JP2010525356A - 検定デバイスおよび方法、並びに前記検定デバイスおよび方法に用いる構成要素。 - Google Patents

Abstract

ハプテンの検定に適したディップスティックおよび他の検定デバイスが開示される。また、そのようなデバイスで使用される遮断薬が開示される。

Description

本発明は、検定デバイス、ハプテンを検定する方法、並びにそのようなデバイスおよび方法に有用な構成要素に関する。より具体的には、本発明は、任意でディップスティックの形態にある浸透性材料を用いる検定デバイス、ハプテンの定質的または定量的測定においてそのようなデバイスを使用する方法、およびそのようなデバイスおよび方法に有用な化学物質に関する。

ハプテンの検定において遭遇する一般的な問題は、標準的な競合検定はハプテンを含有する疑いがある試料中におけるハプテンの量に反比例した信号を生成するということである。したがって、被分析物を含まない試料を試験する場合には強い信号が生成されるが、有意量のハプテンを含有する試料を試験する場合には弱い信号が生成される。これは、現地条件（例えば戸外において）において、また実験室条件下においてさえ、そのような試験を用いることが困難にし得る。また、そのような試験は、検定の結果を確認することができるように、展開するために長時間を要し得る対照線を含む必要がある。この問題に対する解決策は、特許文献１にまず示唆されている。前記文献では、正の読取値が得られる（つまり、試料中のハプテンの量が多いほど、より大きな信号が生成される）ように、その系において付加的な抗体を使用することが提案されている。

特許文献１に記載されたシステムは潜在的に大幅な改善を提示したが、あいにく商業化されていない。これは、一つには、想定される各被分析物について、系中の一次抗体に対して特異的な抗体を調製する必要があることに起因する相当な困難に因るものであった。また、特許文献１の実施形態によって一般に経験される背景は、結果を商業用途において望ましいとはいえなくする傾向にあった。更に、側方流動検定の実施例（例えばディップスティックなど）が、特許文献１の系を用いて作用することは示されていない。

特許文献２および３には、被分析物によって占められていない結合部位の数の測定をもたらす検定を生じる方法が記載されている。

米国特許第５，６４１，６９０号 国際特許出願公開公報第ＷＯ９５／０４２３１号 国際特許出願公開公報第ＷＯ９２／１９９７３号

従って、被験試料中のハプテンの濃度が増大するにつれて、信号が増大するハプテン用検定、特に、信号生成系の一部として各被分析物に対して新規の特異的抗体を生成する必要なく製造することができ、好ましくは、ディップスティックのような側方流動検定(lateral flow assとして形式を定められ得るものを提供する継続的な要求がある。そこで、
そのような検定が見出され、該検定を行なうためのデバイスおよび検定に用いるための構成要素も同様に見出された。

本発明は、水性液体が浸透性材料の第１部分と接触させられると、その水性液体は浸透
性材料の第２部分に浸透するような浸透性材料を備える検定デバイスを提供する。前記浸透性材料は、第１区域および第２区域を有し、第１区域および第２区域は、水性液体が浸透性材料の第１部分と接触させられると、その水性液体はまず第１区域を通過し、該液体が浸透性材料の第２部分に浸透するにつれて、次に第２区域内に移行するように配置されている。
前記第１区域はハプテンに対する抗体で標識された信号生成手段を含有している。
前記第１区域はまた前記ハプテンに対する抗体のための結合物質も含有する。
前記第２区域は、抗体によって標識された信号生成手段上に存在する、ハプテンに結合した抗体には結合するが、前記信号生成手段上に存在する、前記ハプテンに対する抗体のための結合物質に結合した抗体には結合しないような、前記ハプテン(hapen)に対する抗体
のための配置手段を含有する。
前記信号生成手段は、前記配置手段への結合について、信号が生成されるようなものである。前記デバイスにおいて、
（ａ）配置手段はハプテンに対する抗体に特異的な結合剤ではなく、かつ／または、
（ｂ）配置手段は、ハプテンに対する抗体のＦｃ領域に対する抗体であり、かつ／または、
（ｃ）ハプテンに対する抗体のための結合物質はハプテンおよび／またはハプテン類似体を含まず、かつ／または、
（ｄ）前記結合物質は、２０００を上回る分子量の合成親水性分子に共有結合したハプテンまたは構造が近い類似体(close structural analogue)であり、かつ／または、
（ｅ）前記結合物質は２つのハプテンまたは構造が近い類似体を有する。

そのようなデバイスは、ハプテンを含む疑いがある試料中にハプテンが存在するかを判定するために使用され、また、存在するハプテンの量の定性的測定を提供するために適合され得る。

前記検定デバイスは、好ましくはディップスティックの形態にあり、例えば、第１区域はディップスティックの一端に向かって位置し、第２区域はディップスティックのもう一端に向かって位置する。

浸透性材料は、水性液体、例えば水、尿、唾液、血液または血漿の浸透を可能にするいかなる材料であってもよい。そのような材料は、例えば、濾紙のように目に見えて繊維状であってもよいし、または目に見えて非繊維状、例えばセルロース膜であってもよい。前記検定デバイスに使用される浸透性膜は、当業者にはよく知られている。

信号生成手段は、濃度に対して視覚化されるいかなるものであってもよい。適切な信号生成手段は、微粒子、例えばポリマーまたは金属の微粒子を含む。好ましい信号生成手段は、着色されたラテックスおよび金の微粒子であり、そのうち現在のところ金が最も好ましい。側方流動デバイスのような検定デバイスにおいて金のゾルを使用することは、当業者にはよく知られている。

ハプテンに対する抗体は、任意の適当な方法で、例えば金の微粒子に抗体を付着させるために当業者によく理解されているように、信号生成手段に付着させてもよい。
ハプテンに対する抗体は、モノクローナル抗体であっても、またはポリクローナル抗体であってもよい。驚いたことに、ポリクローナル抗体は、本発明のデバイスに特に有効であり、それらの入手しやすさのために、本発明にさらなる利点を提供することが分かった。

これは本発明を実行する非常に簡略化された方法を提示するので、配置手段は、好ましくは、ハプテンに対する抗体に対して特異的な抗体でない。配置手段は、好都合には、ハ
プテンに対する抗体のＦｃ領域に対する抗体である。好ましくは、配置手段は抗ＩｇＧ抗体である。これはモノクローナル抗体であっても、またはポリクローナル抗体であってもよいが、ポリクローナル(polyconal)抗体であることが特に好ましい。

ハプテンに対する抗体に対する結合物質は、ハプテンに対する抗体について、ハプテンと競合することができる任意のものである。一般に、それは、結合物質がハプテンに対する抗体に結合されるときに、結合物質が配置手段に結合するのを防止する分子に共有結合されたハプテンまたは構造が近いハプテン類似体である。適切には、前記ハプテンまたは構造が近い類似体が共有結合される分子は、例えば５０００ダルトン以上の分子量を有する巨大分子である。適当な巨大分子としては、ペプチド、特にタンパク質、炭水化物および合成分子、例えばポリマーが挙げられる。好都合には、前記巨大分子は親水性であり、例えば、ポリエチレングリコールまたは末端アミノ基を有する変性ポリエチレングリコールである。好ましくは、結合手段は、徹底的な透析によって、ハプテンまたはハプテン類似体を含まなくされているであろう。最も適切には、結合手段は、２つ以上、好ましくは２つのハプテンまたは構造が近い類似体を有する。

配置手段は、好都合には、ハプテンに対する抗体に特異的な抗体ではない。配置手段は、適切には、特にハプテンに対する抗体のＦｃ領域に対して、非特異的な抗体である。好ましくは、配置手段は抗ＩｇＧ抗体である。配置手段は、モノクローナルであってもよいが、好ましくはポリクローナルである。

浸透性材料は、該材料を介したハプテンまたは結合剤が結合された信号生成手段の第２区域への移動を可能にするいかなるものであってもよい。そのような材料としては、濾紙のような紙およびセルロース膜、特にニトロセルロース膜が挙げられる。多くの場合、該デバイスは２種以上の浸透性材料から構成されてもよい。したがって、例えば、紙がセルロース膜に接合されていてもよい。そのような配置において、第１区域は紙上に位置し、第２区域はニトロセルロース膜上に位置し得る。

使用において、前記検定デバイスは、ハプテンを含んでいる疑いがある水性試料がまず第１区域に浸透し、次に第２区域に浸透するように、前記水性試料を浸透性材料の一部に塗布することによって、用いられる。前記試料がハプテンを含んでいる場合には、検出可能な信号が生成される。前記信号の強度は、試料中のハプテンの濃度によって増大する。

