JP2010530224A - ジアゾ及びニトロ官能基を担持するマーキング試薬、当該試薬の合成する方法及び生体分子を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
第1の技術は標識を塩基に取り付けることを含み、塩基は天然であるか修飾されている。第2の技術は標識を糖に結合することを有し、再度それは天然であっても又は修飾されていてもよい。第3の方法は、標識をリン酸に結合することを伴う。
直接的に標識されたヌクレオチドの取込みによって標識された核酸を含む方法では、塩基における標識が、特に使われている。
糖における標識は、化学合成によって調製される核酸プローブの場合に、しばしば使われる。
また、リン酸における標識は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、官能基化されたアームと標識を導入するために用いられている。
従って、(式-C(N2)-の)ジアゾメチル官能基が、リン酸基のアルキル化のためにすでに用いられているが、特定数の問題が生じる。第一に、少なくとも一つのジアゾ官能基を組み込まれた試薬は単独で通常不安定であり、標識化キット中のこれらの試薬の使用に問題を起こす;標識された生成物の官能基が任意のサンプルの生物学的標的分子の存在を示す場合、これは全く許容できない。
第三世代の分子のこの工業的利用は、特に統合化された装置またはマイクロシステムで重要であり、問題が生じた場合に、特定の試薬の安定性に疑いをかけられないように、含まれる化学は非常に有効で頑強でなければならない。
・ジアゾメチル官能基は、メタ、パラまたはオルト位のニトロ基(NO2)によって1回以上置換されるα位の芳香族基を有する。
・そのα’位において、ジアゾ官能基は検出を可能する基を有する。この基は、ビオチンあるいは検出可能な他の任意の基であってもよい。
以前は検出可能な基が芳香族部分に依然として結合されており、α’位は少なくとも一つの非官能性置換基によってのみ、ほとんど占められていたので、この第2ポイントは第一及び第二世代の分子と比較して完全にオリジナルの特徴である。
同様に、
・グラフト化の化学、及び
・核酸の3’又は5’末端におけるリン酸の導入についての技術も、またこの上記の特許出願に記載されており、当該文献において本発明の完全な理解のために必要とされる任意の情報を得ることができる。
Lは少なくとも2つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、nは1に等しい整数である。有利には、反応体について前に開示された実施態様または変異体に関係なく、Lは単位 -(O-CH2-CH2)-を、1から20回、好ましくは1から10回、より好ましくは2から5回反復して含む。
Aは、ジアゾ官能基の芳香環との共役を可能にする少なくとも一つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、uは0と2との間、好ましくは0と1との間の整数である。
ある特定の実施態様では、Aは芳香環にジアゾメチル官能基を共役させることを可能にする、少なくとも一つのエチレン二重結合を含むリンカーアームである。ジアゾメチル官能基の安定性を保持する一方で立体障害を少なくするために、リンカーアームAの機能はジアゾメチル官能基を環から遠ざけることである。「共役」によって、リンカーアームAの炭素鎖に沿った芳香環の電子非局在を意味する。例えば、アームAは、以下の構造:
[式中、
・vは1と10との間の整数であり、好ましくは、vは1又は2である、及び
・R10はHまたはアルキル基であり、好ましくはR10はH、メチルまたはエチルである]
を有する。
ラジカルR3及びR4は、互いに独立であり、H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR又はCOORを表わし、ここでRはアルキル又はアリールである。
[式中:
・R1は、1つの検出可能な標識、または少なくとも1つの多量体構造によって互いに連結される少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・R3及びR4は、互いに独立であり、H、NO2、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、るOR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR又はCOORを表わし、ここでRがアルキル又はアリールであり、
・Lは、少なくとも2つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、
・nは1に等しい整数である]
である。
a)カルボン酸誘導体をラクトンのエノラートと反応させ(クライゼン縮合)、環状前駆体を形成すること、
b)前記環状前駆体をハロゲン酸によって開き、続いてハロゲン化芳香族ケトンを形成すること、
c)ハロゲン化芳香族ケトンのカルボニル官能基を保護基によって保護し、被保護前駆体を形成すること、
d)前記被保護前駆体にアミノ化反応(ガブリエル反応)を受けさせ、アミノ化前駆体を形成すること、
e)前記アミノ化前駆体をアミン官能基を解放するために脱保護し、前記アミン官能基を検出可能な標識と反応させ、そのカルボキシル官能基を活性化し、検出可能な標識を含む前駆体を形成すること、
f)標識された前駆体は、カルボニル官能基の脱保護のための反応を受けさせ、標識されたカルボニル化前駆体を形成すること、及び最後に
g)標識されたカルボニル化前駆体を、カルボニル官能基のジアゾ官能基(バンフォード・スティーヴンズ反応)への変換によって上記の通りに標識化試薬に変換する工程。
本発明は、同様に、上記の方法によって得られる標識された生体分子に関する。
また、本発明は、一本鎖又は二本鎖を標識化し、断片化する核酸の方法に関し、
・核酸を断片化すること;
・上記の試薬から選択される標識化試薬を介して断片の少なくとも一つに標識を取り付け、前記試薬を前記断片の少なくとも一つのリン酸に共有結合で、優勢的に結合させる工程を含む。
他の実施態様では、方法は、断片化及び標識化が1工程で実施されることを特徴とする。
いかなる実施態様においても、方法は、標識化が実質的水性均一溶液において行われるという点を特徴とする。
いかなる実施態様においても、方法は、断片化が酵素的に、物理的に又は化学的に実施されることを特徴とする。
本発明は、同様に、上記の任意の実施態様に従った方法により得られる標識された核酸に関する。
