CN118028411A - 一种工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法 - Google Patents

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张娟娟
于雁飞
李亚
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Abstract

本发明公开了一种工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，属于蛋白制备技术领域。该制备方法包括以下步骤：清洗、粉碎；加水匀浆并煮沸；加入木瓜蛋白酶酶解90‑120min，然后加入碱性蛋白酶酶解180‑210min；加热灭活；瞬时降温至50℃以下；加入核酸酶，先于50℃酶解10min，后于60‑65℃酶解120‑150min；灭活；离心；一次板框压滤除臭；二次板框压滤澄清；负压浓缩；瞬时喷雾干燥。本发明通过双酶酶解法，先用蛋白酶对蛋白质进行酶解，再用核酸酶对核酸进行酶解，制备得到了一款溶解性好、富含精氨酸、活性较高的鱼精水解蛋白粉，该鱼精水解蛋白粉同时还含有5'‑核苷酸、寡核苷酸等营养成分。

Description

一种工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种制备蛋白的方法，具体涉及一种工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，属于蛋白制备技术领域。
背景技术
鱼精蛋白是一种多聚阳离子碱性蛋白质，尤其是鲑鱼和鲱鱼等，其鱼精蛋白为单鱼精蛋白，其碱性氨基酸仅含精氨酸，且精氨酸含量在总氨基酸中百分含量达到66％。精氨酸是碱性氨基酸，为条件性必须氨基酸，在应激状态下和特殊生长阶段，它是必需氨基酸，体内合成的精氨酸不能满足生理代谢需要。精氨酸是机体合成NO的唯一底物，具有改善心脑血管疾病、改善性欲、提高机体免疫力等多种独特的生理作用，同时精氨酸增加有利于组织合成蛋白质，促进肌肉合成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)前处理：将成熟的鲱鱼鱼精清洗、粉碎，得到鱼精浆液；
(2)蒸煮：将鱼精浆液加水匀浆并煮沸，保持10min；
(3)蛋白质酶解：向蒸煮后的鱼精浆液中加入浆液重量3‰的木瓜蛋白酶，于55-60℃、pH 6.5-7.0的条件下酶解90-120min，然后再加入浆液重量3‰的碱性蛋白酶，于55-60℃、pH 8.0-9.0的条件下酶解180-210min；
(4)灭活：将酶解后的鱼精浆液加热灭活；
(5)瞬时降温：将灭活后的鱼精浆液瞬时降温至50℃以下；
(6)核酸酶解：向降温至50℃以下的鱼精浆液中加入浆液重量0.3％的核酸酶，先于50℃、pH 5.0-5.5的条件下酶解10min，然后于60-65℃酶解120-150min，得到鱼精水解蛋白料液；
(7)灭活：将酶解得到的鱼精水解蛋白料液加热灭活；
(8)离心：将灭活的鱼精水解蛋白料液用卧式沉降离心机离心，离心得到的离心液再用二相碟片式离心机离心；
(9)一次板框压滤：用装有ZX616#硅藻土助滤剂且滤布上附有一层活性炭纤维的板框压滤机对离心后的鱼精水解蛋白料液进行压滤，得到一次板压滤液；
(10)二次板框压滤：用装有SX821#硅藻土助滤剂且滤布上附有一层活性炭纤维的板框压滤机对一次板压滤液进行压滤，得到二次板压滤液；
(11)负压浓缩：用单效蒸发器对二次板压滤液进行负压浓缩，去除90％以上的水分，得到浓缩料液；
(12)瞬时喷雾干燥：将浓缩料液快速升温到90℃，用干燥塔进行瞬时喷雾干燥，形成干粉，即鱼精水解蛋白粉。
优选的，在步骤(3)中，碱性蛋白酶选用的是AP-200A。
优选的，在步骤(5)中，瞬时降温采用碎冰，向鱼精浆液中加入相同体积的碎冰。