前記検定デバイスは、任意の適当な幾何学的形式であってよいが、ディップスティックの形式、つまり幅よりも長いデバイスが好ましい。
所望により、デバイスは、表面から、例えば皮膚からハプテンを検出するために適合されていてもよい。例えば、これを達成する適当な方法は、一般的に特許文献に記載されており、例えば、米国特許第６，５１４，７７３号は適当な方法について参考にされ得る。

本発明の検定デバイスをディップスティックの形で示す図。ディップスティックは、ニトロセルロース（１）の浸透性層と、紙（２）の浸透性層とを有する。紙層には第１区域（３）があり、ニトロセルロース層には第２区域（４）がある。第１区域は、分析されるべきハプテンに対する抗体で標識された金を含浸した線（５）と、前記抗体用結合剤を含浸した線（６）とを含んでいる。第２区域（３）は、分析されるべきハプテンに対する抗体に対して非特異的な抗体を含有する。もしそれが結合剤を結合していれば、非特異的な抗体はハプテンに対する抗体に結合しない。第１区域は、第１区域の下流の部分（７）において試料の添加のために十分な領域をもたせるように配置される。試料添加部分（７）は緩衝剤を含浸している。 紙（８）と、ニトロセルロース（９）と、再びガラス繊維（１０）とのフィルム（８、９および１０）が用いられる本発明の代替検定デバイスを示す図。紙フィルム（８）は、ハプテンに対する抗体で標識された金および結合剤（１３）を含浸した線（１２）から構成される第１区域（１１）を含む。線（１２）はまた、ビオチンで標識された金を含む。中央フィルム（９）は、金の上で標識された抗体に対して非特異的な結合剤の線（１５）と、ビオチンに対する抗体を含有する線（１６）とを含んでいる。前記フィルム（８、９および１０）はマイラー支持材（１６）上に載置されている。

本発明は、水性液体が浸透性材料の第１部分と接触させられると、水性液体は浸透性材料の第２部分に浸透するような浸透性材料を備える検定デバイスを提供する。前記浸透性材料は、第１区域および第２区域を有し、第１区域および第２区域は、水性液体が浸透性材料の第１部分と接触させられると、該水性液体は、まず第１区域を通過し、次に、前記水性液体は、浸透性材料の第２部分に浸透するにつれて、第２区域内に移行するように配置されている。
前記第１区域はハプテンに対する抗体で標識された信号生成手段を含有している。
前記第１区域はまた、前記ハプテンに対する抗体のための結合物質も含有する。
前記第２区域は、抗体によって標識された信号生成手段上に存在する、ハプテンに結合した抗体には結合するが、信号生成手段上に存在する、前記ハプテンに対する抗体のための結合物質に結合した抗体には結合しないような、ハプテン(hapen)に対する前記抗体のた
めの配置手段を含有する。
前記信号生成手段は、前記配置手段への結合において信号が生成されるようなものである。該デバイスにおいて、
（ａ）前記配置手段はハプテンに対する抗体に特異的な結合剤ではなく、かつ／または、（ｂ）前記配置手段は、ハプテンに対する抗体のＦｃ領域に対する抗体であり、かつ／または、
（ｃ）ハプテンに対する抗体のための結合物質はハプテンおよび／またはハプテン類似体を含まず、かつ／または、
（ｄ）前記結合物質は、２０００を上回る分子量の合成親水性分子に共有結合したハプテンまたは構造が近い類似体であり、かつ／または
（ｅ）前記結合物質は２つのハプテンまたは構造が近い類似体を有する。

現在好ましい形態において、該デバイスは配置手段が非特異的な抗体であるデバイスである。
（ｌ） デバイス
該デバイスは、試料が導入される領域と、第１区域と、第２区域との間における側方流動を可能にするいかなる形式にあってもよい。該デバイスの好ましい形態は「ディップスティック」であろう。当業者は、特許文献および一般文献に記載され、多くが少なくとも小規模に商業化されているディップスティックの多くの形態を知っているであろう。本発明の驚くべき特徴はディップスティック自身の物理的構造ではなくディップスティックに添加される試薬に関係するので、そのような既知の形式を本発明に用いてもよい（しかしながら、以下に見られるように、ディップスティックのいくつかの特に好ましい形態は独立して本発明である）。

ディップスティックの好適な形態は、幅よりも長さが長い長尺状細片であろう。そのようなディップスティックは通常、矩形になるであろう。ディップスティックの長さは、一般に１５ｍｍ〜１００ｍｍ、例えば、少なくとも１８、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０または９０ｍｍであり、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０ｍｍ未満になるであろう。ディップスティックに適した幅は、１０〜５０ｍｍ（いくつかの場合においては、より幅広のディップスティックを用いることができるが）であり、例えば、約１２、１３、１５、１７、２０、２２、２５、３０、３５または４５ｍｍに
なるであろう。適切な幅は、リール形態の製品が入手し易いために、２５ｍｍである。一般に、ディップスティックの作用領域（操作には必要とされないが、美しさまたは便宜の理由で存在する付加的な領域ではなく、使用の領域）は、幅よりも約５倍から２０倍長く、例えば、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７または１９倍である。

水または尿のような高度に移動性の水性液体と共に使用するためのディップスティックは、唾液または尿のようなより粘稠な液体と共に使用するためのディップスティックよりも短い傾向にあるであろう。しかしながら、双方と共に使用することができるディップスティックを設計することは可能である。

浸透性材料は、試薬が第１区域から第２区域へ通過することを可能にするいかなるものであってもよい。当業者には、毛管現象によって液体の通過を可能にするような多くの材料が分かっているであろう。多くのそのような材料は自然界のセルロース、例えば濾紙、セルロース膜、ニトロセルロース膜である。他の適当な材料としては、ポリエステル、ガラス繊維、レーヨンナイロン、ポリジビニルフルオリドなどが挙げられる。特に適切な材料はニトロセルロースである。本発明において使用するには、ディップスティックの製造において典型的に用いられる厚さのニトロセルロースフィルムが適切である。

ニトロセルロース膜の現在の選択は、ザルトリウス(Sartorius)によって供給されるユ
ニザルト(UniSart) ＣＮ １４０および他の供給者からの均等な材料である。ワットマ
ン イムノポア(Whatman Immunopore)を使用に検討してもよい。ＣＮは硝酸セルロースを表わし、また１４０は５ｃｍの長さの材料のを上昇する脱イオン水の平均ウィッキング速度に関連する。より速い、およびより遅いウィッキング材料は様々な形態の検定デバイスに利用可能である。本発明のデバイスにおいて、異なるウィッキング速度は検定反応時間に影響を与える。ウィッキング速度は試料の種類の性質に依存して変化するであろう、例えば、水および尿は比較的速いウィッキング速度を用い、血清および唾液は比較的遅いウィッキング速度を用い得る。当業者には、そのような水性液体に対して標準的な市販の材料が用いられてもよいが、ハプテンを含有する疑いがあるすべての水性試料に対しては、多くの場合、中間のウィッキング速度が適していることが分かるであろう。

多くの場合、該デバイスには２種類以上の膜が用いられる。適切には、２つの異なる膜材料、例えば、ガラス繊維およびニトロセルロースが用いられる。そのような形態において、ガラス繊維は、下流側部分、例えば第１区域が位置する部分に用いられ、ニトロセルロース膜は、さらに上流、例えば、第１区域を越えた第２区域を含み得る部分に用いられる。

該デバイスはまた、試料収集部分、例えば、被験試料を収集するように機能する突出した高度に多孔性かつ吸収性の部分を備えてもよい。そのような試料収集手段は、第１区域の下流のデバイス上において端から突出していてもよい。

該デバイスはまた、例えば、すべての検定試料が吸い上げられるまで流れを促進するために、第２区域を越えたところに吸収材料、例えば吸収材料のパッドを備えてもよい。該デバイスが２層を備える場合、吸収材料は適切には前記層と接触するが、前記層との接触は最小限である。吸収性パッドは適切にはセルロース系材料、例えば多孔質紙パッドである。

また、本発明の成形加工部分は、ハプテン分析用デバイスの調製に使用するための、ハプテンに対する抗体に対して非特異的な抗体を含有する区域を有する透過性細片である。そのような細片は、ハプテンに対する抗体で標識された信号生成手段と結合剤とを包含する細片と組み合わせることによって、従って本願に記載するように、異なるハプテンに対
する多数のデバイスの製造に用いられ得る。

（２） 信号生成手段。
該デバイスは、配置手段によって第２区域で固定されるようになるときに信号を生成する任意の信号生成手段を用い得る。当業者は多くのそのような信号生成手段を熟知しているであろう。機械または眼によって読取り可能な手段を用いることが可能である。

