MX2009007687A - Semicarbazidas de sulfonilo, semicarbazidas de carbonilo, semicarbazidas y ureas, composiciones farmaceuticas de los mismos y metodos para tratar virus de fiebre hemorragica, incluyendo infecciones asociadas con arena virus. - Google Patents

Semicarbazidas de sulfonilo, semicarbazidas de carbonilo, semicarbazidas y ureas, composiciones farmaceuticas de los mismos y metodos para tratar virus de fiebre hemorragica, incluyendo infecciones asociadas con arena virus.

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Dennis E Hruby
Dongcheng Dai
Tove Bolken
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Abstract

Se describen compuestos, métodos y composiciones farmacéuticas para tratar infecciones virales, administrando ciertos semicarbazidas de sulfonilo, semicarbazidas de carbonilo, semicarbazidas, ureas y compuestos relacionados en cantidades terapéuticamente efectivas. Los métodos para preparar los compuestos y los métodos para utilizar los compuestos y composiciones farmacéuticas de los mismos, también se describen. En particular, se describe el tratamiento y profilaxis de infecciones virales tal como, las originadas por virus de fiebre hemorrágica, por ejemplo, que incluyen pero no se limitan a Arenaviridae (Junin, Machupo, Guanarito, Sabia, Lassa, Tacaribe, Pinchinde, y VSV), Filoviridae (virus de ebola y Marburg viruses), Flaviviridae (virus de fiebre amarilla, fiebre hemorrágica Omsk, y enfermedad de Bosque Kyasanur), y Bunyaviridae (fiebre de Valle Rift).

Description

SEMICARBAZIDAS DE SULFONILO. S EMIC ARB AZI DAS DE CARBONILO. SEMIC ARB AZI DAS Y UREAS. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS DE LOS MISMOS Y MÉTODOS PARA TRATAR VIRUS DE FIEBRE HEMORRÁGICA. INCLUYENDO INFECCIONES ASOCIADAS CON ARENA VIRUS Referencia cruzada con solicitudes relacionadas La presente solicitud es una continuación en parte y reclama la prioridad de la Solicitud de Patente Internacional Serie No. PCT/US2005/043931 , presentada el 6 de Diciembre, 2005, la cual reclama la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Serie No. 60/632,990, presentada el 6 de Diciembre de 2004. Ambas solicitudes de prioridad en sus totalidades están incorporadas a la presente invención como referencia para todos los propósitos.
MANIFESTACIÓN CON RESPECTO A LA IN ESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADA POR LA FEDERACIÓN La presente invención fue soportada en parte por fondos del gobierno de los Estados Unidos (Instituto Nacional de Salud SBIR Otorgamientos Nos. 1 R43 AI056525-01, R43 AI056525-02 y R44 AI056525-04) y el gobierno de los Estados Unidos por consiguiente puede tener ciertos derechos en la presente invención.
Campo de la Invención El uso de semicarbazidas de sulfonilo, semicarbazidas de carbonilo, semicarbazidas y ureas, así como derivados y análogos de los mismos, y las composiciones farmacéuticas que contienen los mismos para el tratamiento o profilaxis de infecciones virales de enfermedades asociadas con las mismas. En particular, se pueden tratar las infecciones virales y enfermedades asociadas originadas por virus de fiebre hemorrágica, tal como adenovirus.
Antecedentes de la Invención Los virus de fiebre hemorrágica han sido descritos en la literatura científica. Las publicaciones, patentes y solicitudes de patente que se encuentran a continuación se mencionan en la presente solicitud como números de suscripción: 1. Charrel, R. N. and de Lamballerie X., ANTI I RAL RESEARCH. 57:89-100 (2003). 2. Peters C. J., "Enfermedades de adenavirus" (Arenavirus diseases) en Porterfield J., ed., EXOTIC VIRAL INFECTION, Londres: Chapman and Hall Medical, 227-246 (1995). 3. Buchmeier, M.J., Clegg, J.C.S., Franze-Fernandez, M. T., Kolakofsky, D., Peters, C. J., and Southern, P. J., "Taxonomía de Virus: Sexto Reporte del Comité Internacional de Taxonomía de Virus" (Virus Taxonomy: Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses) Murphy, F.A., Fauquet, C. M. y asociados., Eds. Sprnger-Verlag, Nueva York, 319-323 (1995). 4. Clegg, J. C. S., Bowen, M.D., y asociados, "Arenavirideal" in Van Regenmortel, M. H. V., Fauquet, C. M.,Bishop, D. 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Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en la presente solicitud, están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia hasta el mismo grado como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera indicada de manera específica e individual como incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.
El Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) en los Centros para Control y Prevención de Enfermedades (www. bt.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp). Los agentes más amenazantes, los patógenos de categoría A, tienen el potencial más alto de impactos adversos en la salud pública y contingencias en masas y se utilizan en formas mal intencionadas. Dentro de los patógenos de Categoría A, existe un número de virus que puede originar fiebres hemorrágicas virales con rangos altos rangos de fatalidad. El virus de fiebre hemorrágica Categoría A imponente severas amenazas como armas biológicas potenciales debido: 1) pueden ser diseminados a través de aerosoles; 2) una dosis baja (1-10 de unidades de formación de placa (pfu) puede originar enfermedad; 3) pueden originar morbididad y mortalidad severa (rangos de fatalidad del 15 a 30%); 4) pueden originar miedo y pánico en el público general; 5) no existen vacunas efectivas aprobadas por los Estados Unidos o antivirales específicos disponibles; 6) estos patógenos están fácilmente disponibles y pueden ser producidos fácilmente en grandes cantidades; y 7) se han llevado a cabo investigaciones con respecto al el armamento con varios viruses de fiebre hemorrágica.
Los arenaviruses son viruses envueltos con un genoma que consiste en dos segmentos de ARN de hebra simple diseñados como pequeños (S, 3.5 KB) y grandes (L, 7.5 Kb), ambos de los cuales con un arreglo de codificación de ambisentido36. El segmento de ARN S codifica las proteínas estructurales mayores, la proteína de nucleocápsida (NP) y una proteína de envoltura precursora (GPC) que codifica dos glucoproteínas de envoltura (GP1 externa y GP2 de transmembrana),18,24 30'31 y el segmento de ARN L codifica la proteína de polimerasa de ARN L y una proteína de 11 kDA, proteína Z con función reguladora putativa19. GP1 y GP2 que forman los picos de glucoproteína de la superficie tetramérica, son responsables de la entrada de virus en células huésped dirigidas.
La familia de Arenaviridae consiste en un género simple (Arenavirus) que incluye diversos virus (actualmente 23 virus reconocidos1) que originan enfermedades severas de fiebre hemorrágica en humanos2. La familia Arenaviridae ha sido dividida en dos grupos de acuerdo con la filogenia a base de secuencia. El grupo del "Viejo Mundo", originado desde Africa, incluye el virus de coriomeningitis linfocítica (LCM) de patógenos humanos y el virus Lassa. El grupo del "Nuevo Mundo" originado desde América Latina, se divide en 3 grupos descendientes. El grupo descendiente B incluye además de los virus Tacaribe y Amapari, los virus patogénicos humanos Categoría A Junín (fiebre hemorrágica Argentina), Machupo (fiebre hemorrágica Boliviana), Guanarito (fiebre hemorrágica Venezolana) y Sabia (fiebre hemorrágica Brasileña). Estos virus categoría A tienen la capacidad de originar enfermedad de fiebre hemorrágica severa y con frecuencia fatal en humanos.
Los roedores son el huésped natural de los arenavirus, aunque se encuentra el virus Tacaribe en murciélagos. Los arenavirus producen característicamente infecciones virémicas crónicas en su huésped natural15, lo cual a su vez derrama virus en su orina y heces, infectando finalmente a humanos en contacto cercano con estos materiales infectados ya sea mediante aerosol o contacto directo con abrasiones o cortadas en la piel. La historia natural de la enfermedad humana se determina mediante patogenicidad del virus, su distribución geográfica, el hábitat y los hábitos del huésped del roedor, y la naturaleza de la interacción humano-roedor21.
Están asociados diversos arenavirus con enfermedad hemorrágica severa en humanos. El virus Lassa (del grupo del Viejo Mundo) es responsable de la fiebre hemorrágica Lassa, mientras que 4 virus del grupo Nuevo Mundo (todos los Grupos descendientes B) originan fiebre hemorrágica severa en humanos. Dichos virus son: virus Junin responsable de la fiebre hemorrágica Argentina, virus Machupo de la fiebre hemorrágica Boliviana, y virus Guanarito de la fiebre hemorrágica Venezolana. Se aisló el virus Sabia de un caso fatal de fiebre hemorrágica en Brasil. Se estima que el virus Lassa origina 100,000 a 300,000 infecciones y aproximadamente 5,000 muertes anualmente5. Por lo tanto, un estimado de 30,000 casos confirmados de infecciones Junin han sido documentados, mientras que aproximadamente 2,000 de Machupo, 200 de Guanarito y únicamente 2 de Sabia1.
Los aspectos recientes con respecto al uso de Arenavirus como armas biológicas han subrayado la necesidad de desarrollar terapéuticos de molécula pequeña que se dirijan a estos virus. La capacidad de los fármacos antivirales dirigidos en estos virus puede proporcionar tratamiento y un disuasivo fuerte contra su uso como agentes para guerras biológicas. Ya que los fármacos antivirales pueden ser administrados fácilmente (oral, pildora o líquido) y ejercen su efecto antiviral en unas cuantas horas después de la administración, servirán para tratar en forma efectiva a pacientes enfermos, proteger a aquellos que se sospecha que están expuestos al patógeno (profilaxis post-exposición), y ayudan a la contención oportuna de un desencadenamiento.
Actualmente, no existen tratamientos específicos de virus aprobados para utilizarse contra fiebres hemorrágicas de Arenavirus. El manejo de la enfermedad actual, consiste en un cuidado de soporte general: monitoreo y corrección de fluido, desequilibrios en electrolitos y osmóticos y tratamiento de hemorragias con factor de coagulación o reemplazo de plaquetas. La terapia de suero inmune convalescente puede ser efectiva para tratar casos de enfermedades del virus Junin y Machupo, pero es extremadamente limitada la disponibilidad de dicho suero.
La ribavarina, un análogo de nucleósido, ha sido utilizada con cierto éxito en pacientes con fiebre de Lassa. En pruebas pequeñas, la ribavarina intravenosa administrada a pacientes en los primeros 6 días después del desarrollo de la fiebre, disminuyó la mortalidad en de 76% a 9%7"9. Una prueba controlada de 18 pacientes con fiebre hemorrágica Argentina dio como resultado una mortalidad del 13% en pacientes tratados en comparación con 40% en pacientes no tratados10. La terapia de ribavarina está asociada con efectos adversos que incluyen anemia hemolítica reversible, relacionada con la dosis y también ha demostrado teratogenicidad y letalidad embrional en diversas especies animales. Por consiguiente se clasifica como un fármaco de embarazo de categoría X, contraindicado durante el embarazo. La ribavirina intravenosa está disponible en proveedores limitados en los Estados Unidos, para permitir el uso bajo una aplicación de FND. El resumen de dosificación para terapia de ribavarina que ha sido utilizada en casos de fiebre de Lassa, consiste en una dosis de carga intravenosa (IV) de 30 mg/kg inicial, seguido de 16 mg/kg IV cada 6 horas durante 4 días; posteriormente 8 mg/kg IV cada 8 horas durante 6 días (tiempo de tratamiento total 10 días). El costo de tratamiento para un hombre adulto es de aproximadamente $800. Los atributos de ribavarina la hacen menos que ideal para el tratamiento de fiebres hemorrágicas de Arenavirus.
Se ha reportado un número de inhibidores in vitro de la réplica de Arenavirus en la literatura, incluyendo fenotiazinas, trifluoroperazina y clorpromazina , amantadina12,13, brasinoesteroide14 y actinomicina D15. Las actividades anti-Arenavirus de estos compuestos son generalmente débiles y no especificas.
La única fiebre hemorrágica de Arenavirus para la cual se han llevado a cabo estudios hacia el desarrollo de una vacuna, ha sido la fiebre hemorrágica Argentina (AHF) originada por el virus Junin. Se ha evaluado una vacuna atenuada-viva, denominada Candid 1, en pruebas controladas entre trabajadores en la agricultura en áreas endémicas-AHF, en donde pareció reducir el número de casos AHF reportados con efectos secundarios no severos16. No se ha sabido si la vacuna Candid puede 1 ser útil contra otras fiebres hemorrágicas de Arenavirus, y esta vacuna no está disponible en los Estados Unidos de América.
El virus Tacaribe es un nivel de bioseguridad 2 (BSL 2) de arenavirus del Nuevo Mundo (NWA) que se encuentra en el Grupo Descendiente B y filogenéticamente relacionado con NWA categoría A (Junín, Machupo, Guanarito y Sabiá). El virus Tacaribe es del 67% idéntico al virus Junín en el nivel de aminoácido para las cuatro proteínas virales. Con el objeto de clasificar inhibidores de NWA, se desarrolló un ensayo de clasificación de alto rendimiento (HTS) para la réplica de virus utilizando el virus Tacaribe como un sustituto del NWA de Categoría A. Se clasificó una biblioteca de 400,000 moléculas pequeñas utilizando este ensayo HTS. Se eligió una serie principal con base en propiedades del fármaco y esta serie fue optimizada a través de la química interactiva que dio como resultado la identidad de un inhibidor de molécula pequeña altamente activo y específico del virus Tacaribe con actividad selectiva contra NWA patogénica humana (Junín, Machupo, Guanarito y Sabiá). Esta molécula demuestra propiedades farmacodinámicas favorables que permitieron la demostración de la actividad anti-arenavirus en un modelo de ratón recién nacido.
Todos los patógenos humanos Arenavirus del grupo del Nuevo Mundo, que origina la fiebre hemorrágica proceden de Grupo Descendiente B. Estos viruses patógenos humanos requieren la manipulación bajo una contención de alto nivel. Sin embargo, los virus Amapari y Tacaribe también del Grupo Descendiente B, fueron crecidos en un cultivo de tejido bajo contención (BS1-4) bajo nivel. El trabajo bajo contención de bajo nivel, hace más fáciles y más seguros los experimentos con estos virus. Aunque el virus Amapari produce un bajo efecto citopático, el virus Tacaribe puede crecerse fácilmente en un cultivo celular y producir CPE robusto en de 4 a 6 días. Ya que este CPE está directamente relacionado con la réplica viral, los compuestos que inhiben la réplica de virus en el cultivo celular pueden ser identificados fácilmente como confiriendo protección del CPE inducido por virus (aunque es teóricamente posible inhibir CPE sin inhibir la réplica de virus). Además, los compuestos que tienen actividad identificada contra el virus Tacaribe, probablemente serán activos contra el patógeno humano Arenavirus que origina la fiebre hemorrágica (Junin, Machupo, Guanarito y Sabia) debido al alto grado de homología (alrededor del 70% de identidad con las 4 proteínas de virus Tacaribe en comparación con virus Junin, con un estiramiento largo de la proteína con identidad perfecta) entre estos virus.
Existe la necesidad en la técnica de terapias nuevas y preventivas para el tratamiento de infecciones virales de enfermedades asociadas, tal como las originadas por virus de fiebre hemorrágica tipo Arenavirus.
Breve Descripción de la Invención Se proporcionan compuestos y composiciones y/o métodos para el tratamiento y profilaxis de infecciones virales, así como enfermedades asociadas con infección viral en huéspedes virus. En particular, se proporcionan compuestos y composiciones y/o métodos para el tratamiento y profilaxis de virus de fiebre hemorrágica, tal como Arenavirus.
En una modalidad aquí proporcionada se encuentra un método para el tratamiento ó profilaxis de una infección viral o enfermedad asociada con la misma, que comprende administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva a un mamífero que necesita de la misma, un compuesto de la fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra modalidad, se proporciona otra composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva del compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un transportador farmacéuticamente aceptable. Además, se proporcionan compuestos de la fórmula I, así como sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Los compuestos de la fórmula I incluyen: en donde n es un entero de 0 a 6; m es un entero de 0 a 1; p es un entero de 0 a 1; Ri se selecciona de un grupo que consiste en H y alquilo; R2 se selecciona del grupo que consiste en fenilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido, heteroarilo substituido o no substituido, alquilo substituido o no substituido, alquilo ramificado substituido o no substituido y cicloheteroalquilos insaturados substituidos o no substituidos; o en donde y R2 combinan juntos para formar un heteroalquilo saturado cíclico de C4-io substituido o no substituido; R3 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Otros compuestos de la fórmula I incluyen: en donde R2 se selecciona del grupo que consiste en fenilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido, heteroarilo substituido o no substituido, alquilo substituido o no substituido, alquilo ramificado substituido o no substituido, o cicloheteroalquilos insaturados substituidos o no substituidos o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Los compuestos adicionales de la fórmula I incluyen: en donde se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo; R2 se selecciona del grupo que consiste en fenilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido, heteroarilo substituido o no substituido, alquilo substituido o no substituido, alquilo ramificado substituido o no substituido, y cicloheteroalquilos insaturados substituidos o no substituidos; o en donde Ri y R2 se combinan juntos para formar un heteroalquilo saturado cíclico de C4-io substituido o no substituido; o una sal farmacéuticamente aceptable.
En otras modalidades, En el compuesto de la fórmula I, n es 0 ó 1. Asimismo en otras modalidades, el compuesto de la fórmula I, m es 1 y p es 1 o alternativamente, m es 0 y p es 0.
En modalidades adicionales, en la fórmula, Ri y R2 combinan juntos para formar un heteroalquilo saturado cíclico de C4.10 substituido o no substituido del grupo que consiste en: En modalidades aún adicionales, en la fórmula I, R2 se selecciona del grupo que consiste en: en donde cada uno de R5, R6, R7, e y R9 es seleccionado independientemente del grupo que consiste en: hidrógeno, acetilo, metoxi, trifluorometilo, fluoro, cloro, bromo, yodo, acilamino, metilo, sulfonamida, trifluorometoxi , carboxi, ciano y 1,1,2,2-tetrafluoroetoxi.
En particular, ciertas modalidades se relacionan con un compuesto de la fórmula I seleccionado del grupo que consiste en : N-2-(1 , ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-(fenil)-fenilsulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-(2-metil-2-propil)-fenilsulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[7-(4-metil-3,4-dihidro-2H-benzo[1,4]oxazinil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[5-(1-dimetilamino-na f ti I )s u If o n i I] h i d ra zina-1 - carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2,4,6-tr i metil fe nil)sulfonil]hidrazi na- 1 - carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 , 3,3,3- Hexaflu oro-2-metil pro pil)-2-[(3-cl oro-6- metoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(3,6-dimetoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-(4-[1,2,3]tiadiazolil)fenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(3-bromofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-bromofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-metilfenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-metoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-difluorometoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(3-fluoro-4-cloro-fenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,33-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-trifluorometoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-fluoro-fenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-( ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(3-metoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2-metilfenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(3-trifluorometilfenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2,4-dimetoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[2-(5-cloro-1,3-dimetil-1H-pirazolil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(3-metilfenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-trifluorometilfenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2-trifluorometilfenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 , 1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[4-(pirrolidin-1-sulfonil)fenilsulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2-clorofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 , 1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[2-(5-morfolin-4-il)piridilsulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2-trifluorometoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 )3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2,4-diclorofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 , 1 , 1 , 3,3,3 -Hexaflu oro-2-metilpro p i I )-2 -[fenilsulfonil]hidrazina-1 - carboxamida; N-2-(1 , 1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(3- difluorometoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(3-cianofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-cianofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[5-(2,3-dihidrobenzo[1,4]dioxinil) sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 , 1 , 1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-metilfenil)sulfonil]-1-metilhidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropM)-2-[(3-fluorofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(3,4-difluorofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2,4-dimetiltiazo1-5-il)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-acetilfenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2,6-difluorofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2-fluorofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2,5-difluorofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-metilfenil)sulfonil]-2-metilhidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 , 3,3,3- Hexaf luoro-2-met¡l prop ¡l)-2-diclorofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(2,6-ditrifluorometilfenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-metilfenil)sulfonil]hidrazina-1-metilcarboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(315-dimetilisoxazo1-5-il)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-nitrofenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(1-metilimidazol-4-il)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida; N-2-(1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[metilsulfonil]hidrazina-1-carboxamida; 4-Fenilpiperazina-1-(2,2,2-trifluoro-1-metill-1-trifluorometiletil)-carboxamida; 4-Morfolino-1-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-carboxamida; 1-(2-Acetilfenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 1 - Piperidino-1 - (2,2,2 -trifluoro-1 - metil-1-trifluorometiletil)-c a r b o x a m i d a ; 1 -(2,2,2-tr¡fluoro-1-metil-1 -trifluoromet¡letil)-3-(3,4,5-trimetox¡fen¡l)-urea; 1 - (4-Trifluorometilfenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 - metil-1 - trifluorometiletil)-urea; 4-Metilpiperazina-1 - (2,2, 2-trifluoro-1 - metil-1 -trifluorometiletil)-carboxamida; 1-Naftalen-1-M-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 1-(4-Clorofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 4-Fenilpiperidin-1-il-1-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-carboxamida; 1-(2-Fenil(fenil))-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometilet'il)-urea; 1- (2,6-Difluorofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 2- [3-(1,1-Bis-trifluorometiletil)-ureido]benzamida; 1 - (2-Cloro-6-fluorofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 - metil-1 -trifluorometiletil)-urea; 1- (3-Trifluorometilfenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1-trifluorometiletil)-urea; 2- [3-(1,1-Bis-trifluorometiletil)-ureido]bencenosulfonamida; 1 - (2,2,3,3-Tetrafluoro-2,3-dihidrobenzo[1 ,4]dioxin-5-il)-3- (2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 1-(3-Trifluorometoxifenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1 -trifluorometiletil)-urea; 1-(4-Trifluorometoxifenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1 -trifluorometiletil)-urea; 4-Metil-1 - pipe ridina-1 - (2,2,2 -trifluoro-1 - metil-1 -trifluorometiletil)-carboxamida; 1-Naftalen-2-il-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 1-(2-fluorofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1 -trifluorometiletil)-urea; 1-(2,6-Dimetoxifenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; Ácido 3-Trifluorometoxi-4-[3-(1 , 1 - bis-trifluorometiletil)-ureido]benzoico; 1-Fenil-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 1 - (3-Cianofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1 -trifluorometiletil)-urea; 1-(3-Metoxifenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1 -trifluorometiletil)-urea; 1-(2-(1 ,1 ,2,2-Tetrafluoroetoxi)fenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 3-[3-(1,1-Bis-trifluorometiletil)-ureido]bencenosulfonamida; 1-(3-fluorofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1 -trifluorometiletil)-urea; 1-(4-Bromofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1 -trifluorometiletil)-urea; 1-(2-Cianofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1-trifluorometiletil)-urea; 1-(4-Cianofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1 - trifluorometiletil)-urea; 1-(2,2-Difluorobenzo[1 ,3]dioxol-4-il)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1 -tr¡fluoromet¡letil)-urea; 1-(4-Clorofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 1-(3-Metilfenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metM-1-trifluorometiletil)-urea; 4-[3-(1,1-Bis-trifluorometiletil)-ureido]bencenosulfonamida; 1-(2,6-Dibromofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1 -trifluorometiletil)-urea; 1-(2-Metilfenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 1-(4-Metilfenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil-urea; 1 - Pirro lidinil-1 - (2,2,2-trifluoro-1 - metil-1 -trifluorometiletil)-carboxamida; 1-(4-Fluorofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; 1-(2,4-Dibromofenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1 -trifluorometiletil)-urea; (2,2,2-trifluoro-1 -metil-1 -trifluorometiletil)-amida de ácido azepano-1-carboxílico; 1 - (4-Bromo-2-trifluorometoxifenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1-trifluorometiletil)-urea; 1 - (2-Trifluorometoxifenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 - metil-1 - trifluoromet¡letil)-urea; 1-(2-Trifluorometilfenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1 -metil-1-trifluoromet¡letil)-urea; 1-(2-Metoxifenil)-3-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1-trifluorometiletil)-urea; y N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-hexafluoro-1-metilpropil)-2-[(4-d¡fluorometox¡fenil)sulfonil]h¡draz¡na-1-carboxam¡da.