更に、本発明は、例えば上に開示した標識された核酸を含む標的核酸を検出するためのキットに関する。
また、本発明は、その上に上記の試薬が結合される固体支持体にも関する。
・直接または間接的に、少なくとも一つの生体分子又は核酸、ジアゾメチル官能基を有する核酸又は生体分子を結合させた固体支持体を提供すること、
・前記支持体に遊離した核酸を含みうる生物試料を接触させること、及び
・分子が共有結合で少なくとも核酸に結合されている前記固体支持体を洗浄する工程を含む方法に関する。
・Ar:芳香族、
・s:一重項、
・d:二重項、
・t:三重項、
・qu:五重項、
・m:分離不可能な複合体、
・M:多重項、
・HPLC:高圧液体クロマトグラフィー、
・TLC:薄層クロマトグラフィー、
・NMR:核磁気共鳴、
・RfまたはTR:保持時間、
・DMSO-d6:重水素化ジメチルスルホキシド、
・DMCF:ジメチルシクロヘキシルアンモニウム・ホルマート、
・CDCl3:重水素化クロロホルム、及び
・DMF:ジメチルホルムアミド、
・DCM:ジクロロメタン
・MeOH:メタノール
・ACN:アセトニトリル
・ミリQ水:ミリポア超純水
・DMAC:ジメチルアミノ桂皮アルデヒド。
これらの条件は、下記の実施例1、2、3及び4に適用できる。
HPLC条件(Waters Alliance 2795 HPLC system, diode array detector PDA 996, Empowerソフトウェア, version 2, 及び Waters XTerra MS C18 4.6x30 2.5 μm):
1)基本的方法:
溶出剤A:ミリQ水
溶出剤B:ACN
溶出剤C:500mMのアンモニア水、pH12
これは、20分間の1%から64%のアセトニトリル(一定の5mMのアンモニア水、pH=9)の、直線濃度勾配に対応する。
2)DMCF(ジメチルシクロヘキシルアンモニウム・ホルマート)方法:
溶出剤A:ミリQ水
溶出剤B:ACN
溶出剤C:500mMのDMCF、pH7
これは、20分間の1%から64%の5mMのDCMF含有アセトニトリル(pH=7)の直線濃度勾配に対応する。
DMCFの500mmol/l溶液を、37mlのジメチルシクロヘキシルアミン、9.4mlの純粋なギ酸及び200mlの水から調製する。pHを7に合わせ、溶液は水により500mlにした。
3)一般的な合成条件:
薄層クロマトグラフ分析は、Alugram(登録商標)Macherey-Nagel SIL G/UV254 4x8 cm シリカプレートで、254nmのUV検出により、又はビオチン化された生成物の場合はDMACにより実施した。
生成物は、Flukaシリカゲル60(40-63μm)でシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。フラッシュクロマトグラフィー(アルゴン下での運転)による分離の条件は、Clark Still et al. (Clark Still, W.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43, 2923-2925)に記載されている条件、すなわちシリカの高さが15cmに固定されること、速度5cm/分で運転すること、量に応じたカラムの直径及び精製される生成物のRfを厳密に守ることである。
NMRスペクトルは、Bruker 200MHz分光器に記録された。ケミカルシフト(δ)は、内標準として使用される溶媒のピークに比較して、ppmで示す(25℃において、CDCl3:7.24ppm;DMSO−d6:2.49ppm;D2O:4.80ppm)。スペクトルは、以下の省略形を使用して記載されている:s=一重項、d=二重項、t=三重項、q=四重項、qu=五重項、m=分離不可能な複合体、M=多重項。
質量スペクトル(MS)は、2〜10μl/分でシリカチューブによる注入、ポジティブモードのエレクトロスプレー・イオン化法によってLCQ-イオントラップ計測器(Thermofinnigan、サンノゼ、CA、米国)で得られた。使用する主要な溶媒は、DCM及びMeOHである。
目的:
DKB分子:メタ・ニトロDKBの合成の実施可能性を示す。
手順:
合成の詳細を図2に示す。それは、市販されている、塩化メタ・ニトロベンジル(塩化3-ニトロベンゾイル)の分子から始まる(Aldrich, Saint Quentin Fallavier, フランス)。
マグネシウム・エトキシド(5.41g; 0.0473モル)をクロロベンゼン(33ml)に、続いてα-アセチル-γ-ブチロラクトン(5.29ml; 0.0492モル)に懸濁し、懸濁液は、アルゴン下に置いて、撹拌し、75℃で3時間加熱する。反応混合物は周囲温度まで冷却された後、塩化3-ニトロベンゾイル(10g; 0.0539モル)のクロロベンゼン(16.4ml)の溶液を加えて、系を40℃で2時間加熱した。
混合物は、25mlの1M硫酸によって加水分解される前に10℃まで冷却し;系をデカントし、有機相(上相)を回収し、5%の炭酸水素ナトリウム溶液によって洗浄される。次に、最終的に直径7cm及び高さ10.5cmのシリカゲルカラムで、溶出速度5cm/分により精製する前に、有機相を減圧下で乾燥するまで蒸発させる。第1相において、カラムに通される溶出剤はシクロヘキサン/酢酸エチルの70/30混合物、続いて50/50混合物である。期待される生成物を含む分画を合わせて、乾燥まで蒸発し、生成物1を得て(8.17g; 収率=73.5%)、続く反応において直接使用する。
TLC溶出剤:ジクロロメタン/メタノール:95/5
HPLC:DMCF法;TR=7.7分
分子1(5.50g; 0.0234モル)を48%強度の臭化水素酸水溶液(33ml;6v)に懸濁し、2時間環流する。溶液を周囲温度に冷却した後、水相を30mlのジクロロメタンによって3回抽出する。有機相は、5%の炭酸水素ナトリウムによって逆抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発した。これにより生成物2が得られる(6.06g;収率=95.8%)。
TLC溶出剤:ジクロロメタン/メタノール:95/5
HPLC:DMCFまたはベーシック法;TR=13.6分
1H NMR (200 MHz, DMSO): 2.416 ppm (qu, 2H, CH 2-CH2Br), 3.426 ppm (t, 2H, CH 2Br), 3.279 ppm (t, 2H, CH 2-CO), 7.738 ppm (t, 1H, Ar), 8.328 (d, 1H, Ar), 8.457 (d, 1H, Ar), 8.837 (s, 1H, Ar).
