JP2010526025A - スルホニルセミカルバジド、カルボニルセミカルバジド、セミカルバジドおよび尿素、その薬学的組成物、ならびにアレナウイルスに関連する感染を含む、出血熱ウイルスを治療するための方法。 - Google Patents

スルホニルセミカルバジド、カルボニルセミカルバジド、セミカルバジドおよび尿素、その薬学的組成物、ならびにアレナウイルスに関連する感染を含む、出血熱ウイルスを治療するための方法。 Download PDF

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Abstract

特定の新規スルホニルセミカルバジド、カルボニルセミカルバジド、セミカルバジド、尿素および関連化合物を療法的有効量で投与することによって、ウイルス感染を治療するための化合物、方法および薬学的組成物を開示する。化合物を調製するための方法、ならびに化合物およびその薬学的組成物を用いる方法もまた開示する。特に、出血熱ウイルス、すなわち限定されるわけではないが、アレナウイルス科（フニン、マチュポ、グアナリト、サビア、ラッサ、タカリベ、ピチンデ、およびＶＳＶ）、フィロウイルス科（エボラおよびマールブルグウイルス）、フラビウイルス科（黄熱病、オムスク出血熱およびキャサヌール森林病ウイルス）およびブニヤウイルス科（リフトバレー熱）を含むウイルスによって引き起こされるものなどのウイルス感染の治療および予防を提供する。
【選択図】図５

Description

本出願は、２００４年１２月６日出願の米国仮特許出願第６０／６３２，９９０号に優先権を請求する、２００５年１２月６日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４３９３１号の一部継続出願であり、そして該出願に優先権を請求する。どちらの優先出願もその全体がすべての目的のために本明細書に援用される。
連邦政府が資金援助した研究または開発に関する言及
本発明は、一部、米国政府（米国国立衛生研究所ＳＢＩＲ助成番号第１ Ｒ４３ ＡＩ０５６５２５−０１号、第Ｒ４３ ＡＩ０５６５２５−０２号、および第Ｒ４４ ＡＩ０５６５２５−０４号）からの基金によって援助され、そしてしたがって米国政府は、本発明において、特定の権利を有しうる。
分野
ウイルス感染およびそれに関連する疾患の治療または予防のための、スルホニルセミカルバジド、カルボニルセミカルバジド、セミカルバジド、および尿素、ならびにその誘導体および類似体、ならびに該化合物を含有する薬学的組成物の使用。特に、アレナウイルスなどの出血熱ウイルスによって引き起こされるウイルス感染および関連疾患が治療可能である。
出血熱ウイルスは、科学的文献中に論じられてきている。以下の刊行物、特許、および特許出願は、上付き数字として、本出願中に引用される：
本出願に引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にそして個々に、その全体が本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いまで、その全体が本明細書に援用される。
米国アレルギー感染病研究所（ＮＩＡＩＤ）および米国疾病対策予防センター（ＣＤＣ）は、多数のウイルスをバイオテロリズムの潜在的因子と分類してきている（ｗｗｗ．ｂｔ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ａｇｅｎｔ／ａｇｅｎｔｌｉｓｔ−ｃａｔｅｇｏｒｙ．ａｓｐ）。最高の脅威因子、カテゴリーＡ病原体は、悪意のある方式で使用されたならば、公衆衛生に対する不都合な影響および大量の死傷者を生じる潜在的可能性が最も高い。カテゴリーＡ病原体内には、高い症例致死率で、ウイルス性出血熱を引き起こしうるいくつかのウイルスがある。カテゴリーＡ出血熱ウイルスは：１）エアロゾルを通じて散布可能であり；２）低用量（１〜１０のプラーク形成単位（ｐｆｕ））で疾患を引き起こすことが可能であり；３）深刻な罹患率および死亡率を引き起こし（１５〜３０％の症例致死率）；４）一般住民において、恐怖およびパニックを引き起こす可能性もあり；５）米国で認可された有効なワクチンまたは特異的抗ウイルス薬が入手可能でなく；６）これらの病原体は容易に入手可能であり、そして容易に多量に産生可能であり；そして７）多様な出血熱ウイルスの兵器化に関する研究が行われてきているため、潜在的な生物学的兵器として、深刻な脅威を課す１。
アレナウイルスは、どちらもアンビセンスコード配置を持つ、小セグメント（Ｓ、３．５Ｋｂ）および大セグメント（Ｌ、７．５Ｋｂ）と称される２つの一本鎖ＲＮＡセグメントからなるゲノムを伴う、エンベロープ化ウイルスである３６。Ｓ ＲＮＡセグメントは、主要構造タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）および２つのエンベロープ糖タンパク質（外部ＧＰ１および膜貫通ＧＰ２）をコードする前駆体エンベロープタンパク質（ＧＰＣ）をコードし１８、２４、３０、３１、そしてＬ ＲＮＡセグメントは、ＲＮＡポリメラーゼタンパク質Ｌおよび制御機能を持つと推定される１１ＫＤａタンパク質のＺタンパク質をコードする１９。四量体表面糖タンパク質スパイクを形成するＧＰ１およびＧＰ２は、ターゲットとされる宿主細胞内へのウイルスの侵入に関与する。
アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）は、ヒトにおいて重度の出血熱疾患を引き起こすいくつかのウイルス（現在２３の認識されるウイルス１）を含む、単一の属（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）からなる２。アレナウイルス科は、配列に基づく系統発生学にしたがって２群に分けられている。アフリカから生じた「旧世界」群には、ヒト病原体リンパ球脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）ウイルスおよびラッサウイルスが含まれる。ラテンアメリカから生じた「新世界」群は、３つのクレードに分けられる。クレードＢには、タカリベおよびアマパリウイルスに加えて、カテゴリーＡヒト病原性ウイルス、フニン（アルゼンチン出血熱）、マチュポ（ボリビア出血熱）、グアナリト（ベネズエラ出血熱）、およびサビア（ブラジル出血熱）が含まれる。これらのカテゴリーＡウイルスは、ヒトにおいて重度でそしてしばしば致死性の出血熱疾患を引き起こすことが可能である。
げっ歯類がアレナウイルスの天然宿主であるが、タカリベウイルスはコウモリで見出される。アレナウイルスは、天然宿主において、慢性のウイルス血症感染を特徴的に生じ１５、該宿主が次に、ウイルスを尿および糞便中に排出し、最終的に、エアロゾル、あるいは皮膚擦過または切傷との直接接触のいずれかによって、これらの感染物質と緊密に接触したヒトを感染させる。ヒト疾患の自然経過は、ウイルスの病原性、地理的分布、げっ歯類保有宿主の生息環境および習性、ならびにヒト−げっ歯類相互作用の性質によって決定される２１。
いくつかのアレナウイルス属は、ヒトにおける重度の出血性疾患と関連する。ラッサウイルス（旧世界群由来）は、ラッサ出血熱の原因であり、一方、新世界群由来の４つのウイルス（すべてクレードＢ由来）は、ヒトにおいて重度の出血熱を引き起こす。これらのウイルスは：アルゼンチン出血熱の原因であるフニンウイルス、ボリビア出血熱の原因であるマチュポウイルス、およびベネズエラ出血熱の原因であるグアナリトウイルスである。サビアウイルスは、ブラジルにおいて、出血熱の致死性の症例から単離された。ラッサウイルスは、年間１００，０００〜３００，０００の感染およびおよそ５，０００の死亡を引き起こすと概算される５。これまでに、フニン感染の推定３０，０００の立証された症例が記録されており、一方、マチュポは約２，０００、グアナリトは２００、そしてサビアはわずか２例である１。
生物兵器としてのアレナウイルス属の使用に関する最近の懸念から、これらのウイルスをターゲットとする小分子療法剤を開発する必要性が強調されてきている１。これらのウイルスに向けられた抗ウイルス薬剤が利用可能であれば、生物兵器因子としての該ウイルスの使用に対して、治療および強い抑止力が提供されるであろう。抗ウイルス薬剤は、容易に投与され（経口、丸剤または液体）、そして投与数時間以内にその抗ウイルス効果を発揮するため、罹患患者を効果的に治療し、病原体に曝露されたと推測される患者を防御し（曝露後予防）、そして突発の適時封じ込めを補助するのに役立つであろう。
現在、アレナウイルス属出血熱に対して使用するために認可されたウイルス特異的治療はない。現在の疾患管理は、一般的な対症療法からなる：流体、電解質および浸透圧不均衡の監視および修正、ならびに凝固因子または血小板置換での出血の治療。回復期免疫血清療法は、フニンおよびマチュポウイルス疾患の症例を治療する際に有効でありうるが、こうした血清の入手可能性は非常に限られている。
ヌクレオシド類似体であるリバビリンは、ラッサ熱患者において用いられ、ある程度の成功を収めてきた。小規模試験において、熱を生じた最初の６日以内に患者に投与された静脈内リバビリンは、死亡率を７６％から９％に減少させた７−９。アルゼンチン出血熱患者１８人の対照試験は、非治療患者での４０％に比較して、治療した患者では１３％の死亡率を生じた１０。リバビリン療法は、用量に関連する可逆的溶血性貧血を含む副作用と関連し、そしてまた、いくつかの動物種において、催奇性および胚致死性も立証されている。したがって、妊娠中には禁忌を示す、妊娠カテゴリーＸ薬剤と分類されている。静脈内リバビリンは、ＦＮＤ適用下での例外的使用のため、米国においては限られた供給量でしか入手可能でない。ラッサ熱症例で用いられたリバビリン療法の投薬措置は、最初に３０ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）装填用量、その後、６時間ごとに４日間、１６ｍｇ／ｋｇ ＩＶ；次いで、８時間ごとに６日間、８ｍｇ／ｋｇ ＩＶ（総治療日数１０日間）からなる。成人男性の治療コストはおよそ＄８００である。リバビリンの特性から、該薬剤は、アレナウイルス属出血熱の治療に理想的とは言えない。
アレナウイルス属複製のいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害剤が文献に報告されてきており、これにはフェノチアジン、トリフルオロペラジンおよびクロルプロマジン１、アマンタジン１２、１３、ブラシノステロイド１４ならびにアクチノマイシンＤ１５が含まれる。これらの化合物の抗アレナウイルス属活性は、一般的に弱く、そして非特異的である。
ワクチン開発に向けて研究が行われている唯一のアレナウイルス属出血熱は、フニンウイルスによって引き起こされるアルゼンチン出血熱（ＡＨＦ）である。カンディド１と呼ばれる、生きた弱毒化ワクチンが、ＡＨＦ流行地における農業従事者間の対照試験において評価されてきており、この試験では、深刻な副作用を伴わずに、ＡＨＦ症例数報告が減少するようであった１６。カンディド１ワクチンが、他のアレナウイルス属出血熱に対して有用であるかどうかは未知であり、そしてこのワクチンは米国では入手可能でない。
タカリベウイルスは、バイオセイフティレベル２（ＢＳＬ２）の新世界アレナウイルス（ＮＷＡ）であり、クレードＢに見出され、そして系統発生的にカテゴリーＡ ＮＷＡ（フニン、マチュポ、グアナリトおよびサビア）に関連する。タカリベウイルスは、４つのウイルスタンパク質すべてに関して、アミノ酸レベルで、フニンウイルスに６７％〜７８％同一である。ＮＷＡの阻害剤をスクリーニングするため、カテゴリーＡ ＮＷＡの代理としてタカリベウイルスを用いて、ウイルス複製に関するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを開発した。このＨＴＳアッセイを用いて、４００，０００の小分子ライブラリーをスクリーニングした。薬剤特性に基づいてリードシリーズを選択し、そして反復化学を通じてこのシリーズを最適化し、その結果、ヒト病原性ＮＷＡ（フニン、マチュポ、グアナリトおよびサビア）に対する選択的活性を持つ、タカリベウイルスの高活性でそして特異的な小分子阻害剤を同定した。この分子は、新生マウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏ抗アレナウイルス活性の立証を可能にする、好ましい薬物動態学的特性を示す。
出血熱を引き起こす新世界群由来のすべてのヒト病原体アレナウイルスはクレードＢ由来である。これらのヒト病原体ウイルスは、高レベル封じ込め（ＢＳＬ−４）下での操作を必要とする。しかし、やはりクレードＢ由来のアマパリおよびタカリベウイルスは、ＢＳＬ−２（低レベル）封じ込め下の組織培養中で増殖可能である。低レベル封じ込め下での作業は、これらのウイルスを用いた実験をより容易にしそしてより安全にする。アマパリウイルスは、低い細胞変性効果を生じる一方、タカリベウイルスは、細胞培養中で容易に増殖し、そして４〜６日で、頑強なＣＰＥを生じることも可能である。このＣＰＥは、ウイルス複製に直接関連するため、細胞培養においてウイルス複製を阻害する化合物は、ウイルス誘導性ＣＰＥからの防御を与えるものとして、容易に同定可能である（しかし、ウイルス複製を阻害せずにＣＰＥを阻害することは理論的には可能である）。さらに、タカリベウイルスに対する同定された活性を有する化合物はまた、これらのウイルス間の高い度合いの相同性（完全同一性を持つタンパク質の長いストレッチを伴い、フニンウイルスに比較すると、タカリベウイルスのすべての４つのタンパク質に関して、およそ７０％の同一性）を考慮すると、出血熱を引き起こすアレナウイルス属ヒト病原体（フニン、マチュポ、グアナリトおよびサビア）に対してもまた、活性であるようである。
当該技術分野に必要であるのは、アレナウイルス属のような出血熱ウイルスによって引き起こされるものなどのウイルス感染および関連疾患の治療のための新規療法および予防法である。
ウイルス感染、ならびに生存宿主におけるウイルス感染に関連する疾患の治療および予防のための化合物および組成物および／または方法を提供する。特に、アレナウイルス属などの出血熱ウイルスの治療および予防のための化合物および組成物および／または方法を提供する。
１つの態様において、本明細書において、ウイルス感染または該感染に関連する疾患の治療または予防のための方法であって、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容されうる塩を、こうした方法を必要とする哺乳動物に療法的有効量で投与する工程を含む、前記方法を提供する。別の態様において、薬学的有効量の化合物またはその薬学的に許容されうる塩、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物を提供する。さらに、式Ｉの化合物、ならびにその薬学的に許容されうる塩を提供する。
式Ｉの化合物には
式中
ｎは０〜６の整数であり；
ｍは０〜１の整数であり；
ｐは０〜１の整数であり；
Ｒ１は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択され；
Ｒ２は、置換または非置換フェニル、置換および非置換アリール、置換および非置換ヘテロアリール、置換または非置換アルキル、置換または非置換分枝アルキル、ならびに置換または非置換不飽和シクロへテロアルキルからなる群より選択されるか；
あるいはＲ１およびＲ２が一緒に合わせて置換または非置換Ｃ４−１０環状飽和ヘテロアルキルを形成し；
Ｒ３は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択される
の化合物；またはその薬学的に許容されうる塩が含まれる。
式Ｉの他の化合物には：
式中
Ｒ２は、置換または非置換フェニル、置換および非置換アリール、置換および非置換ヘテロアリール、置換または非置換アルキル、置換または非置換分枝アルキル、ならびに置換または非置換不飽和シクロへテロアルキルからなる群より選択される
の化合物、またはその薬学的に許容されうる塩が含まれる。
式Ｉのさらなる化合物には：
式中
Ｒ１は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択され；
Ｒ２は、置換または非置換フェニル、置換および非置換アリール、置換および非置換ヘテロアリール、置換または非置換アルキル、置換または非置換分枝アルキル、ならびに置換または非置換不飽和シクロへテロアルキルからなる群より選択されるか；
あるいはＲ１およびＲ２が一緒に合わせて置換または非置換Ｃ４−１０環状飽和ヘテロアルキルを形成する
の化合物；またはその薬学的に許容されうる塩が含まれる。
他の態様において、式Ｉの化合物において、ｎは０または１である。また、他の態様において、式Ｉの化合物において、ｍは１であり、そしてｐは１であるか、あるいはｍは０であり、そしてｐは０である。
さらなる態様において、式Ｉにおいて、Ｒ１およびＲ２は、一緒に合わせて：
からなる群より選択される置換または非置換Ｃ４−１０環状飽和ヘテロアルキルを形成する。
さらにさらなる態様において、式Ｉにおいて、Ｒ２は：
式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、各々：水素、アセチル、メトキシ、トリフルオロメチル、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、アシルアミノ、メチル、スルホンアミド、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、シアノおよび１，１，２，２−テトラフルオロエトキシからなる群より独立に選択される
からなる群より選択される。
特に、特定の態様は：
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−（フェニル）−フェニルスルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−（２−メチル−２−プロピル）−フェニルスルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［７−（４−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［５−（１−ジメチルアミノ−ナフチル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２，４，６−トリメチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３−クロロ−６−メトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３，６−ジメトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−（４−［１，２，３］チアジアゾリル）フェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３−ブロモフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−ブロモフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−メチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−メトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−ジフルオロメトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３−フルオロ−４−クロロ−フェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−トリフルオロメトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−フルオロ−フェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３−メトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２−メチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３−トリフルオロメチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２，４−ジメトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［２−（５−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾリル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３−メチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−トリフルオロメチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２−トリフルオロメチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［４−（ピロリジン−１−スルホニル）フェニルスルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２−クロロフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［２−（５−モルホリン−４−イル）ピリジルスルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２−トリフルオロメトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２，４−ジクロロフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［フェニルスルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３−ジフルオロメトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３−シアノフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−シアノフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［５−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−１−メチルヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３−フルオロフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３，４−ジフルオロフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２，４−ジメチルチアゾール−５−イル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−アセチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２，６−ジフルオロフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２−フルオロフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２，５−ジフルオロフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−メチルフェニル）スルホニル］−２−メチルヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２，６−ジクロロフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（２，６−ジトリフルオロメチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−メチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−メチルカルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（３，５−ジメチルイソキサゾール−５−イル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−ニトロフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（１−メチルイミダゾール−４−イル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［メチルスルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド；
４−フェニルピペラジン−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−カルボキサミド；
４−モルホリノ−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−カルボキサミド；
