JP2010511028A - プロスタグランジン/シクロオキシゲナーゼの代謝経路の調節 - Google Patents
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Abstract
Description
炎症と関連づけられた痛み;
重症四肢虚血のような、複数の末梢動脈疾病(四肢に至る血流を妥協させ、末梢粥状(アテローム)硬化により起こされている複数の疾患を含んでいる)およびこれらの後遺症;
虚血心疾病(例えば、安定および不安定狭心症)および心筋梗塞(MI)のような、冠動脈疾病およびこの複数の後遺症;
卒中および複数の一過性虚血発作(TIA)のような複数の脳血管疾病およびこの複数の後遺症;
肝および腎の虚血、例えば、粥状(アテローム)硬化腎動脈狭窄;
2型糖尿、および、複数の末梢動脈疾病、冠動脈疾病、腎の複数の脈管疾病、および糖尿ニューロパシーのような、その複数の後遺症のような複数の代謝疾病;
肥満、および、2型糖尿、複数の末梢動脈疾病、および冠動脈疾病のようなその後遺症;
喘息および慢性閉塞肺疾病(COPD)、例えば、慢性気管支炎のような複数の炎症気道疾病;
アルツハイマー氏病、パーキンソン氏病、多発硬化、および複数の末梢ニューロパシーのような複数の慢性神経変性疾病;
外傷(トラウマ)脳傷害および脊髄傷害のような複数の急性神経学的変性病状;
炎症腸疾病;
リューマチ関節炎、および、1次および2次の骨関節炎、ならびにこれらの後遺症のような関節軟骨の変性により特徴化された複数の炎症疾病;
創傷治癒;ならびに
複数の化学療法剤により起こされた毒性もしくは複数の末梢ニューロパシー
の処置および予防において使用されていてよい。
この破線の円が、これを含有している環が、全部飽和されていてよく、または、1本、2本、もしくは3本の炭素炭素2重結合を持ってよいことを指し示し;
この破線が、この結合が、炭素炭素単結合もしくは炭素炭素2重結合であってよいことを指し示し;
R1が、水素原子もしくはメチル基を表し;
R2、R3、およびR4が、互いと同一もしくは異なっており、各々が、オキソ基、水酸(ヒドロキシ)基、メルカプト(基)、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、もしくはアシル基を表す。
Xが、式>CR5R6のある1基を表し、または、R10が、水素原子を表さない場合、式>SO2のある1基を表し;
Yが、式>NHもしくは式>CR5R6のある1基を表し;
Zが、式>C=Oの1基、式>CH2の1基、もしくは直接の結合を表し;
R5が、水素原子を表し、R6が、水素原子、カルボキシ基、もしくはヒドロキシ基を表し;または
R5およびR6が、オキソ基、メチレンジオキシ基、もしくはヒドロキシイミノ基を一緒に表し;
R7が、水素原子もしくは低級アルキル基を表し;
R8が、2水素原子またはオキソ基もしくはヒドロキシイミノ基を表し;
R9が、水素原子、低級アルキル基、もしくはハロゲン原子を表し;
R10が、水素原子、低級アルコキシ基、もしくはカルボキシ基を表し;
R11およびR12が、互いと同一もしくは異なっており、各々、水素原子、低級アルキル基、もしくはハロゲン原子を表す
こんな複数の化合物ならびに複数の塩および複数のエステルを含む。
Xが、式>CR5R6のある1基を表し、式中、R5が、ハロゲン原子を表し、R6が、水素原子、ヒドロキシ基、もしくはカルボキシ基を表し、またはR5およびR6が、オキソ基もしくはメチレンジオキシ基を一緒に表し;
Yが、式>CR5R6のある1基を表し、式中、R5が、水素原子を表し、R6が、水素原子もしくはカルボキシ基を表し;
R7が、水素原子を表し;
R8が、2水素原子もしくはオキソ基を表し;
R9が、水素原子を表し;
R10が、水素原子、C1〜C4アルコキシ基、もしくはカルボキシ基を表し;
R11およびR12が、互いと同一もしくは異なっており、各々、水素原子もしくはC1〜C4アルキル基を表す
こんな複数のものならびにこれらの塩およびこれらのエステルを特に好む。
複数のPC−12細胞における虚血に対する7β−ヒドロキシ−EPIアンドロステロンの複数の保護効果:シクロオキシゲナーゼ(COX)阻害剤たるインドメタシンによる阻害
この実施例の目的が、プロスタグランジン合成のインドメタシンにより弱められている場合の低酸素のある1モデルにおけるその神経保護効率を7β−OH−EPIAが、保持するかどうか調べることにあった。使用された主な実験系が、複数のPC12細胞における虚血誘発細胞毒性であった。実験の測定された終点が、細胞死であった。
PC−12細胞培養
複数のPC−12細胞が、以降の組成:2mM L−グルタミン、10mM HEPES、1mM 焦性葡萄酸(ピルビン酸)ナトリウム、最終濃度4.5g/Lを与えるように追加の葡萄糖(グルコース、RPMIは通常2g/Lを持つ)、10%熱不活化馬血清、5%牛胎児血清、および50単位のペニシリン/ストレプトマイシンを有する、L−グルタミン無しのRPMI 1640を有する複数のPC−12培地において1型コラーゲンを用いてコーティングされた複数のフラスコ上、維持されていた。複数の培地が、2日毎、変えられていた。
複数のPC−12細胞の合流培養が、無血清だが50ng/ml NGFを有するPC−12培地(複数の PC−12 NGF 培地)において7日間、培養していくことにより分化された。これら細胞が、収穫され、洗浄され、計数されたが、1×105PC−12細胞/穴(ウェル)が、葡萄糖(グルコース)のないPC−12 NGF 培地においてミクロタイタープレートに終夜播かれた。該培地が、次いで、テストされるべき複数の化合物を含有している、葡萄糖(グルコース)のないPC−12 NGF 培地に変更され、これら皿(プレート)が、30分間、通常酸素条件下、放置された。
