JP2010533293A - リポソーム封入蛍光分子で固体支持体上の分析物を検出および定量化するための方法 - Google Patents
リポソーム封入蛍光分子で固体支持体上の分析物を検出および定量化するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、リポソーム封入蛍光分子で固体支持体上の分析物を検出および定量化するための改善された方法に関する。
Description
本発明は、リポソーム封入蛍光分子で固体支持体上の分析物を検出および定量するための改善された方法に関する。
リポソームは、脂質二重層により形成される小胞、および例えば抗体など、共有結合により小胞の外面にカップリングされている、分析物Aと複合体形成することができる分子からなる特定の構造である。イムノアッセイの場合、これらの構造は、小胞における、最も一般的には蛍光性である着色分子、特に、スルホローダミンの封入後に比色または蛍光標識として使用される。このタイプの構造は、数千または百万の着色分子がリポソームごとに包含される限りにおいて、高い比活性を持つ標識を有することを可能にする。これらの構造は、いくつかのアッセイフォーマット:微量滴定プレート、キャピラリーおよび免疫クロマトグラフィー(「ストリップ」)で使用される。
分析物の微量滴定−プレートまたはキャピラリー検出は、最も一般的には、分子の蛍光特性を使用する。しかしながら、リポソーム中の分子の濃度は、蛍光の自己消光の現象が存在するほどである。したがって、蛍光を明らかにするためには、界面活性剤でリポソームを破壊することにより媒体中で分子を希釈することが必要である(SINGHら、Anal.Chem.、72:6019〜6024、2000;DECORYら、Appl Environ.Microbiol.、71(4):1856〜1864、2005;HOら、Anal.Biochem.、330:342〜349、2004)。
免疫クロマトグラフィー(すなわち、ストリップフォーマット)による分析物の検出は、医学的診断、および例えば環境中の汚染物質の検出などの新たな応用分野において使用されている技法である。このフォーマットでは、リポソーム中に封入されている分子の呈色密度のみが使用される(米国特許第4,703,017号;HOおよびHSU、Anal.Chem.、75:4330〜4334、2003;PARKおよびDURST、Anal.Biochem.、280:151〜158、2000;AHN−YOONら、Anal.Bioanal.Chem.、378:68〜75、2004;AHN−YOONら、Anal.Chem.、75:2256〜2261、2003)。実際に、ストリップ上のサンプルの移動後に、界面活性剤を使用してリポソームを分解することができないのは、そのような行為が、キャピラリー作用によりストリップ全体にわたってシグナルが希釈される結果になるためである。したがって、分子が、ストリップフォーマットでそれらの蛍光特性のために使用されることがある場合、それらは、共有結合カップリングにより抗体に直接結合しているか(KIMら、Environ.Sci.Technol.、37:1899〜1904、2003)、多糖類などのポリマーを介して抗体に結合しているか(米国特許第5,543,332号)のどちらかであるフルオロフォアである。
ストリップフォーマットの利点である迅速に得られる結果および使いやすさは、ストリップフォーマットが「ホームテスト」応用またはフィールドにおける応用に完全に適していることを意味している。しかしながら、イムノアッセイまたは質量分析法などの他の技法に比べてその低い感度は、その使用を制限している。
したがって、この数年間、比色または蛍光シグナルを得るための新たな標識が、検出の感度を改善するために開発されてきた。しかしながら、今日まで、リポソームに封入されている分子の蛍光特性を使用して固体支持体上の分析物を検出するための、従来技術の知られている固体支持体上で行われる他の検出方法(比色分析、写真用フィルムにより明らかにされる可能性のあるルミネッセンスなど)の検出感度と少なくとも同等である検出感度を得ることを可能にする方法は存在しない。
SINGHら、Anal.Chem.、72:6019〜6024、2000
DECORYら、Appl Environ.Microbiol.、71(4):1856〜1864、2005
HOら、Anal.Biochem.、330:342〜349、2004
HOおよびHSU、Anal.Chem.、75:4330〜4334、2003
PARKおよびDURST、Anal.Biochem.、280:151〜158、2000
AHN−YOONら、Anal.Bioanal.Chem.、378:68〜75、2004
AHN−YOONら、Anal.Chem.、75:2256〜2261、2003
KIMら、Environ.Sci.Technol.、37:1899〜1904、2003
Rasband,W.S.、Image J.U.S.National Institutes of Health、Bethesda、Maryland USA、http://rsb.info.nih.gov/ij/、1997〜2006
したがって、本発明者らは、リポソームに封入されている分子の蛍光特性を活用することを可能にする、固体支持体上の分析物を検出するための新たな改善された方法を提供するという目的を自分たち自身に与えた。
この方法は、膜または微量滴定プレートなどの固相上のアッセイにおける蛍光トレーサーとしてフルオロフォアを含有するリポソームの使用であって、これらの固相を乾燥した後の使用に基づいている。一般に、リポソーム中の高濃度のフルオロフォアは、蛍光の自己消光の現象、したがって、弱い蛍光シグナルを誘導する。一方、固相を徐々に乾燥することは、液体界面活性剤を添加しないリポソームの溶解、それ故に、固体支持体上のリポソームのフルオロフォア内容物の制御された拡散、したがって、自己消光現象の減少または消失さえも引き起こし、蛍光の大きな増加に反映されるであろう。
したがって、本発明の主題は、蛍光分子を封入しているリポソームにより、固体支持体上で、生物学的サンプル中の少なくとも1つの分析物Aを検出するための方法であって、
1)(a)i)少なくとも1つの分析物Aを含むことができる前記生物学的サンプルを、液体媒体中で、蛍光分子を封入している少なくとも1つのリポソームおよび前記分析物Aと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させ、次いで、ii)前記媒体を、形成される可能性がある分析物A/リポソーム複合体と結合することができる少なくとも1つの固定化基質を含有する固体支持体と接触させるか、
b)固体支持体上に予め固定化されている前記生物学的サンプル(前記サンプルは、少なくとも1つの分析物Aを含むことができる)を、前記蛍光分子を封入しているリポソームを含む液体媒体および前記分析物Aと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させるかのどちらかのステップと、
2)前記固体支持体を乾燥することによりリポソームの外側に存在する液体媒体を除去するステップと、
3)リポソームを溶解するステップと、
4)発せられる可能性のある蛍光シグナルを検出するステップとを含むことを特徴とする方法である。
1)(a)i)少なくとも1つの分析物Aを含むことができる前記生物学的サンプルを、液体媒体中で、蛍光分子を封入している少なくとも1つのリポソームおよび前記分析物Aと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させ、次いで、ii)前記媒体を、形成される可能性がある分析物A/リポソーム複合体と結合することができる少なくとも1つの固定化基質を含有する固体支持体と接触させるか、
b)固体支持体上に予め固定化されている前記生物学的サンプル(前記サンプルは、少なくとも1つの分析物Aを含むことができる)を、前記蛍光分子を封入しているリポソームを含む液体媒体および前記分析物Aと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させるかのどちらかのステップと、
2)前記固体支持体を乾燥することによりリポソームの外側に存在する液体媒体を除去するステップと、
3)リポソームを溶解するステップと、
4)発せられる可能性のある蛍光シグナルを検出するステップとを含むことを特徴とする方法である。
本発明による方法のステップ2)によれば、支持体の乾燥は、リポソームの外側の液体媒体を除去させ、次いで、ステップ3)において、液体界面活性剤を添加する必要なくリポソームを溶解させ、固体支持体全体にわたるそれらの拡散を同時に防ぎながらそれらのフルオロフォア内容物を放出させるであろう。
