CN117286135A - 酵母核酸提取物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种酵母核酸提取物及其制备方法。制备方法包括如下步骤：将酵母配制成酵母悬液，混合所述酵母悬液和自溶促进剂，进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物；对所述自溶热提取产物进行均质破壁处理，制备均质破壁产物；以及向混合所述均质破壁产物和蛋白酶进行酶解，制备酵母核酸提取物。上述方法可以大大提高酵母核酸的收率和纯度，而且成本低、易操作、污染小，非常适合于大规模的工业生产应用。
Description
技术领域
本申请涉及酵母核酸制备技术领域，特别是涉及一种酵母核酸提取物及其制备方法。
背景技术
酵母细胞中的核酸含量约为3％～15％，核酸含量丰富，是一种非常好的核酸源，酵母核酸及其核酸分解产物腺苷酸、鸟苷酸、尿苷酸、胞苷酸等已经广泛应用于医药、保健品、农业、食品等领域，市场前景广阔。
酵母核酸的工业生产和应用主要包括两种，一是通过酶解方式，水解酵母中的核酸，生产得到高核苷酸型酵母抽提物，并将其作为增鲜剂和风味强化剂应用到各种食品中；二是通过提取方式，将酵母核酸从细胞中提取出来，实现酵母核酸定向溶出，得到酵母核酸，后续进行深加工综合利用。
酵母核酸提取工艺中，稀碱法和浓盐法是目前工业化生产中常用的技术方法。稀碱法是用碱溶液裂解酵母细胞，使核酸释放到碱液中，后续用酸中和，再用乙醇沉淀酵母核酸或通过调节PH利用等电点沉淀获取酵母核酸。浓盐法则是用10％浓度的盐溶液改变细胞膜的通透性，使核酸从细胞内释放出来，后续通过沉降获得酵母核酸。利用稀碱法提取酵母核酸，虽然提取率相对较高，但容易混入较多的蛋白质导致酵母核酸的纯度较低，且在生产过程中会产生大量的碱液废水，从而增加后处理难度；浓盐法具有提取条件温和、成本较低等优点，但浓盐法所用盐量过高，从而导致酵母核酸的盐分含量高，影响了酵母核酸的产品质量。因此，无论是稀碱法还是浓盐法提取酵母核酸均具有一定的技术局限性，有待改进。
近年来，研究人员逐步转向利用酶解技术进行酵母核酸的提取，例如一国内发明专利申请提供了一种酵母核酸的提取方法及其在生产富硒核酸中的应用，通过冷冻(-20℃)和加热(80℃)产生的温差对酵母细胞破壁，然后进行酶解，提取得到酵母核酸，该方法要求快速达到反应温度，但温差法的温度极差大，在工业化大量生产中难以实现，工艺耗时长，且温差过大产生的耗能也非常大。又例如国内另一发明专利申请提供了一种利用酵母提取高纯核酸的方法及其产品和应用，通过热提取和双酶解工艺提取酵母中的核酸，但该工艺需要对整个酵母菌体体系进行处理，酶用量大，工艺成本高。
发明内容
基于此，本申请有必要提供一种能够提高收率和纯度，且能够降低工艺成本、操作难度以及污染性的酵母核酸提取物及其制备方法。
本申请一实施例提供了一种酵母核酸提取物的制备方法，包括如下步骤：
将酵母配制成酵母悬液，混合所述酵母悬液中和自溶促进剂，进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物；
对所述自溶热提取产物进行均质破壁处理，制备均质破壁产物；以及混合所述均质破壁产物和蛋白酶进行酶解，制备酵母核酸提取物。
在其中一个实施例中，所述酵母在所述酵母悬液中的质量百分比浓度为10％～25％。
在其中一个实施例中，所述酵母悬液的pH值为7.0～8.5。
在其中一个实施例中，所述自溶促进剂的用量为所述酵母的折干质量的1％～2％。
在其中一个实施例中，所述自溶促进剂包括乙酸乙酯、食盐以及乙醇中的一种或多种。
在其中一个实施例中，自溶热提取处理的条件包括：在90℃～100℃条件下保温1h～5h。
在其中一个实施例中，在进行均质破壁处理前先将所述自溶热提取产物降温至40℃～65℃。
在其中一个实施例中，进行均质破壁处理的条件包括：均质压力为50MPa～100MPa，均质次数为1次～3次。