En otra modalidad de la presente invención se proporciona un método para el tratamiento o profilaxis de una infección viral o enfermedad asociada con la misma, en donde el método comprende administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva a un mamífero que necesita del mismo, un compuesto de la fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra modalidad, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva del compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un transportador farmacéuticamente aceptable. Además, se proporcionan compuestos de la fórmula II, así como las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Los compuestos de la formula II incluyen: Fórmula II en donde n es un entero de 0 a 6; m es un entero de 0 a 1; R1 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo; R2 se selecciona del grupo que consiste en fenilo substituido o no substituido, arilo substituido o no substituido, heteroarilo substituido o no substituido, alquilo substituido o no substituido, alquilo ramificado substituido o no substituido y cicioheteroalquilos insaturados substituidos o no substituidos; o en donde Ri y R2 combinan juntos para formar un heteroalquilo saturado cíclico de C4.10 substituido o no substituido; 3 y R4 son seleccionados independientemente del grupo que consiste en H y alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En particular, ciertas modalidades se refieren a un compuesto de la fórmula II seleccionado del grupo que consiste en: 2-[2,5-bis(2,2,2-trifluoroetoxi)benzoil]-N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida; N-[1 ,1 ,-bis(trifluorometil)propil]-2-(4-tert-butilbenzoil)hid ra zinacarbox amida; 2-(1 ,1 '-bifenil-4-ilcarbonil)-N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida; N-[1,1-bis(trifiuorometil)propil]-2-(1- naftoil)hidrazinacarboxamida; 2-(1 ,1'-bifenil-2-ilcarbonil)-N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propM]hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]2-(4-metilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(2-naftoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 -bis(trifiuorometil)propil]-2-(2,5-dimetoxibenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1-bis(trifluorometil)propil]-2-(3,4-diclorobenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(4-bromobenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 - bis(trifluorometil)propil]-2-(4-isopropilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(3,5-dimetilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-2-(mesitilcarbonil)hidrazinacarboxamida; y N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-2-(5-cloro-2-metoxibenzoil)hidrazinacarboxamida.
En una modalidad, el mamífero que está siendo tratado es un humano. En modalidades particulares, la infección viral que está siendo tratada es un virus de fiebre hemorrágica, tal como un Arenavirus. El Arenavirus puede ser seleccionado del grupo que consiste en Junin, Machupo, Guanarito, Sabia, Lassa, Tacaribe, Pinchinde y VSV.
Los detalles de los métodos y formulaciones se describen con mayor detalle más adelante.
Breve Descripción de las Figuras La figura 1 proporciona la estructura química, fórmula y peso molecular de ST-336.
La figura 2 muestra el efecto de tiempo de adición de ST-336 en la producción y formación de placa en virus Tacaribe. En la figura 2A, se infectaron células Vero con virus Tacaribe en un OI = 0.01. Se agregó ST-336 antes o durante la infección de Tacaribe (-1, 3, 6, 9, 12, 15, 18 ó 21 horas posteriores a la infección). A las 24 horas posteriores a la infección, se determinaron los rendimientos de virus mediante ensayo de placa. En la figura 2B, se infectaron células Vero con 400 pfu de virus Tacaribe. Se agregó ST-336 durante 1 hora antes de la infección (-1), durante 1 hora durante la absorción (0), y durante 1 hora después de la infección (+1). Se lavaron las monocapas infectadas con PBS y se colocaron con un medio que contiene agarosa. Cinco días después de la infección, las células fueron fijadas con glutaraldehído y manchadas con violeta cristal antes del conteo de placa.
La figura 3 muestra que ST-336 enlaza con un Koff al virión Tacaribe intacto en la ausencia de células. En la figura 3A, se proporciona un diagrama del esquema de dilución de virus antes del plaqueo. El virus mezclado con ST-336 y diluido (lado izquierdo) o virus diluido y con ST-336 agregado después de la dilución (lado derecho). En la figura 3, se proporcionan imágenes de las placas que resultaron después del revestimiento de cada dilución mostrada en la figura 3A en células Vero.
La figura 4 muestra el mapeo de las variantes resistentes a fármaco ST-336 ("DRVs"). En la figura 4A, un mapa lineal del precursor de glucoproteína ("GPC") que muestra la ubicación del péptido de señal ("SP"), dominio de transmembrana ("TM"), el sitio de disociación entre GP1 y GP2 (K261-A262), la ubicación de los cuatro mutantes resistentes a ST-336 ("DR#1-4"), y el cambio de aminoácido de cada uno se proporcionan. En la figura 4B, se muestra la alineación de secuencia de GP2 de NWA y ST 336 DRV tipo natural. Se muestra la secuencia de aminoácido de la parte C-terminal de GP2 (aminoácidos 397 a 457) que contienen el dominio de transmembrana (marcado por líneas verticales), la ubicación de las mutaciones para DR#1-4 (subrayado) y la diferencia de aminoácido en Amapari (con letras negritas).
La figura 5 proporciona la estructura química, fórmula y peso molecular de ST-294.
La figura 6 muestra el efecto de ST-294 en ratones recién nacidos estimulados con virus Tacaribe. Se infectaron IP ratones BALB/c ratones IP de cuatro días de edad con 30xLD50 de virus Tacaribe y se trataron diariamente durante 10 días con vehículo (control), ribavarina en 25 mg/kg, ST-294 dos veces al día (BID) en 50 mg/kg o una vez al día (SID) en 100 mg/kg. En la figura 6 se muestran el porcentaje de sobrevivientes en cada grupo de tratamiento el día 9 y el día 10 después de la infección.
Descripción Detallada de la Invención Se proporcionan compuestos que son útiles para el tratamiento y profilaxis de infecciones virales, así como enfermedades asociadas con infecciones virales en huéspedes vivos. En particular, se proporcionan compuestos y composiciones y/o métodos para el tratamiento y profilaxis de virus de fiebre hemorrágica, tal como Arenavirus. Sin embargo, antes de proporcionar detalles adicionales, se definirán los siguientes términos.
Definiciones De acuerdo con esta descripción detallada, aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Deberá observarse que tal como se utiliza en la presente invención, las formas circulares "una" "uno" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Las publicaciones aquí descritas son proporcionadas únicamente para su descripción. Nada de lo que se encuentra en la presente invención está construido como una admisión con respecto a las publicaciones anteriores. Además, las fechas de publicación proporcionadas, pueden ser diferentes a las fechas de publicación reales, lo cual puede necesitar ser confirmado de manera independiente.
Cuando se proporciona un rango de valores, quedará entendido que cada valor de intervención está comprendido. Los límites superiores e inferiores de estos rangos menores pueden ser incluidos en forma independiente en el menor, sujeto a cualquier límite excluido en forma específica en el rango manifestado. Cuando el rango manifestado incluye uno o ambos de los límites, los rangos que excluyen cualquiera o ambos de estos límites incluidos, también están incluidos en la presente invención. También se contemplan cualesquiera valores que estén dentro de los rangos mencionados. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado al comprendido comúnmente por un experto en la técnica. Cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos también pueden ser utilizados en las prácticas o elaboración de pruebas. Todas las publicaciones aquí mencionadas están incorporadas a la presente invención como referencia para describir y mencionar los métodos y/o materiales en relación con los cuales se mencionan las publicaciones.
Por el término "paciente" o "sujeto" se entiende la inclusión de cualquier mamífero. Un "mamífero" para propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo pero sin limitarse a humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, para deportes o de mascotas, tal como perros, caballos, gatos, vacas, ratas, ratones, cerdos de guinea y similares.
El término "eficacia" tal como se utiliza en la presente invención dentro del contexto de un régimen de dosificación crónica, se refiere a la efectividad de un régimen de tratamiento en particular. La eficacia puede ser medida con base en el cambio del curso de la enfermedad en respuesta a un agente.
El término "éxito" tal como se utiliza en la presente invención, dentro del contexto de un régimen de tratamiento crónico, se refiere a la efectividad de un régimen de tratamiento en particular. Esto incluye un equilibrio de eficacia toxicidad (por ejemplo efectos secundarios y tolerancia del paciente a la formulación o unidad de dosificación, cumplimiento del paciente y similares). Para un régimen de administración crónica que será considerado como "exitoso", debe equilibrar los aspectos diferentes de cuidados de paciente y eficacia, para producir un resultado favorable para el paciente.
Los términos "tratamiento", "tratar" y similares, se utiliza en la presente invención para referirse a la obtención de un efecto farmacológico o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de o prevenir parcialmente una enfermedad, síntoma o condición de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una curación parcial o completa de una enfermedad, condición, síntoma o efecto adverso atribuido a la enfermedad. Los términos "tratamiento" y "tratar" tal como se utiliza en la presente invención, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad de un mamífero, tal como un humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad ocurra en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero que aún no ha sido diagnosticado como que la tiene, es decir, que origina los síntomas clínicos de la enfermedad, no para desarrollarse en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no experimenta o muestra síntomas de la misma; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, originar la regresión de la enfermedad y/o sus síntomas o condiciones. El tratamiento de un paciente que padece de la enfermedad relacionada con inflamación patológica, también está contemplado. La prevención, inhibición o liberación de efectos adversos atribuidos a inflamación patológica durante periodos de tiempo largos y/o que son originados por respuestas fisiológicas a inflamación no adecuada presente en el sistema biológico durante periodos de tiempo prolongados, también están contemplados.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "acilo" se refiere a los grupos H-C(O)-, alquil-C(O)-, alquil- C(0)-substituido, alquenil-C(O)-, alquenil-C(0)-substituido, alquinil-C(O)-, alquinil-C(0)-cicloalquil-C(0)-substituido, c¡cloalquil-C(0)-substituido, aril-C(O)-, aril-C(0)-substituido, heteroaril-C(O)-, heteroaril-C(O) substituido, heterocíclico-C(O)-, y heterocíclico-C(0)-substituido en donde alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico y heterocíclico substituido tal como aquí se define.
El término "acilamino" se refiere al grupo -C(0)NRR en donde R es seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo substituido, alquenilo. alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, arilo, arilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico, heterocíclico substituido y en donde cada R está unido para formar junto con átomo de nitrógeno un heterocíclico o anillo heterocíclico substituido, en donde alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico y heterocíclico substituido tal como se define en la presente invención.
El término "alquenilo" se refiere a un grupo alquenilo que tiene preferentemente de 2 a 10 átomos de carbono y más preferentemente 2 a 6 átomos de carbono y que tiene al menos 1 y preferentemente de 1 a 2 sitios de insaturación de alquenilo.
El término "alquenilo inferior" se refiere a un grupo alquenilo que tiene preferentemente de 2 a 6 átomos de carbono y que tiene al menos 1 sitio y preferentemente únicamente un sitio de insaturación de alquenilo (es decir, >C = C<. Este término es ejemplificado por grupos tales como alilo, etenilo, propenilo, butenilo, y similares.
El término "alquenilo substituido" se refiere a grupos alquenilo que tienen de 1 a 5 substituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alcoxi, alcoxi substituido, acilo, acilamino, tiocarbonilamino, aciloxi, amino, amidino, alquilamidino, tioamidino, aminoacilo, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, aminocarboniloxi, arilo, substituido arilo, ariloxi, ariloxi substituido, ariloxiarilo, ariloxiarilo substituido, halógeno hidroxilo, ciano, nitro, carboxilo, carboxilalquilo, alquilo substituido con carboxilo, carboxil-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con carboxilo, carboxilarilo, arilo substituido con carboxilo, carboxilheteroarilo, heteroarilo substituido con carboxilo, carboxilheterocíclico, heterocíclico substituido con carboxilo, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, guanidino, guanidinosulfona, tiol, ti o a I q u i I o , tioalquilo substituido, t i o a r i i o , tioarilo substituido, tiocicloalquilo, tiocicloalquilo substituido, tioheteroarilo, tioheteroarilo substituido, tioheterocíclico, tioheterocíclico substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico, heterocíclico substituido, cicloalcoxi, cicloalcoxi substituido, heteroariloxi, heteroariloxi substituido, heterocicliloxi, heterocicliloxi substituido, oxicarbonilamino, oxitiocarbonilamino, cicloalquiloxi, cicloalquiloxi substituido, heteroariloxi, heteroariloxi substituido, -OS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-arilo, arilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -OS(0)2-, -OS02-NRR en donde R es hidrógeno o alquilo, -NRS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-NR-alquilo, alquilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-heterocíclilo, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-NR- en donde R es hidrógeno o alquilo, mono- y di-alquilamino, mono-y d i - ( a I q u i I o substituido)amino, mono- y di-arilamino, arilamino mono- y di-substituido, mono- y di-heteroarilamino, heteroarilamino mono- y di-substituido, amino mono- y di-heterocíclico, amino heterocíclico mono- y di-substituido, aminas di-substituidas no asimétricas que tienen diferentes substituciones seleccionadas independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico, heterocíclico substituido y grupos alquenilo substituidos que tienen grupos amino bloqueados por grupos de bloqueo convencionales tales como Boc, Cbz, formilo, y similares o grupos de alquenilo/alquenilo substituido, substituidos con -S02-alquilo, alquilo substituido con -S02-, -S02-alquenilo, alquenilo substituido con -S02-, -S02-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con -S02-, -S02-arilo, arilo substituido con -S02-, -S02-heteroarilo, heteroarilo substituido con -SO2-, -S02-heterocíclico, heterocíclico substituido con -S02- y -S02NRR en donde R es hidrógeno o alquilo.
El término "alcoxi" se refiere al grupo "alquil-O" que incluye a manera de ejemplo, metoxi, etoxi, "n-propoxi, iso-propoxi, n-butoxi, tert-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi, n-hexoxi, 1 ,2-dimetilbutoxi, y similar.
"Alcoxi substituido" se refiere al grupo alquil-O-substituido".
El término "alquilo" se refiere a grupos alquilo lineales o ramificados que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, como alternativa 1 a 6 átomos carbono. Este término se ejemplifica mediante grupos tales como metilo, t-butilo, n-heptilo, octilo y similares.
El término "alquilo inferior" se refiere a grupos alquilo monovalentes que tienen de 1 a 5 átomos de carbono incluyendo grupos alquilo de cadena recta o ramificada. Este término se ejemplifica mediante grupos tales como metilo, t-butilo, n-heptilo, octilo y similares. El término "alquilo inferior" puede ser substituido opcionalmente con halógeno tal como cloro, fluoro, bromo y similares.
El término "alquilo substituido" se refiere a un grupo alquilo, de 1 a 10 átomos de carbono que tiene de 1 a 5 substituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alcoxi, alcoxi substituido, acilo, acilamino, tiocarbonilamino, aciloxi, amino, amidino, alquil amidino, tioamidino, aminoacilo, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, aminocarboniloxi, arilo, arilo substituido, ariloxi, ariloxi substituido, ariloxilarilo, ariloxiarilo substituido, ciano, halógeno hidroxilo, nitro, carboxilo, carboxilalquilo, alquilo substituido con carboxilo, carboxil-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con carboxilo, carboxilarilo, arilo substituido con carboxilo, carboxilheteroarilo, heteroarilo substituido con carboxilo, carboxilheterocíclico, heterocíclico substituido con carboxilo, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, guanidino, guanidinosulfona, tiol, tioalquilo, tioalquilo substituido, tioarilo, tioarilo substituido, tiocicloalquilo, tiocicloalquilo substituido, tioheteroarilo, tioheteroarilo substituido, tioheterocíclico, tioheterocíclico substituido, heteroarilo, arilo substituido, heteroarilo substituido, heterocíclico, heterocíclico substituido, cicloalcoxi, cicloalcoxi substituido, heteroariloxi, heteroariloxi substituido, heterocicliloxi, heterocicliloxi substituido, oxicarbonilamino, oxitiocarbonilamino, cicloalquiloxi, cicloalquiloxi substituido, heteroariloxi, heteroariloxi substituido, -OS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-arilo, arilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -OS(0)2-, -OSO2-NRR en donde R es hidrógeno o alquilo, -NRS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-, -N RS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-NR-alquilo, alquilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-heterocíclico, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-NR- en donde R es hidrógeno o alquilo, mono- y di-alquilamino, mono-y di-(alquilo substituido)amino, mono- y di-arilamino, arilamino mono- y di-substituido, mono- y di-heteroarilamino, heteroarilamino mono- y di-substituido, amino mono- y di-heterocíclico, amino heterocíclico mono- y di-substituido, aminas disubstituidas no asimétricas que tienen diferentes substituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico y heterocíclico substituido y grupos alquilo substituidos que tienen grupos amino bloqueados por grupos de bloqueo convencionales tales como Boc, Cbz, formilo, y similares o grupos alquilo/alquilo substituido, substituido con -S02-alquilo, alquilo substituido con -S02-, -S02-alquenilo, alquenilo substituido con -S02-, -S02-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con -S02-, -S02-arilo, arilo substituido con -S02-, -S02-heteroarilo, heteroarilo substituido con -S02-, -S02-heterocíclico, heterocíclico substituido con -S02- y -S02NRR en donde R es hidrógeno o alquilo.
El término "amidino" se refiere al grupo H2NC( = NH)- y el término "alquilamidino" se refiere a compuestos que tienen 1 a 3 grupos alquilo (por ejemplo alqu¡IHNC( = NH)-).
El término "amino" se refiere al grupo -NH2.
El término "amino substituido" se refiere al grupo -NRR, en donde cada grupo R es seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico, heterocíclico substituido, -S02-alquilo, alquilo substituido con -S02-, -S02-alquenilo, alquenilo substituido con -S02-, -S02-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con -S02-, -S02-arilo, arilo substituido con -S02-, -S02-heteroarilo, heteroarilo substituido con -S02-, -S02-heterocíclico, heterocíclico substituido con -S02-, siempre que ambos grupos R no sean hidrógeno; los grupos R pueden ser unidos juntos con el átomo de nitrógeno para formar un anillo heterocíclico o heterocíclico substituido.
El término "aminoacilo" se refiere a los grupos NRC(0)alquilo, alquilo substituido con -NRC(O), NRC(0)cicloalquilo, cicloalquilo substituido con -NRC(O), -NRC(0)alquenilo, alquenilo substituido con -NRC(O), NRC(0)alquinilo, alquinilo substituido con -NRC(O), NRC(0)arilo, arilo substituido con -NRC(O), NRC(0)heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRC(O), N RC(0)heterocíclico, y heterocíclico substituido con -NRC(O) en donde R es hidrógeno o alquilo y en donde alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico y heterocíclico substituido son como se define en la presente invención .
"Arilo" o "Ar" se refiere a un grupo carbocíclico aromático insaturado de 6 a 14 átomos de carbono que tiene un solo anillo (por ejemplo, fenilo) o múltiples anillos condensados (por ejemplo, natilo o antrilo) en donde los anillos condensados pueden o no ser aromáticos (por ejemplo 2-benzoxazolinona, 2H-1 ,4-benzoxazin-3(4H)-ona-7il, y similares) siempre que el punto de adhesión sea a través de un átomo de anillo aromático.
El término "arilo substituido" se refiere a los grupos arilo que son substituidos con 1 a 3 substituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, acilo, acilamino, tiocarbonilamino, aciloxi, alquilo, alquilo substituido, alcoxi, alcoxi substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, amidino, alquilamidino, tioamidino, amino, aminoacilo, aminocarboniloxi, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, arilo, arilo substituido, ariloxi, ariloxi substituido, cicloalcoxi, cicloalcoxi substituido, heteroariloxi, heteroariloxi substituido, heterocicliloxi, heterocicliloxi substituido, carboxilo, carboxilalquilo, alquilo substituido con carboxilo, carboxil-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con carboxilo, carboxilarilo, arilo substituido con carboxilo, carboxilheteroarilo, heteroarilo substituido con carboxilo, carboxilheterocíclico, heterocíclico substituido con carboxilo, carboxilamido, ciano, tiol, tioalquilo, tioalquilo substituido, tioarilo, tioarilo substituido, tioheteroarilo, tioheteroarilo substituido, tiocicloalquilo, tiocicloalquilo substituido, tioheterocíclico, tioheterocíclico substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, guanidino, guanidinosulfona, halo, nitro, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico, heterocíclico substituido, cicloalcoxi, cicloalcoxi substituido, heteroariloxi, heteroariloxi substituido, heterocicliloxi, heterocicliloxi substituido, oxicarbonilamino, oxitiocarbonilamino, -S(0)2-alquilo, alquilo substituido con -S(0)2-, -S(0)2-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con -S(0)2-, -S(0)2-alquenilo, alquenilo substituido con -S(0)2-, -S(0)2-arilo, arilo substituido con -S(0)2-. -S(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -S(0)2-, -S(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -S(0)2-, -OS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-arilo, arilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -OS(0)2-, -OS02-NRR en donde R es hidrógeno o alquilo, -NRS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-, -N RS(0)2-heterocíclico. heterocíclico substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-NR-alquilo, alquilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-heterocíclilo, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-NR- en donde R es hidrógeno o alquilo, mono- y di-alquilamino, mono-y di-(alquilo substituido)amino, mono- y di-arilamino, arilamino mono- y di-substituido, mono- y di-heteroarilamino, heteroarilamino mono- y di-substituido, amino mono- y di-heterocíclico, amino heterocíclico mono- y di-substituido, aminas dí-substituidas no simétricas que tienen diferentes substituciones seleccionadas independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico y heterocíclico substituido y grupos aminos en el arilo substituido bloqueado por grupos de bloqueo convencionales tales como Boc, Cbz, formilo, y similares o substituido con -S02NRR en donde R es hidrógeno o alquilo.
El término "cicloalquenilo" se refiere a grupos alquenilo cíclicos de 3 a 8 átomos de carbono que tienen insaturación simple o múltiple pero que no son aromáticos.
El término "cicloalcoxi" se refiere a grupos -O-cicloalquilo. El término "cicloalcoxi substituido" se refiere a grupos cicloalquilo substituidos -O.