したがって、この方法は、得られるシグナル、したがって、イムノアッセイ(アプローチ1)(a))特に、免疫クロマトグラフィーイムノアッセイの感度を増加させることを可能にするが、同時に、使用が簡単で迅速なままである。免疫ブロッティング(アプローチ1)(b))の場合、この方法は、より良いバンド解像力および基準マーカーであるペルオキシダーゼで得られる感度と少なくとも同等である感度を得ることを可能にする。この方法は、リポソームの様々な集団を使用していくつかの分析物を同時に分析することも可能にし、各集団は、リポソームからなり、その表面は、特定の分析物Aと複合体形成することができる分子にカップリングされており、それらが封入している蛍光分子の性質に応じて特定の波長で蛍光を発する。さらに、これらの2つの応用において、固体支持体を乾燥するステップは、それが含有する結果を容易に保存することを可能にするであろう。
本発明の別の特定の実施形態によれば、前記ステップ1)(a)(ii)は、
− キャピラリー作用による前記固体支持体上の前記媒体の移動か、
− 前記固体支持体上への前記媒体の付着のどちらかにより行われる。
− キャピラリー作用による前記固体支持体上の前記媒体の移動か、
− 前記固体支持体上への前記媒体の付着のどちらかにより行われる。
本発明のさらに別の特定の実施形態によれば、前記ステップ1)(b)は、以下のサブステップ:
i)電気泳動により前記生物学的サンプルから少なくとも1つの分析物Aを分離し、電子移動により固体支持体上に前記分析物Aを固定化するサブステップと、
ii)前記分析物Aが固定化されている前記固体支持体を、蛍光分子を封入している少なくとも1つのリポソームを含む液体媒体および前記分析物Aと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させるサブステップとを含む。
i)電気泳動により前記生物学的サンプルから少なくとも1つの分析物Aを分離し、電子移動により固体支持体上に前記分析物Aを固定化するサブステップと、
ii)前記分析物Aが固定化されている前記固体支持体を、蛍光分子を封入している少なくとも1つのリポソームを含む液体媒体および前記分析物Aと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させるサブステップとを含む。
本発明の特定の実施形態によれば、前記検出方法は、ステップ1)と2)の間に、複合体形成していないリポソームを除去するために固体支持体を洗浄する少なくとも1つのステップを含むこともある。
本発明によれば、固体支持体は、ニトロセルロース膜、微量滴定プレート、好ましくは、ポリスチレン製の、およびバイオチップから選択されることが好ましい。
本発明によれば、リポソームにカップリングされており、分析物Aと複合体形成することができる分子は、前記分析物と複合体形成することができる一次および二次抗体、前記分析物の受容体、ポリ核酸(DNAまたはRNA)、ペプチド核酸、レクチン、および前記分析物のための担体タンパク質または化学分子(キレート、合成受容体)から選択されることが好ましい。これらのリポソームは、それらが封入している蛍光分子の性質に応じて様々な波長で蛍光を発することができる。
本発明によれば、リポソーム封入蛍光分子は、以下のフルオロフォア:フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレセインおよびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)などのその誘導体、ローダミンならびにスルホローダミンおよびテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)などのその誘導体、Invitrogen社によりAlexa Fluor(登録商標)という商品名で販売されている製品、例えば、Alexa Fluor(登録商標)488、500、514、532、546、555、568、594、610−X、633、647、660、680、700、750および790などのN−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形態であるローダミンの水溶性誘導体、クマリンおよび7−アミノクマリンなどのそれらの誘導体、GE Healthcare社により基準品Cy3、Cy3.5、Cy3B、Cy5、Cy5.5およびCy7として販売されているものなどの蛍光シアニン、Texas Red(登録商標)としても知られているスルホローダミン101スルホニルクロリドなどのスルホローダミン誘導体、Fluoroprobes(登録商標)という商品名で販売されている染料、および緑色蛍光タンパク質(GFPと略されることが多い)などから選択されることが好ましい。本発明によれば、スルホローダミンおよびCy5(登録商標)などの蛍光シアニンが特に好ましい。
本発明によれば、固体支持体から液体を除去するステップ2)は、好ましくは、約20〜90℃の範囲である温度にて、さらにより好ましくは、約40℃の温度にて固体支持体を乾燥することにより行われる。
本発明の好ましい実施形態によれば、乾燥ステップ2)は、約20〜90℃の温度にて、好ましくは約40℃の温度にてオーブン中で行われる。
本発明によれば、乾燥ステップ2)の時間は、リポソームの外側の支持体上に存在する液体媒体の量により異なることがある。この時間は、支持体を完全に乾燥するのに必要な時間に対応していなければならないが、リポソームの溶解を引き起こしてはならない。指示としては、この時間は、約1〜60分の範囲であってよく、乾燥時間は、約5分であることが好ましい。
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ステップ2)における支持体の乾燥は、約5分にわたって、約40℃の温度にて、オーブン中で行われる。
ステップ3)におけるリポソームの溶解は、いずれの適当な技術手段によっても行うことができるが、ただし、この手段は、支持体のいかなる再加湿も引き起こさないこととする(熱的、物理的または化学的手段)。
本発明の好ましい実施形態によれば、リポソーム溶解ステップ3)は、支持体の追加乾燥により行われる。この場合、この追加乾燥ステップは、一般的に、リポソームの外側に存在する液体媒体を除去するのに必要とされる最初の乾燥ステップ2)よりも急速である。この時間は、約1〜15分の範囲であってよく、ステップ3)における追加乾燥時間は、約1分であることが好ましい。
本発明の好ましい実施形態によれば、追加乾燥ステップ3)は、約20〜90℃の温度にて、好ましくは約40℃の温度にてオーブン中で行われる。
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ステップ3)における支持体の乾燥は、約1分にわたって、約40℃の温度にて、オーブン中で行われる。
本発明によれば、固体支持体上に固定化される1つまたは複数の基質は、アッセイされる前記分析物Aまたはその類似体もしくはフラグメント、抗分析物A抗体、および例えばマウス、ヒト、ラット、ヤギなどからの免疫グロブリンに対する抗体から選択されることが好ましい。
分析物Aの検出は、固体支持体上のリポソームにより発せられる可能性がある蛍光シグナルを読み取ることにより行われる。発せられる蛍光を読み取るための時間が長ければ長いほど、蛍光シグナルは増加し、それによって、検出限界を高めることを可能にする。したがって、得られる結果による読み取り時間および望ましい検出限界を調節することが可能である。本発明による方法の好ましい実施形態によれば、ステップ4)の蛍光シグナルの検出は、少なくとも1分にわたって、さらにより好ましくは、1〜5分の範囲にわたって行われる。例えば、スルホローダミンがフルオロフォアとして使用される場合、600nmにおける読み取り時間は、約1〜5分の範囲であってよい。
上記のアレンジメントに加えて、本発明は、固体支持体上の、イムノアッセイにおけるリポソーム封入分子の蛍光の増加に対する乾燥の効果を証明する非限定的な実施例、および添付の図1〜14にも言及している、後に続くさらなる説明から浮かび上がるであろう他のアレンジメントも含む。
しかしながら、これらの実施例は、純粋に本発明の例示のために示されており、決していかなる制限にもならないことが理解されるべきである。
リポソームの蛍光に対する乾燥の効果の証明
a)フルオロフォアを含有するリポソームの調製
a−1)フルオロフォアを含有するリポソームの調製
リポソームは、5:5:0.5:0.25のモル比でジパルミトイル−sn−3−グリセロホスホコリン(DPPC)、コレステロール(Chol.)、ジパルミトイル−sn−3−グリセロホスホグリセロール(DPPG)およびジパルミトイル−sn−3−グリセロホスホエタノールアミン(DPPE)からなる脂質の混合物から調製した。
a)フルオロフォアを含有するリポソームの調製
a−1)フルオロフォアを含有するリポソームの調製
