FR2918755A1 - Procede de detection et de quantification d'analytes sur support solide avec des molecules fluorescentes encapsulees dans des immunoliposomes. - Google Patents

Abstract

La présente Invention est relative à un procédé amélioré de détection et de quantification d'analytes sur support solide, avec des molécules fluorescentes encapsulées dans des immunoliposomes.

Description

La présente Invention est relative à un procédé amélioré de détection et

de quantification d'analytes sur support solide, avec des molécules fluorescentes encapsulées dans des immunoliposomes. Les immunoliposomes sont des structures particulières constituées d'une vésicule formée par une bicouche lipidique et de molécules, telles que par exemple des anticorps, capables de complexer un analyte A, qui sont couplées sur la face externe de cette vésicule par liaison covalente. Dans le cadre des dosages immunologiques, ces structures sont utilisées comme marqueurs colorimétriques ou fluorescents après encapsulation d'une molécule colorée qui est le plus souvent fluorescente, en particulier de la sulforhodamine. Ce type de structure permet d'avoir un marqueur à haute activité spécifique dans la mesure où il y a plusieurs milliers voire millions de molécules colorées incluses par immunoliposomes. Ces structures sont utilisées dans plusieurs formats de dosages : plaque de microtitration, capillaire et immunochromatographie ( bandelette ). La détection d'analytes en plaque de microtitration ou capillaire utilise le plus souvent la propriété fluorescente de la molécule. Cependant, la concentration de la molécule dans les immunoliposomes est telle qu'il y a un phénomène d'auto-inhibition de la fluorescence. Pour faire apparaître la fluorescence, il faut donc diluer la molécule dans le milieu en détruisant les immunoliposomes à l'aide de détergent (SINGH et al., Anal. Chem., 72: 6019-6024, 2000 ; DECORY et al., Appl. Environ. Microbiol., 71(4) : 1856- 1864, 2005 ; HO et al., Anal. Biochem., 330 : 342-349, 2004). La détection d'analytes par immunochromatographie (ou le format bandelette) est une technique utilisée dans le diagnostic médical et de nouveaux domaines d'application comme par exemple la détection de polluants dans l'environnement. Dans ce format, seule la densité de la coloration de la molécule encapsulée dans les immunoliposomes est utilisée (US 4,703,017 ; HO et HSU, Anal. Chem., 75 : 4330-4334, 2003 ; PARK et DURST, Anal. Biochem., 280: 151-158, 2000 ; AIN-YOON et al., Anal. Bioanal. Chem., 378: 68-75, 2004 ; AHN-YOON et al., Anal. Chem., 75 : 2256-2261, 2003). En effet, après migration de l'échantillon sur la bandelette, les immunoliposomes ne peuvent pas être disloqués en utilisant des détergents, car une telle action aurait pour conséquence de diluer le signal sur l'ensemble de la bandelette par capillarité. Aussi lorsque des molécules sont parfois utilisées pour leurs propriétés fluorescentes dans le format bandelette, il s'agit de fluorophores soit liés directement à l'anticorps par couplage covalent (KIM et al., Environ. Sci. Technol., 37 : 1899-1904, 2003) soit liés à l'anticorps via un polymère tel que des polysaccharides (US 5,543,332).

Les avantages du format bandelette, une rapidité d'obtention du résultat et une facilité d'utilisation, font qu'il est parfaitement adapté pour des applications home test ou sur le terrain. Cependant, sa faible sensibilité par rapport à d'autres techniques comme les dosages immunologiques sur microplaques ou la spectrométrie de masse, limite son utilisation.

Aussi depuis quelques années, de nouveaux marqueurs permettant l'obtention d'un signal colorimétrique ou fluorescent ont été développés, afin d'améliorer la sensibilité de détection. Or, à ce jour, il n'existe pas de procédé de détection d'analytes sur support solide utilisant les propriétés fluorescentes de molécules encapsulées dans des immunoliposomes et permettant d'obtenir une sensibilité de détection au moins équivalente à celle des autres procédés de détection effectués sur les supports solides connus de l'état de la technique (colorimétrie, luminescence révélée ou non par film photographique, etc...). Aussi, les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à un nouveau procédé amélioré de détection d'analytes sur support solide qui permet d'exploiter les 2 0 propriétés fluorescentes de molécules encapsulées dans des immunoliposomes. Ce procédé repose sur l'utilisation d'immunoliposomes contenant des fluorophores comme traceurs fluorescents lors de tests sur phase solide, telle qu'une membrane ou une plaque de microtitration après le séchage de cette dernière. En général, la concentration élevée des fluorophores dans les immunoliposomes induit un phénomène 25 d'auto-inhibition de la fluorescence et donc un signal fluorescent faible. En revanche, le séchage des phases solides va provoquer la lyse des immunoliposomes sans ajout d'un détergent liquide, d'où une diffusion contrôlée de leur contenu en fluorophore sur le support solide, et donc une diminution voire une disparition du phénomène d'auto-inhibition ; ce qui va se traduire par une forte augmentation de la fluorescence.