在其中一个实施例中，进行酶解的过程中采用的蛋白酶包括中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
在其中一个实施例中，所述蛋白酶中每种酶的用量独立地为所述酵母的折干质量的1‰～5‰。
在其中一个实施例中，酶解的条件包括：酶解温度为55℃～70℃，酶解pH值为6.5～8.0，酶解时间为2h～6h。
在其中一个实施例中，制备所述酵母核酸提取物的步骤还包括：
酶解结束，进行灭酶处理，制备酶解产物；
对所述酶解产物进行分离，收集酶解清液；
对所述酶解清液进行纯化，收集纯化后的酶解清液；以及
对所述纯化后的酶解清液进行沉降，收集沉降物。
在其中一个实施例中，灭酶处理的条件包括：温度为85℃～95℃，保温时间为10min～30min。
在其中一个实施例中，对所述酶解产物进行分离的方式为离心，离心的条件包括：转速为4000rpm～13000rpm，时间为5min～30min。
在其中一个实施例中，进行纯化的步骤包括：对所述酶解清液依次进行微滤处理和超滤处理。
在其中一个实施例中，进行沉降的条件包括：调节所述纯化后的酶解清液的pH值至1.5～3.5。
本申请一实施例还提供了一种酵母核酸提取物，由上述任一实施例中所述的制备方法制备得到。
本申请提供的制备方法首先向酵母悬液中加入自溶促进剂后进行自溶热提取处理，使酵母失活并破胞，促进细胞内物质溶出，制备得到自溶热提取产物；然后对自溶热提取产物进行均质破壁处理，使细胞壁彻底破碎，打开酵母细胞内外通道，以便酵母细胞内物质高效溶出，制备得到均质破壁产物；再通过蛋白酶对均质破壁产物进行酶解，使均质破壁产物中的蛋白质水解为小分子，实现蛋白与核酸的分离，得到酵母核酸提取物。上述方法可以大大提高酵母核酸的收率和纯度，而且成本低、易操作、污染小，非常适合于大规模的工业生产应用。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将结合实施例对本申请进行更全面的描述。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本申请所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本申请所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
研究发现，若希望对酵母细胞内中的核酸进行提取，首先必须要对酵母细胞进行破壁处理，但酵母细胞壁较厚实、结构致密，在进行核酸提取过程中，如何进行破壁是关键。传统的酵母细胞破壁技术方法较为单一且缺陷较大，难以提高细胞内容物质的溶出，例如传统的均质破壁法中，单次均质无法达到有效破壁效果，多次高压均质又会造成提取液中杂质偏多影响产品纯度；传统的酶法破壁酶用量大，成本较高，且酶解效率低；传统的温差法破壁由于在工业大量生产中难以实现快速升降温存在技术壁垒，且耗时长，耗能大；传统的浓盐法、稀碱法需要添加大量化学试剂，污染大。
为克服以上技术局限，本申请一实施例提供了一种酵母核酸提取物的制备方法，包括如下步骤S110～步骤S130。
步骤S110：将酵母配制成酵母悬液，混合酵母悬液和自溶促进剂，进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物。
步骤S120：对自溶热提取产物进行均质破壁处理，制备均质破壁产物。
步骤S130：向均质破壁产物中添加蛋白酶进行酶解，制备酵母核酸提取物。
本申请提供的制备方法首先向酵母悬液中加入自溶促进剂后进行自溶热提取处理，使酵母失活并破胞，促进细胞内物质溶出，制备得到自溶热提取产物；然后对自溶热提取产物进行均质破壁处理，使细胞壁彻底破碎，打开酵母细胞内外通道，以便酵母细胞内物质高效溶出，制备得到均质破壁产物；再通过蛋白酶对均质破壁产物进行酶解，使均质破壁产物中的蛋白质水解为小分子，实现蛋白与核酸的分离，得到酵母核酸提取物。上述方法可以大大提高核酸的收率和纯度，而且成本低、易操作、污染小，非常适合于大规模的工业生产应用。