ディーン・スターク装置を載せた丸底フラスコの中で、化合物2(4.00g; 14.7mmol)、エチレングリコール(2.87ml; 51.4mmol)、パラ‐トルエンスルホン酸(139.6mg; 7.35mmol)及びトルエン(50ml; 12.5v)を混合し、次に混合物は合計7時間(130℃の設定温度で5.5時間、次に150℃で1.5時間)還流する。反応を完了し、トルエンを減圧下で蒸発させ、残留物を70mlの酢酸エチルに溶解し、50mlの250mmol/lの炭酸水素ナトリウム溶液によって2回洗い、次に50mlの水で2回洗い、有機相を硫酸ナトリウムを通じて乾燥し、濾過し、乾燥まで蒸発して、シリカゲルのクロマトグラフィー(Φ = 7 cm, h = 7 cm, f = 5 cm/分)で、シクロヘキサン/酢酸エチル:85/15の溶出剤により精製した。このカラムの後、化合物3を得る(3.70g;収率=79.6%)。
TLC溶出剤:シクロヘキサン/酢酸エチル:85/15
HPLC:ベーシック法;TR=15.3分
1H NMR (200 MHz, DMSO): 1.90-2.10 ppm (m, 4H, CH 2-CH 2-CH2Br), 3.425 ppm (t, 2H, CH 2Br), 3.798 ppm (t, 2H, CH 2-O), 4.081 ppm (t, 2H, CH 2-O), 7.561 ppm (t, 1H, Ar), 7.75-7.85 ppm (m, 1H, Ar), 8.10-8.25 (m, 1H, Ar), 8.30-8.35 (m, 1H, Ar)
生成物3(3.70g; 11.7mmol)をDMF(40ml、0.3M)に溶解し、次にフタルイミドカリウムの全量を一度に加え、混合物を155℃で15分間加熱する。DMFを減圧下で蒸発させ、次に蒸発残留物を60mlのジクロロメタンに溶解し、60mlの0.1モル/lの水酸化ナトリウム溶液によって洗浄する;水相を30mlのジクロロメタンによって逆抽出し、2つの有機相を合わせて、硫酸ナトリウムの層を通じて乾燥し、つづいて溶媒の蒸留によって乾燥まで溶液の濾過と蒸発を行う。残留物をエタノールに溶解し(55ml; 12 v)、10℃に冷却する前に20分間環流で加熱し(溶解が完了しない)、生成物を沈殿させて、ガラスフリットで吸引によりろ過し;生成物4は、9.2mlのエタノールで2回洗浄し、次に減圧下で乾燥させた(3.99g;収率=89.1%)。
HPLC:ベーシック法;TR=14.9分
1H NMR (200 MHz, CDCl3) : 1.604-2.005 ppm (m, 4H, CH 2-CH 2-CH2-N), 3.677-3.783 ppm (m, 4H, O-CH 2-CH 2-O), 4.019 ppm (t, 2H, CH2-N), 7.500 (t, 1H, Ar), 7.600-8.000 (m, 4H, phthalimide), 8.150 (d, 1H, Ar), 8.300 (s, 1H, Ar)
物質4(3.987g; 10.4mmol)をメタノール(210ml; 53 v)に懸濁し、次にヒドラジンと周囲温度で混合する(15.2ml; 313mmol)。反応は20分後に終了する。反応混合物は乾燥するまで蒸発させ、残留物を100mlの酢酸エチルに溶解し、100mlの水で洗う;得られた水相を、100mlのジクロロメタンで2回抽出し、続いて100mlの酢酸エチルで3回抽出する。全ての有機相を合わせて、減圧下で蒸発させ、シリカゲルカラム(Φ=5cm、h =15cm 、f = 5cm/分)に置き、溶出剤として、ジクロロメタン/メタノール/アンモニア水:90/10/1を使用する。
最後に化合物5を得た(2.11g;収率=80.1%)。
TLC溶出剤:ジクロロメタン/メタノール/アンモニア水:90/10/3
HPLC:ベーシック法;TR=4.8分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.464-1.666 ppm (m, 4H, CH 2-CH2-NH 2), 1.904-1.985 ppm (M, 2H, -CH 2-CH2-CH2-NH2); 2.689 ppm (t, 2H, CH 2-NH2), 3.753-4.115 ppm (m, 4H, O-CH 2-CH 2-O), 7.540 ppm (t, 1H, Ar), 7.837 ppm (d, 1H, Ar), 8.147 ppm (d, 1H, Ar), 8.331 ppm (s, 1H, Ar)
ビオチン(6.00g; 24.5mmol)を無水DMF(60ml; 10 v)に溶解し、アルゴン下で溶液をピリジン(2.44ml; 30.0mmol)と、続いてペンタフルオロフェニル・トリフルオロアセタート(5.258ml; 30.5mmol)と混合し、この混合物は30分間40℃に加熱されて、次にオーバーナイトで周囲温度まで戻される。チェック後−反応は終了している−DMFを蒸発させ、残留物を200mlのジクロロメタンに溶解する;生成物は懸濁したままであり、吸引によりろ過し、濾過ケーキを5mlのジクロロメタンで3回洗い、次に固体生成物は25℃のオーブン中で減圧下で乾燥される。
これにより、非常にきれいな生成物がTLC(6.18g; 61.3%)中に得られる。
TLC溶出剤:ジクロロメタン/メタノール:90/10
HPLC:ベーシック法;TR=10.0分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.2-1.8 ppm (m,6H), 2.3-3.4 ppm (m, 5H), 4.0-4.4 ppm (m, 2H), 6.1-6.6 ppm (m, 2H)
