JP2010517545A5

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Publication number: JP2010517545A5
Application number: JP2009548618A
Authority: JP
Filing date: 2008-02-05
Publication date: 2013-06-13
Anticipated expiration: 2028-02-05

Description

したがって、各検出プローブのための判別変数値の評価は、遺伝子型を決定することを可能にする。判別変数が表されるスケールは、閾値を使用して範囲に分けられることが可能であり、その値はプローブの性質に依存する。
従って、本方法の一実施形態によれば、２つのプローブシグナルの組合せに由来する判別変数が達し得る値の範囲は、閾値を使用して範囲に分けることができ、それにより各遺伝子型ごとに判別変数が達し得る値の範囲は、これらの範囲の１つに集まる。
２対立遺伝子のＳＮＰの場合には、判別変数が達し得る値は、閾値を使用して３つの範囲に分けられる：
・下部範囲は以下を含む：
ｏ第１のプローブが突然変異型を検出できて、さらに第２のプローブが野生型を検出できる場合は、ホモ接合野生型のクラスター。第１および第２のプローブは、判別変数の比率中の反応速度位置に関する。第１のプローブの反応速度は（分数の）分子であり、第２のプローブの反応速度は分母である。
ｏ第１のプローブが野生型を検出できて、さらに第２のプローブが突然変異型を検出できる場合は、ホモ接合突然変異型のクラスター。
・上部範囲は以下を含む：
ｏ第１のプローブが野生型を検出できて、さらに第２のプローブが突然変異型を検出できる場合は、ホモ接合野生型のクラスター。
ｏ第２のプローブが野生型を検出できて、さらに第１のプローブが突然変異型を検出できる場合は、ホモ接合突然変異型のクラスター。
・中間範囲（下部と上部範囲の間で、オーバーラップしない範囲）は、ヘテロ接合型のクラスターを含む。