１−（２−アセチルフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−ピペリジノ−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−カルボキサミド；
１−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−尿素；
１−（４−トリフルオロメチルフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
４−メチルピペラジン−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−カルボキサミド；
１−ナフタレン−１−イル−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（４−クロロフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
４−フェニルピペリジン−１−イル−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−カルボキサミド；
１−（２−フェニル（フェニル））−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２，６−ジフルオロフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
２−［３−（１，１−ビス−トリフルオロメチルエチル）−ウレイド］ベンズアミド；
１−（２−クロロ−６−フルオロフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
２−［３−（１，１−ビス−トリフルオロメチルエチル）−ウレイド］ベンゼンスルホンアミド；
１−（２，２，３，３−テトラフルオロ−２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−５−イル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（３−トリフルオロメトキシフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（４−トリフルオロメトキシフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
４−メチル−１−ピペリジン−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−カルボキサミド；
１−ナフタレン−２−イル−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２−フルオロフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２，６−ジメトキシフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
３−トリフルオロメトキシ−４−［３−（１，１−ビス−トリフルオロメチルエチル）−ウレイド］安息香酸；
１−フェニル−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（３−シアノフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（３−メトキシフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２−（１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ）フェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
３−［３−（１，１−ビス−トリフルオロメチルエチル）−ウレイド］ベンゼンスルホンアミド；
１−（３−フルオロフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（４−ブロモフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２−シアノフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（４−シアノフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２，２−ジフルオロベンゾ［１，３］ジオキソール−４−イル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（４−クロロフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（３−メチルフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
４−［３−（１，１−ビス−トリフルオロメチルエチル）−ウレイド］ベンゼンスルホンアミド；
１−（２，６−ジブロモフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２−メチルフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（４−メチルフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−ピロリジニル−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−カルボキサミド；
１−（４−フルオロフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２，４−ジブロモフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
アゼパン−１−カルボン酸（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−アミド；
１−（４−ブロモ−２−トリフルオロメトキシフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２−トリフルオロメトキシフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２−トリフルオロメチルフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；
１−（２−メトキシフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−尿素；および
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−１−メチルプロピル）−２−［（４−ジフルオロメトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド
からなる群より選択される式Ｉの化合物に関する。
別の態様において、ウイルス感染または該感染に関連する疾患の治療または予防のための方法であって、式ＩＩの化合物またはその薬学的に許容されうる塩を、こうした方法を必要とする哺乳動物に療法的有効量で投与する工程を含む、前記方法を提供する。別の態様において、薬学的有効量の化合物またはその薬学的に許容されうる塩、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物を提供する。さらに、式ＩＩの化合物、ならびにその薬学的に許容されうる塩を提供する。
式ＩＩの化合物には
式中
ｎは０〜６の整数であり；
ｍは０〜１の整数であり；
Ｒ１は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択され；
Ｒ２は、置換または非置換フェニル、置換および非置換アリール、置換および非置換ヘテロアリール、置換または非置換アルキル、置換または非置換分枝アルキル、ならびに置換または非置換不飽和シクロへテロアルキルからなる群より選択されるか；
あるいはＲ１およびＲ２が一緒に合わせて置換または非置換Ｃ４−１０環状飽和ヘテロアルキルを形成し；
Ｒ３およびＲ４は、Ｈおよびアルキルからなる群より独立に選択される
の化合物；またはその薬学的に許容されうる塩が含まれる。
特に、特定の態様は：
２−［２，５−ビス（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ベンゾイル］−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
２−（１，１'−ビフェニル−４−イルカルボニル）−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（１−ナフトイル）ヒドラジンカルボキサミド；
２−（１，１'−ビフェニル−２−イルカルボニル）−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−メチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２−ナフトイル）ヒドラジンカルボキサミド；
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（３，４−ジクロロベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−ブロモベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−イソプロピルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（３，５−ジメチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（メシチルカルボニル）ヒドラジンカルボキサミド；および
Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（５−クロロ−２−メトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド
からなる群より選択される式ＩＩの化合物に関する。
１つの態様において、治療される哺乳動物はヒトである。特定の態様において、治療されるウイルス感染は、アレナウイルス属などの出血熱ウイルスである。アレナウイルス属は、フニン、マチュポ、グアナリト、サビア、ラッサ、タカリベ、ピチンデ、およびＶＳＶからなる群より選択されてもよい。
方法および配合の詳細を、以下により完全に記載する。
図１は、ＳＴ−３３６の化学構造、式、および分子量を提供する。 図２は、タカリベウイルス収量およびプラーク形成に対するＳＴ−３３６添加時間の影響を示す。図２Ａにおいて、Ｖｅｒｏ細胞をＭＯＩ＝０．０１でタカリベウイルスに感染させた。タカリベ感染前または感染中に、ＳＴ−３３６を添加した（感染の−１、３、６、９、１２、１５、１８または２１時間後）。感染２４時間後、プラークアッセイによってウイルス収量を決定した。図２Ｂにおいて、Ｖｅｒｏ細胞を４００ｐｆｕタカリベウイルスに感染させた。ＳＴ−３３６を感染前に１時間（−１）、吸着中に１時間（０）、そして感染後に１時間（＋１）、添加した。感染した単層をＰＢＳで洗浄し、そしてアガロースを含有する培地を重層した。感染５日後、細胞をグルタルアルデヒド固定し、そしてクリスタルバイオレット染色した後、プラークを計数した。 図３は、ＳＴ−３３６が、細胞の非存在下で、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）タカリベビリオンに対して緩慢なＫｏｆｆで結合することを示す。図３Ａにおいて、プレーティング前のウイルス希釈スキームの略図を提供する。ウイルスをＳＴ−３３６と混合し、そして希釈する（左側）か、またはウイルスを希釈し、そして希釈後にＳＴ−３３６を添加した（右側）。図３Ｂにおいて、Ｖｅｒｏ細胞上に図３Ａに示す各希釈をプレーティングした後に生じたプラークの写真を提供する。 図４は、ＳＴ−３３６薬剤耐性変異体（「ＤＲＶ」）のマッピングを示す。図４Ａにおいて、シグナルペプチド（「ＳＰ」）、膜貫通ドメイン（「ＴＭ」）、ＧＰ１およびＧＰ２間の切断部位（Ｋ２６１−Ａ２６２）の位置、４つのＳＴ−３３６耐性突然変異体の位置（「ＤＲ＃１〜４」）、ならびに各々のアミノ酸変化を示す、糖タンパク質前駆体（「ＧＰＣ」）の直線マップを提供する。図４Ｂにおいて、野生型ＮＷＡおよびＳＴ３３６ ＤＲＶ由来のＧＰ２のアミノ酸配列並列を示す。膜貫通ドメイン（垂直線によって印を付ける）を含有するＧＰ２のＣ末端部分のアミノ酸配列（アミノ酸３９７〜４５７）、ＤＲ＃１〜４に関する突然変異の位置（下線）、およびアマパリにおけるアミノ酸相違（太字）を示す。 図５は、ＳＴ−２９４の化学構造、式、および分子量を提供する。 図６は、タカリベウイルスに曝露された新生マウスにおけるＳＴ−２９４の効果を示す。４日齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを３０ｘＬＤ５０タカリベウイルスにＩＰ感染させ、そしてビヒクル（対照）、２５ｍｇ／ｋｇのリババリン、５０ｍｇ／ｋｇで１日２回（ＢＩＤ）または１００ｍｇ／ｋｇで１日１回（ＳＩＤ）のＳＴ−２９４で治療した。感染９日後および１０日後の各治療群における生存者パーセントを図６に示す。
ウイルス感染、ならびに生存宿主におけるウイルス感染に関連する疾患の治療および予防に有用な化合物を提供する。特に、アレナウイルス属などの出血熱ウイルスの治療および予防のための化合物および組成物および／または方法を提供する。しかし、さらなる詳細を提供する前に、以下の用語をまず定義する。
定義
この詳細な説明にしたがって、以下の略語および定義を適用する。本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数の指示対象が含まれることに注目しなければならない。
本明細書に論じる刊行物は、単にその開示に関して提供される。本明細書の何ものも、先行する刊行物に関する承認とは見なされないものとする。さらに、提供する刊行日は、実際の刊行日とは異なる可能性もあり、これは、独立に確認する必要がある可能性もある。
値の範囲を提供する場合、間にある値各々が含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立に、このより小さい範囲に含まれてもよく、これは言及する範囲における、特に排除される限界のいずれにも制約される。言及する範囲に一方または両方の限界が含まれる場合、これらの一方または両方の含まれる限界を排除した範囲もまた、本発明に含まれる。引用する範囲内に属するいかなる値もまた、意図される。
別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、一般の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書記載のものと類似かまたは同等のいかなる方法および物質もまた、実施または試験に使用可能である。本明細書に言及する刊行物はすべて、該刊行物が引用されたものと関連して、方法および／または物質を開示し、そして記載するために援用される。
「患者」または「被験体」によって、任意の哺乳動物を含むよう意味する。治療の目的のため、「哺乳動物」は、限定されるわけではないが、ヒトや、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、マウス、モルモット等の、家畜および農場動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペット動物を含む、哺乳動物として分類されるいかなる動物も指す。
用語「効能」は、本明細書において、長期投薬措置に関連して、特定の治療措置の有効性を指す。効能は、剤に反応した疾患の経過の変化に基づいて、測定可能である。
用語「成功」は、本明細書において、長期治療措置に関連して、特定の治療措置の有効性を指す。これには、効能、毒性（例えば配合物または投薬単位の副作用および患者寛容性）、患者コンプライアンス等のバランスが含まれる。長期投与措置が「成功」と見なされるためには、患者ケアおよび効能の異なる側面のバランスをとって、好ましい患者転帰を生じなければならない。
用語「治療すること」、「治療」等は、本明細書において、所望の薬理学的効果および生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患、その症状、または状態を防止するかまたは部分的に防止するという観点で、予防的であってもよいし、そして／または、疾患、状態、症状、または疾患に起因する不都合な影響を部分的にまたは完全に治癒させるという観点で、療法的であってもよい。用語「治療すること」および「治療」は、本明細書において、ヒトなどの哺乳動物における疾患のいかなる治療も含み、そして：（ａ）疾患に罹患しやすい可能性があるが、その疾患を有するとはまだ診断されていない被験体において、疾患が生じるのを防止すること、すなわち、疾患に罹患しやすい可能性があるが、該疾患の症状をまだ経験せず、また示していない被験体において、疾患の臨床的症状が発展しないようにすること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち疾患またはその臨床的症状の発展を抑止するかまたは減少させること；および（ｃ）疾患を軽減させること、すなわち、疾患および／またはその症状または状態の退行を引き起こすことを含む。病理学的炎症に関連する疾患に苦しむ患者の治療が意図される。長期間に渡る病理学的炎症に起因する副作用、ならびに／あるいは長期間に渡って生物学的系に存在する不適切な炎症に対する生理学的反応によって引き起こされる副作用を防止するか、阻害するか、または軽減することもまた、意図される。
本明細書において、「アシル」は、基、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−、アルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）−、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、アリール−Ｃ（Ｏ）−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）、複素環−Ｃ（Ｏ）−、および置換複素環−Ｃ（Ｏ）−を指し、式中、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環は本明細書に定義するとおりである。
「アシルアミノ」は、基、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲであって、式中、各Ｒが、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環からなる群より独立に選択される前記−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、および各Ｒが連結されて、窒素原子と一緒に複素環または置換複素環を形成する前記−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲを指し、式中、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環は本明細書に定義するとおりである。
「アルケニル」は、好ましくは２〜１０炭素原子、そしてより好ましくは２〜６炭素原子を有し、そして少なくとも１部位そして好ましくは１〜２部位のアルケニル不飽和を有するアルケニル基を指す。
「低次アルケニル」は、好ましくは２〜６の炭素原子を有し、そしてアルケニル不飽和（すなわち＞Ｃ＝Ｃ＜）の少なくとも１つの部位を有し、そして好ましくは１つの部位しか持たない、アルケニル基を指す。この用語は、アリル、エテニル、プロペニル、ブテニル等の基によって例示される。
「置換アルケニル」は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、チオカルボニルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミジノ、アルキルアミジノ、チオアミジノ、アミノアシル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールオキシアリール、置換アリールオキシアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、カルボキシル、カルボキシルアルキル、カルボキシル−置換アルキル、カルボキシル−シクロアルキル、カルボキシル−置換シクロアルキル、カルボキシルアリール、カルボキシル−置換アリール、カルボキシルヘテロアリール、カルボキシル−置換ヘテロアリール、カルボキシル複素環、カルボキシル−置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、グアニジノ、グアニジノスルホン、チオール、チオアルキル、置換チオアルキル、チオアリール、置換チオアリール、チオシクロアルキル、置換チオシクロアルキル、チオヘテロアリール、置換チオヘテロアリール、チオ複素環、置換チオ複素環、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、オキシカルボニルアミノ、オキシチオカルボニルアミノ、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、−ＯＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−複素環、−ＯＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＯＳＯ２−ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換複素環、式中、Ｒは水素またはアルキルである、モノ−およびジ−アルキルアミノ、モノ−およびジ−（置換アルキル）アミノ、モノ−およびジ−アリールアミノ、モノ−およびジ−置換アリールアミノ、モノ−およびジ−ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−置換ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−複素環アミノ、モノ−およびジ−置換複素環アミノ、非対称ジ−置換アミンであって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環からなる群より独立に選択される異なる置換基を有する前記非対称ジ−置換アミン、ならびにＢｏｃ、Ｃｂｚ、ホルミル等の慣用的なブロッキング基によってブロッキングされているアミノ基を有する置換アルケニル基、あるいは−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アルケニル、−ＳＯ２−置換アルケニル、−ＳＯ２−シクロアルキル、−ＳＯ２−置換シクロアルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−置換アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、−ＳＯ２−置換ヘテロアリール、−ＳＯ２−複素環、−ＳＯ２−置換複素環および−ＳＯ２ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、で置換されているアルケニル／置換アルケニル基からなる群より独立に選択される、１〜５の置換基を有するアルケニル基を指す。
「アルコキシ」は、基「アルキル−Ｏ−」を指し、これには例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、１，２−ジメチルブトキシ等が含まれる。
「置換アルコキシ」は、基「置換アルキル−Ｏ−」を指す。
「アルキル」は、１〜１０炭素原子、あるいは１〜６炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基を指す。この用語は、メチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、オクチル等の基に例示される。
「低次アルキル」は、直鎖および分枝鎖アルキル基を含む、１〜５炭素原子を有する一価アルキル基を指す。この用語は、メチル、エチル、イソ−プロピル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル等の基によって例示される。「低次アルキル」は、クロロ、フルオロ、ブロモ等のハロゲンで場合によって置換されていてもよい。