リポソームは、5:5:0.5:0.25のモル比でジパルミトイル−sn−3−グリセロホスホコリン(DPPC)、コレステロール(Chol.)、ジパルミトイル−sn−3−グリセロホスホグリセロール(DPPG)およびジパルミトイル−sn−3−グリセロホスホエタノールアミン(DPPE)からなる脂質の混合物から調製した。
この脂質混合物合計100μmolを、6:6:1のモル比のクロロホルム、イソプロピルエーテルおよびメタノールからなる溶媒の混合物10mlに溶かした。窒素下で60℃にてこの溶液を超音波処理した後に、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4中150mMのフルオロフォア(スルホローダミンまたはCy5(登録商標))1.5mlを添加した。窒素下で60℃にて6分にわたって超音波処理した後に、有機溶媒を、ロータリーエバポレーターを使用して45℃にて真空下で蒸発させた。リポソームの懸濁液に対応するゲルは、このようにして得られた。0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4中150mMのフルオロフォア(スルホローダミンまたはCy5(登録商標))3mlをこの溶液に添加した後に、超音波処理を、窒素下で60℃にて5分にわたって行った。
a−2)リポソームの抽出
均一サイズ(0.4μm)のリポソームの溶液を得るために、リポソーム溶液を、水浴中で60℃にてインキュベートし、細孔サイズを減少させながら(1.2μmのフィルターを3回通過、次いで、0.4μmのフィルターを3回通過)ポリカーボネート膜に通して押し出した。このようにして得られたリポソーム溶液を、4℃にて30分にわたって45,000rpmで遠心分離した。リポソームを含有するペレットを、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7、+0.15M NaClに取り、次いで、遊離(非封入)スルホローダミンを、Sephadex(登録商標)G25ゲル上で排除クロマトグラフィーを行うことにより除去した。このクロマトグラフィーが終わったら、リポソーム溶液を、4℃にて30分にわたって45,000rpmで遠心分離した。このようにして得られたペレットを、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7、+0.15M NaCl 4mlに取り、暗所で4℃にて保存した。
均一サイズ(0.4μm)のリポソームの溶液を得るために、リポソーム溶液を、水浴中で60℃にてインキュベートし、細孔サイズを減少させながら(1.2μmのフィルターを3回通過、次いで、0.4μmのフィルターを3回通過)ポリカーボネート膜に通して押し出した。このようにして得られたリポソーム溶液を、4℃にて30分にわたって45,000rpmで遠心分離した。リポソームを含有するペレットを、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7、+0.15M NaClに取り、次いで、遊離(非封入)スルホローダミンを、Sephadex(登録商標)G25ゲル上で排除クロマトグラフィーを行うことにより除去した。このクロマトグラフィーが終わったら、リポソーム溶液を、4℃にて30分にわたって45,000rpmで遠心分離した。このようにして得られたペレットを、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7、+0.15M NaCl 4mlに取り、暗所で4℃にて保存した。
b)リポソームの蛍光に対する乾燥の効果の証明
フルオロフォアとしてスルホローダミンかCy5(登録商標)のどちらかを含むリポソームを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.1% BSA+0.5% Tween(登録商標)20+0.01% NaN3中で1/50、1/500および1/5000まで希釈した。
フルオロフォアとしてスルホローダミンかCy5(登録商標)のどちらかを含むリポソームを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.1% BSA+0.5% Tween(登録商標)20+0.01% NaN3中で1/50、1/500および1/5000まで希釈した。
希釈液の各々5μ1を、カードボード支持体に結合している膜上に付着させ、次いで、蛍光を、それぞれスルホローダミンおよびCy5(登録商標)について535nmおよび625nmの励起フィルター、およびそれぞれスルホローダミンおよびCy5(登録商標)について600nmおよび670nmの発光フィルターでImage Station 4000MM(Kodak Molecular Imaging Systems、USA)を使用して1分にわたって測定した。ストリップを、40℃にてオーブン中で5分にわたって乾燥し、蛍光を、再び測定した。
結果を添付の図1に示す。
図1の凡例:
A=スルホローダミン
B=Cy5(登録商標)。
A=スルホローダミン
B=Cy5(登録商標)。
図1で観察されるように、乾燥は、蛍光を大きく増加させる。
免疫測定フォーマットでのストリップテストにおけるリポソームの使用
a)免疫測定アッセイの原理
図2は、テストラインが、固定化抗分析物抗体からなり、コントロールラインが、固定化抗マウス免疫グロブリン抗体からなる「免疫測定」アッセイの原理を概略的に示している。免疫クロマトグラフィーテストを行うのに使用されるストリップは、カードボード支持体に結合している3つの構成成分(サンプルパッド、ニトロセルロース膜および吸収バッド)からなる。探索される分析物がサンプル中に存在する場合、分析物は、まず、サンプルに添加されたリポソームと複合体形成し(前記リポソームの外面に結合しているマウス抗分析物抗体を介して)、次いで、次に、ストリップ上を移動する間に、テストライン上に固定化されている他の抗分析物抗体に結合するであろう。テストの正しい機能は、非複合体リポソームの外面に付着しているマウス抗分析物抗体の、固定化抗マウス免疫グロブリン抗体との結合によってコントロールラインにおいて検証される。サンプル中の探索されている分析物の存在は、テストラインにおけるシグナルの出現に反映されるであろう。逆に、サンプル中の分析物の非存在は、テストラインにおけるシグナルの非存在に反映されるであろう。
a)免疫測定アッセイの原理
図2は、テストラインが、固定化抗分析物抗体からなり、コントロールラインが、固定化抗マウス免疫グロブリン抗体からなる「免疫測定」アッセイの原理を概略的に示している。免疫クロマトグラフィーテストを行うのに使用されるストリップは、カードボード支持体に結合している3つの構成成分(サンプルパッド、ニトロセルロース膜および吸収バッド)からなる。探索される分析物がサンプル中に存在する場合、分析物は、まず、サンプルに添加されたリポソームと複合体形成し(前記リポソームの外面に結合しているマウス抗分析物抗体を介して)、次いで、次に、ストリップ上を移動する間に、テストライン上に固定化されている他の抗分析物抗体に結合するであろう。テストの正しい機能は、非複合体リポソームの外面に付着しているマウス抗分析物抗体の、固定化抗マウス免疫グロブリン抗体との結合によってコントロールラインにおいて検証される。サンプル中の探索されている分析物の存在は、テストラインにおけるシグナルの出現に反映されるであろう。逆に、サンプル中の分析物の非存在は、テストラインにおけるシグナルの非存在に反映されるであろう。
b)免疫測定フォーマットにおけるストリップテストの調製
b−1)免疫リポソームの調製
b−1−1)スクシンイミジルアセチルチオプロピオネート(SATP)によるリポソームの誘導
ジメチルホルムアミド(DMF)中10mg/mlのSATPの溶液17μlを、実施例1で前に記載されているように調製したスルホローダミンを含むリポソームの溶液300μlに添加した。20℃にて1時間にわたってインキュベートした後に、反応を、1Mトリス/HCl緩衝液、pH7 100μlを添加することにより停止させた。15分後、反応しなかったSATPを、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7、+0.15M NaClを使用するSephadex(登録商標)G25ゲルによる排除クロマトグラフィーにより除去した。リポソームに対応する分画を混ぜ、4℃にて30分にわたって45,000rpmで遠心分離した。得られたペレットを、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl 225μlに取り、SATPのチオール基を、1Mヒドロキシルアミン、pH7 25μlを添加することにより脱保護した。
b−1)免疫リポソームの調製
b−1−1)スクシンイミジルアセチルチオプロピオネート(SATP)によるリポソームの誘導