Claims

生物試料に適用されるタイピング・アッセイにおける遺伝子型決定の方法であって、前記試料が興味がある標的核酸を含んでおり、前記標的核酸が一塩基変異多型（ＳＮＰ）を含みやすく；前記方法が
- 少なくとも２種の異なる標識化プローブの存在下で、標的のリアルタイム増幅を実施し、アンプリコンの多数のコピーを作成し、各プローブが野生型及び少なくとも一つのあり得る突然変異の両方のＳＮＰ位置でのリアルタイム検出を可能にするものである、工程、
- 前記少なくとも２種の異なる標識化プローブの各組合せのシグナルに基づいて判別変数値を計算する工程、及び
- 判別変数値に基づいて遺伝子型を判別する工程であって、
ＳＮＰが２対立遺伝子ＳＮＰである場合、
ヘテロ接合遺伝子型の判別変数値は（Ｋ _{ＷＴ→ＷＴ} ＋Ｋ _ＷＴ→ｍ）／（Ｋ _ｍ→ｍ＋Ｋ _ｍ→ＷＴ）、（Ｋ _{ＷＴ→ＷＴ} − Ｋ _ＷＴ→ｍ）／（Ｋ _ｍ→ｍ − Ｋ _ｍ→ＷＴ）、（Ｋ _{ＷＴ→ＷＴ} ＸＫ _ＷＴ→ｍ）／（Ｋ _ｍ→ｍＸＫ _ｍ→ＷＴ）及び（Ｋ _{ＷＴ→ＷＴ} ／Ｋ _ＷＴ→ｍ）／（Ｋ _ｍ→ｍ／Ｋ _ｍ→ＷＴ）並びにそれらの逆数からなる群から選択される比率であり、
ホモ接合突然変異体の遺伝子型の判別変数値はＫ _ＷＴ→ｍ／Ｋ _ｍ→ｍ又はその逆数の比率であり、ホモ接合野生型の遺伝子型の判別変数値はＫ _ＷＴ→ｍ／Ｋ _ｍ→ＷＴ又はその逆数の比率であり、
ＳＮＰが３対立遺伝子ＳＮＰである場合、ＡＡＡ遺伝子型の判別変数値はＫ _Ａ → _Ａ／Ｋ _Ｇ → _Ａ又はその逆数の比率であり、ＡＡＧ遺伝子型の判別変数値は（２Ｋ _Ａ → _Ａ＋Ｋ _Ａ → _Ｇ）／（２Ｋ _Ｇ → _Ａ＋Ｋ _Ｇ → _Ｇ）、（２Ｋ _Ａ → _Ａ − Ｋ _Ａ → _Ｇ）／（２Ｋ _Ｇ → _Ａ＋Ｋ _Ｇ → _Ｇ）、（２Ｋ _Ａ → _ＡＸＫ _Ａ → _Ｇ）／（２Ｋ _Ｇ → _ＡＸＫ _Ｇ → _Ｇ）及び（２Ｋ _Ａ → _Ａ／Ｋ _Ａ → _Ｇ）／（２Ｋ _Ｇ → _Ａ／Ｋ _Ｇ → _Ｇ）並びにそれらの逆数からなる群から選択される比率であり、ＡＧＧ遺伝子型の判別変数値は（Ｋ _Ａ → _Ａ＋２Ｋ _Ａ → _Ｇ）／（Ｋ _Ｇ → _Ａ＋２Ｋ _Ｇ → _Ｇ）、（Ｋ _Ａ → _Ａ − ２Ｋ _Ａ → _Ｇ）／（Ｋ _Ｇ → _Ａ＋２Ｋ _Ｇ → _Ｇ）、（Ｋ _Ａ → _ＡＸ２Ｋ _Ａ → _Ｇ）／（Ｋ _Ｇ → _ＡＸ２Ｋ _Ｇ → _Ｇ）及び（Ｋ _Ａ → _Ａ／２Ｋ _Ａ → _Ｇ）／（Ｋ _Ｇ → _Ａ／２Ｋ _Ｇ → _Ｇ）並びにそれらの逆数からなる群から選択される比率であり、ＧＧＧ遺伝子型の判別変数値はＫ _Ａ → _Ｇ／Ｋ _Ｇ → _Ｇ又はその逆数の比率である工程
を含む方法。
前記増幅は、前記試料を、ＳＮＰ位置の両側にあるフォワードプライマーとリバースプライマーを含む一対のプライマーに接触させることによって実施される、請求項１に記載の方法。
リアルタイム増幅は、前記試料に、一対のプライマーと前記少なくとも２種の標識プローブを同時に接触させることによって実施される、請求項１又は２に記載の方法。
各プローブによるアンプリコン上へのハイブリダイゼーションによってリアルタイム検出が可能であり、プローブ−アンプリコン・ハイブリッドは前記ＳＮＰ位置を含むものである、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
前記少なくとも２種の異なる標識化プローブは、識別可能なシグナルを提供する標識により、且つ少なくとも一のヌクレオチドが異なる配列により、互いに異なる、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
前記少なくとも２種の異なる標識化プローブの配列は、野生型標的に対応するか又は少なくとも一のあり得る突然変異に対応する、請求項５に記載の方法。
前記少なくとも２種の異なる標識化プローブの各組合せの判別変数値は、前記少なくとも２種の異なる標識化プローブがアンプリコンと結合する反応の相対会合反応速度定数（ｋ_１）である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
前記少なくとも２種の異なる標識化プローブの各組合せの判別変数値は、前記少なくとも２種の異なる標識化プローブがアンプリコンから分離する反応の相対解離反応速度定数（ｋ_２）である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
前記少なくとも２種の異なる標識化プローブからのシグナルの組合せに由来する判別変数が達し得る値の値域は、閾値を使用して範囲に分けることができ、それにより各遺伝子型ごとに判別変数が達し得る値の範囲は、これらの範囲の１つに集まる、請求項７又は８に記載の方法。
ＳＮＰが２対立遺伝子ＳＮＰである、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
判別変数が達し得る値は、閾値を使用して３つの範囲に分けられ、前記３つの範囲は下部範囲、中間範囲及び上部範囲である、請求項１０に記載の方法。
ヘテロ接合の標的の場合、判別変数が達し得る値は、中間範囲に集まる、請求項１１に記載の方法。
判別変数の達し得る値が下部範囲に集まる場合、標的配列は：
- 第１のプローブが突然変異体の遺伝子型を検出できて、一方第２のプローブが野生型を検出できる場合は、ホモ接合野生型であり、
- 第１のプローブが野生型を検出できて、一方第２のプローブが突然変異体の遺伝子型を検出できる場合は、ホモ接合突然変異体の遺伝子型である、請求項１１に記載の方法。
判別変数の達し得る値が上部範囲に集まる場合、標的配列は：
第１のプローブが野生型を検出できて、一方第２のプローブが突然変異体の遺伝子型を検出できる場合は、ホモ接合野生型であり、
第２のプローブが野生型を検出できて、一方第１のプローブが突然変異体の遺伝子型を検出できる場合は、ホモ接合突然変異体の遺伝子型である、請求項１１に記載の方法。
ＳＮＰは３対立遺伝子ＳＮＰである、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
プローブが分子ビーコンを含む、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
標的核酸配列がＤＮＡである、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
増幅反応が核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）法である、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。