「置換アルキル」は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、チオカルボニルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミジノ、アルキルアミジノ、チオアミジノ、アミノアシル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールオキシルアリール、置換アリールオキシアリール、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、カルボキシル、カルボキシルアルキル、カルボキシル−置換アルキル、カルボキシル−シクロアルキル、カルボキシル−置換シクロアルキル、カルボキシルアリール、カルボキシル−置換アリール、カルボキシルヘテロアリール、カルボキシル−置換ヘテロアリール、カルボキシル複素環、カルボキシル−置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、グアニジノ、グアニジノスルホン、チオール、チオアルキル、置換チオアルキル、チオアリール、置換チオアリール、チオシクロアルキル、置換チオシクロアルキル、チオヘテロアリール、置換チオヘテロアリール、チオ複素環、置換チオ複素環、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、オキシカルボニルアミノ、オキシチオカルボニルアミノ、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、−ＯＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−複素環、−ＯＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＯＳＯ２−ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換複素環、式中、Ｒは水素またはアルキルである、モノ−およびジ−アルキルアミノ、モノ−およびジ−（置換アルキル）アミノ、モノ−およびジ−アリールアミノ、モノ−およびジ−置換アリールアミノ、モノ−およびジ−ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−置換ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−複素環アミノ、モノ−およびジ−置換複素環アミノ、非対称ジ−置換アミンであって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環からなる群より独立に選択される異なる置換基を有する前記非対称ジ−置換アミン、ならびにＢｏｃ、Ｃｂｚ、ホルミル等の慣用的なブロッキング基によってブロッキングされているアミノ基を有する置換アルキル基、あるいは−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アルケニル、−ＳＯ２−置換アルケニル、−ＳＯ２−シクロアルキル、−ＳＯ２−置換シクロアルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−置換アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、−ＳＯ２−置換ヘテロアリール、−ＳＯ２−複素環、−ＳＯ２−置換複素環および−ＳＯ２ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、で置換されているアルキル／置換アルキル基からなる群より独立に選択される、１〜５の置換基を有する、１〜１０炭素原子のアルキル基を指す。
「アミジノ」は、基Ｈ２ＮＣ（＝ＮＨ）−を指し、そして用語「アルキルアミジノ」は、１〜３アルキル基を有する化合物（例えばアルキルＨＮＣ（＝ＮＨ）−）を指す。
「アミノ」は、基−ＮＨ２を指す。
「置換アミノ」は、基−ＮＲＲであって、各Ｒ基が、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アルケニル、−ＳＯ２−置換アルケニル、−ＳＯ２−シクロアルキル、−ＳＯ２−置換シクロアルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−置換アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、−ＳＯ２−置換ヘテロアリール、−ＳＯ２−複素環、−ＳＯ２−置換複素環からなる群より独立に選択される、但し、両方のＲ基が水素ではないか；あるいは、Ｒ基は、窒素原子と一緒に連結されて複素環または置換複素環を形成してもよい、前記基−ＮＲＲを指す。
「アミノアシル」は、基、−ＮＲＣ（Ｏ）アルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換アルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換シクロアルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）アルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換アルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アルキニル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換アルキニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アリール、−ＮＲＣ（Ｏ）置換アリール、−ＮＲＣ（Ｏ）ヘテロアリール、−ＮＲＣ（Ｏ）置換ヘテロアリール、−ＮＲＣ（Ｏ）複素環、および−ＮＲＣ（Ｏ）置換複素環、式中、Ｒは水素またはアルキルであり、そして式中、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環は、本明細書に定義する通りである、を指す。
「アリール」または「Ａｒ」は、単環（例えばフェニル）または多重縮合環（例えばナフチルまたはアントリル）を有する６〜１４炭素原子の不飽和芳香族炭素環基を指し、該縮合環は、付着点が芳香族環原子であるという条件で、芳香族（例えば２−ベンゾキサゾリノン、２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−３（４Ｈ）−オン−７−イル等）であってもまたはなくてもよい。
「置換アリール」は、ヒドロキシ、アシル、アシルアミノ、チオカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アミジノ、アルキルアミジノ、チオアミジノ、アミノ、アミノアシル、アミノカルボニルオキシ、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、カルボキシル、カルボキシルアルキル、カルボキシル−置換アルキル、カルボキシル−シクロアルキル、カルボキシル−置換シクロアルキル、カルボキシルアリール、カルボキシル−置換アリール、カルボキシルヘテロアリール、カルボキシル−置換ヘテロアリール、カルボキシル複素環、カルボキシル−置換複素環、カルボキシルアミド、シアノ、チオール、チオアルキル、置換チオアルキル、チオアリール、置換チオアリール、チオヘテロアリール、置換チオヘテロアリール、チオシクロアルキル、置換チオシクロアルキル、チオ複素環、置換チオ複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、グアニジノ、グアニジノスルホン、ハロ、ニトロ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、オキシカルボニルアミノ、オキシチオカルボニルアミノ、−Ｓ（Ｏ）２−アルキル、−Ｓ（Ｏ）２−置換アルキル、−Ｓ（Ｏ）２−シクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）２−置換シクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）２−アルケニル、−Ｓ（Ｏ）２−置換アルケニル、−Ｓ（Ｏ）２−アリール、−Ｓ（Ｏ）２−置換アリール、−Ｓ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）２−複素環、−Ｓ（Ｏ）２−置換複素環、−ＯＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−複素環、−ＯＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＯＳＯ２−ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換複素環、式中、Ｒは水素またはアルキルである、モノ−およびジ−アルキルアミノ、モノ−およびジ−（置換アルキル）アミノ、モノ−およびジ−アリールアミノ、モノ−およびジ−置換アリールアミノ、モノ−およびジ−ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−置換ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−複素環アミノ、モノ−およびジ−置換複素環アミノ、非対称ジ−置換アミンであって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環からなる群より独立に選択される異なる置換基を有する前記非対称ジ−置換アミン、ならびにＢｏｃ、Ｃｂｚ、ホルミル等の慣用的なブロッキング基によってブロッキングされているか、あるいは−ＳＯ２ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、で置換されている、置換アリール上のアミノ基からなる群より選択される、１〜３の置換基で置換されている、アリール基を指す。
「シクロアルケニル」は、単一または多数の不飽和を有するが芳香族性でない、３〜８炭素原子の環状アルケニル基を指す。
「シクロアルコキシ」は、−Ｏ−シクロアルキル基を指す。
「置換シクロアルコキシ」は、−Ｏ−置換シクロアルキル基を指す。
式ＩおよびＩＩの化合物ならびにＰＥＧ誘導体に関する「シクロアルキル」は、単一または多数の縮合環を有する３〜１２炭素原子の環状アルキル基を指し、例えば、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル等が含まれる。
「シクロアルキル」は、単一の環状環を有する、３〜８炭素原子の環状アルキル基を指し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル等が含まれる。この定義から排除されるのは、アダマンタニル等の多環アルキル基である。
「低次シクロアルキル」は、単一環状環を有する３〜６炭素原子の環状アルキル基を指し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが含まれる。
「置換シクロアルキル」および「置換シクロアルケニル」は、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、チオカルボニルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミジノ、アルキルアミジノ、チオアミジノ、アミノアシル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールオキシアリール、置換アリールオキシアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、カルボキシル、カルボキシルアルキル、カルボキシル−置換アルキル、カルボキシル−シクロアルキル、カルボキシル−置換シクロアルキル、カルボキシルアリール、カルボキシル−置換アリール、カルボキシルヘテロアリール、カルボキシル−置換ヘテロアリール、カルボキシル複素環、カルボキシル−置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、グアニジノ、グアニジノスルホン、チオール、チオアルキル、置換チオアルキル、チオアリール、置換チオアリール、チオシクロアルキル、置換チオシクロアルキル、チオヘテロアリール、置換チオヘテロアリール、チオ複素環、置換チオ複素環、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、オキシカルボニルアミノ、オキシチオカルボニルアミノ、−ＯＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−複素環、−ＯＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＯＳＯ２−ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換複素環、式中、Ｒは水素またはアルキルである、モノ−およびジ−アルキルアミノ、モノ−およびジ−（置換アルキル）アミノ、モノ−およびジ−アリールアミノ、モノ−およびジ−置換アリールアミノ、モノ−およびジ−ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−置換ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−複素環アミノ、モノ−およびジ−置換複素環アミノ、非対称ジ−置換アミンであって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環からなる群より独立に選択される異なる置換基を有する前記非対称ジ−置換アミン、ならびにＢｏｃ、Ｃｂｚ、ホルミル等の慣用的なブロッキング基によってブロッキングされているアミノ基を有する置換アルキニル基、あるいは−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アルケニル、−ＳＯ２−置換アルケニル、−ＳＯ２−シクロアルキル、−ＳＯ２−置換シクロアルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−置換アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、−ＳＯ２−置換ヘテロアリール、−ＳＯ２−複素環、−ＳＯ２−置換複素環および−ＳＯ２ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、で置換されているアルキニル／置換アルキニル基からなる群より独立に選択される１〜５の置換基を有する、典型的には３〜８炭素原子のシクロアルキルまたはシクロアルケニル基を指す。
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
「ヘテロアリール」は、芳香族炭素環基であって、２〜１０炭素原子、ならびに該環またはその酸化物内の、酸素、窒素およびイオウからなる群より選択される１〜４のヘテロ原子の、前記芳香族炭素環基を指す。こうしたヘテロアリール基は、単環（例えばピリジルまたはフリル）または多重縮合環（例えばインドリジニルまたはベンゾチエニル）を有してもよく、付着点が芳香族環原子を通じるという条件で、縮合環の１以上が芳香族であってもまたはなくてもよい。さらに、ヘテロアリール基のヘテロ原子を酸化して、すなわち、ピリジンＮ−オキシドまたは１，１−ジオキソ−１，２，５−チアジアゾール等を形成してもよい。さらに、環の炭素原子を、オキソ（＝Ｏ）で置換してもよい。用語「ヘテロアリール環中に２つの窒素原子を有するヘテロアリール」は、ヘテロアリール環中に、２つの、そして２つのみの窒素原子を有し、そして場合によって、ヘテロアリール環中に、酸素またはイオウなどの１つまたは２つの他のヘテロ原子を含有する、ヘテロアリール基を指す。
「置換ヘテロアリール」は、ヒドロキシ、アシル、アシルアミノ、チオカルボニルアミノ、アシルオキシ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アミジノ、アルキルアミジノ、チオアミジノ、アミノ、アミノアシル、アミノカルボニルオキシ、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、カルボキシル、カルボキシルアルキル、カルボキシル−置換アルキル、カルボキシル−シクロアルキル、カルボキシル−置換シクロアルキル、カルボキシルアリール、カルボキシル−置換アリール、カルボキシルヘテロアリール、カルボキシル−置換ヘテロアリール、カルボキシル複素環、カルボキシル−置換複素環、カルボキシルアミド、シアノ、チオール、チオアルキル、置換チオアルキル、チオアリール、置換チオアリール、チオヘテロアリール、置換チオヘテロアリール、チオシクロアルキル、置換チオシクロアルキル、チオ複素環、置換チオ複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、グアニジノ、グアニジノスルホン、ハロ、ニトロ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、オキシカルボニルアミノ、オキシチオカルボニルアミノ、−Ｓ（Ｏ）２−アルキル、−Ｓ（Ｏ）２−置換アルキル、−Ｓ（Ｏ）２−シクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）２−置換シクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）２−アルケニル、−Ｓ（Ｏ）２−置換アルケニル、−Ｓ（Ｏ）２−アリール、−Ｓ（Ｏ）２−置換アリール、−Ｓ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）２−複素環、−Ｓ（Ｏ）２−置換複素環、−ＯＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−複素環、−ＯＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＯＳＯ２−ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換複素環、式中、Ｒは水素またはアルキルである、モノ−およびジ−アルキルアミノ、モノ−およびジ−（置換アルキル）アミノ、モノ−およびジ−アリールアミノ、モノ−およびジ−置換アリールアミノ、モノ−およびジ−ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−置換ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−複素環アミノ、モノ−およびジ−置換複素環アミノ、非対称ジ−置換アミンであって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環からなる群より独立に選択される異なる置換基を有する前記非対称ジ−置換アミン、ならびにＢｏｃ、Ｃｂｚ、ホルミル等の慣用的なブロッキング基によってブロッキングされているか、あるいは−ＳＯ２ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、で置換されている、置換アリール上のアミノ基からなる群より選択される、１〜３の置換基で置換されている、ヘテロアリール基を指す。
「ヘテロアリールオキシ」は、基、−Ｏ−ヘテロアリールを指し、そして「置換ヘテロアリールオキシ」は、基、−Ｏ−置換ヘテロアリールを指す。
「ヘテロアラルコキシ」は、基、ヘテロアリール−アルキレン−Ｏ−を指す。
「置換ヘテロアラルコキシ」は、基、置換ヘテロアリール−アルキレン−Ｏ−を指す。
「複素環」または「複素環性」は、縮合環内の１以上の環がアリールまたはヘテロアリールであってもよい環内に、１〜１０炭素原子、および窒素、硫黄または酸素からなる群より選択される１〜４ヘテロ原子の単環または多数の縮合環を有する飽和または不飽和基を指す。
「置換複素環」は、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、チオカルボニルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミジノ、アルキルアミジノ、チオアミジノ、アミノアシル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールオキシアリール、置換アリールオキシアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、カルボキシル、カルボキシルアルキル、カルボキシル−置換アルキル、カルボキシル−シクロアルキル、カルボキシル−置換シクロアルキル、カルボキシルアリール、カルボキシル−置換アリール、カルボキシルヘテロアリール、カルボキシル−置換ヘテロアリール、カルボキシル複素環、カルボキシル−置換複素環、シクロアルキル、置換シクロアルキル、グアニジノ、グアニジノスルホン、チオール、チオアルキル、置換チオアルキル、チオアリール、置換チオアリール、チオシクロアルキル、置換チオシクロアルキル、チオヘテロアリール、置換チオヘテロアリール、チオ複素環、置換チオ複素環、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、シクロアルコキシ、置換シクロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、オキシカルボニルアミノ、オキシチオカルボニルアミノ、−ＯＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＯＳ（Ｏ）２−アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＯＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＯＳ（Ｏ）２−複素環、−ＯＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＯＳＯ２−ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−置換複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アルキル、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換アリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換ヘテロアリール、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−複素環、−ＮＲＳ（Ｏ）２−ＮＲ−置換複素環、式中、Ｒは水素またはアルキルである、モノ−およびジ−アルキルアミノ、モノ−およびジ−（置換アルキル）アミノ、モノ−およびジ−アリールアミノ、モノ−およびジ−置換アリールアミノ、モノ−およびジ−ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−置換ヘテロアリールアミノ、モノ−およびジ−複素環アミノ、モノ−およびジ−置換複素環アミノ、非対称ジ−置換アミンであって、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環および置換複素環からなる群より独立に選択される異なる置換基を有する前記非対称ジ−置換アミン、ならびにＢｏｃ、Ｃｂｚ、ホルミル等の慣用的なブロッキング基によってブロッキングされているアミノ基を有する置換アルキニル基、あるいは−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アルケニル、−ＳＯ２−置換アルケニル、−ＳＯ２−シクロアルキル、−ＳＯ２−置換シクロアルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−置換アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、−ＳＯ２−置換ヘテロアリール、−ＳＯ２−複素環、−ＳＯ２−置換複素環および−ＳＯ２ＮＲＲ、式中、Ｒは水素またはアルキルである、で置換されているアルキニル／置換アルキニル基からなる群より選択される１〜３の置換基で置換されている複素環基を指す。
複素環およびヘテロアリールの例には、限定されるわけではないが、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリノ、モルホリニル、チオモルホリノ、チオモルホリニル（チアモルホリニルとも称される）、ピペリジニル、ピロリジン、テトラヒドロフラニル等が含まれる。
「場合によって置換された」は、列挙する基が非置換であってもよいし、または列挙する基が置換されていてもよいことを意味する。
「薬学的に許容されうるキャリアー」は、一般的に、安全であり、非毒性であり、そして生物学的にまたは別の意味で望ましくないものでない、薬学的組成物または配合物を調製する際に有用であるキャリアーを意味し、そしてこうしたキャリアーには、獣医学的使用ならびにヒト薬学的使用に許容されうるキャリアーが含まれる。薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤には、こうしたキャリアーの１つまたは１より多くの両方が含まれる。
「薬学的に許容されうるカチオン」は、薬学的に許容されうる塩のカチオンを指す。