La présente Invention a donc pour objet un procédé de détection sur support solide d'au moins un analyte A dans un échantillon biologique, avec des immunoliposomes encapsulant des molécules fluorescentes, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 1) soit (a) (i) la mise en contact en milieu liquide dudit échantillon biologique susceptible de comprendre au moins un analyte A avec au moins un immunoliposome encapsulant une molécule fluorescente et dont la surface est couplée à des molécules capables de complexer ledit analyte A, puis (ii) la mise en contact dudit milieu sur un support solide contenant au moins un substrat immobilisé capable de lier les complexes analyte A / immunoliposomes éventuellement formés, soit (b) la mise en contact dudit échantillon biologique préalablement immobilisé sur un support solide, ledit échantillon étant susceptible de comprendre au moins un analyte A, avec un milieu liquide comprenant ledit immunoliposome encapsulant une molécule fluorescente et dont la surface est couplée à des molécules capables de complexer ledit analyte A ; 2) le séchage dudit support solide ; et 3) la détection des signaux de fluorescence éventuellement émis. Selon l'étape 2) du procédé conforme à l'Invention, le séchage du support va provoquer la lyse des immunoliposomes sans nécessiter l'ajout d'un détergent 2 0 liquide, et donc la libération de leur contenu en fluorophores mais sans diffusion sur l'ensemble du support solide. Ce procédé permet ainsi d'augmenter le signal obtenu et donc la sensibilité des tests immunologiques (voie 1) (a)), en particulier immunochromatographiques, tout en restant simple et rapide d'utilisation. Dans le cadre 25 de l'immunoempreinte (voie 1) (b)), ce procédé permet d'obtenir une meilleure définition des bandes et une sensibilité au moins équivalente à celle obtenue avec la peroxidase qui est le marqueur de référence. Ce procédé permet en outre d'analyser simultanément plusieurs analytes en utilisant différentes populations d' immunoliposomes chaque population étant constituée d'immunoliposomes dont la surface est couplée avec des 30 molécules capables de complexer un analyte A particulier et qui fluorescent à une longueur d'onde particulière en fonction de la nature de la molécule fluorescente qu'ils encapsulent. En outre, dans ces deux applications, l'étape de séchage du support solide va permettre une conservation aisée des résultats qu'il contient. Selon un autre mode de réalisation particulier de la présente Invention, ladite étape 1) (a) (ii) est mise en oeuvre : - soit par migration par capillarité dudit milieu sur ledit support solide ; - soit par dépôt dudit milieu sur ledit support solide. Selon encore un autre mode de réalisation particulier de la présente Invention, ladite étape 1) (b) comprend les sous-étapes suivantes : i) la séparation d'au moins un analyte A dudit échantillon biologique par électrophorèse, et l'immobilisation dudit analyte A sur un support solide par électrotransfert ; ii) la mise en contact dudit support solide sur lequel est immobilisé ledit analyte A avec un milieu liquide comprenant au moins un immunoliposome encapsulant une molécule fluorescente et dont la surface est couplée à des molécules capables de complexer ledit analyte A. Selon un mode de réalisation particulier de la présente Invention, ledit procédé de détection peut comprendre en outre, entre les étapes 1) et 2), au moins une étape de lavage du support solide afin d'éliminer les immunoliposomes non complexés.

Selon l'Invention, le support solide est de préférence choisi parmi les membranes en nitrocellulose, les plaques de microtitration, de préférence en polystyrène et les biopuces. Selon l'Invention, les molécules couplées aux immunoliposomes et capables de complexer un analyte A sont de préférence choisies parmi les anticorps primaires et secondaires capables de complexer ledit analyte, un récepteur dudit analyte, les acides polynucléiques (ADN ou ARN), les acides peptidonucléiques, la lectine, une protéine transporteuse ou molécule chimique (chélate, récepteur synthétique) dudit analyte. Ces immunoliposomes peuvent fluorescer à différentes longueur d'onde en fonction de la nature des molécules fluorescentes qu'ils encapsulent.