側方流動において使用可能であるいかなる信号生成手段を用いてもよいが、眼による直視検出を可能にするものを用いることが好ましい。金のような金属およびラテックスの微粒子のような粒状物質は、当業者によく知られており、本発明のデバイスに用いられ得る。一般文献および特許文献は、そのような材料の多数の例を包含している。例えば、欧州特許第ＥＰ−１４１６２７５号を参照されたい。

ハプテンに対する抗体は、標準的な方法で、例えば、この目的のために販売されている市販キットに記載されている方法を用いて、そのような粒子に付着させることができる。
（３） ハプテン。

本発明のデバイスは、非常に広範囲のハプテンの検定に用いられるように適合されていてもよい。ハプテンは、小さすぎるので、それ自体は免疫反応を引き起こすことができない分子である。本願の目的ために、ハプテンは、９００ダルトン未満、かつ９０ダルトンを超える分子量の分子であると見なされ得る。適切には、ハプテン(happen)は１００〜７００ダルトン、例えば、約１５０、１８０、２５０または３００ダルトンのような１２０〜４００ダルトンの分子量を有する。そのような分子は、通常、炭素、水素を含み、任意で酸素および／または窒素を含み、また時には硫黄および／またはリンのような他の元素を包含するであろう。

適切には、ハプテンは、薬剤、ホルモン、代謝産物（例えば乱用薬物または薬剤のもの）、毒素、汚染物質、食品および飲料に見られる物質、水路および下水に見られる物質、供給源および製品の表示に用いられる物質、または乱用薬物、または分析されるように選択されるあらゆるハプテンであり得る。

適当な被検乱用薬物としては、アンフェタミン、メタンフェタミン、４−メチレンジオキシアンフェタミン（ＭＤＡ）、３，４−ジメチレンジオキシメタンフェタミン（ＭＤＭＡ、エクスタシー）が挙げられる。３，４−メチレンジオキシエチルアンフェタミン、テトラヒドロカンナビノール(tetradydrocanabiniol)（ＴＨＣ、大麻）、コカイン、リゼルギン酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）、ケタミン、モルヒネのようなオピオイド(opiodes)、
メタドン、およびそのような薬物摂取後に生じる代謝産物、例えばコカインの代謝産物であるベンゾイルエクゴニン(benzoylecgogonine)、もまた適当なハプテンである。

特に適当なハプテンは、人由来の試料中におけるその存在が、その人によるコカイン使用の識別を可能にするので、ベンゾイルエクゴニン(benzoylecoconine)である。
ハプテンの例としてはまた、フェンシクリジン、アセトアミノフェン、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、メタドン、プロポキシフェン、三環系抗うつ薬、ジゴキシン、ジギトキシン、Agrochemical Desk Reference 第２版、ジェイ．エイチ．モンゴメリ(J.H. Montgomery)、ＣＲＣプレス社(CRC Press LLC)、１９９７年にあるもののような農薬、ビタミン、ミクロマイシン(micromycins)およびマイコトシン(mycotocins)のような天然毒素
、エストラジオール、エストラジオール、エチリジンエストラジオール(ethylidineestradiol)、テストステロンのようなホルモンなどが挙げられる。

（４） ハプテンに対する抗体
ハプテンに対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。多くの抗体が市販されており、用いられるべき各ハプテン(happen)のために新規の抗体を調達しなければならないのではなく、多くの市販の抗体が用いられ得ることは本発明の大きな効果のうちの１つである。しかしながら、市販の抗体が入手可能でないハプテンもあるであろう。そのような場合には、当業者に知られている従来の方法によって、その抗体を生成してもよい。前記抗体は全抗体であってもよいし、または前記配置手段がそのフラグメントを認識するように選択される限り、抗体のフラグメントであってもよい。しかしながら、配置手段は好ましくは抗体のＦｃ領域に非特異的に結合するので、好ましくは、前記抗体はＦｃ領域を含む全抗体である。抗体は任意のクラスのものであってよく、商業的供給源から得られてもよいし、または当業者によって標準的な方法を用いて製造されてもよい。

抗体が、偽陽性に結びつく、望まれない方法で試料中に生じ得る他のハプテンをも拾い上げないように、抗体は十分に特異的である。特異的な抗体の使用は標準的な市販の検定系の基礎であるので、これは当業者によく理解される。前記抗体は、試験ハプテン単体中、または、例えば、個々の要素によってではなく、ある種類として識別されることが望まれることがある様々なアンフェタミン誘導体の場合におけるように、試験され得るいくつかの密接に関連したハプテン中に見られる特異的なエピトープであるように選択され得る。

（５） 配置手段
配置手段は、これが本発明を実行する非常に簡略化された方法を提示するので、好ましくは、ハプテンに対する抗体に対して特異的な抗体ではない。配置手段は、好都合には、ハプテンに対する抗体のＦｃ領域に対する抗体である。これに代わって、配置手段は、Ｆａｂ領域またはＦｖ領域のようなハプテンに対する抗体の他の領域に対する抗体であってもよい。

配置手段は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であってもよいが、ポリクローナル抗体であることが特に好ましい。
好ましくは、配置手段は抗ＩｇＧ抗体である。また、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよび下位クラスも使用が想定される。例えばラクダ科動物からの一本鎖Ｆｖ剤および単離された抗体重鎖も使用が想定される。前記抗体は組み換え抗体の打ってつけのものであり得る。

本発明における使用に想定される非抗体配置手段としては、分子インプリント（ｍｏｐ）、アプタマー、並びにプロテインＡおよびプロテインＧなどのような抗体を非特異的に結合する物質が挙げられる。

非特異的抗体の使用は、先に言及した選択的な抗体を調製する難しさを回避できるという重要な利点をもたらす。この利点は、異なるハプテンに対する一連の検定デバイス(assay devise)が製造されている場合、特に有用である。同様に、検定デバイス(assay devise)が２種類以上のハプテンに対して使用するために構成されているような場合に、単一の配置手段を用いることができるので、前記利点は特に有用である。

（５） 結合剤
ハプテンに対する抗体に対する結合物質は、ハプテンに対する抗体について、ハプテンと競合することができる任意のものである。一般に、前記結合物質は、該結合物質がハプテンに対する抗体に結合されるときに、該結合物質が配置手段に結合するのを防止する分子に共有結合されたハプテンまたは構造が近いハプテン類似体である。

構造が近い類似体は、該類似体が前記ハプテンに対する抗体に結合するように、前記ハ
プテンと同一の結合部位を保持する分子であろう。
適切には、ハプテンまたは構造が近い類似体が共有結合される分子は、例えば５，０００ダルトン以上の分子量を有する巨大分子である。適当な巨大分子としては、ペプチド、特にタンパク質、炭水化物および合成分子（例えばポリマー）が挙げられる。好都合には、前記巨大分子は親水性であり、例えばポリエチレングリコールまたは末端アミノ基を有する変性ポリエチレングリコールである。

ハプテンまたはハプテン類似体に連結するために従来のイムノアッセイにおいて用いられるタンパク質分子、例えばキーホールリンペットヘモシアニン(keyhole limpet heamocyanin)、ウシ血清アルブミンおよび同様のタンパク質もまた用いられ得る。そのようなタンパク質は、例えば２０，０００ダルトン〜２，０００，０００ダルトンの分子量を有し得る。

適切なブロッカーとしては、分子量２，０００ダルトン以上、例えば、５，０００ダルトン以上、１０，０００ダルトン以上、１５，０００ダルトン以上、２０，０００ダルトン以上であるが、一般に分子量６０，０００ダルトン以下、例えば４００００ダルトン以下、適切には３０，０００ダルトン以下であるポリエチレングリコールが挙げられる。

これまでに確認された特に使用に適したポリエチレングリコールは、分子量２０，０００ダルトンのものである。そのような材料の適当な商業的供給源としては、シグマ(Sigma)が挙げられる。

ハプテンまたは構造が近い類似体の共有結合の容易さのために、ポリエチレングリコール(polyethyleglycols)（または他の合成高分子）は末端アミノ基を有するように修飾さ
れる。

ハプテンまたはハプテン類似体は、熟練化学者に知られている化学カップリングの標準的方法によって、巨大分子に共有結合され得る。典型的には、エステル、アミド、エーテル、または同様の連結子を形成する方法を用いることができる。現在好ましい方法は、容易に置換可能な基、例えば容易に置換可能なエステル基をハプテンまたはハプテン類似体に付加することを含む。現在好ましい方法は、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）のようなカルボジイミドのようなカップリング剤によって、ヒドロキシスクシンアミド基をカルボン酸基に結合することである。そのような反応は、水を含有する媒体中において行なうことができる場合もあるが、ジオキサンまたはジメチルホルムアミドのような乾燥溶媒を用いることが有用であり得る。次に、その活性中間体を、巨大分子と、例えばそのような巨大分子中のアミノ基またはヒドロキシル基と、反応させることができる。この段階は、多くの場合、水のような溶媒中において、例えば重炭酸ナトリウムのような緩衝剤または塩基の存在下で行われ得る。