「薬学的に許容されうる塩」は、生物学的にまたは別の意味で望ましくないものでない、化合物の生物学的有効性および特性を保持する塩を指す。薬学的に許容されうる塩は、化合物の薬学的に許容されうる塩であって、当該技術分野に周知の多様な有機および無機対イオンに由来する塩を指し、そしてこれには、例のみであるが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム等が含まれ；そして分子が塩基性官能性を含有する場合、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩等の有機酸または無機酸の塩が含まれる。
薬学的に許容されうる塩基付加塩を無機塩基および有機塩基から調製してもよい。無機塩基由来の塩には、例のみであるが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩が含まれる。有機塩基由来の塩には、限定されるわけではないが、一級、二級および三級アミンの塩、例えばアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、置換アルキルアミン、ジ（置換アルキル）アミン、トリ（置換アルキル）アミン、アルケニルアミン、ジアルケニルアミン、トリアルケニルアミン、置換アルケニルアミン、ジ（置換アルケニル）アミン、トリ（置換アルケニル）アミン、シクロアルキルアミン、ジ（シクロアルキル）アミン、トリ（シクロアルキル）アミン、置換シクロアルキルアミン、ジ置換シクロアルキルアミン、トリ置換シクロアルキルアミン、シクロアルケニルアミン、ジ（シクロアルケニル）アミン、トリ（シクロアルケニル）アミン、置換シクロアルケニルアミン、ジ置換シクロアルケニルアミン、トリ置換シクロアルケニルアミン、アリールアミン、ジアリールアミン、トリアリールアミン、ヘテロアリールアミン、ジヘテロアリールアミン、トリヘテロアリールアミン、複素環アミン、ジ複素環アミン、トリ複素環アミン、混合ジ−およびトリ−アミンであって、アミン上の置換基の少なくとも２つが異なり、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環等からなる群より選択される、前記混合ジ−およびトリ−アミンが含まれる。やはり含まれるのは、２つまたは３つの置換基が、アミノ窒素と一緒に、複素環またはヘテロアリール基を形成するアミンである。
適切なアミンの例には、例のみであるが、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリ（イソ−プロピル）アミン、トリ（ｎ−プロピル）アミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン等が含まれる。他のカルボン酸誘導体、例えば、カルボキサミド、低次アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド等を含む、カルボン酸アミドが有用であろうこともまた理解すべきである。
薬学的に許容されうる酸付加塩を無機酸および有機酸から調製してもよい。無機酸に由来する塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が含まれる。有機酸に由来する塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等が含まれる。
化合物はプロドラッグとして作用してもよい。プロドラッグは、こうしたプロドラッグが哺乳動物被験体に投与された場合、ｉｎ ｖｉｖｏで活性親薬剤を放出するいかなる化合物も意味する。プロドラッグは、修飾がｉｎ ｖｉｖｏで切断されて、親化合物を放出させることが可能な方式で、存在する官能基を修飾することによって、調製される。プロドラッグには、ｉｎ ｖｉｖｏで切断されて、それぞれ、遊離ヒドロキシル、アミノ、またはスルフィドリル基を再生可能である、ヒドロキシ、アミノ、またはスルフィドリル基が任意の基に結合している化合物が含まれる。プロドラッグの例には、限定されるわけではないが、ヒドロキシ官能基のエステル（例えば、酢酸、ギ酸、および安息香酸誘導体）、カルバメート（例えばＮ，Ｎ−ジメチルアミノ−カルボニル）等が含まれる。
「療法的有効量」は、疾患を治療するために哺乳動物に投与した際に、疾患に対するこうした治療を達成するのに十分な、化合物または抗体の量を意味する。「療法的有効量」は、化合物、疾患、およびその重症度、ならびに治療しようとする哺乳動物の年齢、体重等に応じて多様であろう。
化合物の薬学的配合
一般的に、化合物は、これらの化合物の投与の許容される様式いずれかによって、療法的に有効な量で投与されるであろう。限定されるわけではないが、経口、非経口（例えば、皮下、硬膜下、静脈内、筋内、クモ膜下腔内、腹腔内、脳内、動脈内、または病巣内投与経路）、局所、鼻内、限局（例えば外科的適用または外科的座薬）、直腸、および肺（例えばエアロゾル、吸入、または粉末）を含む多様な経路によって、化合物を投与してもよい。したがって、これらの化合物は、注射可能および経口組成物としてのどちらでも有効である。注入によって、またはボーラス注射によって、化合物を連続投与してもよい。
化合物、すなわち活性成分の実際の量は、疾患、すなわち治療しようとする状態または疾患の重症度、被験体の年齢、および相対的な健康状態、用いる化合物の強度、投与経路および形式、ならびに他の要因などの、いくつかの要因に応じるであろう。
細胞培養または実験動物において、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において療法的に有効な用量）を決定するための、標準的薬学的方法によって、こうした化合物の毒性および療法的有効性を決定してもよい。毒性および療法効果間の用量比が療法指数であり、そしてこれを、比、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表してもよい。
ヒトで使用するための投薬量範囲を策定する際に、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを用いてもよい。こうした化合物の投薬量は、ほとんどまたはまったく毒性がない、ＥＣ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用する投薬型および利用する投与経路に応じて、この範囲内で多様でありうる。用いるいかなる化合物に関しても、最初に、細胞培養アッセイから、療法的有効用量を概算してもよい。用量を動物モデルにおいて配合して、細胞培養で決定したようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する、試験化合物濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成してもよい。こうした情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定してもよい。例えば高性能液体クロマトグラフィーによって、血漿中のレベルを測定してもよい。
患者に投与する薬学的組成物の量は、何を投与しているか、予防または療法などの投与の目的、患者の状態、投与方式等に応じて多様であろう。療法適用において、疾患にすでに罹患している患者に、該疾患およびその合併症の症状を治癒させるかまたは少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で、組成物を投与する。これを達成するのに適切な量は、「療法的有効用量」と定義される。この使用に有効な量は、治療中の疾患状態、ならびに炎症の重症度、患者の年齢、体重、および全身の健康状態等の要因に応じた主治医の判断に応じるであろう。
患者に投与する組成物は、上述の薬学的組成物の形である。これらの組成物を慣用的滅菌技術によって滅菌してもよいし、またはろ過滅菌してもよい。生じる水性溶液をそのまま使用するためにパッケージングしてもよいし、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性キャリアーと混合される。前述の賦形剤、キャリアー、または安定化剤の特定のものの使用は、薬学的塩の形成を生じることが理解されるであろう。
活性化合物は、広い投薬範囲に渡って有効であり、そして一般的に、薬学的または療法的に有効な量で投与される。化合物の療法投薬量は、例えば、治療を行う特定の使用、化合物の投与方式、患者の健康状態および状態、ならびに処方医師の判断に応じて多様であろう。例えば、静脈内投与には、用量は、典型的には、体重キログラムあたり、約０．５ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲であろう。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得た用量−反応曲線から、有効用量を推定してもよい。典型的には、臨床医は、投薬量が所望の効果を達成するに至るまで、化合物を投与するであろう。
薬剤として使用される際、化合物は、通常、薬学的組成物の形で投与される。薬学的組成物は、１以上の薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤と会合した、１以上の上述の化合物を、活性成分として含有する。使用する賦形剤は、典型的には、ヒト被験体または他の哺乳動物に投与するのに適したものである。組成物を作製する際、活性成分を、通常、賦形剤と混合するか、賦形剤によって希釈するか、あるいはカプセル、サシェー、紙または他の容器の形であってもよいキャリアー内に被包する。賦形剤が希釈剤として働く場合、賦形剤は、活性成分のビヒクル、キャリアー、または媒体として作用する、固形、半固形、または液体物質であってもよい。したがって、組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、サシェー、カシェー、エリキシル剤、懸濁物、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル（固形または液体媒体中）、例えば重量１０％までの活性化合物を含有する軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、座薬、滅菌注射可能溶液、ならびに滅菌パッケージング粉末の形であってもよい。
配合物を調製する際、他の成分と合わせる前に、活性化合物を製粉して、適切な粒子サイズを提供する必要がありうる。活性化合物が実質的に不溶性である場合、通常、２００メッシュ未満の粒子サイズに製粉する。活性化合物が実質的に水溶性である場合、通常、例えば約４０メッシュに製粉することによって粒子サイズを調整して、配合物において、実質的に均一な分布を提供する。
適切な賦形剤のいくつかの例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが含まれる。配合物にはさらに：タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどの潤滑剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；安息香酸メチルおよび安息香酸プロピルヒドロキシなどの保存剤；甘味料；ならびにフレーバー剤が含まれてもよい。当該技術分野に知られる方法を使用することによって、患者に投与した後、活性成分の迅速放出、持続放出、または遅延放出を提供するように、本発明の組成物を配合してもよい。
薬学的組成物中の活性化合物の量および該組成物の単位投薬型を、特定の適用、導入方式、特定の化合物の強度、および所望の濃度に応じて、広く変化させるかまたは調整してもよい。用語「単位投薬型」は、ヒト被験体および他の哺乳動物のための単位投薬型として適切な、物理的に別個の単位を指し、各単位は、適切な薬学的賦形剤と会合した、望ましい療法効果を生じると計算された、あらかじめ決定された量の活性物質を含有する。
無菌生理学的生理食塩水溶液などの適切な不活性キャリアー中に、非経口投与のため、化合物を配合してもよい。投与用量は、投与経路によって決定されるであろう。
静脈内配合物による療法剤の投与は、医薬産業に周知である。静脈内配合物は、単に、療法剤が可溶性である組成物であることに加えて、特定の性質を所持しなければならない。例えば、配合物は、活性成分（単数または複数）の全体の安定性を促進しなければならないし、また、配合物の製造は、費用効果的でなければならない。これらの要因のすべてが、最終的に、静脈内配合物の全体の成功および有用性を決定する。
薬学的配合物および化合物中に含まれてもよい他の補助的添加物は、以下のとおりである：溶媒：エタノール、グリセロール、プロピレングリコール；安定化剤：ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、クエン酸；抗菌保存剤：ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン；緩衝剤：クエン酸／クエン酸ナトリウム、酒石酸水素カリウム、酒石酸水素ナトリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、マレイン酸／マレイン酸ナトリウム、フタル酸水素ナトリウム、リン酸／リン酸二水素カリウム、リン酸／リン酸水素二ナトリウム；および浸透圧修飾剤：塩化ナトリウム、マンニトール、デキストロース。
緩衝剤の存在は、約４〜約８の範囲内に、水性ｐＨを維持するために必要でありうる。緩衝系は、一般的に、弱酸およびその可溶性塩の混合物、例えば、クエン酸ナトリウム／クエン酸；あるいは二塩基性酸のモノカチオン塩またはジカチオン塩の混合物、例えば、酒石酸水素カリウム；酒石酸水素ナトリウム、リン酸／リン酸二水素カリウム、およびリン酸／リン酸水素二ナトリウムである。
用いる緩衝系の量は、（１）望ましいｐＨ；および（２）薬剤の量に応じる。一般的に、用いる緩衝剤の量は、４〜８の範囲内のｐＨを維持するために、配合物の緩衝剤：アレンドロネート（緩衝剤のモル数を、緩衝剤成分、例えばクエン酸ナトリウムおよびクエン酸を合わせたモル数とした場合）、０．５：１〜５０：１のモル比にあり、そして一般的に、存在する薬剤に対する緩衝剤（合わせたもの）のモル比、１：１〜１０：１が用いられる。
有用な緩衝剤は、組成物の４〜６の水性ｐＨを維持するのに十分な、１ｍｌあたりクエン酸ナトリウム５〜５０ｍｇから、１ｍｌあたりクエン酸１〜１５ｍｇの範囲のクエン酸ナトリウム／クエン酸である。
緩衝剤はまた、溶解した金属イオン、例えばＣａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ａｌ、Ｂａとの可溶性金属錯体形成を通じて、薬剤の沈殿を防止するために存在してもよく、こうした金属イオンは、ガラス容器またはゴム栓から浸出しうるし、あるいは通常の水道水中に存在しうる。剤は、薬剤との競合的錯化剤として作用して、そして可溶性金属錯体を産生して、望ましくない微粒子の存在を導きうる。
さらに、吐き気または下痢などの望ましくない副作用に、そして場合によっては関連する血液障害につながる、静脈内配合物の投与に際する、赤血球の膨張または収縮を回避するため、浸透圧をヒト血液と同じ値に調整するための剤、例えば約１〜８ｍｇ／ｍｌ量の塩化ナトリウムの存在が必要である可能性もある。一般的に、配合物の浸透圧は、２８２〜２８８ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である、ヒト血液のものとマッチし、そして一般的には、塩化ナトリウム０．９％溶液に対応する浸透圧と同等である２８５ｍＯｓｍ／ｋｇである。
直接静脈内注射、ｉ．ｖ．ボーラスによって、静脈内配合物を投与してもよいし、あるいは０．９％塩化ナトリウム注射液または他の適合する注入溶液などの適切な注入溶液に添加することによって、注入によって投与してもよい。
組成物は、好ましくは、単位投薬型で配合され、各投薬型は、約５〜約１００ｍｇ、より一般的には、約１０〜約３０ｍｇの活性成分を含有する。用語「単位投薬型」は、ヒト被験体および他の哺乳動物のための単位投薬型として適切な、物理的に別個の単位を指し、各単位は、適切な薬学的賦形剤と会合した、望ましい療法効果を生じると計算された、あらかじめ決定された量の活性物質を含有する。
活性化合物は、広い投薬範囲に渡って有効であり、そして一般的に、薬学的に有効な量で投与される。しかし、実際に投与される化合物の量は、治療しようとする状態、選択する投与経路、投与する実際の化合物、個々の患者の年齢、体重、および反応、患者の症状の重症度等を含めて、適切な環境に鑑みて、医師によって決定されるであろう。
錠剤などの固形組成物を調製するため、主な活性成分を薬学的賦形剤と混合して、本発明の化合物の均一な混合物を含有する固形予備処方組成物を形成する。これらの予備処方組成物を均一と称する場合、組成物を、錠剤、丸剤およびカプセルなどの等しく有効な単位投薬型に容易に細分割可能であるように、活性成分が組成物全体に一様に分散していることを意味する。次いで、例えば、０．１〜約５００ｍｇの活性成分を含有する、上述の種類の単位投薬型に、この固形予備処方を細分割する。
錠剤または丸剤をコーティングするかまたは別の方式で化合させて、持続作用の利点を提供する投薬型を提供してもよい。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬型および外部投薬型構成要素を含んでもよく、後者は、前者上のエンベロープの形である。胃における分解に抵抗するように働き、そして内部構成要素が損なわれずに十二指腸内に通過するか、またはその放出が遅延されることを可能にする溶腸層によって、２つの構成要素を分離してもよい。こうした溶腸層またはコーティングには、多様な物質が使用可能であり、こうした物質には、いくつかのポリマー酸、ならびにセラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの物質とポリマー酸の混合物が含まれる。
新規組成物が経口投与または注射による投与のために取り込まれていてもよい液体型には、適切にフレーバー付けされたシロップ、水性または油懸濁物、ならびに綿実油、ゴマ油、ココナツ油、またはピーナツ油などの食用油を含むフレーバー付けされたエマルジョン、ならびにエリキシル剤および類似の薬学的ビヒクルが含まれる。
吸入または吹送のための組成物には、薬学的に許容されうる水性または有機溶媒、あるいはその混合物中の溶液および懸濁物、ならびに粉末が含まれる。液体または固形組成物は、上述のような適切な薬学的に許容されうる賦形剤を含有してもよい。不活性ガスの使用によって、薬学的に許容されうる溶媒中の組成物を噴霧してもよい。噴霧溶液を噴霧デバイスから直接呼吸してもよいし、あるいは噴霧デバイスをフェースマスクテントまたは間欠的陽圧呼吸装置に取り付けてもよい。適切な方式で、配合物を送達するデバイスから、溶液、懸濁物、または粉末組成物を投与してもよい。
持続放出型で化合物を投与してもよい。持続放出調製物の適切な例には、タンパク質を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、該マトリックスは成形された物品、例えばフィルムまたは微小カプセルの形である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． １２：９８−１０５（１９８２）に記載されるようなポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメート（Ｓｉｄｍａｎら， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６， １９８３）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上記）、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（すなわち、乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射可能微小球体）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）が含まれる。
持続放出型、例えば、デポ注射、移植物調製物、または浸透圧ポンプ中で化合物を投与してもよく、該化合物を、活性成分の持続放出を可能にするような方式で配合してもよい。持続放出配合物のための移植物は、当該技術分野に周知である。移植物を、限定されるわけではないが、微小球体、平板として、生体分解性または非生体分解性ポリマーとともに、配合してもよい。例えば、乳酸および／またはグリコール酸のポリマーは、宿主によってよく寛容される浸食性ポリマーを形成する。
以下の配合実施例は、薬学的組成物を例示する。
配合実施例１
以下の成分を含有する硬ゼラチンカプセルを調製する：
上記成分を混合し、そして３４０ｍｇ量で、硬ゼラチンカプセル内に充填する。
配合実施例２
以下の成分を用いて、錠剤配合物を調製する：
構成要素を混和し、そして圧縮して重量各２４０ｍｇの錠剤を形成する。
配合実施例３
以下の構成要素を含有する乾燥粉末吸入配合物を調製する：
活性混合物をラクトースと混合し、そして乾燥粉末吸入アプライアンスに混合物を添加する。
配合実施例４
各３０ｍｇの活性成分を含有する錠剤を以下のように調製する：
活性成分、デンプン、およびセルロースを第２０番メッシュＵ．Ｓ．ふるいにかけ、そして完全に混合する。生じた粉末とポリビニル−ピロリドンの溶液を混合し、これを次いで、１６メッシュＵ．Ｓ．ふるいにかける。こうして生じた顆粒を５０〜６０℃で乾燥させ、そして１６メッシュＵ．Ｓ．ふるいにかける。次いで、あらかじめ第３０番メッシュＵ．Ｓ．ふるいにかけたカルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、およびタルクを顆粒に添加し、混合した後、錠剤装置上で圧縮して、重量各１５０ｍｇの錠剤を得る。
配合実施例５
各４０ｍｇの薬剤を含有するカプセルを以下のように作製する：
活性成分、セルロース、デンプン、およびステアリン酸マグネシウムを混和し、第２０番メッシュＵ．Ｓ．ふるいにかけ、そして１５０ｍｇ量で、硬ゼラチンカプセル内に充填する。
配合実施例６
各２５ｍｇの活性成分を含有する座薬を以下のように作製する：
活性成分を第６０番メッシュＵ．Ｓ．ふるいにかけ、そして必要な最小限の熱を用いてあらかじめ融解させた飽和脂肪酸グリセリド中に懸濁する。次いで、混合物を名目上（ｎｏｍｉｎａｌ）２．０ｇの容量の座薬の流し込み型に注ぎ、そして冷却させる。
配合実施例７
５．０ｍｌ用量あたり、各５０ｍｇの薬剤を含有する懸濁物を以下のように作製する：
薬剤、スクロース、およびキサンタンゴムを混和し、第１０番メッシュＵ．Ｓ．ふるいにかけ、そして次いで、水中の微結晶性セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムのあらかじめ作製した溶液と混合する。安息香酸ナトリウム、フレーバー、および色をある程度の水で希釈し、そして攪拌しながら添加する。次いで、十分な水を添加して、必要な体積を生じる。
配合実施例８
各１５ｍｇの活性成分を含有する硬ゼラチン錠剤を以下のように作製する：
活性成分、セルロース、デンプン、およびステアリン酸マグネシウムを混和し、第２０番メッシュＵ．Ｓ．ふるいにかけ、そして５６０ｍｇ量で、硬ゼラチンカプセル内に充填する。
配合実施例９
静脈内配合物を以下のように調製してもよい：
一般的に、療法化合物組成物を、無菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈内溶液バッグ、あるいは皮下注射針または類似の鋭い装置によって貫通可能な栓を有するバイアルに入れる。
配合実施例１０
局所配合物を以下のように調製してもよい：
融解するまで白色軟パラフィンを加熱する。流動パラフィンおよび乳化ワックスを取り込み、そして溶解するまで攪拌する。活性成分を添加し、そして分散するまで攪拌を続ける。次いで、固形になるまで混合物を冷却する。
配合実施例１１
エアロゾル配合物を以下のように調製してもよい：以下の方法を用いて、３０．０ｍｇ／ｍｌの濃度の０．５％重炭酸ナトリウム／生理食塩水（ｗ／ｖ）中の候補化合物の溶液を調製する：
Ａ． ０．５％重炭酸ナトリウム／生理食塩水ストック溶液：１００．０ｍｌの調製
方法：
１． １００ｍｌ容量フラスコ内に０．５ｇ重炭酸ナトリウムを添加する。
２． およそ９０．０ｍｌの生理食塩水を添加し、そして溶解するまで超音波処理する。
３． １００．０ｍｌまで生理食塩水を適量加え、そして完全に混合する。
Ｂ． ３０．０ｍｇ／ｍｌ候補化合物：１０．０ｍｌの調製
方法：
１． １０．０ｍｌ容量フラスコ内に０．３００ｇの候補化合物を添加する。
２． およそ９．７ｍｌの０．５％重炭酸ナトリウム／生理食塩水ストック溶液を添加する。
３． 候補化合物が完全に溶解するまで超音波処理する。
４． １０．０ｍｌまで０．５％重炭酸ナトリウム／生理食塩水ストック溶液を適量加え、そして混合する。
経皮送達デバイス（「パッチ」）もまた使用可能である。こうした経皮パッチを用いて、調節した量で、化合物の連続または不連続注入を提供してもよい。薬学的剤の送達のための経皮パッチの構築および使用は、当該技術分野に周知である。例えば、本明細書に援用される、１９９１年６月１１日発行の米国特許第５，０２３，２５２号を参照されたい。こうしたパッチを、薬学的剤の連続、パルス、またはオンデマンド送達用に構築してもよい。