複数のPC−12細胞が、低酸素に対し、相対的に抵抗性であった。このせいで、我々が、毒性を開始させるのにより重篤な酸素葡萄糖(グルコース)組み合わせ剥奪(虚血)プロトコールを使用した(図1)。7β−OH−EPIAが、1μM(細胞死における26%の減少)および10μM(細胞死における53%の減少)において観察されている有意な神経保護と共にこのアッセイにおいて用量依存的に細胞保護的であった。図1が、この効果を示している4実験からのデーターの組み合わせを提示する。図1が、別々の4実験からのデーターの組み合わせからの平均百分率(%)細胞死を示す。このデーターが、平均±semとして表現されている。76%±2.2%の細胞死が、虚血単独と共に観察された。細胞死における統計的に有意な減少が、1μM 7β−OH−EPIA(細胞死における26%の減少、p<0.001)、10μM 7β−OH−EPIA(細胞死における53%の減少、p<0.001)と共に観察された。***=p<0.001対(vs)虚血単独。
虚血により誘発されたPC−12細胞死が、7β−OH−EPIAにより一貫して抑えられた。インドメタシンが、プロスタグランジン合成をブロックするが、10μMに至るまでの複数の濃度においてPC−12細胞死に直接影響しなかった。しかしながら、該濃度が、更に100μMに増加された場合、中くらいの神経保護効果が、観察された。
複数のヒト単核細胞による、プロスタグランジンD2、プロスタグランジンE2、およびプロスタグランジン15−デオキシ−Δ12,14−J2の産生への7β−ヒドロキシ−EPIアンドロステロンの効果
この実施例の目的が、7β−OH−EPIAが、複数のヒト単球細胞におけるアラキドン酸特異的代謝産物、すなわち、プロスタグランジンD2(PGD2)、プロスタグランジンE2(PGE2)、および15−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンJ2(15d−PGJ2)の生合成を誘発し得たかどうか確かめることにあった。
複数の末梢血単核細胞
複数の単核細胞(複数の単球および複数のリンパ球)が、フィコール/ハイパーク密度遠心にヒト全血48mlを付してみることにより調製された。血液が、該フィコール(密度=1.077g/ml)の頂(トップ)上、層状とされ、1時間、400gにおいて遠心され(22℃)、この後、相間における複数の細胞が、ピペットにより除かれ、真新しい複数の管(チューブ)に移された。複数の管(チューブ)が、徹底的に混合されたRPMI 1640培養培地(2体積)を用いて満たされ、次いで、5分間、400gにおいて遠心された(22℃)。上清が、漉かれ、細胞ペレットが、RPMI 1640培養培地に再懸濁され、体積が、下の結果の部(セクション)において指し示されたとおりのインキュベート1回当たりの適切な数の細胞を与えるように調整された。複数の細胞が、37℃、空気中5%CO2、および100%湿度において18時間、最終体積1mlのRPMI 1640培地において1.5mlの複数の無菌プラスチック管(チューブ)中、インキュベートされた。組み換えヒト腫瘍壊死因子−α(TNF−α)を加えていく前、7β−OH−EPIAが、次いで、加えられ、複数の細胞が、37℃において更なる1時間、インキュベートされ、複数回のインキュベートが、更なる3時間、継続された。7β−OH−EPIAが、ジメチルスルホキシド(DMSO)中、調製され、全ての残っている剤が、RPMI 1640培地中、調製された。要件に関する複数のコントロールが、培地か、いつも<0.1%(体積/体積、v/v)であった同一濃度のDMSOか、どちらかを含有した。複数回のインキュベートが、22℃において30秒間、11,000gにおいて複数の管(チューブ)を遠心いていき、1.5mlの真新しい複数の管(チューブ)に複数の上清を移していくことにより終結された。複数のサンプルが、次いで、下記されたとおりPGD2の推定用に直ちに加工されたか、または、PGE2もしくは15d−PGJ2の測定の前に−20℃において保管されたか、どちらかであった。
TNF−αを用いた刺激非存在下もしくは存在下どちらかの下、7β−OH−EPIAに対する応答における複数のヒト単球細胞によるプロスタグランジン産生が、商品として入手可能な複数のEIAキットを使用しながら、エイコサノイド細胞外レベルを測定していくことにより求められた。
PGD2が、複数の細胞上清から直接アッセイされ得ないのが、これが、化学的に不安定であり、PGJ2、Δ12−PGJ2、および15−デオキシ−Δ12,14−PGJ2を包含している数多くのJ系列のプロスタグランジンに急速に分解するからである。この問題を迂回するに当たり、不安定なPGD2が、安定な誘導体を与えるように化学的に処理されたが、このケースにおいてプロスタグランジンD2−メトキサミン(PGD2−MOX)であり、引き続いての分析用に保管されていた。複数のインキュベートの終結化の後直ちに、サンプル上清100μlが、10:90(体積/体積、v/v)エタノール/水溶液に溶解されたメチルオキシム化試薬(Methyl Oximating Reagent、塩酸メトキシルアミン(MOX−HCl))および酢酸ナトリウム100μlを含有している1.5mlの複数の管(チューブ)に加えられた。複数の管(チューブ)が、次いで、水浴に入れられ、反応が、60℃において30分間、進むようにされた。この期間の終わりに複数のサンプルが、−80℃において保管された。PGD2の複数のレベルが、引き続き、Cayman ChemicalのプロスタグランジンD2−MOX EIAキット(カタログ番号512011)を使用しながら、推定された。