具体地：
步骤S110：将酵母配制成酵母悬液，混合酵母悬液和自溶促进剂，进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物。
通过步骤S110，在热提取时，由于高温，酵母先一步失活，蛋白质变性，细胞壁结构改变，随后细胞质膜破裂，细胞通透性提高，促进了胞内物质的溶出，通过添加自溶促进剂可以进一步促进细胞壁的水解。
在一些实施例中，酵母在酵母悬液中的质量百分比浓度为10％～25％。酵母在酵母悬液的浓度会影响黏度，浓度越大，黏度越大，控制酵母浓度在适宜范围内，可以确保在热提取以及均质的过程中具有较好的提取和溶出效果，且效率更高。可以理解地，酵母在酵母悬液中的质量百分比浓度例如可以但不限于是10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％等等。
在一些实施例中，酵母悬液的pH值为7.0～8.5。酵母细胞壁从外到内分为甘露聚糖层、蛋白质层及β-葡聚糖层的三层组合结构，甘露聚糖蛋白和葡聚糖蛋白不易溶于酸性环境而更易溶于碱性环境，而在高碱性条件下核酸会发生水解从而降低核酸提取率，同时蛋白质更容易被释放出来从而影响核酸纯度，因此，控制酵母悬液的pH值为7.0～8.5，在这一pH条件下可以有效水解酵母细胞壁中的可溶性甘露聚糖和葡聚糖，同时减少酵母核酸的损失。可以理解地，酵母悬液的pH值例如可以但不限于为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5等等。
在一些实施例中，自溶促进剂的用量为酵母的折干质量的1％～2％。在这一范围内，自溶促进剂能够起到良好的促进酵母细胞壁水解、促进胞内物质溶出的效果。可以理解地，自溶促进剂的用量例如可以但不限于为酵母的折干质量的1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％等等。
在一些实施例中，自溶促进剂包括乙酸乙酯、食盐以及乙醇中的一种或多种。适宜在酸性条件下促进细胞壁的水解的自溶促进剂不利于核酸的提取，因此，选用适宜在碱性条件下进行水解的自溶促进剂可以有效促进细胞壁的水解且不会造成核酸损失。优选地，自溶促进剂为乙酸乙酯，以利于维持热反应碱性环境。
在一些实施例中，自溶热提取处理的条件包括：在90℃～100℃条件下保温1h～5h。在这一温度条件下，温度足够高温可以使酵母灭活，这一过程中，酵母内自身的核酸酶等物质也会失活，可以避免酵母自溶酶解时，部分核酸水解为核苷酸，从而造成核酸损失，与此同时，在这一温度条件下，还会使蛋白质变性，细胞壁结构改变，细胞质膜破裂，细胞通透性提高，胞内物质更快溶出。若温度过低，胞内灭活不彻底，且热提取效率高，若温度过高，易产生美拉德反应加深颜色及产生焦糊味影响产品外观及感官。
步骤S120：对自溶热提取产物进行均质破壁处理，制备均质破壁产物。
通过步骤S110进行自溶热提取处理之后，细胞通透性增大，部分内容物溶出，但酵母细胞可能仍维持着一定的完整性，不少核酸会残留在细胞内，溶出受阻无法收集，并随着细胞壁经离心分离后损失，从而降低提取率，因此需要进一步对细胞进行破壁处理，使酵母细胞彻底破碎，使酵母内的核酸尽可能溶出。通过均质破壁处理，在后续酶解步骤中，酶与底物间的空间位阻能够最大程度的被消除，酶与底物接触作用位点增加，可以减少酶制剂用量，控制生产成本，提高后续酶解效率。
在一些实施例中，在进行均质破壁处理前先将自溶热提取产物降温至40℃～65℃。在这一温度下更适宜进行均质破壁处理，具有较好的均质效果，且能避免对机器造成损伤。可以理解地，例如可以但不限于先将自溶热提取产物降温至40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃等等。