好ましくは、結合手段は、徹底的な透析によって、ハプテンまたはハプテン類似体を含まなくさせられるであろう。例えば一般的な市販の透析膜を用いた、２４時間にわたる従来レベルの透析は、有用性を低減する高いバックグラウンドを有する検定に結びつく。結合剤がハプテンを含まなくするのに成功裡に用いられる方法としては、１０日間以上、例えば２０日間または３０日間にわたる標準的な市販の透析膜を用いた透析が挙げられる。代替の便利な方法は、スピン法を用いることである。

最も適切には、結合手段は２つ以上、好ましくは２つのハプテンまたは構造が近い類似体を有する。現在までに行った実験では、二価のブロッカーは１価のブロッカーよりも良好な結果を生じるように見える。

結合剤は、その検定の有効性を確認するために、当業者に知られている結合アッセイによって、または存在する他のすべての構成要素を備えたディップスティックにおいて使用することによって、金上にある抗体に対して検査され得る。

水性試料がニトロセルロースまたは他の膜材料に浸透すると、前記結合手段はディップスティックを通って移動するであろう。前記結合手段は前記配置手段に結合しないので、結合剤は側方流動デバイスのある領域に固定される必要はなく、これはデバイスの有効性を増進し、相当な強度の信号線を可能にするように思われる。これは、次には、ディップスティックの場合には通常である低濃度のハプテンの検出を可能にし、例えば、困難な照明条件下においてさえ、例えばいくつかの街灯下において、その検定を眼で読み取ることを可能にする。

（６） 対照信号および定量化
前記デバイスは、効果的な作動の確認として機能し、かつ／または試料中のハプテンの量の測定を助け、提供し、推定するために使用され得る対照手段を備えてもよい。

水性液体がデバイスに浸透中であること、および信号生成手段が第２区域に移動中であることを確かめる検査として、第２信号生成手段と、該手段の位置を特定し、それにより信号を生成する手段とが用いられてもよい。第２信号生成手段は、第１区域からは第２区域の反対側のデバイス上に配置された結合対の一方の要素および結合対の他方の要素で標識され得る。前記信号生成手段は第１信号生成手段と同一である必要はないが、そうであると好都合である。したがって、例えば、ハプテン抗体で標識された信号生成手段が金粒子であり、そこで第２信号生成手段もまた好都合には金の粒子である。そのような粒子は、第１信号生成手段のものと本質的に同一であってもよいし、または、それらは多少異なっていてもよい。前記結合対は、配位子および受容体のような任意の適当な対であってもよく、例えば、前記対において、一方は抗体であり、他方は抗体が結合する物質である。しかしながら、前記対の要素として、ビオチンと、従ってアバジン(a vadin)または／お
よび抗ビオチン抗体のような結合相手とを用いることが現在好ましい。ウシ血清アルブミンのようなタンパク質にコンジュゲートされたビオチンを金粒子上に被覆させて、その被覆された粒子を第１区域に塗布することができることが見出された。抗ビオチン抗体の線は第２区域を越えたところに提供され得る。使用において、水性液体は第２区域を越えて浸透し、抗ビオチン抗体の線に到達すると、ビオチンで標識された金粒子は位置が示されるようになり、可視信号を生成する。これは、デバイスは、金が第２区域を過ぎて浸透するのを可能にしていることを確認する。

試料線に対する標準対照線としての比較は、試料中に生じる濃度を推定するために用いることができる。
（７） 検定方法
使用において、前記検定は当業者に知られている方法で用いられ得る。したがって、例えば、ハプテンを含有する疑いがある試料は、ディップスティックの下部に導入され得る。これは、唾液もしくは尿、または例えば肌のような表面を吸収材料で拭き、次に既知の方法でデバイスに移されることによって生じる従来の液体において行われ得る。

実施例
実施例１
ベンゾイルエクゴニンポリオキシエチレンブロッカー
ベンゾイルエクゴニン（ＢＥ）（４ｍｇ）を乾燥したジオキシン（５００ｕｌ）中に溶解させて、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨ）（４ｍｇ）を添加した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロプル）カルボジイミド塩酸塩(1-Ethyl-3-(3-dimethyl ami
no propul)carbodiimide hydrochloride)（８ｍｇ）をジオキサン（１ｍｌ）中に懸濁／
溶解させて、前記混合物に直ちに加えた。その混合物を（ＢＥ−スクシンアミドを形成するために）周囲温度で２時間にわたって振とうした。これに、１ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液中に溶解したジアミノ終端ポリエチレングリコール（分子量２０，０００）を添加した。その溶液を一晩（約１６時間）放置し、次いで、トリス／トリトン緩衝液で希釈した。

上記ブロッカーを４℃で５回の交換を行って透析した。次に、前記ブロッカーをカットオフ分子量１０，０００のスピンカラム中で回転させた。透析緩衝剤は、ｐＨ７．４の５０ｍＭトリス緩衝液（シグマ カタログ番号Ｔｌ５０３番）＋０．００トリトン Ｘ １１０（シグマ カタログ番号Ｔ９２８４番）であった。方法は以下の通りであった。

１）ｄｉＢＥ−ＰＥＧ試料をカットオフ分子量１０，０００の透析カセット（ピアス スライド−エイ−ライザー(Pierce Slide-a-lyser)、カタログ番号６６８３０番）内に配置した。２）透析カセットを５ｌの透析緩衝液中に配置した。３）緩衝液を４時間で交換した。４）緩衝液を８時間で交換し、一晩放置した。５）翌朝、緩衝液を交換し一晩放置した。６）工程５をもう２回繰り返した。その後、６）ブロッカーの１５ｍｌアリコートをビバスピン(Vivaspin) １５Ｒ カットオフ分子量１０，０００のスピンカラム（ザルトリウス(Sartorius) カタログ番号ＶＳｌ １５ＲＨ０２番）内に入れた。７）これら
を３，０００ｒｐｍで３０分間にわたって回転させた。８）前記系に１５ｍｌまでの５０ｍＭトリス緩衝液を継ぎ足していっぱいにし、再度回転させた。９）工程８をもう２回繰り返した。１０）試料をプールし、元の体積まで継ぎ足した。！０）ここで、ブロッカーはすぐに使用できる状態にあるか、または使用前に４Ｃで保存される。

実施例２
アルディカーブ−ＰＥＧブロッカー。
アルディカーブアセテートエチルエステルを合成し、次に加水分解して、アルディカーブのカルボン酸置換類似体である黄色(yeoow)の油を生じた。（シュー(Siew)ら、 International Journal Environ. Anal. Chem、第83巻、第４１７〜４２６頁参照）。アルディ
カーブＣＯＯＨ（２．９ｍｇ）をジオキシン（６００ｕｌ）中に溶解させた。この溶液に、ジオキシン（１５０ｕｍ）中に入れたＮＨＳ（２．９ｍｇ）を添加した。結果として生じた混合物に、ジメチルホルムアミド(dimethylfomamide)（５８０ｕｌ）中に入れたＮ’Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド（５．８ｍｇ）を添加し、その混合物を２時間にわたって振とうしながら放置した。この時間の終わりに、ジアミノ−ＰＥＧ（実施例１として）（１２．４ｍｇ）を０．１ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液（１．２４ｍｌ）中に溶解させた。その混合物を撹拌しながら一晩放置した。これをトリス／トリトン緩衝液で希釈し、実施例１で述べたように透析した。

実施例３
ディップスティック
イソフロー(IsoFlow)ユニットを用いて、２本の線を３０ｃｍの長さのニトロセルロー
ス上に付着させた。前記ニトロセルロースはザルトリウス(Sartorius)からのユニスター
ト（UniStart) ＣＮ １４０であった。リン酸緩衝生理食塩水中において５０％まで希
釈された、抗体上のＦｃ領域に非特異的に結合したポリクローナル ヤギ抗マウスＩｇＧ（シグマ カタログ番号Ｍ４２８０番）の試験線を用いた。モノクローナル抗ビオチン（バイオ−デジゲ(Bio-Desige)、カタログ番号Ｈ２００９８Ｍ番）の対照線も付着させた。対照線は、ニトロセルロースの前縁から１３ｍｍに付着させ、試験線は、ニトロセルロースの前縁から１７ｍｍに付着させた。

