哺乳動物、例えば、神経変性障害を有するか、また
は神経変性障害を発症するリスクがあると診断された対象である。この阻害は、任意のレ
ベルで、例えば、転写レベル、翻訳レベル、または翻訳後修飾として実施可能である。S
NCA発現を阻害する薬剤には、SNCA RNAを標的とするiRNA剤、リボザイム
、およびアンチセンス分子、ジンクフィンガータンパク質、ならびに抗体または天然に存
在するポリペプチドもしくは合成ポリペプチド、または低分子(好ましい実施形態におい
て、SNCAタンパク質に結合しかつこれを阻害するもの)が含まれる。
を標的とするiRNA剤である。このiRNA剤は、SNCA RNAのヌクレオチド配
列に相補的なアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖にハイブリダイズするために十分相補
的なセンス鎖とを有する。1つの実施形態において、このiRNA剤は、生物学的試料中
でiRNA剤を安定化する修飾を含む。例えば、修飾iRNA剤は、分解に対する感受性
がより低く、例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる切断に対する
感受性がより低い。このiRNA剤は、例えば、ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドであ
る少なくとも1つの5’−ウリジン−アデニン−3’(5’−UA−3’)ジヌクレオチ
ド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリ
ジン−グアニン−3’(5’−UG−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが2
’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−シチジン−アデニン−3’(5’−
CA−3’)ジヌクレオチド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少
なくとも1つの5’−ウリジン−ウリジン−3’(5’−UU−3’)ジヌクレオチド、
または5’−シチジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−シチジン
−シチジン−3’(5’−CC−3’)ジヌクレオチドを含み得る。このiRNA剤は、
該ジヌクレオチドを少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、または少なくと
も5個含み得る。1つの実施形態において、2’−修飾ヌクレオチドは2’−O−メチル
化ヌクレオチドである。別の実施形態において、iRNA剤はホスホロチオエートを含む
。
8、20、22、または24のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、iRN
A剤のセンス鎖は配列番号5、15、17、19、21、または23のヌクレオチド配列
を含む。なお別の実施形態において、iRNA剤のアンチセンス鎖は、配列番号6、16
、18、20、22、または24のヌクレオチド配列と部分的に一致し、例えば、少なく
とも1個、5個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、
18個、19個、20個、21個、22個、23個、または24個のヌクレオチドが一致
する。同様に、iRNA剤のセンス鎖は、配列番号5、15、17、19、21、または
23のヌクレオチド配列と部分的に一致可能であり、例えば、少なくとも1個、5個、1
0個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、2
0個、21個、22個、23個、または24個のヌクレオチドが一致可能である。
別の実施形態において、本発明のiRNA剤はSNCAの多型または突然変異を標的とす
る。例えば、本発明のiRNA剤は、SNCAのオープンリーディングフレームのコドン
におけるA53T変異、A30P変異、またはE46K変異に対応する突然変異を標的と
し得る。ある実施形態において、本発明のiRNA剤はSNCAの3’UTRまたは5’
UTRを標的とする。ある実施形態において、本発明のiRNA剤はSNCAのスプライ
シングされたアイソフォームを標的とする。例えば、本発明のiRNA剤は、128アミ
ノ酸のアイソフォームの発現をダウンレギュレーションするためにエキソン2とエキソン
4との間のスプライシングジャンクションを標的としてもよいし、またはiRNA剤が1
12アミノ酸のアイソフォームを標的とするためにエキソン4とエキソン6との間のスプ
ライシングジャンクションを標的としてもよい。
二重化または三重化)、またはParkin遺伝子もしくはユビキチンカルボキシ末端ヒ
ドロラーゼL1(UCHL1)遺伝子の遺伝的変異を有する。別の実施形態において、対
象はシヌクレイン症を有すると診断される。シヌクレイン症は、α−シヌクレインモノマ
ーの蓄積によって特徴付けられる。iRNA剤は、パーキンソン病(PD)、アルツハイ
マー病、多系統萎縮症、レーヴィ小体痴呆、または網膜障害、例えば、網膜症を有すると
診断された患者に投与可能である。
、センスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖を含み、アンチセンスRNA鎖は25ヌク
レオチド長以下であり、iRNA剤の二本鎖領域は18〜25ヌクレオチド長である。i
RNA剤は、1〜4対の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部をさらに含んで
もよく、この非対合ヌクレオチドは少なくとも1つのホスホロチオエート結合ジヌクレオ
チドを有してもよい。このヌクレオチド突出部は、例えば、iRNA剤のアンチセンス鎖
の3’末端にあってよい。
iRNA剤を特徴とする。iRNA剤は、SNCA RNAのヌクレオチド配列に相補的
なアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖にハイブリダイズするために十分相補的なセンス
鎖とを有する。1つの実施形態において、iRNA剤は生物学的試料中でiRNA剤を安
定化する修飾を含む。例えば、修飾iRNA剤は分解に対して感受性がより低く、例えば
、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性が低い。1つ
の実施形態において、iRNA剤は、ホスホロチオエート、または2’−O−メチル化(
2’−O−Me)ヌクレオチドを含む。iRNA剤は、例えば、ウリジンが2’−修飾ヌ
クレオチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−アデニン−3’(5’−UA−3’
)ジヌクレオチド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1
つの5’−ウリジン−グアニン−3’(5’−UG−3’)ジヌクレオチド、または5’
−シチジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−シチジン−アデニン
−3’(5’−CA−3’)ジヌクレオチド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレ
オチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−ウリジン−3’(5’−UU−3’)ジ
ヌクレオチド、または5’−シチジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの
5’−シチジン−シチジン−3’(5’−CC−3’)ジヌクレオチドを含み得る。iR
NA剤は、該ジヌクレオチドを少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、また
は少なくとも5個含み得る。1つの実施形態において、2’−修飾ヌクレオチドは2’−
O−メチル化ヌクレオチドである。
センスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖を含み、該アンチセンスRNA鎖は25ヌク
レオチド長以下であり、iRNA剤の二本鎖領域は18〜25ヌクレオチド長である。i
RNA剤は、1〜4対の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部をさらに含んで
もよく、この非対合ヌクレオチドは少なくとも1つのホスホロチオエート結合ジヌクレオ
チドを有してもよい。このヌクレオチド突出部は、例えば、iRNA剤のアンチセンス鎖
の3’末端にあってよい。
8、20、22、または24のヌクレオチド配列を含む(表1を参照のこと)。別の実施
形態において、本発明のiRNA剤のセンス鎖は配列番号5、15、17、19、21、
または23のヌクレオチド配列を含む(表1を参照のこと)。さらに別の実施形態におい
て、iRNA剤のアンチセンス鎖は、配列番号6、16、18、20、22、または24
のヌクレオチド配列と部分的に一致し、例えば、少なくとも1個、5個、10個、11個
、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個
、22個、23個、または24個のヌクレオチドが一致する。同様に、iRNA剤のセン
ス鎖は、配列番号5、15、17、19、21、または23のヌクレオチド配列と部分的
に一致可能であり、例えば、少なくとも1個、5個、10個、11個、12個、13個、
14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、
または24個のヌクレオチドが一致可能である。
別の実施形態において、iRNA剤は、SNCAの多型または突然変異を標的とする。例
えば、iRNA剤は、SNCAオープンリーディングフレームのコドンにおけるA53T
変異、A30P変異、またはE46K変異に対応する突然変異を標的とし得る(図1Bを
参照のこと)。ある実施形態において、iRNA剤はSNCAの5’UTRまたは3’U
TRを標的とする。ある実施形態において、iRNA剤はSNCAのスプライシングされ
たアイソフォームを標的とする。例えば、iRNA剤は、128アミノ酸のアイソフォー
ムの発現をダウンレギュレーションするためにエキソン2とエキソン4との間のスプライ
シングジャンクションを標的としてもよいし、または112アミノ酸のアイソフォームを
標的とするためにエキソン4とエキソン6との間のスプライシングジャンクションを標的
としてもよい。
において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはジンクフィンガータン
パク質を使用して遺伝子発現を阻害することが可能であり、またはSNCAポリペプチド
を標的とするために抗体もしくは低分子を使用することも可能である。SNCAの発現お
よび活性をダウンレギュレーションするために治療法を組み合わせて使用してもよい。
例えば、SNCA RNAを標的とするiRNA剤、リボザイム、またはアンチセンス核
酸、好ましくはSNCAタンパク質に結合しかつこれを阻害する抗体または天然ポリペプ
チドもしくは合成ポリペプチドあるいは低分子と、薬学的に許容可能な担体との組成物を
特徴とする。
るiRNA剤および薬学的に許容可能な担体を含む。このiRNA剤は、SNCA RN
Aのヌクレオチド配列に対して相補的なアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖にハイブリ
ダイズするために十分相補的なセンス鎖とを有する。1つの実施形態において、本発明の
薬学的組成物のiRNA剤は、生物学的試料中でiRNA剤を安定化する修飾を含む。例
えば、修飾iRNA剤は、分解に対して感受性がより低く、例えば、エキソヌクレアーゼ
またはエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性がより低い。iRNA剤は、例えば
、ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−アデニン
−3’(5’−UA−3’)ジヌクレオチド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレ
オチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−グアニン−3’(5’−UG−3’)ジ
ヌクレオチド、または5’−シチジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの
5’−シチジン−アデニン−3’(5’−CA−3’)ジヌクレオチド、または5’−ウ
リジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−ウリジン−3
’(5’−UU−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが2’−修飾ヌクレオチ
ドである少なくとも1つの5’−シチジン−シチジン−3’(5’−CC−3’)ジヌク
レオチドを含み得る。iRNA剤は、該ジヌクレオチドを少なくとも2個、少なくとも3
個、少なくとも4個、または少なくとも5個含み得る。1つの実施形態において、2’−
修飾ヌクレオチドは2’−O−メチル化ヌクレオチドである。別の実施形態において、i
RNA剤はホスホロチオエートを含む。
オチド長であり、センスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖を含み、該アンチセンスR
NA鎖は25ヌクレオチド長以下であり、iRNA剤の二本鎖領域は18〜25ヌクレオ
チド長である。該組成物のiRNA剤は、1〜4対の非対合ヌクレオチドを有するヌクレ
オチド突出部をさらに含んでもよく、この非対合ヌクレオチドは少なくとも1つのホスホ
ロチオエート結合ジヌクレオチドを有してもよい。このヌクレオチド突出部は、例えば、
iRNA剤のアンチセンス鎖の3’末端にあってよい。
号6、16、18、20、22、または24のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態に
おいて、薬学的組成物のiRNA剤のセンス鎖は配列番号5、15、17、19、21、
または23のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態において、このiRNA剤の
アンチセンス鎖は、配列番号6、16、18、20、22、または24のヌクレオチド配
列と部分的に一致し、例えば、少なくとも1個、5個、10個、11個、12個、13個
、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個
、または24個のヌクレオチドが一致する。同様に、iRNA剤のセンス鎖は、配列番号
5、15、17、19、21、または23のヌクレオチド配列と部分的に一致可能であり
、例えば、少なくとも1個、5個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、
16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、または24個のヌ
クレオチドが一致可能である。
の実施形態において、iRNA剤は、SNCAの多型または突然変異を標的とする。例え
ば、iRNA剤は、SNCAオープンリーディングフレームのコドンにおけるA53T変
異、A30P変異、またはE46K変異に対応する突然変異を標的とし得る。ある実施形
態において、iRNA剤はSNCAの3’UTRまたは5’UTRを標的とする。ある実
施形態において、iRNA剤はSNCAのスプライシングされたアイソフォームを標的と
する。例えば、iRNA剤は、128アミノ酸のアイソフォームの発現をダウンレギュレ
ーションするためにエキソン2とエキソン4との間のスプライシングジャンクションを標
的としてもよいし、または112アミノ酸のアイソフォームを標的とするためにエキソン
4とエキソン6との間のスプライシングジャンクションを標的としてもよい。別の態様に
おいて、本発明は、対象(例えば、ヒトなどの哺乳動物対象)の細胞中のSNCAまたは
SNCA RNAの量を低減する方法を特徴とする。この方法は、SNCAの発現を阻害
する薬剤と細胞を接触させる工程を包含する。阻害は、任意のレベルで、例えば、転写レ
ベル、翻訳レベル、または翻訳後修飾として実施可能である。SNCA発現を阻害する薬
剤には、SNCA RNAを標的とするiRNA剤およびアンチセンス分子、ならびに抗
体または天然に存在するポリペプチドもしくは合成ポリペプチド、または低分子(好まし
い実施形態において、SNCAタンパク質に結合しかつこれを阻害するもの)が含まれる
。
させることによって低減される。1つの実施形態において、iRNA剤は、生物学的試料
中でiRNA剤を安定化する修飾を含む。例えば、修飾iRNA剤は分解に対して感受性
がより低く、例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる切断に対して
感受性がより低い。iRNA剤は、例えば、ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少
なくとも1つの5’−ウリジン−アデニン−3’(5’−UA−3’)ジヌクレオチド、
または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリジン
−グアニン−3’(5’−UG−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが2’−
修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−シチジン−アデニン−3’(5’−CA
−3’)ジヌクレオチド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なく
とも1つの5’−ウリジン−ウリジン−3’(5’−UU−3’)ジヌクレオチド、また
は5’−シチジンが2’−修飾ヌクレオチドである5少なくとも1つの’−シチジン−シ
チジン−3’(5’−CC−3’)ジヌクレオチドを含み得る。iRNA剤は、該ジヌク
レオチドを少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、または少なくとも5個含
み得る。1つの実施形態において、2’−修飾ヌクレオチドは2’−O−メチル化ヌクレ
オチドである。別の実施形態において、iRNA剤はホスホロチオエートを含む。
号6、16、18、20、22、または24のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態に
おいて、本発明の薬学的組成物のiRNA剤のセンス鎖は配列番号5、15、17、19
、21、または23のヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態において、iRNA
剤のアンチセンス鎖は、配列番号6、16、18、20、22、または24のヌクレオチ
ド配列と部分的に一致し、例えば、少なくとも1個、5個、10個、11個、12個、1
3個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、2
3個、または24個のヌクレオチドが一致する。同様に、iRNA剤のセンス鎖は、配列
番号5、15、17、19、21、または23のヌクレオチド配列と部分的に一致可能で
あり、例えば、少なくとも1個、5個、10個、11個、12個、13個、14個、15
個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、または24個
のヌクレオチドが一致可能である。
の実施形態において、iRNA剤は、SNCAの多型または突然変異を標的とする。例え
ば、iRNA剤は、SNCAのオープンリーディングフレームのコドンにおける変異A5
3T、A30P、またはE46K変異に対応する突然変異を標的とし得る。ある実施形態
において、iRNA剤はSNCAの3’UTRまたは5’UTRを標的とする。ある実施
形態において、iRNA剤はSNCAのスプライシングされたアイソフォームを標的とす
る。例えば、iRNA剤は、128アミノ酸のアイソフォームの発現をダウンレギュレー
ションするためにエキソン2とエキソン4との間のスプライシングジャンクションを標的
としてもよいし、または112アミノ酸のアイソフォームを標的とするためにエキソン4
とエキソン6との間のスプライシングジャンクションを標的としてもよい。
センスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖を含み、該アンチセンスRNA鎖は25ヌク
レオチド長以下であり、このiRNA剤の二本鎖領域は18〜25ヌクレオチド長である
。本発明のiRNA剤は、1〜4対の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を
さらに含んでもよく、この非対合ヌクレオチドは少なくとも1つのホスホロチオエート結
合ジヌクレオチドを有してもよい。このヌクレオチド突出は、例えば、iRNA剤のアン
チセンス鎖の3’末端にあってよい。
SNCA mRNAのヌクレオチド配列から18〜25ヌクレオチド長のヌクレオチド配
列を選択する工程と、iRNA剤を合成する工程とを包含する。iRNA剤のセンス鎖は
、SNCA RNAから選択されたヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は該センス
鎖にハイブリダイズするために十分相補的である。1つの実施形態において、この方法は
、本明細書に記載されるように、対象(例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象)にiRN
A剤を投与する工程を包含する。
低分子(低分子とは、好ましくは分子量が3,000ダルトン未満、より好ましくは2,
000ダルトン未満、さらにより好ましくは1000ダルトン未満)、アンチセンス、リ
ボザイム、iRNA剤、またはタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチド、例えば、
ジンクフィンガータンパク質などの本明細書に記載される種類の薬剤(例えば、SNCA
またはSNCA核酸を標的とする薬剤)を評価する方法を特徴とする。本発明は、候補薬
剤を提供する工程と、その候補薬剤がSNCA発現を変化させる(例えば、阻害する)か
否かを、例えば、本明細書に記載の試験系のうち1つまたは複数の使用によって決定する
工程とを包含する。
程と、所定のレベルの変化が観察される場合、第2の、好ましくは異なる試験系において
該候補剤を評価する工程とを包含する。特に好ましい実施形態において、この第2の試験
系は、動物に候補薬剤を投与する工程と、該動物におけるSNCA発現に対する候補薬剤
の効果を評価する工程とを包含する。好ましい実施形態では、2つの試験系が使用され、
第1の試験系が高スループット系であり、例えば、このような実施形態において、第1ま
たは最初の試験は、第2の、好ましくは動物の系よりも、少なくとも100倍、1,00
0倍、または10,000倍多くの化合物をスクリーニングするために使用される。
))と候補薬剤を、好ましくはin vitroで接触させる工程と、相互作用、例えば
、標的への候補薬剤の結合または標的の修飾(例えば、標的内に共有結合を作製もしくは
標的内の共有結合を破壊することによる)が存在するか否かを決定する工程とを包含し得
る。修飾は、SNCA発現を変化させる能力と相関する。試験系は、細胞と候補薬剤を接
触させる工程と、SNCA発現の変化を評価する工程とを包含し得る。例えば、この試験
系は、SNCAまたはSNCA RNAを(内在性遺伝子または外来性構築物から)発現
し得る細胞と候補薬剤を接触させる工程と、SNCAまたはSNCA RNAのレベルを
評価する工程とを包含し得る。別の実施形態において、試験系は、SNCA制御領域(例
えば、マーカータンパク質(例えば、GFPなどの蛍光タンパク質)などの異種配列に連
結されたSNCA制御領域であって、その構築物は、染色体構築物でもエピソーム性構築
物のいずれでもよい)からRNAまたはタンパク質を発現する細胞と、候補薬剤を接触さ
せる工程、RNAまたはタンパク質のレベルに対する効果を決定する工程を含み得る。本
発明の試験系はまた、組織試料、例えば、脳組織試料(例えば、薄片もしくは切片)、眼
組織試料、または神経試料を含む他の試料を候補薬剤とin vitroで接触させる工
程、およびSNCAまたはSNCA RNAのレベルを評価する工程を包含し得る。本発
明の試験系は、動物にin vivoで候補薬剤を投与する工程、およびSNCAまたは
SNCA RNAのレベルを評価する工程を包含し得る。これらのいずれにおいても、S
NCA発現に対する候補薬剤の効果は、SNCA遺伝子の発現を、所定の標準、例えば、
未処理の細胞、組織、または動物などの対照と比較する工程を包含し得る。SNCA遺伝
子の発現は、例えば、候補薬剤との接触の前後で比較可能である。本発明の方法は、iR
NA剤がSNCA遺伝子の発現を阻害するために有用であるか否かを決定することを可能
にする。
方法(例えば、ノーザンブロット分析、RT−PCR、またはRNAse保護アッセイ)
またはSNCAのタンパク質レベルを調べる方法(例えば、ウェスタンブロット法)によ
って評価可能である。
えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、またはヒト以外の霊長類に投与し、この動物を薬
剤の効果についてモニターする。例えば、脳組織または眼の組織などの動物の組織を、S
NCA発現に対する薬剤の効果について調べる。該組織を、例えば、SNCA RNAお
よび/またはタンパク質の存在について調べてもよい。1実施形態では、この動物を観察
して、認知的症状の改善または安定化をモニターする。薬剤は、任意の方法によって、例
えば、経口的に、またはクモ膜下腔内もしくは実質への注射、例えば、脳への立体視によ
る注射によって動物に投与可能である。
えば、本明細書に記載のiRNA剤を評価する方法を特徴とする。この方法は、SNCA
核酸(例えば、SNCA RNA)を標的とするiRNA剤を提供する工程と;SNCA
遺伝子を含み、かつ発現可能である細胞とiRNA剤を接触させる工程と;SNCAの発
現に対するiRNA剤の効果を、例えば、SNCA遺伝子の発現を対照と比較することに
よって(例えば、細胞中で)評価する工程とを包含する。SNCA遺伝子の発現は、例え
ば、細胞とiRNA剤を接触させる前後で比較可能である。この方法により、iRNA剤
がSNCA遺伝子の発現を阻害するために有用であるか否かを決定することを可能となる
。例えば、iRNA剤が、例えば所定の基準値と比較して(例えば、細胞と該iRNA剤
を接触させる前のSNCA RNAまたはタンパク質の量と比較して)、発現を所定の量
(例えば、10%、25%、50%、75%、または90%)低減し得る場合、該iRN
A剤はSNCA遺伝子の発現を阻害するために有用であると決定可能である。SNCA遺
伝子は内在的に発現されてもよいし外来性として発現されてもよい。
治療するための方法およびiRNA剤は、本明細書に記載される任意の投薬量および/ま
たは製剤で、かつ本明細書に記載される任意の投与経路を用いて使用可能である。
含む眼組織中において見出されている。したがって、本明細書に記載される組成物および
方法は、網膜症を含むがこれに限定されない眼または眼組織のシヌクレイン症を治療する
ために適している。
を阻害する薬剤を投与することによって対象を治療する方法を特徴とする。好ましい実施
形態において、この対象はヒトなどの哺乳動物、例えば、眼のシヌクレイン症(例えば、
網膜症)を有するか、または発症するリスクがあると診断された対象である。阻害は、任
意のレベルで、例えば、転写レベル、翻訳レベル、または翻訳後修飾としてもたらされる
ことが可能である。SNCA発現を阻害する薬剤は、SNCA RNAを標的とするiR
NA剤およびアンチセンス分子、ならびに抗体または天然に存在するポリペプチドもしく
は合成ポリペプチド、または低分子(好ましい実施形態においては、SNCAタンパク質
に結合しかつこれを阻害するもの)を含む。
を標的とするiRNA剤である。該iRNA剤は、SNCA RNAのヌクレオチド配列
に相補的なアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖にハイブリダイズするために十分相補的
なセンス鎖とを有する。1つの実施形態において、iRNA剤は、生物学的試料中でiR
NA剤を安定化する修飾を含む。例えば、修飾iRNA剤は、分解に対して感受性がより
低く、例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性
がより低い。iRNA剤は、例えば、ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくと
も1つの5’−ウリジン−アデニン−3’(5’−UA−3’)ジヌクレオチド、または
5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−グア
ニン−3’(5’−UG−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが2’−修飾ヌ
クレオチドである少なくとも1つの5’−シチジン−アデニン−3’(5’−CA−3’
)ジヌクレオチド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1
つの5’−ウリジン−ウリジン−3’(5’−UU−3’)ジヌクレオチド、または5’
−シチジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−シチジン−シチジン
−3’(5’−CC−3’)ジヌクレオチドを含み得る。iRNA剤は、該ジヌクレオチ
ドを少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、または少なくとも5個含み得る
。1つの実施形態において、2’−修飾ヌクレオチドは2’−O−メチル化ヌクレオチド
である。別の実施形態において、iRNA剤はホスホロチオエートを含む。
、22、または24のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、iRNA剤のセ
ンス鎖は配列番号5、15、17、19、21、または23のヌクレオチド配列を含む。
さらに別の実施形態において、iRNA剤のアンチセンス鎖は、配列番号6、16、18
、20、22、または24のヌクレオチド配列と部分的に一致し、例えば、少なくとも1
個、5個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個
、19個、20個、21個、22個、23個、または24個のヌクレオチドが一致する。
同様に、iRNA剤のセンス鎖は、配列番号5、15、17、19、21、または23の
ヌクレオチド配列と部分的に一致可能であり、例えば、少なくとも1個、5個、10個、
11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、
21個、22個、23個、または24個のヌクレオチドが一致可能である。
別の実施形態において、iRNA剤は、SNCAの多型または突然変異を標的とする。例
えば、iRNA剤は、SNCAのオープンリーディングフレームのコドンにおけるA53
T変異、A30P変異、またはE46K変異に対応する突然変異を標的とし得る。ある実
施形態において、iRNA剤はSNCAの3’UTRまたは5’UTRを標的とする。あ
る実施形態において、iRNA剤はSNCAのスプライシングされたアイソフォームを標
的とする。例えば、iRNA剤は、128アミノ酸のアイソフォームの発現をダウンレギ
ュレーションするためにエキソン2とエキソン4との間のスプライシングジャンクション
を標的としてもよいし、112アミノ酸のアイソフォームを標的とするためにエキソン4
とエキソン6との間のスプライシングジャンクションを標的としてもよい。
二重化または三重化)、またはParkin遺伝子もしくはユビキチンカルボキシ末端ヒ
ドロラーゼL1(UCHL1)遺伝子の遺伝的変異を有する。別の実施形態において、対
象はシヌクレイン症を有すると診断される。シヌクレイン症は、α−シヌクレインモノマ
ーの蓄積によって特徴付けられる。iRNA剤は、パーキンソン病(PD)、アルツハイ
マー病、多系統萎縮症、レーヴィ小体痴呆、および網膜障害(例えば、網膜症)を有する
と診断された患者に投与可能である。
、センスRNA鎖およびアンチセンスRNA鎖を含み、該アンチセンスRNA鎖は25ヌ
クレオチド長以下であり、iRNA剤の二本鎖領域は18〜25ヌクレオチド長である。
iRNA剤は、1〜4対の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部をさらに含ん
でもよく、この非対合ヌクレオチドは少なくとも1つのホスホロチオエート結合ジヌクレ
オチドを有してもよい。このヌクレオチド突出部は、例えば、iRNA剤のアンチセンス
鎖の3’末端にあってよい。
剤またはそのフラグメントが標的遺伝子のダウンレギュレーションを仲介可能なだけ十分
な長さのヌクレオチド数を有する。したがって、このiRNA剤は、標的のRNA転写物
(例えば、SNCA転写物)に対して少なくとも部分的に、またはある実施形態において
は完全に相補的な領域であるか、またはそのような領域を含む。iRNA剤と標的との間
の完全な相補性が存在する必要性はないが、両者の一致は、iRNA剤またはその切断産
物が、例えば、標的RNA(例えば、mRNA)のRNAi切断による配列特異的サイレ
ンシングをもたらすために十分でなければならない。標的鎖との相補性、または相同性の
程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。完全な相補性が、特にアンチセンス鎖
において望まれることが多いのに対して、ある実施形態は、特にアンチセンス鎖において
、1つ以上であるが、好ましくは6、5、4、3、2個またはそれ未満の(標的RNAに
対する)ミスマッチを含み得る。特にアンチセンス鎖におけるこのミスマッチは、末端領
域において最も許容されやすく、存在する場合は、5’末端および/または3’末端から
例えば6、5、4、または3ヌクレオチド以内の末端領域中に特にあることが好ましい。
センス鎖は、分子の全体的な二本鎖の性質を維持するためにアンチセンス鎖と十分に相補
性でありさえすればよい。
はヌクレオシド代用物であり、これらのすべてが本明細書において記載されている。多数
の修飾RNAおよびヌクレオシド代用物が記載されるが、好ましい例には、非修飾RNA
よりもヌクレアーゼ分解に対して耐性の高いものが含まれる。好ましい例には、2’糖修
飾、一本鎖突出部(好ましくは3’一本鎖突出部)における修飾、または、特に一本鎖の
場合、1つまたは複数のリン酸基もしくは1つまたは複数のリン酸基アナログを含む5’
修飾を有するものが含まれる。
伝子、好ましくは内在性または病原体の標的RNAの発現をダウンレギュレーション可能
なRNA剤である。理論によって束縛されることは望まないが、iRNA剤は、当該分野
においてRNAiと呼ばれることもある標的mRNAの転写後切断、または転写前もしく
は翻訳前のメカニズムを含む多数のメカニズムのうち1つ以上によって作用する可能性が
ある。iRNA剤は、一本鎖を含んでもよいし、または二本以上の鎖を含んでもよく、例
えば、iRNA剤は二本鎖のiRNA剤であってもよい。iRNA剤が一本鎖である場合
、1つまたは複数のリン酸基または1つまたは複数のリン酸基アナログを含む5’修飾を
含むことが特に好ましい。iRNA剤は、本明細書において短い干渉RNA(siRNA
)またはdsRNAとも呼ばれる。
本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明において示
される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、この説明から、および特許請求の範囲
から明らかである。本願は、すべての引用された参考文献、特許、および特許出願の全体
を、すべての目的のために本願明細書に援用する。
例えば、本発明は以下を提供する:
(項目1)
α−シヌクレイン(SNCA)RNAのヌクレオチド配列に対して相補的なアンチセン
ス鎖、および該アンチセンス鎖に対してハイブリダイズするために十分に相補的なセンス
鎖からなる、iRNA剤。
(項目2)
生物学的試料中におけるiRNA剤の安定性の増大を引き起こす修飾を含んでなる請求
項1に記載のiRNA剤。
(項目3)
ホスホロチオエートまたは2’−OMe’修飾を含んでなる項目1に記載のiRNA
剤。
(項目4)
ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−アデニン
−3’(5’−UA−3’)ジヌクレオチド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレ
オチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−グアニン−3’(5’−UG−3’)ジ
ヌクレオチド、または5’−シチジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの
5’−シチジン−アデニン−3’(5’−CA−3’)ジヌクレオチド、または5’−ウ
リジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−ウリジン−3
’(5’−UU−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが2’−修飾ヌクレオチ
ドである少なくとも1つの5’−シチジン−シチジン−3’(5’−CC−3’)ジヌク
レオチドを含んでなる、項目1に記載のiRNA剤。
(項目5)
前記アンチセンス鎖が、配列番号6、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配
列番号22、および配列番号24からなる群から選択される配列を含んでなる、項目1
に記載のiRNA剤。
(項目6)
前記iRNA剤のセンス鎖が、配列番号5、配列番号15、配列番号17、配列番号1
9、配列番号21、および配列番号23から群から選択される配列を含んでなる、項目
1に記載のiRNA剤。
(項目7)
前記アンチセンス鎖がSNCA RNAの多型に対して相補的である配列を含んでなる
、項目1に記載のiRNA剤。
(項目8)
前記アンチセンス鎖が、SNCA RNAの5’非翻訳領域(UTR)または3’UT
Rのヌクレオチド配列に対して相補的な配列を含んでなる、項目1に記載のiRNA剤
。
(項目9)
前記iRNA剤が少なくとも21ヌクレオチド長であり、かつ該iRNAの二本鎖領域
が約18〜25ヌクレオチド長である、項目1に記載のiRNA剤。
(項目10)
dsRNAのアンチセンスRNA鎖が25ヌクレオチド長以下である、項目1に記載
のiRNA剤。
(項目11)
1〜4個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含んでなる、項目1に
記載のiRNA剤。
(項目12)
前記ヌクレオチド突出部がiRNA剤のアンチセンス鎖の3’末端にある、項目11
に記載のiRNA剤。
(項目13)
ヒトを治療する方法であって、
神経変性障害を有するか、または神経変性障害を発症するリスクがあると診断されたヒ
トを同定する工程、ならびに
α−シヌクレイン(SNCA)RNAのヌクレオチド配列に対して相補的なアンチセン
ス鎖、および該アンチセンス鎖にハイブリダイズするために十分に相補的なセンス鎖から
なるiRNA剤を投与する工程
からなる方法。
(項目14)
前記iRNA剤が、生物学的試料中における該iRNA剤の安定性の増大を引き起こす
修飾を含んでなる、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記iRNA剤がホスホロチオエートまたは2’−OMe修飾を含んでなる項目13
に記載の方法。
(項目16)
前記iRNA剤が、ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−
ウリジン−アデニン−3’(5’−UA−3’)ジヌクレオチド、または、5’−ウリジ
ンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−グアニン−3’(
5’−UG−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが2’−修飾ヌクレオチドで
ある少なくとも1つの5’−シチジン−アデニン−3’(5’−CA−3’)ジヌクレオ
チド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウ
リジン−ウリジン−3’(5’−UU−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが
2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−シチジン−シチジン−3’(5’
−CC−3’)ジヌクレオチドを含んでなる、項目13に記載の方法。
(項目17)
前記アンチセンス鎖が、配列番号6、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配
列番号22、および配列番号24からなる群から選択される配列を含んでなる、項目1
3に記載の方法。
(項目18)
前記iRNA剤のセンス鎖が、配列番号5、配列番号15、配列番号17、配列番号1
9、配列番号21、および配列番号23からなる群から選択される配列を含んでなる、請
求項13に記載の方法。
(項目19)
前記iRNA剤のアンチセンス鎖がSNCA RNAの多型に対して相補的な配列を含
んでなる、項目13に記載の方法。
(項目20)
前記iRNA剤のアンチセンス鎖がSNCA RNAの5’UTRまたは3’UTRの
ヌクレオチド配列に対して相補的な配列を含んでなる、項目13に記載の方法。
(項目21)
前記ヒトがParkin遺伝子またはユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1(U
CHL1)遺伝子中に遺伝子変異を有する、項目13に記載の方法。
(項目22)
前記ヒトがSNCAの遺伝子の多重化を有する、項目13に記載の方法。
(項目23)
ヒトがSNCAの遺伝子の二重化を有する、項目22に記載の方法。
(項目24)
ヒトがSNCAの遺伝子の三重化を有する、項目22に記載の方法。
(項目25)
前記神経変性障害がシヌクレイン症である、項目13に記載の方法。
(項目26)
前記神経変性障害がパーキンソン病である、項目13に記載の方法。
(項目27)
前記神経変性障害がアルツハイマー病、多系統萎縮症、またはレーヴィ小体痴呆である
、項目13に記載の方法。
(項目28)
前記iRNA剤が少なくとも21ヌクレオチド長であり、かつ該iRNA剤の二本鎖領
域が約18〜25ヌクレオチド長である、項目13に記載の方法。
(項目29)
前記iRNA剤のアンチセンスRNA鎖が25ヌクレオチド長以下である、項目13
に記載の方法。
(項目30)
前記iRNA剤が1〜4個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含んで
なる、項目13に記載の方法。
(項目31)
前記ヌクレオチド突出部が前記iRNA剤のアンチセンス鎖の3’末端にある、項目
30に記載の方法。
(項目32)
α−シヌクレイン遺伝子を標的とするiRNA剤、および
薬学的に許容可能な担体
からなる薬学的組成物であって、
前記iRNA剤は、α−シヌクレイン(SNCA)RNAのヌクレオチド配列に対して
相補的なアンチセンス鎖、および該アンチセンス鎖に対してハイブリダイズするために十
分に相補的なセンス鎖からなることを特徴とする、薬学的組成物。
(項目33)
前記iRNA剤が、生物学的試料中における該iRNA剤の安定性の増大を引き起こす
修飾をさらに含んでなる、項目32に記載の薬学的組成物。
(項目34)
前記iRNA剤がホスホロチオエートまたは2’−OMe修飾をさらに含んでなる、請
求項32に記載の薬学的組成物。
(項目35)
前記iRNA剤が、ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−
ウリジン−アデニン−3’(5’−UA−3’)ジヌクレオチド、または5’−ウリジン
が2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−グアニン−3’(5
’−UG−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが2’−修飾ヌクレオチドであ
る少なくとも1つの5’−シチジン−アデニン−3’(5’−CA−3’)ジヌクレオチ
ド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリ
ジン−ウリジン−3’(5’−UU−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが2
’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−シチジン−シチジン−3’(5’−
CC−3’)ジヌクレオチドを含んでなる、項目32に記載の薬学的組成物。
(項目36)
前記iRNAのアンチセンス鎖が、配列番号6、配列番号16、配列番号18、配列番
号20、配列番号22、および配列番号24からなる群から選択される配列を含んでなる
、項目32に記載の薬学的組成物。
(項目37)
前記iRNA剤のセンス鎖が、配列番号5、配列番号15、配列番号17、配列番号1
9、配列番号21、および配列番号23からなる群から選択される配列を含んでなる、請
求項32に記載の薬学的組成物。
(項目38)
前記iRNA剤がホスホロチオエートまたは2’−OMe修飾を含んでなる、項目3
2に記載の薬学的組成物。
(項目39)
前記iRNA剤が少なくとも21ヌクレオチド長であり、かつ該iRNA剤の二本鎖領
域が約18〜25ヌクレオチド長である、項目32に記載の薬学的組成物。
(項目40)
前記iRNA剤のアンチセンスRNA鎖が25ヌクレオチド長以下である、項目32
に記載の薬学的組成物。
(項目41)
前記iRNA剤が1〜4個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含んで
なる、項目32に記載の薬学的組成物。
(項目42)
前記ヌクレオチド突出部が前記iRNA剤のアンチセンス鎖の3’末端にある、項目
41に記載の薬学的組成物。
(項目43)
対象の細胞中のSNCA RNAの量を低減する方法であって、
α−シヌクレイン(SNCA)RNAのヌクレオチド配列に対して相補的なアンチセン
ス鎖、および該アンチセンス鎖に対してハイブリダイズするために十分に相補的なセンス
鎖からなるiRNA剤と細胞を接触させる工程を包含する方法。
(項目44)
前記iRNA剤が、生物学的試料中における該iRNA剤の安定性の増大を引き起こす
修飾をさらに含む、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記iRNA剤がホスホロチオエートまたは2’−OMe修飾をさらに含む、項目4
3に記載の方法。
(項目46)
前記iRNA剤は、ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−
ウリジン−アデニン−3’(5’−UA−3’)ジヌクレオチド、または5’−ウリジン
が2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリジン−グアニン−3’(5
’−UG−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが2’−修飾ヌクレオチドであ