优选的，在步骤(8)中，将卧式沉降离心机的转速调节至2500r/min，生产能力调节至5m3/h；将二相碟片式离心机的转速调节至6000r/min，生产能力调节至1.5m3/h。
优选的，在步骤(9)中，ZX616#硅藻土助滤剂在滤室内以滤饼的形式存在，滤饼厚度为3mm。
优选的，在步骤(10)中，SX821#硅藻土助滤剂在滤室内以滤饼的形式存在，滤饼厚度为3mm。
优选的，在步骤(11)中，进行负压浓缩时，过程控制温度为50℃，负压0.1MPa，每20min排放蒸发冷凝水。
优选的，在步骤(12)中，进行瞬时喷雾干燥时，干燥温度为140-155℃。
本发明的有益之处在于：本发明通过双酶酶解法，先用蛋白酶对蛋白质进行酶解，再用核酸酶对核酸进行酶解，制备得到了一款溶解性好、富含精氨酸、活性较高的鱼精水解蛋白粉，该鱼精水解蛋白粉同时还含有5'-核苷酸、寡核苷酸等营养成分。
附图说明
图1是17种氨基酸标准品测定谱图；
图2是鲱鱼鱼精总氨基酸测定谱图；
图3是本发明制备得到的鱼精水解蛋白粉的总氨基酸测定谱图；
图4是本发明制备得到的鱼精水解蛋白粉的分子量分布图谱。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、制备鱼精水解蛋白
1、筛选原料
在精子细胞成熟过程中，细胞中初始含量较多的组蛋白逐渐转化成中间蛋白，继而转化成精蛋白，因此，同一鱼种的精巢组织成熟度越高，其鱼精蛋白含量越高。
鱼精蛋白是一种多聚阳离子碱性蛋白质，按成分当中精氨酸、赖氨酸、组氨酸三种碱性氨基酸的种类数不同常被分为三大类：一是只含精氨酸一种碱性氨基酸的单鱼精蛋白(典型代表是鲑鱼鱼精蛋白和鲱鱼鱼精蛋白)，其精氨酸在总氨基酸中百分含量达到66％；二是含精氨酸和赖氨酸或组氨酸两种碱性氨基酸的双鱼精蛋白(典型代表是鲤鱼鱼精蛋白)；三是同时含精氨酸、赖氨酸和组氨酸三种碱性氨基酸的三鱼精蛋白(典型代表是鲢鱼鱼精蛋白和鲟鱼鱼精蛋白)。因此，制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白，宜选用成熟的单鱼精蛋白原料，由于鲑鱼鱼精脂肪含量较高，所以成熟的鲱鱼鱼精是最佳的单鱼精蛋白原料。
经检测，成熟的鲱鱼鱼精中的氨基酸组成见图2和表1。
表1成熟的鲱鱼鱼精中各氨基酸所占总氨基酸的百分含量
序号 氨基酸名称 含量 序号 氨基酸名称 含量
1 天冬氨酸 6.66％ 10 蛋氨酸 0.04％
2 谷氨酸 8.17％ 11 半胱氨酸 0.06％
3 丝氨酸 4.98％ 12 异亮氨酸 3.70％
4 精氨酸 30.70％ 13 亮氨酸 6.10％
5 甘氨酸 7.39％ 14 苯丙氨酸 3.38％
6 苏氨酸 4.21％ 15 组氨酸 1.92％
7 脯氨酸 4.84％ 16 赖氨酸 5.14％
8 丙氨酸 5.65％ 17 酪氨酸 1.93％
9 缬氨酸 5.11％ 总氨基酸 100％
可见，成熟的鲱鱼鱼精富含精氨酸，精氨酸占总氨基酸含量的30.70％。
2、前处理
将原料成熟的鲱鱼鱼精，先用纯水清洗2次，然后用斩拌机粉碎，得到鱼精浆液。
3、蒸煮
将粉碎好的鱼精浆液倒入蒸煮罐中，加3倍体积的纯水，匀浆后加热煮沸，煮沸后保持10min。
蒸煮是为了破碎细胞。鱼精的精液中除了含有大量的精子细胞、精母细胞和精原细胞等生殖细胞外，还含有比这些生殖细胞更多的滋养细胞，这些滋养细胞用于向生殖细胞提供营养。因此，鱼精中营养成分的提取首先需要破碎细胞膜、核膜等，充分释放出营养物质。
4、蛋白质酶解
将蒸煮罐中的鱼精浆液泵入到酶解罐中，调节酶解罐pH 6.5-7.0(在本实施例中，将pH调节至7.0)，温度为55-60℃(在本实施例中，将温度调节至58℃)，加入浆液重量3‰的木瓜蛋白酶(800000U/g，安琪酵母股份有限公司)，酶解90-120min(在本实施例中，酶解100min)，然后调节酶解罐pH 8.0-9.0(在本实施例中，将pH调节至8.5)，加入浆料重量3‰的碱性蛋白酶(AP-200A，400000U/g，安琪酵母股份有限公司)，酶解180-210min(在本实施例中，酶解180min)。