Selon l'Invention, les molécules fluorescentes encapsulées dans les immunoliposomes sont de préférence choisies parmi les fluorophores suivants : la phycoérythrine, la phycocyanine, la fluorescéine et ses dérivés tels que la fluorescéine isothiocyanate (FITC), la rhodamine et ses dérivés tels que la sulforhodamine et la tetraméthyl rhodamine isothiocyanate (TRITC), les dérivés hydrosolubles de la rhodamine se présentant sous la forme d'ester de N-hydroxysuccinimide tels que les produits vendus sous la dénomination commerciale Alexa Fluor (D par la société Invitrogen comme par exemple les Alexa Fluor 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610-X, 633, 647, 660, 680, 700, 750 et 790, les coumarines et leurs dérivés tels que la 7- amino-coumarine, les cyanines fluorescentes telles que celles commercialisées sous les références Cy3, Cy3.5, Cy3B, Cy5, Cy5.5 et Cy7 par la société GE Healthcare, les dérivés de sulforhodamine tels que le chlorure/sulfonyl de sulforhodamine 101 également connu sous le nom Texas Red , les colorants vendus sous les dénominations commerciales Fluoroprobes , et la protéine fluorescente verte (souvent abrégée GFP, de l'anglais "Green Fluorescent Protein"), etc.... Selon l'Invention, la sulforhodamine et les cyanines fluorescentes telles que le Cy5 sont particulièrement préférés. Selon l'Invention, l'étape 2) de séchage du support solide est effectuée à une température allant de 20 à 90 C environ, de préférence à une température d'environ 40 C. Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, l'étape 2) de séchage est réalisé dans une étuve à une température de 20 à 90 C environ, de préférence à une température d'environ 40 C. Selon l'Invention, la durée de séchage peut varier de 1 à 60 minutes environ, de préférence la durée du séchage est d'environ 5 minutes. Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'Invention, le séchage est réalisé dans une étuve, à une température d'environ 40 C, pendant une durée d'environ 5 minutes. Selon l'Invention, le(s) substrat(s) immobilisé(s) sur le support solide est(sont) choisis(s) de préférence parmi ledit analyte A à doser ou un analogue ou un 25 fragment de celui-ci, des anticorps anti-analyte A, et des anticorps anti-immunoglobuline par exemple de souris, d'homme, de rat, de chèvre, etc.... La détection de l'analyte A est effectuée par la lecture des signaux de fluorescence éventuellement émis par les immunoliposomes sur le support solide. Plus la durée de la lecture de la fluorescence émise est prolongée, plus les signaux fluorescents augmentent ; ce qui permet d'augmenter la limite de détection. Ainsi, il est possible de moduler le temps de lecture en fonction des résultats obtenus et des limites de détection souhaitées. Selon une forme de réalisation préférée du procédé conforme à l'Invention, la détection des signaux de fluorescence de l'étape 3) est effectuée pendant une durée d'au moins 1 minute, encore plus préférentiellement pendant une durée allant de 1 à 5 minutes. Par exemple, lorsque la sulforhodamine est utilisée comme fluorophore, le temps de lecture à 600 nm peut varier de 1 à 5 minutes environ. Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à des exemples non-limitatifs mettant en évidence l'effet du séchage sur l'augmentation de la fluorescence des molécules encapsulées dans des immunoliposomes lors de tests immunologiques sur support solide ainsi qu'aux figures 1 à 12 annexées dans lesquelles : - la figure 1 montre l'effet du séchage sur la fluorescence des 20 immunoliposomes ; la figure 2 schématise un test bandelette en format immunométrique ; - la figure 3 montre l'effet du séchage sur la fluorescence des immunoliposomes lors d'un test bandelette en format immunométrique ; - la figure 4 montre les limites de détection obtenues avec des 25 immunoliposomes en mesure colorimétrique ou fluorescente lors d'un test bandelette en format immunométrique ; - la figure 5 montre la quantification du signal fluorescent obtenu avec des immunoliposomes lors d'un test bandelette en format immunométrique ; - la figure 6 schématise un test bandelette en format compétitif ; - la figure 7 montre l'effet du séchage sur la fluorescence des immunoliposomes lors d'un test bandelette en format compétitif ; - la figure 8 montre l'effet du séchage sur la fluorescence des immunoliposomes lors d'un test en immunoempreinte ; - la figure 9 montre les limites de détection obtenues avec des immunoliposomes en mesure luminescente (révélée ou non par film photographique) ou fluorescente lors d'un test en immunoempreinte. - les figures 10 et 1 l montrent l'effet du séchage sur la fluorescence des immunoliposomes lors d'un test dans une plaque de microtitration en polystyrène. - la figure 12 montre la quantification du signal fluorescent obtenu avec des immunoliposomes lors d'un test dans une plaque de microtitration en polystyrène. Il doit être entendu toutefois que ces exemples ne sont donnés qu'à titre purement illustratif de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une quelconque limitation.

EXEMPLE 1 : MISE EN EVIDENCE DE L'EFFET DU SECHAGE SUR LA FLUORESCENCE DES LIPOSOMES a) Préparation des liposomes contenant un fluorophore a-1) Préparation des liposomes contenant un fluorophore Des liposomes ont été préparés à partir d'un mélange de lipides constitué de dipalmitoyl-sn-3-glycéro-phosphocholine (DPPC), cholestérol (Chol.), dipalmitoyl-sn-3-glycéro-phosphoglycérol (DPPG), et dipalmitoyl-sn-3-glycero- phosphoéthanolamine (DPPE) avec un ratio molaire de 5:5:0,5:0,25. Un total de 100 moles de ce mélange de lipides a été dissous dans 10 ml d'un mélange de solvants constitué de chloroforme, d'isopropyl d'éther, et de méthanol à un ratio molaire de 6:6:1. Après sonication de cette solution à 60 C sous azote, 1,5 ml de fluorophore (sulforhodamine ou Cy5 ) à 150 mM ont été ajoutés dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,4. Après sonication pendant 6 minutes à 60 C sous azote, les solvants organiques ont été évaporés sous vide à 45 C en utilisant un évaporateur rotatif. Un gel correspondant à la suspension de liposomes a ainsi été obtenu.

Après avoir ajouté à cette solution 3 ml de fluorophore à 150 mM (sulforhodamine ou Cy5 ) dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,4, une sonication a été effectuée pendant 5 minutes à 60 C sous azote. a-2) Extrusion des liposomes Afin d'obtenir une solution de liposomes de taille uniforme (0,4 m), la solution de liposomes a été incubée à 60 C dans un bain-marie et extrudée à travers des membranes de polycarbonate dont la taille des pores décroît (3 passages à travers des filtres de 1,2 gm puis 3 passages à travers des filtres de 0,4 m). La solution de liposomes ainsi obtenue a été centrifugée à 45 000 t/min. pendant 30 minutes à 45 C. Le culot contenant les liposomes a été repris dans du tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7, puis la sulforhodamine libre (non-encapsulée) a été éliminée en réalisant une chromatographie d'exclusion sur gel Sephadex G25. A l'issue de cette chromatographie, la solution de liposomes a été centrifugée à 45 000 t/min. pendant 30 minutes à 4 C. Le culot ainsi obtenu a été repris dans 4 ml de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7, et stocké à 4 C à l'obscurité. b) Mise en évidence de l'effet du séchage sur la fluorescence des liposomes Les liposomes avec soit la sulforhodamine soit du Cy5 comme fluorophore ont été dilués dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,4 + NaCl 0,15 M + BSA 0,1% + 0,5% Tween 20 + 0,01% NaN3, au 1/50ème, 1/500ème et au 1/5 000ème 5 l de chacune des dilutions ont été déposés sur une membrane collée sur un support cartonné, puis la fluorescence a été mesurée pendant 1 minute à l'aide de l'Image Station 4000 MM (Kodak Molecular Imaging Systems, USA) avec un filtre d'excitation à 535 nm et 625 nm pour la sulforhodamine et Cy5 , respectivement, et un filtre d'émission à 600 nm et 670 nm pour la sulforhodamine et Cy5 , respectivement.