る少なくとも1つの5’−シチジン−アデニン−3’(5’−CA−3’)ジヌクレオチ
ド、または5’−ウリジンが2’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−ウリ
ジン−ウリジン−3’(5’−UU−3’)ジヌクレオチド、または5’−シチジンが2
’−修飾ヌクレオチドである少なくとも1つの5’−シチジン−シチジン−3’(5’−
CC−3’)ジヌクレオチドをさらに含んでなる、項目43に記載の方法。
(項目47)
前記iRNA剤が、配列番号6、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番
号22、および配列番号24からなる群から選択される配列を含んでなるアンチセンス鎖
を含む、項目43に記載の方法。
(項目48)
前記iRNA剤が、配列番号5、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番
号21、および配列番号23からなる群から選択される配列を含んでなるセンス鎖を含む
、項目43に記載の方法。
(項目49)
前記iRNA剤がSNCA RNAの多型に対して相補的な配列を含んでなるアンチセ
ンス鎖を含む、項目43に記載の方法。
(項目50)
前記iRNA剤が少なくとも21ヌクレオチド長であり、かつ該iRNA剤の二本鎖領
域が約18〜25ヌクレオチド長である、項目43に記載の方法。
(項目51)
前記iRNA剤のアンチセンスRNA鎖が25ヌクレオチド長以下である、項目43
に記載の方法。
(項目52)
前記iRNA剤が1〜4個の非対合ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部を含んで
なる、項目43に記載の方法。
(項目53)
前記ヌクレオチド突出部が前記iRNA剤のアンチセンス鎖の3’末端にある、項目
52に記載の方法。
(項目54)
iRNA剤を作製する方法であって、
SNCA mRNAのヌクレオチド配列から18〜25ヌクレオチド長のヌクレオチド
配列を選択する工程、および
iRNA剤のセンス鎖が選択されたヌクレオチド配列からなり、かつアンチセンス鎖が
該センス鎖にハイブリダイズするために十分に相補的であることを特徴とするiRNA剤
を合成する工程
を含む方法。
(項目55)
前記iRNA剤を対象に投与する工程をさらに含む、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記対象がシヌクレイン症を有すると診断される、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記対象がパーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症、またはレーヴィ小体痴
呆を有すると診断される、項目55に記載の方法。
(項目58)
前記対象がヒトである、項目55に記載の方法。
(項目59)
SNCA核酸を標的とするiRNA剤を評価する方法であって、
アンチセンス配列がSNCA mRNAのヌクレオチド配列に対して相補的であり、か
つセンス鎖が該アンチセンス鎖にハイブリダイズするために十分に相補的であるiRNA
剤を供給する工程;
SNCA遺伝子を含む細胞に該iRNA剤を接触させる工程;
細胞に該iRNA剤を接触させる前と細胞に該iRNA剤を接触させた後のSNCA遺
伝子の発現を比較する工程;ならびに
該iRNA剤がSNCA遺伝子の発現を阻害するために有用であるか否かを決定する工
程であって、細胞中に存在するSNCAのRNAまたはタンパク質の量が、細胞にiRN
A剤を接触させる前の量よりも少ない場合に該iRNAが有用であることを特徴とする工
程、
を含む方法。
(項目60)
前記比較工程が、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、RT−PCR、およびRN
Ase保護アッセイからなる群から選択される方法を実行することからなる、項目59
に記載の方法。
(項目61)
SNCAの発現を阻害する能力について薬剤を評価する方法であって、候補薬剤を供給
する工程、および該薬剤が動物におけるSNCAの発現を減少させるか否かを決定する工
程を含む方法。
(項目62)
第1の試験系で薬剤を評価する前工程、および所定のレベルの変化が見られる場合には
、前記動物中で該候補薬剤を評価する工程を含む、項目61に記載の方法。
(項目63)
2つの試験系を使用し、第1の試験系が、第2の動物の系よりも少なくとも100倍多
い化合物をスクリーニングするために使用される高スループット系である、項目62に
記載の方法。
(項目64)
第1の試験系が、
SNCA標的、SNCA RNA標的、またはDNA標的と候補薬剤を接触させ、標的
との相互作用が存在するか否かを決定することを含む試験系;
細胞と候補薬物とを接触させ、SNCA発現の変化を評価することを含む試験系;
候補薬剤をin vitroで組織試料と接触させ、SNCAまたはSNCA RNA
のレベルを評価することを含む試験系
から選択される、項目62に記載の方法。
(項目65)
前記第1の系が、SNCAまたはSNCA RNAを(内在性遺伝子または外来構築物
から)発現可能な細胞と前記候補薬剤を接触させる工程、およびSNCAまたはSNCA
RNAのレベルを評価する工程を含む、項目64に記載の方法。
(項目66)
前記第1の系が、SNCA制御領域からRNAまたはタンパク質を発現可能な細胞と前
記候補薬剤を接触させる工程、およびRNAまたはタンパク質のレベルに対する効果を決
定する工程を含む、項目64に記載の方法。
(項目67)
前記第1の系が、異種マーカータンパク質に結合したSNCA制御領域からRNAまた
はタンパク質を発現可能な細胞と前記候補薬剤を接触させる工程を含む、項目64に記
載の方法。
(項目68)
前記動物を薬剤の効果についてモニターする、項目61に記載の方法。
(項目69)
脳組織または眼組織をSNCA発現に対する薬剤の効果について試験する、項目68
に記載の方法。
(項目70)
前記決定する工程が、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、RT−PCR、および
RNAse保護アッセイからなる群より選択される方法を実行することを含む、項目6
1に記載の方法。
(項目71)
前記薬剤が、低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはタンパク
質、ポリペプチド、もしくはペプチドである、項目61に記載の方法。
Aの配列特異的サイレンシングをもたらす。この過程は、哺乳動物および他の脊椎動物を
含めた、広範な種々の生物に存在する。
によるRNAサイレンシングの配列特異的メディエーターであることが実証されてきた。
理論によって束縛されることは望まないが、これらの21〜23ntフラグメント中に存
在する、特定の長さのフラグメントにすぎない分子シグナルが、RNAiを仲介する細胞
因子を発動している可能性がある。本明細書に記載されるものは、これらの21〜23n
tフラグメントおよび他のiRNA剤を調製および投与するための方法、ならびに遺伝子
の機能、および特にSNCA遺伝子の機能を特異的に不活性化するための、前記21〜2
3ntフラグメントおよび他のiRNA剤の使用についてである。iRNA剤(または同
一もしくは類似の性質を有する組換え生産もしくは化学合成されたオリゴヌクレオチド)
の使用により、哺乳動物細胞中でサイレンシングするために特定のmRNAを標的とする
ことが可能となる。さらに、より長いdsRNAフラグメントも、例えば以下に記載され
るように使用可能である。
答を誘導し得るが、短いdsRNA(sRNA)は、少なくとも細胞および宿主に対して
有害なほどはインターフェロン応答を誘発しない。特に、sRNA剤中のiRNA剤の鎖
の長さは、例えば、有害なインターフェロン応答を誘導しないように十分に短く、31、
30、28、25、または23nt未満であり得る。したがって、哺乳動物細胞へのsR
NA剤の組成物(例えば、本明細書に記載されるように製剤化された組成物)の投与は、
インターフェロン応答を回避しながら標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用
され得る。さらに、個別の種類のiRNA剤の使用により、例えば、対立遺伝子について
ヘテロ接合の対象において、標的遺伝子の一方の対立遺伝子を選択的に標的とすることが
可能である。
(例えば、dsRNAで活性化されるプロテインキナーゼPKR)を破壊するiRNA剤
で処理される。このような細胞は、標的RNAに相補的な配列を含み、前記処理がなけれ
ばインターフェロン応答を誘発しうる長さを有する第2のiRNA剤で処理することがで
きる。
、または霊長類などの哺乳動物である。より好ましい実施形態において、対象はヒトであ
り、例えば、健常人、あるいは疾患もしくは障害を有するか、疾患もしくは障害を有する
と診断されるか、または疾患もしくは障害を有する素因がある人である。特に、ヒトはS
NCA遺伝子の過剰発現と関連した疾患もしくは障害、またはα−シヌクレインタンパク
質の凝集によって特徴付けられる疾患もしくは障害を有し得る。
続し得るので、多くの場合において、組成物の投与は1日当たり1回未満の頻度とするこ
とが可能であり、また場合によっては、治療計画全体について1回のみとすることが可能
である。
α−シヌクレインタンパク質は主として細胞質中に見出されるが、核へも局在化してい
る。ドーパミン作動性ニューロンにおいては、α−シヌクレインは膜結合型である。この
タンパク質は、軸索のシナプス前部領域に通常局在している可溶性モノマーである。この
タンパク質は、神経変性シヌクレイン症における細胞内容物の主要な成分であるフィラメ
ント状凝集物を形成し得る。
関連がある。3つの点突然変異(A53T、A30P、およびE46K)、ならびにSN
CAの二重化現象および三重化現象は、常染色体優性のパーキンソン病(家族性PD、F
PDとも呼ばれる)と関連がある。A53T変異およびA30P変異は、in vitr
oにおけるプロトフィブリル形成を促進するSNCAタンパク質の立体構造の変化を引き
起こす。三重化現象は、SNCAタンパク質の2倍の過剰発現を生じる。α−シヌクレイ
ンは、FPDおよび特発性PDに特徴的な細胞質内容物であるレーヴィ小体の主要な線維
成分であり、そしてパーキンソン病の脳の黒質は、線維状のα−シヌクレインを特徴とし
ている。アルツハイマー病患者においては、SNCAペプチドは、アルツハイマー病を有
する患者の脳におけるアミロイドプラークの主要な成分である。
質分解の阻害、または該タンパク質の構造に影響を与える突然変異を含む多数のメカニズ
ムによって引き起こされる可能性があり、このタンパク質が自己会合する傾向を増大させ
ている。
この治療方法は、iRNA剤を用いてSNCA核酸を標的とすることを含み得る。代替例
として、または加えて、遺伝子発現を阻害するためにアンチセンスRNAを使用してもよ
いし、または抗体もしくは低分子を使用してSNCA核酸を標的としてもよい。一般的に
、アンチセンスRNA、抗SNCA抗体、または低分子は、例えば、本明細書に記載され
る任意の方法または組成物によって、iRNA剤の代わりに使用可能である。SNCAの
発現および活性を下方制御するための治療の組み合わせも使用可能である。
)を含む共通のバリアントが明らかになった。REP1は集団間で長さが異なり、かつ特
定の対立遺伝子バリアントはPDのリスクの増加と関連している(クルーガーら(Kru
eger et al.)、Ann Neurol.第45巻、611〜7ページ、19
99年)。SNCAのREP1遺伝子座は、正常な遺伝子発現のために必要である(タッ
チマンら(Touchman et al.)、Genome Res.第11巻、78
〜86ページ、2001年)。異なるREP1の対立遺伝子間のSNCA遺伝子発現のレ
ベルは、3倍の範囲にわたって有意に変化し、このことは、特定の遺伝子型とPDのリス
ク増加との関連性がSNCAの遺伝子の過剰発現の結果である可能性があることを示唆し
ている(チバ−ファレック(Chiba−Falek)およびヌスバウム(Nussba
um)、Hum Mol Genet.第10巻、3101〜9ページ、2001年)。
SNCA遺伝子のREP1遺伝子座における対立遺伝子内バリエーションの機能的分析は
、対立遺伝子の全体の長さが転写調節において主要な役割を果たすことを暗示し;配列が
不均一性であっても、長さにより規定される対立遺伝子に基づく遺伝学的関連研究を混乱
させることはなさそうである(チバ−ファレックら(Chiba−Falek et a
l.)、Hum Genet.第113巻、426〜31ページ、2003年)。PDの
まれな原因としてのSNCA遺伝子三重化という最近の発見は、該遺伝子のプロモーター
中の多型が、遺伝子の過剰発現の同じメカニズムを介して感受性を付与するという観察と
一致している(シングレトンら(Singleton et al.)、Science
第302巻、841ページ、2003年)。
全長140アミノ酸型のタンパク質が最も豊富である。128アミノ酸型はエキソン3を
欠き、そして112アミノ酸型はエキソン5を欠く。本発明のiRNAは、SNCAのあ
らゆるアイソフォームを標的とし得る。iRNAは、すべての既知のアイソフォームを効
果的に標的とするために共通のエキソン(例えば、エキソン2、4、6、または7)を標
的とし得る。iRNA剤はスプライシングジャンクションを標的としてもよいし、または
特定のアイソフォームを標的とするために選択的スプライシングを受けるエキソンを標的
としてもよい。例えば、112アミノ酸のアイソフォームを標的とするために、iRNA
剤は、エキソン4/エキソン6のスプライシングジャンクションと部分的に一致するmR
NA配列を標的とし得る。128アミノ酸のタンパク質アイソフォームを標的とするため
に、iRNA剤は、エキソン2/エキソン4ジャンクションと部分的に一致するmRNA
配列を標的とし得る。
PD(または任意の他のα−シヌクレイン関連障害)を有する任意の患者が、本明細書
に記載される方法または組成物を用いる治療のための候補である。好ましくは、患者は末
期ではなく(例えば、患者は2年間以上の平均余命を有する)、そして好ましくは、患者
はパーキンソン病の最終段階(すなわち、ホーン(Hoehn)およびヤール(Yahr
)の段階5)には達していない。
チセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ジンクフィンガータンパク質、抗体、または
低分子)を用いる治療のための候補であり得る。1つの実施形態において、前駆症状を有
する候補は、リスク−要因プロファイリングおよび機能的神経画像化(例えば、フルオロ
ドーパおよびポジトロン放出断層撮影による)のいずれかまたは両方によって同定される
。例えば、この候補は、リスク−要因プロファイリング、その後の機能的神経画像化によ
って同定可能である。
は、その患者がPDを発症するリスクを増大させる特定の遺伝子変異を有する。例えば、
SNCA遺伝子多重化(例えば、SNCA遺伝子の二重化または三重化)を有する個体は
、PDを発症するリスクが増大しており、iRNA剤を用いる治療のための候補である。
さらに、SNCAにおける機能獲得性突然変異(gain-of-function mutation )は、個体
がPDを発症するリスクを増大させ得る。SNCA REP1遺伝子型(例えば、REP
1「+1対立遺伝子」のヘテロ接合またはホモ接合の遺伝子型)を有する個体は、このよ
うな治療のための候補であり得る。REP1+1対立遺伝子についてホモ接合の個体はS
NCAを過剰発現する。UCHL−1、parkin、またはSNCAの遺伝子における
突然変異を有する個体は、PDのリスクが増大しており、かつ抗SNCA iRNA剤を
用いる治療のための候補であり得る。特に、UCHL−1遺伝子またはparkin遺伝
子における突然変異は、遺伝子またはタンパク質の活性の減少を引き起こす。Tau遺伝
子型(例えば、Tau遺伝子における突然変異)またはTauハプロタイプ(例えば、H
1ハプロタイプなど)を有する個体もまた、PDを発症するリスクを有している。他の遺
伝的なリスク因子には、遺伝子MAPT、DJ1、PINK1、およびNURR1におけ
る突然変異、および遺伝子SNCA、parkin、MAPT、およびNAT2を含むい
くつかの遺伝子における多型が含まれる。
歳、40歳、45歳、または50歳を超える年代)、性別(男性は一般的に女性よりも高
いリスクを有する)、除草剤への曝露、重金属への曝露、および頭部の外傷が含まれる。
一般的に、ユビキチンプロテアソーム経路を破壊する、もしくはより特異的にプロテアソ
ームを阻害する、またはミトコンドリア機能を破壊する、または酸化的ストレスを生じる
、またはα−シヌクレインの凝集および繊維化を促進する内在性および外因性の因子が、
ヒトがPDを発症するリスクを増大させる可能性があり、かつPDの病因に寄与し得る。
的とするために使用可能である。
他の神経変性障害の治療
シヌクレイン症によって特徴付けられる任意の疾患(多系統萎縮症、レーヴィ小体痴呆
、およびアルツハイマー病を含む)が、本明細書に記載される阻害剤(例えば、SNCA
を標的とする薬剤)を用いて治療可能である。あらゆる遺伝子型の個体が治療のための候
補である。ある実施形態において、患者は、シヌクレイン症発症リスクを増大させる特定
の遺伝子突然変異を有する。
Aを標的とするために使用可能である。
個体が、特定の環境因子の結果としてシヌクレイン症を発症する可能性がある。例えば
、酸化的ストレス、特定の除草剤(例えば、24Dおよびオレンジ剤)、細菌感染、およ
び頭部外傷は、PDを発症するリスクの増加と関連付けられており、シヌクレイン症につ
いての個体のリスクを決定する決定要因であり得る。これらの要因(および本明細書に開
示される他の要因)は、抗SNCA治療についての候補対象のリスクプロファイルを評価
する際に考慮されうる。
候補iRNA剤は、遺伝子ウォーキング分析を実行することによって設計可能である。
転写される領域の全体または一部に対応する、重複し、隣接し、または近接しているが間
隔のあいた複数の候補薬剤を作製し試験することが可能である。各iRNA剤について、
標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションする能力に関して試験および評価することが
可能である(後述する「候補iRNA剤の評価」を参照のこと)。
、iRNA剤は、候補二重鎖の相対的融解温度に従って設計可能である。一般的に、二重
鎖は、アンチセンス鎖の3’末端よりもアンチセンス鎖の5’末端において低い融解温度
を有することになる。合理的設計についてのこの要素および他の要素は、以下においてよ
り詳細に議論される(例えば、「パリンドローム」「非対称性」および「Z−X−Y」、
ならびに「二本鎖末端安定性の差次的修飾」および「ワトソン−クリック以外の対合」と
記された節を参照のこと)。
を有し得る。特に、iRNA剤は、SNCA2、7(もしくは7s)、または8(もしく
は8s1もしくは8s2)の配列を有するとよいが、これらは、in vivoおよびi
n vitroにおいてSNCA遺伝子をサイレンシングするために最も有効であること
が見出された。
抗SNCA iRNA剤候補は、SNCA遺伝子の発現をダウンレギュレーションする
能力について評価可能である。例えば、候補iRNA剤が提供され、かつSNCA遺伝子
を発現する細胞と接触させることが可能である。候補iRNA剤との接触の前後のSNC
A遺伝子の発現レベルが比較可能である。標的SNCA遺伝子は、細胞中の、内在性遺伝
子でも外来遺伝子でもよい。SNCA遺伝子から発現されるRNAまたはタンパク質の量
がiRNA剤との接触後に低くなることが測定されれば、該iRNA剤がSNCA遺伝子
の発現をダウンレギュレーションすると結論付けることができる。細胞中のSNCA R
NAまたはタンパク質のレベルは、所望される任意の方法によって決定可能である。例え
ば、SNCA RNAのレベルは、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応と共役
した逆転写反応(RT−PCR)、またはRNAse保護アッセイによって決定可能であ
る。タンパク質のレベルはウェスタンブロット分析によって決定可能である。
れかにおいて試験可能である。例えば、標的遺伝子またはそのフラグメントを、プラスミ
ド上のレポーター遺伝子に融合させることが可能である。このプラスミドで、iRNA剤
候補とともに細胞をトランスフェクションすればよい。iRNA剤の効力は、レポーター
遺伝子の発現をモニターすることによって評価可能である。このレポーター遺伝子は、例
えば、蛍光またはin situハイブリダイゼーション法などによってin vivo
でモニター可能である。例示的な蛍光レポーター遺伝子には、緑色蛍光タンパク質および
ルシフェラーゼが含まれるがこれらに限定されない。レポーター遺伝子の発現は、上記の
ような、ノーザンブロット、RT−PCR、RNAse保護アッセイ、またはウェスタン
ブロット分析によってモニターすることもできる。
)、例えばヒト神経芽細胞腫の細胞株などにおいて試験可能である。例えば、抗SNCA
iRNA剤の効力を試験するために有用な細胞株は、ニューロン性の表現型を有するも
の(神経芽細胞腫、ニューロンに分化した褐色細胞腫、および初代ニューロン培養物)ま
たは非ニューロン性の細胞株(例えば、腎臓、筋肉、または卵巣の細胞)である。神経芽
細胞腫の細胞株には、BE(2)−M17、SH−SY5Y(いずれもヒト)、およびN
2a(マウス)が挙げられる。BE(2)−M17細胞は、α−シヌクレイン症に罹患し
たヒト脳のドーパミン作動性ニューロンを生化学的に模倣する。
(1)例えば、内在性または外来の、標的ではない(オフターゲットの)RNAまたは
タンパク質の発現と比較することによって、標的遺伝子の発現の減少についてアッセイし
、iRNAの効力および特異性を試験すること;および
(2)「非機能性の」iRNA剤を投与することによって、標的遺伝子の発現に対する
効果の特異性を試験すること
が含まれる。
(a)細胞中で発現されない遺伝子を標的とするもの;
(b)ナンセンス配列(例えば、試験iRNAを乱雑化(スクランブル)したもの)で
あるもの;または
(c)標的遺伝子に対して相補的な配列を有するが、遺伝子発現をサイレンシングする
能力を欠くことが事前の実験によってわかっているもの
であってよい。
るための、かつ分裂中の細胞と分裂していない細胞とを比較してモニターするための経時
的実験が含まれる。おそらく、分裂中の細胞においては、dsRNAは時間の経過ととも
に希釈され、したがってサイレンシング効果の期間が減少する。この意味するところは、
in vivoでは投薬量を調整しなければならないこと、および/またはサイレンシン
グ効果を維持するためにiRNA剤をより頻繁に投与しなければならないことである。分
裂していない細胞をモニターするためには、血清の使用を中止して細胞を分裂停止させれ
ばよい。ニューロンは分裂終了細胞であり、したがって神経細胞は、神経系の障害(例え
ば、神経変性障害)の治療のための治療用組成物において使用するためのiRNA剤(例
えば、抗SNCA iRNA剤)の安定性をアッセイするために適している。
なる種(例えば、マウス対ヒト)から誘導された細胞株、または異なる種から単離された
生物学的試料(例えば、血清または組織抽出物)を、標的iRNA剤および候補iRNA
剤でトランスフェクションすることが可能である。異なる種由来の細胞についてiRNA
剤の効力を決定すればよい。
候補のiRNA剤は、該iRNA剤が対象の身体に導入される場合などの、エンドヌク
レアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断に対する感受性に関して評価することがで
きる。修飾、特に切断(例えば、対象の体内に見出される成分による切断)に感受性を有
する部位を同定するための方法を利用可能である。この成分(例えば、エキソヌクレアー
ゼまたはエンドヌクレアーゼ)は、特定の組織、器官、または体液(例えば、血液、血漿
、または血清)などの身体の特定の領域に特異的であり得る。身体の特定の領域における
エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断のいずれかに感受性を有する、
iRNA剤中の部位は、身体の他の領域における切断に対しては耐性である可能性がある
。例示的な方法には:
(1)対象の体内に存在する物質、および好ましくは治療用dsRNAが導入される身
体のコンパートメント(治療剤が直接導入されるコンパートメント(例えば、循環系)な
らびに治療剤が最終的に標的とするコンパートメントがあるが、場合によっては(例えば
、眼および脳)、2つのコンパートメントは同じである))中に存在する成分が、dsR
NA(例えば、iRNA剤)を切断する時点を決定する工程、および
(2)dsRNA中の、(例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、または
その両方による)1つまたは複数の切断部位を同定する工程
が含まれる。任意選択で、この方法はさらに、このような部位における切断を阻害するた
めに修飾されたRNAを提供する工程を包含する。
る。
(i)(a)候補のdsRNA剤(例えば、iRNA剤)を試験物質(例えば、生体物
質)と接触させる工程、
(b)サイズに基づくアッセイ(例えば、ゲル電気泳動)を使用して、iRNA剤が
切断されるか否かを決定する工程。好ましい実施形態では、経時変化が測定され、異なる
時間インキュベートされた多数の試料がサイズに基づくアッセイに供される。好ましい実
施形態では、候補のdsRNAは標識されない。この方法は、「全体を染色する(sta
ins all)」方法であり得る。
;
(b)試験物質と候補dsRNAを接触させる工程、
(c)サイズに基づくアッセイ(例えば、ゲル電気泳動)を使用して、iRNA剤が
切断されるか否かを決定する工程。好ましい実施形態では、経時変化が測定されるが、そ
の場合は多数の試料が異なる時間インキュベートされてサイズに基づくアッセイに供され
る。好ましい実施形態において、測定は、フラグメント中に存在するヌクレオチド数の決
定が可能な条件下でなされる。例えば、インキュベートされた試料は、切断産物の長さを
決定可能にするマーカーを有するゲルで泳動される。このゲルは、「ラダー」状の消化物
である標準品を含んでもよい。センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを標識してもよ
い。好ましくは、一方の鎖のみが特定の実験において標識される。標識は、5’末端、3
’末端、または内部の位置に組み込むことが可能である。フラグメントの長さ(およびし
たがって切断部位)は、上記のラダー、およびRNAse T1などの部位特異的エンド
ヌクレアーゼを用いたマッピングに基づくフラグメントのサイズから決定可能である。
量分析法によって分析可能である。試験物質とiRNA剤を接触させた後、iRNA剤を
、例えば、フェノール−クロロホルム抽出とその後の沈殿処理によって精製(例えば、部
分精製)可能である。次いで、液体クロマトグラフィーを使用してフラグメントを分離可
能であり、そして質量分析法を使用して各フラグメントの分子量を決定することができる
。このことにより、切断のメカニズム、例えば、5’または3’エキソヌクレアーゼ切断
などの直接的なリン酸の切断によるか、または環状リン酸の形成を介して2’OHによっ
て仲介されるかを決定することができる。
る。この評価を用いて、治療用iRNA剤に使用する配列を選択することが可能である。
例えば、評価することによって、対象の体内の関連するコンパートメント中に存在する物
質(例えば、酵素)によって切断される最適な(通常最小の)数の部位を有する配列を選
択することが可能になる。最適化された配列を選択するために、2つ以上のdsRNA候
補を評価すればよい。例えば、2つ以上の候補を評価し、最適な特性を有するもの(例え
ば、切断部位がより少ないもの)を選択することが可能である。
クボーンの原子、糖、または塩基を選択するために使用可能である。
例示的な修飾には、本明細書に記載される修飾などの、エンドヌクレアーゼによる分解
を阻害する修飾が含まれる。特に好ましい修飾には:2’−修飾、例えば、センス鎖また
はアンチセンス鎖(とりわけセンス鎖)のUへの2’OMe部分の付与;バックボーンの
修飾、例えば、リン酸バックボーン内のOのSへの置換を伴う修飾、例えば、特にアンチ
センス鎖のUまたはAまたはその両方へのホスホロチオエート修飾の付与;UからC5ア
ミノリンカーへの置換;AからGへの置換(配列の変化はセンス鎖上に配置されアンチセ
ンス鎖上には配置されないことが好ましい);および2’位、6’位、7’位、または8
’位の修飾、が含まれる。好ましい実施形態は、これらの修飾のうち1つ以上がセンス鎖
上に存在するがアンチセンス鎖上には存在しない実施形態、またはアンチセンス鎖が有す
るこのような修飾がより少ない実施形態である。
ヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は本明細書において見出され得る。特に好ま
しい修飾には:2’−修飾、例えば、3’突出部の例えば3’末端(3’末端とは、文脈
から示されるように、分子の3’位の原子または最も3’側の構成部分、例えば最も3’
側のPまたは2’位を意味する)への2’OMe部分の付与;バックボーンの修飾、例え
ば、PからSへの置換を伴う修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾の付与、または3’
突出部の例えば、3’末端におけるメチル化Pの使用;2’−修飾の組み合わせ、例えば
、2’OMe部分およびバックボーンの修飾(例えば、PからSへの置換を伴う修飾、例
えば、ホスホロチオエート修飾の供給、または3’突出部の例えば3’末端におけるメチ
ル化Pの使用)の付与;3’アルキルを用いる修飾;3’突出部の例えば3’末端におけ
る脱塩基ピロリジンを用いる修飾;ナプロキセン、イブプロフェン、または分解を阻害す
る他の部分を用いる3’末端の修飾、が挙げられる。
に使用可能である。
該方法は、修飾されていない候補dsRNA、または修飾(例えば、分解を阻害する修
飾、dsRNA分子を標的化する修飾、またはハイブリダイゼーションを調節する修飾)
を含む候補dsRNA(例えば、候補iRNA剤)を評価するために使用可能である。こ
のような修飾は本明細書に記載されている。切断アッセイは、修飾または非修飾候補の標
的をサイレンシングする能力を決定するためのアッセイと組み合わせることが可能である
。例えば、標的(または標的でない配列)をサイレンシングする能力を評価するために候
補を(任意選択で)試験してもよいし、切断に対する感受性を評価してもよいし、修飾候
補を作製するために候補dsRNAを(例えば、本明細書に記載されるように、例えば、
分解を阻害するために)修飾してもよいし、サイレンシング能力および分解に抵抗する能
力のうち一方または両方について修飾体を試験してもよいであろう。この手法を繰り返し
ても良い。修飾は、一度に1つ導入してもよいし、まとめて導入してもよい。iRNA剤
がサイレンシングする能力をモニターするために、細胞を用いる方法を使用することもで
きる。これに続いて、活性を確認するために、異なる方法、例えば、動物全体を用いる方
法を実施可能である。
dsRNAを修飾(例えば、切断)することが知られている既知の酵素またはその他の分
子(例えば、エンドヌクレアーゼ)をいう。試験物質は、RNAi剤が曝露されることに
なる体内コンパートメントに存在し得る。例えば、神経組織に(例えば、脳または脊髄に
)直接的に投与されるiRNA剤については、試験物質は脳組織抽出物または脊髄液であ
り得る。眼に直接的に供給されるiRNA剤は、眼の抽出物とともにインキュベートすれ
ばよい。
SNCA遺伝子の発現を阻害することができると同定されたiRNA剤は、動物モデル
(例えば、マウスまたはラットなどの哺乳動物のモデル)においてin vivoでの機
能性について試験可能である。例えば、iRNA剤を動物に投与して、該iRNA剤の生
体内分布、安定性、およびSNCA遺伝子の発現を阻害する能力に関して評価可能である
。
投与されるのと同じ様式で動物モデルに投与されてもよい。例えば、iRNA剤が脳の標
的領域に(例えば、皮質、黒質、淡蒼球、または海馬に)直接注射され、一定時間の後に
脳が採取され組織薄片が薬剤の分布について試験されてもよい。
剤が細胞に取り込まれたか否かを決定することを包含し得る。この評価は、iRNA剤の
安定性(例えば、半減期)を決定することを包含し得る。in vivoでのiRNA剤
の評価は、追跡可能なマーカー(例えば、フルオレセイン[その他]などの蛍光マーカー
;32P、33P、もしくは3Hなどの放射活性標識;金粒子;または免疫組織化学法の
ための抗原粒子)と複合体化されたiRNA剤の使用によって容易となりうる。
レンシング活性を欠いていてもよい。例えば、iRNA剤は、その動物には存在しない遺
伝子を標的としてもよく(例えば、マウスに注射されるiRNA剤がルシフェラーゼを標
的としていてもよい)、またはiRNA剤がいかなる遺伝子も(例えば、内在性のいかな
る遺伝子も)標的としないナンセンス配列を有していてもよい。
上記の追跡可能な薬剤などによってモニター可能である。
iRNA剤は、SNCA発現をダウンレギュレーションする能力に関して評価可能であ
る。in vivoでのSNCA発現のレベルは、例えばin situハイブリダイゼ
ーションによって、またはiRNA剤に曝露させる前後に組織からRNAを単離すること
によって測定可能である。SNCA RNAは、RT−PCR、ノーザンブロット、また
はRNAase保護アッセイを含むがこれらに限定されない任意の所望の方法によって検
出可能である。代替として、または追加として、SNCA遺伝子の発現を、抗SNCA
iRNA剤で処理された組織抽出物についてウェスタンブロット分析を実行することによ
ってモニターすることが可能である。
ルは、例えば、ヒトSNCA遺伝子の野生型コピーを有するマウス(マスリアら(Mas
liah et al.)、Science 第287巻、1265〜1269ページ、
2000年)、または変異型ヒトSNCAを有するマウス(リッチフィールドら(Ric
hfield et al.)、Exp.Neurol.第175巻、35〜48ページ
、2002年;ジアソンら(Giasson et al.)、Neuron 第34巻
、521〜533ページ、2002年;リーら(Lee et al.)、Proc N
atl Acad.Sci.第99巻、8968〜8973ページ、2002年)である
。上記変異型マウスは、A53T変異、A30P変異、またはE46K変異を発現するヒ
トSNCA遺伝子を有していてもよい。治療処理されたマウスモデルを、PDに関連する
症状の減少について観察すればよい。
RNAiを仲介する単離iRNA剤(例えば、RNA分子(二本鎖;一本鎖))が本明
細書中に記載される。このiRNA剤は、対象者の内在性SNCA遺伝子に関連するRN
Aiを好適に仲介する。
ションを仲介することが可能であるように、標的遺伝子に対して十分な相同性の領域を含
み、かつヌクレオチドの長さが十分であるべきである。(説明を簡略化するために、本明
細書中では、用語ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、RNA剤の1つ以上のモノマ
ーサブユニットを指すために使用されることがある。本明細書中において、用語「リボヌ
クレオチド」または「ヌクレオチド」を使用するとき、修飾RNAまたはヌクレオチド代
用物の場合においては、修飾ヌクレオチド、または1つ以上の位置での代用物で置換した
部分をも意味し得ることが本明細書中で理解されよう。)したがって、iRNA剤は、少
なくとも部分的に、およびある実施形態においては完全に、標的RNAに相補的な領域で
あるか、またはその領域を含む。iRNA剤と標的との間の完全な相補性が存在すること
は必ずしも必要ではないが、その一致は、iRNA剤またはその切断産物が、例えば、標
的RNA(例えば、mRNA)のRNAi切断によって、配列特異的に発現を抑制するこ
とを可能にするために十分でなくてはならない。
特に、アンチセンス鎖における完全な相補性が望ましいことが多いが、ある実施形態は、
特にアンチセンス鎖において、1つ以上であるが好ましくは6個、5個、4個、3個、2
個、またはそれより少ないミスマッチ(標的RNAに関して)を含むことが可能である。
特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域において最も寛容性が高く、存在す
る場合、好ましくは末端領域において、例えば、5’末端および/または3’末端の6ヌ
クレオチド以内、5ヌクレオチド以内、4ヌクレオチド以内、または3ヌクレオチド以内
である。センス鎖は、該分子の二本鎖全体の性質を維持するために十分なだけのアンチセ
ンス鎖との相補性があればよい。
、例えば、ヘアピン構造の対合していない領域(例えば、2つの相補性領域をつなぐ領域
)は、修飾またはヌクレオシド代用物を有し得る。iRNA剤の3’末端もしくは5’末
端のうち一方または両方を、例えば、エキソヌクレアーゼに対して安定化するために修飾
すること、またはアンチセンスsRNA剤をRISCに優先的に入れるための修飾するこ
とも好ましい。修飾は、C3(またはC6、C7、C12)アミノリンカー、チオールリ
ンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチド性スペーサー(C3、C6、C9、C1
2、無塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール)、特殊なビオチン、
あるいは、ホスホルアミダイトとして提供され、かつ別のDMT保護されたヒドロキシル
基を有し、RNA合成の際に複数のカップリングを可能にするフルオレセイン試薬を含む
ことが可能である。本明細書中の他所で議論するように、iRNA剤は修飾されるか、ま
たはヌクレオチド代用物に加えてリボース置換モノマーサブユニット(RRMS)を含む
ことが多いであろう。RRMSはリボヌクレオチドのリボース糖を、別の部分、例えば糖
質以外の(好ましくは環式の)担体で置換する。RRMSについては後に詳細に説明する
。
長い分子(これはダイサー(Dicer、ベルンシュタインら(Bernstein e
t al.)、2001.Nature、409:363〜366)によって切断され、
RISC(RNAi誘導性サイレンシング複合体)に入る);およびインターフェロン応
答を誘発しないために十分に短い分子(この分子もまたDicerによって切断されるこ
とが可能であり、かつ/またはRISCに入る)、例えば、RISCに入ることを可能に
するサイズである分子、例えば、Dicer切断産物に類似する分子。インターフェロン
応答を誘発しない十分に短い分子は、本明細書中では、sRNA剤または短いiRNA剤
と呼ばれる。「sRNA剤または短いiRNA剤」は、本明細書中で使用される場合、i
RNA剤、例えば、ヒト細胞において有害なインターフェロン応答を誘導しない十分に短
い二本鎖RNA剤または一本鎖RNA剤をいい、例えば、同RNA剤は、60ヌクレオチ
ド対未満、しかし好ましくは、50、40、または30ヌクレオチド対未満の二本鎖領域
を有する。このsRNA剤またはその切断産物は、例えば、標的RNA(好ましくは、内
在性または病原性の標的RNA)に関してRNAiを誘導することによって、標的遺伝子
をダウンレギュレーションすることが可能である。
チド長以下であり得る。鎖は、好ましくは、少なくとも19ヌクレオチド長である。例え
ば、各々の鎖は21から25の間のヌクレオチド長であり得る。好ましいsRNA剤は、
17、18、19、29、21、22、23、24、または25ヌクレオチド対の二本鎖
、および1つ以上の突出部、好ましくは2〜3ヌクレオチドの1つまたは2つの3’突出
部を有する。
て、iRNA剤は好ましくは以下の特性の1つ以上を有する:
(1)以下の「RNA剤」の節において示される式1、2、3、または4のものである
;
(2)一本鎖である場合、1つ以上のリン酸基または1つ以上のリン酸基アナログを含
む5’修飾を有する;
(3)非常に多数またはすべてのヌクレオシドが修飾されているにもかかわらず、正確
な塩基対を形成可能であり、例えば標的RNAの切断によって標的のダウンレギュレーシ
ョンを可能にするために十分な、相同な標的RNAとの二本鎖構造を形成することが可能
なように、正しい三次元構造にある塩基(または修飾塩基)を提供することが可能なアン
チセンス鎖を有する;
(4)非常に多数またはすべてのヌクレオシドが修飾されているにもかかわらず、なお
「RNA様の」特性を有する。すなわち、リボヌクレオチドに基づく含量では独占的でな
く、または部分的でさえあるにも関わらす、RNA分子の全体的な構造、化学的特性およ
び物理的特性を有する。例えば、iRNA剤は、例えば、すべてのヌクレオチド糖が2’
ヒドロキシルの代わりに例えば2’フルオロを含むセンス鎖および/またはアンチセンス
鎖を含むことが可能である。このデオキシリボヌクレオチド含有剤は、なおRNA様の特
性を示すことが予測されうる。理論によって束縛されることを望まないが、電気的に陰性
のフッ素は、リボースのC2’位に結合されたときに軸方向に配向する傾向がある。この
フッ素の空間的な優先傾向は、ひいては、糖のC3’内部にくぼみを形成させる。これは
、RNA分子中で観察されるのと同じくぼみ形成様式であり、RNAに特徴的なAファミ
リー型ヘリックスを生じる。さらに、フッ素は良好な水素結合のアクセプターであるので
、RNA構造を安定化させることが知られている水分子と同じ水素結合相互作用に関与す
ることが可能である。一般的には、糖の2’位で修飾された部分は、デオキシリボヌクレ
オチドのH部分よりも、リボヌクレオチドのOH部分により特徴的であるH結合に入るこ
とができることが好ましい。好ましいiRNA剤は:その糖の全体、またはその糖の少な
くとも50、75、80、85、90、または95%において、C3’内部にくぼみを示
し;iRNA剤の十分量の糖においてC3’内部のくぼみを示し、RNAに特徴的なAフ
ァミリー型ヘリックスを生じることが可能であり;C3’内部のくぼみ構造ではない20
個、10個、5個、4個、3個、2個、または1個以下の糖を有する。これらの制限はア
ンチセンス鎖において特に好ましい;
(5)修飾の性質にかかわらず、およびRNA剤が、特に突出部または他の一本鎖領域
内にデオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含むことが可能であるとし
ても、DNA分子、あるいは、分子中のヌクレオチドの50、60、もしくは70%より
多く、または二本鎖領域のヌクレオチドの50、60、または70%より多くがデオキシ
リボヌクレオチド、あるいは2’位がデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドであ
る任意の分子は、RNA剤の定義から除外することが好ましい。
iRNA剤である。これは、鎖内の対合によって形成される二本鎖領域を含んでもよく、
例えば、該領域はヘアピン構造またはパン−ハンドル構造であってもよいし、これを含ん
でもよい。一本鎖iRNA剤は、標的分子に関してアンチセンスであることが好ましい。
好ましい実施形態において、一本鎖iRNA剤は5’がリン酸化されるか、または5’プ
ライム末端にホスホリルアナログを含む。5’リン酸修飾は、RISCが仲介する遺伝子
サイレンシングと適合性であるものを含む。適切な修飾には以下が含まれる:5’一リン
酸((HO)2(O)P−O−5’);5’二リン酸((HO)2(O)P−O−P(H
O)(O)−O−5’);5’三リン酸((HO)2(O)P−O−(HO)(O)P−
O−P(HO)(O)−O−5’);5’グアノシンキャップ(7−メチル化または非メ
チル化)(7m−G−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(H
O)(O)−O−5’);5’アデノシンキャップ(Appp)、および任意の修飾また
は非修飾ヌクレオチドキャップ構造(N−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(
O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’一チオリン酸(ホスホロチオエート;
(HO)2(S)P−O−5’);5’一ジチオリン酸(ホスホロジチオエート;(HO
)(HS)(S)P−O−5’)、5’ホスホロチオール酸((HO)2(O)P−S−
5’);酸素/硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ(
例えば、5’−α−チオ三リン酸、5’−γ−チオ三リン酸など)、5’ホスホルアミデ
ート((HO)2(O)P−NH−5’、(HO)(NH2)(O)P−O−5’)、5
’アルキルホスホン酸(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、
例えば、RP(OH)(O)−O−5’−、(OH)2(O)P−5’−CH2)、5’
アルキルエーテルホスホン酸(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH2‐
)、エトキシメチルなど、例えば、RP(OH)(O)−O−5’−)。(これらの修飾
はまた、二本鎖iRNAのアンチセンス鎖とともに使用されることも可能である。)
一本鎖iRNA剤は、該一本鎖iRNA剤がRISCに入ることが可能であり、かつR
ISCの仲介による標的mRNAの切断に関与することが可能であるように、十分に長く
あるべきである。一本鎖iRNA剤は、少なくとも14ヌクレオチド長、およびより好ま
しくは、少なくとも15、20、25、29、35、40、または50ヌクレオチド長で
ある。一本鎖iRNA剤は好ましくは、200、100、または60ヌクレオチド長未満
である。
5ヌクレオチド対に等しいか、または少なくとも17、18、19、29、21、22、
23、24、または25ヌクレオチド対の二本鎖領域を有する。この二本鎖領域の長さは
、好ましくは、200、100、または50ヌクレオチド対以下である。二本鎖領域の好
ましい範囲は、15〜30、17〜23、19〜23、および19〜21ヌクレオチド対
長である。ヘアピンは、好ましくは、一本鎖突出部または末端(好ましくはヘアピンのア
ンチセンス側の好ましくは3’末端)の非対合領域を有する。好ましい突出部は2〜3ヌ
クレオチド長である。
ゼーションにより二本鎖構造を形成することが可能である、1本より多くの鎖、好ましく
は2本の鎖を含むiRNA剤である。
29、40、または60ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも14、15、16
、17、18、19、25、29、40、または60ヌクレオチド長であるべきである。
これは、200、100、または50ヌクレオチド長以下であるべきである。好ましい範
囲は、17〜25、19〜23、および19〜21ヌクレオチド長である。
40、または60ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも14、15、16、17
、18、19、25、29、40、または60ヌクレオチド長であるべきである。これは
、200、100、または50ヌクレオチド長以下であるべきである。好ましい範囲は、
17〜25、19〜23、および19〜21ヌクレオチド長である。
、22、23、24、25、29、40、または60ヌクレオチド対長に等しいか、また
は少なくとも14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、2
5、29、40、または60ヌクレオチド対長であるべきである。これは、200、10
0、または50ヌクレオチド対長以下であるべきである。好ましい範囲は、15〜30、
17〜23、19〜23、および19〜21ヌクレオチド対長である。
ー(Dicer)によって)切断されてより小さなds iRNA剤(例えば、sRNA
剤)を生じることが可能であるように十分に大きい。
望ましい可能性がある。ある場合において、これらの鎖は同じ修飾または同じクラスの修