PGE2の複数の細胞外レベルが、その高感受性プロトコール用の製造元の説明書に従いながら、R&D SystemsのParameter PGE2EIA Kitを使用しながら、推定された。
15d−PGJ2の複数の細胞外レベルが、その製造元の説明書に従いながら、Assay DesignsのCorrelate−EIA プロスタグランジン15−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンJ2EIAキット(カタログ番号900−023)を使用しながら、推定された。
複数の結果が、n=3のインキュベートに関し、その平均±s.d.として表現されている。対とされなかったStudents t−検定(t−Test)が、2組(セット)のデーターが、互いに異なっていたという確率(P)を求めるのに使用された。この違いが、P<0.05の場合、有意であると見なされた。複数の統計計算が、Abacus Concepts Inc.からの、ソフトウェアパッケージたるStatviewを使用しながら、アップル マッキントッシュ(Apple Macintosh)のコンピューター上、完遂された。
複数のヒト単核細胞によるPGD2産生への7β−OH−EPIAの効果
図5(a)が、7β−OH−EPIAを用いて4時間、インキュベートされた1×107末梢血単核細胞/mlの細胞上清中、検出されたPGD2の複数のレベルへの7β−OH−EPIAの濃度を増加させていく(0.1nM〜1000nM)ことの効果を示す。7β−OH−EPIAが、コントロールよりも有意に大きかった(40±13pg/ml PGD2; P=0.01)100nM 7β−OH−EPIAにおけるある1極大(102±24pg/ml PGD2)に届いているPGD2産生における濃度から独立している増加を誘発させるように見えた。
図6(a)が、7β−OH−EPIAを用いて4時間、インキュベートされた6×105末梢血単核細胞/mlの細胞上清中、検出されたPGE2の複数のレベルへの7β−OH−EPIAの濃度を増加させていく(1nM〜1000nM)ことの効果を示す。7β−OH−EPIAが、複数のDMSOコントロールに比べられたら、PGE2の複数のレベルを増加させるように見えたが、しかしながら、これらの増加が、統計的に有意に異なっていなかった。
図7(a)が、7β−OH−EPIAを用いて4時間、インキュベートされた複数の単核細胞の細胞上清中、検出された15d−PGJ2の複数のレベルへの7β−OH−EPIAの濃度を増加させていく(0.1nM〜1000nM)ことの効果を示す。7β−OH−EPIAが、使用された全ての濃度においておよそ9〜12倍、15d−PGJ2の複数のレベルを有意に増加させた。複数のレベルが、複数のDMSOコントロールに関しての51±6pg/mlから、ぞれぞれ、0.1nM、1nM、10nM、100nM、および1000nM 7β−OH−EPIAに関しての506±101pg/ml、539±51pg/ml、520±45pg/ml、450±133pg/ml、および590±84pg/mlにまで増加された(複数のDMSOコントロールと比べられたら、全てのP<0.05)。
7α−ヒドロキシ−DHEA、7β−ヒドロキシ−DHEA、および7β−ヒドロキシ−EPIAが、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)およびエピアンドロステロン(EPIA)の複数の自然代謝産物である。数多くのステロイドが、炎症過程(プロセス)および免疫過程(プロセス)と干渉すると報告されているので、我々の課題が、PG産生および関連酵素遺伝子発現へのこれらのヒドロキシステロイドの効果をテストすることであった。複数のヒト末梢血単球(PBMC)が、原炎症サイトカインたるTNF−α(10ng/mL)の添加有りもしくは無しで、これらステロイドの各々(1〜100nM)の存在下、4時間および24時間、培養された。PGE2のレベル、PGD2のレベル、および15−デオキシ−Δ12,14−PGJ2(15d−PGJ2)のレベルが、そのインキュベート培地において測定されたが、シクロオキシゲナーゼ(COX−2)およびPGE合成酵素(シンターゼ、m−PGES1)のmRNAの細胞含量が、定量的RT−PCRにより査定された。TNF−αの添加が、結果的に、PG産生の上昇ならびにCOX−2mRNAレベルおよびm−PGES1mRNAレベルの増加を与えた。テストされた3種のステロイドの間で、7β−ヒドロキシ−EPIAしか、COX−2およびm−PGES1の発現を減少させなかった一方、顕著に、PGE2の産生を減少させており、15d−PGJ2の産生を増加させている。これらの結果が、7β−ヒドロキシ−EPIAが、複数の抗炎症効果を持つことを指し示す。