在一些实施例中，进行均质破壁处理的条件包括：均质压力为50MPa～100MPa，均质次数为1次～3次。在高压均质条件下，通过对流撞击、高速剪切等物理作用，可以达到破碎细胞的目的，使细胞壁结构被破坏，胞内物质尽可能被释放出来。控制均质压力为50MPa～100MPa，这一压力范围内对细胞破碎效果较好，且对设备损伤、能耗较小。通过控制适宜的均质次数，使酵母细胞破碎地更加彻底，且能够有效控制细胞内其他物质的大量释放，避免由于杂质过多影响产品纯度的问题，也能降低后续处理的工艺难度。可以理解地，均质压力例如可以但不限于为50MPa、55MPa、60MPa、65MPa、70MPa、75MPa、80MPa、85MPa、90MPa、95MPa、100MPa等等。均质次数例如可以但不限于为1次、2次、3次等等。
步骤S130：混合均质破壁产物和蛋白酶进行酶解，制备酵母核酸提取物。
经步骤S110和步骤S120之后，酵母细胞壁破碎，细胞内的物质大量溶出至细胞壁外部的悬液体系中，其中也包括核蛋白。在步骤S130中，通过添加蛋白酶进行酶解，可以使核蛋白中的蛋白质被水解为小分子，而核酸则避免被水解，因此，可以实现蛋白与核酸的分离，得到酵母核酸提取物。
在一些实施例中，进行酶解的过程中采用的蛋白酶包括中性蛋白酶和碱性蛋白酶。中性蛋白酶来自于枯草芽孢杆菌，中性蛋白酶的酶活力为10万U/g以上，优选50-70万U/g。碱性蛋白酶来自于枯草芽孢杆菌，碱性蛋白酶的酶活力为10万U/g以上，优选50-70万U/g。可以理解地，在本申请中的中性蛋白酶和碱性蛋白酶均为常规市售酶，产品符合《中国食品工业用酶制剂安全国家标准》，酶活力符合要求即可，对具体的厂家来源无限制。
在一些实施例中，蛋白酶中每种酶的用量独立地为酵母的折干质量的1‰～5‰。在这一范围内，每种蛋白酶均具有较高的酶解效率，可能尽可能实现蛋白与核酸的分离，提高核酸提取率。可以理解地，每种蛋白酶的用量例如可以但不限于为酵母的折干质量的1‰、2‰、3‰、4‰、5‰等等。优选地，中性蛋白酶与碱性蛋白酶的质量比为(1-5):(1-5)。
在一些实施例中，酶解的条件包括：酶解温度为55℃～70℃，酶解pH值为6.5～8.0，酶解时间为2h～6h。在上述酶解条件下，蛋白酶具有较高的酶活性，酶解效果好，蛋白质酶解充分，有利于提高酵母核酸的收率和纯度。可以理解地，酶解温度例如可以但不限于为55℃、60℃、65℃、70℃等等。可以理解地，酶解pH例如可以但不限于为6.5、7.0、7.5、8.0等等。可以理解地，酶解时间例如可以但不限于为2h、3h、4h、5h、6h等等。
在一些实施例中，制备酵母核酸提取物的步骤S130还包括步骤S131～步骤S134。
步骤S131：酶解结束，进行灭酶处理，制备酶解产物。
在一些实施例中，灭酶处理的条件包括：温度为85℃～95℃，保温时间为10min～30min。可以理解地，灭酶的温度例如可以但不限于为85℃、90℃、95℃等等，保温时间例如可以但不限于为10min、20min、30min等等。
步骤S132：对酶解产物进行分离，收集酶解清液。
在一些实施例中，对酶解产物进行分离的方式为离心。
进一步地，离心的条件包括：转速为4000rpm～13000rpm，时间为5min～30min。
可以理解地，也可以采用其他的方式进行分离。可以理解地，分离方式为离心时，也可以采用其他离心条件，本申请中不作特别限定，只要能够收集得到酶解清液即可。
步骤S133：对酶解清液进行纯化，收集纯化后的酶解清液。
在一些实施例中，进行纯化的步骤包括：对酶解清液依次进行微滤处理和超滤处理。
通过微滤处理可以去除酶解清液中的不溶物，减少杂质，有利于提高酵母核酸的提取纯度。进一步地，微滤采用的过滤膜例如可以但不限于为0.22μm的卷式膜。
通过超滤处理可以将酶解清液中的可溶性固形物按分子量进行分离，实现核酸富集，其超滤未透过液即为富集的核酸提取液。进一步地，超滤采用的过滤膜例如可以但不限于为分子量为5KDa～30KDa的卷式膜。
步骤S134：对纯化后的酶解清液进行沉降，收集沉降物。
在一些实施例中，进行沉降的条件包括：调节纯化后的酶解清液的pH值至1.5～3.5。将pH值调至上述范围，可以达到酵母核酸的等电点，从而沉降形成沉降物，即得酵母核酸。