飾を有するが、他の場合において、センス鎖およびアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、
例えば、ある場合において、センス鎖のみが修飾されることが望ましい。センス鎖のみを
、例えばセンス鎖を不活性化するために修飾することが望ましい可能性があり、例えば、
センス鎖は、センス鎖を不活性化し、かつ活性なsRNA/タンパク質またはRISCの
形成を妨害するために修飾されることが可能である。これは、センス鎖の5’リン酸化を
妨害する修飾によって、例えば、5’−O−メチルリボヌクレオチドを用いる修飾によっ
て達成されることが可能である(ニーケネンら(Nykaenen et al.)、(
2001)「ATPrequirements and small interfering RNA structure in the RNA inte
rferencepathway. 」Cell 107、309〜321を参照のこと)。例えば、単に
5’OHをO−MeではなくHによって置換する、リン酸化を妨害する他の修飾もまた使
用可能である。代替例として、大きなかさ高い基が5’リン酸基に付加され、これがホス
ホジエステル結合に転換されてもよいが、これは、ホスホジエステラーゼがこのような結
合を切断し、かつ機能的sRNA5’末端を遊離することが可能であるので、より望まし
くない可能性がある。アンチセンス鎖修飾は、5’リン酸化ならびに本明細書中で議論さ
れる他の5’修飾のいずれか、特に単鎖iRNA分子に関する節において上記に議論され
た5’修飾を含む。
ように、センス鎖およびアンチセンス鎖が選択されることが好ましい。したがって、ds
iRNA剤は、好ましくは突出部(例えば、1つまたは2つの5’または3’突出部で
あるが好ましくは2〜3ヌクレオチドの3’突出)を含むように対合したセンス鎖および
アンチセンス鎖を含む。多くの実施形態は3’突出部を有する。好ましいsRNA剤は一
本鎖突出部、好ましくは、各々の末端に1ヌクレオチド長または好ましくは2もしくは3
ヌクレオチド長の3’突出部を有する。この突出部は、ある鎖が他の鎖よりも長い結果で
あってもよいし、または、ずれを有する同じ長さの2つの鎖の結果であってもよい。5’
末端は好ましくはリン酸化される。
いて、15から30の間のヌクレオチド長、最も好ましくは18、19、20、21、2
2、および23ヌクレオチド長である。sRNA剤は、長さおよび構造が、長いdsRN
Aからの天然のDicer処理産物に類似する可能性がある。sRNA剤の2つの鎖が結
合される(例えば、共有結合される)実施形態もまた含まれる。ヘアピン、または必要と
される二本鎖領域を提供する他の一本鎖構造物、および好ましくは3’突出部もまた、本
発明の範囲内にある。
標的RNA、例えば、mRNA、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイ
レンシングを仲介することが可能である。便宜上、このようなmRNAは、本明細書中で
はサイレンシングされるmRNAとも呼ばれる。このような遺伝子はまた、標的遺伝子と
もいわれる。一般的に、サイレンシングされるRNAは内在性遺伝子、例えばSNCA遺
伝子である。
、標的RNAをサイレンシングする能力をいう。理論によって束縛されることを望まない
が、サイレンシングは、RNAiの機構またはプロセスおよびガイドRNA(例えば、2
1〜23ヌクレオチドのsRNA剤)を使用すると考えられる。
」は、安定かつ特異的な結合が本発明の化合物と標的RNA分子の間に起こるような、十
分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的結合は、特異的結合が望ま
しい条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合においては生理学
的条件下で、またはインビトロアッセイの場合においてはそのアッセイが実行される条件
下で、オリゴマー化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相
補性を必要とする。非標的配列は、一般的には、少なくとも5ヌクレオチド異なる。
れるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的RNA(例えば、標的SNCA
のmRNA)に「十分に相補的」である。別の実施形態において、iRNA剤は、標的R
NAに対して「厳密に相補的」であり(RRMS含有サブユニットを除外する)、例えば
、標的RNAおよびiRNA剤は、好ましくは、厳密に相補的な領域におけるワトソン−
クリック塩基対から独占的に構成されるハイブリッドを形成するようにアニールする。「
十分に相補的な」標的RNAは、標的RNAに厳密に相補的である内部領域(例えば、少
なくとも10ヌクレオチドの領域)を含み得る。さらに、ある実施形態において、iRN
A剤は、単一ヌクレオチドの違いを特異的に区別する。この場合において、iRNA剤は
、厳密な相補性が単一ヌクレオチドの違いの領域(例えば、7ヌクレオチド以内の領域)
において見出される場合のみにRNAiを仲介する。
はDNA)、好ましくは、100、200、300、または400未満の長さのヌクレオ
チドをいう。
ば、効力を改善するために修飾されたRNA、およびヌクレオシド代用物のポリマーを含
む。未修飾のRNAとは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天
然に存在する、好ましくは人体において天然に存在するのと同じかまたは実質的に同じで
ある分子をいう。当該分野では、修飾RNAのような、まれなまたは一般的でないが天然
に存在するRNAについて言及されており、例えば、リンバックら(Limbach e
t al.)、(1994)、Nucleic Acids Res.22:2183〜
2196を参照されたい。しばしば修飾RNAと呼ばれる(明らかに一般的には転写後修
飾の結果によるからである)、このようなまれなまたは一般的でないRNAは、本明細書
中で使用される場合には用語「非修飾RNA」の範囲内にある。修飾RNAは、本明細書
中で使用される場合、1つ以上の核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分
が、天然に存在するものと異なる、好ましくは人体において存在するものと異なる分子を
いう。これらは修飾「RNA」と呼ばれるが、当然、修飾されているのでRNAではない
分子を含むことになる。ヌクレオシド代用物は、リボリン酸バックボーンが、塩基が正し
い空間的関連において提示されることを可能にする非リボリン酸構築物で置き換えられて
いる分子であり、その結果、ハイブリダイゼーションは、リボリン酸バックボーンの場合
に見られるのと実質的に同様である(例えば、リボリン酸バックボーンの非荷電模倣物)
。上記のすべての例が本明細書中で議論される。
iRNA剤(例えば、部分的に二本鎖のiRNA剤)が必要とされるかまたは好ましい。
したがって、以下に記載される一本鎖構造から作られる二本鎖構造(例えば、2つの別々
の分子が接触して二本鎖領域を形成する場合、または二本鎖領域が分子内対合(例えば、
ヘアピン構造)によって形成される場合)は本発明の範囲内に含まれることが理解される
。好ましい長さは本明細書中の他の箇所に記載される。
多くが核酸内で反復される位置に存在する(例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリ
ン酸部分の非結合Oの修飾)。ある場合において、修飾は、核酸中の対象の位置のすべて
に存在するが、しかし、多くの場合および実際上大部分においてはそうではない。例とし
て、修飾は、3’または5’末端にのみ存在する可能性があり、末端領域(例えば、末端
ヌクレオチドの位置または鎖の最後の2、3、4、5、もしくは10ヌクレオチド)にの
み存在する可能性がある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方において存在す
る可能性がある。修飾は、RNAの二本鎖領域中にのみ存在する可能性もあるし、または
RNAの一本鎖領域にのみ存在する可能性もある。例えば、非結合O位置のホスホロチオ
エート修飾が、一方の末端にのみもしくは両方の末端に存在してもよいし、末端領域(例
えば、末端ヌクレオチド上の位置に、または鎖の最後の2、3、4、5、もしくは10ヌ
クレオチド)にのみ存在してもよいし、または二本鎖および一本鎖の領域、特に末端に存
在することも可能である。5’末端(一方または両方)がリン酸化されることも可能であ
る。
の両方)において、例えば、安定性を増強すること、突出部に特定の塩基を含ませること
、または修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが特に好ましい。例
えば、突出部にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがあり得る。ある実施形
態において、3’または5’の突出部における塩基のすべてまたはいくつかの塩基が、例
えば、本明細書中に記載される修飾を用いて修飾される。修飾は、例えば、リボース糖の
2’OH基での修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌ
クレオチド(例えば、デオキシチミジン)の使用、およびリン酸基中での修飾(例えば、
ホスホチオエート修飾)が含まれうる。突出部は、標的配列と相同である必要はない。
ース糖、塩基、末端リン酸、およびヌクレオチド間リン酸リンカーである。塩基は天然に
存在する塩基(例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、またはシトシン)であり、糖は
非修飾2’ヒドロキシルリボース糖(示されているとおり)、およびW、X、およびZは
すべてOであり、式1は天然に存在する非修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。
、例えば、非修飾オリゴリボヌクレオチドは、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受
ける傾向があり得る。ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解することが
可能である。しかし、上記のRNA成分の1つ以上への化学修飾は改善された特性を付与
することが可能であり、例えば、オリゴリボヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安
定性にすることが可能である。未修飾のオリゴリボヌクレオチドはまた、iRNA剤にリ
ガンドまたは他の部分を結合するためのつなぎ止め部分を提供するという観点で最適に満
たない可能性がある。
(i)変化、例えば、非結合リン酸酸素(XおよびY)の一方もしくは両方の置換、お
よび/または結合リン酸酸素(WおよびZ)の1つ以上の置換(リン酸が末端位置にある
場合、位置WまたはZの1つは、天然に存在するリボ核酸中ではさらなるエレメントにリ
ン酸を結合しない。しかし、用語の単純化のために、他に注記される場合以外は、核酸の
5’末端のW位置および核酸の3’末端のZ位置は、本明細書中で使用される用語「結合
リン酸酸素」の範囲内にある);
(ii)変化、例えば、リボース糖の構成成分(例えば、リボース糖上の2’ヒドロキ
シル)の置換、またはリボース糖の、リボース以外の構造(例えば、本明細書中に記載さ
れるようなもの)による大規模置換;
(iii)リン酸部分(括弧I)の、「リンを含まない(dephospho)」リン
カーによる大規模置換;
(iv)天然に存在する塩基の修飾または置換;
(v)リボース−リン酸バックボーン(括弧II)の置換または修飾;
(vi)RNAの3’末端または5’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾
、もしくは置換、または構成部分の結合(例えば、RNAの3’末端または5’末端のい
ずれかへの蛍光標識部分の結合)。
限定を意味するものではなく、例えば、修飾とは、標準のまたは天然に存在するリボ核酸
を用いて開始しかつそれを修飾して修飾リボ核酸を産生しなくてはならないことを意味す
るものではなく、「修飾された」とは、単に天然に存在する分子との違いを意味する。
(すなわち、ルイス構造)によって十分に表すことは可能ではない。理論によって束縛さ
れることを望まないが、実際の構造は、その代わりに、共鳴型または共鳴構造として集合
的に知られる、2つ以上の標準的な型のある混合物または加重平均であり得る。共鳴構造
は、個別の化学的実体ではなく、紙の上でのみ存在する。これらは、特定の化学的実体に
ついての結合電子および非結合電子の配置または「局在」においてのみ、互いに異なる。
1つの共鳴構造が他よりもより高い程度でハイブリッドに寄与することが可能であり得る
。したがって、本発明の実施形態について記載かつ図示される説明は、特定の種類の実体
についての主要な共鳴型として当該分野で認識されているものに関してなされる。例えば
、任意のホスホロアミデート(非結合酸素の窒素による置換)が、上記の図においてはX
=OおよびY=Nによって表される。
リン酸基は、リン酸以外のものを含む接続部によって置換されることが可能である(上
記の式1中の括弧Iを参照のこと)。理論によって束縛されることを望まないが、荷電し
たホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、この基を中性の構造
模倣物で置換することは、ヌクレアーゼ安定性の増強を付与するはずであると考えられて
いる。この場合も理論によって束縛されることを望まないが、ある態様において、荷電し
たリン酸基が中性部分によって置換される変化を導入することが望ましい可能性がある。
ボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイ
ドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール
、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメ
チルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ。好ましい置換には、メチレンカルボ
ニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が含まれる。
リボリン酸バックボーンの置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオ
チドの代用物によって置換されるオリゴヌクレオチド模倣バックボーンを構築することも
可能である(上記の式1の括弧IIを参照のこと)。理論によって束縛されることを望ま
ないが、反復して荷電したバックボーンが存在しなければ、ポリアニオンを認識するタン
パク質(例えば、ヌクレアーゼ)への結合が減少すると考えられている。再度、理論によ
って束縛されることを望まないが、ある態様において、塩基が中性の代用バックボーンに
よって連結される変化を導入することが望ましい可能性がある。
のヌクレオシド代用物が含まれる。好ましい代用物はPNA代用物である。
候補修飾は以下に記載されるように評価されることが可能である。
オリゴヌクレオチドの3’末端および5’末端が修飾されることが可能である。このよ
うな修飾は、分子の3’末端、5’末端、または両方の末端においてなされ得る。該修飾
は、末端のリン酸全体または末端リン酸基の1つ以上の原子の修飾または置換を含むこと
が可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの3’末端および5’末端が、他の機能的分
子実体、例えば標識部分(例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3色素も
しくはCy5色素などの蛍光団)または保護基(例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、もしく
はエステルを含む基など)に複合体化することが可能である。前記機能的分子実体は、リ
ン酸基および/またはスペーサーを介して糖に結合することが可能である。スペーサーの
末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のC−3’もしくはC−5’のO、N、S、も
しくはC基を接続または置換することが可能である。代替的には、スペーサーは、ヌクレ
オチド代用物(例えば、PNA)の末端原子を接続または置換することが可能である。こ
れらのスペーサーまたはリンカーは、例えば、−(CH2)n−、−(CH2)nN−、
−(CH2)nO−、−(CH2)nS−、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH(
例えば、n=3または6)、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オ
キシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリ
ノなど、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を含み得る。「スペーサー/リン
酸‐機能的分子実体−スペーサーリン酸」という配列構造が、iRNA剤の2つの鎖の間
に介在するとき、この配列構造は、ヘアピン型RNA剤中のヘアピンRNAループの代わ
りに機能することが可能である。3’末端は−OH基であり得る。理論に束縛されること
を望まないが、特定の部分の複合体化は、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性に
ついての特性を改善することが可能であると考えられている。再度、理論に束縛されるこ
とを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の変化を導入することが望ましい可能
性がある。末端修飾の他の例には、色素、インターカレート剤(例えば、アクリジン)、
架橋剤(例えば、ソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフ
ィリン、サッフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナ
ジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性担体(例えば、コレステ
ロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,
3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシル
グリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基
、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リトコール酸、O3−(オレオイ
ル)コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン)およびペプチド複合体(例
えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、リン酸、アミノ、
メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミ
ノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン
)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアー
ゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、
アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のEu3+複合体)が含まれる。
を調節するために、または分解に対する耐性を調節するために、加えられることが可能で
ある。活性を調節するために有用である末端修飾には、リン酸またはリン酸アナログによ
る5’末端の修飾が含まれる。例えば、好ましい態様において、iRNA剤、とりわけア
ンチセンス鎖は、5’リン酸化されてもよいし、または5’プライム末端にリン酸基アナ
ログを含んでもよい。5’リン酸修飾には、RISC介在性の遺伝子サイレンシングと適
合可能であるものが含まれる。適切な修飾には以下が含まれる:5’一リン酸((HO)
2(O)P−O−5’);5’二リン酸((HO)2(O)P−O−P(HO)(O)−
O−5’);5’三リン酸((HO)2(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO
)(O)−O−5’);5’−グアノシンキャップ(7−メチル化または非メチル化)(
7m−G−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)
−O−5’);5’−アデノシンキャップ(Appp)、および任意の修飾または非修飾
ヌクレオチドキャップ構造(N−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−
O−P(HO)(O)−O−5’);5’一チオリン酸(ホスホロチオエート;(HO)
2(S)P−O−5’);5’一ジチオリン酸(ホスホロジチオエート;(HO)(HS
)(S)P−O−5’)、5’−ホスホロチオール酸((HO)2(O)P−S−5’)
;酸素/硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ(例えば
、5’−α−チオ三リン酸、5’−γ−チオ三リン酸など)、5’−ホスホルアミデート
((HO)2(O)P−NH−5’、(HO)(NH2)(O)P−O−5’)、5’−
アルキルホスホン酸(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例
えば、RP(OH)(O)−O−5’、(OH)2(O)P−5’−CH2)、5’−ア
ルキルエーテルホスホン酸(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH2)、
エトキシメチルなど、例えば、RP(OH)(O)−O−5’)。
いて、付加される好ましい基には、蛍光団(例えば、フルオレセイン)またはAlexa
色素(例えば、Alexa 488)が含まれる。末端修飾はまた、取り込みを増強する
ために有用でありうるが、このために有用な修飾にはコレステロールが含まれる。末端修
飾はまた、RNA剤を別の部分に架橋するために有用でありうるが、このための有用な修
飾にはマイトマイシンCが含まれる。
iRNA剤候補(例えば、修飾されたiRNA剤)を評価することが可能である。一般
的な手法について以下に説明するが、SNCAのiRNA剤により特異的な方法について
は本明細書中の他所において議論する。一般に、そのRNA剤または修飾分子および対照
分子を適切な条件に曝露すること、ならびに選択された特性の存在について評価すること
によって、選択された特性を試験することが可能である。例えば、分解剤に対する耐性は
以下のようにして評価されることが可能である。候補修飾RNA(および好ましくは対照
分子、通常は非修飾型)は、分解的な条件、例えば、分解剤(例えば、ヌクレアーゼ)を
含む環境に曝露されることが可能である。例えば、生物学的試料を使用することが可能で
あり、該試料は、例えば、治療的使用、例えば、血液または細胞画分(例えば、無細胞ホ
モジネートまたは破砕された細胞)において遭遇しうる環境と類似の生物学的試料である
。次いで、候補および対照を、多数のアプローチのいずれかによって、分解に対する耐性
について評価することが可能である。例えば、候補および対照を、例えば、放射性標識も
しくは酵素標識または蛍光標識(例えば、Cy3もしくはCy5など)を用いて、好まし
くは、曝露の前に標識することが可能である。対照RNAおよび修飾されたRNAを、分
解剤、および場合によっては対照(例えば、不活化された(例えば、熱不活化された)分
解剤)とともにインキュベートすることが可能である。次いで、物理学的パラメータ(例
えば、修飾分子および対照分子のサイズ)を決定する。これらは、物理学的方法によって
(例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイズ分画カラムによって)、その分
子がその元々の長さを維持していたかを評価するために決定してもよいし、または機能的
に評価することも可能である。代替的には、ノーザンブロット分析を使用して、未標識の
修飾分子の長さをアッセイすることが可能である。
ッセイは、修飾が、遺伝子発現をサイレンシングする分子の能力を変化させるか否かを決
定するために、最初に、または初期の非機能的アッセイ(例えば、分解に対する耐性につ
いてのアッセイ)の後で適用することが可能である。例えば、細胞(例えば、マウスまた
はヒトの細胞などの哺乳動物細胞)を、蛍光タンパク質(例えば、GFP)を発現するプ
ラスミドおよびその蛍光タンパク質をコードする転写物に相同である候補RNA剤で同時
トランスフェクトすることが可能である(例えば、国際公開公報第00/44914号パ
ンフレットを参照されたい)。例えば、GFP mRNAに相同である修飾dsRNAは
、トランスフェクションに候補dsRNAを含めなかった対照細胞(例えば、RNA剤を
加えられなかった対照、および/または非修飾RNAを加えられなかった対照)と比較し
て、細胞の蛍光の減少についてモニターすることによって、GFP発現を阻害する能力に
ついてアッセイすることが可能である。遺伝子発現に対する候補剤の効力は、修飾dsR
NA剤および非修飾dsRNA剤の存在下での細胞の蛍光を比較することによって評価可
能である。
のレベルの減少についてアッセイするノーザンブロットによって、または標的タンパク質
のレベルの減少についてアッセイするウエスタンブロット分析によって確認可能である。
対照は、RNA剤が添加されない細胞、および/または非修飾RNAが添加される細胞を
含むことが可能である。
好ましいRNA剤は以下の構造を有する(以下の式2を参照のこと):
脱塩基ヌクレオチド)、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チ
ミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、2−
アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデ
ニンおよびグアニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、5−ハロウラシルおよび
5−ハロシトシン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、6−アゾウ
ラシル、6−アゾシトシン、および6−アゾチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)
、4−チオウラシル、5−ハロウラシル、5−(2−アミノプロピル)ウラシル、5−ア
ミノアリルウラシル、8−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、およ
び他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウ
ラシルおよびシトシン、7−メチルグアニン、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン
およびN−2,N−6、およびO−6置換プリン(2−アミノプロピルアデニンを含む)
、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3−デア
ザ−5−アザシトシン、2−アミノプリン、5−アルキルウラシル、7−アルキルグアニ
ン、5−アルキルシトシン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、N6,N6−ジ
メチルアデニン、2,6−ジアミノプリン、5−アミノ−アリル−ウラシル、N3−メチ
ルウラシル、置換1,2,4−トリアゾール、2−ピリジノン、5−ニトロインドール、
3−ニトロピロール、5−メトキシウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸、5−メトキシ
カルボニルメチルウラシル、5−メチル−2−チオウラシル、5−メトキシカルボニルメ
チル−2−チオウラシル、5−メチルアミノメチル−2−チオウラシル、3−(3−アミ
ノ−3−カルボキシプロピル)ウラシル、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N
4−アセチルシトシン、2−チオシトシン、N6−メチルアデニン、N6−イソペンチル
アデニン、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、N−メチルグアニン、また
はO−アルキル化塩基である。
H2OR8;O(CH2)nR9;O(CH2)nOR9、H;ハロ;NH2;NHR8
;N(R8)2;NH(CH2CH2NH)mCH2CH2NHR9;NHC(O)R8
;シアノ;メルカプト;SR8;アルキル−チオ−アルキル;アルキル、アラルキル、シ
クロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル(これらの各々は、
場合により、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル
、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジア
ルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールア
ミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバ
モイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、ア
ルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルスルホ
ンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、またはウレイドで置換されても
よい)であるか;または、R4、R5、およびR6は、R7と一緒に組み合わさって、糖
の2’位および4’位の炭素の間の[−O−CH2−]共有結合架橋を形成する。
(好ましいA1は、とりわけアンチセンス鎖に関して、以下の:5’一リン酸((HO)
2(O)P−O−5’);5’二リン酸((HO)2(O)P−O−P(HO)(O)−
O−5’);5’三リン酸((HO)2(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO
)(O)−O−5’);5’−グアノシンキャップ(7−メチル化または非メチル化)(
7m−G−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)
−O−5’);5’−アデノシンキャップ(Appp)、および任意の修飾または非修飾
ヌクレオチドキャップ構造(N−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−
O−P(HO)(O)−O−5’);5’一チオリン酸(ホスホロチオエート;(HO)
2(S)P−O−5’)、5’一ジチオリン酸(ホスホロジチオエート;(HO)(HS
)(S)P−O−5’)、5’−ホスホロチオール酸((HO)2(O)P−S−5’)
;酸素/硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ(例えば
、5’−α−チオ三リン酸、5’−γ−チオ三リン酸など)、5’−ホスホルアミデート
((HO)2(O)P−NH−5’、(HO)(NH2)(O)P−O−5’)、5’−
アルキルホスホン酸(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例
えば、RP(OH)(O)−O−5’−、(OH)2(O)P−5’−CH2)、5’−
アルキルエーテルホスホン酸(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH2−
)、エトキシメチルなど、例えば、RP(OH)(O)−O−5’−)から選択される)
。
W1は、OH、(CH2)nR10、(CH2)nNHR10、(CH2)nOR10
、(CH2)nSR10、O(CH2)nR10、O(CH2)nOR10、O(CH2
)nNR10、O(CH2)nSR10、O(CH2)nSS(CH2)nOR10、O
(CH2)nC(O)OR10、NH(CH2)nR10;NH(CH2)nNR10;
NH(CH2)nOR10、NH(CH2)nSR10;S(CH2)nR10、S(C
H2)nNR10、S(CH2)nOR10、S(CH2)nSR10O(CH2CH2
O)mCH2CH2OR10;O(CH2CH2O)mCH2CH2NHR10;NH(
CH2CH2NH)mCH2CH2NHR10;Q−R10、O−Q−R10、N−Q−
R10、S−Q−R10、または−O−である。W4は、O、CH2、NH、またはSで
ある。
Y1、Y2、Y3、およびY4は、各々独立して、OH、O−、OR8、S、Se、B
H3 −、H、NHR9、N(R9)2、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリー
ル、またはヘテロアリールであり、これらの各々が場合によっては置換されてもよい。
は、OH、(CH2)nR10、(CH2)nNHR10、(CH2)nOR10、(C
H2)nSR10、O(CH2)nR10、O(CH2)nOR10、O(CH2)nN
R10、O(CH2)nSR10、O(CH2)nSS(CH2)nOR10、O(CH
2)nC(O)OR10、NH(CH2)nR10;NH(CH2)nNR10;NH(
CH2)nOR10、NH(CH2)nSR10;S(CH2)nR10、S(CH2)
nNR10、S(CH2)nOR10、S(CH2)nSR10O(CH2CH2O)m
CH2CH2OR10;O(CH2CH2O)mCH2CH2NHR10;NH(CH2
CH2NH)mCH2CH2NHR10;Q−R10、O−Q−R10、N−Q−R10
、S−Q−R10である。
である。
R7はHであるか、またはR4、R5、またはR6と一緒に組み合わさって糖の2’位
および4’位の炭素の間に[−O−CH2−]共有結合架橋を形成する。
アリール、アミノ酸、または糖であり;R9は、NH2、アルキルアミノ、ジアルキルア
ミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジ
ヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり;およびR10はH;蛍光団(例えば、ピ
レン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3色素もしくはCy5色素);硫黄、ケイ素、
ホウ素、もしくはエステルの保護基;インターカレート剤(例えば、アクリジン)、架橋
剤(例えば、ソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリ
ン、サッフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン
)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性担体(コレステロール、コー
ル酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O
(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール
、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン
酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リトコール酸、O3−(オレオイル)コール酸
、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン)およびペプチド複合体(例えば、アンテ
ナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、
PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ;アルキル
、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール;放射線標識マーカー、酵素
、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE
、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミ
ン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環の
Eu3+複合体);またはRNA剤である。mは0〜1,000,000であり、かつn
は0〜20である。Qは、脱塩基性の糖(abasic sugar)、アミド、カルボ
キシ、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホン
アミドもしくはモルホリノ、ビオチン、またはフルオレセイン試薬からなる群より選択さ
れるスペーサーである。
参照のこと):
なくともいずれかは存在しなくてもよい。ここでLはリンカーであり、一方または両方の
Lは存在していても存在していなくてもよく、かつCH2(CH2)g;N(CH2)g
;O(CH2)g;S(CH2)gからなる群より選択される。Gは、シロキサン、カー
ボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイ
ドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール
、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメ
チルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノからなる群より選択される官能基であ
る。
)、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、
ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、2−アミノアデニン、ア
デニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニン
の2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、5−ハロウラシルおよび5−ハロシトシン、
5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、6−アゾウラシル、6−アゾシ
トシン、および6−アゾチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル
、5−ハロウラシル、5−(2−アミノプロピル)ウラシル、5−アミノアリルウラシル
、8−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の8−置換アデ
ニンおよびグアニン、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシ
ン、7−メチルグアニン、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、およびN−2,N
−6、およびO−6置換プリン(2−アミノプロピルアデニンを含む)、5−プロピニル
ウラシルおよび5−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3−デアザ−5−アザシト
シン、2−アミノプリン、5−アルキルウラシル、7−アルキルグアニン、5−アルキル
シトシン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、N6,N6−ジメチルアデニン、
2,6−ジアミノプリン、5−アミノ−アリル−ウラシル、N3−メチルウラシル置換1
,2,4−トリアゾール、2−ピリジノン、5−ニトロインドール、3−ニトロピロール
、5−メトキシウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸、5−メトキシカルボニルメチルウ
ラシル、5−メチル−2−チオウラシル、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラ
シル、5−メチルアミノメチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−カルボキシ
プロピル)ウラシル、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N4−アセチルシトシ
ン、2−チオシトシン、N6−メチルアデニン、N6−イソペンチルアデニン、2−メチ
ルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、N−メチルグアニン、またはO−アルキル化塩
基である。
H2CH2OR8;O(CH2)nR9;O(CH2)nOR9、H;ハロ;NH2;N
HR8;N(R8)2;NH(CH2CH2NH)mCH2CH2R9;NHC(O)R
8;;シアノ;メルカプト;SR7;アルキル−チオ−アルキル;アルキル、アラルキル
、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル(これらの各々
は、場合により、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカ
リル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、
ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリー
ルアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカ
ルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル
、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルス
ルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、またはウレイド基で置換さ
れてもよい)であり;または、R40、R50、およびR60は、R70と一緒に組み合
わさって、糖の2’位および4’位の炭素の間の[−O−CH2−]共有結合架橋を形成
する。
である。
R70はHであるか、またはR40、R50、またはR60と一緒に組み合わさって、
糖の2’位および4’位の炭素の間の[−O−CH2−]共有結合架橋を形成する。
アリール、アミノ酸、または糖であり;R9は、NH2、アルキルアミノ、ジアルキルア
ミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジ
ヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸である、mは0〜1,000,000であり、n
は0〜20であり、かつgは0〜2である。
択される。Lはリンカーであり、かつCH2(CH2)g;N(CH2)g;O(CH2
)g;S(CH2)g;−C(O)(CH2)n−からなる群より選択されるか、または
存在していなくてもよい。Mは、アミド結合;スルホンアミド;スルフィン酸;リン酸基
;本明細書中に記載されるような修飾リン酸基であるか;または存在していなくてもよい
。
オチド)、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサン
チン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、2−アミノアデニ
ン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグ
アニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、5−ハロウラシルおよび5−ハロシト
シン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、6−アゾウラシル、6−
アゾシトシン、および6−アゾチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウ
ラシル、5−ハロウラシル、5−(2−アミノプロピル)ウラシル、5−アミノアリルウ
ラシル、8−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の8−置
換アデニンおよびグアニン、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよび
シトシン、7−メチルグアニン、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジンおよびN−2
,N−6、およびO−6置換プリン(2−アミノプロピルアデニンを含む)、5−プロピ
ニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3−デアザ−5−アザ
シトシン、2−アミノプリン、5−アルキルウラシル、7−アルキルグアニン、5−アル
キルシトシン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、N6,N6−ジメチルアデニ
ン、2,6−ジアミノプリン、5−アミノ−アリル−ウラシル、N3−メチルウラシル置
換1,2,4−トリアゾール、2−ピリジノン、5−ニトロインドール、3−ニトロピロ
ール、5−メトキシウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸、5−メトキシカルボニルメチ
ルウラシル、5−メチル−2−チオウラシル、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオ
ウラシル、5−メチルアミノメチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−カルボ
キシプロピル)ウラシル、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N4−アセチルシ
トシン、2−チオシトシン、N6−メチルアデニン、N6−イソペンチルアデニン、2−
メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、N−メチルグアニン、またはO−アルキル
化塩基である。
であり;gは0〜2である。
ヌクレアーゼ耐性モノマー
RNA、例えばiRNA剤に、ヌクレアーゼ耐性モノマー(NRM)を組み入れること
が可能である。例えば、本発明は、本明細書に記載のiRNA剤、例えばパリンドローム
構造のiRNA剤、非標準的な対合を有するiRNA剤、本明細書に記載の遺伝子、例え
ばSNCA遺伝子を標的とするiRNA剤、本明細書に記載の構成様式もしくは構造を有
するiRNA剤、本明細書に記載の両親媒性送達剤と結合したiRNA剤、本明細書に記
載の薬剤送達モジュールと結合したiRNA剤、本明細書に記載のように投与されるiR
NA剤、または本明細書に記載のように製剤化されたiRNA剤であって、NRMも取り
込むiRNA剤を含む。
ゼまたはエキソヌクレアーゼ)による分解を阻害するように修飾されたモノマーを含みう