全血が、Etablissement Francaise du Sang(ブレスト、フランス)における複数のEDTA補完パウチ中の複数のドナーから、収集された。該PBMCが、収集後、36時間以内で、無菌条件下、全血から、次いで、単離された。密度勾配遠心が、Ficoll(Eurobio)上、完遂された。RPMI 1640培地(Eurobio)中での洗浄後、複数の細胞が、10%熱不活化牛胎児血清(Eurobio)、2mM グルタミン(D.Dutscher)、100Uのペニシリン/ml(D.Dutscher)、および100μgのストレプトマイシン/ml(D.Dutscher)を用いて補完されたRPMI 1640培地において懸濁された。複数の単球が、1時間、プラスチックに対する接着により選ばれ、およそ107の細胞が、。複数枚の6穴(ウェル)組織培養プレート(1ウェル当たり、3mLの培地)においてプレートに播かれた。全てのインキュベートが、37℃および5%CO2における湿らされたインキュベータ中、実施された。複数の細胞が、回収され、0.01μg/mL TNF−α(シグマ−アルドリッチ)存在下もしくは非存在下、7β−ヒドロキシ−EPIA、7β−ヒドロキシ−DHEA、もしくは7α−ヒドロキシ−DHEA(エタノール20μL中)のどれかを用いて補完された作りたてのインキュベート培地2ml中、分散された。コントロールの複数のインキュベートが、エタノール20μlを含有したが、全くステロイドを含有しなかった。複数の上清が、4時間後、収集されたが、これらのPG含量および細胞の測定用の24時間インキュベートが、引き続いてのRNAの単離用に使用された。Trizol試薬(Invitrogen、セルジ−ポントワーズ(Cergy−Pontoise)、フランス(France))を使用しながらの単一工程(ステップ)抽出法が、全RNAを与えた。
複数のcDNAが、Superscript 第1ストランド合成システムキット(Invitrogen)を使用しながら、TURBO DNase I処理RNA(Ambion、Huntingdon、UK)から、合成された。複数のRT−PCR増幅混合物(50μL)が、2,5xRealMaster Mix/20x SYBR溶液(11,25μL、エッペンドルフ、ル ペック、フランス)ならびに200nMの順プライマーおよび逆プライマーを含有した。複数の反応が、RealPlex ep 勾配 S マスターサイクル機(エッペンドルフ)上、行われた。これらサイクルを回していく条件が、95℃において10分であったが、45サイクルをそれぞれ、15秒間、30秒間、および30秒間、95℃、55℃、および68℃においてであった。各アッセイが、コントロールのcDNAの4点の連続の稀釈点(ポイント)の標準曲線を包含した。HPRT1ハウスキーピング遺伝子が、定量化用に使用された。全てのオリゴヌクレオチドプライマー(表2)が、Genecust/Distribio(エヴリ、フランス)により合成された。増幅された生成物の特異性が、その生成物融解曲線の審査によりモニターされたが、アガロースゲル電気泳動上での分析により確かめられた。
商品として入手可能な複数のEIAキットが、複数の培養培地における複数のPGE2レベル(Oxford Biomedical Research、UK)および複数の15d−PGJ2レベル(Assay desingns、Euromedex、France)の決定用に使用された。複数のPGD2レベルの測定が、プロスタグランジンD2−MOX EIA キット(Cayman Chemical、Euromedex)を使用しながら、得られた。このケースにおいて、および、アッセイの前に、これら採れたてのサンプルが、PGD2−MOXへとPGD2を変換した、MOX−HCl試薬と直ちに処理されたが、こうして如何なる更なる化学的劣化をも防いでいる。
全てのアッセイが、3回ずつ完遂されたが、複数の結果が、平均±S.E.M.としてプロットされた。分散の片道での解析が、複数の群の間での違いを比べるためにDuncanの多数回ずつのレンジテストにより伴われて実施された。複数の違いが、p<0.05の場合、統計的に有意と見なされた。
ヒトPBMCが、4時間かもしくは24時間かどちらか、TNF−αの添加有りもしくは無しで、培養された。PGE2レベル、PGD2レベル、および15d−PGJ2レベルが、その培養培地において測定され、関連された複数の遺伝子(COX−2、m−PGES1)のmRNA産生が、その細胞において測定された。得られたデーターが、表2において示されている。TNF−αの非存在および3種の異なる濃度の7α−ヒドロキシ−DHEAを用いた補完が、4時間、複数の培養における、PGE2レベル、PGD2レベル、および15d−PGJ2レベルにおける有意な変化を全く起こさなかった。15d−PGJ2しか、24時間の培養後、中くらいの増加を示さなかった。7α−ヒドロキシ−DHEAを用いたインキュベートが、24時間後、複数の培養において複数のm−PGES1mRNAレベルを有意に増加させた。
ヒトPBMCが、4時間かもしくは24時間かどちらか、TNF−αの添加有りもしくは無しで、培養された。PGE2レベル、PGD2レベル、および15d−PGJ2レベルが、その培養培地において測定され、関連された複数の遺伝子(COX−2、m−PGES1)のmRNA産生が、その細胞において測定された。得られたデーターが、表3において示されている。TNF−α非存在下での4時間の3種の濃度の7β−ヒドロキシ−DHEAを用いたインキュベートが、その培養培地における、PGE2レベル、PGD2レベル、および15d−PGJ2レベルにおける有意な変化を全く起こさなかった。しかしながら、PGD2レベルおよび15d−PGJ2レベル、並びにm−PGES1mRNAレベルが、培養における7β−ヒドロキシ−DHEAとのインキュベート24時間後、増加された。