El término "cicloalquilo" con respecto a los compuestos de las fórmulas I y II y los derivados PEG, se refiere a grupos alquilo cíclicos de 3 a 12 átomos de carbono que tienen anillos condensados simples o múltiples que incluyen a manera de ejemplo, adamantilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclooctilo y similares.
El término "cicloalquilo" se refiere a grupos alquilo cíclicos de 3 a 8 átomos de carbono que tiene un anillo cíclico simple que incluye a manera de ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclooctilo y similar. Excluidos de esta definición se encuentran los grupos alquilo de anillo múltiple tal como adamantanilo, etc.
El término "cicloalquilo inferior" se refiere a grupos alquilo cíclicos de 3 a 6 átomos de carbono que tienen un anillo cíclico simple que incluye a manera de ejemplo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
El termino "cicloalquilo substituido" y "cicloalquenilo substituido" se refiere a un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo normalmente de 3 a 8 átomos de carbono, que tienen 1 a 5 substituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en oxo ( = 0), tioxo ( = S), alcoxi, alcoxi substituido, acilo, acilamino, tiocarbonilamino, aciloxi, amino, amidino, alquilamidino, tioamidino, aminoacilo, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, aminocarboniloxi, arilo, arilo substituido, ariloxi, ariloxi substituido, ariloxiarilo, a ri I ox i arilo substituido, halógeno hidroxilo, ciano, nitro, carboxilo, carboxilalquilo, alquilo substituido con carboxilo, carboxil-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con carboxilo, carboxilarilo, arilo substituido con carboxilo, carboxilheteroarilo, heteroarilo substituido con carboxilo, carboxilheterocíclico, heterocíclico substituido con carboxilo, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, guanidino, guanidinosulfona, tiol, tioalquilo, tioalquilo substituido, tioarilo, tioarilo substituido, tiocicloalquilo, tiocicloalquilo substituido, tioheteroarilo, tioheteroarilo substituido, tioheterocíclico, tioheterocícl ico substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico, heterocíclico substituido, cicloalcoxi, cicloalcoxi substituido, heteroariloxi, heteroariloxi substituido, heterocicliloxi , heterocicliloxi substituido, oxicarbonilamino, oxitiocarbonilamino, -OS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-arilo, arilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -OS(0)2-, -OS02-NRR en donde R es hidrógeno o alquilo, -NRS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-, NRS(O)2-NR-alquil0, alquilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-NR-, NRS(0)2-NR-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-heterocíclico, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-NR- en donde R es hidrógeno o alquilo, mono- y di-alquilamino, mono- y di-(alquilo substituido)amino, mono- y di-arilamino, arilamino mono- y di-substituido, mono- y di-heteroarilamino, heteroarilamino mono- y di-substituido, amino mono- y di-heterocíclico, amino heterocíclico mono- y disubstituido, aminas disubstituidas no simétricas que tienen diferentes substituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico y heterocíclico substituido y grupos alquilo substituidos que tienen grupos amino bloqueados por grupos de bloqueo convencionales tal como Boc, Cbz, formilo, y similares o grupos alquinilo/alquinilo substituido, substituidos con -S02-alquilo, alquilo substituido con -S02-, -S02-alquenilo, alquenilo substituido con -S02-, -S02-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con -S02-, -S02-arilo, arilo substituido con -S02-, -S02-heteroarilo, heteroarilo substituido con -S02-, -S02-heterocíclico, heterocíclico substituido con -S02- y -S02NRR en donde R es hidrógeno o alquilo.
"Halo" o "halógeno" se refiere a fluoro, cloro, bromo y yodo.
El término "heteroarilo" se refiere a un grupo carbocíclico aromático de 2 a 10 átomos de carbono y 1 a 4 heteroátomos seleccionado del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre dentro del anillo u óxidos del mismo. Los grupos heteroarilo pueden tener un anillo simple (por ejemplo, piridilo o furilo) o anillos condensados múltiples (por ejemplo, indolizinilo o benzotienilo) en donde uno o más de los anillos condensados pueden o no ser aromáticos siempre que el punto de adhesión sea a través de un átomo de anillo aromático. Además, los heteroátomos del grupo heteroarilo pueden ser oxidados por ejemplo para formar óxidos de piridina o 1 , 1 -dioxo-1 ,2,5-tiadiazoles y similares. Además, los átomos de carbono de anillo pueden ser substituidos con oxo ( = 0). El término "heteroarilo que tiene dos átomos de nitrógeno en el anillo de heteroarilo" se refiere a un grupo heteroarilo que tiene dos, y únicamente dos átomos de nitrógeno en el anillo de heteroarilo y que contiene opcionalmente 1 ó 2 heteroátomos en el anillo heteroarilo tal como oxígeno o azufre.
El término "heteroarilo substituido" se refiere a grupos heteroarilo que son substituidos con de 1 a 3 substituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, acilo, acilamino, tiocarbonilamino, aciloxi, alquilo, alquilo substituido, alcoxi, alcoxi substituido, alquenilo, alquenilo substituido, alquinilo, alquinilo substituido, amidino, alquilamidino, tioamidino, amino, aminoacilo, aminocarboniloxi, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, arilo, arilo substituido, ariloxi, ariloxi substituido, cicloalcoxi, cicloalcoxi substituido, heteroariloxi, heteroariloxi substituido, heterocicliloxi, heterocicliloxi substituido, carboxilo, carboxilalquilo, alquilo substituido con carboxilo, carboxil-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con carboxilo, carboxilarilo, arilo substituido con carboxilo, carboxilheteroarilo, heteroarilo substituido con carboxilo, carboxilheterocíclico, heterocíclico substituido con carboxilo, carboxilamido, ciano, tiol, tioalquilo, ti o a I q u i I o substituido, tioarilo, tioarilo substituido, tioheteroarilo, tioheteroarilo substituido, tiocicloalquilo, tiocicloalquilo substituido, tioheterocíclico, tioheterocíclico substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, guanidino, guanidinosulfona, halo, nitro, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico, heterocíclico substituido, cicloalcoxi, cicloalcoxi substituido, heteroariloxi, heteroariloxi substituido, heterocicliloxi, heterocicliloxi substituido, oxicarbonilamino, oxitiocarbonilamino, -S(0)2-alquilo, alquilo substituido con - S(0)2-, -S(0)2-cicloalqu¡lo, cicloalquilo substituido con -S(0)2-, -S(0)2-alquenilo, alquenilo substituido con -S(0)2-, -S(0)2-arilo, arilo substituido con -S(0)2-, -S(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -S(0)2-, -S(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -S(0)2-, -OS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-arilo, arilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -OS(0)2-, -OS02-NRR en donde R es hidrógeno o alquilo, -NRS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-, -N RS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-NR-alquilo, alquilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-heterocíclico, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-NR- en donde R es hidrógeno o alquilo, mono- y di-alquilamino, mono-y d i- ( a I q u i I o substituido)amino, mono- y di-arilamino, arilamino mono- y di-substituido, mono- y di-heteroarilamino, heteroarilamino mono- y di-substituido, amino mono- y di-heterocíclico, amino heterocíclico mono- y di-substituido, aminas disubstituidas no simétricas que tienen diferentes substituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico y heterocíclico substituido y grupos amino en el arilo substituido bloqueado por grupos de bloqueo convencionales tales como Boc, Cbz, formilo y similares o substituidos con -S02NRR en donde R es hidrógeno o alquilo.
El término "heteroariloxi" se refiere al grupo -O-heteroarilo y el "heteroariloxi substituido" se refiere al grupo heteroarilo substituido-O.
El término "heteroaralcoxi" se refiere al grupo heteroaril-alquileno-O-.
El término "heteroaralcoxi substituido" se refiere al grupo de heteroaril-alquileno-O- substituido.
El término "heterociclo" o "heterocíclico" se refiere a un grupo saturado o insaturado que tiene un solo anillo o múltiples anillos condensados, de 1 a 10 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, azufre u oxígeno dentro del anillo, en donde, en sistemas de anillos fusionados, uno o más de los anillos pueden ser arilo o heteroarilo.
El "heterocíclico substituido" se refiere a grupos heterociclo que son substituidos con 1 a 3 substituyentes seleccionado del grupo que consiste en oxo ( = 0), tioxo ( = S), alcoxi, alcoxi substituido, acilo, acilamino, tiocarbonilamino, aciloxi, amino, amidino, alquilamidino, tioamidino, aminoacilo, aminocarbonilamino, aminotiocarbonilamino, aminocarboniloxi, arilo, arilo substituido, ariloxi, ariloxi substituido, ariloxiarilo, ariloxiarilo substituido, halógeno, hidroxilo, ciano, nitro, carbonilo, carboxialquilo, alquilo substituido con carboxiio, carboxil-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con carboxiio, carboxilarilo, arilo substituido con carboxiio, carboxiheteroarilo, heteroarilo substituido con carboxiio, carboxilheterocíclico, heterocíclico substituido con carboxiio, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, guanidino, guanidinosulfona, tiol, t i o a I q u i I o , tioalquilo substituido, tioarilo, tioarilo substituido, tiocicloalquilo, tiocicloalquilo substituido, tioheteroarilo, tioheteroarilo substituido, tioheterocíclico, tioheterocíclico substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico, heterocíclico substituido, cicloalcoxi, cicloalcoxi substituido, heteroariloxi, heteroariloxi substituido, -C(0)0-arilo, arilo substituido con -C(0)0-, heterocicliloxi, heterocicliloxi substituido, oxicarbonilamino, oxitiocarbonilamino, -OS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-arilo, arilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -OS(0)2-, -OS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -OS(0)2-, -OS02-NRR en donde R es hidrógeno o alquilo, -NRS(0)2-alquilo, alquilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-, -NRS(0)2-heterocíclico, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-, NRS(O)2-NR-alquil0, alquilo substituido con -NRS(0)2-NR-, - NRS(0)2-NR-arilo, arilo substituido con -NRS(0)2-NR-, NRS(0)2-NR-heteroarilo, heteroarilo substituido con -NRS(0)2-NR-, -NRS(0)2-NR-heterocíclico, heterocíclico substituido con -NRS(0)2-NR- en donde R es hidrógeno o alquilo, mono- y di-alquilamino, mono- y di-(alquilo substituido)amino, mono- y di-arilamino, arilamino mono- y di-substituido, mono- y di-heteroarilamino, heteroarilamino mono- y di-substituido, amino mono- y di-heterocíclico, amino heterocíclico mono- y disubstituido, aminas di-substituidas no simétricas que tienen diferentes substituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido, heteroarilo, heteroarilo substituido, heterocíclico y heterocíclico substituido y grupos alquinilo substituidos que tienen grupos amino bloqueados a través de grupos de bloqueo convencionales tales como Boc, Cbz, formilo y similares o grupos alquinilo/alquinilo substituidos, substituidos con -S02-alquilo, alquilo substituido con -S02-, -S02-alquenilo, alquenilo substituido con -S02-, -S02-cicloalquilo, cicloalquilo substituido con -S02-, -S02-arilo, arilo substituido con -S02-, -S02-heteroarilo, heteroarilo substituido con -S02-, -S02-heterocíclico, heterocíclico substituido con -S02- y -S02NRR en donde R es hidrógeno o alquilo.
Los ejemplos de heterociclos y heteroarílos incluyen, pero no se limitan a, azetidina, pirróle, imidazole, pirazole, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindole, índole, dihidroindole, indazole, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftilpiridina, quinoxalina, quinazolina, cinnolina, pteridina, carbazole, carbolina, fenantridina, acridina, fenantrolina, isotiazole, fenazina, isoxazole, fenoxazina, fenotiazina, imidazolidina, imidazolina, piperidina, piperazina, indolina, ftalimida, 1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[b]tiofeno, tiazole, tiazolidina, tiofeno, benzo[b]tiofeno, morfolino, morfolinilo, tiomorfolino, tiomorfolinilo (también referido como tiamorfolinilo), piperidinilo, pirrolidina, tetrahidrofuranilo, y similares.
El término "opcionalmente substituido" significa que el grupo mencionado puede ser no substituido, o el grupo mencionado puede ser substituido.
El término "transportador farmacéuticamente aceptable" significa un transportador que es útil para preparar una composición o formulación farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica, y ni biológica ni de otra manera indeseable, e incluye un transportador que sea aceptable para uso veterinario, así como para uso farmacéutico humano. El transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable incluye ambos de uno o más de uno de dichos transportadores.
El "catión farmacéuticamente aceptable" se refiere a un catión de una sal farmacéuticamente aceptable.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales que retienen la efectividad y propiedades biológicas de los compuestos que no son biológica o de otra manera indeseables. Las sales farmacéuticamente aceptables se refieren a sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos, en donde las sales son derivadas de una variedad de contra iones orgánicos e inorgánicos conocidos en la técnica e incluyen, a manera de ejemplo únicamente, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio, y similares; y cuando la molécula contiene la funcionalidad básica, las sales de los ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como clorhidrato, bromhidrato, tartrato, mesilato, acetato, maleato, oxalato, y similares.
Las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables pueden ser preparadas a partir de bases inorgánicas y orgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas, incluyen a manera de ejemplo únicamente, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, pero no se limitan a, sales de amina primarias, secundarias y terciarias, tales como alquil aminas, dialquil aminas, trialquil aminas, alquil aminas substituidas, di (alquilo substituido)aminas, tri (alquilo substituido)aminas, alquenil aminas, dialquenil aminas, trialquenil aminas, alquenil aminas substituidas, di(alquenilo substituido)aminas, tri(alquenilo substituido)aminas, cicloalquil aminas, di(cicloalquil)aminas, tri(cicloalquil)aminas, cicloalquil aminas substituidas, cicloalquil aminas disubstituidas, cicloalquil aminas trisubstituidas, cicloalquenil aminas, (di(cicloalquenil)aminas, tri(cicloalquenil)aminas, cicloalquenil aminas substituidas, cicloalquenil amina disubstituidas, cicloalquenil aminas trisubstituidas, aril aminas, diaril aminas, triaril aminas, heteroaril aminas, diheteroaril aminas, triheteroaril aminas, aminas heterocíclicas, aminas diheterocíclicas, aminas triheterocíclicas, di- y tri-aminas mezcladas en donde al menos dos de los substituyentes en la amina son diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en alquilo, alquilo substituido, alquenilo, alquenilo substituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo substituido, arilo, heteroarilo, heterocíclico y similares. También se incluyen aminas en donde los dos o tres substituyentes, junto con el nitrógeno de amino, forman un grupo heterocíclico o heteroarilo.
Los ejemplos de aminas adecuadas incluyen, a manera de ejemplo únicamente, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, tri(iso-propil)amina, tri(n-propil)amina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, trometamina, Usina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaina, etilenodiamina, glucosamina, N-alquilglucaminas, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, morfolina, N-etilpiperidina, y similares. También deberá quedar entendido que otros derivados de ácido carboxílico pueden ser útiles, por ejemplo, amidas de ácido carboxílico, incluyendo carboxamidas, carboxamidas de alquilo inferior, carboxamidas de dialquilo, y similares.
Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables pueden prepararse a partir de ácidos inorgánicos y orgánicos. Las sales derivadas de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares. Las sales derivadas de ácidos orgánicos incluyen ácido acético, ácido propiónico, ácido glucólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-tolueno-sulfónico, ácido salicílico y similares.
Un compuesto puede actuar como un profármaco. Un profármaco significa cualquier compuesto que libere un profármaco de origen activo in vivo cuando dicho profármaco se administra a un sujeto mamífero. Los profármacos se preparan modificando grupos funcionales presentes en una forma tal que las modificaciones pueden ser disociadas in vivo para liberar el compuesto de origen. Los profármacos incluyen compuestos en donde el grupo hidroxi, amino o sulfhidrilo se une a cualquier grupo que pueda ser disociado in vivo para regenerar el grupo hidroxilo, amino o sulfhidrilo libre, respectivamente. Los ejemplos de profármacos incluyen, pero no se limitan a ésteres (por ejemplo, derivados de acetato, formato y benzoato), carbamatos (por ejemplo, ?,?-dimetilamino-carbonilo) de grupos funcionales hidroxi y similares.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad de un compuesto o anticuerpo que, cuando se administra a un mamífero para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar el tratamiento para dicha enfermedad. La "cantidad terapéuticamente efectiva" variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su severidad y la edad, peso, etc., del mamífero que será tratado.
Formulaciones Farmacéuticas de los Compuestos En general, los compuestos serán administrados en una cantidad terapéuticamente efectiva a través de cualesquiera de los modos de administración aceptados para dichos compuestos. Los compuestos pueden ser administrados a través de una variedad de rutas, incluyendo pero sin limitarse a, oral, parenteral (por ejemplo, ruta de administración subcutánea, subdural, intravenosa, intramuscular, intratecal, intraperitoneal, ¡ntracerebral, intraarteríal o intralesional) tópica, intranasal, localizada (por ejemplo, aplicación quirúrgica o supositorio quirúrgico), rectal y pulmonar (por ejemplo, aerosoles, inhalación o polvo). Por consiguiente, estos compuestos son efectivos tanto como composiciones inyectables como orales. Los compuestos pueden administrarse en forma continua mediante infusión o mediante inyección de bolo.
La cantidad real del compuesto, es decir, el ingrediente activo, dependerá de un número de factores, tal como la severidad de la enfermedad, es decir, la condición o enfermedad que será tratada, edad, y salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto utilizado, la ruta y forma de administración, y otros factores.
La toxicidad y eficacia terapéutica de dichos compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal al 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción LD5o/ED50.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios en animales puede utilizarse en la formulación de un rango de dosificaciones para utilizarse en humanos. La dosificación de dichos compuestos está dentro de un rango de concentraciones en la circulación que incluyen la ED50 con poca o nada de toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un rango de concentración en el plasma circulante que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición media-máxima de los síntomas) tal como se determina en cultivo celular. Dicha información puede utilizarse para determinar de manera más precisa, dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden ser medidos, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto desempeño.
La cantidad de la composición farmacéuticamente administrada al paciente variará dependiendo de lo que se este administrando, el propósito de la administración, tal como profilaxis o terapia, el estado del paciente, la forma de administración y similar. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que ya padece de una enfermedad en una cantidad suficiente para curación, o se detiene al menos parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como la "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la condición y enfermedad que este siendo tratada así como del juicio del especialista dependiendo de factores tales como la severidad de la inflamación, la edad, peso y condición general del paciente, y similar.
Las composiciones administradas a un paciente están en la forma de composiciones farmacéuticas descritas anteriormente. Estas composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas de esterilización convencional, o pueden ser filtradas en forma estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para su uso, como tal, o liofilizarse, siendo combinada la preparación I iof i tizada con un transportador acuoso estéril antes de la administración. Quedará entendido que el uso de ciertos excipientes, transportadores o estabilizadores externos, dará como resultado la formación de sales farmacéuticas.
El compuesto activo es efectivo en un amplio rango de dosificación y generalmente se administra en una cantidad farmacéutica o terapéuticamente efectiva. La dosificación terapéutica de los compuestos variará de acuerdo, por ejemplo, con el uso particular para el cual se realiza el tratamiento, la forma de administración del compuesto, la salud y condición del paciente, y el juicio del especialista quien prescribe. Por ejemplo, para administración intravenosa, la dosis normalmente está dentro del rango de aproximadamente 0.5 mg hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal. Las dosis efectivas pueden ser extrapoladas a partir de las curvas de respuesta a dosis derivadas de sistemas de prueba de modelo animal o in vitro. Normalmente, el especialista administrará el compuesto hasta que se alcance una dosis que logre el efecto deseado.
Cuando se emplea como farmacéuticos, los compuestos normalmente se administran en la forma de composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas contienen, como el ingrediente activo, uno o más de los compuestos anteriores, asociados con uno o más transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. El excipiente empleado normalmente es uno adecuado para administración a sujetos humanos u otros mamíferos. Para elaborar las composiciones, el ingrediente activo normalmente se mezcla con un excipiente, se diluye a través de un excipiente, o se guarda dentro de un transportador el cual puede estar en la forma de una cápsula, sobre, papel u otro contenedor. Cuando el excipiente sirve como un diluyente, puede ser un material sólido, semi-sólido, o líquido, el cual actúa como un vehículo, transportador o medio para el ingrediente activo. Por lo tanto, las composiciones pueden estar en la forma de tabletas, pildoras, polvos, grageas, sobres, pildoras, elíxires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un medio sólido o en un medio líquido), ungüentos que contienen por ejemplo, hasta el 10% en peso del compuesto activo, cápsulas de gelatina blanda y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles, y polvos empacados estériles.
Para preparar una formulación, puede ser necesario moler el compuesto activo para proporcionar el tamaño de partícula adecuado antes de combinarlo con otros ingredientes. Si el compuesto activo es substancialmente insoluble, se muele en forma ordinaria hasta un tamaño de partícula menor a malla 200. Si el compuesto activo es substancialmente soluble en agua, el tamaño de partícula normalmente se ajusta moliendo para proporcionar una distribución substancialmente uniforme en la formulación, por ejemplo, aproximadamente malla 40.
Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua estéril, jarabe y metilcelulosa. Las formulaciones pueden incluir además: agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes de humectación; agentes de emulsificación y suspensión; agentes de conservación tales como benzoatos de metilo y propilhidroxi; agentes edulcorantes; y agentes de saborización. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida, o retardada del ingrediente activo después de la administración al paciente, empleando procedimientos conocidos en la técnica.
La cantidad de compuesto activo en la composición farmacéutica y la forma de dosificación de unidad del mismo pueden variar o ajustarse ampliamente dependiendo de la aplicación particular, la manera de introducción, la potencia del compuesto particular, y la concentración deseada. El término "formas de dosificación de unidad" se refiere a unidades físicamente independientes adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéuticamente adecuado.
El compuesto puede formularse para administración parenteral en un transportador inerte adecuado, tal como solución salina fisiológica estéril. La dosis administrada será determinada por la ruta de administración.
La administración de agentes terapéuticos mediante formulación intravenosa es conocida en la industria farmacéutica. Una formulación intravenosa debe poseer ciertas calidades además de ser solo una composición en la cual el agente terapéutico es soluble. Por ejemplo, la formulación debe promover la estabilidad general del ingrediente(s) activo, también, la fabricación de la formulación debe ser efectiva en costo. Todos estos factores determinarán finalmente el éxito y utilidad general de una formulación intravenosa.
Otros aditivos accesorios que pueden ser incluidos en las formulaciones farmacéuticas y compuestos son como se indica a continuación: solventes: etanol, glicerol, propilénglicol; estabilizadores: EDTA (ácido tetraacético de etileno diamina), ácido cítrico; conservadores antimicrobianos: alcohol bencílico, paraben de metilo, paraben de propilo; agentes de amortiguación; ácido cítrico/citrato de sodio, tartrato de hidrógeno de potasio, tartrato de hidrógeno de sodio, ácido acético/acetato de sodio, ácido maleico/maleato de sodio, ftalato de hidrógeno de sodio, pacido fosfórico/fosfato de dihidrógeno de potasio, pacido fosfórico/fosfato de hidrógeno disódico; y modificadores de tonicidad: cloruro de sodio, manitol, dextrosa.