薬学的組成物を脳に導入することが望ましいかまたは必要である場合、直接または間接的配置技術を用いてもよい。直接技術は通常、宿主の脳室系内への薬剤送達カテーテルの配置を伴って、血液脳関門をバイパスする。体の特定の解剖学的領域に生物学的因子を輸送するのに用いられる１つのこうした移植可能送達系は、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，４７２号に記載される。
間接的技術は、通常、親水性薬剤を脂溶性薬剤に変換することによって、組成物を配合して薬剤潜伏性（ｌａｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を提供することを伴う。潜伏性は、一般的に、薬剤上に存在するヒドロキシ、カルボニル、硫酸、および一級アミン基のブロッキングを通じて達成され、薬剤をより脂溶性にして、そして血液脳関門を渡る輸送を受け入れやすくする。あるいは、親水性薬剤の送達は、血液脳関門を一過性に開放可能な高張溶液の動脈内注入によって増進可能である。
血清半減期を増進するため、化合物を被包するか、リポソーム内腔内に導入するか、コロイドとして調製してもよいし、あるいは化合物の血清半減期延長を提供する他の慣用的技術を使用してもよい。リポソームを調製するための多様な方法が利用可能であり、例えば、各々、本明細書に援用される、Ｓｚｏｋａら、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、および第４，８３７，０２８号に記載されるとおりである。
薬学的組成物は、多様な薬剤送達系で使用するのに適している。本発明で使用するのに適した配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ペンシルバニア州フィラデルフィア， 第１７版（１９８５）に見られる。
有用性
提供する化合物および薬学的組成物は、ウイルス感染、および関連する疾患を治療し、そして防止する際に、生物学的活性を示し、そしてしたがって、ヒトを含む哺乳動物において、出血熱ウイルスなどのウイルス感染および関連する疾患を治療する際に有用性を有する。
出血熱ウイルス（ＨＦＶ）は、類似の臨床的特性を伴う、多様な疾患症候群を引き起こすＲＮＡウイルスである。潜在的な生物兵器として懸念されるＨＦＶには、限定されるわけではないが：アレナウイルス科（フニン、マチュポ、グアナリト、サビア、ラッサ、タカリベ、ピチンデ、およびＶＳＶ）、フィロウイルス科（エボラおよびマールブルグウイルス）、フラビウイルス科（黄熱病、オムスク出血熱およびキャサヌール森林病ウイルス）、およびブニヤウイルス科（リフトバレー熱）が含まれる。米国疾病対策予防センターによると、天然存在アレナウイルスおよび潜在的に操作されるアレナウイルスは、大量の死傷者を出す最大の潜在的可能性を有する病原体の中にあるとして、カテゴリーＡ病原体リストに含まれる。
リスク要因には：アフリカまたはアジアへの旅行、動物屍体の取り扱い、感染動物またはヒトとの接触、および／または節足動物咬傷が含まれる。アレナウイルスは、感染血液およびまたは体分泌液との直接接触後に非常に感染性が高い。ヒトは通常、感染したげっ歯類との接触、感染した節足動物の咬傷、動物屍体との直接接触、感染したげっ歯類排泄物の吸入および／またはげっ歯類排泄物で汚染された食品の導入を通じて感染する。タカリベウイルスはコウモリと関連付けられてきている。出血熱の空気感染は別の様式であるが、いくぶん、より一般的でない。個人対個人の接触もまた、いくつかの場合では起こりうる。
出血熱はすべて、類似の臨床症状を示す。しかし一般的に、臨床徴候は非特異的および生存可能である。潜伏期間はおよそ７〜１４日である。発病は発熱および倦怠感、多呼吸、相対的徐脈、低血圧、循環性ショック、結膜充血、咽頭炎、リンパ節腫脹症、脳炎、筋肉痛、背痛、頭痛およびめまい、ならびに皮膚の知覚過敏症を伴い、漸進的である。ある感染患者は、出血徴候を発展させない可能性もある。
専門実験室での診断法には、抗原捕捉酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による抗原検出、抗体捕捉酵素連結免疫吸着アッセイによるＩｇＭ抗体検出、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびウイルス単離が含まれる。急性臨床設定では、抗原検出（酵素連結免疫吸着アッセイによる）および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応が最も有用な診断技術である。ウイルス単離は、バイオセイフティーレベル４（ＢＳＬ−４）の実験室を必要とするため、価値が限られている。
用いる数字（例えば量、温度等）に関して正確さを確実にする努力がなされてきているが、ある程度の実験誤差および逸脱を計上しなければならない。別に示さない限り、割合は重量の割合であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、そして圧は大気圧またはほぼ大気圧である。上に定義されない略語は、一般的に認められる意味を取る。
化合物の合成
化合物は、いくつかの多岐に渡る合成経路を介して容易に調製され、化合物調製の容易さ、出発物質の商業的入手可能性等と関連して、特定の経路が選択される。
以下の一般的な方法および手順を用いて、容易に入手可能な出発物質から、化合物を調製してもよい。プロセス条件（すなわち反応温度、時間、反応物質のモル比、溶媒、圧等）が与えられている箇所では、別に記載しない限り、他のプロセス条件もまた使用可能である。最適反応条件は、用いる特定の反応物質または溶媒で多様であってもよいが、ルーチンの最適化法によって、当業者がこうした条件を決定してもよい。
さらに、当業者に明らかであるように、特定の官能基が望ましくない反応を経るのを防止するために、慣用的な保護基が必要である可能性もある。多様な官能基に適した保護基、ならびに特定の官能基を保護しそして脱保護するのに適した条件が、当該技術分野に周知である。例えば、多くの保護基が、Ｔ．Ｗ． ＧｒｅｅｎｅおよびＧ．Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， 第２版， Ｗｉｌｅｙ， ニューヨーク， １９９１および該文献に引用される参考文献に記載される。
さらに、化合物は、典型的には、１以上のキラル中心を含有する。したがって、所望の場合、純粋な立体異性体として、すなわち個々の光学異性体またはジアステレオマーとして、あるいは立体異性体濃縮混合物として、こうした化合物を調製するかまたは単離してもよい。別に示さない限り、すべてのこうした立体異性体（および濃縮混合物）が含まれる。例えば光学活性出発物質または当該技術分野に周知の立体選択試薬を用いて、純粋な立体異性体（または濃縮混合物）を調製してもよい。あるいは、例えばキラルカラムクロマトグラフィー、キラル溶解剤などを用いて、こうした化合物のラセミ混合物を分離してもよい。
別に示さない限り、産物はＲ、Ｓ光学異性体の混合物である。しかし、キラル産物が望ましい場合、Ｒ、Ｓ混合物から光学異性体を分離して、一方または他方の立体異性体を提供する精製技術を介して、キラル産物を得てもよい。こうした技術が当該技術分野に知られる。
別の態様において、プロドラッグとして化合物を提供してもよく、このプロドラッグがｉｎ ｖｉｖｏで上述の化合物に変換（例えば加水分解、代謝）される。
以下の方法を用いて、示すように、以下に示す化合物を調製した。
実施例１〜１２、１４〜４５、４７〜５０
実施例１３に関して以下に言及する一般的方法にしたがって、化合物１３（ａ）を用い、そしてこれを以下のベンゼンスルホニルヒドラジンと反応させて、実施例１〜５０の化合物を調製した：４−フェニルベンゼンスルホニルヒドラジン、４−ｔ−ブチルベンゼンスルホニルヒドラジン、４−メチル−３，４−ジヒドロ−２ｉ７−ベンゾ［１，４］オキサジン−７−スルホニルヒドラジン、５−（１−ジメチルアミノナフチル）スルホニルヒドラジン、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニルヒドラジン、３−クロロ−６−メトキシベンゼンスルホニルヒドラジン、２，５−ジメトキシベンゼンスルホニルヒドラジン、４−（４−［１，２，３］チアジアゾリル）ベンゼンスルホニルヒドラジン、３−ブロモベンゼンスルホニルヒドラジン、４−ブロモベンゼンスルホニルヒドラジン、４−メチルベンゼンスルホニルヒドラジン、４−メトキシベンゼンスルホニルヒドラジン、３−フルオロ−４−クロロベンゼンスルホニルヒドラジン、４−トリフルオロメトキシベンゼンスルホニルヒドラジン、４−フルオロベンゼンスルホニルヒドラジン、３−メトキシベンゼンスルホニルヒドラジン、２−メチルベンゼンスルホニルヒドラジン、３−トリフルオロメチルベンゼンスルホニルヒドラジン、２，４−ジメトキシベンゼンスルホニルヒドラジン、５−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾリルスルホニルヒドラジン、３−メチルベンゼンスルホニルヒドラジン、４−トリフルオロメチルベンゼンスルホニルヒドラジン、２−トリフルオロメチルベンゼンスルホニルヒドラジン、４−（ピロリジン−１−スルホニル）ベンゼンスルホニルヒドラジン、２−クロロベンゼンスルホニルヒドラジン、５−（２−モルホリン−４−イル）ピリジルスルホニルヒドラジン、２−トリフルオロメトキシベンゼンスルホニルヒドラジン、２，４−ジクロロベンゼンスルホニルヒドラジン、ベンゼンスルホニルヒドラジン、３−ジフルオロメチルベンゼンスルホニルヒドラジン、３−シアノベンゼンスルホニルヒドラジン、４−シアノベンゼンスルホニルヒドラジン、５−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシニル）スルホニルヒドラジン、２−（４−メチルベンゼンスルホニル）−１−メチルヒドラジン、３−フルオロベンゼンスルホニルヒドラジン、３，４−ジフルオロベンゼンスルホニルヒドラジン、２，４−ジメチルチアゾール−５−イルスルホニルヒドラジン、４−アセチルベンゼンスルホニルヒドラジン、２，６−ジフルオロベンゼンスルホニルヒドラジン、２−フルオロベンゼンスルホニルヒドラジン、２，５−ジフルオロベンゼンスルホニルヒドラジン、１−（４−メチルベンゼンスルホニル）−１−メチルヒドラジン、２，６−ジクロロベンゼンスルホニルヒドラジン、２，６−ジトリフルオロメチルベンゼンスルホニルヒドラジン、３，５−ジメチルイソキサゾール−５−イルスルホニルヒドラジン、４−ニトロベンゼンスルホニルヒドラジン、（１−メチルイミダゾール−４−イル）スルホニルヒドラジン、およびメチルスルホニルヒドラジン。
実施例１３
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−ジフルオロメトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミドの調製
ａ． １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−イソシアネート−２−メチルプロパン、化合物１３（ａ）の調製
トリメチルシリルアジド（２６ｍｌ、１８０ｍｍｏｌ）の溶液を、キシレン（１２０ｍｌ）中の２，２−ビス（トリフルオロメチル）プロピオニルフルオリド（３８ｇ、１７９ｍｍｏｌ）および塩化ベンジルトリエチルアンモニウム（０．０６５ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の溶液に、００Ｃでゆっくりと一滴ずつ添加した。添加が完了した際、生じた混合物を１１０℃で加熱した。４時間後、混合物を７６０ｍｍＨｇで蒸留し、そして４０〜５０℃で沸騰する分画が１３（ａ）を含有した。液体産物の収率は６０％である。
ｂ． Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル−２−［（４−ジフルオロメトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミドの調製
１ｍｌの乾燥ＴＨＦ中のメチルアミン（２５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）中の４−ジフルオロベンゼンスルホニルクロリド（６０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で無水ヒドラジン（１５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２時間攪拌した後、１ｍｌのジエチルエーテル中の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−イソシアネート−２−メチルプロパン（１３ａ）（５４ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液。反応混合物を室温で１２時間攪拌した。真空中で溶媒を除去し、そして未精製物質を逆相ＨＰＬＣに供して、白色蝋様固体（８３ｍｇ、７５％）としての産物を得た。
実施例４６
Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−メチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−メチルカルボキサミドの調製
１．６ｍｌのＮＭＰ中の、上述のように調製したＮ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−メチルプロピル）−２−［（４−メチルフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド（１００ｍｇ、０．２５４ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（１６５ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の溶液に、ヨードメタン（１７．５ｙＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。黄色混合物を室温で２時間攪拌した後、５ｍｌの水を添加した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、そして有機相を、水および塩水で連続して洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、そして真空中で濃縮した。ヘキサン中の１０％ ＥｔＯＡｃを用いて、未精製産物をシリカゲル上でクロマトグラフした。
実施例５１
４−フェニルピペラジン−１−（２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−１−トリフルオロメチルエチル）−カルボキサミドの調製
１−フェニルピペラジン（０．０４ｍｌ、０．２５ｍｍｏｌ）に、１ｍｌのジエチルエーテル中の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−イソシアネート−２−メチルプロパン（１３ａ）（１２４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。きつくキャップしたバイアル中、混合物を室温で１２時間攪拌した。反応混合物を逆相ＨＰＬＣ（ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）に供し、そして単離した産物を凍結乾燥して、白色固体としての産物を提供した。
実施例５２〜９８
実施例５１に関して上記に言及する一般的方法にしたがって、化合物１３（ａ）を用い、そしてこれを以下のアミンまたはアニリンと反応させて、実施例５２〜９８の化合物を調製した：モルホリン、２−アセチルアニリン、ピペリジン、３，４，５−トリメトキシアニリン、４−トリフルオロメチルアニリン、４−メチルピペラジン、１−アミノナフタレン、２−クロロアニリン、４−フェニルピペリジン、２−フェニルアニリン、２，６−ジフルオロアニリン、２−アミノベンズアミド、２−クロロ−６−フルオロアニリン、３−トリフルオロメチルアニリン、２−アミノベンゼンスルホンアミド、５−アミノ（２，２，３，３−テトラフルオロ−２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキサン）、３−トリフルオロメトキシアニリン、４−トリフルオロメトキシアニリン、４−メチルピペリジン、２−アミノナフタレン、２−フルオロアニリン、２，６−ジメトキシアニリン、４−アミノ−３−トリフルオロメトキシ安息香酸、アニリン、３−シアノアニリン、３−メトキシアニリン、２−（１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ）アニリン、３−アミノベンゼンスルホンアミド、３−フルオロアニリン、４−ブロモアニリン、２−シアノアニリン、４−シアノアニリン、３−アミノ−２，２−ジフルオロベンゾ［１，３］ジオキサン、４−クロロアニリン、３−メチルアニリン、４−アミノベンゼンスルホンアミド、２，６−ジブロモアニリン、２−メチルアニリン、４−メチルアニリン、ピロリジン、４−フルオロアニリン、２，４−ジブロモアニリン、アゼパン、４−ブロモ−２−トリフルオロメトキシアニリン、２−トリフルオロメトキシアニリン、２−トリフルオロメチルアニリン、および２−メトキシアニリン。
実施例９９〜１１２
以下の合成経路を用いて、実施例９９〜１１２の化合物を調製した：
イソシアネート、２を合成するため、乾燥ｏ−キシレン（１５ｍｌ）中のＭｅ３ＳｉＮ３（３．１２ｍｌ、２５ｍＭｏｌ）の溶液を、乾燥ｏ−キシレン（２０ｍｌ）中のフルオリド、１（５．３４ｇ、２４ｍＭｏｌ）、および塩化トリエチルベンジルアンモニウム（ＴＥＢＡ、２２ｍｇ、４ｍＭｏｌ）の溶液に室温でゆっくり添加した。反応混合物を１１０℃に加熱し、そして４時間攪拌した。未精製反応混合物の蒸留によって、所望のイソシアネート、２を単離した（２．４９ｇ、４６％収率）。
出発試薬としてヒドラジンを用いる一般的方法は以下の通りである：
乾燥ＴＨＦ中のヒドラジド（１当量）の溶液に、乾燥ＴＨＦ中のイソシアネート（１当量）の溶液を添加した。反応混合物を、室温で一晩攪拌した。１０〜８０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡを含む）溶媒系を用いて溶出するＨＰＬＣを用いて、必要な産物を単離した。
出発試薬として酸塩化物を用いた一般的方法は以下の通りである：
乾燥ＴＨＦ中の無水ヒドラジン（１当量）の溶液に、乾燥ＴＨＦ中の酸塩化物（１当量）の溶液をゆっくり添加した。反応混合物を室温で１時間攪拌し、その後、乾燥ＴＨＦ中のイソシアネート（１当量）の溶液を添加した。反応混合物を、室温で一晩攪拌した。１０〜８０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡを含む）溶媒系を用いて溶出するＨＰＬＣを用いて、必要な産物を単離した。
１ ＨＰＬＣによって精製；純度９８％。
２ ＨＰＬＣによって精製；純度９９％。
３ ＨＰＬＣによって精製；純度９７％。
４ ＨＰＬＣによって精製；純度９６％。
アッセイ１
このアッセイでは化合物ライブラリー由来のおよそ４００，０００の化合物を試験した。アッセイプレートを以下のように設定した。９６ウェルプレート上、８０％の集密度でＶｅｒｏ細胞をプレーティングした。ライブラリー由来の試験化合物（プレートあたり８０）を最終濃度５μＭでウェルに添加した。次いで、５日後に９０％ＣＰＥを生じるであろうウイルス希釈でタカリベウイルス（ＴＲＶＬ １１５７３）を添加した（ウイルスストックの８００倍希釈としてあらかじめ決定された；およそ０．００１の感染多重度［ＭＯＩ］）。プレートを３７℃および５％ＣＯ２で５日間インキュベーションし、次いで、５％グルタルアルデヒドで固定し、そして０．１％クリスタルバイオレットで染色した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＶｅｒｓａＭａｘ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて、ＯＤ５７０で、ウイルスＣＰＥの度合いを分光光度的に定量化した。ウイルス感染細胞ウェルの平均ＯＤ５７０から試験化合物ウェルのＯＤ５７０を減じ、次いで偽感染細胞ウェルの平均ＯＤ５７０で割ることによって、各化合物の阻害活性を計算した。結果は、化合物によって与えられたタカリベウイルスＣＰＥ活性に対する防御パーセントに相当する。このアッセイにおける「ヒット」は、試験濃度で５０％より高くウイルス誘導性ＣＰＥを阻害した化合物として定義された。タカリベウイルスＨＴＳキャンペーンにおいてスクリーニングしたおよそ４００，０００の化合物のうち、２，３４７のヒットが同定された（０．５８％ヒット率）。
許容されうる化学構造、抗ウイルス強度および選択性、ならびに抗ウイルス活性スペクトラムを示す阻害化合物（ヒット）として品質ヒットが定義される。特に、ＨＴＳアッセイにおいてヒットとして同定された化合物（上記）を４つの基準に対して評価した：（ｉ）化学的取り扱いやすさ、（ｉｉ）阻害強度、（ｉｉｉ）阻害選択性および（ｉｖ）抗ウイルス特異性。ＨＴＳパラメーターに基づいて、すべてのヒットは＜５μＭのＥＣ５０値を有する。この最初の基準を満たす化合物の化学構造を、化学的取り扱いやすさに関して視覚的に調べた。化学的に取り扱いやすい化合物は、合理的な化学的方法論を用いて合成的にアクセス可能であり、そして化学的に安定な官能性および（潜在的な）薬剤様品質を所持する実体として定義される。この医薬化学フィルターを通過したヒットを、阻害強度に関して評価した。典型的には８つの化合物濃度（５０、１５、５、１．５、０．５、０．１５、０．０５および０．０１５μＭ）に渡る化合物阻害活性のプロットからＥＣ５０値を決定した。ヒットが選択的阻害剤であるかどうかを評価するため、標準的細胞増殖アッセイを用いて、細胞機能に対する影響を決定した。代謝的に活性である細胞における、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）のミトコンドリア酵素による不溶性の青いホルマザン結晶へのｉｎ ｓｉｔｕ還元を測定するテトラゾリウムに基づく比色法を用いて、５０％の細胞傷害性濃度（ＣＣ５０）を決定した。可溶化された結晶を分光光度的に定量化した。ＥＣ５０およびＣＣ５０値を用いて、選択指数（ＳＩ）を計算した（ＳＩ＝ＣＣ５０／ＥＣ５０）。少なくとも１０のＳＩ値を持つヒットをさらに考慮した。
いくつかの関連および非関連ウイルスに対して化合物を試験することにより、ヒット化合物によって示される抗ウイルス活性の特異性を決定した。多様な非関連ＤＮＡ（ＨＳＶ、ＣＭＶ、ワクシニアウイルス）およびＲＮＡ（ＲＳＶ、ロタウイルス、リフトバレー熱、エボラウイルス、エボラＧＰ−偽型、ラッサＧＰ−偽型、ＨＩＶ ｅｎｖ−偽型）ウイルスに対して化合物を試験する。さらなる発展用に選択される化合物は、選択された元来のターゲットウイルスに対して選択性であり、そして非関連ウイルスに対して不活性であるものである。
アッセイ２
多様な別個の供給源から長年に渡って集積した４００，０００化合物の広くそしてよくバランスが取れたコレクションに相当する化学ライブラリーを生成し、そしてスクリーニングした。該ライブラリーは、以下の化学的記述子を伴い、特性空間に渡って広い被覆度を達成する：ｎ−オクタノール／水分配係数の計算対数（ＣｌｏｇＰ）、極性（水アクセス可能表面積（ＰＳＡ））、球度（ｇｌｏｂｕｌａｒｉｔｙ）（三次元構造）および分子量（平均：３９４．５ダルトン）。
細胞およびウイルス
２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補ったイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓上皮、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−８１）細胞を増殖させた。感染培地（ＩＭ）用には、血清濃度を２％に減少させた。１０％熱不活化ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＭＥＭ中で、ＨＥｐ−２細胞（喉頭上皮のヒト癌腫；ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２３）を培養した。１０％熱不活化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２５０３０−０８１）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１１１４０−０５０）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１１３６０−０７０）、および２％重炭酸ナトリウムを含有するＭＥＭ中で、ＭＲＣ−５細胞（ヒト正常肺線維芽細胞；ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ−１７１）を培養した。１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、および２％重炭酸ナトリウム、ならびに６２．５μｇ／ｍｌトリプシンを含むＭＥＭ中でＭＡ１０４細胞（上皮アフリカミドリザル腎臓、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２３７８．１）を培養し、そしてウイルス感染中には血清を含まなかった。すべての細胞株を３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ；Ａ単離体）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ；アームストロングＥ３５０単離体）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ；ＡＤ−１６９単離体）、単純疱疹ウイルス１（ＨＳＶ−１；ＫＯＳ単離体）、ワクシニアウイルス（ＷＲ株）、タカリベウイルス（ＴＲＶＬ １１５７３株）およびロタウイルス（ＷＡ株）をＡＴＣＣから得た（それぞれ、＃ＶＲ−１４２２、＃ＶＲ−１５４０、＃ＶＲ−１３４、＃ＶＲ−５３８、＃ＶＲ−１４９３、＃ＶＲ−１３５４、＃ＶＲ−１１４、および＃ＶＲ−２０１８）。カンディド１およびアマパリＢｅＡｎ７０５６３をテキサス大学医学部（テキサス州ガルベストン）のＲｏｂｅｒｔ Ｔｅｓｈ博士から得た。ＢＳＬ４ウイルス（ラッサ、マチュポ、グアナリト、およびフニン）ならびに重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）を用いた研究は、ＵＳＡＭＲＩＩＤ（メリーランド州フォートデトリック）の共同研究者らによって行われた。