Les bandelettes ont été séchées pendant 5 minutes dans une étuve à 40 C et la fluorescence a été de nouveau mesurée. Les résultats sont représentés sur la Figure 1 annexée. Légende de la Figure 1 : A = sulforhodamine B = Cy5 Comme cela est observé sur la figure 1, le séchage augmente fortement la fluorescence. EXEMPLE 2 : UTILISATION DES IMMUNOLIPOSOMES DANS UN TEST BANDELETTE EN FORMAT IMMUNOMETRIQUE a) Principe du dosage immunométrique La figure 2 schématise le principe d'un dosage dit immunométrique, pour lequel une ligne test est constituée d'anticorps anti-analyte immobilisés et une ligne contrôle est constituée d'anticorps anti-immunoglobuline de souris immobilisés. Si l'analyte recherché est présent dans l'échantillon, il va se complexer dans un premier temps aux immunoliposomes via des anticorps anti-analyte de souris fixés sur la face externe desdits immunoliposomes, puis dans un deuxième temps, au cours de la migration sur la bandelette, il va se lier aux autres anticorps anti-analyte immobilisés sur la ligne test. La présence de l'analyte recherché dans l'échantillon va donc se traduire par l'apparition d'un signal au niveau de la ligne test mais également au niveau de la ligne contrôle du fait de la liaison des anticorps anti-analyte de souris fixés sur la face externe des immunoliposomes non complexés aux anticorps anti-immunoglobuline de souris immobilisés. Au contraire l'absence d'analyte dans l'échantillon va se traduire par l'absence de signal au niveau de la ligne test. b) Préparation du test bandelette en format immunométrique b-1) Préparation des immunoliposomes b-1-1) Dérivation des liposomes avec le succinimidyl acétyl- thiopropionate (SATP) 17 l d'une solution de SATP à 10 mg/ml dans du diméthyl formamide (DMF) ont été ajoutés à 300 l d'une solution de liposomes avec la sulforhodamine préparée comme précédemment décrit à l'exemple 1. Après une incubation d'une heure à 20 C, la réaction a été stoppée en ajoutant 100 l de tampon tris/HCL 1 M pH 7. Après 15 minutes, le SATP n'ayant pas réagi a été éliminé par chromatographie d'exclusion avec un gel Sephadex G25 en utilisant du tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7 + NaCl 0,15 M. Les fractions correspondant aux liposomes ont été mélangées et centrifugées à 45 000 t/min. pendant 30 minutes à 4 C. Le culot obtenu a été repris dans 225 gl de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7,4 + NaCl 0,15 M, et les groupements thiols du SATP ont été déprotégés en ajoutant 25 l d'hydroxylamine 1 M pH 7. b-1-2) Modification des anticorps de souris avec du N-succinimidyl4- (maléimidométhyl) cyclohexanecarboxylate (SMCC) Une solution de SMCC à 1 mg/ml dans du DMF a été ajoutée à une solution d'anticorps monoclonaux murins anti-entérotoxine B (SEB) de Staphylococcus aureus en tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,4 avec un ratio molaire de 20:1. Après une incubation d'une heure à 20 C, la réaction a été stoppée en ajoutant du Tris 1 M pH 7 pendant 15 minutes. L'anticorps ainsi dérivé a été purifié par chromatographie d'exclusion sur gel Sephadex G25 avec du tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7,4 + NaCl 0,15 M, les fractions contenant l'anticorps-SMCC ont été déterminées en mesurant l'absorbance à 280 nm. b-1-3) Couplage des liposomes avec les anticorps Le couplage des liposomes avec les anticorps a été effectué en incubant 500 g d'anticorps-SMCC avec les liposomes-SATP déprotégés (250 l) pendant une nuit à 4 C. Les anticorps non couplés ont été séparés des immunoliposomes par chromatographie d'exclusion avec du gel Sepharose CL-4B (Sigma-Aldrich) en utilisant du tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7,4 + NaCl 0,15 M. Les fractions correspondant aux immunoliposomes ont été collectées et centrifugées à 45 000 t/min. pendant 30 minutes à 4 C. Le culot obtenu a été repris dans 500 l de phosphate de sodium 0,1 M pH 7,4 + NaCl 0,15 M + 0,01% NaN3, et stocké à 4 C à l'obscurité. b-2) Préparation des bandelettes Les bandelettes utilisées pour réaliser les tests immunochromatographiques sont constituées de trois composants (tampon de dépôt de l'échantillon, membrane de nitrocellulose, et tampon d'absorption) collés sur un support cartonné. La zone de détection au niveau de la membrane de nitrocellulose, a été constituée de deux lignes de réactifs : une ligne contrôle correspondant au dépôt d'un anticorps anti-immunoglobuline de souris à 500 gg/ml dans du tampon phosphate de sodium 10 mM pH 7,4 + NaCl 0,15 M à 1 gl/cm en utilisant un distributeur automatique (BioDot AirJet 3050, Irvine CA), et une ligne test correspondant au dépôt d'un anticorps anti-entérotoxine B (SEB) de Staphylococcus aureus à 1 mg/ml dans du tampon phosphate de sodium 10 mM pH 7,4 + NaCl 0,15 M à 1 gl/cm. Les membranes ont été séchées 1 heure à 40 C dans une étuve, puis elles ont été saturées avec du tampon phosphate de sodium 10 mM pH 7,4 + NaCl 0,15 M + 0,5% d'albumine bovine (BSA) pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation. Les membranes ont ensuite été lavées deux fois avec de l'eau ultra pure pendant 5 minutes à température ambiante sous agitation, puis incubées avec du tampon phosphate de sodium 10 mM pH 7,4 + NaCl 0,15 M + 0,15% Tween 20 pendant 15 minutes à température ambiante sous agitation. Les membranes ont été séchées pendant 15 minutes à 40 C dans une étuve, puis le tampon de dépôt de l'échantillon a été collé en bas de la membrane et le tampon d'absorption en haut de la membrane. Enfin les bandelettes ont été obtenues en coupant les membranes ainsi préparées à une largeur de 5 mm à l'aide d'une guillotine programmable (Guillotine Cutting CM 4000, BioDot Irvine CA). c) Mise en évidence de l'effet du séchage sur la fluorescence lors d'un test bandelette en format immunométriQue Les immunoliposomes avec la sulforhodamine et les anticorps monoclonaux anti-SEB précédemment obtenus au paragraphe b-1) ont été dilués au 1 /500ème dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,4 + NaCl 0,15 M + 0,01% NaN3. Une gamme de concentration en SEB (Sigma-Aldrich) (10 ; 5 ; 2,5 ; 1,25 ; 0,6 ; 0,3 ; 0,15 ; 0,08 ; 0,04 ; 0,02 et 0 ng/ml) a été préparée dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,4 + NaCI 0,15 M + 0,1% BSA + 0,5% Tween 20 + 0,01% NaN3. 100 gl de chacune des concentrations de SEB avec 10 l d'immunoliposomes ont été déposés dans des puits de plaque de microtitration. Après une incubation de 10 minutes, sous agitation à température ambiante et à l'obscurité, une bandelette préparée comme décrit au paragraphe b-1) (avec un deuxième anticorps monoclonal anti-SEB immobilisé au niveau de la ligne test) a été déposée dans les puits verticalement (tampon de dépôt de l'échantillon au contact de la solution) et la migration s'est effectuée par capillarité. Après que la solution ait complètement migré sur les bandelettes, celles-ci ont été retirées des puits.