ヒトPBMCが、4時間かもしくは24時間かどちらか、TNF−αの添加有りもしくは無しで、培養された。PGE2レベル、PGD2レベル、および15d−PGJ2レベルが、その培養培地において測定され、関連された複数の遺伝子(COX−2、m−PGES1)のmRNA産生が、その細胞において測定された。得られたデーターが、表4において示されている。TNF−α非存在下での4時間の3種の濃度の7β−ヒドロキシ−EPIAを用いたインキュベートが、その培養培地における、PGE2レベル、PGD2レベル、および15d−PGJ2レベルにおける有意な変化を全く起こさなかった。しかしながら、複数の細胞培養が、24時間、7β−ヒドロキシ−EPIAと共にインキュベートされた場合、PGD2および15d−PGJ2両方が、顕著に増加された。COX−2発現が、4時間かもしくは24時間かどちらかに前記ステロイドにより知らされ得るほど(noticeably)変化されていなかったが、複数のm−PGES1mRNAレベルが、それぞれ、4時間および24時間に有意な減少および増加を示した。
結腸炎の実験モデルへの7β−OH−EPIAの効果
連続6日間の飲料水中のデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の複数のラットに対する投与が、結腸の長さの抑制、MPO活性の増加、複数の杯細胞における粘液の枯渇、ならびに、COX−2およびmPGES−1合成酵素(シンターゼ)の発現の増加、および、プロスタグランジンE2(PGE2)の産生の増加により特徴化された結腸の炎症(結腸炎)を起こさせる。DSSの投与が、腸における蛋白のカルボニル(Prot CO)および複数のTバーのような複数の酸化ストレスマーカーをも増加させる。我々が、今、DSS投与前、7日間、1日1回、7β−ヒドロキシ−EPIAを用いた処置が、DSS誘発結腸炎の発展を防ぎ得るとの証拠を与える。0.01mg/kg 7β−ヒドロキシ−EPIAの投与が、結腸炎による損傷および組織の炎症を完全に防いだが、この7β−ヒドロキシ−EPIAの効果が、複数の酸化ストレスマーカーおよびPGE2産生における顕著な抑制と関連づけられ、COX−2発現における早いが一過性の増加および抗炎症プロスタグランジン15d−PGJ2産生における持続された増加と関連づけられた。これらの結果が、7β−ヒドロキシ−EPIAが、炎症腸疾病(IBD)のこの許容された実験モデルにおける非常に低い複数の用量レベルにおいて顕著な複数の抗炎症効果を持つことを示す。
複数の動物
全ての実験プロトコールおよび手順が、複数の実験動物の使用に関する、ヨーロッパ共同体(EC)の方針86/609/CEEとの合意にあった。複数の雄ウィスター(Wistar)ラット(180〜200g)が、チャールズリヴァー(Charles River)、ラルブレスル(L’Arbresle)、フランス(France)から購入されたが、齧歯類の実験室での食事を用いて給餌され、自由に水を与えられた。
7日の適応期間後、複数の動物が、コントロールの2群(擬似(sham)コントロールおよび7β−ヒドロキシ−EPIA処置コントロール群)ならびに結腸炎の2群(結腸炎および7β−ヒドロキシ−EPIA処置結腸炎)へと分けられた。7β−ヒドロキシ−EPIA(DMSOに溶解された、0.01、0.1、および1mg/kg体重)あるいはDMSO単独(ビヒクル)が、0日目〜7日目、7日間、1日1回、腹腔内(i.p.)投与された。結腸炎が、飲料水に対するDSS(分子量36〜50kDa; MP Biomedicals、フランス)の添加により、7〜14日目、誘発された。これらコントロールの2群が、水道水しか受けなかった。
9、11、13、14日目に、体重、結腸長さ、軟便度が、記録され、採れたての直腸での出液が、肉眼での検査により評価された。結腸の損傷の重篤さが、Mableyら、2001、Inflamm.Res.; 50: 561−569 により記述されたとおり盲検的にスコア化された(0: よく形成された複数のペレットおよび全く結腸の損傷なし; 1: 複数の糞便と混合されて存在する少量の血液を有する結腸; 2: 複数の糞便と共に存在する大量の血液を有する結腸; 3: 血液で満たされた結腸および全く糞便なし)。
近位結腸のある1部分(1cm)が、4%ホルムアルデヒド(Labonord、Templemars、France)中、固定され、パラフィン中、埋められた。複数の組織切片(5μm)が、調製され、この後、きれいにされ、水和され、それぞれ、結腸の損傷および粘液杯細胞含量の組織学的評価用の複数の標準プロトコールに従いながら、ヘマトキシリン/エオシンを用いるかアルシアンブルーを用いるかどちらかで染色された。
結腸が、腸間膜縁に沿って開けられ、その複数の上皮細胞が、ガラススライドの平滑な端を用いてスクラップされて離され、次いで、重量を量られ、洗浄され、そして遠心された。そのペレットが、9体積のTKE緩衝液(バッファー、10mM Tris−HCl;150mM KCl;1mM EDTA;0.25mM PMSF、pH7.4)中、均一化され、次いで、更なる使用までずっと、−80℃において凍結された。複数のホモジェネートの蛋白含量が、Lowryら(J Biol Chem 1951; 193: 265−74)に従いながら、測定された。
MPO活性が、Pelissierらの複数の変法(Steroids 2006;71(3):240−8)と共にKrawiszらのオルト(o−)ジアニシジン法(Gastroenterology 1984;87(6):1344−50)を使用しながら、複数のホモジェネート中、査定された。MPO活性が、酸化されたオルト(o−)ジアニシジンに関する消光係数(1.13×104モル-1cm-1)を使用しながら、460nmでの吸光度における1分当たりの変化を生成させるのに必要な酵素の量として表現された。