特異性スクリーニングに関する抗ウイルスアッセイ：細胞変性効果（「ＣＰＥ」）アッセイ、ウイルスプラーク減少アッセイ、およびＥＬＩＳＡ
ウイルスＣＰＥアッセイを用いて、タカリベウイルス（Ｖｅｒｏ細胞）、カンディド−１ワクチンウイルス（Ｖｅｒｏ細胞）、アマパリウイルス（Ｖｅｒｏ細胞）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ（Ｖｅｒｏ細胞）、ＨＳＶ−１（Ｖｅｒｏ細胞）、ＲＳＶ（ＨＥｐ−２細胞）、ワクシニアウイルス（Ｖｅｒｏ細胞）、およびロタウイルス（ＭＡ１０４）に対して、化合物の抗ウイルス効果を評価した。酵素連結免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）を用いて、ＣＭＶ（ＭＲＣ−５細胞）およびＬＣＭＶ（Ｖｅｒｏ細胞）に対する化合物の抗ウイルス効果を評価した。２％熱不活化ＦＢＳを含有する適切な培地中で、これらのアッセイすべてを行った。使用２４時間前に、ウェルあたり１．５ｘ１０４（Ｖｅｒｏ細胞）、２．２ｘ１０４（ＨＥｐ−２およびＭＡ１０４）、および４．５ｘ１０４（ＭＲＣ−５）細胞を、９６ウェル細胞培養プレートに植え付けた。化合物感受性試験のため、最終濃度５０、１５．８、５、１．６、０．５、０．１６、０．０５、０．０１６および０μＭで、化合物（１００％ＤＭＳＯで可溶化）を２つ組ウェルに添加した。アッセイ中のＤＭＳＯの最終濃度は、０．５％であった。別個の実験において、ウイルスストックを力価決定して、３日（ＨＳＶ−１、ロタウイルスおよびワクシニア）または４日（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＲＳＶ、タカリベウイルス、カンディド１ワクチンウイルスおよびアマパリウイルス）後、細胞単層の９０％の破壊が生じる濃度（ＣＰＥアッセイ）、あるいは３日（ＬＣＭＶ）または４日（ＣＭＶ）後、６５０ｎｍの光学密度（ＯＤ６５０）で、２．５のＥＬＩＳＡシグナルを生じる濃度を決定した。化合物の連続希釈を含有するウェルに、これらのあらかじめ確立されたウイルス希釈を添加した。非感染細胞および化合物なしにウイルスを添加された細胞を各アッセイプレート上に含めた。さらに、入手可能な場合は参照剤を各アッセイプレート上に含めた（ＨＳＶ−１およびＣＭＶに関してはガンシクロビル、Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ２５３６；ＬＣＭＶおよびＲＳＶに関してはリバビリン、Ｓｉｇｍａ ＃Ｒ９６４４；ならびにワクシニアウイルスに関してはリファンピシン、Ｓｉｇｍａ ＃Ｒ３５０１）。３日間（ＨＳＶ−１、ロタウイルス、ＬＣＭＶ、ワクシニアウイルス）または４日間（タカリベウイルス、アマパリウイルス、カンディド１ウイルス、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＲＳＶ、およびＣＭＶ）のいずれかで、３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベーションした。ＨＳＶ−１、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳＶ、タカリベウイルス、アマパリウイルス、カンディド１ワクチンウイルス感染プレートをクリスタルバイオレット染色のためにプロセシングし、一方、ＣＭＶおよびＬＣＭＶに感染させたプレートをＥＬＩＳＡ分析のためにプロセシングした。クリスタルバイオレット染色のため、プレートを５％グルタルアルデヒドで固定し、そして０．１％クリスタルバイオレットで染色した。リンスし、そして乾燥させた後、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて、５７０ｎｍの光学密度（ＯＤ５７０）を測定した。ＥＬＩＳＡ分析のため、ＬＣＭＶおよびＣＭＶ感染プレートから培地を取り除き、そして１００％メタノール（Ｆｉｓｈｅｒ、ＣＡＳ＃６７−５６−１、ＨＰＬＣ等級）で、室温で２０分間、細胞を固定した。メタノール溶液を取り除き、そしてプレートをＰＢＳで３回洗浄した。１３０μＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３７５１５）を添加することによって、非特異的結合部位を３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング剤を取り除き、そしてウェルをＰＢＳで３回洗浄した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液中、３０μＬのＬＣＭＶ核タンパク質（ＮＰ）特異的モノクローナル抗体（Ｊｕａｎ Ｃａｒｌｏｓ ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州ラホヤの寛大な贈り物）１：２０希釈または３０μＬのＣＭＶ（タンパク質５２およびユニークな長い遺伝子４４産物）特異的カクテルモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ、＃Ｍ０８５４）１：２００希釈を添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、一次抗体溶液を取り除き、そして０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳでウェルを３回洗浄した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液中、１：４０００（ＬＣＭＶ）または１：４００（ＣＭＶ）に希釈した４０μＬのヤギ抗マウス西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ・コンジュゲート化モノクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＃１７２−１０１１）をウェルに添加して、そしてプレートを３７℃で１時間インキュベーションした。二次抗体溶液を取り除き、そしてウェルをＰＢＳで５回洗浄した。１３０μＬの３，３’，５，５−テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ ＃Ｔ０４４０）を添加することによって、アッセイを１５分間発色させて、ペルオキシダーゼ活性を定量化した。６５０ｎｍフィルターとともにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて、生じた反応産物のＯＤ６５０を測定した。
３つの方法によって、タカリベウイルスに対する抗ウイルス活性を評価した：ＣＰＥアッセイ、プラーク減少、およびウイルス収量阻害アッセイ。ＨＴＳ ＣＰＥアッセイのため、Ｖｅｒｏ細胞を９６ウェルプレート上に８０％の集密度でプレーティングした。ライブラリー由来の試験化合物（プレートあたり８０）を最終濃度５μＭでウェルに添加した。次いで、５日後に９０％ＣＰＥを生じるであろうウイルス希釈でタカリベウイルスを添加した（およそ０．００１の感染多重度（「ＭＯＩ」））。プレートを３７℃および５％ＣＯ２で５日間インキュベーションし、次いで、５％グルタルアルデヒドで固定し、そして０．１％クリスタルバイオレットで染色した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて、ＯＤ５７０で、ウイルスＣＰＥの度合いを分光光度的に定量化した。ウイルス感染細胞ウェルの平均ＯＤ５７０から試験化合物ウェルのＯＤ５７０を減じ、次いで偽感染細胞ウェルの平均ＯＤ５７０で割ることによって、各化合物の阻害活性を計算した。結果は、各化合物によって与えられたタカリベウイルスＣＰＥ活性に対する防御パーセントに相当する。このアッセイにおける「ヒット」は、試験濃度（５μＭ）で５０％より高くウイルス誘導性ＣＰＥを阻害した化合物として定義された。化学的取り扱いやすさを持つヒットを、その阻害強度に関して、さらに評価した。８つの化合物濃度（５０、１５、５、１．５、０．５、０．１５、０．０５および０．０１５μＭ）に渡るＣＰＥアッセイ後の化合物阻害活性のプロットから、阻害性濃度５０％（ＥＣ５０）値を決定した。すべての決定を２つ組で行った。
プラーク減少アッセイにおいて、６ウェルプレート中で増殖させたＶｅｒｏ細胞単層を多様な濃度の化合物の非存在下または存在下で、約５０ＰＦＵ／ウェルで感染させた。３７℃で１時間ウイルスを吸着させた後、残った接種物を１％ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロース（脱イオン水中）および２ｘＭＥＭの５０：５０混合物と交換した。３７℃で５〜７日インキュベーションした後、プラークを計数した。ウイルスプラーク数を５０％減少させるのに必要な化合物濃度として、ＥＣ５０を計算した。ＢＳＬ ４条件下、ＵＳＡＭＲＩＩＤで、プラーク減少アッセイ（ラッサ、マチュポ、グアナリト、およびフニンウイルスを用いる）を以下のように行った：２００ＰＦＵの各ウイルスを用いて、Ｖｅｒｏ細胞を感染させた。ウイルス吸着後、細胞単層をリンスし、そして１％アガロースを含有し、そして試験化合物を欠くか、または１５μＭ〜０．０５μＭの範囲で異なる濃度を含むかいずれかの完全培地を重層した。３７℃で５日間インキュベーションした後、単層をニュートラルレッドで染色し、そしてプラーク数を計数した。
ウイルス収量減少アッセイでは、２４ウェルプレート中で増殖させたＶｅｒｏ細胞を、０．１の感染多重度（「ＭＯＩ」）で、濃度あたり２ウェルの異なる濃度の化合物の存在下、タカリベウイルスに感染させた。３７℃で４８時間インキュベーションした後、ウイルスを採取し、そしてＶｅｒｏ細胞におけるプラーク形成によって、ウイルス収量を決定した。上に示すようにＥＣ５０値を計算し、そしてＥＣ９０およびＥＣ９９を決定するため、類似の計算を行った。
細胞傷害性アッセイ
５０％細胞傷害性濃度（ＣＣ５０）を計算可能であるように、細胞増殖アッセイによって細胞生存度を測定して、細胞機能に対する化合物の影響を決定した；ＥＣ５０に対するこの値の比は、選択指数（Ｓ．Ｉ．＝ＣＣ５０／ＥＣ５０）と称される。２種類のアッセイを用いて、細胞傷害性を決定した。一方は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の還元を測定する比色法であり、そしてもう一方は、レサズリン（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）の還元を測定するために蛍光光度法を用いる。どちらの方法も類似のデータを生じた。抗ウイルスアッセイで用いたものと同等のインキュベーション条件を用い、各濃度あたり２ウェルを用いて、９６ウェルプレート中の集密培養を異なる濃度の化合物に曝露した。
医薬化学
タカリベＨＴＳによっていくつかの強力な化合物が同定され、そしていくつかの構造タイプクラスターにグループ分けされた。抗ウイルス活性および化学的取り扱いやすさに基づいて、原型に相当するＳＴ−３３６（ＦＷ＝４０７．３）を含む、化合物の１つのクラスターをさらなる発展のために選択した。ＳＴ−３３６の逆合成分析を通じて、イソシアネートとアシルヒドラジドを合わせることによって、単一の合成工程で、類似体ライブラリーが収束的に調製可能であることが決定された。この化学を用いて、１６５の類似体を調製し、そして最も強力なものをｉｎ ｖｉｔｒｏ代謝に関して調べた。
添加時間実験
本実験は、抗ウイルス化合物の作用機構を性質決定するために設計された。Ｖｅｒｏ細胞を２４ウェル培養プレート中で増殖させた。細胞が７０〜８０％集密度に到達したときに培地を取り除き、そして感染培地と交換した。細胞をＭＯＩ＝０．１でタカリベウイルスに感染させた。１時間吸着させた後、ウイルス接種物を取り除き、そして新鮮な感染培地と交換した。感染１時間前、感染時または感染後の特定の時間（感染１〜２０時間後）に、３μＭ ＳＴ−３３６で複製ウェルを１時間処理した。対照感染細胞培養を薬剤ビヒクル（ＤＭＳＯ）のみで処理した。ＳＴ−３３６を吸着１時間後に取り除き、そして単層を冷ＰＢＳ−Ｍで２回洗浄し、そして新鮮な感染培地と交換した。細胞を感染２４時間後に採取し、そして上述のように力価決定した。
別個の実験において、６ウェルプレート中にプレーティングしたＶｅｒｏ細胞をＭＯＩ＝４でタカリベウイルスに感染させた。吸収を１時間実行した。３μＭのＳＴ−３３６を感染１時間前、感染中、および感染１時間後に１時間添加した。薬剤添加およびウイルス感染後、単層を完全培地で３回洗浄した。最後の薬剤添加の４時間後、プラークが形成されるまで、化合物を含まない１％アガロースを単層に重層した。感染の５〜７日後、単層を固定し、クリスタルバイオレット染色し、そしてプラーク数を計数した。
損なわれていないウイルスへの化合物結合に関するアッセイ
タカリベウイルスに対するＳＴ−３３６の結合／融合阻害特性を試験するため、この実験を設計した。２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ中でＶｅｒｏ細胞を増殖させた。この実験のため、細胞を２４ウェル培養プレート中で、７０〜８０％集密度まで増殖させた。試験管の１セットでは、タカリベウイルス（４０００ｐｆｕ）を１％ＤＭＳＯで処理し、感染培地中で連続して１０倍希釈し、そして特定の濃度のＳＴ−３３６（４００ｐｆｕ＋０．５μＭ ＳＴ−３３６、４０ｐｆｕ＋０．０５μＭ ＳＴ−３３６）またはＤＭＳＯのみ（４００ｐｆｕまたは４０ｐｆｕ＋ＤＭＳＯ）で処理した。試験管の別のセットでは、タカリベウイルス（４０００ｐｆｕ）を５μＭ ＳＴ−３３６で処理し、次いで、感染培地中で連続して１０倍希釈した。懸濁物をウェル中にプレーティングし、そして１時間吸着させた後、接種物を取り除き、そしてＭＥＭ中の０．５％Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロースを重層した。ＤＭＳＯ対照ウェルで細胞変性効果が観察されるまで、プレートを３７℃でインキュベーションした。細胞を５％グルタルアルデヒドで固定し、そしてプラーク視覚化のため、０．１％クリスタルバイオレットで染色した。
ビリオン上の融合前Ｆタンパク質へのＳＴ−３３６の結合特性を試験するために使用した別のアッセイは、透析実験であった。精製タカリベウイルス（１０００ｐｆｕ）を５μＭのＳＴ−３３６または０．５％ＤＭＳＯとインキュベーションした。懸濁物を透析チャンバー中、４℃で一晩透析した。２４時間後、透析ウイルス懸濁物をＶｅｒｏ細胞上で力価決定した。１時間吸着させた後、接種物を取り除き、そしてＭＥＭ中の０．５％Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロース重層を適用した。細胞変性効果が観察されるまで、プレートを３７℃でインキュベーションした。細胞を５％グルタルアルデヒドで固定し、そして０．１％クリスタルバイオレットで染色した。透析されたウイルス−薬剤試料中の遊離薬剤の非存在を確認するため、ウイルスを感染時点で透析混合物中にスパイク処理し、そして上記のようにプラークを発生させた。
薬剤耐性変異体ウイルスの単離
最初に、ＷＴタカリベウイルスの単一プラークを単離した。このプラーク精製のため、６ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞をＷＴタカリベウイルスの５０ｐｆｕ／ウェルに３７℃で１時間感染させた。ウイルス吸着後、接種物を取り除き、そして各ウェルにＭＥＭ中の０．５％Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロースを重層し、そしてプラークが可視になるまで３７℃でインキュベーションした（５〜７日）。４つのプラークを摘み取り、そしてＣＰＥが発展するまで、２４ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞中でさらに増幅させた。培地中に細胞を掻き取り、そして次いで１．５ｍｌ微量遠心管中に収集することによって、ウイルス感染細胞抽出物を採取した。各プラーク精製単離体を１５０ｍｍプレート中でさらに増幅させ、そして次いで１つのウイルスプラークから生じた各ウイルスストックを力価決定した。
化合物耐性タカリベウイルス変異体を単離するため、各野生型プラーク精製単離体を、記載するように３μＭ ＳＴ−３３６の存在下で力価決定した。３μＭ ＳＴ−３３６を含有する培地中、１０４〜１０６ｐｆｕ／ウェルで、６ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞を感染させ、次いで３μＭ ＳＴ−３３６を含有するＭＥＭ中の０．５％ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロースを重層し、そしてプラークが形成されるまでインキュベーションした。プラークを摘み取り、そしてこれを用いて、化合物を含まずに２４ウェルプレート中でＶｅｒｏ細胞に感染させた。ＣＰＥが発展したら、感染ウェルを採取した。次いで、化合物を含まず、そして１μＭおよび３μＭ ＳＴ−３３６とともに、２５μＬの純粋ウイルスストックから出発して、０．５ ｌｏｇ希釈中、９６ウェルプレート上で各薬剤耐性単離体を力価決定した。各突然変異体は、最終ウイルスストックができる前に、数周期のプラーク精製を経た。
配列決定
タカリベＷＴ単離体（１〜４）および４つの薬剤耐性単離体（ＤＲ＃１〜４）の各々からＲＮＡを抽出し、そして逆転写ＰＣＲに用いた。タカリベ由来のＧＰＣに特異的なプライマー（Ｔａｃ−順方向： ５' ＧＣＣＴＡＡＣＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣ（配列番号１）およびＴａｃ−逆方向： ５' ＴＡＡＧＡＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＡＣＡＧＧ（配列番号２））を増幅および配列決定に用いた。
溶解度
２回の試験を用いて、化合物溶解度を評価した：多様な濃度の血清を含むおよび含まない細胞培地中の溶解度、ならびにｐＨ７．４の水性緩衝液中の溶解度。溶液を一晩攪拌し、そして次いで、３０，０００ＭＷカットオフのＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ ＹＭ−３０カラムを通じてろ過して、潜在的に沈殿する化合物およびタンパク質に結合した化合物を取り除いた。ＬＣ／ＭＳまたはＵＶ分光測定によって化合物を定量化した。
安定性
大部分の薬剤の生体内変化の主要経路であることが知られる、酸化性コンジュゲート化酵素（例えばチトクロムＰ４５０、ＵｄＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ）の供給源として多様な種由来のホモジナイズ肝臓の９０００ｘｇ上清（Ｓ９）を用いた吸収系（ペンシルバニア州エクストン）によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ代謝安定性を決定した。質量分析によって、Ｓ９分画中、インキュベーション時間に渡る親化合物の持続性として、代謝安定性を測定した。簡潔には、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ（カンザス州レネクサ）から、ヒト、ラット、マウス、およびモルモットＳ９分画を得た。補因子カクテルを除いた反応混合物を調製し（１ｍｇ／ｍｌ肝臓Ｓ９分画、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＵＤＰＧＡ、１ｍＭ ＰＡＰＳ、１ｍＭ ＧＳＨ、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０μＭ試験品目）、そして３７℃で３分間平衡化した。反応混合物のアリコットを陰性対照として取った。反応混合物のみに、補因子カクテルを添加することによって反応を開始し、そして次いで、反応混合物および陰性対照を、振盪水槽中、３７℃でインキュベーションした。アリコット（１００μｌ）を０、１５、３０、および６０分で３つ組で抜き取り、そして９００μｌの氷冷５０／５０アセトニトリル／ｄＨ２Ｏと合わせて、反応を終結させた。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを介して、各試料を分析した。残存パーセントの自然対数を時間に対してプロットした。直線フィットを用いて、速度定数を決定した。試験品目の残存パーセントが１０％未満になったとき、フィットを切り取った。試験および対照品目の消失に関連する排除半減期を決定して、相対的代謝安定性を比較した。
遺伝毒性
予備的細菌突然変異原性アッセイ（Ａｍｅｓ試験）を用いて、化合物遺伝毒性の潜在性を評価した。このアッセイは、先に記載されるように３２、代謝活性化（アロクロール誘導したラット肝臓Ｓ９）を含むおよび含まない、ネズミチフス菌（Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）テスター系統ＴＡ７００７およびＴＡ７００６（単一塩基対突然変異）およびＴＡ９８（フレームシフト突然変異）を利用した。
ラットおよび新生マウスにおける薬物動態学的（「ＰＫ」）評価
２４時間の期間に渡って採取した血清試料を用いた単一用量研究において、スプレーグ・ドーリーラットにおいて、選択した化合物の経口薬物動態の分析を行った。新生マウスＰＫ評価のため、４日齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを腹腔内（ＩＰ）投薬し、そして血清試料を２４時間の期間に渡って採取した。血漿の５０μｌアリコットを、１．５ｍｌ遠心管中、内部標準（１００ｎｇ／ｍｌトルブタミド）を含有する１５０μｌの１００％アセトニトリルと合わせた。試料をボルテックスし、そして１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、生じた上清の８０μｌアリコットを、ウイルス分析のためＨＰＬＣに移した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって各化合物の血漿レベルを決定し、そしてＷｉｎＮｏｌｉｎソフトウェアを用いて、薬物動態パラメーターを決定した。
新生マウスモデルにおける効能
ＳＴ−２９４の許容性を決定するため、臨床状態を毎日評価しながら、新生（４日齢）ＢＡＬＢ／ｃマウスに０（ビヒクル）、１０、２５、または１００ｍｇ／ｋｇ／日のＳＴ−２９４のＩＰ投薬量を５日間投与した。
タカリベ新生マウスモデルにおけるＳＴ−２９４の効能を試験するため、死を終点として、ＩＰ注射によって、マウスあたり３ｘ１０３ＰＦＵ（３０ｘＬＤ５０）のタカリベウイルスに４日齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（用量群あたり８匹）を曝露した。２５ｍｇ／ｋｇで１日１回１０日間ＩＰ投与されるプラセボ（ビヒクル）、リバビリン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で、あるいは１００ｍｇ／ｋｇで１日１回または５０ｍｇ／ｋｇで１日２回１０日間投与されるＳＴ−２９４のいずれかで、マウスを処置した。マウスを毎日監視し、そして研究期間中、１日おきに重量測定した。病的状態の徴候を示したマウスはいずれも、ＣＯ２窒息によって安楽死させた。すべての動物研究は、実験動物研究施設にしたがい、そして適切なＩＡＣＵＣ再審理を通じて認可された。
結果
タカリベおよび他のＢＳＬ ４ ＮＷＡの間の相同性
アレナウイルス科には、現在、２３の認識されるウイルス種がある４。これらのウイルスは、２つの群に分類されている：旧世界（ラッサ／ＬＣＭ）アレナウイルスおよび新世界（タカリベ群）群。新世界タカリベ群は、クレードＡ、Ｂ、およびＣと称される、３つの系統発生系譜を含む。クレードＢには、原型タカリベウイルス、アマパリウイルスおよび４つの南アメリカカテゴリーＡ病原体（フニン、マチュポ、グアナリトおよびサビア）が含まれる。タカリベウイルスは、４つのウイルスタンパク質すべてに関して、アミノ酸レベルで、フニンウイルスに６７％〜７８％同一である２３。真性のカテゴリーＡアレナウイルスを用いた研究は、最大の実験室封じ込め（ＢＳＬ−４）を必要とし、そしてしたがって、重大な兵站学的および安全性の問題を提示する。タカリベウイルスは、カテゴリーＡ病原体に緊密に関連するため、ウイルス複製の阻害剤に関してスクリーニングするＨＴＳアッセイ発展のため、代理ＢＳＬ ２ ＮＷＡとして選択された。