試薬5(500mg; 1.98mmol)を60℃で、DMF(5ml; 10v)とトリエチルアミン(2.22ml; 15.8mmol)の混合物に溶解し;平行して、化合物6も60℃で4.9mlのDMFに溶解する。6の溶液を5の溶液に混合し、混合物はオーバーナイトで周囲温度で撹拌する。それを更なる処理をせず、乾燥まで蒸発させる。
物質7(948mg; 1.98mmol)を80%酢酸(5ml;5.3v)と、環流で16時間反応させる(NB:6Mの塩酸を使用することも可能であり、それは非常に良く反応する)。反応はHPLCによりモニターされ、完了させなければならない。酢酸を、減圧下、蒸留により蒸発させ、次に残留物を500mlのジクロロメタン/メタノール 90/10混合物に溶解し、250mlの0.1Mの水酸化ナトリウム溶液により洗浄する。このように精製された有機相を硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、濾過し、乾燥まで蒸発させる。これにより化合物8が得られる(244.8mg; 28.4%).生成物は更なる処理をすることなしに粗形態で使用される。
TLC溶出剤:使用しない;開始生成物を、最終的な生成物から区別することが不可能である
HPLC:ベーシック法;TR=9.9分
化合物8を、DMF(2.49ml; 12.3 v)とメタノール(12.5ml; 51 v)の混合物に溶解し、酢酸(640μl; 11.1mmol)と混合する;開始生成物は可溶性でない。最後に、ヒドラジン(271μl; 5.57mmol)を加え、試薬が溶解すると、溶液は黄色になる。周囲温度で撹拌し5時間後に、全ての溶媒を蒸発させ、10mlの水により3回、同時蒸発させる。粗反応生成物を5℃で15mlチューブ中の8mlのミリQ水に溶解し、生成物を沈澱させ、系を30秒撹拌し、次にチューブを3分間、8500rpmで遠心分離する;上澄みを抜き、操作を2回繰り返す。最後の洗浄の間に、水のpHを確認すると、実際に7である;もはや酸は残っていない。
HPLC:ベーシック法;TR=8.4分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.1-1.9 ppm (m, 8H, -CH 2-), 2.085 ppm (t, 2H, CO-CH 2), 2.50-2.90 ppm (m, 4H, biotin), 3.00-3.20 ppm (m, 3H), 3.30-3.40 ppm (m, 2H), 4.0-4.4 ppm (m, 2H, biotin), 6.30 and 6.50 ppm (2s, 2H, NH biotin), 7.23 ppm (s, 2H, NH), 7.866 ppm (d, 2H, Ar), 8.155 (s, 2H, Ar)
粉末9(250mg; 0.56mmol)をDMF(4.65ml; 18.6 v)に溶解し、−5℃に冷却し、テトラメチルグアニジン(571μl; 4.53mmol)に、続いて3Åモレキュラーシーブ(957mg)及び酸化マンガン(3.03g; 45.3mmol)に混合する。反応混合物は、40分間、アルゴン下、−5℃で撹拌し、次に1cmのセリットのプラグでろ過し;次にろ液が無色になるまで、プラグをメタノールでリンスする。このろ液を回収し、減圧下で蒸発させる(浴温;最高35℃)。蒸発残留物を、15mlチューブ中の4mlのジクロロメタン/メタノール 90/10混合物に溶解し:次に4mlの0.1Mの炭酸水素ナトリウム溶液で洗う。上澄みは、遠心の後で取り除かれる。ジクロロメタン相を350μlのメタノール及び4mlの炭酸水素ナトリウムと混合し、この系を混合してデカントし、水相を取り除き、最後の有機相を無水炭酸ナトリウムを使用して乾燥し、この系をろ過し、ろ液は減圧下で乾燥まで蒸発させる。これによりオレンジ粉末を得る(最後の2つの工程で、196.8mg;収率=79.3%)。
HPLC:ベーシック法;TR=11.05分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.1-1.9 ppm (m, 8H, -CH 2-), 2.058 ppm (t, 2H, CO-CH 2), 2.4-3.4 ppm (m, 7H), 3.0-3.2 ppm (m, 5H), 4.0-4.3 ppm (m, 2H, biotin), 6.33 and 6.40 ppm (2s, 2H, NH biotin), 7.36 ppm (d, 1H, Ar), 7.50-7.70 ppm (m, 2H, Ar+NH), 7.80-7.90 ppm (m, 3H, Ar).
我々は第三世代の分子を合成することが可能であることを示した。この合成は、前世代の分子に関連するものよりも非常に単純である。
例えば、第二世代の分子は11工程の合成を必要とし、それは比較的複雑で面倒である。
さらに、第二世代の分子のための合成経路は、あまり用途が広くない。本発明の対象である新合成経路は、ずっと用途が広い。すなわち、同じ合成経路に続いて、最終生成物分子の多様性を増やすために、他の芳香族基質を使用することができる。
目的:
DKB分子、パラ・ニトロDKBの合成の実現可能性を示すこと。
手順:
本来の合成を図3に示す。開始生成物は、塩化パラ・ニトロベンジル(Aldrich, St Quentin Fallavier, フランス)である。以下で合成したさまざまな分子は、実施例1に記載された同じ手順に正確に基づく。
TLC溶出剤:ジクロロメタン/メタノール:95/5
HPLC:ベーシック法;Tr=1.8分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 2.40-2.90 ppm (m, 2H, CH 2-CH2O), 4.432 ppm (M, 2H, CH 2O), 5.153 ppm (t, 1H, C=O-CH-C=O), 8.303 ppm (d, 2H, Ar), 8.382 ppm (d, 2H, Ar)
MS: [M-H+]- at m/z = 234.3.