鱼精蛋白是一种小而简单的球形碱性蛋白质，其分子量小，通常在10000以下，一般由30个左右的氨基酸组成，但其溶解性不是很好。鲱鱼鱼精中精氨酸含量较高，尤其是鱼精蛋白，其精氨酸含量达到66％，木瓜蛋白酶可水解蛋白质和多肽中精氨酸的羧基端，通过木瓜蛋白酶的适度酶解，溶解性差的鱼精蛋白转化为水溶性小分子肽。另外，鱼精中还含有大量的滋养细胞，木瓜蛋白酶的蛋白回收率和水解度相对较低，搭配具有广泛切割位点的碱性蛋白酶AP-200A，能更好的提高鱼精中的蛋白回收率和水解度。
5、灭活
调节酶解罐的温度至90-95℃(在本实施例中，将温度调节至90℃)，保持20min。
加热的目的一方面是对蛋白酶进行灭活，另一方面是为了使DNA变性，进而使核酸酶能高效、专一的作用于RNA或DNA单链中的磷酸二酯键，因此核酸的酶解需要先将DNA变性。DNA的变性特点是爆发式的，通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为DNA熔点(Tm)，DNA的Tm值一般在82-95℃之间，灭活的同时可以使DNA的双螺旋结构发生解体，两条链分开形成无规则线团。
6、瞬时降温
将蛋白酶酶解后的鱼精浆液加热灭活后，向酶解罐中加入相同体积的碎冰，使鱼精浆液瞬时降温至50℃以下。
变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，称为DNA复性。热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，称为退火，退火温度＝Tm-25℃；骤然冷却时不可能复性，因此料液灭活后，要立刻加入碎冰使其冷却，以防止复性。
7、核酸酶解
调节酶解罐内温度50℃，pH 5.0-5.5(在本实施例中，将pH调节至5.2)，加入浆液重量0.3％的核酸酶(5’-磷酸二酯酶，50000U/g，南宁东恒华道生物科技有限责任公司)，酶解10min，然后再调节酶解罐内温度65-70℃，酶解60-90min(在本实施例中，将温度调节至70℃，酶解60min)，酶解过程持续搅拌。
DNA为白色纤维状固体，微溶于水。核酸酶能高效、专一的作用于DNA单链中的3'-碳原子上的羟基与磷酸形成的磷酸二酯键得到5'-核苷酸。5'-核苷酸具有很好的营养保健作用，生物体内游离存在的核苷酸多是5'-核苷酸。经过适度酶解后，微溶于水的DNA转变成水溶性的5'-核苷酸和寡核苷酸。核苷酸可直接被肠黏膜吸收，肠黏膜细胞可将核苷酸运输到其他细胞。核酸酶的最适温度为70℃，考虑到热变性的DNA发生复性，先于50℃酶解10min左右，随后调节酶解罐的温度至65-70℃继续酶解。
8、灭活
将酶解得到的鱼精水解蛋白料液加热至85-90℃(在本实施例中，加热至90℃)，保持10min。
9、离心
将灭活后的鱼精水解蛋白料液泵入卧式沉降离心机(在本实施例中，采用的是由江苏巨能机械有限公司生产的LW250C卧式沉降离心机)内，调节转速至2500r/min，调节生产能力至5m3/h。将离心得到的离心液泵入二相碟片式离心机(在本实施例中，采用的是由江苏巨能机械有限公司生产的DHYY360二相碟片式离心机)内，调节转速至6000r/min，调节生产能力至1.5m3/h。
分离效果的好坏与物料中的固含量、固液相密度差、物料黏度等息息相关，要充分重视离心机的选型。卧式沉降离心机适合分离含固相物浓度范围为2-40％的悬浮液，但其转数小，一般小于3000r/min，分离出来的液相仍含量少量固形物。碟片式离心机转速可达到8000r/min，经碟片式离心机分离后的清液澄清透明，但是它主要用于含有少量固相的悬浮液的澄清，有二相(固、液)碟片式离心机和三相(固、液、油)碟片式离心机两种。