タカリベＨＴＳアッセイ
タカリベウイルスは、細胞培養中でよく増殖し、そして明らかなウイルス誘導性細胞病変効果（ＣＰＥ）を引き起こすため、９６ウェルプレート中で頑強なＨＴＳ ＣＰＥアッセイが発展された。ＣＰＥアッセイは、化合物の選択指数の計算およびウイルス生活環におけるいかなる必須の工程の阻害剤の同定も可能にする、全細胞アッセイである。タカリベウイルスＨＴＳアッセイでスクリーニングした４００，０００の化合物のうち、２，３４７ヒットが同定された（０．５８％ヒット率）。これらのヒットのすべてが、≦５μＭのＥＣ５０値を有した。次いで、４つの基準：ｉ）化学的取り扱いやすさ、ｉｉ）阻害強度、ｉｉｉ）阻害選択性、およびｉｖ）抗ウイルス特異性に基づいて、２，３４７ヒットを定量化した。化学的に取り扱いやすい化合物は、合理的化学方法論を用いて合成的にアクセス可能であり、そして化学的に安定な官能性および潜在的な薬剤様品質を所持する実体として定義される。この医薬化学フィルターを通過したヒットをその阻害強度に関して評価した。ＥＣ５０、ＣＣ５０、および選択指数（ＳＩ）値を決定して、ヒットが選択的阻害剤であるかどうかを評価した。少なくとも１０のＳＩ値を持つヒットをさらに考慮した。同定された２，３４７ヒットのうち、３６の化合物が品質ヒットのすべての特徴を示した。これらの化合物は、化学的に取り扱いやすく、≦５μＭのＥＣ５０値および≧１０のＳＩ値を有した。３６の品質ヒットのうち、構造型のいくつかのクラスターがあった。さらなる発展のため、１つの構造型を選択し、そしてＳＴ−３３６は、このシリーズの代表的原型である。ＳＴ−３３６は４０７．３３ダルトンの化合物であり、そしてその構造を図１に示す。
表１：ＳＴ−３３６の特異性
結果は、少なくとも２つの独立の決定の平均に相当する。
＊２０μＭは化合物溶解度の限界に相当する。
ＳＴ−３３６の性質決定
表１に見られるように、ＳＴ−３３６は、マイクロモル未満の強度、優れた選択性、ならびにタカリベウイルスとともにカテゴリーＡ ＮＷＡに対する抗ウイルス特異性を有する。タカリベウイルスに対するウイルス収量減少アッセイにおけるＳＴ−３３６の評価は、それぞれ、０．０６８μＭおよび０．０８５μＭのＥＣ９０およびＥＣ９９値を生じた。細胞培地中のこの化合物の溶解度限界に相当する、Ｖｅｒｏ細胞に対するＳＴ−３３６のＣＣ５０値は＞２０μＭであり、＞３６３の選択指数を生じる。タカリベウイルスに対するＳＴ−３３６の活性を多数の細胞株に対して試験し、そしてすべてのＥＣ５０値は、Ｖｅｒｏ細胞に対して得られたものと類似であった（データ未提示）。いくつかのアレナウイルスに対して試験すると、ＳＴ−３３６は、ＯＷＡに対しては、ＬＣＭウイルスまたは真性ラッサウイルスのいずれに対しても阻害活性を示さなかった（表１）。この薬剤はまた、ＮＷＡアマパリウイルスに対する活性も欠いていた。アマパリおよびタカリベウイルス間の緊密な系統発生学的関係２３、１９を考慮すると、これは驚くべき結果である。すべてのＮＷＡのＧＰ２の配列決定に続いて、この相違を後に論じる。しかし、重要なことに、ＳＴ−３３６は、フニンウイルス（カンディド１）ならびにマチュポ、グアナリト、およびフニンのワクチン株に対する強力な抗ウイルス活性を示した（表１）。
表２：ＳＴ−３３６の選択性
結果は、少なくとも２つの独立の決定の平均に相当する。
＊２０μＭは化合物溶解度の限界に相当する。
いくつかの関連および非関連ウイルスに対して試験することによって、ＳＴ−３３６が示す抗ウイルス活性の特異性を決定した。表２に示すように、ＳＴ−３３６は多様な非関連ＤＮＡ（ＨＳＶ、ＣＭＶ、ワクシニアウイルス）およびＲＮＡ（ＲＳＶ、ロタウイルス、ＳＡＲＳおよびエボラウイルス）ウイルスに対してはまったく活性を示さなかった。
ＳＴ−３３６の作用機構
単一周期（２４時間）添加時間実験を行って、ウイルス複製周期中、いつ、ＳＴ−３３６が抗ウイルス活性を発揮するかを決定した。感染前または感染後の多様な時点で、Ｖｅｒｏ細胞培養に化合物を添加した後、タカリベウイルス収量に対するＳＴ−３３６の効果を決定した。ＳＴ−３３６を感染１時間前（−１ｈ）、ウイルス吸着中（０ｈ）、および感染後のいくつかの時点で、添加した。連続添加後、実験の全時間に渡って、感染細胞培養に対して薬剤を維持した。対照感染培養物を薬剤ビヒクル（ＤＭＳＯ）のみで処理した。感染２４時間後、試料を収集し、そしてプラークアッセイによって、ウイルス収量を決定した。図２Ａに示すように、ＳＴ−３３６は、このウイルス生活環の極初期段階にのみ、阻害効果を発揮した。感染後の任意の時点でＳＴ−３３６を添加してもウイルス収量にはまったく影響がなかった。これらのデータによって、ＳＴ−３３６がウイルス複製の初期段階阻害剤であることが示唆される。
添加時間実験の第二のタイプでこれらの結果を確認した。この実験では、感染１時間前（−１ｈ）、感染中（０）および感染１時間後（＋１ｈ）に、化合物を培地に１時間のみスパイク処理し、そして次いで取り除いた。培養を洗浄して、いかなる残渣化合物も取り除き、そしてアガロースを重層した。次いで、ウイルスプラーク数を感染５日後に決定した。図２Ｂのデータは、ウイルス吸着前および後に１時間添加した化合物がプラーク形成にまったく影響がなかった一方、１時間の吸着／侵入プロセス中に添加した化合物が、タカリベプラーク形成を劇的に減少させることを示した。これらのデータは、ＳＴ−３３６が吸着／侵入阻害剤であることとと一致する。
ＳＴ−３３６が損なわれていないビリオンに結合するかどうかを決定するため、２つのアプローチを取った。最初の実験では、１０００ＰＦＵの精製タカリベウイルスをＳＴ−３３６またはＤＭＳＯとインキュベーションし、そして４℃で一晩透析し、そして力価決定した。薬剤と元来インキュベーションした透析バッグからはウイルスはまったく力価決定されなかった一方、ＤＭＳＯビヒクル透析バッグからは３００を超えるＰＦＵのウイルスが力価決定された（データ未提示）。ウイルスに加えた薬剤の透析混合物が、新鮮に添加されたタカリベウイルス（３００ＰＦＵ）を阻害不能であることによって測定されるように、５μＭの薬剤を元来含有した透析バッグ中には、薬剤は生物学的にまったく検出されなかった。これらのデータは、ＳＴ−３３６が、非常に緩慢な解離定数で、損なわれていないビリオンに結合することを示唆した。第二の実験において（図３）、５μＭのＳＴ−３３６またはＤＭＳＯを含む試験管中でタカリベウイルスをインキュベーションした。連続１：１０希釈を行い、そしていくつかの試料に関して、試料希釈後に期待される薬剤濃度に相当する特定の希釈として、ＳＴ−３３６を添加した。ウイルスおよび化合物が培地で希釈されるにつれて、化合物がウイルスに結合可能でない限り、化合物濃度は、阻害効果を持たない濃度に達するであろう。最初の試験管中に化合物を含まない試験ウイルスもまた、培地中で希釈し、そしてウイルスおよび化合物が一緒に希釈された試験管で見られるものに対応する化合物濃度を各ウイルス希釈に添加した。Ｖｅｒｏ細胞に対する力価決定によって、最初の試験管中に過剰に存在するＳＴ−３３６は、特定のウイルス結合を通じて、２つのさらなる１：１０希釈に持ち越され、そしてウイルス感染を阻害することが示された。対照的に、明記する希釈で薬剤を添加すると、ウイルスは、薬剤とともに希釈されたウイルスと同じ度合いには阻害されなかった（データ未提示）。これらのデータによって、ＳＴ−３３６は、タカリベウイルス上に存在する、損なわれていないタンパク質に、少なくとも緩慢なＫｏｆｆで結合することが示唆される。
薬剤耐性変異体の単離
ＲＮＡウイルスの予期される突然変異率は非常に高く（１０，０００中、〜１の突然変異体）、そして抗ウイルス薬のターゲットを決定するための一般的なアプローチは、抗ウイルス薬に対するウイルス耐性を単離し、そして次いで、耐性部位をマッピングすることである。ＳＴ−３３６に対して、減少した感受性を持つウイルス変異体は、ＳＴ−３３６の存在下でプレーティングされた野生型タカリベウイルスストックから単離された。ＳＴ−３３６薬剤耐性（ＳＴ−３３６ＤＲ）変異体の観察される頻度は、ＲＮＡウイルスに関して予期される通りである。４つの独立の野生型タカリベウイルスストック由来の１６のＳＴ−３３６ＤＲ単離体を単離し、そして３回プラーク精製した。すべてのＳＴ−３３６ＤＲ単離体を、ＳＴ−３３６の存在下で増殖する能力に関して試験した。ＳＴ−３３６ＤＲ単離体の増殖は、野生型タカリベウイルス複製を完全に阻害する濃度でのＳＴ−３３６の存在によって影響を受けなかった（データ未提示）。薬剤耐性ウイルス変異体の単離および確認によって、ＳＴ−３３６が直接抗ウイルス阻害剤として作用することが強く示唆される。
耐性およびＳＴ−３３６の分子ターゲットに関する遺伝的基礎を決定するため、野生型およびＳＴ−３３６ＤＲ単離体からＲＮＡを単離した。添加時間実験に基づいて、ウイルス糖タンパク質がＳＴ−３３６のターゲットなのではないかと推測された。Ｓセグメントの全糖タンパク質前駆体ＧＰＣ領域を配列決定した。４つの野生型単離体（ＷＴ＃１〜４）および各々の対応する親野生株単離体に適用した薬剤選択由来の４つのＳＴ−３３６ＤＲ単離体（ＷＴ＃１由来のＤＲ＃１．１、ＷＴ＃２由来のＤＲ＃２．１、ＷＴ＃３由来のＤＲ＃３．１、およびＷＴ＃４由来のＤＲ＃４．１）に関して、配列分析を行った。配列分析によって、４つの親野生型単離体由来のＧＰＣ遺伝子は同一配列を有することが示された。４つの薬剤耐性変異体のＧＰＣ配列に比較すると、各々は単一ヌクレオチド変化を所持し、これはすべての場合でアミノ酸変化を生じた。図４Ａは、ＧＰ２の膜貫通ドメイン中または該ドメイン周辺に位置する各突然変異の位置を示す。変化を含有するＧＰ２の領域の配列並列を図４Ｂに提示する。単一変化は、ＤＲ＃１．１ではアミノ酸４１８位（Ｉ４１８Ｔ）、ＤＲ＃２．１ではアミノ酸４１６位（Ｔ４１６Ｎ）、ＤＲ＃３．１ではアミノ酸４３３位（Ｓ４３３Ｉ）、そしてＤＲ＃４．１ではアミノ酸４３６位（Ｆ４３６Ｉ）であった。Ｉ４１８は、すべてのクレードＢ新世界アレナウイルスにおいて、同様に保存され（ＩまたはＬ、しかし決してＴではない）、一方、Ｔ４１６は、すべてのクレードＢ ＮＷＡの間で保存されている。Ｆ４３６は１つを例外として同様に保存され；アマパリウイルスは４３６位でロイシンをコードする。アマパリウイルスのこの変化は、ＳＴ−３３６への感受性の欠如を説明しうる（表２）。Ｉ４１８、Ｔ４１６、Ｓ４３３およびＦ４３６は、エンベロープ化ウイルス融合において、重要な役割を果たすことが知られる領域である、ＧＰ２の推定上の膜貫通ドメインのＮ末端およびＣ末端境界の近傍に位置する１７、２７、２８、３８、３９。総合すると、これらのデータは、４１６、４１８、４３３または４３６位いずれかの位のアレナウイルスＧＰ２におけるアミノ酸変化が、ウイルス学的実験によって示唆されるような、提唱される融合阻害機構と一致することを示唆する。
ヒットからリードへの最適化
予備的データは、ＳＴ−３３６が、興味深い抗ウイルス活性および特異性を示す一方で、げっ歯類（マウスおよびラット、データ未提示）において、劣った薬物動態学的（ＰＫ）特性を有することを示した。ＳＴ−３３６のＰＫ特性を改善するため、リード最適化化学キャンペーンを開始した。最適化プログラムの目的は、最終的な薬剤製品プロフィールと一致する特質を所持する化合物を開発することであった。リード最適化活動は、リード構造の類似体の設計および化学合成を伴う一連の反復、その後、新規化合物の一連の生物学的、物理化学的、および薬理学的評価を含んだ。化学的類似体は、第一のｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス学的および細胞傷害性評価、その後、列挙するような一連の評価：ｉｎ ｖｉｔｒｏ代謝安定性（Ｓ９）、溶解度、予備的細菌突然変異誘発および薬物動態学的評価を伴う、化合物評価パラダイムを経る。１６５の類似体を調製し、そして最も強力なものを、Ｓ９肝臓抽出物中のｉｎ ｖｉｔｒｏ代謝に関して調べた。最も安定なものをラットに投薬し、そしてＳＴ−２９４が、化合物の強力で経口的、生物学的に利用可能な代表として出現した。
ＳＴ−２９４の性質決定
ＳＴ−２９４（Ｎ−２−（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−１−メチルプロピル）−２−［（４−ジフルオロメトキシフェニル）スルホニル］ヒドラジン−１−カルボキサミド）の構造を図５に示す。ＳＴ−３３６で生成した薬剤耐性タカリベ突然変異体（ＤＲ＃１〜４）に対してＳＴ−２９４を試験し、そしてすべての突然変異体がＳＴ−２９４への交差耐性を誘発したことから、この化合物が、ＧＰ２のＳＴ−３３６と同じ領域をターゲティングすることが示唆される（データ未提示）。タカリベ、マチュポ、グアナリト、およびフニンウイルスに対するＳＴ−２９４の活性は、ＳＴ−３３６で見られたものと類似であった（表３）。Ｖｅｒｏ細胞に対するＳＴ−２９４のＣＣ５０は、＞５０μＭであり、選択指数＞４１６を生じた。ＳＴ−２９４のさらなる性質決定によって、この化合物が、１０％ウシ胎児血清を含有する培地中で２３μＭまで可溶性であり、そしてＰＨ７．４の緩衝液中で、４８０μＭまで可溶性であることが示された（表３）。ラット、マウス、ヒト、およびモルモット由来のＳ９肝臓抽出物において、ＳＴ−２９４の代謝安定性を試験し、そしてこれが、ヒトＳ９において最も安定であり、続いて、それぞれ、マウス、ラットおよびモルモットで安定であることが見出された（表３）。ＳＴ−２９４の経口薬物動態学の分析をまず、ラットで行ったが、これはこの種がこのタイプの研究に関して最もよく性質決定されているためである。経口経管栄養によってＳＴ−２９４をラットに投与し、そして２４時間に渡って試料を採取した。血清レベルは非常に高く（Ｃｍａｘ＝６６７０ｎｇ／ｍｌ）、そしてＳＴ−２９４は優れた経口生物学的利用能（６８．２％）を有する（表３）。
表３：ＳＴ−２９４の性質決定
新生マウスモデルにおけるＳＴ−２９４での効能研究
ＳＴ−２９４は、ＮＷＡに対する強力な抗ウイルス活性および優れた薬剤様特性を有するため、次の工程は、ＳＴ−２９４が動物モデルにおいてＮＷＡ誘導性疾患を阻害する能力を試験することであった。カテゴリーＡ病原体に関しては、実験はＢＳＬ４封じ込めを必要とする。しかし、最初の読み取りを得る努力の中で、新生マウスにおけるタカリベウイルス曝露モデルが確立された。本研究の準備において、効能試験を行う前に、新生マウスにおいて、ＳＴ−２９４を用いて、ＰＫおよび取り扱いやすさの実験を行った。新生（４日齢）ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０ｍｇ／ｋｇのＳＴ−２９４をＩＰ投与し、そして分析のために血液試料を収集した。タカリベウイルスＣＰＥを阻害するのに必要なｉｎ ｖｉｔｒｏ抗ウイルス濃度（ＥＣ５０＝６６ｎｇ／ｍｌ）に比較して、新生マウスにおける平均血漿濃度は、長期間、このレベルをはるかに超えていた（投薬後８時間まで＞１５ｘ、そして２４時間で６ｘ、データ未提示）。このモデルにおいて、新生マウスに対して多数回の経口経管栄養を行うのは困難であるため、ＩＰ経路を介して薬剤を送達する。取り扱いやすさを試験するため、新生マウスにＳＴ−２９４の０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲でＩＰ投薬量を５日間投与した。毒性の臨床的徴候がなく、そして対照マウスと同じ速度でマウスの体重が増加したため、５日間の１００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬は、新生マウスによってよく許容された（データ未提示）。１００ｍｇ／ｋｇ／日のＳＴ−２９４のこの最高の試験濃度を、タカリベ動物効能研究で用いた。
新生マウスにおけるＰＫ研究で示された薬剤レベルおよび半減期は、ラットで見られるものと同等ではなかったが、血清レベルは、タカリベ動物モデルにおいて、概念実証動物研究を実行するのに十分なレベルに見えた。４日齢のマウスを３０ｘＬＤ５０のタカリベウイルスに曝露し、そしてプラセボ、対照としてのリバビリン、またはＳＴ−２９４で処置した。図６における結果が示すように、ＳＴ−２９４は、タカリベ感染新生マウスにおいて効能を示し、生存および死の遅延はどちらも薬剤対照（リバビリン）と類似であった。総合すると、これらのデータは、モルモットおよび霊長類が真性ＮＷＡ（フニンおよびグアナリトウイルス）に曝露され、そして感染後の多様な時点で、そして予防的にＳＴ−２９４で処置される、最終的な動物研究に進行するのに、ＳＴ−２９４が有望でそして適切な薬剤候補であることを示唆する。
考察
成功したＨＴＳおよび医薬化学プログラムを通じて、ＮＷＡ抗ウイルス薬剤候補、ＳＴ−２９４が同定された。この薬剤は、３つのＮＩＡＩＤ／ＣＤＣカテゴリーＡウイルス（フニン、マチュポ、およびグアナリトウイルス）を含むＮＷＡウイルスをｉｎ ｖｉｔｒｏで強力に、そして選択的に阻害する。この化合物をまた、Ｓ９肝臓抽出物における安定性に関して、そして薬物動態学的特性に関しても評価し、そして該化合物が代謝的に安定であり、そして経口的に生物学的に利用可能であることを見出した。予備的動物効能研究において、ＳＴ−２９４は、新生マウスにおいて、タカリベウイルスが誘導する疾患に対して有意な防御を示した。作用機構研究を通じて、この一連の化合物がＧＰ２をターゲットとし、そしてウイルス侵入阻害剤であることが明らかである。
透析および希釈実験（図３）から、薬剤がウイルスに結合し、そして希釈中に持ち越されることが明らかである。この現象は、他の実験中にウイルス試料を力価決定する際に潜在的に効果を有しうる。しかし、時間添加実験において、感染の１時間以上後に添加した場合、高い希釈が力価に影響を及ぼすために、十分な薬剤持ち越しはなかった（図２）。
ＳＴ−２９４は、ＳＴ−３３６よりも優れたＳ９安定性を有するため、代謝は芳香族環上のメチル基で起こると考えられた（図１）。ベンジル位は酸化に感受性である。ＳＴ−２９４におけるように、存在するベンジル水素がない場合（図２）、酸化は遮断され、そしてしたがって、最速の代謝経路が排除される。ＳＴ−２９４のジフルオロメトキシ基の付加によって、この化合物にＳ９安定性増加が与えられるが、抗ウイルス活性は減少しなかった。
タカリベ新生マウスモデルにおいて、マウスは、神経学的疾患（後半身麻痺によって示される）で死ぬようであり、そしてＳＴ−２９４が血液脳関門を横断可能であるかどうかは知られていない。また、新生マウスにおいてＩＰ投与された薬剤レベルおよびこの薬剤候補の半減期は、ラットにおける経口投薬ほど優れておらず、したがって、血清レベルおよび脳に到達する化合物は、このモデルにおいて、完全な防御を得る能力を損なっている可能性もある。アレナウイルスによって引き起こされる出血熱のより適切な動物モデルは、モルモットおよび非ヒト霊長類におけるものであり、この場合、ウイルスは主に脾臓、リンパ節および骨髄において複製され、出血性体質を引き起こす。モルモットモデルは、フニン、マチュポ、およびグアナリトウイルス疾患に関してよく確立されており、そして前臨床研究中の評価のための最適な小動物モデルを代表する２６、３４。フニンウイルスの病原性株に感染したモルモットは、ヒトＡＨＦに似た致死疾患を発展させる３７。
ウイルス融合タンパク質の機能における膜貫通ドメインの役割の多くの報告がある。インフルエンザウイルス赤血球凝集素の場合、完全融合活性には膜貫通アンカーが必要であることが明らかである２７。対照的に、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型、ネズミ白血病ウイルス、泡沫状ウイルス、コロナウイルス、ニューカッスル病ウイルスおよび麻疹ウイルスにおいて、膜貫通ドメイン内の特定の配列必要性が同定されている２７。これらの研究中に生成した薬剤耐性変異体に基づいて、化合物のＳＴ−３３６クラスはＧＰ２エンベロープタンパク質をターゲットとし、膜貫通領域中またはその周囲に生じる突然変異は、薬剤に対する感受性の減少を誘発する（図４）。
ウイルスエンベロープおよび細胞受容体の間の相互作用をターゲットとする薬剤は、抗ウイルス薬剤の新規クラスに相当する。ＨＩＶ療法に関して、侵入阻害剤は、多剤耐性ウイルスに対する活性のため、近年大きな興味を集めてきている。ＨＩＶに対する新規抗ウイルス薬は、エンフビルチドと呼ばれ、最近ＦＤＡによって認可された。エンフビルチド（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））は、６つのらせん束の形成を遮断し、そしてしたがって膜融合を防止する、強力な融合阻害剤である２９。エンフビルチドは、治療を経験したＨＩＶ感染患者において、ウイルス学的および免疫学的応答を改善するのに成功している３３。異なる開発段階にある、ＨＩＶ侵入に反撃する、いくつかの他の化合物があり、この中には：１）付着阻害剤、デキストリン−２−サルフェート；２）糖タンパク質（ｇｐ）１２０／ＣＤ４相互作用の阻害剤、ＰＲＯ５４２、ＴＮＸ３５５およびＢＭＳ４８８０４３；ならびに３）ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４をターゲットとするものに細分される共受容体阻害剤が含まれる２０。エンフビルチドおよび開発経路中にある他の薬剤の成功は、ウイルス侵入阻害剤が、ヒトにおいてウイルス疾患を治療するために使用可能であることの証明である。
ＳＴ−２９４はまた、ウイルスに結合するようであり（図３）、そして感染を防止するであろうため、予防使用の潜在的能力も有する。他のウイルス侵入阻害剤は、予防的に投与された際、防御を示した２２。
本明細書に示す結果は、ＳＴ−２９４が、カテゴリーＡ出血熱ウイルス（フニン、マチュポ、およびグアナリト）を含む新世界アレナウイルスの強力な特異的阻害剤であることを示す。より重要なことに、ＳＴ−２９４のターゲット（細胞へのウイルス侵入）は、抗ウイルス薬発展のための実行可能なターゲットとして働く。ウイルス感染は、ナノモル範囲の濃度で完全に阻害可能であるため、ＳＴ−２９４のターゲットは、アクセス可能であり、そして感染プロセスにおける役割を崩壊させる試薬に非常に感受性が高いようである。
アッセイ３
細胞変性効果（「ＣＰＥ」）アッセイ
ウイルスＣＰＥアッセイを用いて、タカリベウイルス（Ｖｅｒｏ細胞）、カンディド−１ワクチンウイルス（Ｖｅｒｏ細胞）、アマパリウイルス（Ｖｅｒｏ細胞）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ（Ｖｅｒｏ細胞）、ＨＳＶ−Ｉ（Ｖｅｒｏ細胞）、ＲＳＶ（ＨＥｐ−２細胞）、ワクシニアウイルス（Ｖｅｒｏ細胞）、およびロタウイルス（ＭＡ１０４）に対して、実施例１００〜１１３の抗ウイルス効果を評価した。酵素連結免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）を用いて、ＣＭＶ（ＭＲＣ−５細胞）およびＬＣＭＶ（Ｖｅｒｏ細胞）に対する化合物の抗ウイルス効果を評価した。２％熱不活化ＦＢＳを含有する適切な培地中で、これらのアッセイすべてを行った。使用２４時間前に、ウェルあたり７ｘ１０４（Ｖｅｒｏ）、２．２ｘ１０４（ＨＥｐ−２およびＭＡ１０４）、および４．５ｘ１０４（ＭＲＣ−５）細胞を、９６ウェル細胞培養プレートに植え付けた。化合物感受性試験のため、最終濃度５０、１５．８、５、１．６、０．５、０．１６、０．０５、０．０１６および０μＭで、化合物（１００％ＤＭＳＯで可溶化）を２つ組ウェルに添加した。アッセイ中のＤＭＳＯの最終濃度は、０．５％であった。別個の実験において、ウイルスストックを力価決定して、３日（ＨＳＶ−Ｉ、ロタウイルスおよびワクシニア）または７日（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＲＳＶ、タカリベウイルス、カンディド１ワクチンウイルスおよびアマパリウイルス）後、細胞単層の９０％の破壊が生じる濃度（ＣＰＥアッセイ）、あるいは３日（ＬＣＭＶ）または４日（ＣＭＶ）後、６５０ｎｍの光学密度（ＯＤ６５０）で、２．５のＥＬＩＳＡシグナルを生じる濃度を決定した。化合物の連続希釈を含有するウェルに、これらのあらかじめ確立されたウイルス希釈を添加した。非感染細胞、および化合物なしにウイルスを添加された細胞を各アッセイプレート上に含めた。さらに、入手可能な場合は参照剤を各アッセイプレート上に含めた（ＨＳＶ−ＩおよびＣＭＶに関してはガンシクロビル、Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ２５３６；ＬＣＭＶおよびＲＳＶに関してはリバビリン、Ｓｉｇｍａ ＃Ｒ９６４４；ならびにワクシニアウイルスに関してはリファンピシン、Ｓｉｇｍａ ＃Ｒ３５０１）。プレートを３７℃および５％ＣＯ２で、３日間（ＨＳＶ−Ｉ、ロタウイルス、ＬＣＭＶ、ワクシニアウイルス）または７日間（タカリベウイルス、アマパリウイルス、カンディド１ウイルス、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＲＳＶ、およびＣＭＶ）のいずれかでインキュベーションした。ＨＳＶ−１、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ロタウイルス、ワクシニアウイルス、ＲＳＶ、タカリベウイルス、アマパリウイルス、カンディド１ワクチンウイルス感染プレートをクリスタルバイオレット染色のためにプロセシングし、一方、ＣＭＶおよびＬＣＭＶに感染させたプレートをＥＬＩＳＡ分析のためにプロセシングした。クリスタルバイオレット染色のため、プレートを５％グルタルアルデヒドで固定し、そして０．１％クリスタルバイオレットで染色した。リンスし、そして乾燥させた後、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて、５７０ｎｍの光学密度（ＯＤ５７０）を測定した。ＥＬＩＳＡ分析のため、ＬＣＭＶおよびＣＭＶ感染プレートから培地を取り除き、そして１００％メタノール（Ｆｉｓｈｅｒ、ＣＡＳ＃６７−５６−１、ＨＰＬＣ等級）で、室温で２０分間、細胞を固定した。メタノール溶液を取り除き、そしてプレートをＰＢＳで３回洗浄した。１３０μＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ ＃３７５１５）を添加することによって、非特異的結合部位を３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング剤を取り除き、そしてウェルをＰＢＳで３回洗浄した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液中、３０μＬのＬＣＭＶ核タンパク質（ＮＰ）特異的モノクローナル抗体（Ｊｕａｎ Ｃａｒｌｏｓ ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州ラホヤの寛大な贈り物）１：２０希釈または３０μＬのＣＭＶ（タンパク質５２およびユニークな長い遺伝子４４産物）特異的カクテルモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ、＃Ｍ０８５４）１：２００希釈を添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、一次抗体溶液を取り除き、そして０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳでウェルを３回洗浄した。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液中、１：４０００（ＬＣＭＶ）または１：４００（ＣＭＶ）に希釈した４０μＬのヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート化モノクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＃１７２−１０１１）をウェルに添加して、そしてプレートを３７℃で１時間インキュベーションした。二次抗体溶液を取り除き、そしてウェルをＰＢＳで５回洗浄した。１３０μＬの３，３’，５，５−テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ ＃Ｔ０４４０）を添加することによって、アッセイを１５分間発色させて、ペルオキシダーゼ活性を定量化した。６５０ｎｍフィルターとともにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて、生じた反応産物のＯＤ６５０を測定した。