La presencia de un amortiguador puede ser necesaria para mantener el pH acuoso dentro del rango de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8. El sistema de amortiguador generalmente es una mezcla de un ácido débil y una sal soluble del mismo por ejemplo, citrato de sodio/ácido cítrico; o la sal de mono catión o dicatión de un ácido dibásico, por ejemplo, tartrato de hidrógeno de potasio; tartrato de hidrógeno de sodio, ácido fosfórico/fosfato de dihidrógeno de potasio, y ácido fosfórico/fosfato de hidrógeno disódico.
La cantidad del sistema de amortiguador utilizada depende de (1) el pH deseado; y (2) la cantidad de fármaco. Generalmente, la cantidad de fármaco utilizada está dentro de una proporción molar de 0.5:1 a 50:1 del amortiguador; alendronato (en donde los moles del amortiguador se toman como los moles combinados de los ingredientes de amortiguador, por ejemplo, citrato de sodio y ácido cítrico) de la formulación para mantener un pH dentro del rango de 4 a 8 y generalmente, se utiliza una proporción molar de 1:1 a 10:1 de amortiguador (combinado) a fármaco presente.
Un amortiguador útil es citrato de sodio/ácido cítrico dentro de un rango de 5 a 50 mg por mi de citrato de sodio a 1 a 15 mg por mi de ácido cítrico, suficiente para mantener un pH acuoso de 4 a 6 de la composición.
El agente amortiguador también puede estar presente para evitar la precipitación del fármaco a través de la formación de complejo de metal soluble con iones de metal disueltos, por ejemplo, Ca, Mg, Fe, Al, Ba, el cual puede filtrarse de los contenedores de vidrio o tapones de hule o estar presente en agua de grifo ordinaria. El agente puede actuar como un agente de elaboración de compuestos competitivo con el fármaco y producir un complejo de metal soluble que conduce a la presencia de particulados indeseables.
Además, la presencia de un agente, por ejemplo, cloruro de sodio en una cantidad de aproximadamente 1 a 8 mg/ml, para ajustar la tonicidad al mismo valor de la sangre humana puede ser requerida para evitar la expansión o contracción de los eritrocitos al momento de la administración de la formulación intravenosa que conduce a efectos secundarios indeseables tales como náusea o diarrea y posiblemente a trastornos sanguíneos asociados. En general, la tonicidad de la formulación coincide con la de la sangre humana, la cual está dentro del rango de 282 a 288 mOsm/kg, y en general es de 285 mOsm/kg, lo cual es equivalente a la presión osmótica que corresponde a una solución de cloruro de sodio al 0.9%.
Se puede administrar una formulación intravenosa mediante inyección intravenosa directa, bolo i.v., o puede administrarse mediante infusión mediante la adición a una solución de infusión adecuada tal como inyección de cloruro de sodio al 0.9% u otra solución de infusión compatible.
Las composiciones se formulan preferentemente en una forma de dosificación de unidad, conteniendo cada dosis de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 mg, más normalmente de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 mg, del ingrediente activo. El término "formas de dosificación de unidad" se refiere a unidades físicamente independientes adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado.
El compuesto activo es efectivo en un amplio rango de dosificación y generalmente se administra en una cantidad farmacéuticamente efectiva. Sin embargo, quedará entendido que la cantidad del compuesto administrada realmente, será determinada por un especialista, a la luz de las circunstancias relevantes, incluyendo la condición que será tratada, la ruta de administración elegida, el compuesto real administrado, la edad, peso y respuesta del paciente individual, la severidad de los síntomas del paciente, y similares.
Para preparar composiciones sólidas tales como tabletas, el ingrediente activo principal se mezcla con un excipiente farmacéutico para formar una composición de pre-formulación sólida que contiene la mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención. Cuando se hace referencia a estas composiciones de pre-formulación como homogéneas, se entiende que el ingrediente activo se dispersa de manera uniforme en toda la composición, de modo que la composición puede ser sub-dividida fácilmente en formas de dosificación de unidad igualmente efectivas tales como tabletas, pildoras y cápsulas. Esta pre-formulación sólida se sub-divide posteriormente en formas de dosificación de unidad del tipo descrito anteriormente que contienen, por ejemplo, de 0.1 hasta aproximadamente 500 mg del ingrediente activo.
Las tabletas o pildoras pueden ser recubiertas o elaboradas en compuesto de otra manera para proporcionar una forma de dosificación que produzca la ventaja de la acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o pildora puede comprender un componente de dosificación interno y uno de dosificación externo, estando el último en la forma de una envoltura sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permitir al componente interno pasar intacto en el duodeno o tener una liberación retardada. Una variedad de materiales pueden utilizarse para dichas capas o recubrimientos entéricos, tales como materiales que incluyen un número de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales tales como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.
Las formas líquidas en las cuales las composiciones novedosas pueden ser incorporadas para administración en forma oral o mediante inyección, incluyen soluciones acuosas, jarabes con sabor adecuado, suspensiones acuosas o de aceite, y emulsiones con sabor con aceites comestibles tales como aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de coco, o aceite de cacahuate, así como elíxires y vehículos farmacéuticos similares.
Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en solventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados, tal como se describió supra. Las composiciones en solventes farmacéuticamente aceptables pueden ser nebulizadas a través del uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas pueden ser respiradas directamente del aparato de nebulización o el aparato de nebulización puede ser adherido a una máscara facial, o máquina de respiración de presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, suspensión o polvo pueden administrarse de aparatos que suministran la formulación en una manera adecuada.
Los compuestos pueden ser administrados en una forma de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, en donde las matrices están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) tal como se describe en las publicaciones de Langer y asociados, J. Biomed. Mater, Res. 15: 167-277 (1981) y Langer, Chem, Tech. 12: 98-105 (1982) o poli(alcohol vindico)), polilactidas (Patente Norteamericana No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y gama etil-L-glutamato (Sidman y asociados, Biopolymers 22: 547-556, 1983), acetato de vinilo-etileno no degradable (Langer y asociados, supra), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (por ejemplo, microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido glicólico/ácido láctico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988).
Los compuestos se pueden administrar en una forma de liberación sostenida, por ejemplo, una inyección de depósito, preparación de implante o bomba osmótica, que se pueden formular de tal manera que se permita la liberación sostenida del ingrediente activo. Los implantes para formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica. Los implantes pueden ser formulados, incluyendo pero sin limitarse a, en la forma de microesferas, barras, con polímeros biodegradables o no biodegradables. Por ejemplo, los polímeros de ácido láctico y/o ácido glicólico forman un polímero erosionable que es bien tolerado por el receptor.
Los siguientes ejemplos de formulación ilustran las composiciones farmacéuticas.
Ejemplo de Formulación 1 Se prepararon cápsulas de gelatina dura que contienen los siguientes ingredientes: Cantidad Ingrediente (mg/cápsula) Ingrediente Activo 30.0 Almidón 305.0 Estearato de magnesio 5.0 Se mezclaron los ingredientes anteriores y se llenaron en cápsulas de gelatina dura en cantidades de 340 mg.
Ejemplo de Formulación 2 Se preparó una fórmula de tabletas utilizando los ingredientes que se encuentran a continuación: Cantidad Ingrediente (mg/cápsula) Ingrediente Activo 25.0 Celulosa, microcristalina 200.0 Dióxido de silicón coloidal 10.0 Ácido esteárico 5.0 Los componentes se combinan y comprimen para formar tabletas, que pesan cada una 240 mg.
Ejemplo de Formulación 3 Se preparó una formulación de inhalador de polvo seco que contiene los siguientes componentes: Ingrediente % en Peso Ingrediente Activo 5 Lactosa 95 La mezcla activa se mezcla con la lactosa y la mezcla se agrega a un artefacto de inhalación de polvo seco.
Ejemplo de Formulación 4 Se prepararon como se indica a continuación, tabletas que contienen cada una 30 mg de ingrediente activo: Cantidad Ingrediente (mg/cápsula) Ingrediente Activo 30.0 mg Almidón 45.0 mg Celulosa microcristalina 35.0 mg Polivinilpirrolidona (como una solución al 10% en agua) 4.0 mg Almidón de Carboximetil de sodio 4.5 mg Estearato de magnesio 0.5 mg Talco 1.0 mg Total 120 mg El ingrediente activo, almidón y celulosa se pasaron a través de un cernidor Norteamericano malla No. 20 y se mezclaron completamente. La solución de polivinil-pirrolidona se mezcló con los polvos resultantes, los cuales posteriormente se pasaron a través de un cernidor Norteamericano malla 16.
Los gránulos ya producidos se secaron a una temperatura de 50°C a 60°C y se pasaron a través de un cernidor Norteamericano malla 16. El almidón de carboximetilo de sodio, estearato de magnesio y talco, pasados previamente a través de un cernidor Norteamericano malla No. 30, se agregaron posteriormente a los gránulos, lo cual después del mezclado, se comprimieron en una máquina de generación de tabletas para producir tabletas que pesan cada una 150 mg.
Ejemplo de Formulación 5 Se elaboraron como se indica a continuación, cápsulas que contienen cada una 40 mg de medicamento: Cantidad Ingrediente (mg/cápsula) Ingrediente Activo 40.0 mg Almidón 109.0 mg Estearato de magnesio 1.0 mg Total 150.0 mg El ingrediente activo, celulosa, almidón, un estearato de magnesio se combinaron, pasaron a través de un cernidor Norteamericano malla No. 20, y se rellenaron en cápsulas de gelatina dura en cantidades de 150 mg.
Ejemplo de Formulación 6 Se elaboraron como se indica a continuación, supositorios que contienen cada uno 25 mg de ingrediente activo: Ingrediente Cantidad Ingrediente Activo 25 mg Glicéridos de ácidos grasos saturados para 2,000 mg El ingrediente activo se pasó a través de un cernidor Norteamericano malla No. 60 y se suspendió en los glicéridos de ácidos grasos saturados, derretidos previamente utilizando un calor mínimo necesario. Posteriormente la mezcla se vertió en un molde de supositorio con capacidad nominal de 2.0 g y se dejó enfriar.
Ejemplo de Formulación 7 Se elaboraron como se indica a continuación suspensiones que contienen cada una 50 mg de medicamento por dosis de 5.0 mi: Ingrediente Cantidad Ingrediente Activo 50.0 mg Goma xantan 4.0 mg Carboximetil celulosa de sodio (11%) Celulosa microcristalina (89%) 500 mg Sacarosa 1.75 mg Benzoato de sodio 10.0 mg Sabor y color q.v.
Agua purificada para 5.0 mi Se combinó el medicamento sacarosa y goma xantan, se pasaron a través de un cernidor Norteamericano malla No. 10, y posteriormente se mezclaron con una solución elaborada previamente de celulosa microcristalina y carboximetil celulosa de sodio en agua. Se diluyeron el benzoato de sodio, saborizante y color con parte de agua y se agregaron con agitación. Posteriormente se agregó agua suficiente para producir el volumen requerido.
Ejemplo de Formulación 8 Se elaboraron como se indica a continuación, tabletas de gelatina dura que contienen cada una 15 mg de ingrediente activo: Cantidad Ingrediente (mg/cápsula) Ingrediente Activo 15.0 mg Almidón 407.0 mg Estearato de magnesio 3.0 mg Total 425.0 mg El ingrediente activo, celulosa, almidón y estearato de magnesio se combinaron, pasaron a través de un cernidor Norteamericano malla No. 20, y se rellenaron en cápsulas de gelatina dura en cantidades de 560 mg.
Ejemplo de Formulación 9 Se puede preparar una formulación intravenosa como se indica a continuación: Ingrediente Cantidad Ingrediente Activo 250.0 mg Solución salina isotónica 1000ml Se colocaron composiciones de compuesto terapéuticas generalmente en un contenedor que tiene una puerta de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene un tapón perforable a través de una aguja de inyección hipodérmica o instrumento afilado similar.
Ejemplo de Formulación 10 Se puede preparar una formulación tópica como se indica a continuación: Ingrediente Cantidad Ingrediente Activo 1 - 10 g Cera de Emulsificación 30 g Parafina Líquida 20 g Parafina Blanda Color Blanco para 100 g La parafina blanda color blanco se calienta hasta derretirse. La parafina líquida y la cera de emulsificación se incorporan y agitan hasta disolverse. El ingrediente activo se agrega y se continua con la agitación hasta dispersarse. Posteriormente la mezcla se enfría hasta obtener un sólido.
Ejemplo de Formulación 11 Se puede preparar una formulación en aerosol como se indica a continuación: Una solución del compuesto candidato en bicarbonato de sodio/solución salina al 0.5% (p/v) en una concentración de 30.0 mg/ml, se prepara utilizando el siguiente procedimiento: A. Preparación de Solución de Reserva de Bicarbonato de Sodio/Salina al 0.5%: 100.0 mi Ingrediente Gramo/100.0 mi Concentración Final Bicarbonato de Sodio 0.5 g 0.50% Salina q.s. ad 100.0 mi q.s. ad 100% Procedimiento: 1. Agregar 0.5 g de bicarbonato de sodio en un frasco volumétrico de 100 mi. 2. Agregar aproximadamente 90.0 mi de solución salina y sonicar hasta disolverse. 3. Q.S. a 100.0 mi con solución salina y mezclar completamente.
B. Preparación de 30.0 mq/ml de Compuesto Candidato: 10.0 mi Procedimiento: 1. Agregar 0.300 g del compuesto candidato en un frasco volumétrico de 10.0 mi. 2. Agregar aproximadamente 9.7 mi de solución de reserva de carbonato de sodio/solución salina al 0.5%. 3. Sonicar hasta que el compuesto candidato está completamente disuelto. 4. Q.S. para 10.0 mi con solución de reserva de bicarbonato de sodio/solución salina al 0.5% y mezclar.
También se pueden emplear aparatos de suministro transdérmico ("parches"). Dichos parches transdérmicos se pueden utilizar para proporcionar infusión continua o discontinua de los compuestos en cantidades controladas. La construcción y uso de los parches transdérmicos para el suministro de agentes farmacéuticos también se conocen en la técnica. Ver por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,023,252, presentada el 11 de Junio de 1991, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Dichos parches pueden ser construidos para el suministro de agentes farmacéuticos continuo, pulsátil, o en demanda.
Se pueden utilizar técnicas de colocación directa o indirecta cuando sea deseable o necesario, para introducir la composición farmacéutica al cerebro. Las técnicas directas, normalmente implican colocar un catéter de suministro de fármaco en el sistema ventricular del receptor para derivar la barrera de sangre-cerebro. Uno de dichos sistemas de suministro implantable es utilizado el transporte de factores biológicos a regiones anatómicas específicas del cuerpo, se describe en ia Patente Norteamericana No. 5,011,472, la cual está incorporada a la presente invención como referencia.
Las técnicas indirectas normalmente implican formular las composiciones para proporcionar la latencia del fármaco mediante la conversión de fármacos hidrofílicos en fármacos solubles en lípidos. La latencia se logra generalmente a través del bloqueo de los grupos de hidroxi, carbonilo, sulfato y amina primarias presentes en el fármaco para hacer el fármaco más soluble en lípidos y adaptable a transportación a través de la barrera de sangre-cerebro. Como alternativa, el suministro de los grupos hidrofílicos puede mejorarse mediante infusión intra-arterial de soluciones hipertónicas que temporalmente pueden abrir la barrera de sangre-cerebro.
Con el objeto de aumentar la vida media en el suero, los compuestos pueden ser encapsulados, introducidos en el lumen de liposomas, preparados como un coloide, u otras técnicas convencionales pueden ser empleadas, para proporcionar una vida media en suero prolongada de los compuestos. Una variedad de métodos están disponibles para preparar liposomas, tal como se describe, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,235,871, 4,501,728 y 4,837,028 de Szoka y asociados, cada una de las cuales está incorporada a la presente invención como referencia.
Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para utilizarse en una variedad de sistemas de suministro de fármaco. Las formulaciones adecuadas para utilizarse en la presente invención se encuentran en la publicación de Remington's Pharmaceutical Science, Mace Publishing Company, Filadelfia, PA, 17° ed. (1985).
Utilidad Los compuestos proporcionados y las composiciones farmacéuticas muestran actividad biológica para tratar y prevenir infecciones virales y enfermedades asociadas, y por consiguiente, tienen utilidad para tratar infecciones virales y enfermedades asociadas, tales como virus de fiebre hemorrágica, en mamíferos, incluyendo humanos.
Los virus de fiebre hemorrágica (HFVs) son virus de ARN que originan una variedad de síndromes de enfermedad con características clínicas similares. Los HFVs que son de importancia como armas biológicas potenciales, incluyen pero no se limitan a: Arenaviridae (Junin, Machupo, Guanarito, Sabia, Lassa, Tacaribe, Pinchinde, y VSV), Filoviridae (virus de ebola y Marburg), Flaviviridae (virus de fiebre amarilla, fiebre hemorrágica omsk y enfermedad del Bosque Kyasanur), y Bunyaviridae (fiebre de Valley Rift). Los arenaviruses que ocurren naturalmente y los arenaviruses construidos de manera potencial están incluidos en la lista de patógenos de Categoría A del Centro de Control y Prevención de Enfermedades, como estando entre los agentes que tienen el mayor potencial y contingencia de masas.
Los factores de riesgo incluyen: viajes a África o Asia, manejo de carcasas de animales, contacto con animales o personas infectadas y/o picaduras por artrópodos. Los arenaviruses son altamente infecciosos después de contacto directo con sangre infectada y/o secreciones corporales. Los humanos normalmente quedan infectados por el contacto con roedores infectados, la picadura de un artrópodo infectado, contacto directo con carcasas de animales, inhalación de excreciones de roedores infecciosos y/o inyección de alimentos contaminados con excreciones de roedor. El virus Tacaribe ha sido asociados con murciélagos. La transmisión por aire de la fiebre hemorrágica es otro modo, aunque un tanto menos común. En algunos casos también puede ocurrir en contacto de persona a persona.
Todas las fiebres hemorrágicas exhiben síntomas clínicos similares. Sin embargo, en general las manifestaciones clínicas son no específicas y variables. El período de incubación es de aproximadamente de 7 a 14 días. La generación es gradual con fiebre y malestar, taquipnea, bradicardia relativa, hipotensión, shokc circulatorio, infección conjuntival, faringitis, linfoadenopatía, encefalitis, mialgia, dolor de espalda, dolor de cabeza y vértigo, así como hiperestesia de la piel. Algunos pacientes infectados pueden no desarrollar manifestaciones hemorrágicas.
Los métodos de diagnóstico en laboratorios especializados incluyen detección de antígeno mediante ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA) de captura de antígenos, detección de anticuerpo IgM mediante ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas de captura de anticuerpo, reacción de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR), y aislamiento viral. La detección de antígeno (mediante ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas) y las reacciones de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa son las técnicas de diagnóstico más útiles en instalaciones clínicas agudas. El aislamiento viral es de valor limitado debido a que requiere un laboratorio con bioseguridad nivel 4 (BSL-4).
EJEMPLOS Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) aunque se deben tomar en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es un peso molecular promedio, la temperatura está en grados Centígrados, y la presión está en o cerca de presión atmosférica. Las abreviaturas no definidas anteriormente, tienen su significado generalmente aceptado.
Síntesis de Compuestos Los compuestos se preparan fácilmente a través de diversas rutas sintéticas divergentes con la ruta particular seleccionada en forma relativa a la facilidad de la preparación del compuesto, la disponibilidad comercial de los materiales de partida, y similares.
Los compuestos pueden ser preparados a partir de materiales de partida fácilmente disponibles utilizando los siguientes métodos y procedimientos generales. Se podrá apreciar que cuando se proporcionan condiciones de proceso (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, proporciones molares de reactivos, solventes, presiones, etc.), también se pueden utilizar otras condiciones de proceso a menos que se manifieste lo contrario. Las condiciones de reacción óptimas pueden variar con los reactivos o solventes particulares utilizados, aunque dichas condiciones pueden ser determinadas por un experto en la técnica mediante procedimientos de optimización de rutina.
Además, tal como lo apreciarán los expertos en la técnica, pueden ser necesarios grupos de protección convencionales para evitar que ciertos grupos funcionales pasen por reacciones indeseadas. Los grupos de protección adecuados para diversos grupos funcionales, así como condiciones adecuadas para protección y desprotección de grupos funcionales particulares, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se describen numerosos grupos de protección en la publicación de T.W. Greene y G.M. Wuts, Grupos de Protección en Síntesis Orgánica, Segunda Edición, Wiley, Nueva York, 1991, y las referencias ahí mencionadas.
Además, los compuestos normalmente contendrán uno o más centros quírálicos. Por consiguiente, si se desea, dichos compuestos pueden prepararse o aislarse como estereoisómeros puros, es decir, como enantiómeros o diaesterómeros individuales, o como mezclas enriquecidas con estereoisómeros. Todos de dichos estereoisómeros (y mezclas enriquecidas) están incluidas a menos que se indique lo contrario. Los estereoisómeros puros (o mezclas enriquecidas) pueden prepararse utilizando, por ejemplo, materiales de partida ópticamente activos o reactivos estereoselectivos conocidos en la técnica. Como alternativa, se pueden separar mezclas racémicas de dichos compuestos utilizando, por ejemplo, cromatografía de columna quirálica, agentes de resolución quirálica, y similares.
A menos que se manifieste lo contrario, los productos son una mezcla de enantiómeros R, S. Sin embargo, cuando se desea un producto quirálico, el producto quirálico puede ser obtenido a través de técnicas de purificación que separan enantiómeros de la mezcla R, S para proporcionar uno o el otro estereoisómero. Dichas técnicas son conocidas en el arte.
En otra modalidad, los compuestos se pueden proporcionar como profármacos que convierten (por ejemplo, hidrolizan, metabolizan, etc.) in vivo a un compuesto anterior.
Se utilizaron los siguientes Métodos para preparar los compuestos tal como se establece según se indica.