TLC溶出剤:ジクロロメタン/メタノール:95/5
HPLC:ベーシック法;TR=13.9分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 2.189 ppm (qu, 2H, CH 2-CH2Br), 3.177 ppm (t, 2H, CH 2Br), 3.624 ppm (t, 2H, CH 2-CO), 8.217 ppm (d, 2H, Ar), 8.334 (d, 2H, Ar)
TLC溶出剤:シクロヘキサン/酢酸エチル:85/15
HPLC:ベーシック法;TR=15.5分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.80-2.10 ppm (m, 4H, CH 2-CH 2-CH2Br), 3.415 ppm (t, 2H, CH 2Br), 3.767 ppm (t, 2H, CH 2-O), 4.077 ppm (t, 2H, CH 2-O), 7.669 ppm (d, 2H, Ar), 8.186 (d, 2H, Ar)
HPLC:ベーシック法;TR=15.1分
1H NMR (200 MHz, CDCl3) : 1.50-1.65 ppm (m, 4H, CH 2-CH 2-CH2-N), 3.65-3.70 ppm (m, 4H, CH 2-O and CH 2-N), 4.00-4.10 ppm (M, 2H, CH2-O), 7.55-7.65 (M, 2H, Ar), 7.65-7.75 (M, 2H, phthalimide), 7.80-7.90 ppm (M, 2H, phthalimide) 8.192 ppm (M, 21H, Ar)
TLC溶出剤:ジクロロメタン/メタノール/アンモニア水:90/10/3
HPLC:ベーシック法;TR=5.0分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.30-1.60 ppm (m, 4H, CH 2-CH2-NH 2), 1.80-2.00 ppm (M, 2H, -CH 2-CH2-CH2-NH2); 2.678 ppm (t, 2H, CH 2-NH2), 3.769 ppm (M, 2H, O-CH 2), 4.060 ppm (M, 2H, O-CH 2), 7.66 ppm (M, 2H, Ar), 8.177 ppm (M, 2H, Ar)
HPLC:ベーシック法;TR=9.1分
TLC溶出剤:ジクロロメタン/メタノール:90/10
TLC溶出剤:使用しない;最終的な生成物から開始生成物を区別することが不可能である。
HPLC:ベーシック法;TR=9.0分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.2-1.7 ppm (m, 8H, -CH 2-), 2.093 ppm (t, 2H, CO-CH 2), 2.4-3.0 ppm (m, 2H, biotin), 3.0-3.2 ppm (m, 5H), 4.0-4.4 ppm (m, 2H, biotin), 6.34 and 6.40 ppm (2s, 2H, NH biotin),7.70-7.90 ppm (m, 2H, Ar+NH), 8.20-8.50 ppm (m, 2H, Ar), 8.63 ppm (s, 1H, Ar)
HPLC:ベーシック法;TR=8.2分
HPLC:ベーシック法;TR=10.7分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.2-1.9 ppm (m, 8H, -CH 2-), 2.066 ppm (t, 2H, CO-CH 2), 2.5-3.0 ppm (m, 4H), 3.0-3.2 ppm (m, 2H), 4.00-4.40 ppm (m, 2H, biotin), 6.36 and 6.42 ppm (2s, 2H, NH biotin), 7.19 ppm (d, 2H, Ar), 7.875 ppm (t, 1H, NH), 8.133 ppm (d, 2H, Ar).
パラ・ニトロDKB分子の合成における工程は、メタ・ニトロDKB分子の合成で上記したものと同一である;塩化メタ・ニトロベンジルまたは塩化3-ニトロベンゾイルの分子の代わりに、塩化パラ・ニトロベンジルまたは塩化4-ニトロベンゾイルの分子から開始することが、必要とされる全てである。
目的:
第二世代の分子と比較して、DKB分子の液状媒質における安定性を示すこと。この目的のために、加速安定性研究を極限条件下で行った。すなわち化合物を周囲温度(22℃±1℃)で、96/4 DMSO/メタノール混合物中に125mMで保存した。これらが極端な貯蔵条件である点に注目されたい。
手順:
図10に明示した3つの化合物、メタ・ニトロDKB、パラ・ニトロDKB及びBBPを、96/4 DMSO/メタノール混合物に125mMで溶解し、周囲温度(22℃±1℃)で貯蔵する。クロマトグラムのピークの全ての積分により、主要生成物の分解を測定するために(the Empower 2ソフトウェアのPDA Max Plot)、連続した一定の間隔で、これらの溶液の2μlをHPLC(ベーシック法、Waters HPLCシステム)に注入した。次に、図4に明示するように、時間の関数としての初期化合物の純度の変化を報告する。
結果と結論:
BBPは数日以内に分解されるが(10日目で純度<10%)、一方でDKBはずっと安定したままである(パラ・ニトロDKBでは貯蔵の2ヶ月後純度>40%)。電子非局在化によって及び立体効果によって、ニトロ・アリール単位アルファとジアゾ官能基の標識アルファ’の組合せはジアゾ官能基を安定させて、それによりジアゾ官能基を加水分解から影響を受けにくくする。
目的:
第二世代のBBP分子と比較して、DKB分子の乾燥安定性を示すこと。
手順:
3つの化合物、メタ・ニトロDKB、パラ・ニトロDKB及びBBPを10mMのTris−HCl(pH7.5)と10%トレハロースとの溶液に250mMで溶解する。溶液は、50nモルのアリコートにおいて、オーバーナイトで凍結乾燥する。次に乾燥生成物を4℃で保存する。
クロマトグラムのピークの全ての積分により、主要生成物の分解を測定するために(the Empower 2ソフトウェアのPDA Max Plot)、連続した一定の間隔で、これらの溶液の15μlをHPLC(Waters)に注入した。次に、図5に明示するように、時間の関数としての初期化合物の純度の変化を報告する。