进一步地，pH调节剂例如可以但不限于为浓盐酸。
进一步地，还可以包括对沉降物进行洗涤和干燥的步骤。洗涤剂例如可以为乙醇，酵母核酸不溶于乙醇，而其他脂溶性物质溶于乙醇，利用这一特性可以有效除去其他脂溶性杂质，提高酵母核酸提取物的纯度。进一步地，乙醇例如可以但不限于为体积分数为90％～98％(V/V)的乙醇。
本申请一实施例还提供了一种酵母核酸提取物，由上述任一实施例中的制备方法制备得到。
本申请通过自溶热提取处理与均质破壁处理技术结合，大大提高了酵母细胞破壁率，促使酵母内容物质高效溶出，进一步地，通过蛋白酶酶解提取液中的核蛋白，分离蛋白与核酸，后续再通过分离、膜纯化、沉降等工艺，最后得到具有高收率和高纯度的酵母核酸提取物。本申请所提供的方法破壁速度快，效果佳，酶解前进行了有效地细胞质壁分离处理，消除了细胞壁及细胞膜的空间位阻，促使后续酶解反应快速进行，使酵母核酸提取物的收率及纯度均得到高效提高，本申请利用溶胞破壁(自溶热提取处理)和机械破壁(均质破壁处理)相结合的复合破壁技术进行核酸提取，耗能小，技术工艺流程操作简单，处理量大，无需使用强碱浓盐，相比传统的采用碱溶或盐溶的提取工艺，本申请所提供的提取方法污染小，更安全环保，后续处理简单，能大大降低生产成本。
以下通过具体实施例对本申请的酵母核酸提取物及其制备方法作进一步详细的说明。以下实施例较为具体，可以理解地，在其他实施例中，不限于此。在以下具体实施例中，所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
中性蛋白酶：常规市售，酶活力为50万U/g；
碱性蛋白酶：常规市售，酶活力为50万U/g。
实施例1
一种酵母核酸提取物的制备方法：
(1)将酵母配制成质量百分比浓度为15％的酵母悬液，用氢氧化钠将酵母悬液的pH值调至7.0，向酵母悬液中加入占酵母折干质量1％的乙酸乙酯，在95℃条件下保温3h进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物。
(2)将步骤(1)制备得到的自溶热提取产物降温至40℃，然后通过高压均质机在50Mpa条件下对自溶热提取产物进行均质破壁处理，均质次数为2次，制备均质破壁产物。
(3)将步骤(2)制备得到的均质破壁产物的pH调节至6.5，向均质破壁产物中加入占酵母折干质量3‰的碱性蛋白酶和1‰的中性蛋白酶，在63℃条件下酶解2h，酶解结束，加热至85℃灭酶30min，制备酶解产物。
(4)对步骤(3)制备得到的酶解产物进行离心，收集酶解清液，离心的条件包括：转速为13000rpm，时间为5min。
(5)对步骤(4)收集得到的酶解清液采用0.22μm规格卷式膜进行微滤处理，去除微小不溶物，然后采用分子量15KDa的有机滤膜进行超滤处理，收集未透过液，得到纯化后的酶解清液。
(6)向步骤(5)得到的纯化后的酶解清液中加入浓盐酸，使纯化后的酶解清液的pH值调至2.5，收集沉降物，采用体积分数为95％的乙醇对沉降物进行洗涤，得到酵母核酸提取物。
实施例2
一种酵母核酸提取物的制备方法：
(1)将酵母配制成质量百分比浓度为10％的酵母悬液，用氢氧化钠将酵母悬液的pH值调至8.5，向酵母悬液中加入占酵母折干质量1.4％的乙酸乙酯，在90℃条件下保温5h进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物。
(2)将步骤(1)制备得到的自溶热提取产物降温至45℃，然后通过高压均质机在70Mpa条件下对自溶热提取产物进行均质破壁处理，均质次数为1次，制备均质破壁产物。
(3)将步骤(2)制备得到的均质破壁产物的pH调节至8.0，向均质破壁产物中加入占酵母折干质量1.5‰的碱性蛋白酶和3.5‰的中性蛋白酶，在55℃条件下酶解5h，酶解结束，加热至85℃灭酶20min，制备酶解产物。