る。これらのモノマーをここではNRM、またはヌクレアーゼ耐性促進モノマーもしくは
ヌクレアーゼ耐性促進修飾体と称する。多くの場合、これらの修飾は、iRNA剤の他の
特性、例えばタンパク質(例えば輸送タンパク質(例えば血清アルブミン))もしくはR
ISC(RNA誘導サイレシング複合体)の構成メンバーと相互作用する能力、または最
初の配列と2番目の配列が相互に二本鎖を形成もしくは別の配列、例えば標的分子と二本
鎖を形成する能力という特性も同様に調節する。
ボーンの修飾体は、エンドヌクレアーゼ耐性およびエキソヌクレアーゼ耐性を増強し、さ
らに輸送タンパク質およびRISC複合体の1つまたは複数の機能的要素との相互作用を
亢進すると考えられる。好ましい修飾体は、エキソヌクレアーゼ耐性およびエンドヌクレ
アーゼ耐性を高め、したがって、RISC複合体と相互作用する前のiRNA剤の半減期
を延長するが、同時に、RISC複合体におけるエンドヌクレアーゼの活性に対してはi
RNA剤を耐性にしない修飾体である。繰り返すが、いかなる理論にも縛られることは望
まないが、上記修飾をアンチセンス鎖の3’末端および/もしくは5’末端またはこれら
の近くに配置することにより、上記に描写される好ましいヌクレアーゼ耐性の基準を満た
すiRNA剤が生じると考えられる。やはり繰り返すが、いかなる理論にも縛られること
は望まないが、修飾を、例えばセンス鎖の中央に配置することにより、オフターゲットの
可能性が比較的低いiRNA剤が作製可能と考えられる。
NAおよびRNA様分子へ組み込むことが可能である。iRNA剤はハイブリッド形成し
たセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる二本鎖を含むことができ、この場合アンチセン
ス鎖および/またはセンス鎖は、本明細書に記載される1つまたは複数の修飾を含むこと
が可能である。アンチセンス鎖は、3’末端および/もしくは5’末端、ならびに/また
は鎖のいずれかの末端から1〜6ヌクレオチド、例えば1〜5、1〜4、1〜3、1〜2
ヌクレオチドにある1つもしくは複数の位置に修飾を含むことが可能である。センス鎖は
、3’末端および/もしくは5’末端、ならびに/または鎖の両末端の間にある介入位置
のいずれか1つに修飾を含むことが可能である。また、iRNA剤は、ハイブリッド形成
した2つのアンチセンス鎖からなる二本鎖を含むことが可能である。第1および/または
第2のアンチセンス鎖は、本明細書に記載の1つまたは複数の修飾を含むことが可能であ
る。したがって、1つおよび/または両方のアンチセンス鎖は、3’末端および/もしく
は5’末端、ならびに/または鎖のいずれかの末端から1〜6ヌクレオチド、例えば1〜
5、1〜4、1〜3、1〜2ヌクレオチドにある1つもしくは複数の位置に修飾を含むこ
とが可能である。以降に特定の構造について述べる。
ために有用と考えられる修飾は、以下に記すような、糖、塩基および/またはリン酸バッ
クボーンについての1つまたは複数の化学的および/または立体化学的修飾を含むことが
可能である:
(i)キラル(Sp)チオエート。したがって、好ましいNRMは、通常は酸素によっ
て占められる非架橋位置、例えば位置XのSpまたはRpにヘテロ原子を含む特定のキラ
ル型の修飾リン酸基について富化された、または前記修飾リン酸基について純粋なヌクレ
オチド二量体を含む。また、Xの原子にはS、Se、Nr2またはBr3が考えられる。
XがSならば、富化された、またはキラル型について純粋なSpとの結合が好ましい。富
化とは好ましい型が少なくとも70、80、90、95または99%であることを意味す
る。そのようなNRMについては以下により詳細に記載する;
(ii)糖、塩基および/またはリン酸バックボーン部分もしくは修飾リン酸バックボ
ーン部分のリン原子への1つまたは複数のカチオン基の結合。したがって、好ましいNR
Mは、末端にカチオン基で誘導体化されたモノマーを含む。アンチセンス配列の5’末端
は、末端−OHまたはリン酸基を有する必要があるので、前記のNRMは、アンチセンス
配列の5’末端では使用されないことが好ましい。このカチオン基は、水素結合形成およ
びハイブリッド形成との干渉を最少化する塩基上の位置、例えばもう一方の鎖の相補的塩
基と相互作用する面から離れた位置(例えばピリミジンの5’位またはプリンの7位)で
結合しなければならない。これらについては以下により詳細に述べる;
(iii)末端での非リン酸結合。したがって、好ましいNRMは、例えば切断に対す
る耐性がリン酸結合よりも大きくなる4原子の結合などの、非リン酸結合を含む。例とし
て、3’CH2−NCH3−O−CH2−5’および3’CH2−NH−(O=)−CH
2−5’が挙げられる。
RMは前記の構造を含むことが可能である。
(v)L−RNA、2’−5’結合、逆向きの結合、α−ヌクレオシド。したがって、
他の好ましいNRMに含まれるものは、LヌクレオシドおよびL−ヌクレオシド由来のヌ
クレオチド二量体;2’−5’リン酸塩、非リン酸塩および修飾リン酸塩の結合、例えば
チオリン酸塩、ホスホルアミデートおよびホウ素化リン酸塩;逆向きの結合、例えば3’
−3’または5’−5’結合を有する二量体;糖の1’位にα結合を有するモノマー、例
えば本明細書に記載のα結合を有する構造が挙げられる;
(vi)結合基。したがって、好ましいNRMは、例えば標的結合部分、または、例え
ば糖、塩基もしくはバックボーンを通してモノマーと結合する、本明細書に記載の結合リ
ガンドを含むことが可能である。
うな脱塩基モノマー(例えば核酸塩基のないモノマー)、本明細書に記載されるような芳
香族モノマーもしくは複素環式モノマー、または多複素環式芳香族モノマーを含むことが
可能である;
(vii)5’−ホスホネートおよび5’−ホスフェート型プロドラッグ。したがって
、好ましいNRMは、好ましくは末端部位(例えば5’位)に、リン酸基の1つまたは複
数の原子が保護基により誘導体化されているモノマーを含み、この1つまたは複数の保護
基は、対象の体内成分、例えばカルボキシエステラーゼまたは対象の体内に存在する酵素
の作用により除去される。例えば、カルボキシエステラーゼが保護分子を切断する結果チ
オエートアニオンが生じ、チオエートアニオンがリン酸塩のOに隣接する炭素を攻撃する
結果として保護されていないリン酸塩が生じるリン酸プロドラッグ。
ことが可能である。NRM修飾は、配列またはiRNA剤に2回以上使用することが可能
である。一部のNRMはハイブリッド形成を妨げるので、取り込む総数は、許容可能なレ
ベルのiRNA剤の二本鎖形成が維持されるものでなければならない。
い配列(センス鎖またはセンス配列)の末端切断部位または切断領域へ導入される。この
ことによりオフターゲットによるサイレンシングを低減しうる。
修飾は、1つもしくは両方の非結合(XおよびY)リン酸酸素および/または1つもし
くは複数の結合(WおよびZ)リン酸酸素の変更(例えば置換)を含みうる。下記の式X
は2つの糖/糖代用物‐塩基部分(SB1およびSB2)が結合しているリン酸塩部分を
表す。
の1つは次のいずれか1つ:S、Se、BR3(Rは水素、アルキル、アリールなど)、
C(すなわち、アルキル基、アリール基など)、H、NR2(Rは水素、アルキル、アリ
ールなど)、またはOR(Rはアルキルまたはアリール)と置換可能である。非修飾リン
酸基のリン原子はアキラルである。しかし、非結合酸素の1つを上記の原子または原子群
の1つと置換することにより、リン原子がキラル化される。いいかえれば、このように修
飾されたリン酸基内のリン酸原子は立体中心である。立体中心のリン原子は「R」配置(
ここではRp)または「S」配置(ここではSp)を有することが可能である。したがっ
て、立体中心のリン原子の60%がRp配置を有するとき、残る40%の立体中心のリン
原子はSp配置を有することになる。
リン酸基を有するiRNA剤は、立体中心の原子の少なくとも約50%(例えば立体中心
の原子の少なくとも約60%、同原子の少なくとも約70%、同原子の少なくとも約80
%、同原子の少なくとも約90%、同原子の少なくとも約95%、同原子の少なくとも約
98%、同原子の少なくとも約99%)がSp配置を有する立体中心リン原子の集団を含
むことが可能である。あるいは、リン酸非結合酸素が他の原子または原子群で置換されて
いるリン酸基を有するiRNA剤は、立体中心の原子の少なくとも約50%(例えば立体
中心の原子の少なくとも約60%、同原子の少なくとも約70%、同原子の少なくとも約
80%、同原子の少なくとも約90%、同原子の少なくとも約95%、同原子の少なくと
も約98%、同原子の少なくとも約99%)がRp配置を有する立体中心リン原子の集団
を含むことが可能である。他の実施形態において、立体中心リン原子の集団がSp配置を
有し、かつRp配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。さ
らに他の実施形態において、立体中心リン原子の集団がRp配置を有し、かつSp配置を
有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。本明細書では、「Rp配
置を有する立体中心リン原子を実質的に含まない」という句は、Rp配置を有する立体中
心リン原子を含む部分が当技術分野で公知の従来の方法(キラルHPLC、キラルシフト
試薬を使用した1H NMR分析など)により検出できないことを意味する。本明細書で
は、「Sp配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まない」という句は、Sp配置を
有する立体中心リン原子を含む部分が当技術分野で公知の従来の方法(キラルHPLC、
キラルシフト試薬を使用した1H NMR分析など)により検出できないことを意味する
。
の非結合酸素がイオウ原子と置換されているリン酸基を含む。特に好ましい実施形態にお
いて、ホスホロチオエートの立体中心リン原子の集団はSp配置を有し、かつRp配置を
有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。
オエートを導入するために使用することができ、後者は鎖の5’末端または例えばいずれ
かの末端から1、2、3、4、5または6つ目のヌクレオチドの位置に修飾を導入するた
めに使用する。上記の式で、Yは2−シアノエトキシでよく、WおよびZはOでよく、R
2’は、例えば糖にC−3末端構造を付与しうる置換基、例えばOH、F、OCH3でよ
く、DMTはジメトキシトリチルであり、「塩基」は天然の塩基でも、通常でない塩基で
も、または普遍的な塩基でもよい。
(すなわち、実質的にSp配置を含まない)もしくはSp配置だけを有する(すなわち、
実質的にRp配置を含まない)立体中心リン原子の集団を有するホスホロチオエート含有
二量体を生じさせることが可能な配位性制御基を使用して調製可能である。あるいは、二
量体が、約50%がRp配置を有し、原子の約50%がSp配置を有する立体中心リン原
子の集団を有するように調整することが可能である。Rp配置の立体中心リン原子を有す
る二量体を特定し、例えば酵素的分解および/または通常のクロマトグラフィ法を使用し
てSp配置の立体中心リン構造を有する二量体から分離することが可能である。
また、修飾は、糖、塩基および/またはリン酸バックボーン部分もしくは修飾リン酸バ
ックボーン部分のリン原子への1つまたは複数のカチオン基の結合を含むことも可能であ
る。カチオン基は、天然の塩基、通常でない塩基または普遍的な塩基上で置換可能な任意
の原子に結合可能である。好ましい位置は、ハイブリッド形成を妨げない、すなわち塩基
対形成に必要な水素結合の相互作用を妨げない位置である。カチオン基は、例えば糖のC
2’位、または環状もしくは非環状の糖代用物中の類似の位置を介して結合することが可
能である。カチオン基は、例えばO−AMINE(AMINE=NH2;アルキルアミノ
、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリ
ールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)由来のプロ
トン化アミノ基、例えばO(CH2)nAMINE(例えばAMINE=NH2;アルキ
ルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘ
テロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノなど
)のアミノアルコキシ、アミノ(例えばNH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘ
テルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロア
リールアミノまたはアミノ酸)、またはNH(CH2CH2NH)nCH2CH2−AM
INE(例えばAMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリ
ル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリール
アミノ)を含むことが可能である。
また、修飾は鎖の5’末端および3’末端のうち少なくともいずれかに非リン酸結合を
組み込むことが可能である。リン酸基を置換することが可能な非リン酸結合の例には、メ
チルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸、カルボキシメチル、カルバミ
ン酸、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸、スルホンアミド
、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチ
ルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイ
ミノを含む。好ましい置換体は、メチルホスホン酸基およびヒドロキシルアミノ基を含む
。
逆向きの結合、α−ヌクレオシド;結合基;脱塩基結合;ならびに5’ホスホン酸および
5’リン酸プロドラッグ
上記の式Xについて言及すると、修飾はリン酸バックボーン部分の架橋または結合リン
酸酸素(WおよびZ)のうちの1つの置換体を含むことが可能である。XまたはYのうち
1つだけを変更する状況とは違い、ホスホロジチオエートのリン原子の中心はアキラルで
あり立体中心リン原子を含むiRNA剤の形成を妨げる。
ン酸基を介して2つの糖を結合することを含むことが可能である。同様に考えられるのは
、1番目の糖と2番目の糖がそれぞれの3’位を通してそれぞれ結合する逆向きの結合で
ある。また、修飾RNAは、C−1’で核酸塩基を欠く「脱塩基性の」糖を含むことも可
能である。糖基は、リボースにおける対応する炭素とは反対の立体化学的配置を有する炭
素を1つまたは複数含むことも可能である。したがって、修飾iRNA剤は、糖として、
例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含むことが可能である。上記修飾のもう1つの
サブセットでは、天然の塩基、通常でない塩基または普遍的な塩基はα−配置を有するこ
とが可能である。また、修飾体は、L−RNAを含むことが可能である。
Fなど)の5’−ホスホン酸および例えばP(O)[OCH2CH2SC(O)R]2C
H2C5’−糖などの5’ホスホン酸プロドラッグを含むことが可能である。後者の場合
、プロドラッグ基は、最初にカルボキシエステラーゼで始まる作用を介して分解される可
能性がある。分子内SN2置換を介した残るエチルチオレート基は、エピスルフィドとし
て分離され、非誘導体化リン酸基を生じることが可能である。
であり、結合基は結合可能な任意のアミノ基を介してiRNA剤へ結合されることが好ま
しい。
も配置可能な修飾とがある。通常、ハイブリッド形成を抑制することが可能な修飾は、末
端領域でのみ使用することが好ましく、対象の配列または遺伝子を標的とする配列の切断
部位または切断領域では使用しないことが好ましい。iRNA剤の2つの配列間で十分な
ハイブリッド形成が維持されるという条件であれば、センス配列のどの位置においても使
用することが可能である。一部の実施形態では、オフターゲットのサイレンシングを最小
化することが可能なため、対象の配列または遺伝子を標的としない配列の切断位置または
切断領域にNRMを配することが望ましい。
しない突出部を有することが可能である。これは突出部ではあるが、それ自体と、または
iRNA剤のもう一方の配列以外の別の核酸と、ハイブリッド形成する。
(多くの場合、アンチセンス配列と呼ばれる)、対象の配列を標的にしないか(多くの場
合、センス配列と呼ばれる)により配置が異なる。配列が対象の配列を標的にするならば
、エンドヌクレアーゼによる切断を妨害または阻害する修飾は、RISCの仲介による切
断を受ける領域、例えば切断部位または切断領域に挿入すべきではない(エルバッシャー
ら[Elbashir et al.]、2001年、Genes and Dev.1
5:188[参照により本願に援用]に記載されるとおりである)。標的の切断は、およ
そ20もしくは21ntのガイドRNAのほぼ中央またはガイド配列に相補的な最初のヌ
クレオチドの10もしくは11ヌクレオチド上流で起きる。本明細書では、切断部位とは
、標的上または標的とハイブリッド形成するiRNA剤の鎖上の、切断部位の両側のヌク
レオチドを指す。切断領域は、切断部位のヌクレオチドとその両方向の1、2または3ヌ
クレオチドを意味する)。
例えば末端、または末端の2、3、4もしくは5位の位置へ導入することが可能である。
iRNA剤は以下から選択した第1鎖および第2鎖を有することが可能である。
、2、3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有する第1鎖、
配列を標的とせず、かつ5’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1
、2、3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有する第1鎖、
配列を標的とせず、かつ3’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1
、2、3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有し、さらに5’末端から1、
2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位置に
NRM修飾を有する第1鎖、
配列を標的とせず、切断部位または切断領域にNRM修飾を有する第1鎖、
配列を標的とせず、切断部位または切断領域にNRM修飾を有し、かつ、3’末端から
1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位
置のNRM修飾と、5’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、
3、4、5もしくは6位以内の位置のNRM修飾と、あるいは3’末端および5’末端の
両方から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位
以内の位置のNRM修飾とのうち1つまたは複数を有する第1鎖と、
配列を標的とし、3’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、
3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有する第2鎖、
配列を標的とし、5’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、
3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有する第2鎖(5’末端の修飾は、末
端よりむしろアンチセンス鎖の5’末端から1、2、3、4、5または6位離れた位置が
好ましい)、
配列を標的とし、3’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、
3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有し、さらに5’末端から1、2、3
、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM
修飾を有する第2鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にNRM修飾が存在しない第2鎖
、
配列を標的とし、切断部位または切断領域のNRM修飾、ならびに、3’末端から1、
2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位置の
NRM修飾、5’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4
、5もしくは6位以内の位置のNRM修飾、あるいは3’末端および5’末端の両方から
1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位
置のNRM修飾のうち1つまたは複数が存在しない第2鎖(5’末端の修飾は、末端より
むしろアンチセンス鎖の5’末端から1、2、3、4、5または6位離れた位置が好まし
い)。
鎖および第2鎖を有することが可能である。
配列を標的とし、3’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、
3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有する第1鎖、
配列を標的とし、5’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、
3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有する第1鎖(5’末端の修飾は、末
端よりむしろアンチセンス鎖の5’末端から1、2、3、4、5または6位離れた位置が
好ましい)、
配列を標的とし、3’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、
3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有し、さらに5’末端から1、2、3
、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM
修飾を有する第1鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にNRM修飾が存在しない第1鎖
、
配列を標的とし、切断部位または切断領域のNRM修飾、ならびに、3’末端から1、
2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位置の
NRM修飾、5’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4
、5もしくは6位以内の位置のNRM修飾、あるいは3’末端および5’末端の両方から
1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位
置のNRM修飾のうち1つまたは複数が存在しない第1鎖(5’末端の修飾は、末端より
むしろアンチセンス鎖の5’末端から1、2、3、4、5または6位離れた位置が好まし
い)と、
配列を標的とし、3’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、
3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有する第2鎖、
配列を標的とし、5’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、
3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有する第2鎖(5’末端の修飾は、末
端よりむしろアンチセンス鎖の5’末端から1、2、3、4、5または6位離れた位置が
好ましい)、
配列を標的とし、3’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、
3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM修飾を有し、さらに5’末端から1、2、3
、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位置にNRM
修飾を有する第2鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にNRM修飾が存在しない第2鎖
、
配列を標的にし、切断部位または切断領域のNRM修飾、ならびに、3’末端から1、
2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位置の
NRM修飾、5’末端から1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4
、5もしくは6位以内の位置のNRM修飾、あるいは3’末端および5’末端の両方から
1、2、3、4、5もしくは6位の位置または1、2、3、4、5もしくは6位以内の位
置のNRM修飾のうち1つまたは複数が存在しない第2鎖(5’末端の修飾は、末端より
むしろアンチセンス鎖の5’末端から1、2、3、4、5または6位離れた位置が好まし
い)。
RNA、例えばiRNA剤に、リボース模倣体を組み込むことが可能である。さらに本
発明は、リボース模倣体および本願明細書に記載する他の構成要素を有するiRNA剤を
含む。例えば本発明は、本願明細書に記載するiRNA剤、例えばパリンドローム構造の
iRNA剤、非標準的な対合を有するiRNA剤、本願明細書に記載する遺伝子、例えば
SNCA遺伝子を標的とするiRNA剤、本願明細書に記載する構成様式または構造を有
するiRNA剤、本願明細書に記載する両親媒性送達物質と結合したiRNA、本願明細
書に記載する薬剤送達モジュールと結合したiRNA、本願明細書に記載するように投与
されるiRNA剤、または本願明細書に記載するように製剤化されたiRNA剤であって
、リボース模倣体も組み込まれたiRNA剤を含む。
アーゼ耐性を与えることが可能である、第2ヒドロキシル基を含むiRNA剤を特徴とす
る。ヌクレアーゼ、例えば細胞ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解
し、核酸の部分的または完全な分解をもたらすことが可能である。第2ヒドロキシル基は
、この修飾を欠くiRNAと比べて、iRNA剤がヌクレアーゼ分解を受ける傾向を低下
させることによって、iRNA剤にヌクレアーゼ耐性を与える。理論によって縛られるこ
とは望まないが、iRNA剤上の第2ヒドロキシル基の存在が3’リボースのヒドロキシ
ル基の構造上の模倣体として働くことによって、iRNA剤が分解を受けにくくなると考
えられる。
している「OH」基を指す。上記のようにヌクレアーゼ耐性を与える第2ヒドロキシル基
は、任意の非環式炭素含有基の一部であってもよい。ヒドロキシル基は、任意の環式炭素
含有基の一部であってもよく、以下の条件、すなわち(1)ヒドロキシル基と末端リン酸
基の間にリボース部分が存在しないこと、または(2)該ヒドロキシル基は塩基と結合し
た糖部分には存在しないこと、のうち1つまたは複数に見合うことが好ましい。ヒドロキ
シル基は、iRNA剤の末端リン酸基のリンから、少なくとも2結合(化学結合2個)の
位置にある(例えば、少なくとも3結合離れて、少なくとも4結合離れて、少なくとも5
結合離れて、少なくとも6結合離れて、少なくとも7結合離れて、少なくとも8結合離れ
て、少なくとも9結合離れて、少なくとも10結合離れている)。好ましい実施形態では
、末端リン酸基のリンと第2ヒドロキシル基の間に5つの介在結合が存在する。
RNA剤送達モジュールは、以下の構造を有する(以下の式Yを参照):
む。iRNA剤は、リン酸基の「W」と直接的あるいは間接的に(例えばスペーサーまた
はリンカーを介して)結合することが可能である。これらのスペーサーまたはリンカーは
、例えば−(CH2)n−、−(CH2)nN−、−(CH2)nO−、−(CH2)n
S−、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH(例えば、n=3または6)、脱塩基性
の糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジス
ルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬および
フルオレセイン試薬を含むことが可能である。
基または修飾されている末端リン酸基を有し得る。修飾されているリン酸基では、Wおよ
びZは独立にNH、OまたはSであってよく;XおよびYは独立にS、Se、BH3 −、
C1〜C6アルキル、C6〜C10アリール、H、O、O−、アルコキシまたはアミノ(
アルキルアミノ、アリールアミノなどを含む)であってよい。W、XおよびZがOであり
、YがSであることが好ましい。
〜C100アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置
換されており、かつ/あるいは任意選択でN、O、S、アルケニルまたはアルキニルが挿
入されていてもよい。
択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ/あるい
は任意選択でN、O、S、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく;あるい
はnが1であるとき、R2がR4またはR6と合わさって5〜12原子の環を形成しても
よい。
択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ/あるい
は任意選択でN、O、S、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく;あるい
はnが1であるとき、R4がR2またはR5と合わさって5〜12原子の環を形成しても
よい。
択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ/あるい
は任意選択でN、O、S、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく;あるい
はnが1であるとき、R5がR4と合わさって5〜12原子の環を形成してもよい。
択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ/あるい
は任意選択でN、O、S、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく、あるい
はnが1であるとき、R6がR2と合わさって6〜10原子の環を形成してもよい。
であり;Tは水素または官能基であり;nおよびqはそれぞれ独立に1〜100であり;
R8はC1〜C10アルキルまたはC6〜C10アリールであり;かつR9は水素、C1
〜C10アルキル、C6〜C10アリールまたは固形支持体物質である。
を含むことが可能である。
RNAi剤送達モジュールの1つのサブセットでは、Aは該RNA剤の末端3’または
5’リボース糖の炭素を介して、直接的あるいは間接的に結合することが可能である。
である。
RNAi剤送達モジュールのさらに他のサブセットでは、nは1であり、R2とR6が
合わさって6原子を含む環を形成し、R4とR5が合わさって6原子を含む環を形成する
。環系はトランス−デカリンであることが好ましい。例えば、このサブセットのRNAi
剤送達モジュールは、式(Y−1)の化合物を含むことが可能である:
ーター基(例えばフルオロフォア)、または標識(同位元素で標識された部分)であって
よい。標的化基は、タンパク質結合物質、内皮細胞標的化基(例えばRGDペプチドおよ
び模倣体)、癌細胞標的化基(例えば葉酸ビタミンB12、ビオチン)、骨細胞標的化基
(例えばビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸)、多価マンノース
(例えばマクロファージ試験用)、ラクトース、ガラクトース、N−アセチル−ガラクト
サミン、モノクローナル抗体、糖タンパク質、レクチン、メラノトロピン、またはチロト
ロピンをさらに含むことが可能である。
には明らかであろう。合成した化合物を反応混合物から分離し、カラム・クロマトグラフ
ィ、高速液体クロマトグラフィ、または再結晶化などの方法によってさらに精製すること
が可能である。さらに、様々な合成工程を他の順序または順番で行って、所望の化合物を
与えることも可能である。本明細書に記載した化合物を合成する際に有用な、合成化学変
換および保護基に関する方法(保護および脱保護)は当分野で知られており、例えばアー
ル ラロック(R.Larock)、「Comprehensive Organic
Transformations」、VCH Publishers(1989);ティ
ー ダブリュー グリーン(T.W.Greene)およびピー エム ジー ワッツ(
P.G.M.Wuts)、「Protective Groups in Organi
c Synthesis」、第2版、John Wiley and Sons(199
1);エル ファイザー(L.Fieser)およびエム ファイザー(M.Fiese
r)、「Fieser and Fieser’s Reagents for Org
anic Synthesis」、John Wiley and Sons(1994
);およびエル パクエッテ(L.Paquette)、ed.、「Encyclope
dia of Reagents for Organic Synthesis」、J
ohn Wiley and Sons(1995)、ならびにその後続版に記載された
ものなどを含む。
iRNA剤の1つまたは複数の特性を最適化することが可能ないくつかの方法で、iR
NA剤を修飾することが可能である。RNA物質、例えばiRNA剤はリボース置換モノ
マーサブユニット(RRMS)、例えば本明細書中に記載されたRRMSなどを含むこと
が可能である。さらに、iRNA剤は、RRMSおよび本願明細書に記載する他の構成要
素を有することができる。例えば本発明は、本願明細書に記載のiRNA剤、例えばパリ
ンドローム構造のiRNA剤、非標準的な対合を有するiRNA剤、本願明細書に記載の
遺伝子、例えば腎臓中で活性がある遺伝子を標的とするiRNA剤、本願明細書に記載の
構成様式または構造を有するiRNA剤、本願明細書に記載の両親媒性送達物質と結合し
たiRNA、本願明細書に記載の薬剤送達モジュールと結合したiRNA、本願明細書に
記載のように投与されるiRNA剤、または本願明細書に記載のように製剤化されるiR
NA剤であって、RRMSも取り込むiRNA剤、を含む。
構成部分、例えば非糖質の(好ましくは環式の)担体で置換することが可能である。サブ
ユニットのリボース糖がこのように置換されているリボヌクレオチド・サブユニットを、
本願明細書ではRRMSと呼ぶ。環式担体は炭素環系(すなわち、すべての環原子が炭素
原子)であってもよいし、あるいはヘテロ環系(すなわち、1つまたは複数の環原子がヘ
テロ原子、例えば窒素、酸素、イオウ)であってもよい。環式担体は単環系であってよく
、あるいは2つ以上の環、例えば縮合環を含むことも可能である。環式担体は完全に飽和
な環系であってよく、あるいはそれは1つまたは複数の二重結合を含むことも可能である
。
とも1つの「連結部結合点」を含む。本願明細書で使用する「バックボーン結合点」は、
官能基、例えばヒドロキシル基、または一般的に、バックボーン(例えばリボ核酸のリン
酸バックボーンまたはイオウを含むなどの修飾リン酸バックボーン)への担体の取り込み
に利用可能かつ好適な結合を指す。本願明細書で使用する「連結部結合点」は、環式担体
の構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子(バックボーン結合点を提供する原子と
は異なるもの)であって、選択した構成部分と結合する原子を指す。選択した構成部分は
、例えばリガンド(例えば標的化部分または送達成分)、またはiRNA剤の物理的性質
(例えば親油性)を変える構成部分であってよい。場合によっては、選択した成分は、介
在する連結部によって環式担体と結合する。したがって選択した成分は、官能基(例えば
アミノ基)を含むか、または一般的に、他の化学的実体(例えば該構成環に対するリガン
ド)の取り込みまたは連結に適した結合を与えることになる。
へ取り込むことによって、特に適切な実体と連結された場合、1つまたは複数の新しい性
質を該RNA剤に与え、かつ/あるいは該RNA分子の1つまたは複数の既存の性質を変
化させ、高め、あるいは調節することが可能である。例えば、親油性またはヌクレアーゼ
耐性のうち1つまたは複数を変化させることが可能である。本願明細書に記載する1つま
たは複数のRRMSをiRNA剤中へ取り込むことによって、特にRRMSが適切な実体
と連結された場合、標的mRNAに対するiRNA剤の結合親和性を調節する(例えば増
大させる)ことが可能であり、iRNA剤の二重らせん形の形状を変化させることが可能
であり、分布を変化させることや、iRNA剤を身体の特定部分に向けることが可能であ
り、あるいは(例えばRISC形成時および鎖の分離時の)核酸結合タンパク質との相互
作用を改変することが可能である。
であって、式(R−1)を有する少なくとも1つのサブユニットが前記鎖のうち少なくと
も1つの中に取り込まれているiRNA剤を特徴とする。
R8、O、S、CR9R10であるかまたは存在せず、かつZはCR11R12であるか
または存在しない。
、(CH2)nORa、または(CH2)nORbである、ただし、R1、R2、R3、
R4、R9、およびR10の少なくとも1つはORaまたはORbであり、かつR1、R
2、R3、R4、R9、およびR10の少なくとも1つは(CH2)nORa、または(
CH2)nORbであり(RRMSが末端に存在するとき、R1、R2、R3、R4、R
9、およびR10の1つはRaを含み、かつ1つはRbを含み;RRMSが内部に存在す
るとき、R1、R2、R3、R4、R9、およびR10のうち2つがそれぞれRbを含む
);さらに、ORaは(CH2)nORbとともにのみ存在し、(CH2)nORaはO
Rbとともにのみ存在することが好ましいものとする。
3で置換されたC1〜C6アルキル、またはC(O)NHR7であり;あるいは、R5お
よびR11が一体となって、任意選択でR14により置換されたC3〜C8シクロアルキ
ルをなす。
ルであり;R13はヒドロキシ、C1〜C4アルコキシ、またはハロであり;かつR14
はNRcR7である。
Rbは
AとCのそれぞれは独立にOまたはSである。
BはOH、O−、または
RcはHまたはC1〜C6アルキルであり;RdはHまたはリガンドであり;nは1〜
4である。
またはNR7であり、YはCR9R10であり、かつZは存在しない。
他の好ましい実施形態では、リボースはピペリジン骨格で置換され、かつXはN(CO
)R7またはNR7であり、YはCR9R10であり、かつZはCR11R12である。
)R7またはNR7であり、YはNR8であり、かつZはCR11R12である。
他の好ましい実施形態では、リボースはモルホリノ骨格で置換され、かつXはN(CO
)R7またはNR7であり、YはOであり、かつZはCR11R12である。
り;YはCR9R10であり;かつZはCR11R12であり;かつR5およびR11は
一体となってC6シクロアルキルをなす。
CH2であり;YはCR9R10であり;かつZはCR11R12であり;かつR5およ
びR11は一体となってC5シクロアルキルをなす。
本願明細書に記載するRRMSは、本願明細書に記載する任意の二本鎖RNA様分子、
例えばiRNA剤に取り込ませることが可能である。iRNA剤は、ハイブリダイズした
センス鎖とアンチセンス鎖とからなる二本鎖を含むことが可能であり、このときアンチセ
ンス鎖および/またはセンス鎖は、本願明細書に記載する1つまたは複数のRRMSを含
むことが可能である。RRMSは、二本鎖iRNA剤の一方または両方の鎖の中の1つま
たは複数の個所に導入することが可能である。RRMSは、センス鎖の3’または5’端
またはその近く(1、2、または3位以内)に配置されてもよいし、あるいはアンチセン
ス鎖の3’端またはその近く(2または3位以内)に配置されてもよい。いくつかの実施
形態では、RRMSはアンチセンス鎖の5’端またはその近く(1、2、または3位以内
)にはないことが好ましい。RRMSは内部に存在してもよく、アンチセンスが標的と結
合するのに重要ではない領域中に位置することが好ましいであろう。
もしくは3位以内)にRRMSを有することが可能である。1実施形態では、iRNA剤
は、アンチセンス鎖の3’端(または3’端から1、2、もしくは3位以内)およびセン
ス鎖の3’端(または3’端から1、2、もしくは3位以内)に、RRMSを有すること
が可能である。1実施形態では、iRNA剤は、アンチセンス鎖の3’端(または3’端
から1、2、または3位以内)にRRMSを、およびセンス鎖の5’端にRRMSを有す
ることが可能であり、この場合両方のリガンドがiRNA剤の同じ端に位置する。
リガンドは疎水性の構成部分である。理論によって縛られることは望まないが、疎水性リ
ガンドが対になることにより、分子間のファン−デル−ワールス相互作用によって、iR
NA剤を安定化させることが可能であると考えられる。
または3位以内)にRRMSを、かつセンス鎖の5’端にRRMSを有することが可能で
あり、この場合両方のRRMSが、各RRMSとリガンド上の別々の位置との結合によっ
て、同じリガンド(例えばコール酸)を共有することが可能である。2つの隣接するRR
MS間で共有されるリガンドを、本願明細書では「ヘアピン・リガンド」と呼ぶ。
部位置にRRMSを有することが可能である。iRNA剤は、センス鎖の内部位置にRR
MSを有することが可能であり;あるいはアンチセンス鎖の内部位置にRRMSを有する
ことが可能であり;あるいはセンス鎖の内部位置にRRMSを、かつアンチセンス鎖の内
部位置にRRMSを有することも可能である。
上に位置する2つの配列ではなく2つの別個の分子であり、例えば生理的条件下、例えば
ヘリカーゼまたは他の巻き戻し酵素と接触しない生理的条件下でハイブリダイズする(お
よびそれによって二本鎖領域を形成する)ために互いに十分な相補性を有することが好ま
しい。
、第1配列および第2配列を選択することが好ましい。したがって、ds iRNA剤は
、好ましくは突出部を含むように対合した第1配列および第2配列を含み、該突出部は例
えば1つまたは2つの5’または3’突出部であり、ただし好ましくは2〜3ヌクレオチ
ドの3’突出部である。大部分の実施形態は3’突出部を有する。好ましいsRNA剤は
、それぞれの端に1ヌクレオチド長あるいは好ましくは2または3ヌクレオチド長の一本
鎖突出部、好ましくは3’突出部を有する。これらの突出部は、1本の鎖が他方より長い
結果でもよいし、あるいは同じ長さの2本の鎖がずれた結果でもよい。5’端はリン酸化
されていることが好ましい。
広く様々なもの(実体)を、iRNA剤に、例えばRRMSの担体に連結させることが
可能である。以下にRRMSと関連付けて実施例を記載するが、該RRMSは単に好まし
いものであるにすぎず、実体は他の地点においてiRNA剤に結合させることも可能であ
る。好ましい実体は、神経細胞、例えばSNCAを発現している神経細胞を標的とする実
体である。
合により、直接的あるいは介在する連結部を介して間接的に結合される。好ましい実施形
態では、リガンドは介在する連結部を介して担体に結合される。前に論じたように、リガ
ンドまたは連結部に連結されたリガンドは、RRMSモノマーが伸長する鎖に取り込まれ
るときにRRMSモノマー上に存在していてもよい。いくつかの実施形態では、「前駆体
」RRMSモノマーを伸長する鎖に取り込ませた後に、「前駆体」RRMSにリガンドを
取り込ませることが可能である。例を挙げれば、例えばアミノ末端を有する連結部を備え
た(すなわちリガンドが結合していない)RRMSモノマー、例えばTAP−(CH2)
nNH2を、伸長するセンスまたはアンチセンス鎖に取り込ませることが可能である。後
の操作において、すなわち前駆体モノマーを鎖に取り込ませた後、続いて、求電子基(例
えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基)を有するリガンドを、リガン
ドの求電子基と前駆体RRMSの連結部の末端求核基とのカップリングによって、前駆体
RRMSと結合させることが可能である。
的指向性または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのよう
なリガンドが存在しない分子種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞または細
胞種、コンパートメント、例えば細胞または器官のコンパートメント、組織、器官または
身体の領域に関する高い親和性をもたらす。例えば、好ましい実施形態では、リガンドに
より脳内などの神経細胞に対する選択性が向上することになる。好ましいリガンドは、二
本鎖の核酸における二本鎖の対合には関与しないであろう。
が可能であり、生成する天然または修飾オリゴリボヌクレオチド、または本願明細書に記
載するモノマーおよび/または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含ん
でなるポリマー分子の、ヌクレアーゼ耐性を向上させることも可能である。
ば分布を調べるための診断用化合物またはレポーター基;架橋剤;およびヌクレアーゼ耐
性を与える構成部分が挙げられる。一般例には、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タン
パク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体がある。
(HSA)、低密度リポタンパク質(LDL)、またはグロブリン);糖質(例えば、デ
キストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアル
ロン酸);または脂質などが挙げられる。リガンドは、合成ポリマー、例えば合成ポリア
ミノ酸などの、組換え分子または合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例には、ポリ
リシン(PLL)、ポリL−アスパラギン酸、ポリL−グルタミン酸、スチレン−無水マ
レイン酸コポリマー、ポリ(L−ラクチド−コ−グリコリド)コポリマー、ジビニルエー
テル−無水マレイン酸コポリマー、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコ
ポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(P
VA)、ポリウレタン、ポリ(2−アクリル酸エチル)、N−イソプロピルアクリルアミ
ドポリマー、またはポリホスファジンがある。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン
、ポリリシン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−
ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン
、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、また
はαらせん状ペプチドがある。
タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば神経細胞などの特定の細胞種と結合する抗体
も含み得る。
えばソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフ
ィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エ