イソフロー付着パラメーターは以下の通りであった。
セットアップムーブメニュー セットアップポンプメニュー
パラメーター 設定 パラメーター 設定
供給距離 ３００ｍｍ 供給率 ０．１００ｕｌ／ｍｍ
供給速度 ５０ｍｍ／ｓ 吸引速度 ８ｕｌ／ｓ
リターン速度 ３００ｍｍ／ｓ 開始ポーズ −０．１０ｓ
開始位置 ０ｍｍ、 停止ポーズ −０／１０ｓ
リターンポーズ １．００ｓ シリンジサイズ １００ｕｌ
ノズル下降 ０．５０ｓ 入口体積 ４０ｕｌ
ノズル上昇 １．００ｓ 出口体積 ６０ｕｌ
付着に続いて、各長さの材料を欠陥について検査し、欠陥があった場合には印をつけて、組立後に廃棄した。いったん検査し、付着した線が依然として可視であるときには、その帯状の部分を、最大に設定したヘアドライヤーを用いて乾燥させた。乾燥後、前記材料を乾燥環境に保存した。

特異的な抗ＢＥ線を記した。精製水(purified eater)中で３００〜３５０ｕｇ／ｍｌに予め希釈された、ＢＥに特異的モノクローナル(Monoclomal）抗体（イースト コースト
バイオロジカルズ(East Coast Biologicals)、カタログ番号Ｐ０１−９９−１１Ｍ−Ｐ番）をバイオ検定 ワークス ゴールド（BioAssay Works gold）（ＢＡＷ金コンジュゲ
ーションキット）にコンジュゲートした。いったんコンジュゲートさせたら、その金は、ガラス繊維（またはニトロセルロース）膜上に噴霧する前に、２〜８Ｃで保存することができる。

対照を形成するために、ビオチンをウシ血清アルブミンにコンジュゲートし、ブリティッシュ バイオセル インターナショナル(British Biocell International)によって供
給されるＯＤ１．０のコロイド金上に被覆した。１ｍｇ／ｍｌのコンジュゲートしたビオチン−ＢＳＡ溶液の金へのインキュベーションは、周囲温度で３０分間にわたって混合しながら行った。インキュベーション後、前記コロイド金を１３，０００ｒｐｍで６分間にわたって遠心分離し、上澄液を廃棄し、沈殿物を、トリトンＸ−１００および１％ＢＳＡを含有するｐＨ８．２のトリス緩衝食塩水に、ＯＤ０．５に相当する濃度で、再懸濁した。

調製したら、前記コロイド金コンジュゲートを、ｐＨ８．２のトリス緩衝食塩水中において、１部の特異的ＢＥマーカーおよび１部のスクロース溶液に対して１部の対照線の金の比率で混合した。

膜（コンジュゲート放出パッド(conjugate release pad)）は幅２７ｍｍであり、リー
ル（ワットマン(Whatman)、スタンダード１４、部品番号８１３３−２７５０番）で供給
された。前記膜を噴霧のために３０ｃｍの長さに切断した。

イソフロー(IsoFlow)を使用し、セットアップムーブメニューの供給速度は３０ｍｍ／
ｓであり、セットアップポンプの供給速度は０．８ｕｌ／ｍｍであったこと以外は上記で与えたパラメーターを用いて、前記金を前記膜上にエアブラシで吹き付けた。前記金は、コンジュゲートパッドの上方の５ｍｍの高さで、４ｐｓｉで、パッドの前縁から１０ｍｍに噴霧した。

付着させたら、材料の帯状部をインキュベーター内において３７Ｃで３時間乾燥させた後、乾燥環境中で保存した。
結合物質は実施例１に記載されるようなジ−ＢＥ−ポリエチレンゴリコール(di-BE-polethyleglycol)（アミノ基を介してコンジュゲートされている）であった。この材料を、
コンジュゲートされていないＢＥが存在しないことを確認するために、分光光度計で２０
０〜５００ｎｍにわたって走査した。

結合物質を、トリトンＸ−１００および１％ＢＳＡを含有するｐＨ８．２のトリス緩衝食塩水で１：１に希釈した。前記混合物を、イソフロー(IsoFlow)を使用し、セットアッ
プポンプの供給速度が０．４ｕｇ／ｍｍであったことを除いて上述したパラメーターを用いて、前縁から２０ｍｍのコンジュゲートパッド上に噴霧した。付着後、その材料をインキュベーター中において３７Ｃで３時間乾燥させた後、乾燥環境で保存した。

構成要素を調製したら、それらの構成要素を作動試験へと組み立てた。すべての構成要素を自己粘着性カード（Ｇ＋Ｌプレシジョン）上に取り付けた。カードは、７５ｍｍ×３０００ｍｍの、ＧＬ−１８７接着剤を備えた０．０１インチ白色ビニルであった。

まず前記カードにニトロセルロース膜を、カードの基部から２５ｍｍの前縁を有するように、前記接着剤に適用した。カードの上面には、シンクを形成するために吸取り紙の細片（ワットマン、ＣＦ６、部品番号８１１６−２７５０番）を追加した。これは幅２７ｍｍの材料のリールとして供給され、よってニトロセルロースと２ｍｍの重なりが存在した。次に、コンジュゲートパッドを、ニトロセルロースとの２ｍｍの重なりをもって、パッドの基部に付けた。

次に、組み立てられたカードを、使用できる状態にある５ｍｍの細片に切断した。
試験するとき、前記ディップスティックは、混入した尿(spiked urine)の試料中、１０ｎｇ／ｍｌ（試験中、最低濃度）、１００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、１，０００ｎｇ／ｍｌおよび１０，０００ｎｇ／ｍｌの濃度のＢＥを検出することができ、濃度が増大するほど、検出線の強度の増大を示した。

実施例４
メタンフェタミン検定に用いられる検定に使用される様々なブロッカーの調製。
化学的構造

ジオキサン（１ｍｌ）に分子量２０，０００のα，ω−ジ−スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール）（９．９ｍｇ、４．９５×１０^−４ｍｍｏｌ）を入れた後、ジ−イソプロピルエチルアミン（０．０２ｍｌ）を入れたものに、乾燥ジオキサン（０．２ｍｌ）中のＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−１−メチル−２−フェニルエチル］アミン（５．０ｍｇ、０．０２２７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０〜２５℃で２３時間振とうした。前記混合物を希釈し、カットオフ分子量１０，０００の(10,000 molecular weight cut off)膜を使用し、ｐＨ７．４で５０ｍＭのトリ
ス緩衝液（４×５Ｌ）に対して透析した。結果として生じた溶液ＧＲＤ−５５（６．２０４ｇ）の外観はわずかに濁りを帯びていた。

メタンフェタミンＢＳＡ、メタンフェタミンＫＬＨ
水（４ｍｌ）中のＢＳＡ（２６．４ｍｇ）に、水（０．５ｍｌ）中のＮＨＳ（２１．３
ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加し、次いで水（０．５ｍｌ）中のＥＤＣ（４０ｍｇ、０．１９３ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を２０〜２５℃で１５分間振とうした。ジオキサン（０．２ｍｌ）中のＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチル−Ｎ［（１Ｓ）−１−メチル−２−フェニルエチル］アミン（１．８ｍｇ、０．００８１ｍｍｏｌ）を添加した後、ジ−イソプロピルエチルアミン（０．０２ｍｌ）を添加した。その混合物を２０〜２５℃で１８時間振とうした。

水（４ｍｌ）中のＫＬＨ（２０ｍｇ）に、水（０．５ｍｌ）中のＮＨＳ（２４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を添加した後、水（０．５ｍｌ）中のＥＤＣ（３９ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を２０〜２５℃で１５分間振とうした。ジオキサン（０．２ｍｌ）中のＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチル−Ｎ［（１Ｓ）−１−メチル−２−フェニルエチル］アミン（１．８ｍｇ、０．００８１ｍｍｏｌ）を添加した後、ジ−イソプロピルエチルアミン（０．０２ｍｌ）を添加した。その混合物を２０〜２５℃で１８時間振とうした。

上記の物質を、カットオフ分子量１０，０００の膜を用いて、アジ化ナトリウムを含有した５０ｍＭのトリス緩衝液に対してｐＨ７．４で透析した。ＢＣＡタンパク質検定は、２．２ｍｇ／ｍｌおよび１．９ｍｇ／ｍｌの濃度をそれぞれ与えた。

化学的構造

ジオキサン（０．５ｍｌ）中のＮ−（４−アミノブチル）−Ｎ−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−１−メチル−２−フェニルエチル］アミン（１０．４ｍｇ、０．０４７２ｍｍｏｌ）に、０．４１ｍｌの無水コハク酸（０．５ｍｌのジオキシン中、６．１ｍｇ）を添加した。反応混合物を７０℃で１８時間加熱した。