(4)对步骤(3)制备得到的酶解产物进行离心，收集酶解清液，离心的条件包括：转速为4000rpm，时间为30min。
(5)对步骤(4)收集得到的酶解清液采用0.22μm规格卷式膜进行微滤处理，去除微小不溶物，然后采用分子量5KDa的有机滤膜进行超滤处理，收集未透过液，得到纯化后的酶解清液。
(6)向步骤(5)得到的纯化后的酶解清液中加入浓盐酸，使纯化后的酶解清液的pH值调至2，收集沉降物，采用体积分数为95％的乙醇对沉降物进行洗涤，得到酵母核酸提取物。
实施例3
一种酵母核酸提取物的制备方法：
(1)将酵母配制成质量百分比浓度为25％的酵母悬液，用氢氧化钠将酵母悬液的pH值调至7.3，向酵母悬液中加入占酵母折干质量1.6％的乙酸乙酯，在92℃条件下保温2h进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物。
(2)将步骤(1)制备得到的自溶热提取产物降温至50℃，然后通过高压均质机在80Mpa条件下对自溶热提取产物进行均质破壁处理，均质次数为3次，制备均质破壁产物。
(3)将步骤(2)制备得到的均质破壁产物的pH调节至7.3，向均质破壁产物中加入占酵母折干质量5‰的碱性蛋白酶和1‰的中性蛋白酶，在64℃条件下酶解5h，酶解结束，加热至85℃灭酶30min，制备酶解产物。
(4)对步骤(3)制备得到的酶解产物进行离心，收集酶解清液，离心的条件包括：转速为10000rpm，时间为15min。
(5)对步骤(4)收集得到的酶解清液采用0.22μm规格卷式膜进行微滤处理，去除微小不溶物，然后采用分子量10KDa的有机滤膜进行超滤处理，收集未透过液，得到纯化后的酶解清液。
(6)向步骤(5)得到的纯化后的酶解清液中加入浓盐酸，使纯化后的酶解清液的pH值调至2.5，收集沉降物，采用体积分数为95％的乙醇对沉降物进行洗涤，得到酵母核酸提取物。
实施例4
一种酵母核酸提取物的制备方法：
(1)将酵母配制成质量百分比浓度为19％的酵母悬液，用氢氧化钠将酵母悬液的pH值调至8.0，向酵母悬液中加入占酵母折干质量2％的乙酸乙酯，在100℃条件下保温1h进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物。
(2)将步骤(1)制备得到的自溶热提取产物降温至65℃，然后通过高压均质机在100Mpa条件下对自溶热提取产物进行均质破壁处理，均质次数为2次，制备均质破壁产物。
(3)将步骤(2)制备得到的均质破壁产物的pH调节至7.3，向均质破壁产物中加入占酵母折干质量5‰的碱性蛋白酶和5‰的中性蛋白酶，在70℃条件下酶解6h，酶解结束，加热至90℃灭酶15min，制备酶解产物。
(4)对步骤(3)制备得到的酶解产物进行离心，收集酶解清液，离心的条件包括：转速为8000rpm，时间为20min。
(5)对步骤(4)收集得到的酶解清液采用0.22μm规格卷式膜进行微滤处理，去除微小不溶物，然后采用分子量30KDa的有机滤膜进行超滤处理，收集未透过液，得到纯化后的酶解清液。
(6)向步骤(5)得到的纯化后的酶解清液中加入浓盐酸，使纯化后的酶解清液的pH值调至3，收集沉降物，采用体积分数为95％的乙醇对沉降物进行洗涤，得到酵母核酸提取物。
对比例1
一种酵母核酸提取物的制备方法：
(1)将酵母配制成质量百分比浓度为7％的酵母悬液，用氢氧化钠将酵母悬液的pH值调至6.0，在95℃条件下保温6h进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物。
(2)将步骤(1)制备得到的自溶热提取产物降温至45℃，然后通过高压均质机在40Mpa条件下对自溶热提取产物进行均质破壁处理，均质次数为1次，制备均质破壁产物。
(3)将步骤(2)制备得到的均质破壁产物的pH调节至6.5，向均质破壁产物中加入占酵母折干质量1‰的碱性蛋白酶和1‰的中性蛋白酶，在65℃条件下酶解4h，酶解结束，加热至85℃灭酶30min，制备酶解产物。