ンドヌクレアーゼ(例えばEDTA)、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸
、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘ
キサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボ
ルネオール、メンソール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、
ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リトコール酸、O3−(オレオイル)コール酸、ジ
メトキシトリチル、またはフェノキサジン)、およびペプチド複合体(例えば、アンテナ
ペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、P
EG(例えばPEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置
換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えばビオチン)、輸送/吸収促進物
質(例えばアスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾ
ール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾ
ール複合体、テトラアザマクロ環のEu3+複合体)、ジニトロフェニル、HRP、また
はAPがある。1実施形態では、リガンドによりiRNA剤が血液脳関門を通り抜けやす
くなる可能性がある。
通のリガンドに関する特異的親和性を有する分子、または抗体(例えば神経細胞などの特
定の細胞種と結合する抗体)であってよい。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体
も含み得る。リガンドは、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、補因子、多価ラクトース、
多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン多価マ
ンノース、または多価フコースなどの、非ペプチドの分子種も含み得る。
イクロフィラメント、および/または中間径フィラメントを破壊することによって、細胞
内へのiRNA剤の取り込みを増大させることが可能な物質、例えば薬物であってよい。
薬物は例えば、タキソン(taxon)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラ
シン、ノコダゾール、ジャプラキノライド(japlakinolide)、ラトランク
リンA、ファロイジン、スウィンホライドA、インダノシン(indanocine)、
またはミオセルビン(myoservin)であってよい。
り込みを増大させることが可能である。このような効果を有すると思われる例示的なリガ
ンドには、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン−1β、またはγインターフ
ェロンがある。
子は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン(HSA)と結合することが好ましい
。HSA結合リガンドは、身体の標的組織、例えば肝臓以外の標的組織に、本発明の複合
体を分布させることが可能である。好ましくは、標的組織は脳である。HSAと結合する
ことが可能である他の分子も、リガンドとして使用することが可能である。例えば、ネプ
ロキシンまたはアスピリンを使用することが可能である。脂質または脂質系リガンドは、
(a)複合体の分解に対する耐性を増大させること、(b)標的細胞または細胞膜への標
的指向性または輸送を増大させることが可能であり、かつ/あるいは(c)血清タンパク
質、例えばHSAとの結合を調節するために使用することが可能である。
することが可能である。例えば、HSAとさらに強く結合する脂質または脂質系リガンド
は、肝臓に対する標的指向性が低くなると思われ、したがって身体から除去されにくくな
ると思われる。
合体が好ましくは非腎臓組織に分布するような十分な親和性で、HSAと結合することが
好ましい。しかしながら、その親和性は、HSAとリガンドとの結合が不可逆的であるほ
ど強くはないことが好ましい。
、例えばビタミンである。これらのリガンドは、望ましくない細胞増殖、例えば悪性また
は非悪性型の細胞増殖、例えば癌細胞の増殖によって特徴付けられる疾患を治療するのに
非常に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンA、E、およびKがある。他の例示
的なビタミンには、Bビタミン、例えば葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリド
キサール、あるいは癌細胞によって取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素がある。
HSAおよび低密度リポタンパク質(LDL)も含まれる。
ある。該物質は両親媒性であることが好ましい。例示的な物質は、tatまたはアンテナ
ペディアなどのペプチドである。該物質がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、イン
バートマー、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびD−アミノ酸の使用を含めて
、該ペプチドを改変することが可能である。らせん状物質は、親油性および撥油性の相を
好ましくは有する、αらせん状物質であることが好ましい。
書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ぶ)は、天然のペプチドと類似した一定の3次元構造
にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体と、iRNA剤が
結合することによって、細胞の認識および吸収を高めることなどにより、iRNAの薬物
動態学的分布に影響を与えることが可能である。ペプチドまたはペプチド模倣体の構成部
分は、約5〜50アミノ酸長、例えば約5、10、15、20、25、30、35、40
、45、または50アミノ酸長であってよい(例えば表3を参照)。
両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド(例えば、主にTyr、TrpまたはPheか
ら構成される)であってよい。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、制約型(con
strained)ペプチドまたは架橋ペプチドであってよい。ペプチド部分は、L−ペ
プチドでもD−ペプチドでもよい。他の代替例では、ペプチド部分は、疎水性の膜移行配
列(MTS)を含むことが可能である。例示的な疎水性MTS含有ペプチドは、アミノ酸
配列AAVALLPAVLLALLAP(配列番号46)を有するRFGFである。疎水
性MTSを含むRFGF類似体(例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP(配列番
号47))も、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド
、およびタンパク質を含めた大きな極性分子を、細胞膜を横切って運ぶことができる「送
達」ペプチドであってよい。例えば、HIV Tatタンパク質由来の配列(GRKKR
RQRRRPPQ(配列番号48))、およびショウジョウバエのアンテナペディア・タ
ンパク質由来の配列(RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号49))は、送達ペ
プチドとして機能しうることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファ
ージ・ディスプレイ・ライブラリー、または1ビーズ1化合物(OBOC)コンビナトリ
アル・ライブラリーから同定されたペプチドなど、DNAのランダムな配列によってコー
ドされてもよい(ラムら(Lam et al.)、Nature、354:82〜84
、1991)。取り込まれたモノマーユニットを介してiRNA剤と連結したペプチドま
たはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)ペプチド、ま
たはRGD模倣体などの、細胞標的化ペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長
さは、約5アミノ酸〜約40アミノ酸の範囲であってよい。ペプチド部分は、安定性を増
大させるため、あるいは立体構造上の特性を得るためなどの、構造的改変を有し得る。以
下に記載する任意の構造的改変を、使用することが可能である。
とが可能である。細胞透過性ペプチドは、核局在化シグナル(NLS)をも含み得る。例
えば、細胞透過性ペプチドは、HIV−1 gp41の融合ペプチドドメインとSV40
大型T抗原のNLSとに由来するMPGなどの、2部分の両親媒性ペプチドであってよい
(シメオニら(Simeoni et al.)、Nucl.Acids Res.31
:2717〜2724、2003)。
たはLペプチド;α、β、またはγペプチド;N−メチルペプチド;アザペプチド;1つまたは複数のアミドを有するペプチド、すなわち1つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で置換されたペプチド結合;または環状ペプチドを有するリガンドがある。
iRNA剤は、修飾塩基または非天然塩基、例えば本願明細書に記載の塩基を含むこと
が可能である。さらに、iRNA剤は、修飾または非天然塩基および本願明細書に記載す
るその他の要素を有することができる。例えば本発明は、本願明細書に記載するiRNA
剤、例えばパリンドローム構造のiRNA剤、非標準的な対合を有するiRNA剤、本願
明細書に記載する遺伝子、例えばSNCA遺伝子を標的とするiRNA剤、本願明細書に
記載する構成様式または構造を有するiRNA剤、本願明細書に記載する両親媒性送達物
質と結合したiRNA、本願明細書に記載する薬剤送達モジュールと結合したiRNA、
本願明細書に記載するように投与されるiRNA剤、または本願明細書に記載するように
製剤化されるiRNA剤であって、修飾または非天然塩基も取り込むiRNA剤を含む。
実施することが可能である。例えば、テゥルーフェルトら(Trufert et al
.)、Tetrahedron、52:3005、1996;およびManoharan
、「Oligonucleotide Conjugates in Antisens
e Technology」、Antisense Drug Technology、
ed中、エス ティー クルーク、マルセル デッカー、インコーポレイティッド社(S
.T.Crooke、Marcel Dekker,Inc.)、2001を参照のこと
。
造をとる制約型ペプチドを作製することが可能であり、該立体構造によってペプチドの効
力および選択性を増大させることが可能である。例えば、制約型ペプチドはアザペプチド
であってよい(Gante、Synthesis、405〜413、1989)。アミノ
酸側鎖の構造を変えずに、アミノ酸のα−炭素を窒素原子で置換することによって、アザ
ペプチドが合成される。例えば、ヒドラジンを「カルボニル・ドナー」、例えばクロロギ
酸フェニルと反応させることなどによって、伝統的なペプチド合成カップリング法におい
てヒドラジンを使用することによって、アザペプチドを合成することが可能である。
れるペプチドまたはペプチド模倣体)は、N−メチルペプチドであってよい。N−メチル
ペプチドはN−メチル・アミノ酸から構成されるが、N−メチル・アミノ酸はペプチドの
バックボーン中に追加のメチル基を与えることによってタンパク質分解酵素による切断に
対する他の耐性手段を与える可能性がある。N−メチルペプチドは、当分野で知られてい
る方法によって合成することが可能である(例えば、リンドグレンら(Lindgren
et al.)、Trends Pharmacol.Sci.21:99、2000
;Cell Penetrating Peptides:Processes and
Applications、Langel、ed.、CRC Press、Boca
Raton、FL、2002;フィッシェら(Fische et al.)、Bioc
onjugate.Chem.12:825、2001;ワンダーら(Wander e
t al.)、J.Am.Chem.Soc.、124:13382、2002を参照)
。例えば、AntペプチドまたはTatペプチドが、N−メチルペプチドであってもよい
。
れるペプチドまたはペプチド模倣体)は、β−ペプチドであってよい。β−ペプチドは、
溶液中でらせん、プリーツ・シート、ターンおよびヘアピンなどの安定した2次構造を形
成する。β−ペプチドの環状誘導体は、固体状態で折りたたまれてナノチューブになりう
る。β−ペプチドは、タンパク質分解酵素による分解に対して耐性がある。β−ペプチド
は、当分野で知られている方法によって合成することが可能である。例えば、Antペプ
チドまたはTatペプチドは、β−ペプチドであってもよい。
れるペプチドまたはペプチド模倣体)は、オリゴカルバメートであってよい。オリゴカル
バメートペプチドは、カルバメートトランスポーターによって促進される輸送経路により
細胞内に内在化する。例えば、AntペプチドまたはTatペプチドが、オリゴカルバメ
ートであってもよい。
れるペプチドまたはペプチド模倣体)は、ペプチド模倣体のアミド結合が尿素部分で置換
されているオリゴ尿素複合体(またはオリゴチオ尿素複合体)であってよい。アミド結合
の置換によって、タンパク質分解酵素、例えば胃腸間内でのタンパク質分解酵素による分
解に対する高い耐性が与えられる。1実施形態では、オリゴ尿素複合体を、経口送達にお
いて使用するためにiRNA剤と連結させる。オリゴ尿素ペプチド模倣体のそれぞれの繰
り返しユニット中のバックボーンは、天然アミノ酸と比較して1炭素原子だけ広がる可能
性がある。1炭素原子の広がりによって、例えばペプチドの安定性および親油性が増大す
る可能性がある。したがってオリゴ尿素ペプチドは、iRNA剤が細菌細胞壁の通過を目
的とするとき、あるいは神経障害の治療などのためにiRNA剤が血液−脳関門を横断し
なければならないときに、有利である可能性がある。1実施形態では、受容体との高い親
和性を生み出すために、水素結合ユニットをオリゴ尿素ペプチドに結合させる。例えば、
AntペプチドまたはTatペプチドが、オリゴ尿素複合体(またはオリゴチオ尿素複合
体)であってもよい。
と関連付ける、例えば連結させることが可能である。例えばペプチドを、センス鎖上また
はアンチセンス鎖上のいずれかにおいて末端に結合させてもよいし、ペプチドをビス結合
(1つのペプチドが各端で連結され、一端がセンス鎖に結合し、一端がアンチセンス鎖に
結合する)。他の選択肢では、ペプチドは、短いヘアピン構造のiRNA剤のループ中な
ど、内部に結合し得る。さらに他の選択肢では、ペプチドはペプチド−担体複合体などの
複合体と関連付けられてもよい。
たは複数のiRNA剤を内包しうる少なくとも1つの担体分子と、担体複合体を特定の組
織または細胞種に対して指向させるためなどの、前記担体分子の外側に連結されたペプチ
ド部分とから構成される。担体複合体は、該複合体の外側に追加の標的化分子、または細
胞への送達を助ける細胞融合剤を担持することも可能である。担体内に被包される1つま
たは複数のiRNA剤を、担体の内部への物質の送達を助けることが可能な親油性分子と
結合させてもよい。
ム)、ナノ粒子、ミクロスフェア、または生分解性ポリマーであってよい。ペプチド部分
は、ジスルフィド結合、酸不安定結合、ペプチド系結合、オキシアミノ結合またはヒドラ
ジン結合などの様々な結合によって、担体分子と連結することが可能である。例えば、ペ
プチド系結合はGFLGペプチドであってよい。いくつかの結合は個々の利点を有し、そ
の利点(または欠点)を、標的組織または目的とする用途に応じて考慮することが可能で
ある。例えば、ペプチド系結合は血流中では安定性があるが、リソソーム中では酵素によ
る切断を受けやすい。
用語「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素の任意の基を指す。
用語「アルキル」は、示した数の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す
。例えば、C1〜C12アルキルとは、該基が1個〜12個の炭素原子をその中に有する
ことが可能であることを示す。用語「ハロアルキル」は、1つまたは複数の水素原子がハ
ロによって置換されているアルキルを指し、すべての水素がハロによって置換されている
アルキル部分(例えばペルフルオロアルキル)を含む。アルキルおよびハロアルキル基は
、任意選択でO、N、またはSが挿入されていてもよい。用語「アラルキル」は、アルキ
ル水素原子がアリール基によって置換されているアルキル部分を指す。アラルキルは、2
つ以上の水素原子がアリール基によって置換されている基を含む。「アラルキル」の例に
は、ベンジル、9−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基がある。
ことを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。典型的なアルケニルの例には
、アリル、プロペニル、2−ブテニル、3−ヘキセニルおよび3−オクテニル基があるが
、これらだけには限られない。用語「アルキニル」は、2〜8個の炭素原子を含み1つま
たは複数の三重結合を有することを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。
典型的なアルキニルのいくつかの例は、エチニル、2−プロピニル、および3−メチルブ
チニル、およびプロパルギルである。sp2およびsp3炭素が、任意選択で、それぞれ
アルケニル基およびアルキニル基の結合点として作用してもよい。
で置換されたアルキルを指す。用語「メルカプト」は、−SH基を指す。用語「チオアル
コキシ」は、−S−アルキル基を指す。
2CH2−、および−CH2CH2CH2−を指す。用語「アルキレンジオキソ」は、構
造−O−R−O−(Rはアルキレンを表す)の2価の分子種を指す。
、芳香族単環、2環、または3環炭化水素環系を指す。アリール部分の例には、フェニル
、ナフチル、およびアントラセニルがあるが、これらだけには限られない。
よって置換することが可能な、3〜12個の炭素を有する飽和環状、2環、3環、または
多環炭化水素基を含む。本願明細書に記載するシクロアルキル基は、縮合環も含み得る。
縮合環は、共通の炭素−炭素結合を共有する環である。シクロアルキル部分の例には、シ
クロヘキシル、アダマンチル、およびノルボルニルがあるが、これらだけには限られない
。
1〜14員の3環の環系であって、単環の場合1〜3個のヘテロ原子、2環の場合1〜6
個のヘテロ原子、または3環の場合1〜9個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がO、
N、またはSから選択されることを特徴とする環系(例えば炭素原子と、単環、2環、ま
たは3環である場合、N、OまたはSのヘテロ原子それぞれ1〜3個、1〜6個、または
1〜9個)であり、置換可能な任意の環原子を置換基によって置換することが可能な環系
を指す。本願明細書に記載するヘテロシクリル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通
の炭素−炭素結合を共有する環である。ヘテロシクリルの例には、テトラヒドロフラニル
、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピロリニルおよびピロリジニルが
あるが、これらだけには限られない。
14員の3環の環系であって、単環の場合1〜3個のヘテロ原子、2環の場合1〜6個の
ヘテロ原子、または3環の場合1〜9個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がO、N、
またはSから選択されることを特徴とする環系(例えば炭素原子と、単環、2環、または
3環である場合、N、OまたはSのヘテロ原子それぞれ1〜3個、1〜6個、または1〜
9個)であり、置換可能な任意の環原子を置換基によって置換することが可能な環系を指
す。
る場合はN−オキシドを形成し、イオウと結合している場合はスルホキシドまたはスルホ
ンを形成する酸素原子を指す。
ルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル
、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指す。
リル、ヘテロシクロアルケニル、シクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリール基
上で該基の任意の原子について「置換された」基を指す。適切な置換基には、制限を設け
るものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ
、シアノ、ニトロ、アミノ、SO3H、硫酸、リン酸、ペルフルオロアルキル、ペルフル
オロアルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、カルボキシル、オキソ、チオオ
キソ、イミノ(アルキル、アリール、アラルキル)、S(O)nアルキル(nは0〜2)
、S(O)nアリール(nは0〜2)、S(O)nヘテロアリール(nは0〜2)、S(
O)nヘテロシクリル(nは0〜2)、アミン(モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキ
ル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ)、エステル(アルキル、ア
ラルキル、ヘテロアラルキル)、アミド(モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロ
アラルキル、およびこれらの組合せ)、スルホンアミド(モノ−、ジ−、アルキル、アラ
ルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ)、非置換アリール、非置換ヘテロア
リール、非置換ヘテロシクリル、および非置換シクロアルキルがある。1態様では、基上
の置換基は独立に、前述の置換基のいずれか1つ、またはいずれかのサブセットである。
アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルの基を指す。
本願明細書で使用する「通常でない」核酸塩基は、以下のいずれか1つを含むことが可
能である:
2−メチルアデニニル、
N6−メチルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−メチルアデニニル、
N6−イソペンテニルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニニル、
N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデニニル、
2−メチルチオ−N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデニニル、
N6−グリシニルカルバモイルアデニニル、
N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
N6−メチル−N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
N6,N6−ジメチルアデニニル、
3−メチルシトシニル、
5−メチルシトシニル、
2−チオシトシニル、
5−ホルミルシトシニル、
5−ヒドロキシメチルシトシニル、
1−メチルグアニニル、
N2−メチルグアニニル、
7−メチルグアニニル、
N2,N2−ジメチルグアニニル、
N2,N2,7−トリメチルグアニニル、
1−メチルグアニニル、
7−シアノ−7−デアザグアニニル、
7−アミノメチル−7−デアザグアニニル、
プソイドウラシリル、
ジヒドロウラシリル、
5−メチルウラシリル、
1−メチルプソイドウラシリル、
2−チオウラシリル、
4−チオウラシリル、
2−チオチミニル
5−メチル−2−チオウラシリル、
3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウラシリル、
5−ヒドロキシウラシリル、
5−メトキシウラシリル、
ウラシリル5−オキシ酢酸、
ウラシリル5−オキシ酢酸メチルエステル、
5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシリル、
5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシリルメチルエステル、
5−メトキシカルボニルメチルウラシリル、
5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシリル、
5−アミノメチル−2−チオウラシリル、
5−メチルアミノメチルウラシリル、
5−メチルアミノメチル−2−チオウラシリル、
5−メチルアミノメチル−2−セレノウラシリル、
5−カルバモイルメチルウラシリル、
5−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、
5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシリル、
3−メチルウラシリル、
1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)プソイドウラシリル、
5−カルボキシメチルウラシリル、
5−メチルジヒドロウラシリル、または
3−メチルプソイドウラシリル。
RNA、例えばiRNA剤は、本願明細書に記載するパリンドローム構造を有すること
が可能である。例えば、本発明のiRNA剤は、2つ以上のRNA領域を標的とすること
が可能である。例えばiRNA剤は、互いにハイブリダイズするのに十分相補的な第1配
列および第2配列を含むことが可能である。第1配列はSNCAのRNAの第1の標的配
列と相補的であってよく、第2配列はSNCAのRNAの第2の標的配列と相補的であっ
てよい。第1の標的配列と第2の標的配列は、少なくとも1ヌクレオチド異なっていると
よい。iRNA剤の第1配列および第2配列が異なるRNA鎖上にあり、かつ第1配列と
第2配列の間のミスマッチを、50%、40%、30%、20%、10%、5%、または
1%未満とすることができる。iRNA剤の第1配列および第2配列が同じRNA鎖上に
あり、かつ関連実施形態では、該iRNA剤の50%、60%、70%、80%、90%
、95%より多く、あるいは1%が、2分子の形態であってもよい。iRNA剤の第1配
列と第2配列が、互いに完全に相補的であってもよい。
例えばSNCA遺伝子の第1および第2の対立遺伝子によってコードされる転写物上に存
在してもよい。配列の変異は、例えば突然変異、または多型性であってよい。第1の標的
RNA領域が、第2の標的RNA領域と比べてヌクレオチドの置換、挿入、または欠失を
含むことも可能であり、あるいは第2の標的RNA領域が、第1の標的領域の突然変異体
または変異体であることも可能である。
iRNA剤は、互いにハイブリダイズするのに十分相補的な第1配列および第2配列を含
むことが可能であり、さらに第1配列は第1の標的RNA領域と相補的であり、第2配列
は第2の標的RNA領域と相補的である。この混合物は、互いにハイブリダイズするのに
十分相補的な第3配列および第4配列を含む、少なくとも1つの他の種類のiRNA剤を
含むことも可能であり、この場合第3配列は第3の標的RNA領域と相補的であり、第4
配列は第4の標的RNA領域と相補的である。さらに、第1配列または第2配列は、第3
配列または第4配列と、互いにハイブリダイズすることが可能であるほど十分相補的であ
ってもよい。第1配列と第2配列は同じRNA鎖上に存在しても異なるRNA鎖上に存在
してもよく、第3配列と第4配列は同じRNA鎖上に存在しても異なるRNA鎖上に存在
してもよい。
NCAの第2の変異体RNA標的領域と相補的な第2配列を含むことが可能である。第1
および第2の変異体RNA標的領域は、標的SNCA遺伝子の対立遺伝子変異、突然変異
(例えば点突然変異)、または多型を含んでいてもよい。標準的なワトソン−クリック以
外の二本鎖構造。
RNA、例えばiRNA剤は、別のモノマー、例えば別の鎖上のモノマーと標準的なワ
トソンクリック以外の対合を形成することができるモノマーを包含することができる。二
本鎖のモノマー間の「標準的なワトソン−クリック以外の対合」の使用は、二本鎖のすべ
て又は一部の融解を制御(多くの場合は促進)するのに使用することができる。iRNA
剤は、選択された位置又は制約された位置にモノマーを包含することができ、その結果、
iRNA剤二本鎖における(例えば、二本鎖iRNA剤の2つの別個の分子間での)第1
のレベルの安定性、及びiRNA剤の配列と別の配列分子(例えば、対象者における標的
配列又はオフターゲット(標的ではない)配列)との間の二本鎖における第2のレベルの
安定性をもたらす。場合によっては、第2の二本鎖は、例えばiRNA剤のアンチセンス
配列と標的mRNAとの間の二本鎖において、比較的高いレベルの安定性を有する。この
場合、1つ又はそれ以上のモノマー、iRNA剤におけるモノマーの位置、及び標的配列
(本明細書中では、選択パラメータ又は制約パラメータと称することもある)の選択は、
iRNA剤二本鎖が比較的低い会合の自由エネルギーを有する(メカニズム又は理論によ
り拘束されることを望まないが、このことはRISCに関しては二本鎖iRNA剤の解離
を促進することにより有効性に寄与すると考えられる)一方で、標的指向性のアンチセン
ス配列とその標的配列との間で形成される二本鎖が、比較的高い会合の自由エネルギーを
有する(メカニズム又は理論により拘束されることを望まないが、このことはアンチセン
ス配列と標的RNAとの会合を促進することにより有効性に寄与すると考えられる)よう
になされる。
NAとの間の二本鎖において、比較的低いレベルの安定性を有する。この場合、1つ又は
それ以上のモノマー、iRNA剤におけるモノマーの位置、及びオフターゲット配列の選
択は、iRNA剤二本鎖が比較的高い会合の自由エネルギーを有する一方で、標的指向性
のセンス配列とそのオフターゲット配列との間で形成される二本鎖が、比較的低い会合の
自由エネルギーを有する(メカニズム又は理論により拘束されることを望まないが、セン
ス鎖とオフターゲット配列から形成される二本鎖の解離を促進することにより、オフター
ゲット配列をサイレンシングするレベルを低減すると考えられる)ようになされる。
配列と別のRNA、例えば標的mRNAとの間で形成される二本鎖に関する第2の安定性
を有するという特性は、iRNA剤の構造において固有のものである。上述のように、こ
の特性は、選択された位置又は制約された位置の1つ又はそれ以上のモノマーの慎重な選
択、選択された位置又は制約された位置を設定するための二本鎖における位置の選択、及
び標的配列の配列(例えば、標的とされるべき標的遺伝子の特定の領域)の選択により達
成され得る。これらの要件を満たすiRNA剤配列は、本明細書中では制約配列と称する
こともある。制約パラメータ又は選択パラメータは、例えば、検査により、あるいはコン
ピュータ支援方法により達成することができる。パラメータの使用により、例えば二本鎖
の安定性又は相対安定性に関して所望の結果が得られるように、標的配列及び特定のモノ
マーを選択することができる。
2の標的領域を標的とする第2の配列を包含するiRNA剤を特徴とする。第1の配列及
び第2の配列は、例えば生理学的条件下で(例えば、生理学的条件下であるが、ヘリカー
ゼ又は他の巻き戻し酵素とは接触しない条件下で)互いにハイブリダイズするのに十分な
相補性を有する。iRNA剤の二本鎖領域では、選択された位置又は制約された位置で、
第1の標的領域が第1のモノマーを有し、第2の標的領域が第2のモノマーを有する。第
1のモノマー及び第2のモノマーは、相補的位置又は対応する位置を占める。一方のモノ
マー、及び好ましくは両方のモノマーが、第1の配列と第2の配列との間での二本鎖に寄
与するモノマーの対合の安定性が、第1の配列又は第2の配列と標的配列との間での対合
の安定性と異なるように選択される。
ーとその相補的モノマーとの対合により保有されるであろう解離の自由エネルギー及びT
mよりも、低い解離の自由エネルギー及び低いTmを有するiRNA剤二本鎖における対
合をモノマーが形成するように選択される(標的配列の選択も同様に要求され得る)。
る。例えば、iRNA剤二本鎖において、2個以上であるが、3個未満、4個未満、5個
未満、6個未満又は7個未満の部位に制約が適用され得る。
えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の配列の3’末端又は5’末端の一方から3位、
4位、5位又は6位以内の位置に存在することができる。制約部位又は選択部位は、二本
鎖領域の中央に存在することもでき、例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の領域の
末端から4位以上、5位以上、6位以上又は7位以上の位置であり得る。
複数)のほかに、ミスマッチを有する。好ましくは、iRNA剤の二本鎖領域は、標準的
なワトソン−クリック対を形成しないか、又はハイブリダイズしない1個以下、2個以下
、3個以下、4個以下又は5個以下の塩基を有する。突出部については、本明細書中の他
の箇所で詳述しているが、好ましくは約2ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされ
る遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、又は他の配列でもよい。TTは、突出部
の好ましい配列である。第1のiRNA剤配列及び第2のiRNA剤配列はまた、例えば
ヘアピンを形成するための追加の塩基により、あるいは他の非塩基リンカーにより連結さ
せることもできる。
は天然に存在する塩基を有する修飾リボヌクレオチドであるように、かつ、相補的部位を
占有する場合、対合もせず実質的レベルのH結合も有さないか、又は非標準的ワトソン−
クリック対合を形成して非標準的なH結合のパターンを形成する(通常、標準的なワトソ
ン−クリック対合で見られるよりも低い解離の自由エネルギーを有するか、あるいはそう
でなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、例えば標準的な対合の
会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーとなるように対合する)ように選
択することができる。iRNA剤の配列の一方(又は両方)が標的と二本鎖を形成する場
合、第1の(又は第2の)モノマーは、標的上の相補的位置にある塩基と標準的なワトソ
ン−クリック対合を形成するか、あるいはiRNA剤における対合で見られるよりも高い
解離の自由エネルギー及び高いTmを有する非標準的なワトソン−クリック対を形成する
。古典的なワトソン−クリック対は、以下の通りである:A−T、G−C及びA−U。非
標準的なワトソン−クリック対合は、当該技術分野で既知であり、U−U、G−G、G−
Aトランス、G−Aシス及びGUを挙げることができる。
他方の配列の対応するモノマーとの対を形成し、その対が安定性を最小限にする(例えば
、一方の配列の選択部位のモノマーと他方の配列の対応する部位のモノマーとの間で形成
されるH結合は、一方(又は両方)の配列のモノマーと各々の標的配列とにより形成され
るH結合よりも安定性が劣る)ようになされる。一方又は両方の鎖のモノマーの選択はま
た、鎖とその標的配列により作製される二本鎖の一方又は両方における安定性を促進する
ように為される。例えば、1つ又はそれ以上のモノマー及び標的配列の選択は、選択位置
又は制約位置で、iRNA剤二本鎖中でH結合が形成されないか、もしくは非標準的な対
合が形成されるか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満
であるか、又は例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネル
ギーを付与するように対合するが、一方(又は両方の)配列が各々の標的と二本鎖を形成
する場合は、選択部位又は制約部位での対合は標準的なワトソン−クリック対であるよう
にすることができる。
RNA剤二本鎖を不安定化すること、センス配列と意図されない標的配列(オフターゲッ
ト配列と称することもある)との間の相互作用を不安定化すること、配列と意図される標
的との間の相互作用は不安定化されないこと、を有することになる。
ないモノマー又は修飾モノマーがiRNA剤の選択位置又は制約位置に配置される場合は
第1の解離の自由エネルギーを示し、かつそれらの一方(又は両方)が天然に存在するモ
ノマーと対合する場合は、対が第2の解離の自由エネルギーを示す(通常、第2の解離の
自由エネルギーは、第1のモノマーと第2のモノマーの対合の解離の自由エネルギーより
も高い)ように実施することができる。例えば、第1のモノマー及び第2のモノマーが相
補的位置を占める場合、第1のモノマー及び第2のモノマーは、対合もせず、実質的レベ
ルのH結合も有さないか、又は、該モノマーの一方が天然に存在するモノマーと形成する
よりも弱い結合を形成して、その二本鎖の安定性を低減するが、その二本鎖が解離すると
、少なくとも一方の鎖は標的と二本鎖を形成し、標的との二本鎖においては、選択モノマ
ーは安定性を促進する(例えばモノマーは、標的配列中の天然に存在するモノマーと、i
RNA剤において形成される対合よりも安定な対を形成する)。
れかである。
iRNA剤の相補的位置に配置される場合、これらのモノマーはほとんど対合せず、安
定性は最小限となる。しかしながら、2−アミノAと天然に存在する標的のUとの間で二
本鎖が形成されるか、あるいは、2−チオUと天然に存在する標的のAとの間、又は2−
チオTと天然に存在する標的のAとの間で二本鎖が形成され、比較的高い解離の自由エネ
ルギーを有し、かつより安定となる。
、二本鎖の第1の配列の第1のモノマーと第2の配列の対応する位置の第2のモノマーと
の間での対合であって、下記のうち1つまたはそれ以上が事実であるものを指す:(1)
該2つのモノマーの間に本質的に対合が存在しない、例えばモノマー間に有意なレベルの
H結合が存在しないか、あるいはモノマー間の結合が二本鎖の安定性に対していかなる有
意な寄与もしていない、(2)該モノマーが、天然に存在する塩基を有する非標準的なモ
ノマー対である、すなわち、A−T、A−U又はG−C以外であり、かつ該モノマーは、
モノマー間のH結合を形成するが、概して形成されるH結合パターンは、標準的な対合に
より形成される結合よりも弱い、あるいは(3)該モノマーの少なくとも1つは天然に存
在しない塩基を包含し、かつモノマー間で形成されるH結合は、好ましくは、標準的な対
合すなわちA−T、A−U、G−Cのうち1つ又はそれ以上により形成される結合よりも
弱い。
べき配列以外の配列を指す。
普遍的塩基:「ワイルドカード」;形状に基づいた相補性
(「ジフルオロトルエンとアデニンとの間の塩基対の、二本鎖の多重部位における複製
:「逆」シーケンシングによる確認(Bi-stranded, multisite replication of a base p
air betweendifluorotoluene and adenine: confirmation by 'inverse' sequencing.)
」、リウ、ディー;モラン、エス;クール、イー.ティー(Liu,D.;Moran,
S;Kool,E.T.)、Chem.Biol.、1997年、第4巻、919〜92
6ページ)
る末端塩基対水素結合の重要性(Importance of terminal base pair hydrogen-bonding
in 3'-endproofreading by the Klenow fragment of DNA polymerase I.)」、モラレス
、ジェー.シー;クール、イー.ティー(Morales,J.C;Kool,E.T.
)、Biochemistry、2000年、第39巻、2626〜2632ページ)
(「水素結合を伴わない選択的かつ安定なDNA塩基対合(Selective and stable DNA
basepairing without hydrogen bonds. )」、マトレイ、ティー、ジェー;クール、イ
ー、ティー(Matray,T.J;Kool,E.T.)、J.Am.Chem.So
c.,1998年、第120巻、6191〜6192ページ)
異的かつ効率的にアデニンをコードする(Difluorotoluene, a nonpolar isostere for t
hymine, codesspecifically and efficiently for adenine in DNA replication.)」、
モラン、S;レン、アール.エックス.−エフ;ラムネイ アイブイ、エス;クール、イ
ー.ティー(Moran,S.Ren,R.X.−F;Rumney IV,S;Koo
l,E.T.)、J.Am.Chem.Soc.、1997年、第119巻、2056〜
2057ページ)
(「デオキシアデノシンに関する複製可能な無極性同配体の構造及び塩基対特性(Stru
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Qは、N又はCR44であり、
Q’は、N又はCR45であり、
Q”は、N又はCR47であり、
Q’’’は、N又はCR49であり、
Qivは、N又はCR50であり、
R44は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、NH2、NHRb、又
はNRbRc、C1〜C6アルキル、C6〜C10アリール、C6〜C10ヘテロアリー
ル、C3〜C8ヘテロシクリルであるか、あるいはR45と一体となって−OCH2O−
を形成し、
R45は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、NH2、NHRb、又
はNRbRc、C1〜C6アルキル、C6〜C10アリール、C6〜C10ヘテロアリー
ル、C3〜C8ヘテロシクリルであるか、あるいはR44又はR46と一体となって−O
CH2O−を形成し、
R46は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、NH2、NHRb、又
はNRbRc、C1〜C6アルキル、C6〜C10アリール、C6〜C10ヘテロアリー
ル、C3〜C8ヘテロシクリルであるか、あるいはR45又はR47と一体となって−O
CH2O−を形成し、
R47は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、NH2、NHRb、又
はNRbRc、C1〜C6アルキル、C6〜C10アリール、C6〜C10ヘテロアリー
ル、C3〜C8ヘテロシクリルであるか、あるいはR46又はR48と一体となって−O
CH2O−を形成し、
R48は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、NH2、NHRb、又
はNRbRc、C1〜C6アルキル、C6〜C10アリール、C6〜C10ヘテロアリー
ル、C3〜C8ヘテロシクリルであるか、あるいはR47と一体となって−OCH2O−
を形成し、
R49、R50、R51、R52、R53、R54、R57、R58、R59、R60
、R61、R62、R63、R64、R65、R66、R67、R68、R69、R70
、R71及びR72はそれぞれ独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロ
キシ、NH2、NHRb、又はNRbRc、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルキニル
、C6〜C10アリール、C6〜C10ヘテロアリール、C3〜C8ヘテロシクリル、N
C(O)R17、又はNC(O)R0から選択され、
R55は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、NH2、NHRb、又
はNRbRc、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルキニル、C6〜C10アリール、C
6〜C10ヘテロアリール、C3〜C8ヘテロシクリル、NC(O)R17、又はNC(
O)R0であるか、あるいはR56と一体となって縮合芳香環を形成し、該縮合芳香環は
任意選択で置換されていてもよく、
R56は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、NH2、NHRb、又
はNRbRc、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルキニル、C6〜C10アリール、C
6〜C10ヘテロアリール、C3〜C8ヘテロシクリル、NC(O)R17、又はNC(
O)R0であるか、あるいはR55と一体となって縮合芳香環を形成し、該縮合芳香環は
任意選択で置換されていてもよく、
R17は、ハロ、NH2、NHRb、又はNRbRcであり、
Rbは、C1〜C6アルキル又は窒素保護基であり、
RCは、C1〜C6アルキルであり、
R0は、任意選択でハロ、ヒドロキシ、ニトロ、保護ヒドロキシ、NH2、NHRb、
又はNRbRc、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルキニル、C6〜C10アリール、
C6〜C10ヘテロアリール、C3〜C8ヘテロシクリル、NC(O)R17、又はNC
(O)R0で置換されたアルキルである。)
普遍的塩基の例として以下のものが挙げられる:
RNA、例えばiRNA剤は、本明細書中に記載するように、かつ2004年3月8日
付けで出願された国際出願第PCT/US04/07070号(これは、参照により本明
細書に援用される)に記載されるように、非対称的に修飾することができる。
RNA剤を包含する。例えば、本発明は、本明細書中に記載するiRNA剤、例えば、パ
リンドローム構造のiRNA剤、非標準的な対合を有するiRNA剤、本明細書中に記載
する遺伝子(例えば、SNCA遺伝子)を標的とするiRNA剤、本明細書中に記載する
構成様式又は構造を有するiRNA剤、本明細書中に記載する薬物送達モジュールと結合
されたiRNA、本明細書中に記載するように投与されるiRNA剤、又は本明細書中に
記載するように製剤化されるiRNA剤であって、非対称的な修飾も取り入れるiRNA
剤を包含する。
NA剤である。非対称的な修飾とは、一方の鎖上に見られるが、他方の鎖上には見られな
い修飾である。任意の修飾、例えば本明細書中に記載する任意の修飾は、非対称的な修飾
として存在し得る。非対称的な修飾により、修飾に伴う任意の望ましい特性、例えば本明
細書中で論述した特性を付与することができる。例えば、非対称的な修飾は、分解に対す
る耐性、半減期の変更をもたらすこともできるし、iRNA剤に特定の標的(例えば、特
定の組織)を指向させることもできるし、鎖のその相補体又は標的配列に対する親和性を
調節(例えば、増大又は低減)することもできるし、あるいは末端部分の修飾(例えば、
キナーゼ又はRISC機構の経路に関与する他の酵素による修飾)を妨害又は促進するこ
ともできる。ある修飾について1つの特性を有するものとして指定しても、該修飾が他の
特性を有していないことを意味するわけではない(例えば、安定化を促進する修飾として
言及される修飾が、標的化も増強することもありうる)。
な修飾は、iRNA剤をセンス鎖及びアンチセンス鎖の異なるすなわち「非対称的」機能
という観点で最適化させることが可能であると考えられる。例えば、両方の鎖がヌクレア