脂質過酸化(Tbars)が、Ohkawaらにより記述された方法(Anal Biochem 1979; 95: 315−58)の、Albrechtらによるある1種の変法(1992、Toxicol.Lett; 63: 91−96)により測定された。赤い1:2付加物たるマロンジアルデヒド−チオバルビツール酸(シグマ−アルドリッチ(Sigma−Aldrich)、サンカンタン−ファラヴィエ(St Quentin−Fallavier)、フランス(France))の吸光度が、532nmにおいて測定された(使用された消光係数:0.156μモル-1cm-1)。酸化された複数の蛋白におけるカルボニル含量(Prot CO)が、Levineらの方法(Methods Enzymol 1990;186:464−78)により査定された。その非蛋白スルフヒドリル基含量(大抵、GSH)が、複数のホモジェネート中の抗酸化剤防禦マーカーとして採られ、SedlakおよびLindsayの方法(Anal Biochem 1968;25(1):192−205)により求められた。
商品として入手可能な複数のEIAキットが、採れたての複数のホモジェネートから得られた結腸の複数の上清中、PGE2の複数のレベル(オックスフォード バイオメディカル リサーチ(Oxford Biomedical Research)、英国(UK))および15d−PGJ2の複数のレベル(Assay Designs、Euromedex、France)の決定用に使用された。PGD2の複数のレベルの測定が、プロスタグランジンD2−MOX EIA キット(Cayman Chemical、Euromedex)を使用しながら、得られた。このケースにおいて、および、あっせいの前に、これら採れたてのサンプルが、PGD2−MOXへとPGD2を変換したMOX−HCl試薬を用いて直ちに処理されたが、こうして如何なる更なる化学的劣化をも防いでいる。
採れたての複数の結腸サンプル(300mg)からの全RNAが、Trizol試薬(Invitrogen、セルジ−ポントワーズ(Cergy−Pontoise)、フランス(France))を使用しながら、抽出された。ポリ(A)RNAが、MicroPoly(A)Purist キット(Ambion、Huntingdon、英国(UK))を用い、全RNAから精製された。cDNAが、Superscript 第1ストランド合成システムキット(Invitrogen)を使用しながら、合成された。リアルタイムPCRが、2.5xRealMaster Mix/20x SYBR溶液(11.25μL、エッペンドルフ、ル ペック、フランス)および300nMの順プライマーおよび逆プライマーを含有している複数の混合物(25μL)を使用しながら、実施された。複数の反応が、RealPlex ep 勾配 S マスターサイクル機(エッペンドルフ)上、行われた。これらサイクル化条件が、10分間、95℃においてであったが、40サイクルをそれぞれ、15秒間、30秒間、および30秒間、95℃、55℃、および68℃においてであった。各アッセイが、コントロールのcDNAの4点の連続の稀釈点(ポイント)の標準曲線を包含した。複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、Genecust/Distribio(エヴリ、フランス)により合成された。増幅された生成物の特異性が、その生成物融解曲線の審査によりモニターされたが、アガロースゲル電気泳動上での分析により確かめられた。mRNAのこれらレベルが、HPRT1に対する規格化後、DMSOコントロールのものに相対し、表現された。
全てのアッセイが、各動物に関し、3回ずつ完遂されたが、複数の結果が、平均±S.E.M.としてプロットされている。分散の片道での解析が、複数の群の間での違いを比べるためにDuncanの多数回ずつのレンジテストにより伴われて実施された。複数の違いが、p<0.05の場合、統計的に有意と見なされた。
結腸炎誘発の時間経過(タイムコース)研究
7日間(7日目〜14日目、D7〜D14)、飲料水中、5%のDSSを用いた複数のラットの処置が、死亡率を伴わず、結腸炎の臨床兆候および組織学的兆候を結果的に与えた。典型的に、全てのこれらラットが、結腸炎誘発(12日目)後の5日、重篤な下痢を呈し、次の日、直腸での出液が、起きた。体重、副睾丸の脂肪組織の質量、および肝重量におけるある1種の減少が、複数の擬似コントロールと比べられた場合、全てのDSS処置ラットにおいて11日目に記録された(それぞれ、−5%、−17%、−8%;p<0.05)。これらの減少が、14日目にも観察された(表5)。脾重量における変化が、全く観察されなかった。該擬似コントロール群と比べた場合、複数のDSS処置ラットが、結腸の厚くなった組織および大便の損失(ロス)と関連づけられて、11日目(−14%、p<0.05)〜14日目(−26%;p<0.05)、結腸の有意な短縮も実証した。表5を見よ。結腸粘膜におけるMPO活性が、好中球浸潤のある1指標(インデックス)として測定された。13および14日目に、粘膜のMPO活性の9倍および7倍の増加が、複数の擬似コントロールと比べられた場合、該結腸炎群において観察された(p<0.05、図8A)。MPO活性の修飾が、13日目の前に全く観察されなかった。これらの結果が、組織学的分析と一致している。本当に、結腸の炎症の主要な複数の刻印(ホールマーク)、すなわち、隠蔽された歪み、粘膜組織中への好中球の浸潤、および、より少なきムチンを含有した複数の杯細胞の損失(ロス)が、13日目に該結腸炎群において明らかとなり、擬似コントロール群と比べられた場合、14日目により多く知れ渡った(データーは示されなかった)。