ＰＥＧへの結合
ＤＩＣ法
０．４５５ｍｌの上記溶液に、ジオキシン（０．１ｍｌ）中のＮＨＳ（１４．８ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）を添加した後、ＤＩＣ（１８．５μｌ、０．１１９ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を２０分間振とうし、次にジオキサン（０．５ｍｌ）中のＯ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−ポリエチレングリコール２０，０００（６．０ｍｇ、３×１０^−４ｍｏｌ）を添加した。その反応を２０〜２５°Ｃで１８時間振とうした。その溶液を、カットオフ分子量１０，０００の膜を用いて、４×５Ｌの１０％エタノール／水に対して透析し、５．６７８ｇのコンジュゲート溶液を生じた。

ＢＯＰ法
ジオキサン（０．４ｍｌ）中のＯ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−ポリエチレングリコール２０，０００（５．９ｍｇ、２．９×１０^−４ｍｍｏｌ）にジオキサン（０．４ｍｌ）およびＤＭＦ（０．６ｍｌ）中に溶解したジイソプロピルエチルアミン（０．０４５ｍｌ、０．２３６ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（５３ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）を添加し
た。０．４５５ｍｌのスクシナート溶液を添加し、その混合物を２０〜２５℃で１８時間振とうした。透析は上記通りであり、１１．２０５ｇの溶液を生じた。

実施例５
アンフェタミン検定で使用されるブロッカーの調製
化学的性質

ジオキサン（０．４ｍｌ）中のα，ω−ジ−スクシンイミジルエステルポリ（エチレングリコール）分子量２０，０００（１７．６．ｍｇ（８．８×１０^−４ｍｍｏｌ））に、ジオキサン（０．２ｍｌ）中のＮＨＳ（１４．７ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を添加した後、ＤＩＣ（１８．５μｌ、１５ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４８時間振とうした。ジオキサン（０．２ｍｌ）中のＮ−［（１Ｓ）−１−メチル−２−フェニルエチル］ブタン−１，４−ジアミン（２１ｍｇ，０．１０１ｍｍｏｌ）を添加した後、ジイソプロピルエチルアミン（０．０３６ｍｌ）を添加した。反応混合物を２０〜２５℃で２４時間振とうした。次に、その混合物を、カットオフ分子量１０，０００の膜を用いて、１０％メタノールを含有した脱イオン水（４×５Ｌ）に対して透析した。結果として生じた溶液ＧＲＤ−８９（１６．０８２ｇ）はわずかに濁りを帯びていた。

アンフェタミンＢＳＡ
水（４ｍｌ）中のＢＳＡ（２４．８ｍｇ）に、水（０．５ｍｌ）中のＮＨＳ（２２．２ｍｇ、０．１９３ｍｍｏｌ）を添加した後、水（０．５ｍｌ）中のＥＤＣ（４１ｍｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を２０〜２５℃で１５分間振とうした。ジオキサン（０．２ｍｌ）中のＮ−［（１Ｓ）−１−メチル−２−フェニルエチル］ブタン−１，４−ジアミン（２．７ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の後、ジ−イソプロピルエチルアミン（０．０２ｍｌ）。その混合物を２０〜２５℃で１８時間振とうした。上記の物質を、カットオフ分子量１０，０００の膜を用いて、アジ化ナトリウムを含有したｐＨ７．４の５０ｍＭのトリス緩衝液に対して透析した。透析後のＢＣＡタンパク質検定は、１．６ｍｇ／ｍｌの濃度を与えた。

実施例６
アンフェタミン検定で使用するブロッカーの調製
化学的構造

乾燥ジオキサン（２．２ｍｌ）中のアルディカーブカルボン酸（１１．０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）に、乾燥ジオキサン（０．７ｍｌ）中のＮＨＳ（１１．５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加した後、乾燥ジオキサン（２．１ｍｌ）中のＤＣＣ（２９．０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物は２０〜２５℃で２３時間振とうした。

分子量６０００のＰＥＧ
０．１ＭのＮａＨＣＯ_３（１．５ｍｌ）中の６ＫのＰＥＧ−ジアミン（５．０ｍｇ、８．３×１０^−４ｍｍｏｌ）に、上記のように調製した活性化アルディカーブカルボン酸溶液（１．６７ｍｌ、０．０１５６ｍｍｏｌ）を添加した。次に、その反応混合物を１８時間振とうした。

分子量１０．０００のＰＥＧ
０．１ＭのＮａＨＣＯ_３（１．５ｍｌ）中の１０ＫのＰＥＧ−ジアミン（８．１ｍｇ、８．１×１０^−４ｍｍｏｌ）に、活性化アルディカーブカルボン酸溶液（１．６７ｍｌ、０．０１５６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８時間振とうした。

分子量２０．０００のＰＥＧ
０．１ＭのＮａＨＣＯ_３（１．５ｍｌ）中の２０ＫのＰＥＧジアミン（１４．９ｍｇ、７．４５×１０^−４ｍｍｏｌ）に、活性化アルディカーブカルボン酸溶液（１．６７ｍｌ、０．０１５６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８時間振とうした。

上記の物質を別々に、分子量２，０００のカットオフ膜を用いて、アジ化ナトリウムを含有した５０ｍＭトリス緩衝液（５×５Ｌ）に対してｐＨ７．４で透析した。
透析により、６ＫのＰＥＧ（ＧＲＤ−５４−１）に対して９．２４８ｇの溶液が生じ、１０ＫのＰＥＧ（ＧＲＤ−５４−２）に対して８．９５５ｇの溶液が生じ、２０ＫのＰＥＧ（ＧＲＤ−５４−３）対して８．８０Ｏｇの溶液が生じた。

側方流動データ
２０，０００ダルトンのＰＥＧアルディカーブを１００％のブロッキング効率とすると、１０，０００および６，０００のＰＥＧアルディカーブは、それぞれ９０％および８０％であった。

実施例７
ジアミノ終端ポリエチレン(Polyehthylene)グリコールからの様々なブロッカーの調製
ジアミノ−ＰＥＧブロッカー
すべてのブロッカーは、１０倍過剰のＰＥＧ−ＮＨ２基に対する抗原を用いて以下の通
りに調製した。ＰＥＧ抗原複合体を、当初は、以下で与えられるように、ＥＬＩＳＡおよびディップスティック検定において用いた緩衝液であったようなトリス−トリトン緩衝液中において透析した。トリトンは、結果として生じるコンジュゲートを分析するのを非常に困難にする２８０ｎｍにおける大きな吸収を有する。従って、現在は、慣例的に、前記コンジュゲートをｐＨ７．５の１０〜２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（または水）中で透析する。これは、最終コンジュゲートの分析をはるかに容易にする。

ＰＥＧ（ＮＨ_２）_２に対するベンゾイルエクゴニン
ベンゾイルエクゴニン（ＢＥ）はコカインの代謝産物であり、ＢＥに対する抗体はコカインと１００％交差反応する。

４ｍｇのベンゾイルエクゴニン（ＢＥ）を５００ｕｌの乾燥ジオキサン中に溶解し、これに、別の５００ｕｌのジオキサン中において、４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド(N-Hydroxysuccinimde)（ＮＨＳ）を添加する。次に、８ｍｇの１−エチル−３−［３−
ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩を１ｍｌのジオキサン中に懸濁し（完全には溶解しない）、直ちにＢＥ／ＮＨＳ混合物に加える。混合物を周囲温度で２時間振とうしながら放置すると、安定したＢＥ−ＮＨＳエステルが生成する。２時間後、１ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中に溶解した１１ｍｇのＰＥＧ−（ＮＨ_２）_２を添加する。ＢＥ−ＮＨＳ残留物は、アミド結合を介してＰＥＧ−ＮＨ_２基に結合し、自由ＮＨＳの再生を伴う。これを振とうしながら一晩放置して、ＰＥＧ−（ＮＨ−ＣＯ−ＢＥ）_２複合体を形成する。次に、反応混合物をトリス／トリトン緩衝液で１１ｍｌまで希釈し、５ｌのトリス／トリトン緩衝液に対して、１日当たり緩衝液を２〜３回交換しながら、２〜３日間透析した。