(4)对步骤(3)制备得到的酶解产物进行离心，收集酶解清液，离心的条件包括：转速为11000rpm，时间为5min。
(5)对步骤(4)收集得到的酶解清液采用0.22μm规格卷式膜进行微滤处理，去除微小不溶物，然后采用分子量15KDa的有机滤膜进行超滤处理，收集未透过液，得到纯化后的酶解清液。
(6)向步骤(5)得到的纯化后的酶解清液中加入浓盐酸，使纯化后的酶解清液的pH值调至2.5，收集沉降物，采用体积分数为95％的乙醇对沉降物进行洗涤，得到酵母核酸提取物。
对比例2
一种酵母核酸提取物的制备方法：
(1)将酵母配制成质量百分比浓度为30％的酵母悬液，用氢氧化钠将酵母悬液的pH值调至9.0，在95℃条件下保温3h进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物。
(2)将步骤(1)制备得到的自溶热提取产物降温至68℃，然后通过高压均质机在120Mpa条件下对自溶热提取产物进行均质破壁处理，均质次数为3次，制备均质破壁产物。
(3)将步骤(2)制备得到的均质破壁产物的pH调节至6.5，向均质破壁产物中加入占酵母折干质量5‰的碱性蛋白酶和4‰的中性蛋白酶，在65℃条件下酶解5h，酶解结束，加热至85℃灭酶30min，制备酶解产物。
(4)对步骤(3)制备得到的酶解产物进行离心，收集酶解清液，离心的条件包括：转速为8000rpm，时间为15min。
(5)对步骤(4)收集得到的酶解清液采用0.22μm规格卷式膜进行微滤处理，去除微小不溶物，然后采用分子量10KDa的有机滤膜进行超滤处理，收集未透过液，得到纯化后的酶解清液。
(6)向步骤(5)得到的纯化后的酶解清液中加入浓盐酸，使纯化后的酶解清液的pH值调至2.5，收集沉降物，采用体积分数为95％的乙醇对沉降物进行洗涤，得到酵母核酸提取物。
对比例3
与实施例4大致相同，区别在于，步骤(3)添加的蛋白酶为占酵母折干质量10‰的碱性蛋白酶。
对比例4
与实施例4大致相同，区别在于，步骤(3)添加的蛋白酶为占酵母折干质量10‰的中性蛋白酶。
对比例5
与实施例2大致相同，区别在于，没有进行均质破壁处理。
具体制备方法为：
(1)同实施例2步骤(1)。
(2)将步骤(1)制备得到的自溶热提取产物的pH调节至8.0，向自溶热提取产物中加入占酵母折干质量1.5‰的碱性蛋白酶和3.5‰的中性蛋白酶，在55℃条件下酶解5h，酶解结束，加热至85℃灭酶20min，制备酶解产物。
(3)～(5)同实施例2步骤(4)～(6)。
对比例6
与实施例1大致相同，区别在于，没有对酵母悬液进行自溶热提取处理。具体制备方法为：
(1)将酵母配制成质量百分比浓度为15％的酵母悬液，升温至40℃，然后通过高压均质机在50Mpa条件下对自溶热提取产物进行均质破壁处理，均质次数为2次，制备均质破壁产物。
(2)～(5)同实施例1步骤(3)～(6)。
测定并计算实施例1～实施例4以及对比例1～对比例6制备得到的酵母核酸提取物的核酸提取率以及核酸纯度，结果如下表1。
核酸提取率为提取后得到的酵母核酸提取物中的核酸含量与提取前的酵母中中核酸含量的百分比值。
核酸纯度为提取后得到的酵母核酸提取物中的核酸含量占酵母核酸提取物重量的百分比值。
表1核酸提取率和核酸纯度
由表1可见，采用实施例1～实施例4的酵母核酸提取方法，所得到的核酸提取物中，具有更高的收率和纯度，说明实施例1～实施例4的方法中，酵母细胞破壁效果好，酶解效率高。
对比例1～对比例2与实施例1～实施例4相比，自溶热提取处理条件为酸性或高碱性环境，使得核酸提取率核酸纯度有所降低，且未添加自溶促进剂，水解效果更加不理想。另外，对比例1的均质压力过低影响了破壁效果，而对比例2的均质压力过高且多次均质处理会导致细胞内其他内含物大量释放，造成提取液中杂质偏多影响产品纯度，同时对比例2中酵母浓度过高也会导致高压均质破碎效果降低。因此，为提高提取效率，降低能耗，实现生产成本的有效控制，应对自溶热提处理和均质破壁处理的条件进行合理控制。