ジメチルホルムアミド(DMF)中10mg/mlのSATPの溶液17μlを、実施例1で前に記載されているように調製したスルホローダミンを含むリポソームの溶液300μlに添加した。20℃にて1時間にわたってインキュベートした後に、反応を、1Mトリス/HCl緩衝液、pH7 100μlを添加することにより停止させた。15分後、反応しなかったSATPを、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7、+0.15M NaClを使用するSephadex(登録商標)G25ゲルによる排除クロマトグラフィーにより除去した。リポソームに対応する分画を混ぜ、4℃にて30分にわたって45,000rpmで遠心分離した。得られたペレットを、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl 225μlに取り、SATPのチオール基を、1Mヒドロキシルアミン、pH7 25μlを添加することにより脱保護した。
b−1−2)N−スクシンイミジル−4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)によるマウス抗体の修飾
DMF中1mg/mlのSMCCの溶液を、20:1のモル比で、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4中の黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)エンテロトキシンB(SEB)に対するマウスモノクローナル抗体の溶液に添加した。20℃にて1時間にわたってインキュベートした後に、反応を、15分にわたって、1M Tris、pH7を添加することにより停止させた。このようにして誘導された抗体を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaClでのSephadex(登録商標)G25ゲル上の排除クロマトグラフィーにより精製し、抗体−SMCCを含有する分画を、280nmにおける吸光度を測定することにより決定した。
DMF中1mg/mlのSMCCの溶液を、20:1のモル比で、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4中の黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)エンテロトキシンB(SEB)に対するマウスモノクローナル抗体の溶液に添加した。20℃にて1時間にわたってインキュベートした後に、反応を、15分にわたって、1M Tris、pH7を添加することにより停止させた。このようにして誘導された抗体を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaClでのSephadex(登録商標)G25ゲル上の排除クロマトグラフィーにより精製し、抗体−SMCCを含有する分画を、280nmにおける吸光度を測定することにより決定した。
b−1−3)リポソームの抗体とのカップリング
リポソームの抗体とのカップリングは、抗体−SMCC 500μgを4℃にて一夜にわたって脱保護したリポソーム−SATP(250μl)と一緒にインキュベートすることにより行った。カップリングしなかった抗体を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaClを使用するSepharose(登録商標)CI−4Bゲル(Sigma−Aldrich)での排除クロマトグラフィーによりリポソームから分離した。リポソームに対応する分画を集め、4℃にて30分にわたって45,000rpmで遠心分離した。得られたペレットを、0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.4、+0.15M NaCl+0.01% NaN3 500μlに取り、暗所で4℃にて保存した。
リポソームの抗体とのカップリングは、抗体−SMCC 500μgを4℃にて一夜にわたって脱保護したリポソーム−SATP(250μl)と一緒にインキュベートすることにより行った。カップリングしなかった抗体を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaClを使用するSepharose(登録商標)CI−4Bゲル(Sigma−Aldrich)での排除クロマトグラフィーによりリポソームから分離した。リポソームに対応する分画を集め、4℃にて30分にわたって45,000rpmで遠心分離した。得られたペレットを、0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.4、+0.15M NaCl+0.01% NaN3 500μlに取り、暗所で4℃にて保存した。
b−2)ストリップの調製
ニトロセルロース膜上の検出ゾーンは、試薬の2つのライン:自動ディスペンサー(BioDot AirJet(登録商標)3050、Irvine、CA)を使用する、1μl/cmでの、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl中500μg/mlの抗マウス免疫グロブリン抗体の付着に対応するコントロールライン、および1μl/cmでの、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl中1mg/mlの抗黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)エンテロトキシンB(SEB)抗体の沈着に対応するテストラインからなる。
ニトロセルロース膜上の検出ゾーンは、試薬の2つのライン:自動ディスペンサー(BioDot AirJet(登録商標)3050、Irvine、CA)を使用する、1μl/cmでの、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl中500μg/mlの抗マウス免疫グロブリン抗体の付着に対応するコントロールライン、および1μl/cmでの、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl中1mg/mlの抗黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)エンテロトキシンB(SEB)抗体の沈着に対応するテストラインからなる。
膜を、オーブン中で40℃にて1時間にわたって乾燥し、次いで、かき混ぜながら周囲温度にて30分にわたって、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.5%ウシアルブミン(BSA)で飽和させた。次いで、膜を、かき混ぜながら周囲温度にて5分にわたって超純水で2回洗浄し、次いで、かき混ぜながら周囲温度にて15分にわたって、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.15% Tween(登録商標)20と一緒にインキュベートした。膜を、オーブン中で40℃にて15分にわたって乾燥し、次いで、サンプルパッドを、膜の下部に結合させ、吸収パッドを、膜の上部に結合させた。最後に、ストリップを、このようにして調製された膜を、プログラム可能な裁断機(Guillotine Cutting(登録商標)CM4000、BioDot Irvine CA)を使用して5mmの幅に切断することにより得た。
c)免疫測定フォーマットでのストリップテストにおける蛍光に対する乾燥の効果の証明
パラグラフb−1)で前に得られたスルホローダミンおよび抗SEBモノクローナル抗体を含むリポソームを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.01% NaN3中で1/500まで希釈した。SEB(Sigma−Aldrich)についての濃度範囲(10;5;2.5;1.25;0.6;0.3;0.15;0.08;0.04;0.02および0ng/ml)を、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.1% BSA+0.5% Tween(登録商標)20+0.01% NaN3中で調製した。
パラグラフb−1)で前に得られたスルホローダミンおよび抗SEBモノクローナル抗体を含むリポソームを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.01% NaN3中で1/500まで希釈した。SEB(Sigma−Aldrich)についての濃度範囲(10;5;2.5;1.25;0.6;0.3;0.15;0.08;0.04;0.02および0ng/ml)を、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.1% BSA+0.5% Tween(登録商標)20+0.01% NaN3中で調製した。