注：水溶性カルボジイミドであるＥＤＣでなければならない。他のカルボジイミドは、おそらくＢＥ結晶が水を含んでいるため、作用しない。添加されるＢＥの量は、ＰＥＧの両端に結合するために必要とされる量の約１０倍過剰である。
ＢＥの分子量（ＭＷ）は、３６５×２＝７３０ｍｇ、ＢＥ＝２０，０００ｍｇのＰＥＧ
１ｍｇのＰＥＧの両端に結合するには、３６．５ｕｇのＢＥが必要
１０倍過剰で、４ｍｇのＢＥ＝１１ｍｇのＰＥＧ
ＢＥ−ＮＨＳエステル基とＰＥＧアミン基との間のアミド結合の形成を最大限にするために、ＰＥＧ−（ＮＨ_２）_２を重炭酸塩（ｐＨ約８．４）に加えた。トリス／トリトン緩衝液は、０．０５％のトリトンＸ−１００を含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液である。

ＰＥＧ（ＮＨ_２）_２に対するアルディカーブ
アルディカーブアセテートエチルエステルを合成し、次にこれを加水分解して、アルディカーブのカルボン酸置換類似体である黄色の油を生じた。（先に記載したように、シューら、 Intern. J. Environ. Anal. Chem. 、第８３巻、第４１７〜４２６頁）。

２．９ｍｇのアルディカーブ−ＣＯＯＨをジオキサン（６００ｕｌ）中に溶解し、別の１５０ｕｌのジオキサン中で２．９ｍｇのＮＨＳを加えた。５８０ｕｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した５．８ｍｇのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）を添加し、その混合物を２時間振とうしながら放置して、アルディカーブ−ＮＨＳエステルを形成する。２時間後、１．２４ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中に溶解した１２．４ｍｇのＰＥＧ−（ＮＨ_２）_２を添加して、その混合物を一晩振とうして放置した。次に、これをトリス／トリトン緩衝液で１２．４ｍｌまで希釈し、５ｌのトリス／トリトン緩衝液に対して、１日当たり緩衝液を２〜３回交換しながら、２〜３日間透析する。

注：再度、ＰＥＧ−（ＮＨ_２）_２に対して１０倍過剰のアルディカーブ
アルディカーブ酸の分子量は２３４、ＰＥＧ−（ＮＨ_２）_２の分子量は２０，０００
従って、４６８ｍｇのアルディカーブ＝２０，０００ｍｇのＰＥＧ（２つの反応性アミン）
２３．４ｕｇ＝１ｍｇのＰＥＧ
１０倍過剰で、２３４ｕｇ＝１ｍｇ
２．９ｍｇ＝１２．４ｍｇのＰＥＧ
パラコート−ＰＥＧ（ＮＨ_２）_２
４００ｕｌ水中の６ｍｇのパラコートヘキサン酸誘導体（Anal Chem 第５８巻、第１８６６〜１８７３頁参照）に、６００ｕｌ純水中の６ｍｇのＮＨＳを添加した。次に、３０ｍｇのＥＤＣをパラコート／ＮＨＳ混合物に加えた。パラコート−ＮＨＳは水中で不安定なため、これを１５分だけ放置した（ＮＨＳエステルは有機溶液中では安定しているが、パラコートは有機化合物に可溶ではない）。さらに１６ｍｇのＰＥＧ−（ＮＨ_２）_２を１．６ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中で加えた。これを一晩放置し、次にトリス／トリトン緩衝液で１６ｍｌにして、上記の通りに透析した。

クロルピリホス−ＰＥＧ（ＮＨ_２）_２

５ｍｇのクロルピリホスカルボン酸誘導体（Hapten 2、 Bull. Korean. Chem. Soc 2002、第２３巻、第４８１〜４８７頁）を1ｍｌのＤＭＦ中に溶解した後、０．５ｍｌＤＭＦ中の５ｍｇのＮＨＳおよび０．５ｍｌＤＭＦ中の５ｍｇのＤＣＣを添加した。これを２時間で振とうして、クロルピリホス−ＮＨＳエステルを形成した。次に、１１．５ｍｇのＰＥＧ−（ＮＨ_２）_２を、ｐＨ７．５の１．１５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム中で添加した（クロルピリホスは、ｐＨ＞８．０において急速に加水分解するので、他のハプテンを用いて行うように、クロルピリホスを重炭酸塩中でＰＥＧ−（ＮＨ_２）_２に結合させてはならない）。
振とうしながら一晩放置し、トリス／トリトンによって最終体積を１１．５ｍｌにして、上記にように再度透析する。

注：ここでは、ＰＥＧ−（ＮＨ_２）_２を２ｍｌｓのジオキサン（緩衝液の代わりに）中に溶解させる。クロルピリホス−ＮＨＳは、この有機溶液中において、ＰＥＧアミン基に安定して結合するであろう。次に、透析をリン酸緩衝液中においてｐＨ７．０で行う。これは、ＰＥＧ−クロルピリホスコンジュゲートの安定性を最大にする。

実施例８
プロトコルおよびアセンブリ方法
バイオ検定 ワークス ４０ｎｍ コロイド金評価の概要プロトコル
用いる抗体濃度は０．３〜１．５ｍｇ／ｍｌであり、それはまた全フラグメントであっても、またはＦａｂフラグメントであってもよい。同様に金上に被覆されたＳｃＦｖを用いることもできるに違いない。

方法：
・４０ｎｍのコロイド金を超純水中で３分の１に希釈する（＝ＯＤ５．０）。
・０．１ｍｌの金のゾルを１０本のラベルを付けた試験管に入れ、各管に０．２ｍｌの超純水を加える。
・別個のラベルを付けた管中に、以下のμＬの緩衝液の混合物を用意する。

・３μＬの各緩衝液を対応する番号が付されたコロイド金含有管に移す。
・混合物を優しく攪拌する。
・各管に１５μＬの抗体（２５０〜３５０μｇ／ｍｌ）を加える。
・混合物を優しく攪拌する。
・３０分間にわたって静かにインキュベートする。
・各管に３０ｕＬの供給されたブロッキング溶液を加える。
・混合物を優しく攪拌する。
・金は試験準備が整う。

膜の付着
全抗体用の試験線の付着はαマウスＩｇＧ（Ｆｃ特異性）を用いる。
Ｆａｂフラグメント用の試験線はαマウスＩｇＧ（ｆａｂ特異性）を用いる。
対照線としてのＭＡｂα−ビオチンの付着。
材料：
ＭＡｂ α−ビオチン バイオデザイン
ヤギαマウスＩｇＧ（Ｆｃ特異性）シグマ １ｍｇ／ｍｌ
ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異性）
ザルトリウス メンブレン ユニサートＣＮ １４０(Sartorius Membrane Unisart CN 140)
１０ｍＭのＰＢＳ
方法：
標準的な機械プログラム：
ライン付着
セットアップムーブメニュー
パラメーター 設定
供給距離 ３００ｍｍ
供給速度 ５０ｍｍ／ｓ
リターン速度 ３００ｍｍ／ｓ
開始位置 ０ｍｍ
リターンポーズ １．００ｓ
ノズル下降 ０．５０ｓ
ノズル上昇 １．００ｓ
セットアップポンプメニュー
パラメーター 設定
供給率 ０．１００μＬ／ｍｍ
吸引速度 ８μＬ／ｓ
開始ポーズ −０．１０ｓ
停止ポーズ −０．１０ｓ
シリンジサイズ １００μＬ
入口体積 ４０ｕＬ
出口体積 ６０ｕＬ
ＭＡｂ α−ビオチンをＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、ヤギ αマウスＩｇＧ（Ｆｃ特異性）をＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。

リールから３０ｃｍのニトロセルロースの帯を切断し、裏面に線を描いた（マイラーで支持された側の、上端に指定されているいずれかの縁から３ｍｍ）。前記帯を移動して、１本の帯の上端に線を描いて向きを保証した（上端の黒線が、操作者から最も遠い）。全部で６本の３０ｃｍの帯に付着させた。３本の帯に付着させた後、ヘアドライヤーを用いてこれらを乾燥させる。

試験線は細片の基部から５ｍｍ〜１３ｍｍまで変化し、対照線は細片の基部から１０ｍｍ〜１８ｍｍまで変化し得る。
膜は帯としてシリカゲルを入れた気密容器に保管した。

コンジュゲートパッドの噴霧
目標：
金、緩衝液およびブロッカーを付着させる。

材料：
コンジュゲートした金− 金にコンジュゲートした被分析物
対照の金− 金にコンジュゲートしたビオチンＢＳＡ
検定緩衝液− トリス塩基(Trizma Base) ５０ｍＭ＋ＮａＣＬ １５
４ｍＭ ｐＨ ８．２
一緒に− １％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
０．１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００
０．１％（ｗ／ｖ）のＮａＮ_３
検定ブロック− Ｂｉｓ ＰＥＧ２０，０００にコンジュゲートした被分析物の濃度は最高４回のパスを生ずる濃度に調節される。

