JP2010512757A - リポキシゲナーゼの抽出および精製 - Google Patents
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Abstract
Description
−植物から水溶液中へリポキシゲナーゼを抽出して抽出物を形成する工程;
−該抽出物のpHをリポキシゲナーゼの等電点より低くし、溶液中にリポキシゲナーゼを保持しつつ、該抽出物から化合物を選択的に凝析あるいは凝集させ、酸性化抽出物を形成する工程;
−凝析あるいは凝集した化合物を該酸性化抽出物から分離し、リポキシゲナーゼの精製抽出物を提供する工程。
−植物から水溶液中へリポキシゲナーゼを抽出して抽出物を形成する工程;
−該抽出物のpHをリポキシゲナーゼの等電点より低くし、溶液中にリポキシゲナーゼを保持しつつ、該抽出物から化合物を選択的に凝析させ、酸性化抽出物を形成する工程;
−凝析させた化合物を該酸性化抽出物から分離し、リポキシゲナーゼの精製抽出物を提供する工程、
を含む方法が提供される。
次いで、抽出物をさらに処理してリポキシゲナーゼを濃縮し、溶媒を選択的に精製抽出物から除去し、精製抽出物中のリポキシゲナーゼの濃度を高めてもよい。これは、凝析および再溶解、クロマトグラフィなどを含む様々なアプローチにより行うことができる。しかしながら、本発明者は精密ろ過、イオン交換、および限外ろ過が特に有用なアプローチであることを見出した。
酵素アッセイ:
Sudaらにより記載されたメチレンブルー漂白法(1995)に基づく。
70mgのリノール酸(Sigma)および70mgのTween20を4mLのDW中でパスツールピペットを用いて均質化した。透明な溶液を得るために、0.55mLの0.5N NaOHを加え、DWを用いて溶液の全量を25mLとした。この基質溶液の1.5mlのアリコートをバイアルに入れ、N2ガスで覆い、使用時まで冷凍庫で保管した。
全脂酵素活性大豆粉を、0.1% w/vの界面活性剤(トリトン-X-100)を含むpH 9.0(0.1MトリスHCL)の1:5 w/v懸濁液として調製し、6時間処理した。この時点の酵素活性は45単位であることがわかった。
大豆の浸漬
100kgのCowrie大豆をpH 9.0に調整した400Lの水に24時間浸漬させる。
大豆を最大24時間浸漬させた後、豆をそのバッファーから取り出す。次いで豆とバッファーを、1:4(豆:バッファー)の割合で、3L/minのバッファー流速でコロイドミルに供給する。抽出物に蓄積される熱を最小化するためには、コロイドミルへの安定した液体の流れが必要である。
粉砕した抽出物のpHは、植物材料からの抽出を最大化するためにpH 9.0に維持される(これはLOX1活性にとって至適pHでもある)。浸漬し柔らかくなった大豆抽出物は、該豆抽出物からのLOX1の抽出を向上させるためにさらに1時間このpHに維持される。
粗抽出物を、隔膜ポンプを用いて3層振動スクリーンに通す。
加熱のためのパラメータは55℃にセットされる。一度この温度が達成されたら、抽出物をこの温度に15分間維持し、次いで抽出物を1Mクエン酸を用いてpH 4.5に酸性化する。あるいは、加熱の前に公知量の作りたてのGDL溶液を抽出物に混合し、GDLがグルコン酸に変化することによるpHの低下をモニターしてもよい。
冷却した抽出物は、熱交換器を通すか、あるいは円錐タンクに移送して、大豆タンパク単離物を沈殿させるために、24時間冷却室で10℃未満に保持される。沈殿が生じた後、透明になった抽出物を上部から吸いだして取り出す。抽出物の下半分は40μmメッシュのスクリーンを通してろ過し、次いで遠心分離して不要なタンパク質を除去する。
抽出物を、0.45μm膜を通して精密ろ過し、透過物を回収する。
リポキシゲナーゼは、50mLlのカラム上で流速3mL/分の25mMトリス-HCL(pH 7.0)を用いるDEAEアニオン交換クロマトグラフィによって、0.5M塩化ナトリウムで溶出することで単離できる。
抽出物は、10kDa NMWCを用いて濃縮される(当初の量から10〜30倍濃縮される)。
Claims (10)
- 植物からリポキシゲナーゼを精製する方法であって、以下の工程:
−植物から水溶液中へリポキシゲナーゼを抽出して抽出物を形成する工程;
−該抽出物のpHをリポキシゲナーゼの等電点より低くし、溶液中にリポキシゲナーゼを保持しつつ、該抽出物から化合物を選択的に凝析させ、酸性化抽出物を形成する工程;
−凝析させた化合物を該酸性化抽出物から分離し、リポキシゲナーゼの精製抽出物を提供する工程
を含む前記方法。 - 抽出物を粉砕および水和された植物から形成し、水溶液が植物に浸透するのを促進させる、請求項1に記載の方法。
- 植物を粉砕する前に、植物を水溶液に浸して浸漬溶液を形成する、請求項2に記載の方法。
- 植物を浸漬溶液中で粉砕する、請求項3に記載の方法。
- 粉砕の前および後に溶液をアルカリ性のpHとし、リポキシゲナーゼの溶液への抽出を促進させる、請求項2に記載の方法。
- 溶液をろ過して、溶液から細胞物質を除去し抽出物を形成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 加熱し、および溶液のpHを下げ、溶液中の化合物をリポキシゲナーゼから分離して抽出物を形成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 55℃より高い温度で抽出物をろ過し、次いで酸性化抽出物を冷却し、凝析した化合物が抽出物から分離するのを促進させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 酸性化抽出物をアルカリ性のpHにして酵素の比活性を高めることを含む、請求項1に記載の方法。
- 精製抽出物から選択的に溶媒を除去し、精製抽出物中のリポキシゲナーゼの濃度を高めることを含む、請求項1に記載の方法。
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