La fluorescence a été mesurée pendant une minute à l'aide de l'Image Station 4000 MM (Kodak Molecular Imaging Systems, USA) avec un filtre d'excitation à 535 nm et un filtre d'émission à 600 nm. Les bandelettes ont ensuite été séchées (5 minutes dans une étuve à 40 C) et la fluorescence a été mesurée dans les mêmes conditions que précédemment. Les résultats sont présentés dans la figure 3. Les résultats montrent que le séchage permet d'obtenir un signal fluorescent au niveau des lignes test et contrôle. D'autre part le signal au niveau de la ligne test augmente avec la concentration en SEB, ce qui est en accord avec le principe du format immunométrique. Cette expérience démontre que le séchage est indispensable pour l'utilisation des immunoliposomes comme marqueurs fluorescents lors des tests bandelette. d) Comparaison des limites de détection obtenues avec des immunoliposomes en 15 mesure colorimétrique ou fluorescente en format immunométrique Des immunoliposomes avec la sulforhodamine comme fluorophore et des anticorps monoclonaux anti-SEB ont été préparés comme précédemment décrit dans le paragraphe b-1), puis dilués au 1/50ème dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,4 + NaCl 0,15 M -F 0,01% NaN3. Une gamme de concentration en SEB (Sigma- 2 0 Aldrich) a également été préparée comme précédemment décrit dans le paragraphe c). La mise en contact des immunoliposomes avec les différentes concentrations en SEB, puis la migration capillaire ont été réalisées comme précédemment décrit dans le paragraphe c). Après que la solution ait complètement migré sur les bandelettes, celles- 2 5 ci ont été séchées (5 minutes dans une étuve à 40 C), et la fluorescence a été mesurée comme précédemment décrit dans le paragraphe c), puis ces mêmes bandelettes ont été scannées avec un scanner Epson Expression 1640XL pour mesurer le signal colorimétrique. Les résultas sont présentés dans la Figure 4.