３つの方法によって、タカリベウイルスに対する抗ウイルス活性を評価した：ＣＰＥアッセイ、プラーク減少、およびウイルス収量阻害アッセイ。ＨＴＳ ＣＰＥアッセイのため、Ｖｅｒｏ細胞を９６ウェルプレート上に８０％の集密度でプレーティングした。ライブラリー由来の試験化合物（プレートあたり８０）を最終濃度５μＭでウェルに添加した。次いで、７日後に９０％ＣＰＥを生じるであろうウイルス希釈でタカリベウイルスを添加した（およそ０．００１の感染多重度（「ＭＯＩ」））。プレートを３７℃および５％ＣＯ２で７日間インキュベーションし、次いで、５％グルタルアルデヒドで固定し、そして０．１％クリスタルバイオレットで染色した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて、ＯＤ５７０で、ウイルスＣＰＥの度合いを分光光度的に定量化した。ウイルス感染細胞ウェルの平均ＯＤ５７０から試験化合物ウェルのＯＤ５７０を減じ、次いで偽感染細胞ウェルの平均ＯＤ５７０で割ることによって、各化合物の阻害活性を計算した。結果は、各化合物によって与えられたタカリベウイルスＣＰＥ活性に対する防御パーセントに相当する。ＣＰＥアッセイ後の８つの化合物濃度（５０、１６、５、１．６、０．５、０．１６、０．０５および０．０１６μＭ）に渡る化合物阻害活性のプロットから、阻害性濃度５０％（ＥＣ５０）値を決定した。ＡＵ決定を２つ組で行った。
プラーク減少アッセイにおいて、６ウェルプレート中で増殖させたＶｅｒｏ細胞単層を多様な濃度の化合物の非存在下または存在下で、約５０ＰＦＵ／ウェルで感染させた。３７℃および５％ＣＯ２で１時間ウイルスを吸着させた後、残った接種物を１％ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロース（脱イオン水中）および２ｘＭＥＭの５０：５０混合物と交換した。３７℃で５〜７日インキュベーションした後、プラークを計数した。ウイルスプラーク数を５０％減少させるのに必要な化合物濃度として、ＥＣ５０を計算した。ＢＳＬ ４条件下、ＵＳＡＭＲＩＩＤで、プラーク減少アッセイ（ラッサ、マチュポ、グアナリト、およびフニンウイルスを用いる）を以下のように行った：各２００ＰＦＵのウイルスを用いて、Ｖｅｒｏ細胞を感染させた。ウイルス吸着後、細胞単層をリンスし、そして１％アガロースを含有し、そして試験化合物を欠くか、または１５μＭ〜０．０５μＭの範囲で異なる濃度を含むかいずれかの完全培地を重層した。３７℃および５％ＣＯ２で５日間インキュベーションした後、単層をニュートラルレッドで染色し、そしてプラーク数を計数した。
ウイルス収量減少アッセイでは、２４ウェルプレート中で増殖させたＶｅｒｏ細胞を、０．０１の感染多重度（「ＭＯＩ」）で、濃度あたり２ウェルの異なる濃度の化合物の存在下、タカリベウイルスに感染させた。３７℃で４８時間インキュベーションした後、ウイルスを採取し、そしてＶｅｒｏ細胞におけるプラーク形成によって、ウイルス収量を決定した。上に示すようにＥＣ５０値を計算し、そしてＥＣ９０およびＥＣ９９を決定するため、類似の計算を行った。
細胞傷害性アッセイ
５０％細胞傷害性濃度（ＣＣ５０）を計算可能であるように、細胞増殖アッセイによって細胞生存度を測定して、細胞機能に対する化合物の影響を決定した；ＥＣ５０に対するこの値の比は、選択指数（Ｓ．Ｉ．＝ＣＣ５０／ＥＣ５０）と称される。３種類のアッセイを用いて、細胞傷害性を決定した。１つは、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の還元を測定する比色法であり、１つは、レサズリン（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）の還元を測定するために蛍光光度法を用い、そして最後の方法は、クリスタルバイオレットの光学密度測定を用いる。３つの方法はすべて類似のデータを生じた。抗ウイルスアッセイで用いたものと同等のインキュベーション条件を用い、各濃度あたり２ウェルを用いて、９６ウェルプレート中の集密培養を異なる濃度の化合物に曝露した。クリスタルバイオレット染色には、プレートを５％グルタルアルデヒドで固定し、そして０．１％クリスタルバイオレットで染色した。リンスし、そして乾燥させた後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて、５７０ｎｍの光学密度（ＯＤ５７０）を測定した。
アッセイ４
偽型抗ウイルスアッセイ
ウイルス偽型を用いて、上述のＳＴ−３３６のウイルスターゲットが、アレナウイルスエンベロープ糖タンパク質であることを立証した。これは、ウイルス自体ではなく、ターゲットウイルスのエンベロープタンパク質のみを用いる代理アッセイである。レポーター遺伝子を含有する複製不全レトロウイルスプロウイルス、および異種ウイルスエンベロープを発現するプラスミドの同時トランスフェクションによって、ウイルス偽型を生成する。相同レトロウイルスエンベロープが発現されず、そしてしたがって出芽ウイルス粒子が非特異的に細胞表面タンパク質を捕捉するため、異種ウイルスエンベロープタンパク質が獲得されるように、プロウイルスを操作する。この方式で調製された偽型は、異種エンベロープを通じて細胞を感染させ、そして一般的に、異種エンベロープの機能をアッセイするのに用いられる４０−４５。組み込まれたレポーター構築物から生じるシグナルによって、感染を測定する。本明細書に記載する研究には、ホタル・ルシフェラーゼレポーターを含むｅｎｖ不全ＨＩＶプロウイルスを用いた。細胞培養株を感染させるのに用いた感染性ウイルスの量は、数桁に渡って、感染細胞中で産生されるルシフェラーゼが仲介する発光に正比例する。非関連ウイルスエンベロープ、通常、水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶｇタンパク質を含有する偽型ウイルスを、特異性対照として用いる。
ウイルス偽型の別の使用は、これらが由来したウイルスの背景外のエンベロープの機能分析を可能にすることである。多くの出血熱ウイルスは、最大の実験室封じ込め（ＢＳＬ−４）を必要とし、これは重大な兵站学的および安全性の問題を与える。代理アッセイは病原体自体を使用しないため、より制限されないＢＳＬ−２実験室条件下で実行可能である。この戦略を用いて、マチュポおよびグアナリトウイルスなどの、通常は最大の実験室封じ込めを必要とする出血熱アレナウイルスに対する抗ウイルス効能を調べた。
組織培養細胞、通常、２９３Ｔ（ヒト胚性腎臓）またはＭＲＣ−５（ヒト肺）において、偽型ウイルス感染をアッセイする。細胞が翌日に幾分、集密未満であるように、細胞を９６ウェルプレートに植え付ける。所定の化合物の阻害特性を試験するため、ＤＭＳＯ中で連続化合物希釈を調製する。次いで、これらの希釈を各々、細胞培地中でさらに１００倍希釈する。細胞培地を培地中の化合物希釈と交換し、そして次いで続いて、等体積の偽型ウイルスストックを添加する。各ウェルに添加するウイルスの量が、２０対５０のシグナル対ノイズ比を提供するルシフェラーゼシグナルを生じるのに十分であるように、偽型ウイルスを細胞培地中で希釈する。Ｐｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッセイ系などの標準的なルシフェリンに基づく生物発光検出法を用いて、感染２〜３日後、ルシフェラーゼ活性を測定する。各化合物希釈を３つ組で試験し、そしてルシフェラーゼ活性を、同じプレート上の陽性（化合物なし）および陰性（ウイルスなし）対照に基づいて、感染性パーセントに変換する。ｙ＝Ａ＋Ｂ／（１＋（ｘ／Ｃ）＾Ｄ）、式中、Ａ（最低値）およびＢ（最高値）がそれぞれ０および１００％に固定されている、Ｃ＝ＥＣ５０、Ｄ＝傾斜係数、ｘ＝化合物濃度、およびｙ＝応答に適合する４パラメーターロジスティックモデルを用いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ用のＩＤＢＳ ＸＬｆｉｔ４．１ソフトウェアで、５０パーセント有効濃度（ＥＣ５０）を計算する。
本明細書に引用するすべての参考文献は、すべての目的のために、その全体が援用される。

Claims (32)

  1. ウイルス感染または該感染に関連する疾患の治療または予防のための方法であって、以下の式ＩＩ：
    式中
    ｎは０〜６の整数であり；
    ｍは０〜１の整数であり；
    Ｒ１は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択され；
    Ｒ２は、置換または非置換フェニル、置換および非置換アリール、置換および非置換ヘテロアリール、置換または非置換アルキル、置換または非置換分枝アルキル、ならびに置換または非置換不飽和シクロへテロアルキルからなる群より選択されるか；
    あるいはＲ１およびＲ２が一緒に合わせて置換または非置換Ｃ４−１０環状飽和ヘテロアルキルを形成し；
    Ｒ３およびＲ４は、Ｈおよびアルキルからなる群より独立に選択される
    の化合物；またはその薬学的に許容されうる塩を、こうした方法を必要とする哺乳動物に療法的有効量で投与する工程を含む、前記方法。
  2. ｎが０、１または２である、請求項１の方法。
  3. ｎが１である、請求項１の方法。
  4. ｍが１である、請求項１の方法。
  5. ｍが１であり、そしてｎが１である、請求項１の方法。
  6. 式ＩＩの化合物が：
    ２−［２，５−ビス（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ベンゾイル］−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    ２−（１，１’−ビフェニル−４−イルカルボニル）−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（１−ナフトイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    ２−（１，１’−ビフェニル−２−イルカルボニル）−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−メチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２−ナフトイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（３，４−ジクロロベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−ブロモベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−イソプロピルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（３，５−ジメチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（メシチルカルボニル）ヒドラジンカルボキサミド；および
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（５−クロロ−２−メトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド
    からなる群より選択される、請求項１の方法。
  7. 式ＩＩの化合物がＮ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−メチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミドである、請求項１の方法。
  8. 式ＩＩの化合物がＮ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミドである、請求項１の方法。
  9. 哺乳動物がヒトである、請求項１の方法。
  10. ウイルス感染が出血熱ウイルスである、請求項１の方法。
  11. 出血熱ウイルスがアレナウイルス属（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）である、請求項１０の方法。
  12. アレナウイルス属が、タカリベ、グアナリト、マチュポ、ピチンデおよびＶＳＶからなる群より選択される、請求項１１の方法。
  13. シドホビル、環状シドホビル、あるいはその塩、エステル、またはプロドラッグを同時投与する工程をさらに含む、請求項１の方法。
  14. ウイルス感染または該感染に関連する疾患の治療または予防のための方法であって、以下の式Ｉ：
    式中
    ｎは０〜６の整数であり；
    ｍは０〜１の整数であり；
    ｐは０〜１の整数であり；
    Ｒ１は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択され；
    Ｒ２は、置換または非置換フェニル、置換および非置換アリール、置換および非置換ヘテロアリール、置換または非置換アルキル、置換または非置換分枝アルキル、ならびに置換または非置換不飽和シクロへテロアルキルからなる群より選択されるか；
    あるいはＲ１およびＲ２が一緒に合わせて置換または非置換Ｃ４−１０環状飽和ヘテロアルキルを形成し；
    Ｒ３は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択される
    の化合物；またはその薬学的に許容されうる塩を、こうした方法を必要とする哺乳動物に療法的有効量で投与する工程を含み、そしてシドホビル、環状シドホビル、あるいはその塩、エステル、またはプロドラッグの組み合わせを同時投与する工程をさらに含む、前記方法。
  15. 薬学的に許容されうるキャリアー、および式ＩＩ：
    式中
    ｎは０〜６の整数であり；
    ｍは０〜１の整数であり；
    Ｒ１は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択され；
    Ｒ２は、置換または非置換フェニル、置換および非置換アリール、置換および非置換ヘテロアリール、置換または非置換アルキル、置換または非置換分枝アルキル、ならびに置換または非置換不飽和シクロへテロアルキルからなる群より選択されるか；
    あるいはＲ１およびＲ２が一緒に合わせて置換または非置換Ｃ４−１０環状飽和ヘテロアルキルを形成し；
    Ｒ３およびＲ４は、Ｈおよびアルキルからなる群より独立に選択される
    の化合物；またはその薬学的に許容されうる塩の薬学的有効量を含む、薬学的組成物。
  16. ｎが０、１または２である、請求項１５の薬学的組成物。
  17. ｎが１である、請求項１５の薬学的組成物。
  18. ｍが１である、請求項１５の薬学的組成物。
  19. ｍが１であり、そしてｎが１である、請求項１５の薬学的組成物。
  20. 式ＩＩの化合物が：
    ２−［２，５−ビス（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ベンゾイル］−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    ２−（１，１’−ビフェニル−４−イルカルボニル）−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（１−ナフトイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    ２−（１，１’−ビフェニル−２−イルカルボニル）−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−メチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２−ナフトイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（３，４−ジクロロベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−ブロモベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−イソプロピルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（３，５−ジメチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（メシチルカルボニル）ヒドラジンカルボキサミド；および
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（５−クロロ−２−メトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド
    からなる群より選択される、請求項１５の薬学的組成物。
  21. 式ＩＩの化合物がＮ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−メチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミドである、請求項１５の薬学的組成物。
  22. 式ＩＩの化合物がＮ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミドである、請求項１５の薬学的組成物。
  23. シドホビル、環状シドホビル、あるいはその塩、エステル、またはプロドラッグをさらに含む、請求項１５の薬学的組成物。
  24. 薬学的に許容されうるキャリアー、および式Ｉ：
    式中
    ｎは０〜６の整数であり；
    ｍは０〜１の整数であり；
    ｐは０〜１の整数であり；
    Ｒ１は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択され；
    Ｒ２は、置換または非置換フェニル、置換および非置換アリール、置換および非置換ヘテロアリール、置換または非置換アルキル、置換または非置換分枝アルキル、ならびに置換または非置換不飽和シクロへテロアルキルからなる群より選択されるか；
    あるいはＲ１およびＲ２が一緒に合わせて置換または非置換Ｃ４−１０環状飽和ヘテロアルキルを形成し；
    Ｒ３は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択される
    の化合物；またはその薬学的に許容されうる塩の薬学的有効量を含み、そしてシドホビル、環状シドホビル、あるいはその塩、エステル、またはプロドラッグをさらに含む、薬学的組成物。
  25. 式ＩＩ：
    式中
    ｎは０〜６の整数であり；
    ｍは０〜１の整数であり；
    Ｒ１は、Ｈおよびアルキルからなる群より選択され；
    Ｒ２は、置換または非置換フェニル、置換および非置換アリール、置換および非置換ヘテロアリール、置換または非置換アルキル、置換または非置換分枝アルキル、ならびに置換または非置換不飽和シクロへテロアルキルからなる群より選択されるか；
    あるいはＲ１およびＲ２が一緒に合わせて置換または非置換Ｃ４−１０環状飽和ヘテロアルキルを形成し；
    Ｒ３およびＲ４は、Ｈおよびアルキルからなる群より独立に選択される
    の化合物；またはその薬学的に許容されうる塩。
  26. ｎが０、１または２である、請求項２５の化合物。
  27. ｎが１である、請求項２５の化合物。
  28. ｍが１である、請求項２５の化合物。
  29. ｍが１であり、そしてｎが１である、請求項２５の化合物。
  30. 式ＩＩの化合物が：
    ２−［２，５−ビス（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ベンゾイル］−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    ２−（１，１’−ビフェニル−４−イルカルボニル）−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（１−ナフトイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    ２−（１，１’−ビフェニル−２−イルカルボニル）−Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−メチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２−ナフトイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（３，４−ジクロロベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−ブロモベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−イソプロピルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（３，５−ジメチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド；
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（メシチルカルボニル）ヒドラジンカルボキサミド；および
    Ｎ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（５−クロロ−２−メトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミド
    からなる群より選択される、請求項２５の化合物。
  31. 式ＩＩの化合物がＮ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（４−メチルベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミドである、請求項２５の化合物。
  32. 式ＩＩの化合物がＮ−［１，１−ビス（トリフルオロメチル）プロピル］−２−（２，５−ジメトキシベンゾイル）ヒドラジンカルボキサミドである、請求項２５の化合物。
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