7β−ヒドロキシ−EPIAのこれら2種の低い用量(0.01、0.1mg/kg)が、14日目に下痢の抑圧および直腸での出液により指し示されたとおりのこれらDSS誘発結腸損傷を防いだ。DSS投与前、7日間、日に1回、0.01mg/kg 7β−ヒドロキシ−EPIAの腹腔内注射が、副睾丸の重量を代えてしまうことなく、コントロールの複数のレベルに体重を復元させた(表5)。9日目〜14日目、結腸の長さの抑制が、結腸炎群におけるよりも、ステロイドのこれら2種の低い方の用量(0.01、0.1mg/kg)により処置されたこれら群においてより少なく見受けられた(pronounced)(9日目に関してはデータは示されなかった、表5)。7β−ヒドロキシ−EPIAが、14日目に複数の杯細胞における粘液の枯渇、および、クリプト(crypts)および好中球の浸潤の異常のような複数の組織学的変化を防ぎ(データーは示されなかった)、全ての用量のレベル、0.01、0.1、および1mg/kgにおいてMPO活性を有意に減少させた(図8A)。これら酸化ストレスパラメーター(Prot CO、複数のTバー)および複数のGSHのレベルが、全ての群、すなわち、擬似コントロール、結腸炎、および7β−ヒドロキシ−EPIA処置(0.01、0.1、および1mg/kg)結腸炎群において9日目(示されなかった)および11日目に似ていた(図8B、C、およびD)。酸化ストレスの全てのマーカーおよび抗酸化剤防禦マーカーが、7β−ヒドロキシ−EPIAを用いて処置されてきていた複数の動物において変化されていなかったままであった一方(D0〜7日目)、これらのパラメーターが、該結腸炎群において有意に増加された(p<0.05)。これらの結果が、7β−ヒドロキシ−EPIAが、炎症腸疾病(IBD)のこの実験モデルにおいて非常に低い複数の用量レベルにおいて顕著な複数の抗炎症効果を持つことを示す。
複数の7β−ヒドロキシ−EPIA処置が、結腸炎のないコントロールの複数のラットにおけるPGE2結腸組織レベルおよびPGD2結腸組織レベルを代えさせなかった(データは示されなかった)。対照的に、0日目〜7日目、7β−ヒドロキシ−EPIAの投与が、2日目〜14日目、複数の15d−PGJ2レベルのベースのレベルを上回る有意な増加に至った。0.1mg/kg 7β−ヒドロキシ−EPIAの投与が、2日目に51倍の増加を結果的に与えたが、4日目〜14日目、漸進的に減少した(44倍〜5倍の範囲である増加分。図9A、図10C)。
複数のプロスタグランジンレベルにおける有意な複数の修飾が、DSS投与および7複数のβ−ヒドロキシ−EPIA処置と共に観察されたので、我々が、COX−2、mPGES−1、およびH−PGDSの発現が、リアルタイムRT−PCRによる特異的mRNAの定量によるステロイド前処理により代えられた(変化した)かどうかテストした。これらの遺伝子の転写が、審査され、ハウスキーピング遺伝子HPRT1のものに関連づけられた。結腸炎のないコントロールの複数のラットにおいて、0.1mg/kg 7β−ヒドロキシ−EPIAの投与が、15時間に複数のCOX−2mRNAレベルにおける有意な1.5倍の増加を誘発させたが、次いで、2日目および4日目に有意な減少、この後、ベースの複数の値に戻っていった(図9B)。mPGES−1mRNA発現が、6時間〜15時間の間、一過性に増加したが、2日目にベースの複数のレベルに向かって戻っていった。H−PGDSのmRNAの合成が、本実験のコースの間中、変えられなかったままであった。
1.コラーゲン誘発関節炎における7β−OH−EPIAの効果
この研究が、コラーゲン誘発関節炎のある1モデルと関連された炎症変化および病理変化をコントロールしていくことに狙いを定めた7β−OH−EPIAの有効さをテストした。そのネズミモデルが、ヒト関節炎の臨床での疾病のレミニッセントを実証する。
複数の実験群(n=10/群)
群1: 0日目、CII/CFA、処置されなかった〜見かけ処置された、20日目〜50日目
群2: 0日目、CII/CFA、処置7β−ヒドロキシ−EPIA 1μg/kg、20日目〜50日目
群3: 0日目、CII/CFA、処置7β−ヒドロキシ−EPIA 10μg/kg、20日目〜50日目
群4: 0日目、CII/CFA、処置7β−ヒドロキシ−EPIA 100μg/kg、20日目〜50日目
群5: 0日目、CII/CFA、処置7β−ヒドロキシ−EPIA 10μg/kg、 0日目〜30日目
群6: 0日目、CII/CFA、処置されなかった〜見かけ処置された、 0日目〜30日目。
0 通常
1 関節全部の僅かな膨潤または個々の桁での炎症
2 赤味を帯びた関節全部の中間的な膨潤および/または1桁よりも多い桁における炎症
3 重篤な関節炎症および多数の桁にまで広がっている赤味
4 重篤な関節炎症および多数の桁にまで広がっている赤味、骨の再モデル化の顕わな複数の兆候(サイン)。
上で調製されたとおりの複数の膝ホモジェネート中の15d−PGJ2レベルおよびPGE2レベルが、複数の標準アッセイ手法を使用しながら、測定された。表8から判るのが、PGE2のこれらレベルが、処置されなかったコントロール群に比べられた場合、0.1mg/kgの7β−OH−EPIAを用いて処置された群においてより低かったことである。0.1mg/kgの7β−OH−EPIAを用いて処置された群が、処置されなかったコントロールに比べられた場合、より高い複数のレベルの15d−PGJ2を持った。