実施例3と同様だが、BBPが凍結乾燥に耐えないが(この工程の間に>60%分解)、一方でDKBが完全に安定したままであり、特にメタ・ニトロDKBが特にそうであったことが、より顕著に証明される。ジアゾ官能基に対するニトロ・アリール単位アルファとジアゾ官能基の標識アルファ’の組合せは当該官能基を非常に安定化し、加水分解から影響を受けにくくする。
目的:
第二世代の分子(BBP)と比較して、DKB分子による核酸の標識化の有効性を示すこと。
この目的のために、増幅反応により得られたRNAアンプリコン(マイコバクテリウム・ツベルクローシスの174塩基配列の断片)をDKBによる反応によって、ビオチンで標識する。標識化反応の生成物は、Affymetrix DNAチップ上のハイブリダイゼーションによって検出される(J. Clin. Microbiol., 37(1), PP49-55, A. Troesch et al., 1999に記載のCustom DNA Chip Combo Myco )。
手順:
以下の成分をチューブに加える:
・18μlの250mMの標識溶液(DMSO/メタノール 96/4)、DKB又はBBPのどちらか、
・12μlのDMSO、
・15μlのNASBA0.5Xバッファー(「NucliSensベーシックキット EasyQ」ビオメリュー)、
・35μlの1MのTris−HCl、
・5μlのNASBA0.1X(NASBA増幅反応、10倍希釈、174塩基のアンプリコン)、
・15μlの20mMのHCl又は15μlの水、及び
・15μlの水(非HClコントロールとして)。
溶液をボルテックスし、次に65℃で10分間インキュベートする。
核酸の精製:
標識された核酸は、製造業者によって推奨される精製プロトコルを使用して、QiaQuickカラム(PCR精製キットQiaQuick、Qiagen、ヒルデン、ドイツ)で精製した。溶出量は100μlである。
精製後、標識された核酸は、400μlのハイブリダイゼーション・バッファーに移される。サンプルは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの16SRNAの「GenBank」M20940配列の解析用に設計されたDNAチップにハイブリザイズさせる。このDNAチップはA. Troesch et al(J. Clin. Microbiol., 37(1), PP49-55, 1999)によって記載されている。
ハイブリダイゼーション工程は、A. Troesch et alの上記刊行物に記載されているハイブリダイゼーションプロトコルとバッファーを利用して、FS 450 fluidics stations (Affymetrix, Santa Clara, Californie, USA)で実施する。
ハイブリダイゼーションは、フィコエリトリン(PE)で標識されたストレプトアビジン(SA)の結合が、以下の条件下で使用された標識のビオチンと相互作用することで明らかにされる:300μlの純水;300μlの100mMトリスバッファー(pH7)/1MのNaCl/0.05%のTween20/0.005%の消泡剤;6μlのBSA(50mg/ml);6μlのSA−PE(300μg/ml)。
標識化とハイブリダイゼーションの後で、DNAチップの表面に放出される蛍光の読取及びシグナル強度と相同性パーセンテージ用データの作成を、Affymetrix(Scanner Gene Chip Array 及びGCOSソフトウェア)から提供される読取りシステムとソフトウェアによって実施する。読取りシステムは、rfu(相対的蛍光単位)で表示されるシグナル強度とバックグラウンド・ノイズ強度を提供する。相同性パーセンテージをリファレンス配列(この場合はマイコバクテリウム・ツベルクローシスの配列)と比較して示す(図6、続いて図7及び図9でも、%BCは%Rightと等しい)。
シグナルの正中の強度(Med)及びバックグラウンド・ノイズの正中の強度(Med Bckgd)、相同性パーセンテージ(%Right)を、標識BBP、メタ・ニトロDKB及びパラ・ニトロDKBの図6のグラフに示す。
一般的に言って、求められる主要なパラメーターは、90%より高い相同性パーセンテージである。第2に、高い特異的なシグナルと低いバックグラウンド・ノイズが求められる。
この実施例は、添加塩酸の非存在下で、標識メタ・ニトロDKBが最高の結果を呈することを示す。添加の3mM塩酸の存在下では、標識メタ・ニトロDKBとパラ・ニトロDKBがBBP基準標識より良好な結果を呈する。
全ての場合において、DKBの非常に高い安定性にかかる評価については、それらの標識能力は第二世代のBBP基準分子の標識能力に勝っていない場合であっても少なくとも同じである点において、後の標識が前の世代の分子に比べ優れていることを示す。
目的:
目的は、過剰の標識を精製しない不利な条件下で実施例5と同じことを証明することである。
手順:
1mlチューブ中に、以下の成分を混合する:
・5μlの8mMの標識溶液(DMSO/メタノール 96/4)。標識はDKBかBBPのどちらかを含む。
・5μlのNASBA 0.1X (ビオメリューのNucliSensベーシックキット)、
・5μlの1MのTris−HCl、及び
・5μlの20mMのHCl。
溶液をボルテックスし、次に65℃で10分間インキュベートする。
この方法で標識された核酸は精製しないで、直接ハイブリダイズする。
標識された核酸は、精製せずに、480μlのハイブリダイゼーション・バッファーに移される。サンプルは、前の実施例と同じ方法でDNAチップにハイブリダイズさせる。
DNAチップの読取り:
標識BBP、メタ・ニトロDKB及びパラ・ニトロDKBについての強度、バックグラウンド・ノイズ、及び相同性パーセンテージに関する結果を図7のグラフに示す。
この実施例は、標識メタ・ニトロDKB及びパラ・ニトロDKBが、それらがBBP基準分子に比較して減少したバックグラウンド・ノイズを呈することを意味する構造を有することを示す。特異的なシグナルも向上し(特にパラ・ニトロDKBの場合)と、相同性パーセンテージは、BBPでは比較的低いが、メタ・ニトロDKBでは極めて高くなっている。前の世代に比較して、第三世代の分子の優位性が、前の世代に比較して、再度示される。
目的:
目的は、標識したRNAアンプリコンがその蛍光強度を失うことなしに、DNAチップ上に24時間までハイブリダイズできることを証明することである。これは、RNA−標識の結合の安定性を示す。
手順:
以下の成分をチューブに加える:
・5μlの10mMの標識(メタ・ニトロDKB又はパラ・ニトロDKB)DMSO/MeOH(96/4)溶液、
・5μlのNASBA 0.1X 増幅生産物(ビオメリューのNucliSensベーシックキット)、
・5μlの1MのTris−HCl、及び
・5μlの水。
溶液をボルテックスし、次に65℃で10分間インキュベートする。
標識した核酸を、製造業者によって推奨される精製プロトコルを使用して、QiaQuickカラムで(PCR精製キット、Qiagen)精製した。溶出量は100μlである。
DNAチップ上のハイブリダイゼーション:
精製後の、標識化核酸を、400μlのハイブリダイゼーション・バッファーに移す。
サンプルは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの16SRNAの「GenBank」M20940配列の解析用に設計されたDNAチップにハイブリザイズさせる。このDNAチップはA. Troesch et al(J. Clin. Microbiol., 37(1), PP49-55, 1999)によって記載されている。
ハイブリダイゼーション工程は、80μlのハイブリダイゼーション混合物をチップに注入し、次にハイブリダイゼーション・オーブンにチップを45℃で0.5時間、2時間、6.5時間又は24時間置くことによって行った。
ハイブリダイゼーションは、フィコエリトリン(PE)で標識されたストレプトアビジン(SA)の結合が、以下の条件下で使用された標識のビオチンと相互作用することで明らかにされる:300μlの純水;300μlの100mMトリスバッファー(pH7)/1MのNaCl/0.05%のTween20/0.005%の消泡剤;6μlのBSA(50mg/ml);6μlのSA−PE(300μg/ml)。
標識化とハイブリダイゼーションの後で、DNAチップの表面に放出される蛍光の読取り、及びシグナル強度と相同性パーセンテージ用データの作成を、Affymetrix(Scanner Gene Chip Array及びGCOSソフトウェア)から提供される読取りシステムとソフトウェアによって実施する。読取りシステムは、rfu(相対的蛍光単位)で表示されるシグナル強度とバックグラウンド・ノイズ強度を提供する。相同性パーセンテージをリファレンス配列(この場合はマイコバクテリウム・ツベルクローシスの配列)と比較して示す。
ハイブリダイゼーション時間を関数としたシグナルの正中の強度(Med)を標識メタ・ニトロDKB(m−NO2−DKB)及びパラ・ニトロDKB(p−NO2−DKB)について図8のグラフに示す。
それらは、蛍光シグナルが安定したままであり、ハイブリダイゼーション時間に関して上昇する傾向さえあることを示す。
この実施例は、メタ・ニトロDKBまたはパラ・ニトロDKBにより標識されたアンプリコンがハイブリダイゼーションの過程において、24時間に延長されても完全に安定したままであることを示す(特に長いハイブリダイゼーションや腫瘍学での遺伝子発現において有利である);図8を参照。
蛍光シグナルが時間とともに増加さえすることが観察され、それはアンプリコンの良好なハイブリダイゼーションのためである(ハイブリダイゼーションの反応速度は遅い)。
そのため、これは標識-核酸の結合の安定性を証明する。
手順:
RNAアンプリコンは、上述のとおりNASBA増幅によって調製し、BBP、p−NO2−DKBまたはm−NO2−DKB分子で標識する。
以下の成分をチューブに加える:
・5μlのNASBA 1X(ビオメリューのNucliSensベーシックキット)、
・5μlの20mMのBBP、p−NO2−DKB又はm−NO2−DKBのDMSO/メタノール(96/4)溶液、
・5μlの1MのTris−HCl(pH7.4)、及び
・5μlの水。
溶液をボルテックスし、次に65℃で10分間インキュベートする。
Kreatechの市販キットによる標識化を、製造業者によって推奨されるプロトコルに従って行った。要約すると、次のものを混合する:
・20μlのNASBA 1X(ビオメリューのNucliSensベーシックキット)、
・1μlの標識溶液、
・3μlの10×バッファー、及び
・6μlの水。
溶液を85℃で30分間インキュベートした。
BBP、p−NO2−DKB又はm−NO2−DKB分子を使用して標識した核酸を、製造業者によって推奨される精製プロトコルを使用して、QiaQuickカラム(PCR精製キット、Qiagen)で精製した。
溶出量は100μlである。
市販のキットを使用して核酸を標識する場合、Kreatechにより推奨され提供されている精製を使用した。
最終体積は30μlであり、その会社によって推奨される100μlのブロッキング溶液を添加する。
精製に続いて、標識化核酸を、400μlのハイブリダイゼーション・バッファー(BBP、p−NO2−DKB又はm−NO2−DKB)か、370μlのハイブリダイゼーション・バッファー(Kreatech)に移す。
前記核酸を、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの16SRNAの「GenBank」M20940配列の解析用に設計されたDNAチップにハイブリダイズさせる。
このDNAチップはA. Troesch et al(J. Clin. Microbiol., 37(1), PP49-55, 1999)によって記載されている。
ハイブリダイゼーション工程は、A. Troesch et alの上記刊行物に記載されているハイブリダイゼーションプロトコルとバッファーを利用して、FS 450 fluidics stations (Affymetrix, Santa Clara, Californie, USA)で実施する。
ハイブリダイゼーションは、フィコエリトリン(PE)で標識されたストレプトアビジン(SA)の結合が、以下の条件下で使用された標識のビオチンと相互作用することで明らかにされる:300μlの純水;300μlの100mMトリスバッファー(pH7)/1MのNaCl/0.05%のTween20/0.005%の消泡剤;6μlのBSA(50mg/ml);6μlのSA−PE(300μg/ml)。
標識化とハイブリダイゼーションの後で、DNAチップの表面に放出される蛍光の読取り、及びシグナル強度と相同性パーセンテージ用データの作成を、Affymetrixから提供される読取りシステムとソフトウェアによって実施する(Gene Chip Array及びGCOSソフトウェア)。
読取りシステムは、rfu(相対的蛍光単位)で表示されるシグナル強度とバックグラウンド・ノイズ強度を示す。