ーゼ耐性を増大するように修飾されてもよいが、変更によってはRISC活性が阻害され
得るため、これらの変更をセンス鎖に関して選択してもよい。さらに、一部の修飾、例え
ば標的化部分は、例えばRISC複合体の切断活性を妨害しうる大きな嵩高い基を付加す
ることができるので、そのような修飾はセンス鎖に配置されることが好ましい。したがっ
て、標的化部分、特に嵩高い標的化部分(例えば、コレステロール)は、センス鎖に優先
的に付加される。一実施形態では、バックボーンのリン酸をSで置換する非対称的修飾、
例えばホスホロチオエート修飾がアンチセンス鎖に存在し、かつ2’修飾、例えば2’O
Meがセンス鎖に存在する。標的化部分は、iRNA剤のセンス鎖の5’又は3’末端の
いずれか(又は両方)に存在し得る。好ましい例では、アンチセンス鎖においてはバック
ボーンのPがSで置き換えられ、2’OMeがセンス鎖に存在し、標的化部分がiRNA
剤のセンス鎖の5’又は3’末端のいずれかに付加される。
られない修飾をセンス鎖上に有し、アンチセンス鎖は、センス鎖上では見られない修飾を
有する。
鎖は、iRNA剤に対して第1の特性を付与する第1の非対称的修飾を包含することがで
き、他方の鎖は、iRNAに対して第2に特性を付与する第2の非対称的修飾を有するこ
とができる。例えば、一方の鎖、例えばセンス鎖は、iRNA剤が組織を標的とするよう
な修飾を有することができ、他方の鎖、例えばアンチセンス鎖は、標的遺伝子配列とのハ
イブリダイゼーションを促進する修飾を有する。
する耐性を増大させるように修飾することができるが、例えば修飾がさらに他の特性に影
響を及ぼすという理由で、センス鎖及びアンチセンス鎖に関して異なる修飾が選ばれる。
例えば、一部の変更は、RISC活性に影響を及ぼし得るため、これらの修飾はセンス鎖
について選ばれる。
他方の鎖は、リン酸バックボーンの非対称的修飾、例えばホスホロチオエート修飾を有す
る。したがって、一実施形態では、アンチセンス鎖が非対称的な2’OMe修飾を有し、
センス鎖が非対称的なホスホロチオエート修飾を有する(あるいは、その逆でもよい)。
特に好ましい実施形態では、本発明のiRNA剤は、センス鎖上に非対称的な2’−Oア
ルキル、好ましくは2’−OMe修飾を、アンチセンス鎖には非対称的なバックボーンの
P修飾、好ましくはホスホロチオエート修飾を有する。1つ又は多数の2’−OMe修飾
が存在することができ、例えば、センス鎖の少なくとも2個、3個、4個、5個又は6個
のサブユニットを2’−OMe修飾することができる。1つ又は多数のホスホロチオエー
ト修飾が存在することができ、例えば、アンチセンス鎖の少なくとも2個、3個、4個、
5個又は6個のサブユニットをホスホロチオエート修飾することができる。センス鎖上に
多数の2’−OMe修飾及びアンチセンス鎖上に多数のホスホロチオエート修飾が存在す
るiRNA剤を有することが好ましい。一方又は両方の鎖上のすべてのサブユニットを前
記のように修飾することもできる。両方の鎖上の多数の非対称的修飾の特に好ましい実施
形態は、長さが約20〜21サブユニット、好ましくは19サブユニットの二本鎖領域、
及び長さが約2サブユニットの1個又は2個の3’突出部を有する。
を促進するのに有用である。iRNA剤は、分解に対する耐性を促進する1つ又はそれ以
上の非対称的修飾を包含することができる。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖上の
修飾は、標的のサイレンシングを妨害しない修飾、例えば標的の切断を妨害しない修飾で
ある。鎖上のすべてではないにしても、ほとんどの部位が、エンドヌクレアーゼによる分
解に対してある程度弱い。相対的に弱い部位を特定し、分解を阻害する非対称的修飾を挿
入することができる。多くの場合、iRNA剤におけるUA部位の非対称的修飾を提供す
ることが望ましく、場合によっては、両方の鎖上のUA配列に非対称的修飾を提供するこ
とが望ましい。エンドヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書中に見出
すことができる。特に好適な修飾としては、2’位修飾(例えば特にセンス鎖上のUへの
2’OMe部分の付与)、バックボーンの修飾(例えば、特にアンチセンス鎖上のU若し
くはA又はその両方についてリン酸バックボーンのOをSで置き換えること(例えば、ホ
スホロチオエート修飾の提供)による修飾)、UをC5アミノリンカーで置き換えること
、AをGで置き換えること(配列の変更は、センス鎖上に位置し、アンチセンス鎖上には
位置しないことが好ましい)、及び2’、6’、7’又は8’位の修飾が挙げられる。好
ましい実施形態は、1つ又はそれ以上のこれらの修飾がセンス鎖上に存在するが、アンチ
センス鎖上には存在しない実施形態、あるいはアンチセンス鎖のほうがこのような修飾の
数が少ない実施形態である。
きる。非対称的な修飾としては、一方の鎖のみが修飾されるもの、ならびに両方が修飾さ
れるものを挙げることができる。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖上の修飾は、標
的のサイレンシングを妨害しない修飾、例えば標的の切断を妨害しない修飾である。幾つ
かの実施形態は、センス鎖上、例えば3’突出部の例えば3’末端に、及びアンチセンス
鎖上、例えば3’突出部の例えば3’末端に、非対称的修飾を有する。修飾により異なる
サイズの構成部分が導入される場合、大きいほうがセンス鎖上に存在することが好ましい
。修飾により異なる電荷の構成部分が導入される場合、より大きな電荷を有する部分がセ
ンス鎖上に存在することが好ましい。
る。特に好適な修飾としては、2’位修飾(例えば3’突出部の例えば3’末端への2’
OMe部分の提供(3’末端とは、文脈により示されるように、分子の3’位の原子、又
は最も3’側の構成部分、例えば最も3’側のP又は2’位を意味する))、例えばPを
Sで置き換えること(例えば、ホスホロチオエート修飾の提供)もしくは3’突出部の例
えば3’末端におけるメチル化Pの使用によるバックボーンの修飾、2’位修飾の組合せ
(例えば、2’OMe部分の提供と、例えばPをSで置き換えること(例えば、ホスホロ
チオエート修飾の提供)もしくは3’突出部の例えば3’末端におけるメチル化Pの使用
によるバックボーンの修飾との組合せ)、3’アルキルによる修飾、3’突出部の例えば
3’末端における脱塩基ピロリジンによる修飾、ナプロキセン、イブプロフェン又はその
他の分解を阻害する構成部分による3’末端の修飾が挙げられる。好ましい実施形態は、
1つ又はそれ以上のこれらの修飾がセンス鎖上に存在するが、アンチセンス鎖上には存在
しないもの、あるいはアンチセンス鎖のほうがこのような修飾の数が少ない実施形態であ
る。
提供することが可能である。例えば標的の切断を阻害することにより、サイレンシングを
阻害し得る標的化修飾は、センス鎖の非対称的修飾として提供され得る。体内分布を変化
させる構成部分(例えばコレステロール)は、センス鎖における1つ又はそれ以上(例え
ば、2つ)の非対称的修飾として提供され得る。比較的大きな分子量(例えば400、5
00又は1,000ダルトンを上回る分子量)を有する構成部分を導入する標的化修飾、
あるいは電荷を有する構成部分(例えば、2つ以上の正電荷又は1つの負電荷を有する構
成部分)を導入する標的化修飾は、センス鎖上に配置させることができる。
飾、例えば本明細書中に記載する修飾は、非対称的修飾として提供され得る。これらの修
飾としては、5メチルU、5メチルC、プソイドウリジン、ロックト核酸、2チオU及び
2−アミノ−Aが挙げられる。幾つかの実施形態では、これらの1つ又はそれ以上がアン
チセンス鎖上に提供される。
ば2又は3ヌクレオチドの短い一本鎖の突出部が、一方又は両方の3’末端に存在する。
非対称的な修飾を、例えばiRNA内に選択的に位置させることにより、このような構造
の活性を最適化するのに使用することができる。例えば、センス鎖の5’末端及びアンチ
センス鎖の3’末端により規定されるiRNA剤の末端領域は、機能にとって重要である
。この領域は、末端の2個、3個又は4個のヌクレオチド対と任意の3’突出部とを含む
ことができる。好ましい実施形態では、以下、すなわち:センス鎖のキナーゼ活性化を阻
害するセンス鎖5’末端の修飾(例えば、キナーゼ分子を標的とする複合体の結合、又は
5’エキソヌクレアーゼによる分解に対して保護的に作用する修飾の使用など)、又はセ
ンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合を増強することにより分子のこの末端にある「緊密
な」構造を促進する、いずれか一方の鎖、好ましくはセンス鎖の修飾、のうち1つ又はそ
れ以上をもたらす非対称的修飾が使用される。
領域もまた機能にとって重要である。この領域は、末端の2個、3個又は4個のヌクレオ
チド対と任意の3’突出部とを含むことができる。好ましい実施形態は、センス鎖とアン
チセンス鎖との間の結合を減少させることにより分子のこの末端にある「開放的な」構造
を促進する、いずれか一方の鎖、好ましくはセンス鎖の非対称的修飾を包含する。このよ
うな修飾としては、分子を標的とする複合体を配置すること、あるいはセンス鎖のこの領
域におけるヌクレアーゼ耐性を促進する修飾が挙げられる。キナーゼ活性化を阻害するア
ンチセンス鎖の修飾は、好ましい実施形態では回避される。
(a)バックボーン修飾(例えば、バックボーンのPの修飾)であって、PをSで置き
換えること、又はアルキル若しくはアリル(例えば、Me)で置換されたP、及びジチオ
エート(S−P=S)を含む;これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するのに使用す
ることができる;
(b)2’−Oアルキル(例えば、2’−OMe)、3’−Oアルキル(例えば、3’
−OMe)(末端及び内部位置の少なくともいずれかを修飾);これらの修飾は、ヌクレ
アーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を増強するために使
用することができ、3’位修飾は、RISCによるセンス鎖活性化を回避するためにセン
ス鎖の5’末端で使用することができる;
(c)2’〜5’結合(2’−H、2’−OH及び2’−OMeによるもの、及びP=
O又はP=Sによるもの);これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はア
ンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはR
ISCによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の5’末端で使用することもでき
る;
(d)L糖(例えば、2’−H、2’−OH及び2’−OMeを有する2’L−リボー
ス、L−アラビノース);これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアン
チセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはRI
SCによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の5’末端で使用することもできる
;
(e)修飾糖(例えば、ロックト核酸(LNA)、ヘキソース核酸(HNA)及びシク
ロヘキセン核酸(CeNA));これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又
はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるい
はRISCによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の5’末端で使用することも
できる;
(f)核酸塩基修飾(例えば、C−5修飾ピリミジン、N−2修飾プリン、N−7修飾
プリン、N−6修飾プリン);これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、又
はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を促進するために使用することができる;
(g)カチオン基及び双性イオン基(末端にあることが好ましい);これらの修飾は、
ヌクレアーゼ耐性を促進するために使用することができる;
(h)複合体基(末端位置にあることが好ましい)、例えば、ナプロキセン、ビオチン
、コレステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質;これらの修飾は、ヌクレ
アーゼ耐性を促進するため、又は分子を標的化するために使用することもできるし、ある
いはRISCによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の5’末端で使用すること
もできる。
る:
(a)バックボーン修飾(例えば、バックボーンのPの修飾)であって、PをSで置き
換えること、又はアルキル若しくはアリル(例えば、Me)で置換されたP、及びジチオ
エート(S−P=S)を含む;
(b)2’−Oアルキル(例えば、2’−OMe)(末端位置を修飾);
(c)2’〜5’結合(2’−H、2’−OH及び2’−OMeによるもの(例えば、
3’末端での末端修飾);P=O又はP=Sによる好ましくは3’末端の修飾);これら
の修飾は、キナーゼ活性のようなRISC酵素活性を妨害し得るため、5’末端領域から
は排除されることが好ましい;
(d)L糖(例えば、2’−H、2’−OH及び2’−OMeを有するL−リボース、
L−アラビノース);例えば、3’末端での末端修飾;例えばP=O又はP=Sによる好
ましくは3’末端の修飾;これらの修飾は、キナーゼ活性を妨害し得るため、5’末端領
域から排除されることが好ましい;
(e)修飾糖(例えば、LNA、HNA及びCeNA);これらの修飾は、センス鎖と
アンチセンス鎖との間の対合の望ましくない増強に寄与し得るが、多くの場合は5’領域
において「緩い」構造を有することが好ましいので、さらに該修飾はキナーゼ活性を妨害
し得るので、5’末端領域からは排除されることが好ましい;
(f)核酸塩基修飾(例えば、C−5修飾ピリミジン、N−2修飾プリン、N−7修飾
プリン、N−6修飾プリン);
(g)カチオン基及び双性イオン基(末端にあることが好ましい);
糖の2’位、糖の3’位にあるカチオン基及び双性イオン基;核酸塩基修飾(例えば、
C−5修飾ピリミジン、N−2修飾プリン、N−7修飾プリン、N−6修飾プリン)とし
てのカチオン基及び双性イオン基;
複合体基(末端位置にあることが好ましい)、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレ
ステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質であって、但し、嵩高い基又は概
してRISC活性を阻害する基はあまり好ましくないはずである。
幾つかの好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を促進する修飾は、3’末端、特に3
’突出部に包含されるべきである。
とする。該方法は、活性を有する配列を選択すること、該配列に1つ又はそれ以上の非対
称的な修飾を導入することを包含し、非対称的な修飾の導入によりiRNA剤の特性が最
適化されるが、活性の減少はもたらされない。
好ましい実施形態では、活性の減少とは、修飾が導入されないこと以外は同じiRNAと
比較した場合に、5%、10%、20%、40%又は50%未満の減少であることを意味
する。活性は、例えば、in vivo又はin vitroで測定することができ、い
ずれにおける結果も、所要の活性維持を実証するのに十分である。
修飾に関するセクションで論述する特性であり得る。修飾は、任意の非対称的な修飾、例
えば、本明細書中の非対称的な修飾に関するセクションで記載する非対称的な修飾であり
得る。特に好ましい非対称的な修飾は、特にセンス配列における2’−Oアルキル修飾(
例えば2’−OMe修飾)、及びアンチセンス鎖におけるバックボーンのOの修飾、特に
ホスホロチオエート修飾である。
他の実施形態ではアンチセンス配列が選択されて非対称的な修飾が付与される。幾つかの
実施形態では、センス配列及びアンチセンス配列がともに選択され、それぞれ1つ又はそ
れ以上の非対称的な修飾が付与される。
得る。配列は、少なくとも2個、4個、6個、8個又はそれ以上の修飾を有することがで
き、配列のすべてのモノマー又は実質的にすべてのモノマーを修飾することができる。
RNA、例えばiRNA剤は、本明細書中に記載するようなZ−X−Y構成様式又は構
造を有することができる。さらに、iRNA剤は、Z−X−Y構造及び本明細書中に記載
する別の構成要素を有することができる。例えば、本発明は、本明細書中に記載するiR
NA剤、例えばパリンドローム構造のiRNA剤、非標準的な対合を有するiRNA剤、
本明細書中に記載する遺伝子(例えば、SNCA遺伝子)を標的とするiRNA剤、本明
細書中に記載する両親媒性送達剤と結合されたiRNA、本明細書中に記載する薬物送達
モジュールと結合されたiRNA、本明細書中に記載するように投与されるiRNA剤、
又は本明細書中に記載するように製剤化されるiRNA剤であって、Z−X−Y構築様式
も取り入れるiRNA剤を包含する。
X領域、及び任意選択で第3の領域であるY領域:
Z−X−Y
を有することができる。
することが望ましい場合がある。場合によっては、サブユニットは、同じ修飾又は同じ種
類の修飾を有するが、Z及び/又はYにおいて施される修飾は、Xにおいて施される修飾
と異なる場合のほうが多い。
2〜14個、より好ましくは2〜10個のサブユニットの長さである。通常、Z領域は一
本鎖状である(すなわちZ領域は、別の鎖の塩基と塩基対合しない)が、幾つかの実施形
態では、自己会合して、例えばループ構造を形成し得る。このような構造は、鎖の末端が
折り返して鎖内二本鎖を形成することにより形成され得る。例えば、通常2個又はそれ以
上の対合しないサブユニットでできた折り返し領域又は接続領域を有する2個、3個、4
個、5個又はそれ以上の鎖内塩基対が生じ得る。これは、鎖の一方の末端で生じてもよい
し両末端で生じてもよい。Z領域の典型的な実施形態は、一本鎖突出部、例えば本明細書
の他の箇所に記載する長さの突出部である。したがって、Z領域は、3’又は5’末端の
一本鎖でもよいし、又は3’又は5’末端の一本鎖を包含していてもよい。Z領域はセン
ス鎖でもアンチセンス鎖でもよいが、アンチセンスである場合には、領域は3−突出部で
あることが好ましい。Z領域における典型的なサブユニット間結合としては、P=O、P
=S、S−P=S、P−NR2及びP−BR2が挙げられる。キラルP=X(式中、Xは
、S、N又はBである)のサブユニット間結合もまた存在することができる。他の好まし
いZ領域サブユニット修飾(同様に本明細書中の他の箇所で論述)としては、3’−OR
、3’SR、2’−OMe、3’−OMe及び2’OH修飾ならびに構成部分、α立体配
置の塩基、ならびに2’アラビノ修飾を挙げることができる。
るいは二本鎖のiRNA剤の場合には他方の鎖の対応する領域とともに、二本鎖状をなし
ている。X領域の長さは多様であり得るが、通常10〜45個、より好ましくは15〜3
5個のサブユニットである。特に好ましい領域Xは、17個、18個、19個、29個、
21個、22個、23個、24個又は25個のヌクレオチド対を包含するが、他の適切な
長さは、本明細書中の他の箇所で記載されており、それらを使用することができる。典型
的なX領域のサブユニットとしては、2’−OHサブユニットが挙げられる。典型的な実
施形態では、サブユニット間リン酸結合が好ましい一方で、ホスホロチオエート又は非リ
ン酸結合は存在しない。X領域において好ましい他の修飾としては、結合を改善するため
の修飾(例えば、核酸塩基修飾)、カチオン性核酸塩基修飾、及びC−5修飾ピリミジン
(例えば、アリルアミン)が挙げられる。幾つかの実施形態は、4個又はそれ以上の連続
した2’OHサブユニットを有する。ホスホロチオエートの使用は好ましくないこともあ
るが、4個未満の連続した2’OHサブユニットを結合する場合に使用することもできる
。
域及びZ領域は同じである必要はなく、異なる種類及び異なる数の修飾が存在することが
でき、実際、一方は通常3’突出部であり、一方は通常5’突出部である。
ルで置換されたリボヌクレオシドをそれぞれが有するY及び/又はZ領域、ならびに2’
−OHが非置換のままである少なくとも4個の連続したリボヌクレオシドサブユニットを
含むX領域を有する。
を促進するために修飾されてもよい。このような修飾の数多くの例が本明細書中に開示さ
れており、その一例がホスホロチオエート結合である。これらの修飾は、領域X、Y及び
Zのいずれかのサブユニット間に付与することができる。しかしながら、それらの修飾は
最小限に抑えられることが好ましく、特に連続した修飾結合は回避されることが好ましい
。
ボヌクレオシドをそれぞれが有するY及びZ領域、ならびに2’−OHが非置換のままで
ある少なくとも4個の連続したサブユニット(例えば、リボヌクレオシドサブユニット)
を含むX領域を有する。
ために修飾されてもよい。これらの修飾は、領域Y、X及びZのいずれかのサブユニット
間に付与することができる。しかしながら、修飾は最小限に抑えられることが好ましく、
特に連続した修飾結合は回避されることが好ましい。
れるわけではなく、より好ましくは、ホスホジエステル結合以外の結合により連結された
連続サブユニットの最大数は、2個、3個又は4個である。特に好ましいiRNA剤は、
サブユニットがそれぞれ修飾結合(すなわちRNA及びDNAで天然に見られるホスホジ
エステル結合と比較した場合に分解に対して結合を安定化するように修飾された結合)に
より結合された4個又はそれ以上の連続したサブユニット、例えば2’−ヒドロキシルリ
ボヌクレオシドサブユニットを持たない。
実施形態では、Xにおけるヌクレオシドサブユニット結合のそれぞれがホスホジエステル
結合であるか、あるいは領域Xのサブユニット結合が修飾される場合、このような修飾は
最小限に抑えられる。例えば、Y及び/又はZ領域は、分解に対して安定化されたサブユ
ニット間結合を包含することができるが、このような修飾はX領域では最小限に抑えられ
、特に連続した修飾は最小限に抑えられる。したがって、好ましい実施形態ではホスホジ
エステル結合以外で結合される連続したサブユニットの最大数は、2個、3個又は4個で
ある。特に好ましいX領域は、サブユニットがそれぞれ修飾結合(すなわちRNA及びD
NAで天然に見られるホスホジエステル結合と比較した場合に分解に対して結合を安定化
するように修飾された結合)により結合された4個又はそれ以上の連続したサブユニット
、例えば2’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを持たない。
方又は両方が他の修飾、例えばサブユニット結合の他の修飾を含有してもよい。
好ましい実施形態では、領域X、あるいは場合によっては全iRNA剤が、同一の2’
部分を有する3個以下又は4個以下のサブユニットを有する。
ユニット結合を有する3個以下又は4個以下のサブユニットを有する。
好ましい実施形態では、1つ又はそれ以上のホスホロチオエート結合(又はサブユニッ
ト結合の他の修飾)がY及び/又はZ中に存在するが、このような修飾結合は、2’位修
飾(例えば、2’−O−アルキル部分)を有する隣接した2つのサブユニット(例えばヌ
クレオシド)を結合しない。例えば、Y及び/又はZにおけるすべての隣接した2’−O
−アルキル部分は、ホスホロチオエート結合以外の結合により接続される。
接したヌクレオシドなどのサブユニット(例えば、2’−O−アルキルヌクレオシド)の
間に1つだけホスホロチオエート結合を有する。Y及び/又はZにおいて、2’修飾を有
する隣接したヌクレオシドなどのサブユニット(例えば、2’−O−アルキルヌクレオシ
ド)がもう1組存在する場合、この第2の組は、ホスホロチオエート結合以外の結合、例
えばホスホロチオエート結合以外の修飾結合により接続される。
クレオシドなどのサブユニット(例えば、2’−O−アルキルヌクレオシド)の隣接した
対を結合する2個以上のホスホロチオエート結合を有するが、2’位修飾を有するヌクレ
オシドなどのサブユニット(例えば、2’−O−アルキルヌクレオシド)の隣接したサブ
ユニットのうち少なくとも1対は、ホスホロチオエート以外の結合、例えばホスホロチオ
エート結合以外の修飾結合により結合される。
制限の1つが、Xにおけるサブユニットに関する制限と組み合わされる。例えば、1つ又
はそれ以上のホスホロチオエート結合(又はサブユニット結合の他の修飾)がY及び/又
はZ中に存在するが、このような修飾結合は、2’修飾(例えば、2’−O−アルキル部
分)を有するヌクレオシドなど、2つの隣接したサブユニットを結合しない。例えば、Y
及び/又はZのあらゆる隣接した2’−O−アルキル部分は、ホスホロチオエート結合以
外の結合により接続される。さらに、X領域は、3個以下又は4個以下の同一のサブユニ
ット(例えば同一の2’部分を有するサブユニット)を有するか、あるいはX領域は、3
個以下又は4個以下の同一のサブユニット結合を有するサブユニットを有する。
書中に開示する修飾を包含することができる。このような修飾は、独立して、本明細書中
に記載する任意の修飾(例えば、ヌクレアーゼ耐性サブユニット、修飾塩基を有するサブ
ユニット、修飾サブユニット間結合を有するサブユニット、修飾糖を有するサブユニット
、及び別の構成部分(例えば、標的化部分)に連結されたサブユニット)から選ぶことが
できる。好ましい実施形態では、2個以上のこのようなサブユニットが存在し得るが、幾
つかの実施形態では、1個以下、2個以下、3個以下又は4個以下のこのような修飾が行
われるか、又は連続して行われることが好ましい。好ましい実施形態では、修飾の頻度は
、Y及び/又はZとXとの間で異なり、例えば、修飾は、Y及び/又はZとXとのうち一
方に存在し、他方には存在しない。
飾を包含することができる。このような修飾は、独立して、本明細書中に記載する任意の
修飾から(例えば、ヌクレアーゼ耐性サブユニット、修飾塩基を有するサブユニット、修
飾サブユニット間結合を有するサブユニット、修飾糖を有するサブユニット、及び別の構
成部分(例えば、標的化部分)に連結されたサブユニットから)選ぶことができる。好ま
しい実施形態では、2個以上のこのようなサブユニットが存在し得るが、幾つかの実施形
態では、1個以下、2個以下、3個以下又は4個以下のこのような修飾が行われるか、又
は連続して行われることが好ましい。
の鎖の1つ又はそれ以上の部位に導入することができる。RRMSは、Y及び/又はZ領
域においては、センス鎖の3’若しくは5’末端又はその付近(末端から1、2又は3位
以内)に、あるいはアンチセンス鎖の3’末端又はその付近(末端から2又は3位以内)
に配置させることができる。幾つかの実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端又はその
付近(5’末端から1、2又は3位以内)にRRMSを有していないことが好ましい。R
RMSをX領域に配置することも可能であり、好ましくはセンス鎖に、あるいは標的に対
するアンチセンス鎖の結合に重要でないアンチセンス鎖の領域に配置されることになる。
一態様では、本発明は、末端における二本鎖の安定性の差次的修飾(DMTDS)を有
することができるiRNA剤を特徴とする。
A剤を包含する。例えば、本発明は、本明細書中に記載するiRNA剤、例えば、パリン
ドローム構造のiRNA剤、非標準的な対合を有するiRNA剤、本明細書中に記載する
遺伝子(例えば、SNCA遺伝子)を標的とするiRNA剤、本明細書中に記載する構成
様式又は構造を有するiRNA剤、本明細書中に記載する両親媒性送達剤と結合されたi
RNA、本明細書中に記載する薬物送達モジュールと結合されたiRNA、本明細書中に
記載するように投与されるiRNA剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるi
RNA剤であって、DMTDSも取り入れるiRNA剤を包含する。
融解する傾向を増大させること(二本鎖の会合の自由エネルギーを減少させること)によ
り最適化することができる。このことは、例えば、アンチセンス鎖の5’末端の領域に、
二本鎖が解離又は融解する傾向を増大させるサブユニットを含めることにより達成するこ
とができる。また、5’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を増大させるリガ
ンドを結合することにより達成することもできる。理論により拘束されることを望まない
が、その効果は、ヘリカーゼのような酵素の作用を促進すること、例えばアンチセンス鎖
の5’末端に近接した酵素の作用を促進することに起因し得る。
又は融解する傾向を減少させること(二本鎖の会合の自由エネルギーを増大させること)
により最適化することができることも発見した。このことは、例えばアンチセンス鎖の3
’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を減少させるサブユニットを含めること
により達成することができる。また、5’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向
を減少させるリガンドを結合することにより達成することもできる。
記載する他の修飾と、例えば二本鎖の3’末端が解離する傾向を減少させる修飾と併用し
て使用することができる。同様に、二本鎖の3’末端が解離する傾向を減少させる修飾は
、単独で、あるいは本明細書中に記載する他の修飾と、例えば二本鎖の5’末端が解離す
る傾向を増大させる修飾と併用して使用することができる。
サブユニット対は、解離又は融解を促進するそれらの傾向に基づいて順位付けすること
ができる(例えば、特定の対の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も簡単なアプ
ローチは、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同様の分析もまた使
用することができる)。解離を促進するという観点では、
A:Uは、G:Cよりも好ましく、
G:Uは、G:Cよりも好ましく、
I:Cは、G:Cよりも好ましく(I=イノシン);
ミスマッチ、例えば非標準的な対合すなわち標準的対合以外の対合(本明細書中の他の
箇所に記載するようなもの)は、標準的な(A:T、A:U、G:C)対よりも好ましく
;
普遍的塩基を含む対合は、標準的な対合よりも好ましい。
ない)5’センス鎖突出部を示し、R2は任意選択の(しかし、好ましい)3’センス突
出部を示し、R3は任意選択の(しかし、好ましい)3’アンチセンス突出部を示し、R
4は任意選択の(かつ好ましくない)5’アンチセンス突出部を示し、Nはサブユニット
を示し、[N]は、さらなるサブユニット対が存在し得ることを示し、Pxは、センス鎖
のNxとアンチセンス鎖のNxとの対を示す。突出部は、P図では示していない。幾つか
の実施形態では、本明細書中の他の箇所に記載するように、3’AS突出部は領域Zに相
当し、二本鎖領域は領域Xに相当し、3’S鎖突出部は領域Yに相当する。(図は、最大
又は最小の長さを暗に示すことを意味するものではなく、長さに関するガイダンスは、本
明細書中の他の箇所に提供される)。
以上の位置において使用されることが好ましい。末端の対(AS鎖に関しては最も5’側
の対)は、P−1と称され、それに続く二本鎖内の対合の位置(AS鎖から見ると3’方
向に向かっていく)は、P−2、P−3、P−4、P−5等と称される。二本鎖形成を調
節する修飾を施すための好ましい領域は、P−5〜P−1、より好ましくはP−4〜P−
1、さらに好ましくはP−3〜P−1である。P−1の修飾は特に好ましく、単独でも、
あるいは他の位置(複数可)(例えば、上記に同定された位置のいずれか)の修飾(複数
可)との併用でもよい。上述の領域の1つに存在する少なくとも1個、より好ましくは2
個、3個、4個又は5個の対は、独立に、以下の群:
A:U
G:U
I:C
ミスマッチな対、例えば非標準的な対、すなわち標準的な対以外の対、あるいは普遍的
塩基を含む対合
から選ばれることが好ましい。
の変更はセンス鎖で行われるが、幾つかの実施形態では、該変更がアンチセンス鎖で行わ
れる。
を促進する対である。
好ましい実施形態では、P−1〜P−4における少なくとも2個又は3個の対は、A:
Uである。
Uである。
好ましい実施形態では、P−1〜P−4における少なくとも2個又は3個の対は、I:
Cである。
マッチな対、例えば、非標準的な対、すなわち標準的な対以外の対である。
好ましい実施形態では、P−1〜P−4における少なくとも2個又は3個の対は、普遍
的塩基を含む対である。
サブユニット対は、安定性を促進し、かつ解離又は融解を阻害するそれらの傾向に基づ
いて順位付けすることができる(例えば、特定の対合の会合又は解離の自由エネルギーに
関して、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同
様の分析もまた使用することができる)。二本鎖の安定性を促進するという観点では、
G:Cは、A:Uよりも好ましく、
ワトソン−クリックの対合(A:T、A:U、G:C)は、非標準的な対合、すなわち
標準的な対合以外の対合よりも好ましく、
安定性を増大させる類縁体は、ワトソン−クリックの対合(A:T、A:U、G:C)
よりも好ましく、
2−アミノ−A:Uは、A:Uよりも好ましく、
2−チオU又は5Me−チオ−U:Aは、U:Aよりも好ましく、
G−クランプ(4個の水素結合を有するCの類縁体):Gは、C:Gよりも好ましく、
グアナジニウム−G−クランプ:Gは、C:Gよりも好ましく、
プソイドウリジン:Aは、U:Aよりも好ましく、
結合を増強する糖修飾、例えば2’位修飾(例えば、2’F、ENA又はLNA)は、
非修飾部分よりも好ましく、二本鎖の安定性を増強するために一方又は両方の鎖上に存在
することができる。二本鎖を形成する傾向を増大させる対合が、二本鎖の1つ又はそれ以
上の位置でAS鎖の3’末端で使用されることが好ましい。末端の対(AS鎖から見て最
も3’側の対)は、P1と称され、これに続く二本鎖の対合の位置(AS鎖から見て5’
方向に向かっていく)は、P2、P3、P4、P5等と称される。二本鎖形成を調節する
修飾を施すための好ましい領域は、P5〜P1、より好ましくはP4〜P1、さらに好ま
しくはP3〜P1である。P1での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置(
複数可)(例えば、上記に同定された位置のいずれか)の修飾(複数可)と併用されても
よい。上述の領域に存在する少なくとも1個、より好ましくは2個、3個、4個又は5個
の対は、独立して、以下の群:
G:C
ワトソン−クリックの対合(A:T、A:U、G:C)を上回って安定性を増大させる
類縁体を有する対
2−アミノ−A:U
2−チオU又は5Me−チオ−U:A
G−クランプ(4個の水素結合を有するCの類縁体):G
グアナジニウム−G−クランプ:G
プソイドウリジン:A
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば2’位修飾(例えば、
2’F、ENA又はLNA)を有する対
から選ばれることが好ましい。
鎖の安定性を促進する対である。
好ましい実施形態では、P1〜P4における少なくとも2個又は3個の対は、G:Cで
ある。
−クリックの対合を上回って安定性を増大させる類縁体を有する対である。
好ましい実施形態では、P1〜P4における少なくとも2個又は3個の対は、2−アミ
ノ−A:Uである。
U又は5Me−チオ−U:Aである。
好ましい実施形態では、P1〜P4における少なくとも2個又は3個の対は、G−クラ
ンプ:Gである。
ニウム−G−クランプ:Gである。
好ましい実施形態では、P1〜P4における少なくとも2個又は3個の対は、プソイド
ウリジン:Aである。
両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば2’位修飾(例えば、2’F、E
NA又はLNA)を有する対である。
ている。ホルムズ及びガイト(Holmes and Gait)、「2’−O−メチル
G−クランプ含有オリゴヌクレオチドの合成及びHIV−1 Tat−TAR相互作用の
それらの阻害(TheSynthesis of 2'-O-Methyl G-Clamp Containing Oligonucleotides an
d TheirInhibition of the HIV-1 Tat-TAR Interaction)」、Nucleotides、
Nucleotides&Nucleic Acids、第22巻:1259〜1262
ページ、2003年、ホルムズら(Holmes et al.)、「2’−O−メチル
G−クランプリボヌクレオシド類縁体を含有するオリゴヌクレオチドによるin vit
roでの及び細胞におけるヒト免疫不全ウイルス1型Tat依存性トランス活性化の立体
阻害(Stericinhibition of human immunodeficiency virus type-1 Tat-dependent tran
s-activationin vitro and in cells by oligonucleotides containing 2'-O-methyl G
-clampribonucleoside analogues)」、Nucleic Acids Research
、第31巻:2759〜2768ページ、2003年、ワイルズら(Wilds,et
al.)、「合成三環式シトシン類縁体:グアニジニウムG−クランプによるグアノシン
の認識に関する構造基盤 (Structural basis for recognition of guanosine by a synth
etic tricycliccytosine analogue:Guanidinium G-clamp) 」、Helvetica C
himica Acta、第86巻:966〜978ページ、2003年、ラジェエエフ
ら(Rajeev,et al.)、「三環式シトシン類縁体を含有する高親和性ペプチ
ド核酸オリゴマー(High-AffinityPeptide Nucleic Acid Oligomers Containing Tricycl
ic CytosineAnalogues)」、Organic Letters、第4巻:4395〜43
98ページ、2002年、アウシンら(Ausin,et al.)、「アミノ−及びグ
アニジノ−G−クランプPNAモノマーの合成(Synthesis of Amino- and Guanidino-G-C
lamp PNAMonomers)」、Organic Letters、第4巻:4073〜4075
ページ、2002年、マイヤーら(Maier et al.)、「三環式シトシン類縁
体フェノキサジン及び9−(2−アミノエトキシ)フェノキサジン(「G−クランプ」)
を含有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性及びそれらのヌクレアーゼ耐性特性の
由来(Nucleaseresistance of oligonucleotides containing the tricyclic cytosine a
naloguesphenoxazine and 9-(2-aminoethoxy)-phenoxazine ("G-clamp") and originso
f theirnuclease resistance properties) 」、Biochemistry、第41巻:
1323〜7ページ、2002年、フラナガンら(Flanagan,et al.)、
「アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する増強された効力を付与するシトシン類縁体(A
cytosineanalog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides) 」
、Proceedings Of The National Academy Of
Sciences Of The United States Of America
、第96巻:3513〜8ページ、1999年。
同時に行うこと
上述のように、iRNA剤は、二本鎖のAS 5’末端の安定性を減少させ、かつ二本
鎖のAS 3’末端の安定性を増大させるように修飾することができる。このことは、二
本鎖のAS 5’末端における1つ又はそれ以上の安定性を減少させる修飾を、二本鎖の
AS 3’末端における1つ又はそれ以上の安定性を増加させる修飾と組み合わせること
により達成することができる。したがって、好ましい実施形態は、P−5〜P−1、より
好ましくはP−4〜P-1、さらに好ましくはP-3〜P-1における修飾を包含する。P-1で
の修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置(例えば、上記に同定された位置)
との併用でもよい。二本鎖領域のAS 5’末端の上述の領域の1つに存在する少なくと
も1個、より好ましくは2個、3個、4個又は5個の対は、独立に、以下の群から選ばれ
ることが好ましい:
A:U
G:U
I:C
ミスマッチな対、例えば非標準的な対合、すなわち標準的な対合以外の対合、あるいは
普遍的塩基を含む対合、及び
P5〜P1、より好ましくはP4〜P1、さらに好ましくはP3〜P1での修飾。P1
での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置(例えば、上記に同定された位置
)との併用でもよい。二本鎖領域のAS 3’末端の上述の領域の1つに存在する少なく
とも1個、より好ましくは2個、3個、4個又は5個の対は、独立に、以下の群:
G:C
ワトソン−クリックの対合(A:T、A:U、G:C)を上回って安定性を増大させる
類縁体を有する対
2−アミノ−A:U
2−チオU又は5Me−チオ−U:A
G−クランプ(4個の水素結合を有するCの類縁体):G
グアナジニウム−G−クランプ:G
プソイドウリジン:A
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば2’位修飾(例えば、
2’F、ENA又はLNA)を有する対
から選ばれることが好ましい。
えば、iRNA剤として使用するための候補配列に関して標的配列をスクリーニングする
場合、本明細書中に記載するDMTDS特性を有する配列、及び、所望のレベルのDMT
DSを付与するために好ましくはできる限り少ない変更で特にAS鎖に対して修飾を施す
ことができる配列を選択することができる。
を提供するために、P−5〜P−1における少なくとも1個のP及び/又はP5〜P1 に
おける少なくとも1個のPを修飾することを包含する。
AのRNAをサイレンシングするために、本明細書中に記載する任意の障害(例えば、神
経変性障害)を治療するために、本明細書中に記載する任意の製剤中で、ならびに通常は
本明細書中の他の箇所に記載する方法及び組成物において、または本明細書中の他の箇所
に記載する方法及び組成物とともに使用することができる。DMTDS iRNA剤は、
本明細書中に記載する他の修飾、例えば標的化剤を結合すること又は安定性を増強する修
飾を含めること、例えばヌクレアーゼ耐性モノマーを含めることもしくは自己会合して鎖
内二本鎖構造を形成する一本鎖突出部(例えば、3’AS突出部及び/又は3’S鎖突出
部)を含めること、を取り入れることができる。
その他の実施形態
RNA、例えばiRNA剤は、例えば細胞へ送達される外来DNAの鋳型から、in
vivoで細胞において産生され得る。例えば、該DNA鋳型をベクターに挿入して、遺
伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注
射、局所投与(米国特許第5,328,470号)により、あるいは定位注射(例えば、
チェンら(Chen et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
第91巻:3054〜3057ページ、1994年を参照)により対象へ送達すること
ができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクタ
ーを含むこともできるし、あるいは遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放性マトリックス
を含むこともできる。例えば、DNA鋳型は、2つの転写ユニット(iRNA剤の鎖の上
部を包含する転写物を産生するもの、及びiRNA剤の下部を包含する転写物を産生する
もの)を包含することができる。鋳型が転写されると、iRNA剤が産生され、プロセシ
ングを受けて遺伝子サイレンシングを仲介するsRNA剤断片となる。
iRNA剤は、対象(例えば、ヒトのような哺乳類)へiRNA剤を効率的に送達する
ためのポリマーに結合、例えば非共有結合させることができる。iRNA剤は、例えばシ
クロデキストリンと複合体形成させることができる。シクロデキストリンは、治療用化合
物の送達ビヒクルとして使用されている。シクロデキストリンは、シクロデキストリンの
疎水性キャビティ内へ収まることが可能な薬物と包接複合体を形成することができる。他
の例では、シクロデキストリンは、オリゴヌクレオチド及びそれらの誘導体のような他の
生物学的に活性な分子と非共有結合を形成する。シクロデキストリンの使用により、水溶
性の薬物送達複合体が創出され、該複合体は標的指向性の基又は他の官能基で修飾するこ
とができる。米国特許第5,691,316号(これは、参照により本明細書に援用され
る)に記載されるオリゴヌクレオチド用のシクロデキストリン細胞送達系は、本発明の方
法における使用に適している。この系では、オリゴヌクレオチドはシクロデキストリンと
非共有結合的に複合体形成されるか、あるいはオリゴヌクレオチドがアダマンチンに共有
結合され、続いてアダマンチンがシクロデキストリンと非共有結合的に結合される。
ポリマーであってシクロデキストリンコポリマーに少なくとも1つのリガンドが結合され
たものを挙げることができる。米国特許第6,509,323号(参照により本明細書に
援用される)に記載されるような送達系は、本発明における使用に適している。iRNA
剤は、線状シクロデキストリンコポリマー及び/又は線状酸化シクロデキストリンコポリ
マーに結合させることができる。シクロデキストリンコポリマー又は酸化シクロデキスト
リンコポリマーの一方又は両方を、別のポリマーに架橋させることもでき、かつ/又はリ
ガンドに結合させることもできる。
体」を使用することができる。この構造では、「ホスト分子」が、送達ビヒクル中の別の
化合物の少なくとも1部を空間的に封入する。封入される化合物(「ゲスト分子」)は、
ホスト分子のフレームワーク構造に影響を及ぼすことなくホスト分子のキャビティに配置
される。「ホスト」は、好ましくはデキストリンであるが、米国特許公報第2003/0
008818号(参照により本明細書に援用される)で提唱される任意の分子であり得る
。
化合物は、「ホスト−ゲスト」複合体の種類に属する。ホスト−ゲストの関係内で、ホス
ト分子及びゲスト分子の結合部位は、立体電子的意味合いで相補的であるべきである。本
発明の組成物は、少なくとも1つのポリマー及び少なくとも1つの治療薬を、通常はポリ
マー及び治療薬(例えば、iRNA剤)の粒子状複合物の形態で含有することができる。
iRNA剤は、1つ又はそれ以上の複合化剤を含有することができる。粒子状複合物の少
なくとも1つのポリマーは、ホスト−ゲスト又はゲスト−ホスト相互作用で複合化剤と相
互作用して、ポリマーと複合化剤との間で包接複合体を形成することができる。より具体
的には、ポリマー及び複合化剤は、組成物に機能性を導入するのに使用することができる
。例えば、粒子状複合物の少なくとも1つのポリマーはホスト機能を有し、ゲスト機能を
有する複合化剤と包接複合体を形成する。別例として、粒子状複合物の少なくとも1つの
ポリマーはゲスト機能を有し、ホスト機能を有する複合化剤と包接複合体を形成する。粒
子状複合物のポリマーはまた、ホスト機能及びゲスト機能の両方を含有し、ゲストの複合