５０％のスクロース溶液
ＡＣＳ水
噴霧位置および噴霧順序
１番目 金コンジュゲート位置−
金をコンジュゲートパッドの中央に２パスで噴霧する。
２番目 緩衝液位置
緩衝液をコンジュゲートパッドの下から５ｍｍに２パスで噴霧する。
３番目 ブロッカー位置−
ブロッカーをコンジュゲートパッドの上端から５ｍｍに、互いの上端の各側で２回ずつ４パスで噴霧。各パス間においてドライヤーを用いて乾燥させる。

方法
リールから３０ｃｍのコンジュゲートパッドの帯を切断する。パッドの底縁を確認するために右側下の角を切断する。

ビオチン金コンジュゲートおよび被分析物金コンジュゲートを１：２で混合し、これに１部のＡＣＳ水および１部の５０％スクロースを加える。
ここで、これは下記に見られる標準的な機械設定を用いて噴霧する準備が整う。

各線の付着と付着との間ではヘアドライヤーの低の設定を用いて乾燥させ、緩衝液の噴霧とブロッカーの噴霧との間では３７℃で３時間にわたって乾燥させる。
標準的な機械プログラム：

リールから３０ｃｍのコンジュゲートパッドの帯を切断する。パッドの底縁を確認するために右側下の角を切断する。
さらなる注釈
入手可能な場合には、市販の抗体を用いてもよい。容易に商業的に入手できる抗体がない場合には、下記のような標準法によって調達してもよい。

クロルピリホスに対する抗体は以下の日程によって調達した：０日目、１００μｇを完全フロイント中で一次免疫；１６日目、不完全フロイント中１００μｇで１次ブート(boot)；２８日目、不完全フロイント中１００μｇで２次ブースト；６３日目、不完全フロイント中で３次ブースト；１１２日目、融合のために４次ブースト；１１６日目、融合。免疫原はクロルピリホス−ＫＬＨコンジュゲートであり、マウス脾は骨髄腫株ＮＳ−１と融合させた。

アルデカーブ(aldecarb)に対する抗体は、同一のプロトコルで、アルデカーブ(aldecarb)−ＢＳＡコンジュゲートを用いて作製した。
メタンフェタミンに対する抗体は、アンフェタミンＢＳＡおよびメタンフェタミンＢＳＡの混合物を用いて製造した。４回の１００μｇの免疫付与、すなわち完全フロイントでの１回、不完全フロイントでの他の３回を用いた。脾臓はＮＳｌ骨髄腫に融合させ、アンフェタミンおよびメタンフェタミンに対してスクリーニングした。抗体は、メタンフェタミンに対して非常に感度が高く、アンフェタミンに対しては約１０００倍も感度が劣った
。

市販のアンフェタミンに対する抗体を用いた。
パラコートに対する抗体は以下の日程でパラコート−ＫＬＨで免疫することにより調達した。０日目、タイターマックス ゴールド(TitreMax Gold)中１００μｇで一次免疫；
１５日目、タイターマックス ゴールド中１００μｇで一次ブースト；２８日目、タイターマックス ゴールド中１００μｇで二次ブースト；３７日目、融合のために４次ブースト；４１日目、融合。マウス脾は骨髄腫株ＮＳ−１と融合させた。クローンは競合Ｅｌｉｚａを用いてスクリーニングされ、陽性のものが選択され、単一細胞からクローン化され、安定したクローンにスクリーニングされる。

用いられる免疫原は、生成された抗体がハプテンと結合物質との双方に潜在的に結合するように、結合物質を反映する。それがデバイス全体を通って移動するときに、液相中のこれらの薬剤間において競争が起こり得ることが望しい。

従ってメタンフェタミンに抗体を調達する目的で免疫原を生成するために、メタンフェタミンを、４−ブロモブチルフタルアミドとの反応およびそれに続く加水分解によって、−（ＣＨ_２）_４ＮＨ基に連結する。次に、このアミンを、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−エチルＮ−カルボジイミド（ＥＤＣ）のような水溶性カルボジイミドを用いて、ＢＳＡに結合させる。

同様に、パラコート抗体は、−（ＣＨ_２）_４ＮＨ_２リンカー（市販で入手可能）を介して、パラコートコンジュゲートを用いて調達される。アルデカーブ(Aldecarb)コンジュゲートは、アルデカーブ酸をＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド）で活性化し、これを、例えばｐＨ９でタンパク質と反応させることによって、誘導することができる。クロルピリホス(chlorpyrifos)（本願においてクロルピリホス(chlorpyriphos)とも称される）
については、６つの炭素リンカーを備えた類似体が、アミノカプロン酸との反応、ＮＨＳによる活性化、タンパク質への結合によって得られる。

当業者は、本願において検定の原理を読んだならば、必要な化学的性質を理解する。構造が近い類似体の概念は、一般的に非常に多くの診断システムが作用するためにこの概念に依存しているので、同様に当業者にはよく理解されている。類似体は、抗体上の部位に対してそれと競合できるように、ハプテンと共通した十分な構造上の特徴を含み得、したがって、関連するエピトープは維持されるであろう。そのような類似体は、多くの場合、ハプテンまたは化合物中の、酸性基のエステル、またはヒドロキシル基もしくはアミノ基のエステルもしくはアミドである。ここで、ヒドロキシル基またはアミノ基は、アルキルで置換されているか、または置換アルキル基または同種のものである。当業者は、前記概念を完全に理解するであろう。

Claims (13)

1. 水性液体が浸透性材料の第１部分と接触させられると、前記水性液体は浸透性材料の第２部分に浸透するような浸透性材料を備える検定デバイスであって、前記浸透性材料は第１区域および第２区域を有し、第１区域および第２区域は、水性液体が浸透性材料の第１部分と接触させられると、水性液体はまず第１区域を通過し、次に該液体が浸透性材料の第２部分に浸透するにつれて、第２区域内に移行するように配置されており、
   前記第１区域はハプテンに対する抗体で標識された信号生成手段を含有しており、
   前記第１区域はまた前記ハプテンに対する抗体のための結合物質も含有し、
   前記第２区域は、抗体によって標識された信号生成手段上に存在する、ハプテンに結合した抗体には結合するが、信号生成手段上に存在する、前記ハプテンに対する抗体のための結合物質に結合した抗体には結合しないような、ハプテン(hapen)に対する前記抗体の
   ための配置手段を含有し、
   前記信号生成手段は、前記配置手段への結合において信号が生成されるようなものであり、該デバイスにおいて、
   （ａ）前記配置手段はハプテンに対する抗体に特異的な結合剤ではなく、かつ／または、
   （ｂ）前記配置手段は、ハプテンに対する抗体のＦｃ領域に対する抗体であり、かつ／または、
   （ｃ）前記ハプテンに対する抗体のための結合物質はハプテンおよび／またはハプテン類似体を含まず、かつ／または、
   （ｄ）前記結合物質は、２０００を上回る分子量の合成親水性分子に共有結合したハプテンまたは構造が近い類似体であり、かつ／または、
   （ｅ）前記結合物質は２つのハプテンまたは構造が近い類似体を有する、検定デバイス。
2. ディップスティックの形態にある請求項１に記載のデバイス。
3. 前記配置手段は、ハプテンに対する抗体のＦｓｕｂｃ部分に対する抗体である、請求項２に記載のディップスティック。
4. 前記配置手段はポリクローナル抗体である、請求項３に記載のディップスティック。
5. 前記信号生成手段は着色した金微粒子である、請求項２乃至４のいずれか１項に記載のディップスティック。
6. 前記結合剤は、ハプテンまたは構造が近いハプテン類似体が結合する、例えば分子量５０００ダルトン以上の巨大分子である、請求項２乃至５のいずれか１項に記載のディップスティック。
7. 前記巨大分子は親水性合成分子である、請求項６に記載のディップスティック。
8. 前記ポリマーはポリエチレングリコールである、請求項７に記載のディップスティック。
9. 前記ポリエチレングリコールは、５０００〜６００００ダルトン、より適切には１００００〜４００００ダルトン、好ましくは２００００〜３００００ダルトンの分子量を有する、請求項８に記載のディップスティック。
10. 前記結合物質は、該結合物質に結合した２分子以上の、好ましくは２分子のハプテンま
    たは構造が近い類似体を有する、請求項６乃至９に記載のディップスティック。
11. 測定されるべきハプテンは乱用薬物または環境汚染物である、請求項２乃至１０のいずれか１項に記載のディップスティック。
12. 前記乱用薬物はコカインアンフェタミンまたはメタンフェタミンである、請求項１１に記載のディップスティック。
13. 前記環境汚染物はアルジカルブ、パラコートまたはクロルピラホス(chlorpyraphos)で
    ある、請求項１１に記載のディップスティック。

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