相同性パーセンテージをリファレンス配列(この場合はマイコバクテリウム・ツベルクローシスの配列)と比較して示す。
シグナルの正中の強度(Med)、バックグラウンド・ノイズの正中の強度(Med Bckgd)、及び相同性パーセンテージ(%BC)を、標識BBP、m−NO2−DKB及びp−NO2−DKBについて、及び競合社のキットについて図9のグラフに示す。
Kreatechの場合は、バックグラウンド・ノイズ(図9)から明確に分けられるシグナルを得るためには4倍以上の濃度のRNAを加える必要であるが、全ての場合でDKB又はBBP分子により生成される標識より10倍以上弱いままであるので、Kreatech(供給者によって記載されている条件を正確に適用する)のcis-platin標識を使用する技術は本発明によって提供される技術的解決法よりも非常に低い標識能力を有することがわかった。
全ての場合において、同一性パーセンテージ(%BC)は同じままである。
従って、他の標識化技術と比較して、インター・ヌクレオシド結合上の標識化は、分子の生成にかかわりなく、非常により良好な検出感度を得ることを可能にする。
Claims (17)
- 式(A):
[式中、
・R1は、1つの検出可能な標識、または少なくとも1つの多量体構造によって互いに結合される少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・R2及びR3は、互いに独立であって、H、NO2、Cl、Br、F、I、R4-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR又はCOORを表わし、ここでRがアルキル又はアリールであり、R4が1つの検出可能な標識、または少なくとも1つの多量体構造によって互いに結合される少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・Lは、少なくとも2つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、
・nは1に等しい整数であり
・Aは、ジアゾ官能基の芳香環との共役を可能にする少なくとも一つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、
・uは0と2との間の整数である]
の標識化試薬。 - 式(C):
[式中、
・R1は、1つの検出可能な標識、または少なくとも1つの多量体構造によって互いに結合される少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・R2及びR3は、互いに独立であって、H、NO2、Cl、Br、F、I、R4-(L)n-Y-X-、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR又はCOORを表わし、ここでRがアルキル又はアリールであり、R4が1つの検出可能な標識、または少なくとも1つの多量体構造によって互いに結合される少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・Lは、少なくとも2つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、
・nは1に等しい整数である]
の請求項1に記載の標識化試薬。 - ニトロ基がメタまたはパラ位にあることを特徴とする請求項1から3の何れか一項に記載の試薬。
- a)カルボン酸誘導体をラクトンのエノラートと反応させ(クライゼン縮合)、環状前駆体を形成すること、
b)前記環状前駆体をハロゲン酸によって開き、続いてハロゲン化芳香族ケトンを形成すること、
c)ハロゲン化芳香族ケトンのカルボニル官能基を保護基によって保護し、被保護前駆体を形成すること、
d)前記被保護前駆体にアミノ化反応(ガブリエル反応)を受けさせ、アミノ化前駆体を形成すること、
e)前記アミノ化前駆体をアミン官能基を解放するために脱保護し、前記アミン官能基を検出可能な標識と反応させ、そのカルボキシル官能基を活性化し、検出可能な標識を含む前駆体を形成すること、
f)標識された前駆体は、カルボニル官能基の脱保護のための反応を受けさせ、標識されたカルボニル化前駆体を形成すること、及び最後に
g)標識されたカルボニル化前駆体を、カルボニル官能基のジアゾ官能基(バンフォード・スティーヴンズ反応)への変換によって請求項1から5の何れか一項に記載の標識化試薬に変換する工程を含む、
請求項1から5の何れか一項に記載の標識化試薬を合成する方法。 - 実質的水性緩衝液の均一溶液において、請求項1から5の何れか一項に記載の試薬と生体分子を接触させることを含む 、生体分子、特に核酸を標識する方法。
- 請求項7に記載の方法によって得られる標識された生体分子。
- ・核酸を断片化すること;
・請求項1から5の何れか一項に記載の試薬から選択される標識化試薬を介して、標識を断片のうちの少なくとも1つに取り付け、前記試薬は前記断片の少なくとも一つのリン酸に共有結合により優勢的に結合させる工程
を含む、一本鎖又は二本鎖核酸を断片化し且つ標識する方法。 - 断片化と標識化が2工程で実施されることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 断片化と標識化が1工程で実施されることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 標識化が実質的水性均一溶液において行われること特徴とする、請求項9から11の何れか一項に記載の方法。
- 断片化が、酵素的に、物理的に、又は化学的に実施されることを特徴とする、請求項9から11の何れか一項に記載の方法。
- 請求項9から13の何れか一項に記載の方法によって得られる標識された核酸。
- 請求項14に記載の標識された核酸を含む、標的核酸を検出するためのキット。
- 請求項1から5の何れか一項に記載の試薬をその上に結合している、固体支持体。
- 核酸を捕獲する方法であって、
・直接または間接的に、請求項8に記載の少なくとも一つの生体分子又は請求項14に記載の核酸、ジアゾメチル官能基を有する核酸又は生体分子を結合させた固体支持体を提供すること、
・前記支持体に遊離した核酸を含みうる生物試料を接触させること、及び
・分子が共有結合で少なくとも核酸に結合されている前記固体支持体を洗浄する工程を含む方法。
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