鱼精水解蛋白料液，其固相物浓度约5％左右、固液相密度差大、物料黏度小、油脂少，宜先用卧式沉降离心机进行粗分离，将大量固相残渣除去，再用二相碟片式离心机进行含有少量固相料液的澄清。卧式沉降离心机和二相碟片式离心机先后组合使用，得到的料液比较澄清，大大减轻了后续板框压滤工序的负担。
9、一次板框压滤(去腥臭)
在板框的滤布上附一层活性炭纤维，将ZX616#硅藻土助滤剂(胶州市新星助滤厂)和纯水按体积比1：10的比例在配浆罐内配成悬浮浆液，将配好的悬浮浆液泵入板框压滤机内，板框压滤机利用滤布两边的压力差，迫使悬浮浆液中的绝大部分水透过滤布流出机体外，而ZX616#硅藻土助滤剂被阻隔在滤室内形成滤饼，滤饼厚度为3mm。将离心后的鱼精水解蛋白料液泵入装有ZX616#硅藻土助滤剂滤饼的板框压滤机内进行压滤，固体颗粒因粒径大于过滤介质的孔隙而被截留在滤室内，并形成滤饼层，液相则透过滤饼和过滤介质由出液孔排出机外，得到一次板压滤液，压滤过程中的压力为0.2MPa-0.4MPa。随着滤饼厚度的增加，过滤压力会逐渐增大，直到滤室内充满滤饼。
鱼精的腥味极大，己醛、庚醛和壬醛这3种物质通常呈现出青草味和鱼腥味，并带有油、蜡的特征性气味，是鱼精产生腥味的重要原因。活性炭纤维微孔丰富、外表面积大、易于与吸附质接触、吸附速度快，且对己醛、庚醛和壬醛等醛类挥发性有机物质具有很好的吸附作用；同时活性炭纤维扩散阻力小，且当活性炭纤维吸附达到饱和状态以后，可以通过热蒸汽进行脱附再生，节约生产成本。ZX616#硅藻土助滤剂，具有中粗的微孔结构，不仅能使鱼精水解蛋白料液获得较好的流速比，并且能滤除微细的悬浮物。
10、二次板框压滤(澄清滤液)
将一次板压滤液再次泵入板框压滤机内进行二次压滤，得到二次板压滤液，此次的板框压滤机上装有SX821#硅藻土助滤剂(胶州市新星助滤厂)，此型号硅藻土助滤剂具有较细的微孔结构，可以使滤液澄清透明。二次板框压滤的方法与一次板框压滤的方法相同，不再赘述。
11、负压浓缩
将二次板压滤液泵入单效蒸发器内，负压浓缩，过程控制温度为50℃，负压0.1MPa，每20min排放蒸发冷凝水，去除90％以上的水分，得到浓缩料液。
12、瞬时喷雾干燥
将浓缩料液快速升温到90℃，然后泵入干燥塔中进行瞬时喷雾干燥，干燥温度为140-155℃(在本实施例中，干燥温度为150℃)，形成干粉，即鱼精水解蛋白粉。
二、检测鱼精水解蛋白粉的理化性质
1、溶解性
将2.0g鱼精水解蛋白粉加入到100mL水中，搅拌均匀，得到浓度为2g/100mL的鱼精水解蛋白水溶液。
经观察，该水溶液澄清透明，鱼精水解蛋白粉的溶解性很好。
2、水分、灰分、氨基酸含量
经检测，该鱼精水解蛋白粉的水分含量为5.6％；灰分含量为6.9％；总氨基酸测定谱图如图3所示。
经计算，以干基计，该鱼精水解蛋白粉总氨基酸含量为56.84g/100g(见表2)，其中，精氨酸含量达到了18.57g/100g，精氨酸占总氨基酸含量的32.68％(见表3)。
表2每100g鱼精水解蛋白粉中各氨基酸的含量(以干基计)
表3鱼精水解蛋白粉中各氨基酸所占总氨基酸的百分含量
序号 氨基酸名称 含量 序号 氨基酸名称 含量
1 天冬氨酸 6.63％ 10 蛋氨酸 0.27％
2 谷氨酸 8.48％ 11 半胱氨酸 0.02％
3 丝氨酸 5.16％ 12 异亮氨酸 3.35％
4 精氨酸 32.68％ 13 亮氨酸 5.33％
5 甘氨酸 7.96％ 14 苯丙氨酸 2.84％
6 苏氨酸 4.14％ 15 组氨酸 1.74％
7 脯氨酸 4.98％ 16 赖氨酸 4.78％
8 丙氨酸 5.48％ 17 酪氨酸 1.22％
9 缬氨酸 4.93％ 总氨基酸 100％
3、分子量分布
经检测，该鱼精水解蛋白粉的分子量分布图谱如图4所示。经计算，该鱼精水解蛋白粉的分子量分布见表4。
表4鱼精水解蛋白粉的分子量分布
依据分子量标品回归直线方程：Y＝-0.23775X+7.03636，R2＝0.9897，经计算，本发明制备得到的鱼精水解蛋白粉的平均相对分子质量为637u，分子量适中，活性较高。