对比例3和对比例4与实施例4相比，对比例3和对比例4在酶解的步骤中仅采用了一种蛋白酶进行酶解，所得酵母核酸提取物的提取率和纯度均比实施例4更低，说明单种类的酶制剂进行酶解处理，提取核酸效率较低，且单种类酶在水解时，水解程度有限，因此优选添加不同种类蛋白酶进行组合，增加了不同蛋白酶作用效果的互补性，可以提高核蛋白的水解度，从而有利于提高酵母核酸提取物的提取率和纯度。
对比例5与实施例2相比，在自溶热提取处理后，没进行均质破壁处理，所得酵母核酸提取物的提取率与实施例2相比显著更低，说明虽然经过自溶热提取处理后，酵母细胞通透性增大，部分内容物溶出，但在未经过均质破壁处理的情况下，酵母细胞可能仍维持着一定的完整性，不少核酸会残留在细胞内，溶出受阻无法收集，从而降低了得率。
对比例6与实施例1相比，在均质破壁处理之前，没有进行自溶热提取处理，酵母核酸提取物的得率显著下降，说明在均质破壁处理之前，优选地应先进行自溶热提取处理，从而才能有利于提高后续的均质效果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种酵母核酸提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将酵母配制成酵母悬液，混合所述酵母悬液和自溶促进剂，进行自溶热提取处理，制备自溶热提取产物；
对所述自溶热提取产物进行均质破壁处理，制备均质破壁产物；以及
混合所述均质破壁产物和蛋白酶进行酶解，制备酵母核酸提取物。
2.根据权利要求1所述的酵母核酸提取物的制备方法，其特征在于，制备所述自溶热提取产物的步骤中，满足以下条件中的至少一个条件：
(1)所述酵母在所述酵母悬液中的质量百分比浓度为10％～25％；
(2)所述酵母悬液的pH值为7.0～8.5；
(3)所述自溶促进剂的用量为所述酵母的折干质量的1％～2％；
(4)所述自溶促进剂包括乙酸乙酯、食盐以及乙醇中的一种或多种；以及
(5)自溶热提取处理的条件包括：在90℃～100℃条件下保温1h～5h。
3.根据权利要求1所述的酵母核酸提取物的制备方法，其特征在于，制备所述均质破壁产物的步骤中，满足以下条件中的至少一个条件：
1)在进行均质破壁处理前先将所述自溶热提取产物降温至40℃～65℃；以及
2)进行均质破壁处理的条件包括：均质压力为50MPa～100MPa，均质次数为1次～3次。
4.根据权利要求1所述的酵母核酸提取物的制备方法，其特征在于，制备所述酵母核酸提取物的步骤中，满足以下条件中的至少一个条件：
I)进行酶解的过程中采用的所述蛋白酶包括中性蛋白酶和碱性蛋白酶；
II)所述蛋白酶中每种酶的用量独立地为所述酵母的折干质量的1‰～5‰；以及
III)酶解的条件包括：酶解温度为55℃～70℃，酶解pH值为6.5～8.0，酶解时间为2h～6h。
5.根据权利要求1～4任一项所述的酵母核酸提取物的制备方法，其特征在于，制备所述酵母核酸提取物的步骤还包括：
酶解结束，进行灭酶处理，制备酶解产物；
对所述酶解产物进行分离，收集酶解清液；
对所述酶解清液进行纯化，收集纯化后的酶解清液；以及
对所述纯化后的酶解清液进行沉降，收集沉降物。
6.根据权利要求5所述的酵母核酸提取物的制备方法，其特征在于，灭酶处理的条件包括：温度为85℃～95℃，保温时间为10min～30min。
7.根据权利要求5所述的酵母核酸提取物的制备方法，其特征在于，对所述酶解产物进行分离的方式为离心，离心的条件包括：转速为4000rpm～13000rpm，时间为5min～30min。
8.根据权利要求5所述的酵母核酸提取物的制备方法，其特征在于，进行纯化的步骤包括：对所述酶解清液依次进行微滤处理和超滤处理。
9.根据权利要求5所述的酵母核酸提取物的制备方法，其特征在于，进行沉降的条件包括：调节所述纯化后的酶解清液的pH值至1.5～3.5。
10.一种酵母核酸提取物，其特征在于，由权利要求1～9任一项所述的制备方法制备得到。
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