Ejemplos 1 a 12. 14 a 45. 47 a 50 Los compuestos de los Ejemplos 1 a 50, se prepararon siguiendo el procedimiento general que se menciona más adelante para el Ejemplo 13, utilizando el compuesto 13 (a) y haciéndolo reaccionar con las siguientes bencenosulfonilhidrazinas: hidrazina de 4- Fenilbencenosulfonilo, hidrazina de 4-t-butilbencenosulfonilo, hidrazina de 4-metil-3,4-dihidro-2i7-benzo[1 ,4]oxazina-7-sulfonilo, hidrazina de 5-(1 -dimetilaminonaftil)sulfonilo, hidrazina de 2,4,6-trimetilbencenosulfonilo, hidrazina de 3-cloro-6-metoxibencenosulfonilo, hidrazina de 2,5-dimetoxibencenosulfonilo, hidrazina de 4-(4- [1 ,2,3]tiadiazolil)bencenosulfonilo, hidrazina de 3-bromobencenosulfonilo, hidrazina de 4-bromobencenosulfonilo, hidrazina de 4-metilbencenosulfonilo, hidrazina de 4-metoxibencenosulfonilo, hidrazina de 3-fluoro-4-clorobencenosulfonilo, hidrazina de 4-trifluorometoxibencenosulfonilo, hidrazina de 4-fluorobencenosulfonilo, hidrazina de 3-metoxibencenosulfonilo, hidrazina de 2-metilbencenosulfonilo, hidrazina de 3-trifluorometilbencenosulfonilo, hidrazina de 2,4-dimetoxibencenosulfonilo, hidrazina de 5-cloro-1 , 3-d i meti I- H-pirazolilsulfonilo, hidrazina de 3-metilbencenosulfonilo, hidrazina de 4-trifluorometilbencenosulfonilo, hidrazina de 2-trifluorometilbencenosulfonilo, hidrazina de 4-(pirrolidin- -sulfonil)bencenosulfonilo, hidrazina de 2-clorobencenosulfonilo, hidrazina de 5-(2-morfolin-4-il)piridilsulfonilo, hidrazina de 2-trifluorometoxibencenosulfonilo, hidrazina de 2,4-diclorobencenosulfonilo, hidrazina de bencenosulfonilo, hidrazina de 3-difluorometilbencenosulfonilo, hidrazina de 3-cianobencenosulfonilo, hidrazina de 4-cianobencenosulfonilo, hidrazina de 5-(2,3-dihidrobenzo[1 ,4]dioxinil)sulfonilo, hidrazina de 2-(4-metilbencenosulfonilo)-1 -metilo, hidrazina de 3-fluorobencenosulfonilo, hidrazina de 3,4-difluorobencenosulfonilo, hidrazina de 2,4-dimetiltiazol-5-ilsulfonilo, hidrazina de 4-acetilbencenosulfonilo, hidrazina de 2,6-difluorobencenosulfonilo, hidrazina de 2-fluorobencenosulfonilo, hidrazina de 2,5-difluorobencenosulfonilo, hidrazina de 1-(4-metilbencenosulfonil)-1 -metilo, hidrazina de 2,6-diclorobencenosulfonilo, hidrazina de 2,6-ditrifluorometilbencenosulfonilo, hidrazina de 3,5-dimetilisoxazol-5-ilsulfonilo, hidrazina de 4-nitrobencenosulfonilo, hidrazina de (1 -metilimidazol-4-il)sulfonilo, e hidrazina de metilsulfonilo.
Ejemplo 13 Preparación de N-2-(1,1 , 1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4- difluorometoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida a. Preparación de 1 , 1 , 1.3,3.3-Hexafluoro-2-isocianato-2-metilpropano. compuesto 13(a) 13(a) Una solución de trimetilsililazida (26 mi, 180 mmol), se agregó lentamente en forma de gotas a una solución de fluoruro de 2,2-bis(trifluorometil)propionilo (38 g, 179 mmol) y cloruro de benciltrietilamonio (0.065 g, 0.28 mmol) en xilenos (120 mi) a una temperatura de 0°C. Al término de la adición, la mezcla resultante se calentó a una temperatura de 110°C. Después de 4 horas, la mezcla se destiló en 760 mm Hg, y la fracción hirvió a una temperatura de 40 a 50°C conteniendo el 13(a). El rendimiento del producto líquido es del 60%. b. Preparación de N-2-M .1.1.3.3.3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-í(4-difluorometoxifenil)sulfoninhidrazina-1-carboxamida 13 A una solución de cloruro de 4-difluorobencenosulfonilo (60 mg, 0.25 mmol) en metilamina (25 mg, 0.25 mmol) en 1 mi de THF seco se le agregó hidrazina anhidro (15 mg, 0.26 mmol) a temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, se obtuvo una solución de 1 ,1 , 1 ,3,3,3-hexafluoro-2-isocianato-2-metilpropano (13a) (54 mg, 0.26 mmol) en 1 mi dietiléter. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. El solvente se eliminó in vacuo, y el material crudo se sometió a HPLC de fase inversa para producir el producto en la forma de un sólido ceroso, color blanco (83 mg, 75%).
Ejemplo 46 Preparación de N-2-(1, 1, 1 , 3,3, 3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4- metilfenil)sulfonil]hidrazina-1-metilcarboxamida A una solución de N-2-(1 , 1 , 1 ,3,3,3-Hexafluoro-2-metilpropil)-2-[(4-metilfenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida (100 mg, 0.254 mmol) preparada como se describió anteriormente, y carbonato de cesio (165 mg, 0.51 mmol) en 1.6 mi de NMP, se le agregó yodometano (17.5 yL, 0.28 mmol). La mezcla color amarillo se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas antes de agregar 5 mi de agua. La mezcla se extractó con EtOAc, y la fase orgánica se lavó en forma sucesiva con agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgS04, y se concentró in vacuo. El producto crudo se cromatografió sobre gel de sílice con 10% EtOAc en hexanos.
Ejemplo 51 Preparación de 4-Fenilpiperazina-1-(2,2,2-trifluoro-1-metil-1- trifluorometiletil)-carboxamida A 1 -fenilpiperazina (0.04 mi, 0.25 mmol) se le agregó 1 , 1 , 1 ,3,3,3-hexafluoro-2-isocianato-2-metilpropano (13a) (124 mg, 0.6 mmol) en 1 mi de dietiléter. La mezcla se agitó a temperatura ambiente en un frasco sellado con tapa en forma ajustada durante 12 horas. La mezcla de reacción se sometió a HPLC de fase inversa (CH3CN/H20), y el producto aislado se liofilizó para proporcionar el producto en la forma de un sólido color blanco.
Ejemplo 52 a 98 Los compuestos de los Ejemplos 52 a 98 se prepararon siguiendo el procedimiento general antes mencionado del Ejemplo 51 utilizando el compuesto (13(a) y haciéndolo reaccionar con las siguientes aminas o anilinas: morfolina, 2-acetilanilina, piperidina, 3,4,5-trimetoxianilina, 4-trifluorometilanilina, 4-metilpiperazina, 1 -aminonaftaleno, 2-cloroanilina, 4-fenilpiperidina, 2-fenilanilina, 2,6-difluoroanilina, 2-aminobenzamida, 2-cloro-6-fluoroanilina, 3-trifluorometilanilina, 2-aminobencenosulfonamida, 5-amino(2,2,3,3-Tetrafluoro-2,3-dihidrobenxo[1,4]dioxano), 3-trifluorometoxianilina, 4-trifluorometoxianilina, 4-metilpiperidina, 2-aminonaftaleno, 2-fluoroanilina, 2,6-dimetoxianilina, ácido 4-amino-3-trifluorometoxibenzoico, anilina, 3-cianoanilina, 3-metoxianilina, 2-(1,1,2,2-tetrafluoroetoxi)anilina, 3-aminobencenosulfonamida, 3-fluoroanilina, 4-bromoanilina, 2-cianoanilina, 4-cianoanilina, 3-amino,2,2-difluorobenzo[1 ,3]dioxano, 4-cloroanilina, 3-metilanilina, 4-aminobencenosulfonamida, 2,6-dibromoanilina, 2-metilanilina, 4-metilanilina, pirrolidina, 4-fluoroanilina, 2,4-dibromoanilina, azepano, 4-bromo-2-trifluorometoxianilina, 2-trifluorometoxianilina, 2-trifluorometilanilina y 2-metoxianilina.
Número de Estructura Nombre Ejemplo I) N-2-( 1,1,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2- metilpropil)-2-[(4-(fen¡l)- 1 fenilsulfonil]hidrazina-1- carboxamida.
N-2-( 1,1,1 ,3,3,3-Hexaf luoro-2- met¡lprop¡l)-2-[(4-(2-met¡l-2- 2 propil)-fenilsulfonil]h¡drazina-1- carboxamida.
N-2-(1 ,1 ,1 ,3,3,3-Hexafluoro-2- metilprop¡l)-2-[7-(4-met¡l-3,4- 3 dihidro-2H- benzo[1,4]oxazin¡l)sulfonil)hidra zina-1-carboxamida.
N-2-(1 ,1 , 1 ,3,3,3-Hexafluoro-2- metilprop¡l)-2-[5-(1-dimet¡lamino 4 naft¡l)sulfonil]h¡draz¡na-1- carboxamida. f \ F IL CH, 25 25 25 25 25 25 25 25 25 1-(4-Bromo-2- tr¡fluorometoxilfenil)-3-(2,2,2- 95 trifluoro-1-metil-1- trifluoromet¡letil)-urea. 1 -(2-Tr¡fluorometox¡fenil)-3- 96 (2,2,2-tr¡fluoro-1-metil-1- tr¡fluorometilet¡l)-urea. 1-(2-Trifluoromet¡lfenil)-3-(2,2,2- 97 trifluoro-1-met¡l-1- trifluorometiletil)-urea. 1-(2-Metoxifen¡l)-3-(2,2,2- 98 tr¡fluoro-1-metil-1- trifluoromet¡letil)-urea.
Ejemplos 99 a 112 Los compuestos de los Ejemplos 99 a 112 se prepararon utilizando la siguiente ruta sintética: Para sintetizar el isocianato, 2, se agregó lentamente una solución de Me3SiN3 (3.12 mi, 25 mMol) en o-xileno seco (15 mi) a una solución del fluoruro, 1 (5.34 g, 24 mMol), y cloruro de trietilbencilamonio (TEBA, 22 mg, 4 mMol) en o-xileno seco (20 mi) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a una temperatura de 110°C y se agitó durante 4 horas. El isocianato deseado, 2, se aisló mediante destilado de la mezcla de reacción cruda (2.49 g, rendimiento 46%).
El procedimiento general, utilizando hidrazina como reactivo de partida es como se indica a continuación: A una solución de hidrazida (1 eq) en THF seco se I agregó una solución de isocianato (1 eq) en THF seco. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El producto requerido se aisló utilizando HPLC eluyendo con 10 a 80% del sistema de solvente de acetonitrilo/H20 (con 0.1% TFA).
El procedimiento general utilizando cloruro de ácido como reactivo de partida es como se indica a continuación: A una solución de hidrazina anhidro (1 eq) en THF seco se le agregó lentamente una solución de cloruro de ácido (1 eq) en THF seco. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual se agregó una solución de ¡socianato (1 eq) en THF seco. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El producto requerido se aisló utilizando HPLC eluyendo con 10 a 80% del sistema de solvente de acetonitrilo/H20 (con 0.1% TFA).
? RMN en CDjOD: d 8.34 (d, 1H), 8.01 (d, 1H), 7.93 N-[1,1-bis(trifluorometil)propil] 1021 (d, 1H), 7.76 (dd, 1H), 7.56 2-(1- (m, 3H), 2.55 (q, 2H), 1.15 naftoil)hidrazinacarboxamida (t, 3H) ? RMN en CD3OD.57.65 (d, 1H), 7.54 (t, 1H), 7.39 2-(1 , 1 '-bifenil-2-ilcarbonil)-N- (m, 7H), 2.49 (q, 2H), 1.07 [1,1- 1033 bis(trifluormetil)propil]hidrazin (t, 3H) acarboxamida ? RMN en CD3OD: d 7.76 N-[1,1-bis(trifluorometil)propil] (d, 2H), 7.29 (d, 2H), 2.49 2-(4- 1041 (q, 2H), 2.40 (s, 3H), 1.10 metilbenzoil)hidrazinacarboxa (t, 3H) mida ? RMN en CD3OD: d 8.44 (s, 1H), 7.93 (m, 4H), 7.59 N-[1 ,1 -bis(trifluorometil)propil] 1053 (m, 2H), 2.51 (q, 2H), 1.13 2-(2- F F ° (t,3H) naftoil)hidrazinacarboxamida 'HN R in CDJOD: d 7.49 (s, 1H), 7.10 (s, 2H), 3.93 N-[1,1-bis(trifluorometil)propil] 1064 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 2.S0 2-(2,5- (q, 2H), 1.11 (t,3H); MS dimetoxibenzoil)hidrazinacarb O-CH, ES >n/z ! .9 (M+H)* oxamida ? RMN en D SO-da: d 10.54 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), N-[1,1-bis(trifluorometil)propil] 8.13 (s, 1H), 7.84 (m, 2H), 2-(3,4- 1073 7.46 (s, 1H), 2.41 (q, 2H), diclorobenzoil)hidrazinacarbo ¦1.03 (t, 3H) xamida ? RMN en CD3OD: d 7.78 N-(1,1-bis(trifluorometil)propil] (d, 2H), 7.65 (d, 2H), 2.49 2-(4- 1083 (q, 2H), 1.10 (t,3H) bromobenzoil)hidrazinacarbo F F ° xamida ? RMN en CD3OD: d 7.79 (d, N-[1,1-bis(trifluorometil)propil] 2H), 7.35 (d, 2H), 2.97 2-(4- 1091 (n , 1H), 2.49 (q,2H), 1.27 (d, isopropilbenzoil)hidrazinacarb 6H), 1.11 (t, 3H) F O oxamida ? RMN en CD3OD: d 7.47 N-[1 ,1 -bis(trifluorometil)propil] (s,2H), 7.22 (s, 1H), 2.49 2-(3,5- 1101 (q, 2H),2.35(s, 6H), 1.11 dimetilbenzoil)hidrazinacarbo (t, 3H) xamida ? RMN en CDjOD: d 6.88 (s, 2H), 2.52 (q, 2H), 2.32 N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil] (s, 6H),2.26 (s, 3H), 1.11 2- 111" (t, 3H) (mesitilcarbonil)hidrazinacarb A 0 ° oxamida ? RMN en CD3OD: d 7.86 N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil] (d, IH), 7.50 (dd, 1H), 7.16 2-(5-cloro-2- 1123 (d, 1H), 3.97 (s, 3H), 2.48 0 (q, 2H), 1.10(t,3H) metoxibenzoil)hidrazinacarbo xamida 1 Purificado mediante HPLC; pureza 98%. 2 Purificado mediante HPLC; pureza 99%. 3 Purificado mediante HPLC; pureza 97%. 4 Purificado mediante HPLC; pureza 96%.
ENSAYO 1 Se probaron aproximadamente 400,000 compuestos de la biblioteca de compuestos en este ensayo. Las placas de ensayo se prepararon como se indica a continuación. Se revistieron vero células en una confluencia al 80% en placas de 96 depósitos. Los compuestos de prueba (80 por placa) de la biblioteca, se agregaron a depósitos a una concentración final de 5 µ?. El virus Tacaribe (TRVL 11573), se agregó posteriormente en una dilución de virus que puede dar como resultado el 90% CPE después de 5 días (determinado previamente como una dilución de 800 veces de la reserva de virus; multiplicidad de infección [MOI] aproximadamente 0.001). Las placas fueron incubadas a una temperatura de 37°C y 5% C02 durante 5 días, posteriormente fijadas en glutaraldehído al 5% y manchadas con 0.1% de violeta cristal. El grado de virus CPE se cuantificó en forma espectrométrica en OD570 utilizando un Lector de Microplaca Molecular Devices VersaMax Tunable. La actividad inhibidora de cada compuesto se calculó substrayendo el OD570 del depósito del compuesto de prueba del OD570 promedio de los depósitos de células infectadas con virus, posteriormente dividiendo entre el OD5 0 promedio de los depósitos de célula infectada-mock. El resultado representa el porcentaje de protección contra la actividad CPE del virus Tacaribe conferida por el compuesto. Los "golpes" en este ensayo fueron definidos como compuestos que inhibieron el CPE inducido por virus en más del 50% en la concentración de prueba. De los aproximadamente 400,000 compuestos clasificados en la campaña HTS del virus Tacaribe, se identificaron 2,347 aciertos (rango de acierto del 0.58%).
Los aciertos de calidad se definen como compuestos inhibidores (aciertos) que exhiben estructuras químicas, potencia antiviral y selectividad aceptables, y espectro de la actividad antiviral. Específicamente, los compuestos identificados como aciertos en ensayo HTS (descrito anteriormente) se evalúan contra cuatreo criterios: (i) maleabilidad química, (ii) potencia inhibidora, (iii) selectividad inhibidora y, (iv) especificidad antiviral. Con base en estos parámetros HTS, todos los aciertos tienen valores EC50 < 5 µ?.
Las estructuras químicas de los compuestos que cumplen con estos criterios se revisaron visualmente para maleabilidad química. Se define un compuesto químicamente maleable como una entidad que es sintéticamente accesible utilizando metodología química razonable, y que posee funcionalidades químicamente estables y cualidades tipo fármaco (potencial). Los aciertos que pasan este filtro de química medicinal, fueron evaluados con respecto a su potencia inhibidora. Los valores EC50 fueron determinados a partir de un trazo de la actividad inhibidora del compuesto, normalmente a través de ocho concentraciones de compuesto (50, 15, 5, 1.5, 0.5, 0.15, 0.05 y 0.015 uM). Para evaluar si el acierto es un inhibidor selectivo, el efecto en funciones celulares fue determinado utilizando un ensayo de proliferación de célula estándar. Se determinó una concentración de citotoxicidad del 50% (CC50) utilizando un método colorimétrico a base de tetrazolio, el cual mide, la reducción in situ de bromuro de tetrazolio de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilo (MTT) a cristales de formación azul insolubles mediante enzimas mitocondriales en células metabólicamente activas. Los cristales solubilizados se cuantif icaron en forma espectrométrica. Utilizando los valores EC50 y CC50, se calculo un Indice Selectivo (SI) (SI = CC50/ EC50). Los aciertos con valores SI de al menos 10 se consideraron en forma adicional.
La especificidad de la actividad antiviral exhibida por los compuestos de acierto, se determinó probando los compuestos contra un número de virus relacionados y no relacionados. Los compuestos se probaron contra una variedad de virus de ADN (virus HSV, CMV, vacuna) y de ARN (RSV, rotavirus, fiebre de Valley Rift, virus Ebola, Ebola pseudotipo GP, Lassa pseudotipo GP, VIH pseudotipo env) no relacionados. Los compuestos que serán seleccionados para desarrollo adicional, son los que sean selectivos contra el virus objetivo original seleccionado e inactivos contra virus no relacionados.
Tacaribe EC50 A=<0.5 Candida I A= < 0.5 uM Número de uM B= 0.5a<1.0uM B=0.5a<1.0uM C=1.0a Ejemplo C= 1.0 a < 5 uM D= >5 <5 uM D= > 5 uM uM 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 A 8 A 9 A 10 A 11 A 12 A 13 A 14 B 15 B 16 B 17 B 18 B 19 B 20 B 21 B C 22 B 23 B 24 C 25 C 26 C Tacaribe EC50 A=<0.5 Candida 1 A= < 0.5 uM Número de uMB= 0.5a<1.0 uM B=0.5a 1.0uMC=1.0a Ejemplo C= 1.0 a < 5 uM D= >5 <5uM D= > 5 uM uM 27 C 28 C 29 C 30 C 31 C 32 C 33 C 34 C 35 C 36 C 37 C 38 C 39 C D 40 C 41 C 42 C 43 C 44 C 45 C 46 D 47 D 48 D 49 D 15 50 D Tacaribe EC50 A=<0.5 uM B= 0.5 a Número de Ejemplo <1.0 uM C= 1.0 a < 5 uM D= >5 uM 51 A 52 A 53 B 54 B 55 B 20 56 B 57 C 58 C 59 C 60 C 61 C 62 C 63 C 64 C 65 C Tacaribe EC50 A=<0.5 u B= 0.5 a Número de Ejemplo <1.0 uM C= 1.0 a < 5 uM D= >5 uM 66 C 67 C 68 c 69 c 70 c 71 c 72 c 73 c 74 c 75 c 76 c 77 c 78 c 79 c 80 c 81 c 82 c 83 c 84 c 85 D 86 D 87 D 88 D 89 D 90 D 91 D 92 D 93 D 94 D 95 D 96 D 97 D 98 D Ensayo 2 Se creó una biblioteca química y se clasificó de modo que represente una recolección amplia y bien equilibrada de 400,000 compuestos acumulados durante un número de años que proceden de una variedad de distintas fuentes. La biblioteca logra una cobertura amplia a través del espacio de propiedad que implica los siguientes descriptores químicos: logaritmo calculado del coeficiente de división n-octanol/agua (ClogP), polar (área de superficie accesible-agua (PSA), globularidad (estructuras tridimensional) y peso molecular (promedio: 394.5 daltons).
Células v virus Se crecieron células Vero (epitelial de riñon de mono verde Africano, ATCC #CCL-81) en un medio esencial mínimo de Eagle (MEM, Gibco) suplementado con 2 mM de L-glutamina, 25 pg/ml de gentamicina y 10% de suero de bovino fetal desactivado con calor (FBS). Para el medio de infección (IM), la concentración de suero se redujo al 2%. Se cultivaron células HEp-2 (carcinoma humano de epitelial de laringe; ATCC #CCL-23) en un MEM que contiene 10% de FBS desactivado con calor y 1% de penicilina/estreptomicina. Se cultivaron células MRC-5 (fibroblasto de pulmón normal humano; ATCC #CCL-171) en MEM que contiene 10% de FBS desactivado con calor, 1% penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina (Invitrogen 25030-081), 1% de Aminoácidos no Esenciales (Invitrogen #11140-050), 1% de piruvato de sodio (Invitrogen #11360-070), y 2% de bicarbonato de sodio. Se cultivaron células MA104 (riñon de mono verde Africano epitelial, ATCC CRL-2378.1) en un MEM con 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% de Aminoácidos no Esenciales, 1% de piruvato de sodio, y 2% de bicarbonato de sodio y 62.5 ug/ml de tripsina y sin suero durante la infección del virus. Todas las líneas celulares se incubaron a una temperatura de 37°C y condiciones 5% C02. Se obtuvieron virus sincitial respiratorio (RSV; aislado A), virus de coriomeningitis linfocítica (LCMV; aislado Armstrong E350), citomegalovirus (CMV; aislado AD-169), virus 1 de herpes simple (HSV-1; aislado KOS), virus Vaccinia (Cepa WR), virus Tacaribe (cepa TRVL 11573) y rotavirus (cepa WA) en ATCC (#VR-1422, #VR-1540, #VR-134, #VR-538, #VR-1493, #VR-1354, #VR-114, y # VR-2018 respectivamente). Se obtuvieron Candid 1 y Amapari BeAn 70563 por parte del Doctor Robert Tesh en la University of Texas Medical Branch (Galveston, TX). Se realizó el trabajo con viruses de BSL 4 (Lassa, Machupo, Guanarito, y Junin) así como coronavirus asociado con síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV), a través de los colaboradores en USAMRIID (Fort Detrick, MD).