综上，采用本发明提供的工业化制备方法，制备得到了溶解性好、富含精氨酸且活性较高的鱼精水解蛋白粉。
需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)前处理：将成熟的鲱鱼鱼精清洗、粉碎，得到鱼精浆液；
(2)蒸煮：将鱼精浆液加水匀浆并煮沸，保持10min；
(3)蛋白质酶解：向蒸煮后的鱼精浆液中加入浆液重量3‰的木瓜蛋白酶，于55-60℃、pH 6.5-7.0的条件下酶解90-120min，然后再加入浆液重量3‰的碱性蛋白酶，于55-60℃、pH 8.0-9.0的条件下酶解180-210min；
(4)灭活：将酶解后的鱼精浆液加热灭活；
(5)瞬时降温：将灭活后的鱼精浆液瞬时降温至50℃以下；
(6)核酸酶解：向降温至50℃以下的鱼精浆液中加入浆液重量0.3％的核酸酶，先于50℃、pH 5.0-5.5的条件下酶解10min，然后于60-65℃酶解120-150min，得到鱼精水解蛋白料液；
(7)灭活：将酶解得到的鱼精水解蛋白料液加热灭活；
(8)离心：将灭活的鱼精水解蛋白料液用卧式沉降离心机离心，离心得到的离心液再用二相碟片式离心机离心；
(9)一次板框压滤：用装有ZX616#硅藻土助滤剂且滤布上附有一层活性炭纤维的板框压滤机对离心后的鱼精水解蛋白料液进行压滤，得到一次板压滤液；
(10)二次板框压滤：用装有SX821#硅藻土助滤剂且滤布上附有一层活性炭纤维的板框压滤机对一次板压滤液进行压滤，得到二次板压滤液；
(11)负压浓缩：用单效蒸发器对二次板压滤液进行负压浓缩，去除90％以上的水分，得到浓缩料液；
(12)瞬时喷雾干燥：将浓缩料液快速升温到90℃，用干燥塔进行瞬时喷雾干燥，形成干粉，即鱼精水解蛋白粉。
2.根据权利要求1所述的工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，其特征在于，在步骤(3)中，碱性蛋白酶选用的是AP-200A。
3.根据权利要求1所述的工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，其特征在于，在步骤(5)中，瞬时降温采用碎冰，向鱼精浆液中加入相同体积的碎冰。
4.根据权利要求1所述的工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，其特征在于，在步骤(8)中，将卧式沉降离心机的转速调节至2500r/min，生产能力调节至5m3/h。
5.根据权利要求1所述的工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，其特征在于，在步骤(8)中，将二相碟片式离心机的转速调节至6000r/min，生产能力调节至1.5m3/h。
6.根据权利要求1所述的工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，其特征在于，在步骤(9)中，ZX616#硅藻土助滤剂在滤室内以滤饼的形式存在，滤饼厚度为3mm。
7.根据权利要求1所述的工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，其特征在于，在步骤(10)中，SX821#硅藻土助滤剂在滤室内以滤饼的形式存在，滤饼厚度为3mm。
8.根据权利要求1所述的工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，其特征在于，在步骤(11)中，进行负压浓缩时，过程控制温度为50℃，负压0.1MPa，每20min排放蒸发冷凝水。
9.根据权利要求1所述的工业化制备富含精氨酸的鱼精水解蛋白的方法，其特征在于，在步骤(12)中，进行瞬时喷雾干燥时，干燥温度为140-155℃。
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