Les résultats montrent que la limite de détection obtenue avec le signal fluorescent est d'environ 20 pg/ml alors qu'elle est d'environ 300 pg/ml avec le signal colorimétrique. L'utilisation du signal fluorescent grâce au procédé de séchage permet 5 donc d'augmenter la limite de détection d'un facteur 15 en utilisant les mêmes réactifs dans les mêmes conditions. e) Exemple de quantification du signal fluorescent dans un test bandelette en format immunométrique Des immunoliposomes avec la sulforhodamine comme fluorophore et 10 des anticorps monoclonaux anti-SEB ont été préparés, puis dilués au 1/500ème comme précédemment décrit dans le paragraphe c). Une gamme de concentration en SEB (Sigma-Aldrich) a également été préparée comme précédemment décrit dans le paragraphe c). La mise en contact des immunoliposomes avec les différentes 15 concentrations en SEB, puis la migration capillaire ont été réalisées comme précédemment décrit dans le paragraphe c). Après que la solution ait complètement migré sur les bandelettes, la fluorescence a été mesurée pendant une minute comme précédemment décrit dans le paragraphe c). Les bandelettes ont ensuite été séchées (5 minutes dans une étuve à 40 C) 2 0 et la fluorescence a été mesurée pendant 1 minute et 5 minutes comme précédemment décrit dans le paragraphe c). Pour quantifier le signal fluorescent correspondant à chaque concentration, il a été soustrait au signal fluorescent de la ligne test, le signal fluorescent d'une zone de même dimensions située entre la ligne test et la ligne contrôle de la même bandelette. Toutes ces quantifications ont été réalisées en utilisant le logiciel Image J 25 (Rasband, W.S., Image J, U.S. Natinal Institutes of Health, Bethesda, Maryland USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2006). Les résultats sontprésentés dans la Figure 5. Les résultats montrent que la mesure de la fluorescence pendant une plus grande durée permet d'augmenter les signaux de fluorescence, ce qui permet d'augmenter la limite de détection. Ainsi le temps de lecture peut être modulé en fonction des résultats obtenus et des limites de détection souhaitées. EXEMPLE 3: UTILISATION DES IMMUNOLIPOSOMES DANS UN TEST BANDELETTE EN FORMAT COMPETITIF a) Principe du format compétitif La figure 6 schématise le principe d'un dosage dit compétitif pour lequel une ligne test est constituée d'un analyte ou d'un analogue de celui-ci immobilisé et une ligne contrôle est constituée d'anticorps anti-immunoglobuline de souris immobilisés. Si l'analyte recherché est présent dans l'échantillon, il va se lier dans un premier temps aux anticorps anti-analyte de souris fixés sur la face externe des immunoliposomes, et ces derniers ne pourront donc plus se lier à l'analyte ou à son analogue immobilisé au niveau de la ligne test au cours de la migration sur la bandelette car les sites de liaisons seront occupés. La présence de l'analyte recherché dans l'échantillon va donc se traduire par une baisse ou une disparition totale du signal au niveau de la ligne test. Au contraire, l'absence de l'analyte recherché dans l'échantillon va permettre aux immunoliposomes de se lier à l'analyte ou à son analogue immobilisé au niveau de la ligne test, et va donc se traduire par la présence d'un signal au niveau de la ligne test. Dans tous les cas, le signal au niveau de la ligne contrôle reste maximal et inchangé du fait de la liaison des immunoliposomes aux anticorps anti-immunoglobuline de souris immobilisés via les 2 0 anticorps anti-analyte de souris fixés sur la face externe des immunoliposomes. b) Préparation du test bandelette b-1) Préparation des immunoliposomes Les immunoliposomes sont préparés comme précédemment décrit dans le paragraphe b-1) de l'exemple 2, sauf qu'une solution d'anticorps monoclonaux murins 25 anti-microcystine LR en tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,4 a été utilisée. b-2) Préparation des bandelettes Les bandelettes utilisées sont préparées comme précédemment décrit dans le paragraphe b-2) de l'exemple 2, sauf que la ligne test correspond au dépôt de microcystine LR couplée à de l'albumine bovine à 5 g/ml dans du tampon phosphate de sodium 10 mM pH 7,4 + NaCl 0,15 M à 1 pl/cm. c) Mise en évidence de l'effet du séchage sur la fluorescence lors d'un test bandelette en format immunométrique Les immunoliposomes avec la sulforhodamine comme fluorophore et des anticorps monoclonaux anti-microcystine LR ainsi obtenus ont été dilués au 1/500ème comme précédemment décrit dans le paragraphe c) de l'exemple 2. Une gamme de concentration en microcystine LR (Sigma-Aldrich) (3 ; 1,5 ; 0,75 ; 0,38 ; 0,19 ; 0,09 et 0 ng/ml) a été préparée dans du tampon phosphate de potassium 0,1 M pH 7,4 + NaCl 0,15 M + 0,1% BSA + 0,5% Tween 20 + 0,01% NaN3. 100 pl de chacune des concentrations de microcystine LR avec 10 pi d'immunoliposomes ont été déposés dans des puits de plaque de microtitration. Après une incubation de 10 minutes, une bandelette (avec de la microcystine couplée à de la BSA immobilisée au niveau de la ligne test) a été déposée dans les puits verticalement. Après que la solution ait complètement migré sur les bandelettes, les bandelettes ont été séchées (5 minutes dans une étuve à 40 C) et la fluorescence a été mesurée pendant une minute dans les mêmes conditions que celles précédemment décrites dans le paragraphe c) de l'exemple 2. Les résultats sont présentés dans la Figure 7. Les résultats obtenus montrent que les immunoliposomes sont utilisables quelque soit le format de détection utilisé. Les signaux fluorescents sont inversement proportionnels à la concentration de microcystine, ce qui est en accord avec le format compétitif. EXEMPLE 4: AUTRE APPLICATION DES IMMUNOLIPOSOMES SUR MEMBRANE : IMMUNOEMPREINTE ("WESTERN BLOT") Des échantillons soit d'extrait de cerveau de souris pour détecter la 30 protéine prion soit d'immunoglobulines de souris purifiées entières ou sous forme de fragment F(ab')2 ont été utilisés. L'extrait de cerveau de souris a été dilué au 1/50ème, 1/100ème, 1/200ème et 1/400ème dans du tampon de Laemmli (Tris/HC1 60 mM pH 6,8 + 0,1% SDS + 10% glycérol + 0,3% bleu de bromophénol) contenant 2,5% de J3- mercaptoéthanol. Les immunoglobulines ont été diluées à 1 gg/ml et 5 g/ml dans du 5 tampon de Laemmli. Les extraits de cerveau ont été déposés (15 l/dilution) sur un gel de polyacrylamide 12%, et les immunoglobulines (15 gl/dilution) sur un gel de polyacrylamide 6%. Les dépôts ont été effectués en double. L'électrophorèse a été réalisée pendant 1 heure sous 200 volts avec un tampon de migration Tris/glycine. 10 L'électrotransfert des molécules présentes dans les gels de polyacrylamide a été réalisé sur une membrane en PolyVinylidine DiFluoride (PVDF) vendue sous la dénomination commerciale Immobilon-FL , Milipore) dans du tampon Tris/CAPS (Biorad) à 100 volts pendant 1 heure. La membrane a été récupérée et rincée par immersion rapide dans du 15 tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7,4 + 0, 15 M NaCl (PBS) puis dans de l'éthanol et enfin dans de l'eau pendant 5 minutes. La membrane a été saturée pendant 30 minutes dans du PBS + 0,1% Tween 20 + 5% BSA. La membrane a été rincée par deux lavages courts (10 secondes) puis un de 5 minutes avec du PBS + 0,1% Tween 20. La membrane correspondant aux extraits de cerveau de souris a été 2 0 préalablement incubée 30 minutes à température ambiante avec un anticorps anti-protéine du prion dilué à 4 g/ml dans du PBS + 0,1% Tween 20 + 1% BSA, puis rincée par une immersion rapide suivie de deux lavages de 5 et de 10 minutes dans du PBS + 0,1% Tween 20. Les membranes correspondant aux extraits de cerveaux et aux 25 immunoglobulines ont ensuite été incubées soit avec l'anticorps anti-immunoglobuline de souris couplé à la peroxidase (Pierce) dilué au 1/1000ème dans du PBS + 0,1% Tween 20 + 3% BSA soit avec les irnmunoliposomes contenant de la sulforhodamine et couplés à un anticorps anti-immunoglobuline de souris dilués au 1/500ème dans du PBS + 0,1% Tween 20 + 3% BSA, pendant 20 minutes à température ambiante. Les membranes ont 3 0 par la suite été rincées par une immersion rapide suivie d'un lavage de 5 minutes et de deux lavages de 10 minutes dans du PBS + 0,1% Tween 20. Enfin, les membranes ont été rincées dans du PBS pendant 1 minute. Par la suite, les membranes correspondant aux immunoliposomes ont été séchées pendant 5 minutes dans une étude à 40 C, et la fluorescence a été mesurée pendant 1 minute (Figure 8) et 5 minutes (Figure 9). Les membranes correspondant à la peroxidase ont été immergées dans de l'ECL Plus (Pierce) puis placées sous film plastique, et la luminescence a été lue pendant une minute (Figure 8) et 5 minutes (Figure 9) sans filtre d'excitation ou d'émission à l'aide de la station d'image Kodak 2000 MM. Après cette mesure, la luminescence a également été révélée à l'aide d'un film photographique selon une procédure classique (Figure 9). Les résultats sont présentés dans les Figures 8 et 9. Comme le montre la Figure 8 (échelle des signaux de 0 à 2500), le séchage des membranes est indispensable pour obtenir un signal fluorescent avec les liposomes, ce qui confirme les résultats obtenus avec les bandelettes. Comme le montre la Figure 9 liposomes (échelle de signaux de 0 à 16 000), les immunoliposomes permettent d'obtenir une sensibilité au moins équivalente à celle de la luminescence révélée par film photographique (Figure 9 peroxidase film photographique , scan du film photographique traité par Image J) et très supérieure à celle obtenue avec la luminescence mesurée à l'aide de la station Kodak (Figure 9 peroxidase station Kodak , échelle de signaux de 0 à 160). En outre, les bandes correspondant aux différentes molécules révélées par les anticorps sont beaucoup moins diffuses avec les immunoliposomes, ce qui facilite et rend plus précis leur analyse. EXEMPLE 5: UTILISATION DES IMMUNOLIPOSOMES DANS DES 25 PLAQUES DE MICROTITRATION Des plaques de microtitration en polystyrène (Colstar) dont les puits possèdent des parois noires mais un fond transparent ont été utilisées. Le polystyrène de ces plaques a une haute capacité d'adsorption des protéines. 1 pl d'une solution de neutravidine (analogue de l'avidine vendu par Pierce) à 1 mg/ml dans du tampon phosphate 0,05 M pH 7,4, a été déposé sur le fond des puits. Après une incubation de 16 heures à 20 C dans une chambre humide, la solution de neutravidine a été éliminée et les plaques ont été lavées avec du tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 + 0,01% Tween 20 (tampon de lavage). Les sites d'adsorption des plaques ont été saturés en déposant dans les puits 300 pl d'une solution de tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,15 M NaCl + 0,01% NaN3 (tampon de dilution). Après lavage des plaques avec du tampon phosphate, 40 là 1 gg/ml d'un premier anticorps anti-entérotoxine B (SEB) biotinylé ont été déposés dans les puits, pendant 30 minutes, à 20 C. En parallèle, une gamme de SEB (10 ; 3,33 ; 1,11 ; 0,37 ; 0,12 ; 0,041 et 0 ng/ml) en tampon de dilution a été mélangée (v/v) avec des immunoliposomes (contenant de la sulforhodamine B) dilués au 1/500ème dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 + 0,15 M NaCl, sur lesquels un deuxième anticorps anti-SEB a été couplé. Après une incubation de 30 minutes à 20 C, et après lavage des plaques avec du tampon de lavage, 40 pl de ces solutions ont été déposés dans les puits pendant 30 minutes, à 20 C. Les plaques ont ensuite été lavées puis 100 pl de tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 + 0,15 M NaCl ont été déposés, et la fluorescence a été mesurée sur la Station Kodac (filtre d'excitation à 535 nm et filtre d'émission à 600 nm) pendant 1 minute (figure 10A). 2 0 Après cette lecture, les puits ont été vidés et la plaque a été séchée pendant 10 minutes à 40 C dans une étuve. Une nouvelle lecture a été réalisée sur la Station Kodak pendant 1 minute (figure 10B), et la fluorescence de chaque puits a été mesurée pendant 5 sec. (figure 11A) et 15 sec. (figure 11B), à l'aide d'un microscope inversé (Olympus 1X 71) couplé à une caméra PCO 1600 (Photon Lines), ce qui permet de tracer les courbes 2 5 (figure 12) exprimant la quantité de fluorescence mesurée (en unités arbitraires) en fonction de la concentration en SEB (en ng/ml) à 5 secondes (triangles pleins) et à 15 secondes (carrés pleins). Les résultats de la figure 10 montrent que, comme pour les autres supports solides, le séchage est nécessaire pour l'apparition d'un signal fluorescent.