化剤及びホストの複合化剤と包接複合体を形成することもできる。機能性を有するポリマ
ーは、例えば細胞標的化及び/又は細胞との接触(例えば、神経細胞に対する標的化又は
神経細胞との接触)、細胞間輸送、ならびに細胞への流入及び細胞からの放出のうち少な
くともいずれか)を促進することができる。
よいし、あるいは維持しなくてもよい。治療用組成物から、具体的には粒子状複合物のポ
リマーから放出されると、iRNA剤の活性は回復する。したがって、粒子状複合物は好
適には、例えば分解に起因する活性の損失からiRNA剤を保護し、生物学的利用性を増
強する。したがって、組成物は、iRNA剤又は任意の活性な化学物質に安定性、特に貯
蔵中又は溶液中の安定性を提供するのに使用することができる。iRNA剤は、粒子状複
合物又は治療用組成物を形成する前又は後に、リガンドでさらに修飾されてもよい。リガ
ンドは、さらなる機能性を提供することができる。例えば、リガンドは、標的化部分であ
り得る。
本明細書中に記載するiRNA剤は、治療上の毒性の決定が、該iRNA剤と、ヒト配
列および非ヒト動物配列の両方との相補性によってより容易になされるように設計するこ
とができる。これらの方法では、RNA剤は、ヒト由来の核酸配列及び少なくとも1種類
の非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類(例えば、げっ歯類、反すう類又は霊長類)由来の核
酸配列に完全に相補的である配列から構成され得る。例えば、非ヒト哺乳類は、マウス、
ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ピグミーチンパンジー、ナミチンパン
ジー、アカゲザル又はカニクイザルであり得る。iRNA剤の配列は、非ヒト哺乳類及び
ヒトの相同遺伝子、例えば発がん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子内の配列に相補的であり得る
。非ヒト哺乳類におけるiRNA剤の毒性を決定することにより、ヒトにおけるiRNA
剤の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験のためには、iRNA剤を、ヒト
及び2種類以上(例えば2種類又は3種類又はそれ以上)の非ヒト動物に対して相補的と
することができる。
毒性作用のような任意の望ましくない作用、又は任意の好ましい作用、すなわち所望の作
用と相関させるのに使用することができる。
RNA、例えば本明細書中に記載するiRNA剤は、例えば、本明細書中に記載する薬
物送達複合体又はモジュールとともに使用することができる。さらに、本明細書中に記載
のiRNA剤、例えば、パリンドローム構造のiRNA剤、非標準的な対合を有するiR
NA剤、本明細書中に記載する遺伝子(例えば、SNCA遺伝子)を標的とするiRNA
剤、本発明に記載する化学修飾(例えば、分解に対する耐性を増強する修飾)を有するi
RNA剤、本明細書中に記載する構成様式又は構造を有するiRNA剤、本明細書中に記
載するように投与されるiRNA剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるiR
NA剤は、そのような薬物送達複合体又はモジュールと組み合わされ、結合され、かつそ
のような薬物送達複合体又はモジュールにより送達されうる。
。複合体は、(a)縮合剤(例えば、核酸を例えばイオン相互作用又は静電相互作用によ
り誘引(例えば、結合)することが可能な作用物質)、(b)融合剤(例えば、細胞膜(
例えば、エンドソーム膜)と融合すること、及び/又は該膜を通過して輸送されることが
可能な作用物質)、及び(c)標的化基、例えば、細胞又は組織を標的とする物質(例え
ば、脳内の神経細胞のような特定の細胞種に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質又は
タンパク質(例えば抗体)、のうち1つ又はそれ以上(好ましくは2つ又はそれ以上、よ
り好ましくは3つすべて)に連結させた担体物質を包含することができる。
合体に連結(例えばカップリング又は結合)させることができる。iRNA剤は、複合体
の縮合剤と相互作用することができ、複合体は、例えばin vitro又はin vi
voで、iRNA剤を細胞へ送達するのに使用することができる。例えば、複合体は、i
RNA剤の送達を必要とする対象へiRNA剤を送達するために、例えば障害(例えば、
神経変性疾患又は神経変性障害のような本明細書中に記載する障害)を有する対象へiR
NA剤を送達するために使用することができる。
ってもよい。例えば、ポリアミノ鎖、例えばポリエチレンイミン(PEI)は、融合剤及
び/又は縮合剤であり得る。
(a)縮合剤(例えば、核酸を例えばイオン相互作用により誘引(例えば、結合)する
ことが可能な作用物質)、
(b)融合剤(例えば、細胞膜(例えば、エンドソーム膜)と融合すること及び/又は
該膜を通過して輸送されることが可能な作用物質)、及び
(c)標的化基、例えば、細胞又は組織を標的とする物質(例えば、脳内の神経細胞な
どの神経細胞のような特定の細胞種に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパ
ク質(例えば抗体)のうち1つ又はそれ以上(好ましくは2つ又はそれ以上の、より好ま
しくは3つすべて)に連結させた担体物質を包含することができる。標的化基は、甲状腺
刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタント
プロテインA、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチルガラクト
サミン、N−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリ
アミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸
、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミン
B12、ビオチン、ネプロキシン(Neproxin) 、又はRGDペプチド若しくはRDGペプ
チド擬似体であり得る。
本明細書中に記載するモジュラー複合体の担体物質は、縮合剤、融合剤及び標的化基の
うち1つ又はそれ以上を結合するための基剤であり得る。担体物質は内因性の酵素活性を
欠いていることが好ましい。担体物質は好ましくは、生体分子、好ましくは高分子である
。高分子の生物学的担体が好ましい。担体分子は生分解性であることもまた好ましい。
ク質(LDL)又はグロブリン)、糖質(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キ
トサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸)、又は脂質のような天然に存
在する物質であり得る。担体分子はまた、合成ポリマー(例えば、合成ポリアミノ酸)の
ような組換え分子又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン(P
LL)、ポリL−アスパラギン酸、ポリL−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物
コポリマー、ポリ(L−ラクチド−コ−グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル−マ
レイン酸無水物コポリマー、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマ
ー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)
、ポリウレタン、ポリ(2−エチルアクリル酸)、N−イソプロピルアクリルアミドポリ
マー、又はポリホスファジン(polyphosphazine)が挙げられる。他の有用な担体分子は、
日常的な方法により同定することができる。
電基、好ましくは5〜5,000個の荷電基を有すること、(c)少なくとも1:1の担
体物質対融合剤の比で複合体中に存在すること、(d)少なくとも1:1の担体物質対縮
合剤の比で複合体中に存在すること、(e)少なくとも1:1の担体物質対標的化剤の比
で複合体中に存在すること、のうち1つ又はそれ以上を特徴とすることができる。
本明細書中に記載するモジュラー複合体の融合剤は、pH環境に応答性である、例えば
pH環境に応じて電荷を変化させる作用物質であり得る。エンドソームのpHに遭遇する
と、融合剤は、物理的変化、例えばエンドソーム膜を崩壊するか、又はエンドソーム膜の
浸透性を増大する浸透圧特性の変化を引き起こすことができる。好ましくは、融合剤は、
生理学的範囲未満のpHで、電荷を変化させる(例えば、プロトン化されるようになる)
。例えば、融合剤は、pH4.5〜6.5でプロトン化されるようになり得る。融合剤は
、複合体が例えばエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれた後、細胞の細胞質へi
RNA剤を放出するように作用することにより、細胞内のiRNA剤の細胞内濃度を増大
させることができる。
ばプロトン化)を受ける構成部分(例えば、アミノ基)を有することができる。融合剤の
電荷の変化は、小胞、例えば細胞内小胞(例えば、エンドソーム)の変化(例えば、浸透
圧変化)を誘発することができる。例えば、融合剤は、エンドソームのpH環境に暴露さ
れると、エンドソーム膜の多孔性を増大するのに(好ましくは、破裂させるのに)実質的
に十分な溶解性又は浸透圧変化を引き起こす。
))であり得る。PEIは、直鎖状でも、分岐状でも、合成でも天然でもよい。PEIは
、例えばアルキル置換されたPEIでもよいし脂質置換されたPEIでもよい。
リプロピレンイミン、メリチン又はポリアセタール物質(例えば、カチオン性ポリアセタ
ール)であり得る。幾つかの実施形態では、融合剤は、αらせん構造を有することができ
る。融合剤は、膜崩壊剤(例えばメリチン)であり得る。
くとも1Daであること、(b)少なくとも10個の荷電基、好ましくは10〜5,00
0個の荷電基、より好ましくは50〜1,000個の荷電基を有すること、(c)少なく
とも1:1の融合剤対担体物質の比で複合体中に存在すること、(d)少なくとも1:1
の融合剤対縮合剤の比で複合体中に存在すること、(e)少なくとも1:1の融合剤対標
的化剤の比で複合体中に存在すること。
する(例えば、pH環境に応じて電荷を変化させる)能力は、日常的な方法により、例え
ば細胞アッセイにおいて試験することができる。例えば、試験化合物を細胞と組み合わせ
るか、又は細胞と接触させて、例えばエンドサイトーシスにより細胞に試験化合物を取り
込ませる。続いて、接触させた細胞からエンドソーム調製物を作製することができ、該エ
ンドソーム調製物を対照細胞由来のエンドソーム調製物と比較することができる。接触処
理した細胞由来のエンドソーム画分の対照細胞に対する変化(例えば、減少)は試験化合
物が融合剤として機能することができることを示す。あるいは、接触処理した細胞及び対
照細胞を、例えば顕微鏡法により(例えば、光学顕微鏡法又は電子顕微鏡法により)評価
して、細胞におけるエンドソーム集団の差を決定することができる。試験化合物を標識し
てもよい。別のタイプのアッセイでは、本明細書中に記載するモジュラー複合体は、1つ
又はそれ以上の試験融合剤又は推定融合剤を用いて構築される。モジュラー複合体は、i
RNAの替わりに標識された核酸を用いて構築することもできる。2工程アッセイも実施
することができ、該アッセイでは、第1のアッセイが試験化合物単独のpH環境に応答す
る(例えば、pH環境に応じて電荷を変化させる)能力を評価し、第2のアッセイが、試
験化合物を含むモジュラー複合体のpH環境に応答する(例えば、pH環境に応じて電荷
を変化させる)能力を評価する。
本明細書中に記載するモジュラー複合体の縮合剤は、iRNA剤と相互作用(例えば、
iRNA剤を誘引、保持又はiRNA剤に結合)することができ、(a)iRNA剤を縮
合(例えば、iRNA剤のサイズ又は電荷を低減)させ、かつ/又は(b)iRNA剤を
保護(例えば、分解に対してiRNA剤を保護)するように作用することができる。縮合
剤は、例えばイオン性相互作用により、核酸(例えば、iRNA剤)と相互作用すること
ができる構成部分(例えば、荷電基)を包含することができる。縮合剤は好ましくは、荷
電ポリマー(例えば、ポリカチオン鎖)である。縮合剤は、ポリリシン(PLL)、スペ
ルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリ
アミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質
、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩又はαらせん状ペプチドであり得る。
こと、(b)少なくとも2個の荷電基、好ましくは2〜100個の荷電基を有すること、
(c)少なくとも1:1の縮合剤対担体物質の比で複合体中に存在すること、(d)少な
くとも1:1の縮合剤対融合剤の比で複合体中に存在すること、(e)少なくとも1:1
の縮合剤対標的化剤の比で複合体中に存在すること。
作用する試験剤の能力を評価することにより、試験及び同定され得る。試験剤の、核酸(
例えば、iRNA剤)と相互作用する(例えば、iRNA剤を縮合又は保護する)能力は
、日常的な技法により評価することができる。1つのアッセイでは、試験剤を核酸と接触
させて、接触させた核酸のサイズ及び/又は電荷を、分子の質量及び/又は電荷の変化を
検出するのに適した技法により評価する。このような技法としては、非変性ゲル電気泳動
、免疫学的方法(例えば、免疫沈降)、ゲル濾過、イオン相互作用クロマトグラフィ等が
挙げられる。試験剤は、対照と比較して、接触させた核酸の質量及び/又は電荷(好まし
くは、両方)を変化させる場合に、縮合剤として同定される。2工程アッセイもまた実施
することができ、該2工程アッセイでは、第1のアッセイが試験化合物単独の核酸と相互
作用する(例えば、核酸に結合する(例えば、核酸の電荷及び/又は質量を縮合する))
能力を評価し、第2のアッセイが、試験化合物を含むモジュラー複合体の、核酸と相互作
用する(例えば、核酸に結合する(例えば、核酸の電荷及び/又は質量を縮合する))能
力を評価する。
RNA、例えば本明細書中に記載するiRNA剤は、本明細書中に記載する両親媒性送
達複合体又はモジュールとともに使用することができる。さらに、iRNA剤、例えば、
パリンドローム構造のiRNA剤、非標準的な対合を有するiRNA剤、本明細書中に記
載する遺伝子(例えば、SNCA遺伝子)を標的とするiRNA剤、本明細書中に記載す
る化学修飾(例えば、分解に対する耐性を増強する修飾)を有するiRNA剤、本明細書
中に記載する構成様式又は構造を有するiRNA剤、本明細書中に記載するように投与さ
れるiRNA剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるiRNA剤は、このよう
な両親媒性送達複合体と組み合わされ、結合され、かつこのような両親媒性送達複合体に
より送達されうる。
脂質(例えば、細胞の脂質二重層)と相互作用する(例えば、浸透又は破壊する)ことが
できる。したがって、両親媒性分子は、会合された(例えば、結合された)iRNA(例
えば、本明細書中に記載するiRNA又はsRNA)の送達剤として作用することができ
る。本明細書中に記載する組成物(例えば、本明細書中に記載する両親媒性iRNA構築
物)で使用されるべき好ましい両親媒性分子は、ポリマーである。該ポリマーは、二次構
造、例えば反復性の二次構造を有し得る。
疎水面を有するような二次構造を有するポリペプチドである。両親媒性ペプチド構造(例
えば、αらせん状ポリペプチド)の設計は、当業者には日常的である。例えば、以下の参
照文献にガイダンスが提供されている:グレルら(Grell et al.)(200
1年)、J Pept Sci 第7(3)巻:146〜51ページ;チェンら(Che
n et al.)(2002年)、J Pept Res 第59(1)巻:18〜3
3ページ;イワタら(Iwata et al.)(1994年)、J Biol Ch
em 第269(7)巻:4928〜33ページ;コーナットら(Cornut et
al.)(1994年)、FEBS Lett 第349(1)巻:29〜33ページ;
ネグレートら(Negrete et al.)(1998年)、Protein Sc
i 第7(6)巻:1368〜79ページ。
部分(例えば、1つ又はそれ以上の親水性基及び1つ又はそれ以上の疎水性基を有する環
状部分)を含有する2つ又はそれ以上のサブユニットから構成されるポリマーである。例
えば、サブユニットは、ステロイド(例えばコール酸)又は芳香族部分を含有してもよい
。このような構成部分は、それらがポリマー構造中にある場合、対向する親水面及び疎水
面を形成することができるように、アトロプ異性を示すことができることが好ましい。
方法により、例えば無細胞アッセイ又は細胞アッセイにおいて試験することができる。例
えば、試験化合物を、合成脂質二重層、細胞膜分画又は細胞と組み合わせるか、あるいは
接触させて、試験化合物が、脂質二重層、細胞膜又は細胞と相互作用し、細胞膜又は細胞
に浸透し、あるいは細胞膜又は細胞を破壊するその能力に関して評価する。試験化合物を
、脂質二重層、細胞膜又は細胞との相互作用を検出するために標識することもできる。別
のタイプのアッセイでは、試験化合物をレポーター分子又はiRNA剤(例えば、本明細
書中に記載するiRNA又はsRNA)に連結させて、レポーター分子又はiRNA剤が
脂質二重層、細胞膜又は細胞に浸透する能力を評価する。2工程アッセイもまた実施する
ことができ、該2工程アッセイでは、第1のアッセイが、試験化合物単独の、脂質二重層
、細胞膜又は細胞と相互作用する能力を評価し、第2のアッセイが、試験化合物及びレポ
ーター又はiRNA剤を含む構築物(例えば、本明細書中に記載する構築物)の、脂質二
重層、細胞膜又は細胞と相互作用する能力を評価する。
ましくは少なくとも5個、より好ましくは少なくとも10個、25個、50個、100個
、200個、500個、1,000個、2,000個、50,000個又はそれ以上のサ
ブユニット(例えば、アミノ酸又は環状サブユニット)を有する。1つの両親媒性ポリマ
ーを、1つ又はそれ以上、例えば2個、3個、5個、10個又はそれ以上のiRNA剤(
例えば、本明細書中に記載するiRNA又はsRNA剤)に連結させることができる。幾
つかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、アミノ酸及び環状サブユニット(例えば、芳
香族サブユニット)の両方を含有することができる。
iRNA又はsRNA)を包含する組成物を特徴とする。このような組成物は、本明細書
中では「両親媒性iRNA構築物」とも呼ばれる。このような組成物及び構築物は、iR
NA剤の送達又は標的化、例えばiRNA剤を細胞へ送達又は標的化するのに有用である
。理論により拘束されることを望まないが、このような組成物及び構築物は、例えばiR
NA剤の細胞への進入が可能となるように、脂質(例えば、細胞の脂質二重層)の多孔性
を増大させる(例えば、浸透又は崩壊させる)ことができる。
記載するiRNA剤又はsRNA剤)を含む組成物に関する。iRNA剤及び両親媒性分
子は、共有結合又は非共有結合のいずれかにより、互いに持続的に接触した状態に保持さ
れていてもよい。
外であることが好ましい。
組成物又は構築物の両親媒性分子は、好ましくはポリマーである。該ポリマーは、2つ
又はそれ以上の両親媒性サブユニットを含んでもよい。1つ又はそれ以上の親水性基及び
1つ又はそれ以上の疎水性基がポリマー上に存在してもよい。ポリマーは、反復性の二次
構造ならびに第1の面及び第2の面を有してもよい。反復性の二次構造に沿った親水性基
及び疎水性基の分布は、ポリマーの一方の面が親水面であり、かつポリマーの他方の面が
疎水面であるような分布であり得る。
ペプチドであり得る。
一実施形態では、両親媒性ポリマーは、1つ又はそれ以上の環状部分(例えば、1つ又
はそれ以上の親水性基及び/又は1つ又はそれ以上の疎水性基を有する環状部分)を含有
する1つ又はそれ以上のサブユニットを包含する。一実施形態では、ポリマーは、環状部
分が交互に疎水性基及び親水性基を有するように環状部分を有するポリマーである。例え
ば、サブユニットは、ステロイド(例えば、コール酸)を含有してもよい。別の例では、
サブユニットは、芳香族部分を含有してもよい。芳香族部分は、アトロプ異性を示すこと
ができるもの、例えば2,2’−ビス(置換)−1,1’−ビナフチル又は2,2’−ビ
ス(置換)ビフェニルであり得る。サブユニットは、式(M):
本発明は、両親媒性分子と関連付けられたiRNA剤(例えば、本明細書中に記載する
iRNA又はsRNA)を包含する組成物を特徴とする。このような組成物は、本明細書
中では「両親媒性iRNA構築物」と称し得る。このような組成物及び構築物は、iRN
A剤の送達又は標的化、例えば細胞へのiRNA剤の送達又は標的化において有用である
。理論により拘束されることを望まないが、このような組成物及び構築物は、例えばiR
NA剤の細胞への進入が可能となるように、脂質(例えば、細胞の脂質二重層)の多孔性
を増大させる(例えば浸透又は破壊する)ことができる。
はハロで置換されるか、かつ/又は任意選択でO、S、アルケニル又はアルキニルが挿入
されるC1〜C100アルキル、C1〜C100ペルフルオロアルキル、又はOR5であ
る。
OR6、又は任意選択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニル若しくはアル
キルスルフィニル、アリールスルホニル若しくはアルキルスルホニル、サルフェート、ス
ルホン酸、リン酸、リン酸エステル、置換若しくは非置換アリール、カルボキシル、カル
ボン酸、アミノカルボニル又はアルコキシカルボニルで置換されるか、かつ/又は任意選
択でO、NH、S、S(O)、SO2、アルケニル又はアルキニルが挿入されるC1〜C
100アルキルである。
R4は、水素であるか、又はR3と一体となって融合フェニル環を形成する。
R5は、任意選択でアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ又はハロで置換さ
れるか、かつ/又は任意選択でO、S、アルケニル又はアルキニルが挿入されるC1〜C
100アルキル、あるいはC1〜C100ペルフルオロアルキルであり、R6は、任意選
択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニル若しくはアルキルスルフィニル、
アリールスルホニル若しくはアルキルスルホニル、サルフェート、スルホン酸、リン酸、
リン酸エステル、置換若しくは非置換アリール、カルボキシル、カルボン酸、アミノカル
ボニル又はアルコキシカルボニルで置換されるか、かつ/又は任意選択でO、NH、S、
S(O)、SO2、アルケニル又はアルキニルが挿入されるC1〜C100アルキルであ
る。
本発明の方法は、iRNA剤、ならびにiRNA剤の細胞への取り込みに影響を及ぼす
薬物の投与を包含し得る。該薬物は、iRNA剤が投与される前に、iRNA剤が投与さ
れた後に、あるいはiRNA剤が投与されると同時に投与され得る。薬物はiRNA剤と
共有結合され得る。薬物は、細胞に対する一過性の影響を有し得る。
フィラメント及び/又は中間フィラメントを崩壊させることにより、iRNA剤の細胞へ
の取り込みを増大させることができる。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビ
ンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノライド(japlakinolide )
、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホライド(swinholide)A、インダノシン(
indanocine)又はミオセルビン(myoservin)であり得る。
iRNA剤は、第2の作用物質にカップリング(例えば、共有結合)させることができ
る。例えば、特定の障害を治療するのに使用されるiRNA剤は、第2の治療薬、例えば
iRNA剤以外の作用物質にカップリングさせることができる。第2の治療薬は、同じ障
害の治療を対象とするものであり得る。例えば、α‐シヌクレインの蓄積を特徴とする障
害(例えば、PD)を治療するのに使用されるiRNAの場合では、iRNA剤は、PD
の治療に有用な第2の作用物質にカップリングさせることができる。
iRNAは、例えば大量に、各種方法により生産することができる。例示的な方法とし
ては、有機合成及びRNA切断(例えば、in vitroでの切断)が挙げられる。
iRNAは、二本鎖のRNA分子の各々の鎖を別個に合成することにより作製すること
ができる。次に、構成成分の鎖をアニーリングさせることができる。
ia Biotec AB)(スウェーデンウプサラ(Uppsala)所在)のOli
goPilot(商標)II)を用いて、所定のiRNA用の特定のRNA鎖を大量に生
産することができる。OligoPilotIIリアクターは、1.5M過剰のホスホロ
アミダイトヌクレオチドのみを使用して、効率的にヌクレオチドをカップリングすること
ができる。RNA鎖を作製するためには、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。標
準的なモノマー添加サイクルを使用して、iRNA用の21〜23ヌクレオチド鎖を合成
することができる。通常、2つの相補的な鎖を別個に生産した後、例えば固体支持体から
の放出及び脱保護の後にアニーリングさせる。(アルナイラムへの関連はあるか)。
対する該iRNA種の相補性を、正確に指定することができる。例えば、該iRNA種は
、多型、例えば一塩基多型を含む領域に相補的であり得る。さらに、多型の位置は、正確
に規定され得る。幾つかの実施形態では、多型は、内部領域、例えば末端の一方又は両方
から少なくとも4、5、7又は9ヌクレオチドの位置にある。
iRNAはまた、より大きなds iRNAを切断することにより作製することができ
る。切断は、in vitro又はin vivoで実現され得る。例えば、in vi
troでの切断によりiRNAを生産するために、以下の方法を使用することができる:
in vitro転写。 dsRNAは、両方向に核酸(DNA)セグメントを転写す
ることにより生産される。例えば、HiScribe(商標)RNAi転写キット(ニュ
ー イングランド バイオラブズ(New England Biolabs))は、ベ
クターと、両側にT7プロモーターが隣接する位置で該ベクターにクローニングされた核
酸セグメントに関してdsRNAを生産する方法とを提供する。別個の鋳型が、dsRN
A用の2つの相補鎖のT7転写用に生成される。該鋳型は、T7RNAポリメラーゼの添
加によりin vitroで転写され、dsRNAが生産される。PCR及び/又は他の
RNAポリメラーゼ(例えば、T3ポリメラーゼ又はSP6ポリメラーゼ)を用いた同様
の方法もまた使用することができる。一実施形態では、この方法により生成されるRNA
は、組換え酵素の調製物に混入し得るエンドトキシンを除去するように慎重に精製される
。
IIIベースの活性を用いて、in vitroで切断されてiRNAとなる。例えば、
dsRNAは、ショウジョウバエ由来のin vitro抽出物中で、あるいは精製され
た成分(例えば、精製RNAアーゼ又はRISC複合体(RNA誘導性サイレンシング複
合体))を用いてインキュベートすることができる。例えば、ケッテイングら(Kett
ing et al.) Genes Dev 2001年10月15日、第15(20
)巻:2654〜9ページ及びハモンド(Hammond) Science 2001
年8月10日;第293(5532)巻:1146〜50ページを参照されたい。
RNA分子の特定の21〜23ntフラグメントである。例えば、もとのdsRNA分子
のオーバーラッピング領域及び隣接領域に相補的な配列を含むiRNAが存在し得る。
/又は有機溶液)中で調製することができる。例えば、iRNA調製物は、純粋な二重に
蒸留した蒸留水中で沈殿及び再溶解され、凍結乾燥され得る。続いて、乾燥させたiRN
Aは、意図される製剤化プロセスに適した溶液中に再懸濁させることができる。
製剤化
本明細書中に記載するiRNA剤は、対象への投与用に製剤化することができる。
剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のiRNA剤
、例えば修飾iRNA剤で実施することができ、かつそのような実施は本発明の範囲内に
あることが理解されるべきである。
例では、組成物は、少なくとも部分的に結晶性、一様に結晶性、かつ/又は無水(例えば
、水分が80%未満、50%未満、30%未満、20%未満又は10%未満)である。別
の例では、iRNAは、水相中に、例えば水を含む溶液中に存在する。
関して)又は粒子(例えば、結晶性組成物に関して適切であり得るような微粒子)に組み
込むことができる。概して、iRNA組成物は、意図される投与方法と適合性の様式で製
剤化される。
流動床乾燥(fluidbed drying)又はこれらの技法の組合せ、あるいは液体を用いた超音
波処理、フリーズドライ、凝縮及び他の自己集合、の少なくとも1つにより調製される。
質(例えば、iRNAと複合体形成してiRNPを形成するためのタンパク質)と組み合
わせて製剤化することができる。さらに別の作用物質としては、例えばEDTAなどのキ
レート化剤(例えば、Mg2+のような二価カチオンを除去するため)、塩、RNAアー
ゼ阻害剤(例えば、RNAsinのような広域特異性のRNAアーゼ阻害剤)等が挙げら
れる。
遺伝子に関してRNAiを仲介することができる第2のiRNAを包含する。さらに別の
調製物は、少なくとも3個、5個、10個、20個、50個若しくは100個又はそれ以
上の異なるiRNA種を包含することができる。このようなiRNAは、同様の数の異な
る遺伝子に関してRNAiを仲介することができる。
NA以外の作用物質)を包含する。例えば、神経変性疾患(例えば、PD)の治療用のi
RNA組成物は、既知のPD治療剤(例えば、レバドーパ(levadopa)又はデプロニル(
depronil))を含んでもよい。
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物および方法は、主として非修飾iRN
A剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、他のiRN
A剤、例えば修飾iRNA剤で実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内に
あることが理解されるべきである。
えば、前駆体、例えばsRNA剤へプロセシングされ得るより大きなiRNA剤、あるい
は、例えば二本鎖のiRNA剤もしくはsRNA剤などのiRNA剤またはそれらの前駆
体をコードするDNA)は、特定の細胞を標的とする。例えば、iRNAを包含するリポ
ソームもしくは粒子または他の構造は、標的細胞上の特定の分子を認識する標的化部分を
包含することもできる。標的化部分は、標的細胞に関して特異的な親和性を有する分子で
あり得る。標的化部分には、標的細胞の表面上に見られるタンパク質に対する抗体、ある
いは標的細胞の表面上に見られる分子に関するリガンドまたはリガンドの受容体結合部分
を挙げることができる。
。
一実施形態では、標的化部分はリポソームに結合される。例えば、米国特許第6,24
5,427号は、タンパク質またはペプチドを用いてリポソームを標的化する方法につい
て記載している。別の例では、リポソームのカチオン性脂質成分が、標的化部分で誘導体
化される。例えば、国際公開公報第96/37194号は、N−グルタリルジオレオイル
ホスファチジルエタノールアミンをN−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルに変換す
ることについて記載している。該生成物は続いてRGDペプチドにカップリングされた。
本明細書に記載される組成物は、例えば、シヌクレインの活性を妨害するため、および
/またはシヌクレインの凝集を阻害するために、シヌクレインポリペプチドを標的とする
抗体を含み得る。抗体は、抗体またはそのフラグメント、例えば、抗体の抗原結合部分で
あってよい。本明細書において使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも1つ、お
よび好ましくは2つの重鎖(H鎖)可変領域(本明細書ではVHという略号を使用する)
、ならびに少なくとも1つ、および好ましくは2つの軽鎖(L鎖)可変領域(本明細書で
はVLという略号を使用する)を含むタンパク質をいう。VH領域およびVL領域は、「
相補性決定領域」(「CDR」)と呼ばれる超可変領域にさらに分割可能であり、超可変
領域にはより保存性の高い「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれる領域が散在してい
る。フレームワーク領域およびCDRの範囲は正確に決定されている(カバトら(Kab
at et al.)、「Sequences of Proteins of Imm
unological Interest」、第5版、米国保健社会福祉省(U.S.D
epartment of Health and Human Services)、
NIH出版第91−3242号、1991年、およびショチアら(Chothia et
al.)、J.Mol.Biol.第196巻、901〜917ページ、1987年を
参照のこと、これらは本願明細書に援用する)。各VHおよびVLは3つのCDRおよび
4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって次の順番:FR1
、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4に配列されている。
鎖および軽鎖の免疫グロブリン鎖を形成し得る。1つの実施形態において、抗体は、2つ
の免疫グロブリン重鎖および2つの免疫グロブリン軽鎖のテトラマーであり、ここで、免
疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖は、例えばジスルフィド結合によって、鎖間
で結合されている。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3か
ら構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLから構成される。重鎖および軽鎖
の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、一般に宿主
の組織または因子、例えば、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古
典的な補体系の最初の成分(C1q)などに対する抗体の結合を仲介する。
ト」)とは、本明細書で使用される場合、抗原(例えば、SNCA核酸によってコードさ
れるポリペプチド)に特異的に結合する能力を保持している、抗体全長のうちの1つまた
は複数のフラグメントをいう。用語、抗体の「抗原結合フラグメント」に含まれる結合フ
ラグメントの例には:(i)VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1
ドメインからなる1価フラグメントであるFabフラグメント;(ii)ヒンジ領域にお
いてジスルフィド結合で連結された2つのFabフラグメントを含む2価フラグメントで
あるF(ab’)2フラグメント;(iii)VHドメインおよびCH1ドメインからな
るFdフラグメント;(iv)抗体の単一アームのVLドメインおよびVHドメインから
なるFvフラグメント;(v)VHドメインで構成されるdAbフラグメント(ワードら
(Ward et al.)、Nature 第341巻、544〜546ページ、19
89年);ならびに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。さらに、
Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHは、別々の核酸によってコードされ
ているが、組換え技法を使用して、VL領域およびVH領域が対となり1価の分子を形成
する単一のタンパク質鎖として作製されうるような合成リンカーによって連結されてもよ
い(単鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、バードら(Bird et al.
)、Science 第242巻、423〜426ページ、1988年、およびヒュース
トンら(Huston et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 第85巻、5879〜5883ページ、1988年を参照のこと)。このような単鎖
抗体もまた、用語、抗体の「抗原結合フラグメント」の中に含まれることが意図される。
これらの抗体フラグメントは、当業者に公知である従来の技術を使用して入手され、該フ
ラグメントは、完全な抗体と同様にして有用性についてスクリーニングされる。用語「モ
ノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用される場合
、特定のエピトープと免疫反応しうる抗原結合部位を1種類だけ含む抗体分子の集団をい
う。したがって、モノクローナル抗体組成物は、一般には、免疫反応する相手の特定のタ
ンパク質について単一の結合親和性を示す。
ールを使用して本明細書に記載されるように作製可能である(例えば「Antibodi
es:A Laboratory Manual」、ハーロー(Harlow)およびレ
ーン(Lane)編、コールドスプリングハーバー出版(Cold Spring Ha
rbor Press)、1988年を参照のこと)。
して使用して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技
術を使用して、該成分に結合する抗体を作製することが可能である。完全長の成分タンパ
ク質を使用してもよいし、または代替として該成分の抗原性ペプチドフラグメントを免疫
原として使用してもよい。
は他の哺乳動物)を該免疫原で免疫することによって、抗体を調製する。適切な免疫原性
調製物は、例えば、組換え型の本明細書に記載されるタンパク質、例えば、α−シヌクレ
インポリペプチドを含み得る。例えば、米国特許第5,460,959号;ならびに同時
係属の米国特許出願第08/334,797号;同第08/231,439号;同第08
/334,455号;および同第08/928,881号(これらはその全体を明確に本
明細書に援用する)を参照のこと。α−シヌクレインのヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列は公知である。この調製物はさらに、フロイントの完全アジュバントもしくは不完全
アジュバントなどのアジュバント、または同様の免疫刺激剤をさらに含み得る。本明細書
に記載の免疫原性タンパク質(例えば、α−シヌクレインポリペプチド)またはフラグメ
ントの調製物を用いて適切な対象を免疫することにより、ポリクローナル抗体応答が誘導
される。
を使用して作製可能な、ヒト部分と非ヒト部分の両方を含んでなるキメラモノクローナル
抗体およびヒト化モノクローナル抗体などを使用可能である。このようなキメラモノクロ
ーナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野において公知の標準的なDNA
操作方法を用いる遺伝子操作により作製可能である。使用されうる方法は、例えば、ロビ
ンソンら(Robinson et al.)、国際出願番号第PCT/US86/02
269号;アキラら(Akira et al.)、欧州特許出願第184,187号;
タニグチ(Taniguchi),M.、欧州特許出願第171,496号;モリソンら
(Morrison et al.)、欧州特許出願第173,494号;ノイバーガー
ら(Neuberger et al.)、国際公開公報第86/01533号;キャビ
リーら(Cabilly et al.)、米国特許第4,816,567号;キャビリ
ーら(Cabilly et al.)、欧州特許出願第125,023号;ベターら(
Better et al.)、Science 第240巻、1041〜1043ペー
ジ、1988年;リューら(Liu et al.)、PNAS 第84巻、3439〜
3443ページ、1987年;リューら(Liu et al.)、J.Immunol
.第139巻、3521〜3526ページ、1987年;サンら(Sun et al.
)、PNAS 第84巻、214〜218ページ、1987年;ニシムラら(Nishi
mura et al.)、Canc.Res.第47巻、999〜1005ページ、1
987年;ウッドら(Wood et al.)、Nature 第314巻、446〜
449ページ、1985年;およびショーら(Shaw et al.)、J.Natl
. Cancer Inst.第80巻、1553〜1559ページ、1988年);モ
リソン(Morrison),S.L.,Science 第229巻、1202〜12
07ページ、1985年;オイら(Oi et al.)、BioTechniques
第4巻、214ページ、1986年;ウィンター(Winter)米国特許第5,22
5,539号;ジョーンズら(Jones et al.)、Nature 第321巻
、552〜525ページ、1986年;バーホーエンら(Verhoeyan et a
l.)、Science 第239巻、1534ページ、1988年;およびバイドラー
ーら(Beidler et al.)、J.Immunol.第141巻、4053〜
4060ページ、1988年に記載されている。
ヒトモノクローナル抗体を、標準的な技術を使用して作製可能である。例えば、ヒトモノ
クローナル抗体は、トランスジェニックマウス、または抗体を産生するヒト細胞を移植し
た免疫不全マウスにおいて生産可能である。このようなマウスを生成する方法は、例えば
、以下の文献に記載されている:ウッドら(Wood et al.)、国際公開公報第
91/00906号;クチャラパチら(Kucherlapati et al.)、国
際公開公報第91/10741号;ロンバーグら(Lonberg et al.)、国
際公開公報第92/03918;ケイら(Kay et al.)、国際公開公報第92
/03917号;ケイら(Kay et al.)、国際公開公報第93/12227号
;ケイら(Kay et al.)、国際公開公報第94/25585;ラジュースキー
ら(Rajewsky et al.)、国際公開公報第94/04667号;ジチュー
リオら(Ditullio et al.)、国際公開公報第95/17085号;ロン
バーグら(Lonberg et al.)、Nature 第368巻、856〜85
9ページ、1994年;グリーンら(Green et al.)、Nature Ge
net.第7巻、13〜21ページ、1994年;モリソンら(Morrison et
al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 第81巻、6851〜6
855ページ、1994年;ブラグマンら(Bruggeman et al.)、Ye
ar Immunol 第7巻、33〜40ページ、1993年;チョイら(Choi
et al.)、Nature Genet.第4巻、117〜123ページ、1993
年;ツアリオンら(Tuaillon et al.)、PNAS 第90巻、3720
〜3724ページ、1993年;ブラグマンら(Bruggeman et al.)、
Eur J Immunol 第21巻、1323〜1326ページ、1991年;ジュ
コサールら(Duchosal et al.)、国際公開公報第93/05796号;
米国特許第5,411,749号;マックーンら(McCune et al.)、Sc
ience 第241巻、1632〜1639ページ、1988年;カメル−レイドら(
Kamel− Reid et al.)、Science 第242巻、1706ペー
ジ、1988年;スパノポロウ(Spanopoulou)、Genes & Deve
lopment 第8巻、1030〜1042ページ、1994年;およびシンカイら(
Shinkai et al.)、Cell 第68巻、855〜868ページ、199
2年。ヒト抗体トランスジェニックマウス、またはヒト抗体を産生する細胞もしくは組織
を移植した免疫不全マウスを、本明細書に記載のタンパク質、例えば、α−シヌクレイン
タンパク質、またはその抗原性ペプチドで免疫し、次いで、これらの免疫マウス由来の脾
細胞を、ハイブリドーマ作製のために使用することができる。ハイブリドーマの作製方法
は周知である。
ノクローナル抗体はまた、対象のリンパ球に由来するmRNAから調製された免疫グロブ
リンの軽鎖および重鎖のcDNAを使用して、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブ
ラリー、例えば、FabファージディスプレイライブラリーまたはscFvファージディ
スプレイライブラリーなどを構築することによって調製可能である。例えば、マッカファ
ーティーら(McCafferty et al.)、国際公開公報第92/01047
号;マークスら(Marks et al.)、J.Mol.Biol.第222巻、5
81〜597ページ、1991年;およびグリフィスズら(Griffiths et
al.)、EMBO J 第12巻、725〜734ページ、1993年を参照のこと。
さらに、既知のヒト抗体を変異させることによって抗体可変領域のコンビナトリアルライ
ブラリーを作製可能である。例えば、本明細書に記載されるタンパク質に結合することが
知られているヒト抗体の可変領域を、例えば、ランダムに変化するように変異誘発させた
オリゴヌクレオチドを使用することによって変異させ、変異を有する可変領域のライブラ
リーを作製することが可能であり、次いで該ライブラリーを、本明細書に記載のタンパク
質(例えば、α−シヌクレイン)への結合についてスクリーニングすることができる。免
疫グロブリンの重鎖および/または軽鎖のCDR領域中でランダムな変異誘発を誘導する
方法、ランダムに変異させた重鎖および軽鎖を相互に組み合わせて対を形成させる方法、
ならびにスクリーニング方法は、例えば、バーバスら(Barbas et al.)、
国際公開公報第96/07754号;およびバーバスら(Barbas et al.)
、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 第89巻、4457〜4461ペ
ージ、1992年において見出され得る。
ましくは繊維状ファージ由来のディスプレイパッケージの集団によって発現させることが
可能である。抗体ディスプレイライブラリーを作製する際に特に使用しやすい方法および
試薬の例は、例えば、ラドナーら(Ladner et al.)の米国特許第5,22
3,409号;カンら(Kang et al.)、国際公開公報第92/18619号
;ダウアーら(Dower et al.)、国際公開公報第91/17271号;ウィ
ンターら(Winter et al.)、国際公開公報第92/20791号;マーク
ランドら(Markland et al.)、国際公開公報第92/15679号;ブ
ライトリングら(Breitling et al.)、国際公開公報第93/0128
8号;マックファーティーら(McCafferty et al.)、国際公開公報第
92/01047号;ギャラードら(Garrard et al.)、国際公開公報第
92/09690号;ラドナーら(Ladner et al.)、国際公開公報第90
/02809号;フッチスら(Fuchs et al.)、Bio/Technolo
gy 第9巻、1370〜1372ページ、1991年;ヘイら(Hay et al.