Ensayos Antivirales para Clasificación de Especificidad: Ensayo de Efecto Citopático ("CPE"), Ensayo de Reducción de Placas de Virus, v ELISA Se utilizó un ensayo CPE viral para evaluar el efecto antiviral de compuestos contra el virus Tacaribe (células Vero), virus de vacuna Candid-1 (células Vero), virus Amapari (células Vero), SARS-CoV (células Vero), HSV-1 (células Vero), RSV (HEp-2 células), virus vaccinia (células Vero), y Rotavirus (MA 104). Se utilizó un ensayo inmuno-absorbente enlazado por enzimas ("ELISA") para evaluar el efecto antiviral de los compuestos contra CMV (células MRC-5) y LCMV (células Vero). Todos estos ensayos se llevaron a cabo en un medio adecuado que contiene FBS desactivado por calor al 2%. Se sembraron placas de cultivo celular de noventa y seis depósitos, 24 horas antes de utilizarse con 1.5 X 1 O4 (Vero), 2.2 X 104 (HEp-2 y MA104), y 4.5 X 104 (MRC-5) células por depósito. Para las pruebas de susceptibilidad del compuesto, se agregaron compuestos (solubilizados con 100% DMSO) para duplicar los depósitos en concentraciones finales de 50, 15.8, 5, 1.6, 0.5, 0.16, 0.05, 0.016 y 0 µ?. La concentración final de DMSO en los ensayos fue de 0.5%. Se titularon las reservas de virus en un experimento separado para determinar la concentración que dio como resultado el 90% de destrucción de la monocapa celular (ensayo CPE) después de 3 días (HSV- , Rotavirus y vaccinia) ó 4 días (SARS-CoV, RSV, virus Tacaribe, virus de vacuna Candid 1 y virus Amapari) o la concentración que generó una señal ELISA de 2.5 en una densidad óptica de 650 nm (OD6so) después de 3 días (LCMV) ó 4 días (CMV). Estas diluciones preestablecidas del virus se agregaron a depósitos que contienen diluciones en serie del compuesto. Las células no infectadas y las células que reciben virus sin compuestos incluyeron en cada placa de ensayo. Además, los agentes de referencia, cuando están disponibles, se incluyeron en cada placa de ensayo (ganciclovir de HSV-1 y CMV, Sigma #G2536; ribavirina para LCMV y RSV, Sigma #R9644; y rifampicina para virus vaccinia, Sigma #R3501). Las placas se incubaron a una temperatura de 37°C y 5% C02 durante ya sea 3 días (HSV-1, Rotavirus, LCMV, virus Vaccinia) o 4 días (virus Tacaribe, virus Amapari, virus Candid 1, SARS-CoV, RSV, y CMV). Se procesaron placas infectadas con virus de HSV-1, SARS-CoV, Rotavirus, virus Vaccinia, RSV, virus Tacaribe, virus Amapari, virus de vacuna Candid 1 para manchado de violeta cristal, en tanto que las placas infectadas con CMV y LCMV fueron procesadas para análisis ELISA. Para el manchado de violeta cristal, las placas se fijaron con 5% de glutaraldehído y se mancharon con violeta cristal al 0.1%. Después de enjuagar y secar, la densidad óptica en 570 nm (OD570) fue medido utilizando un Lector de Placa Microplate Reader. Para análisis ELISA, el medio de las placas infectadas con LCMV y CMV, fue eliminado y las células se fijaron con 100% de metanol (Fisher, CAS #67-56-1, grado HPLC) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó la solución de metanol y las placas se lavaron tres veces con PBS. Se bloquearon sitios de enlace no específicos mediante la adición de 130 µ? de Amortiguador de Bloqueo Superblock (Pierce #37515) durante 1 hora a una temperatura de 37°C. Se eliminó el agente de bloqueo y los depósitos se lavaron tres veces con PBS. Se agregaron treinta µ? de una dilución 1:20 de anticuerpo monoclonal específico de Proteína Nuclear LCMV (NP) (obsequio generoso de Juan Carlos de la Torre, The Scripps Research Institute, La Jolla CA) ó 30 µ? de una dilución 1:200 de anticuerpos monoclonales de cóctel específico CMV (proteína 52 y producto único de gen 44 largo) (Dako, #M0854) en un Amortiguador de Bloqueo de Superbloque que contiene 0.1% Tween-20. Después de una incubación de 1 hora a una temperatura de 37°C, se eliminó la solución de anticuerpo primaria y los depósitos se lavaron tres veces con PBS que contiene 0.1% Tween-20. Se agregaron cuarenta µ? de anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano de anti-ratón de cabra (Bio-Rad #172-1011) diluido 1:4000 (LCMV) ó 1:400 (CMV) en Amortiguador de Bloqueo de Superbloque que contiene 0.1 % de Tween-20 a los depósitos y las placas se incubaron durante 1 hora a una temperatura de 37°C. Se eliminó la solución de anticuerpo secundaria y los depósitos se lavaron 5 veces con PBS. El ensayo se desarrolló durante 15 minutos mediante la adición de 130 µ? de substrato de 3,3', 5,5-tetrametilbencidina (Sigma #T0440) para cuantificar la actividad de peroxidasa. El OD6so de producto de reacción resultante se midió utilizando un Lector de Microplaca Cinética de Molecular Devices con un filtro 650 nm.
La actividad antiviral contra el virus Tacaribe se evaluó a través de tres métodos: Ensayo CPE, Reducción de Placa y Ensayo de Inhibición de Rendimiento de Virus. Para el ensayo HTS CPE, se revistieron células Vero en una confluencia al 80% en placas de 96 depósitos. Los compuestos de prueba (80 por placa) en donde la biblioteca se agregaron a los depósitos en una concentración final de 5 µ?. Se agregó posteriormente el virus Tacaribe en una dilución de virus que puede dar como resultado 90% CPE después de 5 días (multiplicidad de infección ("MOI") aproximadamente 0.001). Las placas se incubaron a una temperatura de 37°C y 5% C02 durante 5 días, posteriormente se fijaron con glutaraldehído al 5% y se mancharon con violeta cristal al 0.1%. El grado de CPE de virus fue cuantificado en forma espectrométrica en OD570 utilizando el Lector de Microplaca Envision. La actividad inhibidora de cada compuesto fue calculada substrayendo del OD570 del compuesto de prueba del OD570 promedio de los depósitos de células infectadas con virus, dividiendo posteriormente entre el OD570 promedio de depósitos de células infectadas con mock. El resultado representa el porcentaje de protección contra la actividad CPE del virus Tacaribe conferida para cada compuesto. Los "aciertos" en este ensayo fueron definidos como compuesto que inhibió el CPE inducido por virus en más del 50% en la concentración de prueba (5 µ?). Los aciertos que poseyeron la maleabilidad química, fueron evaluados en forma adicional con respecto a su potencia inhibidora. Los valores de concentración de inhibición del 50% (EC50), fueron determinados a partir de un trazo de la actividad inhibidora del compuesto después de un ensayo CPE a través de ocho concentraciones de compuesto (50, 15, 5, 1.5, 0.5, 0.15, 0.05 y 0.015 µ?). Todas las determinaciones se llevaron a cabo por duplicado.
En el Ensayo de Reducción de Placa, las monocapas de célula Vero crecidas en placas de 6 depósitos fueron infectadas con aproximadamente 50 PFU/depósito en la ausencia o presencia de varias concentraciones de los compuestos. Después de una hora de absorción de virus a una temperatura de 37°C, se reemplazó el inoculo residual en una mezcla 50:50 de agarosa de placa marina al 1% (en agua desionizada) y 2x MEM. Las placas se contaron después de 5 a 7 días de incubación a una temperatura de 37°C. El EC50 se calculó con la concentración del compuesto requerida para reducir los números de placa de virus en un 50%. Bajo condiciones BSL 4 en USAMRIID, los ensayos de reducción de placa (con virus Lassa, Machupo, Guanarito, y Junin) se llevaron a cabo como se indica a continuación: 200 PFU de cada virus fue utilizado para infectar células Vero. Después de la absorción del virus, se enjuagaron las monocapas celulares y se colocaron con un medio completo que contiene agarosa al 1% y ya sea sin compuesto de prueba o con diferentes concentraciones que fluctúan de 15 µ? a 0.05 µ?. Después de 5 días de incubación a una temperatura de 37°C, las monocapas se mancharon con rojo neutral y se contaron los números de placas.
En Ensayos de Reducción de Rendimiento de Virus, se infectaron células Vero crecidas en placas de 24 depósitos con virus Tacaribe en una multiplicidad de infección ("MOI") de 0.1 en la presencia de diferentes concentraciones de los compuestos, dos depósitos por concentración. Después de 48 horas de incubación a una temperatura de 37°C el virus fue recolectado y se determinaron los rendimientos del virus mediante formación de placas en células Vero. Los valores EC50 fueron calculados como se indicó anteriormente y se llevaron a cabo cálculos similares para determinar el EC90 y EC99.
Ensayo de Citotoxicidad Se midió la viabilidad celular a través de un ensayo de proliferación celular para determinar el efecto de un compuesto en funciones celulares de modo que se puede calcular una concentración de citotoxicidad al 50% (CC50); la proporción de este valor al EC50 se refiere como el índice selectivo (S.l. = CC50/EC50). Se utilizaron dos tipos de ensayos para determinar la citotoxicidad. Uno fue un método colorimétrico que mide la reducción de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio ( TT), y el otro utiliza fluorimetría para medir la reducción de resazurina (Alamar Blue). Ambos métodos produjeron datos similares. Se expusieron cultivos confluentes en placas de 96 depósitos a diferentes concentraciones de los compuestos, con dos depósitos por cada concentración, utilizando condiciones de incubación equivalentes a las utilizadas en los ensayos antivirales.
Química medicinal Se identificaron diversos compuestos potentes mediante HTS Tacaribe y se agruparon en diversos grupos de tipos de estructura. Un grupo de compuestos, con ST-336 (FW = 407.3) que representa el prototipo basado en la actividad antiviral y maleabilidad química, fue elegido para desarrollo adicional. A través del análisis retrosintético de ST-336, se determinó que una biblioteca de análogos puede ser preparado en forma convergente en un paso sintético simple, combinando un isocianato con una hidrazida de acilo. Utilizando esta química, se prepararon 165 análogos y el más potente se revisó para metabolismo in vitro.
Tiempo de Experimento de Adición Este experimento se diseñó para caracterizar el mecanismo de acción de los compuestos antivirales. Se crecieron células Vero en placas de cultivo de 24 depósitos. El medio se eliminó cuando las células alcanzaron una confluencia de 70 a 80% y se reemplazaron con medio de infección. Las células se infectaron con virus Tacaribe en MOI = 0.1. Después de 1 hora de absorción, se eliminó el inoculo viral y se reemplazo con un medio de infección fresco. Se trataron depósitos por duplicado con 3µ? ST-336 1 hora antes de la infección, al momento de la infección o en momentos específicos posteriores a la infección (de 1 a 20 h p.i.). Se trataron cultivos celulares infectados con control únicamente con vehículo de fármaco (DMSO). Se eliminó ST-336 1 hora después de la absorción y la monocapa de lavó dos veces con PBS-M frío y se reemplazó con un medio de infección fresco. Las células se recolectaron en 24 h p.i. y se titularon tal como se describió anteriormente.
En un experimento separado, se infectaron células Vero revestidas en una placa de 6 depósitos con virus de virus Tacaribe en MOI = 4. La absorción se llevó a cabo durante 1 hora. Se agregaron tres µ? de ST-336 durante 1 hora, 1 hora antes de la infección, durante la infección y 1 hora después de la infección. Después de la adición de fármaco y la infección de virus, las monocapas se lavaron tres veces con medio completo. Cuatro horas después de la última adición de fármaco, las monocapas se colocaron con agarosa al 1% sin compuesto hasta que se desarrollaron las placas. De 5 a 7 días después de la infección, las monocapas fueron fijadas, se mancharon con violeta cristal y se contaron los números de placa.
Ensayo para Enlace de Compuesto a Virus Intacto Este experimento se diseñó para probar las propiedades inhibidoras de enlace/fusión de ST-336 hacia virus Tacaribe. Las células Vero fueron crecidas en MEM con suero de becerro fetal al 2%. Para este experimento, las células se crecieron a una confluencia de 70 a 80% en placas de cultivo de 24 depósitos. En un conjunto de tubos, se trató el virus Tacaribe (4000 pfu) con DMSO al 1%, se diluyó en serie diez veces en un medio de infección y se trató con concentraciones específicas de ST- 336 (400 pfu + 0.5 µ? ST-336, 40 pfu + 0.05 µ? ST-336) o únicamente DMSO (400 pfu o 40 pfu + DMSO). En otro conjunto de tubos, se trató el virus Tacaribe (4000 pfu) con 5 µ? de ST-336, posteriormente se diluyó en serie diez veces en un medio de infección. Las suspensiones se revistieron en depósitos y después de la absorción durante una hora, se eliminaron los inoculos y se colocaron con agarosa Seaplaque al 0.5% en MEM. La placa se incubó a una temperatura de 37°C hasta que se observó el efecto citopático en el depósito de control DMSO. Las células se fijaron con glutaraldehído al 5% y se mancharon con violeta cristal al 0.1% para visualización de placa.
Otro ensayo empleado para probarlas propiedades de enlace de ST-336 para fusionar previamente las proteínas-F en viriones, fue un experimento de diálisis. Se incubó el virus Tacaribe purificado (1000 pfu) con 5 µ? de ST-336 o 0.5% DMSO. Las suspensiones se dializaron durante la noche a una temperatura de 4°C en una cámara de diálisis. 24 horas después de la diálisis, se trataron las suspensiones virales en células Vero. Una hora después de la absorción, los inoculos fueron eliminados y se aplicó agarosa Seaplaque al 0.5% en MEM. La placa se incubó a una temperatura de 37°C hasta que se observó el efecto citopático. Las células se fijaron con glutaraldehído al 5% y se mancharon con violeta cristal al 0.1%.
Para confirmar la ausencia de fármaco libre en la muestra de virus-fármaco dializada, el virus fue bloqueado en mezcla dializada al momento de la infección, y las placas desarrolladas como se describió anteriormente.
Aislamiento de Virus Variante Resistentes a Fármaco Inicialmente, se aislaron placas simples de virus Tacaribe WT- para esta purificación-placa, se infectaron células Vero en placas de 6 depósitos con 50 pfu/depósito en un virus WT durante 1 hora a una temperatura de 37°C. Después de la absorción del virus, el inoculo fue eliminado y cada depósito se cubrió con agarosa al Seaplaque al 0.5% en MEM y se incubó a una temperatura de 37°C hasta que las placas fueron visibles (5 a 7 días). Se recogieron cuatro placas y se amplificaron en forma adicional en células Vero en una placa de 24 depósitos hasta que se desarrolló CPE (5 a 7 días). Los extractos de células infectados con virus se recolectaron raspando las células en el medio, y posteriormente recolectando en tubos de microcentrifugación de 1.5 mi. Cada aislado purificado con placas se amplificó en forma adicional en placas de 150 mm, y posteriormente cada reserva de virus que se originó de la una placa de virus, fue titulada.
Para el aislamiento de las variantes de virus Tacaribe, resistentes a compuestos, cada aislado purificado por placa tipo natural se tituló en la presencia de 3 µ? de ST-336 tal como se describe. Se infectaron células Vero en una placa de 6 depósitos con 104- 106 pfu/depósito en un medio que contiene 3 µ? de ST- 336 durante 1 hora, posteriormente las células se cubrieron con agarosa seaplaque al 0.5% en MEM que contiene 3 µ? de ST-336 y se incubaron hasta que se formaron las placas. Las placas se recolectaron y se utilizaron para infectar células Vero en una placa de 24 depósitos sin compuesto. Cuando se desarrolló CPE, se recolectaron las células infectadas. Cada aislado resistente a fármacos se tituló posteriormente en una placa de 96 depósitos en diluciones 0.5 log, comenzando con 25 µ? de reserva de virus puro, sin compuesto y con 1 µ? y 3 µ? de ST-336. Cada mutante corrió durante diversas vueltas de purificación de placa antes de que se elaboraran las reservas de virus final.
Secuenciación Se extractó el ARN de cada uno de los aislados Tacaribe WT (1 a 4) y cuatro de los aislados resistentes a fármacos (DR#1-4) y se utilizaron para PCR de transcripción inversa. Los sebadores específicos para el GPC (Tac-directo: 5' GCCTAACTGAACCAGGTG AATC (SEQ ID NO: 1) y Tac-inverso: 5' TAAG ACTTCCGCACCACAGG (SEQ ID NO:2)) de Tacaribe, se utilizaron para amplificación y secuenciación.
Solubilidad Se utilizaron dos pruebas para evaluar la solubilidad del compuesto: solubilidad en un medio de cultivo celular con o sin varias concentraciones de suero, y solubilidad en amortiguador acuoso en pH 7.4. Las soluciones se agitaron durante la noche y posteriormente se filtraron a través de una columna Amicon Centrifree YM-30 con un corte de 30,000 MW para eliminar el compuesto potencialmente precipitado y el compuesto enlazado a la proteína. El compuesto se cuantificó mediante LC/MS o espectrometría UV.
Estabilidad Se determinó la estabilidad metabólica ¡n vitro mediante Absorption Systems (Exton, PA) utilizando 9000 x g de sobrenadante (S9) de hígado homogeinizado de varias especies como una fuente de enzimas de conjugación oxidativa (por ejemplo, citocromos P450, transferasa de UdP-glucuronosil) que son conocidos por ser las trayectorias primarias de biotransformación para la mayor parte de los fármacos. La estabilidad metabólica fue medida como la persistencia del compuesto de origen durante el tiempo de incubación en las fracciones S9 mediante espectrometría de masa. En síntesis, se obtuvieron fracciones S9 de humano, rata, ratón, y cerdo de guinea en Xenotech (Lenexa, KS). La mezcla de reacción, menos los cocteles de co-factor, fue preparada (1 mg/ml de fracciones S9 de hígado, 1 mM NADPH, 1 mM UDPGA, 1 mM PAPS, 1 mM GSH, 100 mM de fosfato de potasio pH 7.4, 10 mM de cloruro de magnesio, 10 µ? de artículo de prueba) y se equilibró a una temperatura de 37°C durante 3 minutos. Se tomó como un control negativo, una alícuota de la mezcla de reacción. La reacción se inició mediante la adición de cocteles de co-factor a la mezcla de reacción únicamente, y posteriormente la mezcla de reacción y el control negativo se incubaron en un baño de agua en agitación a una temperatura de 37°C. Las alícuotas (100 µ?) se extrajeron en triplicado en 0, 15, 30, y 60 minutos y se combinaron con 900 µ? de acetonitrilo/dH20 50/50 enfriado con hielo para determinar la reacción. Cada muestra se analizó mediante LC/MS/MS. El log natural del porcentaje restante, se trazó versus el tiempo. Se utilizó un ajuste lineal para determinar la constante de rango. El ajuste fue truncado cuando el porcentaje restante del artículo de prueba fue menor al 10%. Se determinó la eliminación de las vidas medias asociadas con la desaparición de los artículos de control y de prueba, para comparar su estabilidad metabólica relativa.
Genotoxicidad Se utilizó un ensayo de mutagenecidad bacterial exploratoria (prueba Ames) para evaluar el potencial de genotoxicidad del compuesto. Este ensayo utilizó cepas de prueba S. typhimurium TA7007 y TA7006 (mutaciones de par base) y TA98 (mutación de cambio de estructura) con o sin activación metabólica (hígado de rata S9 inducido mediante Aroclor) tal como se describió previamente.32 Evaluaciones Farmacocinéticas ("PJ") en Ratas y Ratones Recién Nacidos El análisis de las farmacocinéticas orales de los compuestos seleccionados, se llevó a cabo en ratas Sprague Dawley en un estudio de dosis simple con muestras de suero tomadas durante un período de 24 horas. Para la evaluación PK de ratones recién nacidos, se dosificaron ratones BALB/c de 4 días de edad en forma intraperitoneal (IP) y se tomaron las muestras de suero durante un período de 24 horas. Se combinaron 50 µ? de una alícuota de plasma con 150 µ? de acetonitrílo al 100% que contiene un estándar interno (100 ng/ml de tolbutamida) en un tubo de centrifugación de 1.5 mi. Las muestras se vortizaron y se centrifugaron en 13,000 rpm durante 10 minutos. Posteriormente se transfirieron un alícuota de 80 µ? del sobrenadante resultante a un HPLC para análisis en frasco. Se determinaron los niveles en plasma de cada compuesto mediante LC/MS/MS, y se determinaron los parámetros farmacocinéticos utilizando el software WinNolin. Eficacia en Modelo de Ratón Recién Nacido Para determinar la capacidad de toleración de ST-294, a ratones BALB/c recién nacidos (4 días de edad) se les administraron dosis IP de 0 (vehículo), 10, 25, o 100 mg/kg/día de ST-294 durante 5 días con evaluación diaria del estado clínico.
Para probar la eficacia de ST-294 en el modelo de ratón recién nacido Tacaribe, se estimularon ratones BALB/c de 4 días de edad (8 por grupo de dosis) con 3x103 PFU (30XLD50) de virus Tacaribe por ratón mediante inyección IP con la muerte como el punto de extremo. Los ratones fueron ya tratados con placebo (vehículo), ribavirina (MP Biomedical), administrado a IP en 25 mg/kg una vez día durante 10 días, o ST-294 administrada IP en 100 mg/kg una vez al día o en 50 mg/kg dos veces al día un día durante 10 días. Los ratones fueron monitoreados diariamente y se pesaron cada tercer día a lo largo del estudio. Cualesquiera ratones que muestran signos de morbilidad fueron eutanizados mediante asfixia con C02. Todos los estudios en animales estuvieron de acuerdo con el Institute for Laboratory Animal Research y fueron aprobados a través de la revisión de la IACUC adecuada.
Resultados Homología entre Tacaribe v otros BSL 4 NWA Actualmente existen 23 especies virales reconocidas de la familia Arenaviridae4. Estos virus han sido clasificados en dos grupos: los arenavirus del Viejo Mundo (Lassa/LCM) y el grupo del Nuevo Mundo (complejo Tacaribe). El complejo Tacaribe del Nuevo Mundo comprende tres linajes filogenéticos, designados grupos de descendientes A, B, y C. El grupo de descendiente B incluye el virus Tacaribe prototípico, virus Amapari y cuatro patógenos categoría A de América del Sur (Junin, Machupo, Guanarito y Sabia). El virus Tacaribe es del 67% al 78% idéntico al virus Junin en el nivel de aminoácido para las cuatro proteínas virales23. El trabajo con arenavirus Categoría A auténticos, requieren una contención máxima en laboratorio (BSL-4), y por consiguiente presenta aspectos de logística y seguridad significativos. Ya que el virus Tacaribe está relacionado cercanamente con los patógenos Categoría A, se eligió como un sustituto de BSL 2 NWA para el desarrollo del ensayo HTS para clasificar los inhibidores de la réplica del virus.