リポソーム10μlと一緒に、SEBの濃度の各々100μlを、微量滴定プレートウェル中に沈着させた。暗所で周囲温度にてかき混ぜながら、10分にわたってインキュベートした後に、パラグラフb−1)に記載されているように調製したストリップ(テストラインに固定化されている第2の抗SEBモノクローナル抗体を含む)を、垂直にウェルに入れると(溶液と接触しているサンプルパッド)、移動がキャピラリー作用により起こった。溶液がストリップ上を完全に移動した後に、これらをウェルから取り出した。
蛍光は、535nmの励起フィルターおよび600nmの発光フィルターでImage Station(登録商標)4000MM(Kodak Molecular Imaging Systems、USA)を使用して1分にわたって測定した。ストリップを、サンプルパッドおよび吸収パッドから取り除いた後に、オーブン中で40℃にて5分にわたって乾燥し(ステップ2および3)、蛍光を、前と同じ条件下で測定した。
結果を図3に示す。
結果は、乾燥が、テストラインおよびコントロールラインにおいて蛍光シグナルを得ることを可能にすることを示している。さらに、テストラインにおけるシグナルは、SEBの濃度と共に増加し、免疫測定フォーマットの原理と一致している。
この実験は、液体を除去し、次いで、乾燥することが、ストリップテストにおける蛍光標識としてリポソームを使用するのに不可欠であることを証明している。
d)免疫測定フォーマットでの比色測定または蛍光測定でリポソームについて得られる検出限界の比較
フルオロフォアとしてのスルホローダミンおよび抗SEBモノクローナル抗体を含むリポソームを、パラグラフb−1)で前に記載されているように調製し、次いで、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.01% NaN3中で1/50まで希釈した。SEB(Sigma−Aldrich)についての濃度範囲も、パラグラフc)で上記に記載されているように調製した。
フルオロフォアとしてのスルホローダミンおよび抗SEBモノクローナル抗体を含むリポソームを、パラグラフb−1)で前に記載されているように調製し、次いで、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.01% NaN3中で1/50まで希釈した。SEB(Sigma−Aldrich)についての濃度範囲も、パラグラフc)で上記に記載されているように調製した。
リポソームをSEBの様々な濃度と接触させること、次いで、キャピラリー作用による移動は、パラグラフc)で前に記載されているように行った。
溶液がストリップ上を完全に移動した後に、サンプルパッドおよび吸収パッドを取り除き、ストリップを、40℃にて5分にわたって乾燥し(ステップ2および3)、蛍光を、パラグラフc)で前に記載されているように測定し、次いで、これらの同じストリップを、比色シグナルを測定するためにEpson Expression(登録商標)1640XLスキャナーでスキャンした。
結果を図4に示す。
結果は、蛍光シグナルについて得られた検出限界が、約20pg/mlであり、一方、比色シグナルについては約300pg/mlであることを示している。
したがって、乾燥方法による蛍光シグナルの使用は、同じ条件下で同じ試薬を使用して、検出限界を15倍まで高めることを可能にする。
e)免疫測定フォーマットでのストリップテストにおける蛍光シグナルの定量化の例
フルオロフォアとしてのスルホローダミンおよび抗SEBモノクローナル抗体を含むリポソームを調製し、パラグラフc)で前に記載されているように1/500まで希釈した。SEB(Sigma−Aldrich)についての濃度範囲も、パラグラフc)で前に記載されているように調製した。
フルオロフォアとしてのスルホローダミンおよび抗SEBモノクローナル抗体を含むリポソームを調製し、パラグラフc)で前に記載されているように1/500まで希釈した。SEB(Sigma−Aldrich)についての濃度範囲も、パラグラフc)で前に記載されているように調製した。
リポソームをSEBの様々な濃度と接触させること、次いで、キャピラリー作用による移動は、パラグラフc)で前に記載されているように行った。
溶液がストリップ上を完全に移動した後に、蛍光を、パラグラフc)で前に記載されているように1分にわたって測定した。サンプルパッドおよび吸収パッドを取り除き、次いで、ストリップを、40℃にて5分にわたって乾燥し(ステップ2および3)、蛍光を、パラグラフc)で前に記載されているように1分および5分にわたって測定した。各濃度に対応する蛍光シグナルを定量化するために、同じストリップのテストラインとコントロールラインの間に位置する同じ寸法のゾーンの蛍光シグナルを、テストラインの蛍光シグナルから減じた。すべてのこれら定量化は、Image Jソフトウェア(Rasband,W.S.、Image J.U.S.National Institutes of Health、Bethesda、Maryland USA、http://rsb.info.nih.gov/ij/、1997〜2006)を使用して行った。
結果を図5に示す。
結果は、長時間にわたって蛍光を測定することが、蛍光シグナルを増加させ、それによって、検出限界を高めることを可能にすることを示している。したがって、読み取り時間は、得られる結果および望ましい検出限界に従って調節することができる。
競合フォーマットでのストリップテストにおけるリポソームの使用
a)競合フォーマットの原理
図6は、テストラインが、固定化分析物またはその固定化類似体からなり、コントロールラインが、固定化抗マウス免疫グロブリン抗体からなる「競合」アッセイの原理を概略的に示している。探索される分析物がサンプル中に存在する場合、分析物は、まず、免疫リポソームの外面に付着しているマウス抗分析物抗体と結合し、したがって、結合部位が占有されているためにストリップ上を移動中にテストラインに固定化されている分析物またはその類似体ともはや結合することができないであろう。したがって、サンプル中の探索されている分析物の存在は、テストラインにおけるシグナルの減少または完全消失に反映されるであろう。逆に、探索されている分析物がサンプル中に存在しない場合、これは、リポソームを、テストラインに固定化されている分析物またはその類似体に結合させ、したがって、テストラインにおけるシグナルの存在に反映されるであろう。すべての場合において、コントロールラインにおけるシグナルは、免疫リポソームの外面に付着しているマウス抗分析物抗体を介するリポソームの固定化抗マウス免疫グロブリン抗体との結合によって最大で不変のままである。
a)競合フォーマットの原理
図6は、テストラインが、固定化分析物またはその固定化類似体からなり、コントロールラインが、固定化抗マウス免疫グロブリン抗体からなる「競合」アッセイの原理を概略的に示している。探索される分析物がサンプル中に存在する場合、分析物は、まず、免疫リポソームの外面に付着しているマウス抗分析物抗体と結合し、したがって、結合部位が占有されているためにストリップ上を移動中にテストラインに固定化されている分析物またはその類似体ともはや結合することができないであろう。したがって、サンプル中の探索されている分析物の存在は、テストラインにおけるシグナルの減少または完全消失に反映されるであろう。逆に、探索されている分析物がサンプル中に存在しない場合、これは、リポソームを、テストラインに固定化されている分析物またはその類似体に結合させ、したがって、テストラインにおけるシグナルの存在に反映されるであろう。すべての場合において、コントロールラインにおけるシグナルは、免疫リポソームの外面に付着しているマウス抗分析物抗体を介するリポソームの固定化抗マウス免疫グロブリン抗体との結合によって最大で不変のままである。
b)ストリップテストの調製
b−1)免疫リポソームの調製
リポソームは、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4中の抗ミクロシスチンLRマウスモノクローナル抗体の溶液を使用したことを除いて、実施例2のパラグラフb−1)で前に記載されているように調製する。
b−1)免疫リポソームの調製
リポソームは、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4中の抗ミクロシスチンLRマウスモノクローナル抗体の溶液を使用したことを除いて、実施例2のパラグラフb−1)で前に記載されているように調製する。
b−2)ストリップの調製
使用されるストリップは、テストラインが、1μl/cmでの、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl中5μg/mlのウシアルブミンにカップリングされているミクロシスチンLRの付着に対応していることを除いて、実施例2のパラグラフb−2)で前に記載されているように調製する。