)、Hum Antibod Hybridomas 第3巻、81〜85ページ、19
92年;フセら(Huse et al.)、Science 第246巻、1275〜
1281ページ、1989年;グリフィスズら(Griffiths et al.)、
1993年、前出;ホーキンスら(Hawkins et al.)、J Mol Bi
ol 第226巻、889〜896ページ、1992年;クラックソンら(Clacks
on et al.)、Nature 第352巻、624〜628ページ、1991年
;グラムら(Gram et al.)、PNAS 第89巻、3576〜3580ペー
ジ、1992年;ギャラードら(Garrad et al.)、Bio/Techno
logy 第9巻、1373〜1377ページ、1991年;フーゲンブームら(Hoo
genboom et al.)、Nuc Acid Res 第19巻、4133〜4
137ページ、1991年;およびバーバスら(Barbas et al.)、PNA
S 第88巻、7978〜7982ページ、1991年において見出され得る。ディスプ
レイパッケージ(例えば、繊維状ファージ)の表面に提示(ディスプレイ)させた上で、
該抗体ライブラリーを、本明細書に記載のタンパク質、例えば、α−シヌクレインポリペ
プチドに結合する抗体を発現するパッケージを同定および単離するためにスクリーニング
する。好ましい実施形態では、ライブラリーの一次スクリーニングでは、本明細書に記載
の固定化タンパク質を用いるパニングが実施され、本明細書に記載の固定化タンパク質に
結合する抗体を発現しているディスプレイパッケージが選択される。
本明細書に記載のタンパク質、例えば、α−シヌクレインポリペプチドをコードするヌ
クレオチドに対してアンチセンスである核酸分子は、該タンパク質の発現を阻害する薬剤
として使用することも可能である。「アンチセンス」核酸は、該成分をコードする「セン
ス」核酸に対して相補的である、例えば、二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的である
か、またはmRNA配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、ア
ンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合を形成可能である。アンチセンス核酸は、コー
ド鎖または非コード鎖の一部分に対して相補的であってもよい。
列(例えば、cDNA分子のセンス鎖の配列)が与えられると、ワトソン−クリック塩基
対合の規則に従ってアンチセンス核酸を設計することができる。アンチセンス核酸分子は
、mRNAのコード領域または非コード領域の一部分に対して相補的であってもよい。例
えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳開始部位周辺の領域(例えば
、5’UTR)に対して相補的であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例
えば、長さが約10〜25ヌクレオチド(例えば、長さが11、12、13、14、15
、16、18、19、20、または24ヌクレオチド)であり得る。
よるライゲーションを使用して構築可能である。例えば、アンチセンス核酸(例えば、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチド、または、該分子の生
物学的安定性を高めるために、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成され
る二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された様々な修飾を有するヌクレオチドを使
用して、化学的に合成可能であり、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン
置換ヌクレオチドを使用可能である。アンチセンス核酸を作製するために使用可能な修飾
ヌクレオチドの例には:2’−O−メチル化ヌクレオチド、5−フルオロウラシル、5−
ブロモウラシル、5−クロロウラシル、5−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチ
ン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−カル
ボキシメチルアミノメチル−2−チオウリジン、5−カルボキシメチルアミノメチルウラ
シル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6−イソペン
テニルアデニン、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン
、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン
、N6−アデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキ
シアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルクエオシン、5’−メトキシカ
ルボキシメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニ
ルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、
クエオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4
−チオウラシル、5−メチルウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラ
シル−5−オキシ酢酸(v)、5−メチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−
N−2−カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6−ジアミノプリ
ンが含まれる。代替的には、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクロー
ニングされている発現ベクターを使用して生物学的に生産可能である(すなわち、挿入さ
れた核酸から転写されるRNAは、対象とする標的核酸に対してアンチセンス方向となる
)。
オリゴデオキシヌクレオチド)、またはデオキシリボヌクレオチド配列とリボヌクレオチ
ド配列の両方を含み得る。例えば、リボヌクレオチドのみからなるアンチセンス剤は、相
補的なRNA(例えば、α−シヌクレインRNA)にハイブリダイズし、この標的RNA
転写物に対する翻訳装置の接近を妨害することによって、タンパク質合成を妨害すること
ができる。デオキシリボヌクレオチドのみを含むアンチセンス分子、またはデオキシリボ
ヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含むアンチセンス分子(例えば、5’末端および
3’末端にRNA配列が隣接しているDNA配列のアンチセンス剤)は、相補的RNAに
ハイブリダイズ可能であり、続いて該標的RNAは酵素(例えば、RNAseH)によっ
て切断されうる。該標的RNAの分解により翻訳が阻止される。この隣接RNA配列は2
’−O−メチル化ヌクレオチド、およびホスホロチオエート結合を含んでもよく、内側の
DNAは、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含んでもよい。RNAseH活性
の標的としたい場合、内側のDNA配列の長さは少なくとも約5ヌクレオチドであること
が好ましい。
クレオシドを反転させることにより、さらに修飾することができる。別の代替例において
、3’末端をアミノアルキル基でブロックすることもできる。
ジンクフィンガータンパク質技術を用いて、標的候補遺伝子、例えば、SNCA遺伝子
の転写をダウンレギュレーションすることが可能である。例えば、SNCA遺伝子特異的
なDNA結合ドメインを、SNCA遺伝子の発現をダウンレギュレーションするためにリ
プレッサードメインに融合させることができる。様々な特異性を有する様々な多数のジン
クフィンガードメインを使用してジンクフィンガータンパク質を構築し、新規な配列を認
識するのみならず、様々な長さの配列も認識するDNA結合タンパク質を提供することが
できる。遺伝子発現の調節のためのジンクフィンガー結合タンパク質については、例えば
、米国特許第6,607,882号および同第6,534,261号に記載されている。
いる)による遺伝子発現の抑制が可能となるような、標的遺伝子(例えば、SNCA遺伝
子)中の任意の適切な部位であってよい。好ましい標的部位には、転写開始部位の下流ま
たは上流に隣接する領域が含まれる。さらに、標的部位は、エンハンサー領域、リプレッ
サー部位、RNAポリメラーゼ休止部位、および特異的調節部位(例えば、REP1部位
)に位置してもよく、cDNAコード領域内の部位、または発現配列タグ(EST)コー
ド領域内に位置してもよい。典型的には、各フィンガーは2〜4塩基対を認識し、2フィ
ンガーのZFPは4〜7bpの標的部位に結合し、3フィンガーのZFPは6〜10塩基
対の部位に結合し、そして6フィンガーのZFPは各々約6〜10塩基対の2つの隣接す
る標的部位に結合する。
eppel結合ボックス(KRAB)、ERFリプレッサードメイン(ERD)、または
mSIN3相互作用ドメイン(SID)などの転写因子リプレッサードメインに連結され
る。遺伝子発現を抑制するためには、一般に、該遺伝子の発現を、約20%低減し(すな
わち、ZFPの調節を受けていない発現の80%とし)、より好ましくは約50%低減し
(すなわち、ZFPの調節を受けていない発現の50%とし)、より好ましくは約75〜
100%低減する(すなわち、ZFPの調節を受けていない発現の25〜0%とする)。
ジンクフィンガータンパク質の活性を調節可能とすることができる。1つの実施形態にお
いて、細胞は2つのジンクフィンガータンパク質を含む。これらのジンクフィンガータン
パク質は2つの異なる候補遺伝子を標的とし得る。例えば、1つのZFPがSNCA遺伝
子を標的として発現を阻害し、第2のZFPがプロテアソーム機構の成分をコードする遺
伝子を標的として、例えば発現を増強してもよい。別例として、第2のZFPが、α−シ
ヌクレインの凝集表現型に寄与する第2の遺伝子の発現を標的とし、かつ阻害してもよい
。別例として、ジンクフィンガータンパク質が、同じ候補遺伝子上の2つの異なる標的部
位を標的としてもよい。各ジンクフィンガータンパク質の発現が低分子(例えば、2つの
異なる低分子)の制御下にあり、遺伝子発現の抑制の程度を変動可能にすることもできる
。
は核酸、例えば、SNCAタンパク質または核酸の活性を調節することによって、細胞ま
たは生物の表現型に影響を与え得る化学化合物である。低分子は、タンパク質と直接的に
相互作用することによって、またはタンパク質の発現もしくは活性をもたらす生化学カス
ケードの上流もしくは下流に作用する分子と相互作用することによって、細胞に影響を与
え得る。典型的には、低分子の分子量は、約3000Da未満、好ましくは約2000D
a未満、より好ましくは約1000Da未満、約900Da未満、約800Da未満、約
700Da未満、または約600Da未満である。
以下の議論は、iRNA剤を用いる治療に関する。しかしながら、本発明は、本明細書
に開示される他の阻害剤、例えば、SNCA RNAを標的とするアンチセンス分子およ
びリボザイム、ジンクフィンガータンパク質、および抗体、ならびに、好ましい実施形態
においてSNCAタンパク質に結合しかつこれを阻害する合成ポリペプチドおよび天然に
存在するポリペプチドまたは低分子を使用または具体化する類似の方法および組成物を含
むと理解されるものである。α−シヌクレインを標的とする組成物、例えば、リボザイム
、アンチセンスオリゴヌクレオチド、iRNA剤、抗体、低分子、またはジンクフィンガ
ータンパク質を含む組成物は、種々の経路によって対象に送達可能である。例示的な経路
には、クモ膜下腔内、(例えば、脳内の)実質、静脈内、鼻、および眼への送達が含まれ
る。好ましい送達経路は、脳への直接送達である。抗SNCA剤は、投与に適した薬学的
組成物に組み込まれ得る。例えば、組成物は、1種以上のiRNA剤および薬学的に許容
可能な担体を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」と
は、薬学的投与に適した任意のあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤
、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためにこの
ような媒体および薬剤を使用することは、当該分野において周知である。任意の従来の媒
体または薬剤は、該活性化合物とは相容れない場合を除き、本発明の組成物中における使
用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込み可能である。
た治療すべき領域により、多数の方法で投与可能である。投与は、局所(点眼、鼻内投与
、経皮投与など)でも、経口または非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内点滴、
皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射、またはクモ膜下腔内もしくは脳室内の投与を含む
。
SNCA iRNA剤を、脳に直接的に、例えば、脳の黒質に直接的に(例えば、黒質内
の線条体のドーパミン領域に)投与可能である。多系統萎縮症と診断された対象には、脳
に直接的に、例えば、脳の線条体および黒質の領域に、および脊髄にiRNA剤を投与可
能である。レーヴィ小体痴呆と診断された対象には、脳に直接的に、例えば、脳の皮質に
直接的にiRNA剤を投与可能であり、そして投与は拡散可能である。SNCA発現を阻
害する薬剤、例えば、抗SNCA iRNA剤に加えて、患者に、第2の治療、例えば、
緩和治療および/または疾患特異的な治療を施しても良い。緩和治療は、ドーパミン作動
薬治療、例えば、メチルドーパまたはコエンザイムQ10などであり得る。
ば、対症的治療(例えば、症状を緩和するため)、神経を保護する治療(例えば、疾患の
進行を遅延または停止させるため)、または回復治療(例えば、疾患の過程を逆行させる
ため)であり得る。対症的治療は、薬物カルビドーパ/レボドーパ、エンタカポン、トル
カポン、プラミペキソール、ロピネロール(ropinerole)、ペルゴリド、ブロ
モクリプチン、セレゲリン、アマンタジン、および数種の抗コリン作用剤を含む。脳深部
刺激手術ならびに定位的脳手術もまた、対症的軽減をもたらす可能性がある。神経を保護
する治療には、例えば、カルビドーパ/レボドーパ、セレゲリン、ビタミンE、アマンタ
ジン、プラミペキソール、ロピネロール、コエンザイムQ10、およびGDNFが含まれ
る。回復治療には、例えば、幹細胞の外科的移植が含まれ得る。
過する必要のない送達方法が利用可能である。例えば、iRNA剤を含む薬学的組成物を
、α−シヌクレイン凝集物を含む領域への直接的な注射によって患者に送達可能である。
例えば、薬学的組成物を、脳への直接的注射によって送達可能である。この注射は、脳の
特定の領域(例えば、黒質、皮質、海馬、または淡蒼球)への定位的な注射であり得る。
iRNA剤は、中枢神経系の複数の領域に(例えば、脳の複数の領域に、および/または
脊髄に)送達可能である。iRNA剤は、脳の広範な領域に送達可能である(例えば、脳
の皮質への拡散性送達)。
、または淡蒼球)に一端が移植されたカニューレまたは他の送達デバイスによって送達可
能である。カニューレはiRNA剤のリザーバーに接続可能である。フローまたは送達は
、ポンプ、例えば、浸透圧ポンプまたはミニポンプによって調節可能である。1つの実施
形態において、ポンプまたはリザーバーは組織から離れた領域に、例えば、腹部に移植さ
れ、送達は、ポンプまたはリザーバーから放出部位まで通じている導管によってもたらさ
れる。脳への送達のためのデバイスは、例えば、米国特許第6,093,180号および
同第5,814,014号に記載されている。
、該薬剤が血液脳関門を通過できるようにする分子と複合体化されてもよい。このような
修飾iRNA剤は、任意の所望の方法によって、例えば、脳室内もしくは筋肉内注射によ
って、または肺送達によって投与可能である。
眼に投与可能である。例えば、薬学的組成物は、眼の表面または周辺組織、例えば、瞼の
内部に施用可能である。該組成物は、局所的に、例えば、噴霧することによって、点眼と
して、眼洗浄液として、または軟膏として施用可能である。軟膏および滴下可能な液体は
、当該分野で既知の眼への送達系、例えば、アプリケーターまたは点眼器によって送達さ
れてもよい。このような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、もしくはポリ(ビニルアルコール)などの粘膜模倣物、ソルビン
酸、EDTA、またはベンジルクロミウムクロライドなどの保存剤、ならびに通常の量の
希釈剤および/または担体を含み得る。薬学的組成物はまた、眼の内部に投与可能であり
、かつ選択された領域または構造に組成物を導入することが可能な針または他の送達デバ
イスによって導入可能である。iRNA剤を含む組成物はまた、眼用パッチを介して施用
可能である。
によって為されても良い。介護者は、ヒトを介護することに関与する任意の存在であり得
る:例えば、病院、ホスピス、医院、外来診察室;医師、看護師、もしくは他の実務者な
どの医療従事者;または配偶者もしくは保護者(例えば、親)などである。投薬は、測定
された用量で、または測定された用量を送達するディスペンサーで供給可能である。
である。例えば、患者をMRIによって、例えば、注射後毎日または毎週、または注射後
定期的な時間間隔でモニター可能である。
ようなモニタリングは、例えば、経時的な臨床評価(例えば、統合パーキンソン病評価尺
度を使用して)、または機能的神経画像化によって達成可能である。モニタリングはまた
、未治療の対象から収集した規準データに対して治療した対象を比較する、線条体ドーパ
ミン作動性機能の経時的な定量測定値(例えば、フルオロドーパおよびポジトロン放出断
層撮影)を含み得る。別の成果尺度には、生存ならびに緩和治療および診療所への入所な
しでの生存を含み得る。治療した対象および未治療の対象についてのこれらの測定値およ
び成果における統計学的に有意な違いは、治療効力の証拠である。
有するか、または発症するリスクがあると診断された任意の患者に投与可能である。1つ
の実施形態において、患者は神経変性障害を有すると診断され、その患者は他の点では一
般的に良好な健康状態にある。例えば、この患者は末期症状にはなく、この患者は、診断
後少なくとも2年、3年、5年、または10年またはそれ以上生存すると思われる。患者
は診断後すぐに治療されてもよいし、またはより衰弱させる症状(例えば、PD患者にお
ける動揺性動作障害および運動障害)を患者が経験するまで治療を遅延してもよい。別の
実施形態において、患者は疾患の重症な段階に達しておらず、例えば、患者は、ホーン(
Hoehn)およびヤール(Yahr)のPDの段階5に達していない(ホーン(Hoe
hn)およびヤール(Yahr)、Neurology 第17巻、427〜442ペー
ジ、1967年)。別の実施形態において、患者は末期症状ではない。一般的に、抗SN
CA iRNA剤は、任意の適切な方法によって投与可能である。本明細書において使用
される場合、局所送達とは、身体の任意の表面(眼、粘膜、体腔の表面、または任意の内
部表面)へのiRNA剤の直接的施用を指すことが可能である。局所投与のための製剤に
は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点眼剤、スプレー、およびリキッ
ド剤が含まれうる。従来の薬学的担体、水性、粉末、または油性の基剤、増粘剤などが必
要であるか、または望ましい場合がある。局所投与は、対象の表皮もしくは真皮、または
表皮もしくは真皮の特定の層、または下層組織にiRNA剤を選択的に送達するための手
段としても使用可能である。 クモ膜下腔内投与または脳室内投与のための組成物は滅菌
水性溶液を含んでもよく、該水性溶液はさらに緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加剤
を含んでもよい。
希釈剤、および他の適切な添加物を含んでもよい。脳室内注射は、例えばリザーバーに連
結された脳室内カテーテルによって容易に実施可能である。静脈内で使用するためには、
溶質の全体の濃度を調節して、調製物を等張にするべきである。
、患者が分散物を吸入することによって、分散物中の組成物、好ましくはiRNAが肺に
到達可能となり、肺において肺胞領域を介して血液循環中に直接容易に吸収されうるよう
に送達することができる。肺送達は、全身への送達、および肺の疾患を治療するための局
所送達のいずれにおいても有効であり得る。1つの実施形態において、肺送達によって投
与される抗SNCA iRNA剤は、血液脳関門を通過可能であるように修飾されている
。
の手法によって達成可能である。送達は、液体噴霧器、エアロゾルベースの吸入器、およ
び乾燥粉末分散物用デバイスを用いて達成可能である。計量式デバイスが好ましい。アト
マイザーまたは吸入器を使用する利点の1つは、デバイスが内蔵型であるために夾雑物混
入の可能性が最小化されることである。乾燥粉末分散物用デバイスは、例えば、乾燥粉末
として容易に製剤化可能な薬物を送達する。iRNA組成物は、単独で凍結乾燥粉末もし
くは噴霧乾燥粉末として、または適切な粉末担体と組み合わせて安定に保存可能である。
吸入用組成物の送達は投薬調節要素を介して行うことも可能であり、該投薬調節要素には
、デバイスに組み込まれたときに、エアロゾル医薬の投与時における用量の追跡、服薬の
監視、および/または患者への投薬開始を可能にする、タイマー、用量計測器、時間測定
デバイス、または時間表示器が含まれ得る。
の薬物レベルを提供するために必要な、組成物中に存在する量である。
用語「生理学的有効量」は、所望の緩和効果または治癒効果を与えるために対象に送達
される量である。
わずに肺に取り込まれ得ることを意味する。
担体として有用である医薬賦形剤の種類には、ヒト血清アルブミン(HSA)などの安
定剤、糖質、アミノ酸、およびポリペプチドなどの充填剤;pH調整剤または緩衝剤;塩
化ナトリウムなどの塩;その他が含まれる。これらの担体は、結晶型でもアモルファス型
でもよく、またはその2つの混合物であってもよい。
み合わせが含まれる。適切な糖質には、ガラクトース、D−マンノース、ソルボースなど
の単糖;ラクトース、トレハロースなどの二糖;2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデ
キストリンなどのシクロデキストリン;およびラフィノース、マルトデキストリン、デキ
ストランなどの多糖;マンニトール、キシリトールなどのアルジトールが含まれる。好ま
しい糖質の群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、お
よびマンニトールが含まれる。適切なポリペプチドにはアスパルテームが含まれる。アミ
ノ酸には、アラニンおよびグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。
などの有機酸および有機塩基から調製した有機塩が含まれ;クエン酸ナトリウムが好まし
い。
れらの膜を通して投与される薬物は、作用開始が迅速であり、治療的な血漿レベルを提供
し、肝代謝の初回通過効果を回避し、かつ敵対的な胃腸(GI)環境に対する薬物の曝露
を回避する。さらなる利点には、薬物が容易に適用、局在化、および除去されうるように
膜部位へ接近しやすいことが含まれる。1つの実施形態において、経口または経鼻送達に
よって投与される抗SNCA iRNA剤は、血液脳関門を通過可能であるように修飾さ
れている。
移植されたデバイスによって投薬される。このデバイスは、対象の体内のパラメータをモ
ニターするセンサーを含み得る。例えば、このデバイスは、浸透圧ポンプなどのポンプ、
および場合により、関連する電子部品を備え得る。
しくは酵素的に作製された人工のカプシドまたはそこから誘導される構造物にパッケージ
ングされてもよい。
または体重1kg当たり10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.
005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、もしくは0.00
001mg未満の単位用量で投与可能であり、体重1kg当たり200ナノモル(例えば
、約4.4×1016コピー)のRNA剤、または体重1kg当たり1500、750、
300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.
015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015ナノモルのRN
A剤の単位用量で投与可能である。この単位用量を、例えば、注射(例えば、静脈内注射
もしくは筋肉内注射、クモ膜下腔内注射、または脳への直接的な注射)、吸入投薬、また
は局所的施用によって投与可能である。特に好ましい投薬量は、体重1kgあたり2、1
、または0.1mg未満である。
00001mg〜約3mg、または好ましくは器官当たり約0.0001〜0.001m
g、器官当たり約0.03〜3.0mg、眼当たり約0.1〜3.0mg、または器官当
たり約0.3〜3.0mgのオーダーの投薬量であり得る。
または予防するために有効な量であり得る。
1つの実施形態において、単位用量は、1日に1回未満の頻度で、例えば、2日毎、4
日毎、8日毎、または30日毎に1回未満の頻度で投与される。別の実施形態において、
単位用量は、一定の頻度で投与されない(例えば、不規則的な投与頻度)。例えば、単位
用量が単回投与されてもよい。
の実施形態において、対象はPDを有し、該治療様式はiRNA剤以外、例えば、二本鎖
iRNA剤またはsRNA剤以外の治療剤である。この治療様式は、例えば、レバドーパ
またはデプロニルであり得る。
例えば、二本鎖iRNA剤、またはsRNA剤(例えば、前駆体、例えば、プロセシング
されてsRNA剤になる大きなiRNA剤、またはiRNA剤(例えば、二本鎖iRNA
剤、またはsRNA剤、またはそれらの前駆体)をコードするDNA)を投与する。維持
用量は、一般的に初回用量よりも少なく、例えば、初回用量の半分である。維持投薬計画
は、1日当たり体重1kg当たり0.01μg〜1.4mgの範囲、例えば、1日当たり
体重1kg当たり10、1、0.1、0.01、0.001、または0.00001mg
の用量で対象を治療することを包含し得る。維持用量は、5日、10日、または30日毎
に1回以下投与されることが好ましい。さらに、治療計画の継続期間は、特定の疾患の性
質、その重症度、および患者の全身状態に依存して変化しうる。好ましい実施形態におい
て、投薬量は、1日に1回以下、例えば、24時間、36時間、48時間、またはそれ以
上の時間当たりで1回以下、例えば、5日毎または8日毎に1回以下送達してもよい。治
療後、患者の状態の変化について、および疾患状態の症状の緩和について患者をモニター
してもよい。化合物の投薬量は、患者が現在の投薬量レベルに対して有意に応答しない場
合には増加してもよいし、疾患状態の症状の緩和が観察される場合、疾患状態が除去され
た場合、もしくは望ましくない副作用が観察される場合には用量を減少してもよい。
は2回以上の投与で投与可能である。反復または頻繁な注入を容易にすることが所望され
る場合、送達デバイス(例えば、ポンプ、半透過性ステント(例えば、静脈内、腹腔内、
槽内、または嚢内)、またはリザーバーの移植が推奨されることがある。
別の実施形態において、複数種の該iRNA剤の配列は、天然に存在する標的配列に関し
て別の種類のiRNA剤と重複せず、かつ隣接しない。別の実施形態において、複数種の
iRNA剤は、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。別の実施形態において
、iRNAは対立遺伝子特異的である。
とが望ましいことがある。該維持治療において、本発明の化合物は、体重1kg当たり0
.01μg〜100gの範囲の維持用量で投与される(米国特許第6,107,094号
を参照のこと)。
たはヒトにおける生理学的状態を調節するために十分な量である。投与されるiRNA剤
の濃度または量は、薬剤について決定されるパラメータ、および投与方法(例えば、鼻、
口腔、または肺)に依存する。例えば、点鼻用製剤は、鼻腔の刺激および炎症を回避する
ために、一部の成分を非常に低濃度とする必要がある傾向を有する。適切な点鼻用製剤を
提供するために、経口製剤を10〜100倍まで希釈することが望ましいことがある。
らびに存在する他の疾患など(これらに限定されない)の特定の要因は、対象を有効に治
療するために必要な投薬量に影響を与える可能性がある。さらに、治療有効量のiRNA
剤、例えば、二本鎖iRNA剤、またはsRNA剤(例えば、前駆体、例えば、プロセシ
ングされてsRNA剤となりうる大きなiRNA剤、またはiRNA剤(例えば、二本鎖
iRNA剤、またはsRNA剤、またはそれらの前駆体)をコードするDNA)を用いる
対象の治療は、単一の治療も、好ましくは、一連の治療を含み得る。当然のことながら、
治療のために使用されるiRNA剤(例えば、sRNA剤)の有効投薬量が特定の治療の
過程にわたって増加または減少されてもよい。投薬量の変化は、本明細書に記載されるよ
うな診断アッセイの結果に起因することもあり、かつ該結果から明らかとなることもある
。例えば、iRNA剤組成物の投与後に対象をモニター可能である。モニタリングからの
情報に基づいて、付加的な量のiRNA剤組成物を投与することができる。
カ月まで続くか、または治癒がもたらされるまで、もしくは疾患状態の減少が達成される
までである。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物の蓄積の測定から計算
可能である。当業者は、最適な投薬量、投薬方法論、および反復の程度を容易に決定可能
である。最適投薬量は、個々の化合物の相対的効力に依存して変化する可能性があり、一
般的には、in vitroおよびin vivoの動物モデルにおいて有効であること
が見出されたEC50に基づいて推定することができる。ある実施形態において、動物モ
デルは、ヒト遺伝子(例えば、標的RNA(例えば、SNCA RNA)を産生する遺伝
子)を発現するトランスジェニック動物を含む。トランスジェニック動物は、対応する内
在性RNAが欠損していてもよい。別の実施形態において、試験のための組成物は、動物
モデル中の標的RNAとヒト中の標的RNAとの間で保存されている配列に対して、少な
くとも内部領域において相補的であるiRNA剤を含む。
、またはsRNA剤(例えば、前駆体、例えば、プロセシングされてsRNA剤になりう
る大きなiRNA剤、またはiRNA剤(例えば、二本鎖iRNA剤、またはsRNA剤
、またはそれらの前駆体)をコードするDNA)の医薬製剤を含む適切な容器を含むキッ
トを提供する。特定の実施形態において、医薬製剤の個々の成分は1つの容器中で提供さ
れ得る。別例として、医薬製剤の成分を2つ以上の容器中で別々に提供することが望まし
い場合もある。例えば、前記2つ以上の容器のうち1つの容器はiRNA剤調製物のため
であり、および少なくとももう1つの容器は担体化合物のためである。キットは、多数の
異なる構成として(例えば、単一の箱の中に1つまたは複数の容器などの構成として)パ
ッケージすることが可能である。異なる成分を、例えば、キットとともに提供される指示
書に従って組み合わせることが可能である。成分は、例えば、薬学的組成物を調製および
投与するために、本明細書に記載の方法に従って組み合わせることが可能である。キット
はまた、送達デバイスを含み得る。
べきではない。
表1に記載される配列を有する二本鎖RNAを合成した。図1Aは、完全長のSNCA
mRNAの配列、およびdsRNA SNCA1〜9(表1)の標的部位を示す。
ehead Institute)[米国マサチューセッツ州ケンブリッジ(Cambr
idge)所在]で開発され、オンラインで自由に利用可能なdsRNA選択ツールを使
用して設計した。該dsRNA選択ツールを使用することによって、(a)4つ以上連続
するA、T、またはG残基を含む任意の配列、および(b)1列に8つ以上の連続するG
C対を有する任意の配列を除く、30%から70%の間のGC含量を有するすべての可能
なsiRNAを選択した。全体で237種の候補siRNAがこの判断基準に合致した。
次いで、この237種の候補siRNAを、ヒトα−シヌクレインにのみ合致した配列を
有するsiRNAを同定するために、UniGeneデータベース(ポンチウスら(Po
ntius et al.)「The NCBI Handbook.」の「UniGe
ne:a unified view of the transcriptome.」
、米国メリーランド州ベテスダ所在のNational Center for Bio
technology Information;2003年)に対してスクリーニング
した。このスクリーニングは、BLAST検索技術(アルチュールら(Altschul
et al.)Nucleic Acids Res.第25巻、3389〜3402
ページ、1997年)を使用して実行した。同定されたsiRNAのサブセットを、マウ
スのα−シヌクレイン遺伝子にのみ合致する配列を有するsiRNAを同定するためにB
LASTを使用してマウスUniGeneに対してスクリーニングした。13個の配列が
同定され、重複部分を含まない4個の二本鎖(SNCA6、7、8、および9)を、以下
に記載するアッセイにおける使用のために選択した。
神経芽細胞腫細胞(BE(2)−M17)を、50nM dsRNA、およびEGFP
またはα−シヌクレイン−EGFP(EGFP/NACP)融合タンパク質のいずれかを
発現するプラスミドで同時にトランスフェクションした(本明細書において使用されるよ
うに、NACPはSNCAの遺伝子産物と同義である)。EGFPおよびEGFP/NA
CP融合タンパク質の発現をウェスタンブロット分析によってアッセイした(図2)。
現をダウンレギュレーションする能力をモニターする。これらの実験におけるSNCA標
的RNAはEGFP RNAに融合されている。EGFPに対する抗体は、RNAから翻
訳されたEGFP/NACP融合タンパク質の検出を容易にする。
sRNA(図2の「siRNA Mr」と記されたレーンを参照のこと)、およびsiR
NAでトランスフェクションされていない細胞の使用を含めた。αチューブリンに対する
抗体を、各レーンに装荷された全タンパク質の量をモニターするための対照として使用し
た。対照実験は、EGFPタンパク質およびEGFP/NACPタンパク質が、抗SNC
A dsRNAの非存在下ではほぼ等量で発現されていることを示した。観察されたEG
FP/NACP発現のダウンレギュレーション効果が最大であったのは、Mayo2、M
ayo7、およびMayo8 dsRNAであった(本明細書において使用される場合、
MayoX siRNAは、SNCAX dsRNAと同義である)。Mayo1、Ma
yo6、およびMayo9 dsRNAでは、それより弱い効果が観察された。siRN
A Mrは、ベクター由来のEGFPおよびEGFP/NACP複合体の両方の発現に影
響を与え、このアッセイの適合性を実証した。
様々なdsRNA濃度において24時間インキュベーションとして試験した(図3)。I
C50値は1nM未満と決定された。
ている神経芽細胞腫細胞中で試験した。BE(2)−M17細胞を、EGFP/NACP
融合タンパク質を発現するプラスミド単独でトランスフェクションするか(対照)、また
はdsRNA Mayo2、Mayo7、もしくはMayo8とともに同時トランスフェ
クションした。EGFP/NACPタンパク質の発現を、6日間にわたってモニターした
。融合タンパク質の発現は、少なくとも3日間有効にサイレンシングされることが観察さ
れた(図4)。dsRNAはまた、少なくとも3日間、同様の細胞において内在性タンパ
ク質の発現も阻害した(図5)。Mayo2、Mayo7、およびMayo8 siRN
Aはまた、ゆっくりと分裂している細胞中の内在性α−シヌクレインRNAの発現も阻害
した(図6)。6日後、Mayo2およびMayo8は、内在性SNCA発現を有効に阻
害し続けていた。細胞中のα−シヌクレインmRNAのレベルは、定量的RT−PCRの
Taqman(登録商標)法によって、18S rRNA発現レベルに対して標準化して
測定した。SNCAの3’UTRを標的とするMayo9は、内在性α−シヌクレインR
NAの発現を阻害しなかった。
。細胞を、dsRNA、およびEGFPのみをコードするプラスミド(ベクター)または
ヒトもしくはマウス由来のEGFP−NACPをコードするプラスミドを用いて同時トラ
ンスフェクションした。EGFPおよびEGFP−NACPの発現を、ウェスタンブロッ
トによってアッセイした。3種すべてのdsRNAがヒトEGFP−NACPの発現を阻
害したのに対して、Mayo2のみがマウスEGFP−NACPの発現を阻害した(図7
)。ヒトおよびマウスのmRNA配列はMayo2遺伝子座においては同一であるが、M
ayo7およびMayo8の各遺伝子座においては、2つのヌクレオチドが相違している
。
列類似性を共有しているが、配列中4つのヌクレオチドが異なっている。Mayo2の効
力を、SNCBに対して試験した。BE(2)−M17細胞を、dsRNA Mayo2
またはMayo9を発現するプラスミドでトランスフェクションした。内在性のSNCA
およびSNCBのRNAの発現を、Taqman(登録商標)法による定量的RT−PC
Rでアッセイした。Mayo2はSNCAの発現を阻害したが、SNCBの発現を阻害し
なかった(図11)。予測されたように、Mayo9はSNCBまたはSNCAの発現を
阻害しなかった。
SNCA siRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の安定性を、90%マウス血清
または90%ヒト血清中で、およびマウス脳組織中で試験した。安定性アッセイを実行す
るために、siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖を放射活性標識した(両方の鎖を
、血清および脳組織中での安定性についてアッセイした)。タンパク質抽出物をマウス脳
から調製し、100nMのsiRNA二本鎖を、該抽出物とともに37℃でインキュベー
トした。4〜5時間にわたって経時的に、試料を取り出してポリアクリルアミド変性ゲル
で分析した。
らに、Mayo7およびMayo8の切断部位を、T1分析によってマッピングした(図
8Aおよび8B)。RNAse T1はGヌクレオチドの3’を切断するので、既知の配
列を有するRNAのT1消化により、RNAse T1以外の切断部位を検出するための
方向および比較の基準が得られる。T1を、Mayo7(SNCA7、またはAL−DU
P−1477とも呼ばれる)およびMayo8(SNCA8、またはAL−DUP−14
78とも呼ばれる)の各siRNAの切断部位をマッピングするために使用した(それぞ
れ図8Aおよび8B、ならびに表1)。Mayo7および8のセンス鎖を32Pで5’末
端標識し、そしてRNAse T1消化を4時間実行した。試料を電気泳動によって分析
した。Mayo7は、U16およびU17の3’エンドヌクレアーゼ切断に対して感受性
であることが見出された。Mayo8は、U16の3’エンドヌクレアーゼ切断に対して
感受性であることが見出された。
を2’−O−Me基またはホスホロチオエート連結で修飾し、Mayo7s、Mayo8
s1、およびMayo8s2を作製した(表1)。該修飾siRNA(50nM)を、E
GFP−NACPベクターとともに、上記のように細胞に同時トランスフェクションした
。トランスフェクションしていない細胞は対照とした。遺伝子発現を、ウェスタンブロッ
ト分析によってモニターした。3種の修飾siRNAの各々が、EGFP−NACP構築
物の発現を阻害した(図9Aおよび9B)。
ログ番号E9379、米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ(Sigma))によっ
て分析し、分析は以下のようにして実行した。すべての溶液を、ヌクレアーゼを含まない
水(カタログ番号9930、米国テキサス州オースチン(Austin)所在のアンビヨ
ン(Ambion))中で、ヌクレアーゼを含まない試薬を使用して調製した。安定性ア
ッセイにおいて使用するためのdsRNAの50μMストックを、1×PBS中で、50
μMのセンス鎖RNAおよび50μMのアンチセンス鎖を混合することによって調製した
。この混合物を90℃で2分間インキュベートして核酸を変性させ、次いでアニーリング
のために37℃で1時間インキュベートした。
ログ番号H1513、米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ)を使用した。血清を氷
上で融解し、dsRNAと混合して終濃度約4.5μMとした(すなわち、約4.2μg
、または約300ピコモルのdsRNA)。「0」の時点で、1つの対照試料をdsRN
Aの血清への添加直後にドライアイス上で凍結し、この試料を−80℃で保存した。他の
時点については(ヒト血清中、15分、30分、60分、120分、および240分)、
試料をサーモミキサー(Thermomixer)(エッペンドルフ(Eppendor
f)[ドイツ、ハンブルク所在])中で37℃にてインキュベートした。各々の終了時点
において、試料をドライアイス上で凍結し、−80℃で保存した。
ヌクレアーゼを含まないもの;カタログ番号9760、米国テキサス州オースチン(Au
stin)所在のアンビヨン(Ambion))を試料に加えて、終濃度を約0.45M
NaClとした。この試料を短時間(約5秒間)渦流混合し、次いで、調製しかつ冷却
したPhase−Lock−Gel−Eppis(商品名、ドイツ国ハンブルク所在のエ
ッペンドルフ(Eppendorf))に移した。500μlのフェノール:クロロホル
ム:イソアミルアルコール(25:24:1)および300μLのクロロホルムを加えて
混合した。試料を30秒間手短に渦流混合し、次いで13,200rpmで15分間、4
℃にて遠心分離した。
0.1M NaOAcの最終濃度まで加えた。この溶液を約20秒間渦流混合し、次いで
、1μLのGlyco Blue(商品名、米国テキサス州オースチン所在のアンビヨン
)を加えた。溶液を手短にかつ穏やかに渦流混合し、次いで、1mLの氷冷100%エタ
ノールを加えた。この溶液を約20秒間渦流混合し、次いで、RNAを沈殿させるために
−80℃で1時間、または−20℃で一晩保存した。沈殿後、この混合物を13,200
rpmで30分間、4℃にて遠心分離し、そしてRNAペレットを500μLの70%エ
タノールで洗浄した。このペレットを風乾し、次いで30μLのゲルローディング緩衝液
(95%ホルムアミド、50mM EDTA、キシレンシアノール、ブロモフェノールブ
ルー)を加えて混合し、そしてこの混合物を2分間渦流混合して再懸濁させた。
リルアミドゲルで分析した。このゲルを作製するために、24gの8M尿素、25mLの
40%(19:1)アクリルアミド、および8mLのホルムアミドを、1×TBE中で混
合して50mLの溶液とした。重合は、50μLのTemedおよび200μLの10%
APS(過硫酸アンモニウム)によって活性化した。ゲルは1×TBE中で泳動した。ゲ
ルを40mAで30分間予備泳動した。試料を100℃で5分間加熱し、次いで、すぐに
氷上で冷却した。対照実験のために、2μLのdsRNAを、8μLのゲルローディング
緩衝液と混合した。試料を13,200rpmで(20秒間、4℃)遠心分離し、10μ
Lをゲルに装荷した。このゲルを40mAで約1時間泳動した。
9、米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ)(100mgのStains−Allを
800mLのホルムアミド:水(1:1 v/v)に溶解)で30分間染色した。必要に
応じて、ゲルを30〜60分間、水中で脱色した。次いで、ゲルをスキャナー上で画像化
して分析した。
のSNCA8 dsRNAが急速に分解され、部分的に修飾されたdsRNA(SNCA
8s1)が部分的に安定化され、そしてさらに修飾されたSNCA8s2がこれら3種の
二本鎖中では最も安定であることが示されている。
siRNAがin vivoで神経細胞に送達され得るか否かを測定するために、ルシ
フェラーゼを標的とするsiRNA(ALN−DP−3000)(表1)をフルオレセイ
ン標識と複合体化し、定位的注射によってマウス脳の個別の領域に投与した(表2)。A
LN−DP−3000を、脳の皮質、海馬、および淡蒼球の領域に注射した。注射後の異
なる時点において、脳組織を採取し、その切片を作製し、蛍光標識されたsiRNAの局
在を顕微鏡で調べた。試験したすべての脳組織(皮質、海馬、および淡蒼球)において、
および注射後のすべての時点において、siRNAは細胞外空間ならびに細胞内に局在し
ていることが見出された。
シヌクレイン症と診断された患者には、SNCA遺伝子を標的とするiRNA剤を含む
薬学的組成物を投与することができる。この組成物は、浸透圧ポンプおよび小型カニュー
レを備え、患者に左右対称に移植されたデバイスによって脳に直接送達することができる
。
へのカニューレの送達のためにコンピュータ補助軌道を使用する。小型ポンプデバイスを
腹部に移植し、次いで、出血についてモニターするために患者を2〜3日入院させる。
。このヒトが十分に治癒しており、かつデバイス移植の結果として合併症が起こっていな
ければ、抗SNCA組成物をポンプに、そしてカニューレに注入することができる。治療
計画の開始の前に試験用量の抗SNCA剤を投与することができる。
、ならびにデバイスに対する患者の反応およびiRNA剤を用いる治療をモニターするこ
とができる。臨床医は、浮腫および炎症性応答の発生に注意すべきである。治療開始の1
年後に、必要に応じてMRIを実施することができる。
ができる。モニタリングには、連続的な臨床的評価および機能的神経画像化(例えば、M
RIによる)が含まれうる。
本発明のいくつかの実施形態に関して説明してきた。しかしながら、本発明の思想およ
び範囲を逸脱することなく種々の変更を施すことが可能であることは理解されよう。従っ
て、その他の実施形態は添付の特許請求の範囲に包含される。
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- 本明細書中に記載される発明。
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