D'autre part, les résultats de la figure 11 montrent que le signal fluorescent est parfaitement localisé au niveau des plots. Enfin, les résultats de la figure 12 montrent que le signal obtenu est quantifiable et proportionnel à la quantité d'analyte présent dans l'échantillon. L'ensemble de ces observations permet d'envisager l'utilisation des immunoliposomes avec des biopuces constituées de plusieurs milliers de plots, et analysant soit des polynucléotides soit des peptides ou protéines. Ainsi, l'Invention a pour également pour objet l'utilisation du procédé de détection et de quantification tel que défini précédemment pour la lecture de biopuces.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1. Procédé de détection et de quantification sur support solide d'au moins un analyte A dans un échantillon biologique, avec des immunoliposomes encapsulant des molécules fluorescentes, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 1) soit (a) (i) la mise en contact en milieu liquide dudit échantillon biologique susceptible de comprendre au moins un analyte A avec au moins un immunoliposome encapsulant une molécule fluorescente et dont la surface est couplée à des molécules capables de complexer ledit analyte A, puis (ii) la mise en contact dudit milieu sur un support solide contenant au moins un substrat immobilisé capable de lier les complexes analyte A / immunoliposomes éventuellement formés, soit (b) la mise en contact dudit échantillon biologique préalablement immobilisé sur un support solide, ledit échantillon étant susceptible de comprendre au moins un analyte A, avec un milieu liquide comprenant ledit immunoliposome encapsulant une molécule fluorescente et dont la surface est couplée à des molécules capables de complexer ledit analyte A ;