使用されるストリップは、テストラインが、1μl/cmでの、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl中5μg/mlのウシアルブミンにカップリングされているミクロシスチンLRの付着に対応していることを除いて、実施例2のパラグラフb−2)で前に記載されているように調製する。
c)競合フォーマットでのストリップテスト
このようにして得られたフルオロフォアとしてのスルホローダミンおよび抗ミクロシスチンLRマウスモノクローナル抗体を含むリポソームを、実施例2のパラグラフc)で前に記載されているように1/500まで希釈した。ミクロシスチンLR(Sigma−Aldrich)についての濃度範囲(3;1.5;0.75;0.38;0.19;0.09および0ng/ml)を、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.1% BSA+0.5% Tween20+0.01% NaN3中で調製した。
このようにして得られたフルオロフォアとしてのスルホローダミンおよび抗ミクロシスチンLRマウスモノクローナル抗体を含むリポソームを、実施例2のパラグラフc)で前に記載されているように1/500まで希釈した。ミクロシスチンLR(Sigma−Aldrich)についての濃度範囲(3;1.5;0.75;0.38;0.19;0.09および0ng/ml)を、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.1% BSA+0.5% Tween20+0.01% NaN3中で調製した。
リポソーム10μlと一緒に、ミクロシスチンLRの濃度の各々100μlを、微量滴定プレートウェル中に付着させた。10分にわたってインキュベートした後に、ストリップ(テストラインに固定化されているBSAにカップリングされているミクロシスチンと一緒に)を、垂直にウェルに入れた。溶液がストリップ上を完全に移動した後に、サンプルパッドおよび吸収パッドを取り除き、ストリップを、40℃にて5分にわたって乾燥し(ステップ2および3)、蛍光を、実施例2のパラグラフc)で前に記載されているのと同じ条件下で1分にわたって測定した。
結果を図7に示す。
結果は、リポソームが、使用される検出フォーマットに関係なく使用することができることを示している。蛍光シグナルは、ミクロシスチンの濃度と反比例しており、競合フォーマットと一致している。
膜上のリポソームの他の応用:ウェスタンブロッティング
プリオンタンパク質を検出するためのマウス脳抽出物か、全精製マウス免疫グロブリンもしくはF(ab’)2フラグメントの形態の精製マウス免疫グロブリンのいずれかのサンプルを使用した。マウス脳抽出物を、β−メルカプトエタノール2.5%を含有するLaemmli緩衝液(60mM Tris/HCl、pH6.8、+0.1% SDS+10%グリセロール+0.3%ブロモフェノールブルー)中で1/50、1/100、1/200および1/400まで希釈した。免疫グロブリンを、Laemmli緩衝液中で1μg/mlおよび5μg/mlまで希釈した。
プリオンタンパク質を検出するためのマウス脳抽出物か、全精製マウス免疫グロブリンもしくはF(ab’)2フラグメントの形態の精製マウス免疫グロブリンのいずれかのサンプルを使用した。マウス脳抽出物を、β−メルカプトエタノール2.5%を含有するLaemmli緩衝液(60mM Tris/HCl、pH6.8、+0.1% SDS+10%グリセロール+0.3%ブロモフェノールブルー)中で1/50、1/100、1/200および1/400まで希釈した。免疫グロブリンを、Laemmli緩衝液中で1μg/mlおよび5μg/mlまで希釈した。
脳抽出物は、12%ポリアクリルアミドゲル上にロードし(15μl/希釈液)、免疫グロブリンは、6%ポリアクリルアミドゲル上にロードした(15μl/希釈液)。それらは、二つ組でロードした。電気泳動を、Tris/グリシン泳動緩衝液で200ボルトにて1時間にわたって行った。
ポリアクリルアミドゲル中に存在する分子の電子移動は、1時間にわたって100ボルトにてTris/CAPS緩衝液(Biorad)中のImmobilon−FL(登録商標)(Millipore)という商品名で販売されているPolyVinylidene DiFluoride(PVDF)膜上で行った。
膜を回収し、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl(PBS)中、次いで、エタノール中、最後に、5分にわたる水中の素早い浸漬によりすすいだ。膜を、PBS+0.1% Tween(登録商標)20+5% BSA中で30分にわたって飽和させた。膜を、2回の短い洗浄(10秒)、次いで、PBS+0.1% Tween20による5分の洗浄によりすすいだ。
マウス脳抽出物に対応する膜を、PBS+0.1% Tween(登録商標)20+1% BSA中で4μg/mlまで希釈された抗プリオンタンパク質抗体と一緒に周囲温度にて30分にわたってプレインキュベートし、次いで、素早い浸漬と、続く、PBS+0.1% Tween20中の5および10分にわたる2回の洗浄によりすすいだ。
次いで、脳抽出物および免疫グロブリンに対応する膜を、周囲温度にて20分にわたって、PBS+0.1% Tween20+3% BSA中で1/1000まで希釈されたペルオキシダーゼ(Pierce)にカップリングされている抗マウス免疫グロブリン抗体か、PBS+0.1% Tween(登録商標)20+3% BSA中で1/500まで希釈されている、スルホローダミンを含有し抗マウス免疫グロブリン抗体にカップリングされているリポソームのどちらかと一緒にインキュベートした。続いて、膜を、素早い浸漬と、続く、5分にわたる1回の洗浄およびPBS+0.1% Tween(登録商標)20中の10分にわたる2回の洗浄によりすすいだ。最後に、膜を、1分にわたってPBS中ですすいだ。
続いて、リポソームに対応する膜を、40℃にて5分にわたって乾燥し(ステップ2および3)、蛍光を、1分(図8)および5分(図9)にわたって測定した。
ペルオキシダーゼに対応する膜を、ECL Plus(登録商標)(Pierce)に浸漬し、次いで、プラスチックフィルムの下に置き、ルミネッセンスを、Kodak(登録商標)2000 MMイメージステーションを使用し、励起または発光フィルターなしに、1分(図8)および5分(図9)にわたって読み取った。この測定後、ルミネッセンスも、従来の手順による写真用フィルムを使用して明らかにされた(図9)。
結果を図8および9に示す。
図8(0〜2500のシグナルスケール)に示すように、リポソーム溶解に先立って膜を乾燥することは、良質の局在的な蛍光シグナルを得て、それによってストリップで得られる結果を確認するのに不可欠である。
図9「リポソーム」(0〜16,000のシグナルスケール)に示すように、リポソームは、写真用フィルムにより明らかにされるルミネッセンスの感度(図9「ペルオキシダーゼ写真用フィルム」、Image Jにより処理される写真用フィルムのスキャン)と少なくとも同等であり、Kodak(登録商標)ステーションを使用して測定される発光で得られる感度(図9「ペルオキシダーゼKodak(登録商標)ステーション」、0〜160のシグナルスケール)よりもかなり高い感度を得ることを可能にする。さらに、抗体により明らかにされる様々な分子に対応するバンドは、免疫リポソームについてはかなり少ない拡散であり、その分析を容易にし、前記分析をより正確にする。
微量滴定プレートにおけるリポソームの使用
ウェルが、黒い壁であるが透明な底を有するポリスチレン微量滴定プレート(Colstar)を使用した。これらのプレートのポリスチレンは、高いタンパク質吸着能力を有する。
ウェルが、黒い壁であるが透明な底を有するポリスチレン微量滴定プレート(Colstar)を使用した。これらのプレートのポリスチレンは、高いタンパク質吸着能力を有する。
0.05Mリン酸塩緩衝液、pH7.4中1mg/mlのニュートラアビジン(Pierceにより販売されているアビジン類似体)の溶液1μlを、ウェルの底に付着させた。湿性チャンバー内で20℃にて16時間にわたってインキュベートした後に、ニュートラアビジン溶液を除去し、プレートを、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.1% Tween20(洗浄用緩衝液)で洗浄した。
プレート上の吸着部位を、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.1% BSA+0.15M NaCl+0.01% NaN3の溶液(希釈緩衝液)300μlをウェル中に付着させることにより飽和させた。リン酸塩緩衝液でプレートを洗浄した後に、1μg/mlのビオチニル化した第1の抗エンテロトキシンB(SEB)抗体40μlを、20℃にて30分にわたって、ウェル中に付着させた。