Ensayo HTS de Tacaribe Ya que el virus Tacaribe crece bien en un cultivo celular y origina un efecto citopático inducido por virus despejado (CPE) se desarrolló un ensayo HTS CPE robusto en una placa de 96 depósitos. El ensayo CPE es un ensayo de célula completa que permite el cálculo del índice selectivo de los compuestos y la identificación de inhibidores de cualesquiera pasos esenciales en el ciclo de vida del virus. De los 400,000 compuestos clasificados en el ensayo HTS de virus Tacaribe, se identificaron 2,347 aciertos (rango de acierto 0.58%). Todos estos aciertos tuvieron valores EC50 de <5 µ?. Los 2,347 aciertos fueron calificados posteriormente con base en cuatro criterios: i) maleabilidad química, ii) potencia inhibidora, iii) selectividad inhibidora, y iv) especificidad antiviral. Se definió un compuesto químicamente maleable como una entidad que es sintéticamente accesible utilizando metodología química razonable, y que posee funciones químicamente estables y calidades potenciales tipo fármaco. Los aciertos que pasaron este filtro de químico medicinal fueron evaluados con respecto a su potencia inhibidora. Los valores EC50, CC50, y de índice selectivo (SI) se determinaron para evaluar si el acierto fue un inhibidor selectivo. Los aciertos con valores SI de al menos 10 fueron considerados en forma adicional. De los 2,347 aciertos identificados, 36 compuestos exhibieron todas las características de los aciertos de calidad. Estos compuestos fueron maleables químicamente, tuvieron valores de EC50 <5 µ? y valores SI > 10. Entre los 36 aciertos de calidad, hubieron muchos grupos de tipo estructura. Un tipo de estructura fue elegido para desarrollo adicional y ST-336 es el prototipo representativo de esta serie. ST-336 es un compuesto de 407.33 dalton y su estructura se muestra en la figura 1.
Tabla 1: Especificidad de ST-336 Virus (ensayo) ST-336 NWA Tacaribe (CPE) EC50 0.055 (CPE) EC90 0.125 (Rendimiento de virus) EC90 0.068 (Rendimiento de virus) EC99 0.085 (Reducción de placa) EC50 0.100 Candidl (CPE) EC50 0.062 Amapari (CPE) EC50 >20* Machupo (reducción de placa) EC50 0.150 Guanarito (reducción de placa) EC50 0.300 Junin (reducción de placa) EC50 0.150 OWA Lassa (reducción de placa) EC50 >20 LC V (Elisa) EC50 >20 Los resultados representan el promedio de al menos dos determinaciones independientes. *20 µ? representa el límite de la solubilidad del compuesto.
Caracterización de ST-336 Tal como se aprecia en la tabla 1, ST-336 tiene potencia submicromolar, buena selectividad y especificidad antiviral contra el virus Tacaribe así como NWA Categoría A. La evaluación de ST-336 en un ensayo de reducción de rendimiento de virus contra el virus Tacaribe produjo valores EC90 y EC99 de 0.068 µ? y 0.085 µ? respectivamente. El valor CC50 de ST-336 en células Vero es >20 µ?, lo cual representa el límite de solubilidad de este compuesto en el medio de cultivo celular, proporcionándolo un índice selectivo de >363. La actividad de ST-336 contra el virus Tacaribe se probó en líneas celulares múltiples y todos los valores EC50 fueron similares a los logrados en células Vero (datos no mostrados). Cuando se probó contra diversos arenavirus, ST-336 no mostró actividad inhibidora contra OWA, ya sea virus LCM virus o virus Lassa auténtico (tabla 1). Este fármaco también careció de actividad contra el virus NWA Amapari. Esto fue un resultado sorprendente debido a la relación filogenética cercana entre los virus Amapari y Tacaribees23. Esta discrepancia se describe posteriormente después de la secuenciación de GP2 de todos los NWA. Sin embargo, ST-336 mostró de manera importante actividad antiviral potente contra la cepa de vacuna de virus Junin (Candid 1) así como Machupo, Guanarito, y Junin (tabla 1).
Tabla 2: Selectividad ST-336 Virus (ensayo) ST-336 EC50 (µ ) Virus ADN HSV-1 (CPE) >20* C V (Elisa) >20 Vaccinia (CPE) >20 ARN virus RSV-A (CPE) >20 Rotavirus (CPE) >20 SARS (CPE) >20 Ebola (CPE) >20 Los resultados representan el promedio de al menos dos determinaciones independientes. *20 µ? representa el límite de la solubilidad del compuesto.
La especificidad de la actividad antiviral exhibida por ST-336, se determinó probando contra un número de virus relacionados y no relacionados. Tal como se muestra en la tabla 2, ST-336 no mostró actividad contra una variedad de viruses de ADN (virus HSV, CMV, vaccinia) y ARN (virus RSV, Rotavirus, SARS y Ebola) no relacionados.
Mecanismo de Acción de ST-336 Se realizó un tiempo de ciclo simple (24 horas) del experimento de adición para determinar cuándo durante la réplica del virus, el ciclo ST-336 ejerce su actividad antiviral. El efecto de ST-336 en el rendimiento del virus Tacaribe, fue determinado después de la adición del compuesto a los cultivos de células en varios tiempos antes o después de la infección. Se agregó ST-336 una hora antes de la infección (-1 hora), durante la absorción del virus (0 horas), y en varios tiempos después de la infección. Se mantuvo el fármaco, después de la adición secuencial, en cultivo celulares infectados durante todo el tiempo del experimento. Se trataron cultivos infectados de control únicamente con vehículo de fármaco (DMSO). A las 24 horas posteriores de la infección, se reportaron las muestras, y se determinaron los rendimientos del virus mediante ensayo de placa. Tal como se muestra en la figura 2A, ST-336 ejerció su efecto inhibidor únicamente en una etapa muy temprana del ciclo de vida del virus. Además de ST-336, en cualesquiera punto de tiempo posteriores a la infección, no hubo efecto en el rendimiento del virus. Estos datos sugieren que ST-336 s un inhibidor de etapa temprana de la réplica del virus.
Los resultados fueron confirmados en un segundo tipo de experimento de adición de tiempo. En este experimento, el compuesto fue inactivado en el medio de cultivo durante únicamente 1 hora, 1 hora antes de la infección (-1 hora), durante la infección (0) y 1 hora después de la infección (*1 hora), y posteriormente se eliminó. Los cultivos se lavaron para eliminar cualquier compuesto residual y se cubrieron con agarosa. Posteriormente se determinaron los números de placa de virus a los 5 días posteriores de la infección. Los datos en la figura 2B mostraron que aunque el compuesto agregado antes y después de la absorción de virus durante 1 hora, no tuvo efecto en la formación de placas, el compuesto agregado durante 1 hora en el proceso de absorción/entrada redujo dramáticamente la formación de placa Tacaribe. Estos datos son consistentes con ST-336 que es un inhibidor de absorción/entrada.
Se tomaron dos métodos para determinar si ST-336 se enlaza a viriones intactos. En el primer experimento, se incubaron 1000 PFU del virus Tacaribe purificado con ST-336 o DMSO y se dializaron durante la noche a una temperatura de 4°C y se titularon. Aunque no se titularon los virus de la bolsa dializada originalmente incubada con fármaco, se titularon más de 300 PFU de virus a partir de la bolsa dializada con vehículo DMSO (datos no mostrados). No se detectó biológicamente el fármaco en la bolsa de diálisis que contiene originalmente 5 µ? de fármaco tal como se mide a través de la incapacidad de la mezcla dializada de virus más fármaco, de inhibir el virus Tacaribe (300 PFU) agregado recientemente. Estos datos sugirieron que ST-336 enlaza viriones intactos con una constante de disociación muy baja. En el segundo experimento (figura 3), el virus Tacaribe fue incubado el tubo de prueba con 5 µ? de ST-336 o DMSO. Se llevaron a cabo diluciones en serie 1:10 y para algunas muestras ST-336 se agregó como una dilución específica que representa la concentración del fármaco esperada después de la dilución de la muestra. Conforme el virus y el compuesto se diluyen con el medio, la concentración del compuesto alcanzará una concentración sin efecto inhibidor, a menos que el compuesto obtuviera la capacidad de enlazar al virus. El virus de prueba sin compuesto en el tubo inicial, también se diluyó en el medio y las concentraciones del compuesto que corresponden al encontrado en los tubos en donde se diluyeron el virus y el compuesto juntos, se agregó a cada dilución de virus. La titulación en células Vero mostró que ST-336 presente en exceso en el tubo inicial, se llevó durante dos diluciones 1:10 adicionales a través del enlace de virus específico e inhibe la infección de virus. En contraste, cuando el fármaco se agregó en una dilución específica, el virus no fue inhibido al mismo grado que el virus diluido con fármaco (datos no mostrados). Estos datos sugiere que ST-336 enlaza con al menos un K0ff lento a la proteína intacta presente en el virus Tacaribe.
Aislamiento de Variantes Resistentes a Fármaco El rango de mutación esperado de virus de ARN es muy alto (-1 mutante en 10,000) y un método común para determinar el objetivo de un antiviral, es para aislar la resistencia del virus al antiviral, y posteriormente mapear el sitio de resistencia. Las variantes de virus con susceptibilidad reducida a ST-336, fueron aisladas a las reservas del virus Tacaribe tipo natural, revestidas en la presencia de ST-336. La frecuencia observada de las variantes resistentes a fármaco ST-336 (ST-336D ) fue tal como se esperó para los virus de ARN. Se aislaron dieciséis aislados ST-336DR de cuatro reservas de virus Tacaribe tipo natural independiente, y se purificaron con placa tres veces. Todos los aislados AU ST-336DR fueron probados con respecto a su capacidad de crecer en la presencia de ST-336. El crecimiento de aislados ST-336DR no se vio afectado con la presencia de ST-336 en concentraciones que inhiben completamente la réplica de virus Tacaribe tipo natural (datos no mostrados). El aislamiento y confirmación de las variantes de virus resistentes a fármacos, sugieren fuertemente que ST-336 actúa como un inhibidor antiviral directo.
Para determinar las bases genéticas para resistencia y el objetivo molecular de ST-336, se aisló el ARN de los aislados ST-336DR y tipo natural. Con base en el tiempo de los experimentos de adición, se sospecha que las glucoproteínas virales deben ser el objetivo de ST-336. Toda la región GPC precursora de glucoproteína del segmento S fue secuenciado. El análisis de secuencia se llevó a cabo en cuatro aislados tipo natural (WT#1-4) y cuatro aislados ST-336DR derivados de la selección de fármaco aplicada a cada aislado tipo natural de origen correspondiente (DR#1.1 de WT#1, DR#2.1 de WT#2, DR#3.1 de WT#3 y DR#4.1 de WT#4). El análisis de secuencia mostró que el gen GPC de cuatro aislados tipo natural de origen tuvo secuencias idénticas. Cuando se comparó con las secuencias GPC de cuatro variantes resistentes a fármacos, cada una poseyó un cambio de nucleótido simple que en todos los casos dio como resultado un cambio de aminoácido. La figura 4 muestra la ubicación de cada una de las mutaciones que se localizan en o alrededor del dominio de transmembrana de GP2. Las alineaciones de secuencia de la región de GP2 que contienen los cambios se presentan en la figura 4B. El cambio simple en DR#1.1 fue en la posición de aminoácido 418 (1418T), en DR#2.1 en aminoácido 416 (T416N), en DR#3.1 en aminoácido 433 (S433I) y en el DR#4.1 en aminoácido 436 (F436I). 1418 se conserva en forma similar (I o L, aunque nunca un T) en todos los arenavirus del Nuevo Mundo del grupo de descendientes B, en tanto que T416 se conserva entre todos los NWA del grupo de descendientes B. F436 se conserva en forma adicional con una excepción; el virus Amapari codifica una leucina en la posición 436. Este cambio en el virus Amapari puede explicar su carencia de susceptibilidad a ST-336 (tabla 2). 1418, T416, S433 y F436 están cerca de los límites N-terminal y C-terminal del dominio de transmembrana putativo de GP2, una región conocida por desempeñar un papel vital en la fusión de virus envueltos 17·27· 28· 38· 39. Tomados juntos, estos datos sugieren que los cambios de aminoácido en el GP2 de arenavirus en cualesquiera de las posiciones 416, 418, 433 ó 436, son suficientes para conferir una susceptibilidad reducida ST-336 y son consistentes con el mecanismo de inhibición de fusión propuesta sugerida por los experimentos virológicos.
Optimización de Acierto para Conducción Los datos preliminares mostraron que ST-336, aunque demuestra una interesante actividad y especificidad antiviral, tuvo propiedades farmacocinéticas (PK) deficientes en roedores (ratones y ratas, datos no mostrados). Con el objeto de mejorar las propiedades de PK de ST-336, se inició una campaña de química de optimización de conducción. El objetivo del programa de optimización fue desarrollar compuestos que posean atributos consistentes con el último perfil de producto del fármaco. Las actividades de optimización de conducción comprenden una serie de interacciones que implican el diseño y síntesis química de análogos de la estructura de conducción, a través de una serie de evaluaciones biológicas, fisioquímicas y farmacológicas de los nuevos compuestos. Los análogos químicos que fluyen a través de un paradigma de evaluación de compuestos que implicó primero las evaluaciones in vitro virológicas y de citotoxicidad, seguido de una serie de evaluaciones tal como se describe: estabilidad metabólica in vitro (S9), solubilidad, mutagénesis bacteriana exploratoria y evaluaciones farmacocinéticas. Se prepararon 165 análogos y se revisaron los más potentes para el metabolismo S9 en extractos de hígado. El más estable se dosificó en ratas, y ST-294 surgió como un potente representativo de compuestos oralmente biodisponibles.
Caracterización de ST-294 La estructura de ST-294 (N-2-( ,1 , ,3,3,3-hexafluoro-1 -metilpropil)-2-[(4-difluorometoxifenil)sulfonil]hidrazina-1-carboxamida) se muestra en la figura 5. Se probó ST-294 contra los mutantes Tacaribe resistentes a fármacos generados con ST-336 (DR#l-4) y todos los mutantes provocaron una resistencia cruzada con ST-294, lo que sugiere que este compuesto se está dirigiendo a la misma área de GP2 que ST-336 (datos no mostrados). La actividad de ST-294 contra virus Tacaribe, Machupo, Guanarito, y Junin, fue similar a la observada con ST-336 (tabla 3). El CC5o de ST-294 en células Vero es >50 µ? que produce un índice selectivo de >416. La caracterización adicional de ST-294 mostró que este compuesto es soluble hasta 23 µ? en un medio que contiene suero de cabra fetal al 10% y hasta 480 µ? en un amortiguador con un pH de 7.4 (tabla 3). La estabilidad metabólica de ST-294 fue probada en extractos de hígado S9 de rata, ratón, humano, y cerdos de guinea y se encontró como el más estable en S9 humanos seguido de ratón, rata y cerdos de guinea, respectivamente (tabla 3). El análisis de las farmacocinéticas orales de ST-294 se llevó a cabo inicialmente ya que esta especie está bien caracterizada mediante este tipo de estudio. Las ratas fueron dosificadas con ST-294 mediante gavaje oral, y se tomaron muestras en un período de 24 horas. Los niveles de suero fueron muy altos (Cmax = 6670 ng/ml) y ST-294 tuvo una buena biodisponibilidad oral (68.2%) (tabla 3).
Tabla 3: Caracterización de ST-294 Virus (ensayo) ST-294 Tacaribe (CPE) EC50 0.120 µ? (Reducción de placa) EC50 0.100 µ? Machupo (Reducción de placa) EC50 0.300 µ? Guanarito (Reducción de placa) EC50 1.0 µ Junin (Reducción de placa) EC50 0.300 µ?? Propiedades Solubilidad (0%, 2%, 10% PBS) 18, 21 y 23 u Solubilidad (p/on, pH 7.4) 480 µ Estabilidad (S9) rata/ratón/humano/cg 26/74/100/23 minutos Genotoxicidad (prueba Ames) Negativo PK (rata/oral) ½ vida 2 horas Biodisponibilidad (F) 68.2% PK (ratón recién nacido/IP) ½ vida 3 horas Cmax 2910 ng/ml Estudio de Eficacia con ST-294 en un Modelo de Ratón Recién Nacido ST-294 tiene potente actividad antiviral contra NWA y buenas propiedades tipo fármaco, de modo que el siguiente paso fue probar la capacidad de ST-294 para inhibir enfermedad inducida por NWA en un modelo animal. Para los agentes de Categoría A, los experimentos requieren contención BSL 4. Sin embargo, en un esfuerzo para obtener una lectura inicial, se estableció un modelo de estímulo de virus Tacaribe en ratones recién nacidos. En la preparación de este estudio, se llevaron a cabo experimentos PK y de tolerabilidad con ST-294 en ratones recién nacidos antes de llevar a cabo una prueba de eficacia. Se dosificaron IP ratones BALB/c recién nacido (4 días de edad) con 10 mg/kg de ST-294 y se recolectaron muestras de sangre para análisis. En forma relativa a las concentraciones antivirales in vitro para inhibir el virus Tacaribe CPE (EC50 = 66 ng/ml), las concentraciones en plasma promedio en ratones recién nacidos estuvieron bien arriba de este nivel durante períodos de tiempo prolongados (>15x en 8 h y 6x en 24h después de la dosificación, datos no mostrados). En este modelo el fármaco se suministra a través de de la ruta IP debido a la dificultad de llevar a cabo múltiples gavajes orales en ratones recién nacidos. Para probar la tolerabilidad, a ratones recién nacidos se les administraron dosificaciones IP que fluctúan de 0-100 mg/kg/día de ST-294 durante 5 días. Las dosificaciones de 100 mg/kg/día durante 5 días fueron bien toleradas por los ratones recién nacidos, ya que no hubieron signos clínicos de toxicidad y los ratones ganaron peso en el mismo rango que los ratones de control (datos no mostrados). Esta concentración probada más alta de ST-294 de 100 mg/kg/día se utilizó en un estudio de eficacia de animal Tacaribe.
Los niveles de fármaco y la vida media mostrada en el estudio PK en los ratones recién nacidos, no fueron equivalentes a los observados en ratas, sino los niveles de suero parecieron suficientes para llevar a cabo un estudio en animales que prueba el concepto en el modelo animal Tacaribe. Se estimularon ratones de cuatro días de edad con 30 X LD50 de virus Tacaribe y se trataron con placebo, ribavirina como un control o ST-294. Tal como lo demuestran los resultados de la figura 6, ST-294 mostró eficacia en los ratones recién nacidos infectados con Tacaribe tanto con supervivencia como retardo en muertes similares al control de fármaco (ribavirina). Tomados juntos estos datos sugieren que ST-294 es un candidato de fármaco prometedor y adecuado para avanzar en estudios animales definitivos en donde cerdo de guinea y primates serán estimulados con NWA auténtico (virus Junin y Guanarito) y tratados en varios momentos posteriores a la infección y en forma profiláctica con ST-294.
Descripción A través de un HTS exitoso y un programa de química medicinal, se ha identificado un candidato de fármaco antiviral NWA, ST-294. Este fármaco inhibe en forma potencial y selectiva los virus NWA \n vitro incluyendo los virus Categoría A 3 NIAID/CDC (virus Junin, Machupo, y Guanarito). Este compuesto también fue evaluado para estabilidad en extractos de hígado S9 y para sus propiedades farmacocinéticas y se descubrió como metabólicamente estable y oralmente biodisponible. En un estudio de eficacia animal preliminar, ST- 294 mostró una protección significativa contra enfermedad inducida por virus Tacaribe en ratones recién nacidos. A través el mecanismo de los estudios de acción, se puede apreciar que esta serie de compuestos tiene su objetivo en GP2, y son inhibidores de entrada virales.
A partir de la diálisis y experimentos de dilución (figura 3), se puede apreciar que el fármaco enlaza al virus y es llevado durante las diluciones. Este fenómeno puede tener potencialmente un efecto cuando se titulan muestras de virus durante los experimentos. Sin embargo, en el experimento de tiempo de adición, no hubo un suficiente transporte de fármaco debido a la alta dilución, para que se pudieran afectar los tituladores cuando se agregan 1 hora o más después de la infección (figura 2).
Ya que ST-294 tiene una mejor estabilidad S9 que ST-336, se considera que el metabolismo ocurre en el grupo de metilo en el anillo aromático (figura 1). La posición bencílica es susceptible a oxidación. Cuando no existe hidrógeno bencílico presente como en ST-294 (figura 2), la oxidación se bloquea y de esta forma elimina la trayectoria de metabolismo más rápida. La adición del grupo de difluorometoxi en ST-294 proporcionó esta estabilidad S9 incrementada por el compuesto, aunque no redujo la actividad antiviral.
En el modelo de ratón recién nacido Tacaribe, los ratones parecieron morir de una enfermedad neurológico (indicada por parálisis en el cuarto trasero) y no se sabe si ST-294 puede cruzar la barrera de sangre cerebro. Asimismo los niveles de fármaco y vida media de este candidato de fármaco proporcionado IP en ratones recién nacidos, no es tan bueno como la dosificación oral en ratas, ya que los niveles de suero y el compuesto que llega al cerebro pueden haber comprometido la capacidad de obtener la protección completa en este modelo. Los modelos animales más adecuados para fiebre hemorrágica originada por arenaviruses, son cerdos de guinea y primates no humanos, en donde el virus se replica predominantemente en el bazo, nodos linfáticos y médula ósea originando diátesis hemorrágica. Los modelos de cerdo de guinea están bien establecidos para enfermedades de virus Junin, Machupo, y Guanarito, y representan el mejor modelo de animales pequeños para evaluación durante estudios preclínicos 26, 34. Los cerdos de guinea infectados con cepa patógenas de virus Junin, desarrollan una enfermedad fatal semejante a AHF humano37.
Existen muchos reportes del desempeño del dominio de transmembrana en la función de proteínas de fusión viral. En el caso de hemaglutinina de virus de influenza, queda claro que se requiere de un ancla de transmembrana para la actividad de fusión total27. En contraste, los requerimientos de secuencia específicos dentro de un dominio de transmembrana, han sido identificados, por ejemplo, en virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1, virus de leucemia de múrido, virus espumosos, coronavirus, virus de enfermedad de Newcastle y virus de sarampión27. Con base en las variantes resistentes a fármacos generados durante estos estudios, la clase de compuestos ST-336, se dirige a la proteína de envoltura GP2, con mutaciones que provocan una susceptibilidad reducida al surgimiento del fármaco en o alrededor de la región de transmembrana (figura 4).
Los fármacos que dirigen las interacciones entre la envoltura del virus y el receptor celular representan una nueva clase de fármacos antivirales. Para terapia VIH, los inhibidores de entrada han tenido recientemente un mayor interés debido a la actividad contra virus resistentes a fármaco múltiples. Un antiviral nuevo contra VIH fue aprobado recientemente por la FDA, llamado enfuvirtida. Enfuvirtida (Fuzeon®) es un inhibidor de fusión de proteína que bloquea la formación del manojo de seis hélices y de esta forma evita la fusión de la membrana29. La enfuvirtida ha sido exitosa en mejorar la respuesta virológica e inmunológica en pacientes infectados por VIG que experimentan un tratamiento VIH33. Existen otros diversos compuestos que encuentran la entrada del VIH que están en diferentes etapas de desarrollo, entre ellos: 1) el inhibidor de adhesión dextrin-2-sulfato; 2) los inhibidores de glucoproteína (gp) interacción 120/CD4 PRO 542, TNX 355 y BMS 488043; y 3) los inhibidores de co-receptor subdivididos en los que se dirigen a CCR5 o CXCR420. El éxito de enfuvirtida y otros en la trayectoria de desarrollo, prueban que los inhibidores de entrada de virus pueden utilizarse para tratar enfermedades virales en humanos.