2) le séchage dudit support solide ; et

3) la détection des signaux de fluorescence éventuellement émis. 20 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape 1) (a) (ii) est mise en oeuvre : - soit par migration par capillarité dudit milieu sur ledit support solide ; - soit par dépôt dudit milieu sur ledit support solide. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape 2 5 1) (b) comprend les sous-étapes suivantes : i) la séparation d'au moins un analyte A dudit échantillon biologique par électrophorèse, et l'immobilisation dudit analyte A sur un support solide par électrotransfert ; ii) la mise en contact dudit support solide sur lequel est immobilisé 30 ledit analyte A avec un milieu liquide comprenant au moins un immunoliposomeencapsulant une molécule fluorescente et dont la surface est couplée à des molécules capables de complexer ledit analyte A.

4. Procédé selon la revendication l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, entre les étapes 1) et 2), au moins une étape de lavage du support solide afin d'éliminer les immunoliposomes non complexés.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support est choisi parmi les membranes en nitrocellulose et les plaques de microtitration et les biopuces.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les molécules couplées aux immunoliposomes et capables de complexer un analyte A sont choisies parmi les anticorps primaires et secondaires capables de complexer ledit analyte, un récepteur dudit analyte, les acides polynucléiques, les acides peptidonucléiques, la lectine, une protéine transporteuse ou un chélate ou récepteur synthétique dudit analyte

7. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les molécules fluorescentes sont choisies parmi la phycoérythrine, la phycocyanine, la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, les dérivés hydrosolubles de la rhodamine se présentant sous la forme d'ester de 2 0 N-hydroxysuccinimide, les coumarines et leurs dérivés, les cyanines fluorescentes, les dérivés de sulforhodamine, et la protéine fluorescente verte.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les molécules fluorescentes sont choisies parmi la sulforhodamine et les cyanines fluorescentes.

9. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, 2 5 caractérisé en ce que l'étape 2) de séchage est effectuée à une température de 20 à 90 C.

10. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la durée de l'étape 2) de séchage varie de 1 à 60 minutes.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la détection des signaux de fluorescence de l'étape 3) est effectuée 3 0 pendant une durée d'au moins 1 minute.

12. Utilisation du procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1, 2 et 4 à 11, dans la lecture de biopuces.