並行して、希釈緩衝液中のある範囲のSEB(10;3.33;1.11;0.37;0.12;0.041および0ng/ml)を、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl中で1/500まで希釈されたリポソーム(スルホローダミンBを含有する)と混ぜ、第2の抗SEB抗体をカップリングさせた。20℃にて30分にわたってインキュベートし、洗浄用緩衝液でプレートを洗浄した後に、これらの溶液40μlを、20℃にて30分にわたってウェル中に付着させた。続いて、プレートを洗浄し、次いで、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl 100μlを付着させ、蛍光を、1分にわたってKodak(登録商標)Station(535nmの励起フィルターおよび600nmの発光フィルター)で測定した(図10A)。この読み取りの後に、ウェルを、空にし、プレートを、オーブン中で40℃にて10分にわたって乾燥した。さらなる読み取りを、1分にわたってKodak(登録商標)Stationで行い(図10B)、各ウェルの蛍光を、PCO1600カメラ(Photon Lines)に連結されている倒立顕微鏡(Olympus(登録商標)IX71)を使用し、5秒(図11A)および15秒(図11B)にわたって測定し、それによって、5秒(黒三角)および15秒(黒四角)におけるSEBの濃度(ng/ml)の関数として測定された蛍光の量(任意の単位)を表す曲線(図12)をプロットすることを可能にした。
図10の結果は、他の固体支持体に関して、乾燥が、蛍光シグナルの出現を観察するために必要であることを示している。
さらに、図11の結果は、蛍光シグナルが、スポットに完全に局在していることを示している。最後に、図12の結果は、得られるシグナルが、定量化可能であり、サンプル中に存在する分析物の量に比例していることを示している。すべてのこれらの知見は、数千のスポットからなり、ポリヌクレオチドか、ペプチドもしくはタンパク質のどちらかを分析するバイオチップについてリポソームの使用を想定することを可能にする。
したがって、本発明の主題は、バイオチップを読み取るための、上記で定義されているような検出および定量化方法の使用でもある。
支持体を乾燥し、リポソームを溶解するために使用される手順の重要性の証明
a)ストリップテストにおけるリポソームの使用
スルホローダミンおよび抗SEBモノクローナル抗体を含むリポソームを、実施例2のパラグラフb−1)で前に記載されているように調製した。続いて、これらのリポソームを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.015M NaCl+0.01% NaN3中で1/500まで希釈した。2濃度(5および0ng/ml)のエンテロトキシンB(Sigma Aldrich)を、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.1% BSA+0.5% Tween(登録商標)20+0.01% NaN3中で調製した。SEBの各濃度100μlを、リポソーム10μlと一緒に微量滴定プレートウェル中に付着させた。10分にわたってインキュベートした後に、ストリップ(テストラインに固定化されている第2の抗SEBモノクローナル抗体と一緒に)を、ウェルに垂直に入れた。2つのストリップを、エンテロトキシンBの各濃度について調製した。溶液がストリップ上を完全に移動した後に、サンプルパッドおよび吸収パッドを、濃度の各々のストリップのうちの1つから取り除き、ストリップを、45分にわたって40℃にて乾燥した。
a)ストリップテストにおけるリポソームの使用
スルホローダミンおよび抗SEBモノクローナル抗体を含むリポソームを、実施例2のパラグラフb−1)で前に記載されているように調製した。続いて、これらのリポソームを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.015M NaCl+0.01% NaN3中で1/500まで希釈した。2濃度(5および0ng/ml)のエンテロトキシンB(Sigma Aldrich)を、0.1Mリン酸カリウム緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl+0.1% BSA+0.5% Tween(登録商標)20+0.01% NaN3中で調製した。SEBの各濃度100μlを、リポソーム10μlと一緒に微量滴定プレートウェル中に付着させた。10分にわたってインキュベートした後に、ストリップ(テストラインに固定化されている第2の抗SEBモノクローナル抗体と一緒に)を、ウェルに垂直に入れた。2つのストリップを、エンテロトキシンBの各濃度について調製した。溶液がストリップ上を完全に移動した後に、サンプルパッドおよび吸収パッドを、濃度の各々のストリップのうちの1つから取り除き、ストリップを、45分にわたって40℃にて乾燥した。
濃度の各々の他のストリップについては、パッドを取り除かず、ストリップを、45分にわたって40℃にてオーブン中で乾燥させた。ストリップのための乾燥時間は、膜単独を乾燥するより(約5分)もパッドを乾燥するのにかなり時間がかかることから、前よりも長かった。
次いで、蛍光を、実施例2)c)で上記に前に示されているのと同じ条件下で読み取った。
結果を添付の図13に示すが、左側の2つのストリップについて得られた結果(図13A)は、パッドが乾燥ステップの前に取り除かれなかったストリップについて得られたものであり、一方、右側の2つのストリップについて得られた結果(図13B)は、パッドが乾燥ステップの前に取り除かれたストリップについて得られたものである。
これらの結果は、リポソーム溶解が、たとえリポソームの外側に存在する液体媒体が完全に除去されなくても起こる場合に、ストリップ上にシグナルの制御されない拡散が存在することを示している。この現象は、不均一な乾燥に起因する。このことは、ストリップがパッドよりも素早く乾燥し、それによって、リポソームの溶解およびパッドから生じる液体の移動を引き起こし、ストリップ上で遊離フルオロフォアの制御されない拡散を引き起こすことが原因である。
b)微量滴定プレートにおけるリポソームの使用
この試験を行うために、ウェルが、黒い壁であるが透明な底を有するポリスチレン微量滴定プレート(Costar)を使用した。これらのプレートのポリスチレンは、高いタンパク質吸着能力を有する。0.05Mリン酸塩緩衝液、pH7.4中1mg/mlの濃度のNeutrAvidin(登録商標)(Pierce社、USAにより販売されているアビジン類似体)の溶液1μlを、ウェルの底に付着させた。湿性チャンバー内で20℃にて16時間にわたってインキュベートした後に、NeutrAvidin(登録商標)溶液を除去し、プレートを、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.01% Tween(登録商標)20(洗浄用緩衝液)で洗浄した。
この試験を行うために、ウェルが、黒い壁であるが透明な底を有するポリスチレン微量滴定プレート(Costar)を使用した。これらのプレートのポリスチレンは、高いタンパク質吸着能力を有する。0.05Mリン酸塩緩衝液、pH7.4中1mg/mlの濃度のNeutrAvidin(登録商標)(Pierce社、USAにより販売されているアビジン類似体)の溶液1μlを、ウェルの底に付着させた。湿性チャンバー内で20℃にて16時間にわたってインキュベートした後に、NeutrAvidin(登録商標)溶液を除去し、プレートを、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.01% Tween(登録商標)20(洗浄用緩衝液)で洗浄した。
プレート上の吸着部位を、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.1%ウシアルブミン+0.15M NaCl+0.01% NaN3の溶液(希釈緩衝液)300μlをウェル中に付着させることにより飽和させた。洗浄用緩衝液でプレートを洗浄した後に、1μg/mlのビオチニル化した第1の抗エンテロトキシンB抗体40μlを、20℃にて30分にわたってウェル中に付着させた。並行して、希釈緩衝液中のある範囲のエンテロトキシンB(10;5;2.5;1.25;0.6;0.3および0ng/ml)を、スルホローダミンB(上記の実施例2のステップb−1)で調製したような)を含有し、0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl中で1:500まで希釈したリポソームと混ぜ(v/v)、これに、第2の抗エンテロトキシンB(SEB)抗体を、実施例2、ステップb−1−2)およびb−1−3)で上記に記載されているようにカップリングさせた。20℃にて30分にわたってインキュベートし、洗浄用緩衝液でプレートを洗浄した後に、これらの溶液40μlを、20℃にて30分にわたってウェル中に付着させた。各濃度を、3つの別々のウェル中に付着させた。続いて、プレートを洗浄し、同じ濃度に対応する3つのウェルを、別々に処理した:
i)1つのウェルは、空のままにしておいた(本発明の方法による、免疫リポソームの外側の液体媒体の非存在下での続く乾燥によるリポソーム溶解のため)、
ii)0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl 40μlを、第2のウェルに、100℃にて添加した(熱ショックによるリポソーム溶解を行い、次いで、緩衝液の存在下でそれらを乾燥するため:本発明の1部ではない比較方法)、
iii)第3のウェルは、その中に0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl 40μlを付着させた後に、10秒にわたって超音波を受けた(緩衝液の存在下で乾燥ステップの前に超音波の作用によるリポソーム溶解を行うため:本発明の1部ではない比較方法)。
i)1つのウェルは、空のままにしておいた(本発明の方法による、免疫リポソームの外側の液体媒体の非存在下での続く乾燥によるリポソーム溶解のため)、
ii)0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl 40μlを、第2のウェルに、100℃にて添加した(熱ショックによるリポソーム溶解を行い、次いで、緩衝液の存在下でそれらを乾燥するため:本発明の1部ではない比較方法)、
iii)第3のウェルは、その中に0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4、+0.15M NaCl 40μlを付着させた後に、10秒にわたって超音波を受けた(緩衝液の存在下で乾燥ステップの前に超音波の作用によるリポソーム溶解を行うため:本発明の1部ではない比較方法)。
次いで、すべてのウェルを、オーブン中で40℃にて3時間にわたって乾燥した。緩衝液40μlを含有するウェルを完全に乾燥するためには、以前(実施例5)よりも長い乾燥時間が必要である。各ウェルの蛍光を、pco.1600カメラ(Photon Line社により販売されている)に連結されている倒立顕微鏡(Olympus IX71)を使用して5秒にわたって測定した。
結果を添付の図14に示す。
この図において、
− 左側のウェルのカラムは、本発明の方法により、免疫リポソームの外側に存在する液体媒体の除去後に乾燥ステップを受けたウェルに対応し(i)、
− ウェルの中央のカラムは、液体媒体中の熱ショックによるリポソーム溶解後に乾燥されたウェルに対応し(ii)、
− 右側のウェルのカラムは、液体媒体中の超音波処理によるリポソーム溶解後に乾燥されたウェルに対応している(iii)。
− 左側のウェルのカラムは、本発明の方法により、免疫リポソームの外側に存在する液体媒体の除去後に乾燥ステップを受けたウェルに対応し(i)、
− ウェルの中央のカラムは、液体媒体中の熱ショックによるリポソーム溶解後に乾燥されたウェルに対応し(ii)、
− 右側のウェルのカラムは、液体媒体中の超音波処理によるリポソーム溶解後に乾燥されたウェルに対応している(iii)。
得られた結果は、リポソーム溶解が、それ自体で局在的な蛍光シグナルを得るには十分でないことを示している。実際に、液体媒体中の熱ショックまたは超音波によるリポソーム溶解が、蛍光シグナルの大きな減少または完全な消失さえも引き起こし、一方、液体媒体の非存在下でリポソームを乾燥することは、きわめて局在的な蛍光シグナルを得ることを可能にすることが図14で観察される。
結論として、蛍光シグナルを明らかにするステップは、リポソーム溶解を液体のない環境、すなわち、フルオロフォアの拡散を許さない環境で行うために、リポソーム溶解に使用される処理とは関係なく、使用される固体支持体に適しているプロトコルおよび処理に従って行われるべきである。
Claims (15)
- 蛍光分子を封入しているリポソームにより、固体支持体上で、生物学的サンプル中の少なくとも1つの分析物Aを検出および定量化するための方法であって、
1)(a)i)少なくとも1つの分析物Aを含むことができる前記生物学的サンプルを、液体媒体中で、蛍光分子を封入している少なくとも1つのリポソームおよび前記分析物Aと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させ、次いで、ii)前記媒体を、形成される可能性がある分析物A/リポソーム複合体と結合することができる少なくとも1つの固定化基質を含有する固体支持体と接触させるか、
b)固体支持体上に予め固定化されている前記生物学的サンプル(前記サンプルは、少なくとも1つの分析物Aを含むことができる)を、前記蛍光分子を封入しているリポソームを含む液体媒体および前記分析物Aと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させるかのどちらかのステップと、
2)前記固体支持体を乾燥することによりリポソームの外側に存在する液体媒体を除去するステップと、
3)リポソームを溶解するステップと、
4)発せられる可能性のある蛍光シグナルを検出するステップとを含むことを特徴とする方法。 - 前記ステップ1)(a)(ii)が、
キャピラリー作用による前記固体支持体上の前記媒体の移動か、
前記固体支持体上への前記媒体の付着のどちらかにより行われることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 前記ステップ1)(b)が、以下のサブステップ、すなわち、
i)電気泳動により前記生物学的サンプルから少なくとも1つの分析物Aを分離し、電子移動により固体支持体上に前記分析物Aを固定化するサブステップと、
ii)前記分析物Aが固定化されている前記固体支持体を、蛍光分子を封入している少なくとも1つのリポソームを含む液体媒体および前記分析物Aと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させるサブステップとを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - ステップ1)と2)の間に、複合体形成していないリポソームを除去するために固体支持体を洗浄する少なくとも1つのステップも含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 支持体が、ニトロセルロース膜、微量滴定プレートおよびバイオチップから選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- リポソームにカップリングされており、分析物Aと複合体形成することができる分子が、前記分析物と複合体形成することができる一次および二次抗体、前記分析物の受容体、ポリ核酸、ペプチド核酸、レクチン、および前記分析物のための担体タンパク質またはキレートまたは合成受容体から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光分子が、フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形態であるローダミンの水溶性誘導体、クマリンおよびそれらの誘導体、蛍光シアニン、スルホローダミン誘導体および緑色蛍光タンパク質から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光分子が、スルホローダミンおよび蛍光シアニンから選択されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 乾燥ステップ2)が、20〜90℃の温度にて行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 乾燥ステップ2)の時間が、1〜60分の範囲であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ3)におけるリポソームの溶解が、支持体の追加乾燥により行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 追加乾燥の時間が、1〜15分の範囲であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- ステップ3)における支持体の乾燥が、20〜90℃の温度にて、オーブン中で行われることを特徴とする、請求項11または12に記載の方法。
- ステップ4)の蛍光シグナルの検出が、少なくとも1分にわたって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- バイオチップを読み取る際の、請求項1、2および4〜14のいずれか一項に記載の方法の使用。
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