ST-294 también tiene un potencial de utilizarse en forma profiláctica, ya que este fármaco parece enlazar al virus (figura 3) y puede prevenir la infección. Otros inhibidores de entrada de virus han demostrado protección, cuando se proporcionan en forma profiláctica22. Los resultados presentados en la presente invención, muestran que ST-294 es un inhibidor específico potente de Nuevo Mundo incluyendo los virus de fiebre hemorrágica Categoría A (Junin, Machupo, y Guanarito). De manera más importante, el objetivo de ST-294 (entrada de virus en las células) sirve como un objetivo viable para el desarrollo antiviral. Ya que la infección del virus puede ser inhibida completamente en concentraciones en el rango nanomolar, el objetivo de ST-294 puede parecer tanto accesible como extremadamente sensible a reactivos que interrumpen su desempeño en el proceso de infección.
ENSAYO 3 Ensayo de Efecto citopático ("CPE") Se utilizó un ensayo CPE viral para evaluar el efecto antiviral de los Ejemplos 100 a 113 contra el virus Tacaribe (células Vero), virus de vacuna Candid-1 (células Vero), virus Amapari (células Vero), SARS-CoV (células Vero), HSV-1 (células Vero), RSV (HEp-2 células), virus de vaccinia (células Vero), y Rotavirus (MA1 04). Se utilizó un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas ("ELISA") para evaluar el efecto antiviral de los compuestos contra CMV (MRC-5 células) y LCMV (células Vero). Todos estos ensayos se llevaron a cabo en el medio adecuado que contiene FBS desactivado por calor al 2%. Se sembraron placas de cultivo celular de noventa y seis depósitos 24 horas antes de utilizarse con 7 x 104 (Vero), 2.2 x 104 (HEp-2 y MA104), y 4.5 x 104 (MRC-5) células por depósito. Para probar la susceptibilidad del compuesto. Se agregaron compuestos (solubilizados con 100% de DMSO) para duplicar los depósitos en concentraciones finales de 50, 15.8, 5, 1.6, 0.5, 0.16, 0.05, 0.016 y 0 µ?. La concentración final de DMSO en los ensayos fue de 0.5%. Las reservas de virus se titularon en un experimento separado para determinar la concentración que dio como resultado la destrucción al 90% de la monocapa celular (ensayo CPE) después de 3 días (HSV-1, Rotavirus y vaccinia) o 7 días (SARS-CoV, RSV, virus Tacaribe, virus de vacuna Candid 1 y virus Amapari) o la concentración que generó una señal ELISA de 2.5 en una densidad óptica de 650 nm (OD50) después de 3 días (LCMV) o 4 días (CMV). Estas diluciones pre-establecidas del virus se agregaron a depósitos que contienen diluciones en serie del compuesto. Las células no infectadas de células que reciben virus sin compuesto, se incluyeron en cada placa de ensayo. Además, los agentes de referencia, cuando están disponibles se incluyeron en cada placa de ensayo (ganciclovir para HSV-1 y CMV, Sigma #G2536; ribavirina para LCMV y RSV, Sigma #R9644; y rifampicina para virus vaccinia, Sigma #R3501 ). Se incubaron placas a una temperatura de 37°C y 5% C02 durante 3 días (virus HSV-1, Rotavirus, LCMV, Vaccinia) o 7 días (virus Tacaribe, virus Amapari, virus Candid 1, SARS-CoV, RSV, y CMV). Se procesaron placas infectadas con HSV-1, SARS-CoV, Rotavirus, virus Vaccinia, virus RSV, virus Tacaribe, virus Amapari, virus de vacuna Candid 1 para manchado con violeta cristal, mientras que las placas infectadas con CMV y LCMV fueron procesadas para análisis ELISA. Para el manchado de violeta cristal, las placas se fijaron con 5% de glutaraldehído y se mancharon con 0.1% de violeta cristal. Después de enjuagar y secarse, se midió la densidad óptica en 570 nm (OD570) utilizando un lector de Microplaca Reader. Para el análisis ELISA, se eliminó el medio de las placas infectadas con LCMV y CMV y las células se fijaron con metanol al 100% metanol (Fisher, CAS #67-56-1, grado HPLC) durante 20 minutos a temperatura ambiente. La solución de metanol se eliminó y las placas se lavaron 3 veces con PBS. Los sitios de enlace no específicos se bloquearon a través de la adición de 130 µ? de Amortiguador de Bloqueo Superblock (Pierce #37515) durante 1 hora a una temperatura de 37°C. El agente de bloqueo fue eliminado y los depósitos se lavaron 3 veces con PBS. Se agregaron treinta µ de una dilución 1:20 de anticuerpo monoclonal específico de Proteína Nuclear LCMV (NP) obsequio generoso de Juan Carlos de la Torre, The Scripps Research Institute, La Jolla CA) ó 30 µ? de una dilución 1:200 de anticuerpos monoclonales de cóctel específicos de CMV (proteína 52 y producto único de gen largo 44) (Dako, #M0854) en un Amortiguador de Bloqueo de Superblock que contiene 0.1% de Tween-20. Después de incubación durante 1 hora a una temperatura de 37°C, se eliminó la solución de anticuerpo primaria y los depósitos se lavaron tres veces con PBS que contiene 0.1% Tween-20. Se agregaron cuarenta µ? de anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano de anti-ratón (Bio-Rad #172-1011) diluido 1:4000 (LCMV) ó 1:400 (CMV) en Amortiguador de Bloqueo Superblock que contiene 0.1 % de Tween-20 a los depósitos y las placas se incubaron durante 1 hora a una temperatura de 37°C. La solución de anticuerpo secundaria se eliminó y los depósitos se lavaron 5 veces con PBS. El ensayo se desarrolló durante 15 minutos mediante la adición de 130 µ? de substrato de 3,3', 5,5-tetrametilbencidina (Sigma #T0440) para cuantificar la actividad de peroxidasa. El OD6so del producto de reacción resultante se midió utilizando un Lector de Microplaca Cinética de Molecular Devices con un filtro 650 nm.
Se evaluó la actividad antiviral contra el virus Tacaribe a través de tres métodos: Ensayo CPE, Reducción de Placa y Ensayo de Inhibición de Rendimiento de Virus. Para el ensayo HTS CPE, se revistieron células Vero en una confluencia al 80% en placas de 96 depósitos. Los compuestos de prueba (80 por placa) de la biblioteca, fueron agregados a depósitos en una concentración final de 5 µ . Posteriormente se agregó el virus Tacaribe en una dilución de virus que puede dar como resultado el 90% CPE después de 7 días (multiplicidad de infección ("MOI") aproximadamente 0.001). Las placas se incubaron a una temperatura de 37°C y 5% C02 durante 7 días, posteriormente se fijaron en glutaraldehído al 5% y se mancharon con 0.1% de violeta cristal. La extensión del virus CPE se cuantificó en forma espectrométrica en OD570 utilizando un Lector de Microplaca Envision. Se calculó la actividad inhibidora de cada compuesto substrayendo del OD5 0 del compuesto de prueba del OD570 promedio de los depósitos de célula infectada con virus, posteriormente dividiendo entre el OD570 promedio de los depósitos de célula infectada con mock. El resultado representa el porcentaje de protección contra la actividad CPE del virus Tacaribe conferida por cada compuesto. Los valores de concentración de inhibición del 50% (EC50) fueron determinados a partir de un trazo de la actividad inhibidora del compuesto después de in ensayo CPE a través de ocho concentraciones del compuesto (50, 15, 5, 1.5, 0.5, 0.15, 0.05 y 0.015 µ?). Se llevaron a cabo por duplicado determinaciones AU.
En el Ensayo de Reducción de Placa, se infectaron monocapas de célula Vero crecidas en placas de 6 depósitos, con aproximadamente 50 PFU/depósito en la ausencia o presencia de diversas concentraciones de los compuestos. Después de una hora de absorción del virus a una temperatura de 37°C y 5% C02, se reemplazó el inoculo residual en una mezcla 50:50 de agarosa de placa marina al 1% (en agua desionizada) y 2x MEM. Las placas se contaron después de 5 a 7 días de incubación a una temperatura de 37°C. El EC50 fue calculado como la concentración del compuesto requerida para reducir los números de placa de virus en un 50%. Bajo condiciones BSL 4 en USAMRIID, los ensayos de reducción de placa (con virus Lassa, achupo, Guanarito, y Junin) se llevaron a cabo como se indica a continuación: 200 PFU de cada virus fue utilizado para infectar células Vero. Después de la absorción del virus, las monocapas celulares se enjuagaron y cubrieron con un medio completo que contiene agarosa al 1%, y ya sea sin compuesto de prueba o con diferentes concentraciones que fluctúan de 15 µ? a 0.05 µ?. Después de 5 días de incubación a una temperatura de 37°C 5% C02l, las monocapas se mancharon con rojo neutral y se contaron los números de placas.
En Ensayos de Reducción de Rendimiento de Virus, se infectaron células Vero crecidas en placas de 24 depósitos con virus Tacaribe en una multiplicidad de infección ("MOI") de 0.01 en la presencia de diferentes concentraciones de los compuestos, dos depósitos por concentración. Después de 48 horas de incubación en 37°C, el virus se recolectó y se determinaron los rendimientos del virus mediante formación de placa en células Vero. Los valores EC50 se calcularon como se indicó anteriormente y se llevaron a cabo cálculos similares para determinar el EC90 y EC99.
Ensayo de Citotoxicidad Se midió la viabilidad celular a través de un ensayo de proliferación celular para determinar el efecto de un compuesto en funciones celulares, de modo que se pueda calcular una concentración de citotoxicidad del 50% (CC5o); la proporción de este valor al EC50 es referida como el índice selectivo (S.l. = CC50/EC50). Se utilizaron tres tipos de ensayos para determinar la citotoxicidad. Uno fue un método colorimétrico que mide la reducción de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio (MTT), uno utiliza fluorimetría para medir la reducción de resazurina (Alamar Blue) y el método final utiliza medidas de densidad óptica de violeta cristal. Los tres métodos produjeron datos similares. Los cultivos confluentes en placas de 96 depósitos fueron expuestos a diferentes concentraciones de los compuestos, con dos depósitos por cada concentración, utilizando condiciones de incubación equivalentes a las utilizadas en los ensayos antivirales. Para manchado de violeta cristal, las placas se fijaron con glutaraldehído al 5% y se mancharon con violeta cristal al 0.1%. Después del enjuague y secado, se midió la densidad óptica en 570 nm (OD57o) utilizando un lector de microplaca Envision.
ENSAYO 4 Ensayo de Antivirus Pseudotipificado Se utilizaron pseudotipos virales para demostrar que el objetivo viral de ST-336, descrito anteriormente, es la glucoproteína de envoltura de arenavirus. Esto es un ensayo substituto que utiliza únicamente la proteína de envoltura del virus objetivo, no el propio virus. Los pseudotipos virales se generan mediante co-transfección de un provirus retroviral con defecto de réplica que contiene un gen reportero, y un plásmido que expresa una envoltura viral heteróloga. El provirus es construido de modo que la envoltura retroviral homologa no se expresa, y por lo tanto las proteínas de envoltura viral heterólogas son adquiridas como partículas virales de brote que capturan en forma no específica las proteínas de la superficiess celular. Los pseudotipos preparados en esta forma, infectarán células a través de la envoltura heterologa y se utilizan comúnmente para ensayar funciones de la envoltura heterologa 4°-45. La infección se mide mediante la señal producida a partir de la construcción reportera integrada. Se utilizó un provirus VIH con def iciencia-env con un reportero de luciferasa de luciérnaga para el trabajo que aquí se describe. La cantidad de virus infecciosa utilizado para infectar una línea de cultivo celular es directamente proporcional, con respecto en varios órdenes de magnitud, a la luminiscencia transmitida por luciferasa producida en células infectadas. Los viruses pseudotipificados que contienen envolturas virales no relacionadas, normalmente la proteína VSVg del virus de estomatitis vesicular, se utilizan como controles de especificidad.
Otro uso de pseudotipos virales es que permiten el análisis funcional de una envoltura fuera del contexto del virus del cual se derivó. Muchos virus de fiebre hemorrágica requieren una contención de laboratorio máxima (BSL-4); lo cual imparte aspectos logísticos y de seguridad significativos. Los ensayos sustitutos pueden llevarse a cabo bajo condiciones de laboratorio BSL-2 menos restrictivas, ya que no utilizan el propio patógeno. Esta estrategia fue utilizada para revisar la eficacia antiviral contra arenavirus de fiebre hemorrágica que normalmente requieren contención en laboratorio máxima, tal como los virus Machupo y Guanarito.
La infección del virus de pseudotipo se ensayó en células de cultivo celular, normalmente 293T (riñon embriónico humano) o MRC-5 (pulmón humano). Las células se sembraron en placas de 96 depósitos de modo que son un tanto subconfluentes al siguiente día. Con el objeto de probar las propiedades inhibidoras de un compuesto determinado, se prepararon diluciones del compuesto en serie en DMSO. Cada una de estas diluciones se diluyó posteriormente 100 veces en un medio de cultivo celular. El medio de cultivo celular se reemplaza con las diluciones del compuesto en el medio, y posteriormente subsecuentemente se agrega un volumen igual de reserva de virus de pseudotipo. El virus de pseudotipo se diluye en el medio de cultivo celular de modo que la cantidad de virus agregada a cada depósito, sea suficiente para producir una señal de luciferasa que proporcione una proporción de señal a ruido de 20 a 50. La actividad de luciferasa se mide 2 a 3 días posteriores a la infección utilizando método de detección de bioluminiscencia a base de luciferina estándar, tal como el Sistema de Ensayo de Luciferasa de Promega. Cada dilución el compuesto se prueba en depósitos por triplicado, y se convierte la actividad de luciferasa a un porcentaje de inefectividad con base en controles positivos (sin compuesto) y negativos (sin virus) en la misma placa. Se calcularon concentraciones efectivas del cincuenta por ciento (EC50S) son el software IDBS XLfit4.1 de Microsoft Excel, utilizando un modelo logístico de cuatro parámetros adaptado a y = A + B/(1 + (x/C)AD), en donde A (del fondo) y B (superior) se fijan en 0 y 100% respectivamente, C = EC50, D = factor dependiente, x = concentración de compuesto, y y = respuesta.
Tolas referencias mencionadas en la presente invención, están incorporadas en su totalidad a la misma como referencia para todos los propósitos.

Claims (32)

REIVINDICACIONES
1. Un método para el tratamiento o profilaxis de una infección viral o enfermedad asociada con la misma, en donde el método comprende administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva a un mamífero que necesita del mismo, un compuesto de la fórmula II que se encuentra a continuación: Fórmula II en donde n es un entero de 0 a 6; m es un entero de 0 a 1; R es seleccionado del grupo que consiste en H y alquilo; R2 es seleccionado del grupo que consiste en fenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, alquilo ramificado sustituido o no sustituido, y cicloheteroalquilos insaturados sustituido o no sustituido; o en donde Ri y R2 se combinan juntos para formar un heteroalquilo saturado cíclico de C4.i0 sustituido o no sustituido; R3 y 4 son seleccionados independientemente del grupo que consiste en H y alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Un método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque n es 0, 1, ó 2.
3. Un método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque n es 1.
4. Un método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque m es 1.
5. Un método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque m es 1 y n es 1.
6. Un método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de la fórmula II se selecciona del grupo que consiste en: 2-[2,5-bis(2,2,2-trifluoroetoxi)benzoil]-N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 - bis(trifluorometil)propil]-2-(4-ter-butilbenzoil)hidrazinacarboxamida; 2-(1 ,1 '-bifenil-4-ilcarbonil)-N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida¡ N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-1-(1-naftoil)hidrazinacarboxamida; 2-(1 ,1 '-bifenil-2-ilcarbonil)-N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 - bis(trifluorometil)propil]-2-(4-metilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propil]-2-(2- naftoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1-bis(trifluorometil)propil]-2-(2,5-dimetoxibenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 ,1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(3,4-diclorobenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(4-bromobenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(4-isopropilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(3,5-dimetilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1,1-bis(trifluorometol)propil]-2(mesitilcarbonil)hidrazinacarboxamida; y N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-2-(5-cloro-2-metoxibenzoil)hidrazinacarboxamida.
7. Un método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de la fórmula II es N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-2-(4-metilbenzoil)hidrazinacarboxamida.
8. Un método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de la fórmula II es N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-2-(2,5-dimetoxibenzoil)hidrazinacarboxamida.
9. Un método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el mamífero es un humano.
10. Un método tal como se describe en la reivindicación I, caracterizado porque la infección viral es un virus de fiebre hemorrágica .
11. Un método tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque el virus de fiebre hemorrágica es un Arenavirus.
12. Un método tal como se describe en la reivindicación II, caracterizado porque el Arenavirus se selecciona del grupo que consiste en Tacaribe, Guanarito, Machupo, Pichinde, y VSV.
13. Un método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además administrar en conjunto cidofovir, cidofovir cíclico, o sales, ésteres o profármacos de los mismos.
14. Un método para el tratamiento o profilaxis de una infección viral o enfermedad asociada con la misma, caracterizado porque comprende administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva a un mamífero que necesita del mismo, un compuesto de la fórmula I que se encuentra a continuación: en donde n es un entero de 0 a 6; m es un entero de 0 a 1; p es un entero de 0 a 1 ; R-i se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo; R2 es seleccionado del grupo que consiste en fenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, alquilo ramificado sustituido o no sustituido, y cicloheteroalquilos insaturados sustituido o no sustituido; o en donde R-¡ y R2 se combinan juntos para formar un heteroalquilo saturado cíclico de C4-10 sustituido o no sustituido; R3 es seleccionado del grupo que consiste en H y alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y comprende además administrar en conjunto una combinación de cidofovir, cidofovir cíclico o sales, ésteres o profármacos de los mismos.
15. Una composición farmacéutica que comprende un transportador farmacéuticamente aceptable y una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula II: Fórmula II en donde n es un entero de 0 a 6; m es un entero de 0 a 1 ; Ri es seleccionado del grupo que consiste en H y alquilo; R2 es seleccionado del grupo que consiste en fenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, alquilo ramificado sustituido o no sustituido, y cicloheteroalquilos insaturados sustituido o no sustituido; o en donde R-\ y R2 se combinan juntos para formar un heteroalquilo saturado cíclico de C4-i0 sustituido o no sustituido; R3 y R4 son seleccionados independientemente del grupo que consiste en H y alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
16. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque n es 0, 1, ó 2.
17. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque n es 1.
18. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque m es 1.
19. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque m es 1 y n es 1.
20. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque el compuesto de la fórmula II se selecciona del grupo que consiste en: 2-[2,5-bis(2,2,2-trifluoroetoxi)benzoil]-N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida; N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-2-(4-ter-butilbenzoil)hidrazinacarboxamida; 2-(1 ,1 '-bifenil-4-ilcarbonil)-N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida; N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-1-(1-naftoil)hidrazinacarboxamida; 2-(1 ,1 '-bifenil-2-ilcarbonil)-N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida; N-[1 ,1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(4-metilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 ,1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(2-naftoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1-bis(trifluorometil)propil]-2-(2,5-dimetoxibenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 ,1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(3,4-diclorobenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , - bis(trifluorometil)propil]-2-(4-bromobenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(4-isopropilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(3,5-dimetilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1,1-bis(trifluorometol)propil]-2(mesitilcarbonil)hidrazinacarboxamida; y N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-2-(5-cloro-2-metoxibenzoil)hidrazinacarboxamida.
21. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque el compuesto de la fórmula II es N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(4-metilbenzoil)hidrazinacarboxamida.
22. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque el compuesto de la fórmula es N-[1 ,1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(2,5-dimetoxibenzoil)hidrazinacarboxamida.
23. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque comprende además cidofovir, cidofovir cíclico, o sales, ésteres o profármacos del mismo.
24. Una composición farmacéutica que comprende un transportador farmacéuticamente aceptable y una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula I: en donde n es un entero de 0 a 6; m es un entero de 0 a 1; p es un entero de 0 a 1; R1 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo; R2 se selecciona del grupo que consiste en fenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, alquilo ramificado sustituido o no sustituido, y cicloheteroalquilos insaturados sustituido o no sustituido; o en donde y R2 se combinan juntos para formar un heteroalquilo saturado cíclico de C4-10 sustituido o no sustituido; R3 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende además cidofovir, cidofovir cíclico, o sales, ásteres o profármacos del mismo.
25. Un compuesto de la fórmula II: Fórmula II en donde n es un entero de 0 a 6; m es un entero de 0 a 1; R-\ se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo; R2 se selecciona del grupo que consiste en fenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, alquilo sustituido o no sustituido, alquilo ramificado sustituido o no sustituido, y cicloheteroalquilos insaturados sustituido o no sustituido; o en donde Ri y R2 se combinan juntos para formar un heteroalquilo saturado cíclico de C4-io sustituido o no sustituido; R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
26. Un compuesto tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque n es 0, 1, ó 2.
27. Un compuesto tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque n es 1.
28. Un compuesto tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque m es .
29. Un compuesto tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque m es 1 y n es 1.
30. Un compuesto tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque el compuesto de la fórmula II se selecciona del grupo que consiste en: 2-[2,5-bis(2,2,2-trifluoroetoxi)benzoil]-N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 - bis(trifluorometil)propil]-2-(4-ter-butilbenzoil)hidrazinacarboxamida; 2-(1 ,1'-bifenil-4-ilcarbonil)-N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida; N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-1-(1-naftoil)hidrazinacarboxamida; 2-(1 ,1 '-bifenil-2-ilcarbonil)-N-[1 ,1-bis(trifluorometil)propil]hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 - bis(trifluorometil)propil]-2-(4-metilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1 , 1 - bis(trifluorometil)propil]-2-(2- naftoil)hidraz¡nacarboxamida; N-[1 ,1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(2,5-dimetoxibenzoil)h¡drazinacarboxam¡da; N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)prop¡l]-2-(3,4-diclorobenzoil)hidrazinacarboxam¡da; N-[1 ,1 - bis(trifluoromet¡l)prop¡l]-2-(4-bromobenzoil)hidrazinacarboxam¡da; N-[1 ,1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(4-isopropilbenzoil)h¡draz¡nacarboxam¡da¡ N-[1 , 1-bis(trifluoromet¡l)propil]-2-(3,5-dimetilbenzoil)hidrazinacarboxamida; N-[1,1-bis(trifluorometol)propil]-2(mesitilcarbon¡l)hidrazinacarboxam¡da; y N-[1,1-bis(trifluorometil)propil]-2-(5-cloro-2-metox¡benzoil)hidrazinacarboxamida.
31. Un compuesto tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque el compuesto de la fórmula II es N-[1 , 1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(4-metilbenzoil)hidrazinacarboxamida.
32. Un compuesto tal como se describe en la reivindicación 25, caracterizado porque el compuesto de la fórmula II es N-[1 ,1 -bis(trifluorometil)propil]-2-(2,5-dimetoxibenzoil)hidrazinacarboxamida.
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