7β−ヒドロキシ−EPIAの明らかな抗炎症効果が、あった。誘発時での処置が、最大効果を持つように見えた。これが、このモデルにおいて複数のステロイドを包含している他の複数のテスト化合物と共に保っていくことにあり、既存の複数の変更を逆転させていくのに反対されたとおり、関節の損傷を防いでいくことの相対的な容易さを反映する。こう言ってきているが、より高い方の複数の用量の7β−ヒドロキシ−EPIAを用いて処置されたそんな複数の動物における疾病のこれらレベルが、処置が、20日目までずっと遅らされた場合、似ていた。疾病からの保護のこのレベルが、治療体制用に良好である。最低用量の7β−ヒドロキシ−EPIAが、疾病の複数のレベルへより少ない効果を持つように見えたが、統計解析が、これが、明らかな用量効果であったかどうか調べるのに必要とされると思われる。
シスプラチン誘発末梢ニューロパシーモデルについての7β−OH EPIAの効果
シスプラチンが、複数の癌の処置に使用された抗有糸分裂化合物である。しかしながら、この使用が、幾つかの逆効果により、限られており、これらの間でもこれら末梢ニューロパシーが、特に窮迫している。複数のシスプラチン誘発ニューロパシーが、優先して敏感な複数のニューロパシーである。複数の患者が、感覚失調により伴われた遠位の四肢における感覚の複数の損失を患う。複数の組織学研究が、軸索の変性を示した。複数の細胞培養中、シスプラチンによる複数の感覚神経の処理が、細胞体の変性により伴われた神経突起ネットワーク密度のある1減少を誘発させた。複数の感覚神経に特異的な成長因子たる、神経成長因子(NGF)が、この中毒に対する複数の神経への複数の保護効果を持つ。培養におけるシスプラチンによる複数の感覚神経の中毒が、これゆえ、複数の末梢ニューロパシーにける複数の化合物の複数の神経保護効果の研究用のふさわしいモデルである。
−抗MAP 2(微小管関連蛋白2)抗体を用いて染色された複数の神経細胞体
−抗β−チューブリン抗体を用いて染色された神経突起ネットワークの密度
複数のラット感覚神経が、Hallら、1997年[Hallら、J.Neurosci.1997年4月15日;17(8);2775〜84]により記述された方法に従いながら、調製された。端的に、雌ラット(妊娠15日)が、頸脱臼により屠殺され(Rats Wistar;Janvier、Le Genest−St−Isle、フランス)、その複数の胎児が、その子宮から除かれた。複数の背根神経節(DRG)を有するそれらの脊髄が、除かれ、ペニシリン50UI/ml−ストレプトマイシン50μg/ml(PS、1%)および牛血清アルブミン(BSA1%、Sigma A6003)を含有しているLeibovitz(L15、Fisher 11415−049)の氷冷培地に入れられた。これらDRGが、回収され、カルシウムおよびマグネシウムなく、PBS中、稀釈された(Fisher 2007−03)トリプシンEDTA10X、10%、Fisher 15400054、37℃において20分間、トリプシン処理により、解離された。この反応が、DNase I グレード II(II等級、0.1mg/ml、Roche診断薬104159)および牛胎児血清(FBS10%、Fisher10270−098)を含有しているDulbecco修飾Eagle培地(DMEM、Fisher21969−035)の添加により、止められた。この細胞懸濁が、10mlのピペットを用いて擦られ、室温において10分間、350×gにおいて遠心された。解離された複数の細胞のペレットが、次いで、決められた培養培地において再懸濁された。
培養5日後、その培養培地が、下記:
・ビヒクル(DMSO 0.1%)
・ビヒクル(DMSO 0.1%)+シスプラチン(3μg/ml、Sigma参照番号:p4394)
・テスト化合物7β−OH EPIA(1nM、10nM、および100nM)+シスプラチン(3μg/ml)
・対照化合物NGF(10ng/ml)+シスプラチン(3μg/ml)
の異なる条件に従いながら、決められた培養培地へと変更された。
複数の感覚神経の細胞体が、モノクローナル抗MAP−2抗体(Sigma M4403)により標識され(ラベルされ)、複数の感覚神経の神経突起が、モノクローナルβ−チューブリン抗体(Sigma T8660)により標識された(ラベルされた)。これらの抗体が、インキュベート溶液(FCS5%およびサポニン0.1%を有するPBS、Sigma S−7900)中、1:400において稀釈された。これらの抗体が、それぞれ、複数の神経細胞体および複数の神経突起を特異的に標識する(ラベルする)。
神経突起密度のシスプラチン誘発損失に対しての7β−OH EPIAによる保護
3μg/mlのシスプラチンを用いた48時間のインキュベート
神経突起密度が、培地(<<ビヒクル>>)を用いた複数の感覚神経のインキュベート後、つまり、48時間、シスプラチンなしで、1フィールド当たり平均5459μmの全神経突起長を表現した。シスプラチンを用いた48時間のインキュベートが、およそ4585μmにまで、1フィールド当たりの該全神経突起長を抑えた。シスプラチンによる神経突起ネットワーク密度におけるこの抑制が、ビヒクルに比べられた場合、統計的に有意であった(−16%、p<0.001)。
シスプラチンなしの<<ビヒクル>>培地における複数の感覚神経が、1フィールド当たり平均5320μmの全神経突起長を発現させた。シスプラチンを用いた72時間のインキュベートが、およそ4046μmにまで、1フィールド当たりの該全神経突起長を抑えた。シスプラチンによる神経突起ネットワーク密度におけるこの抑制が、ビヒクルに比べられた場合、統計的に有意であった(−24%、p<0.001)。
48時間、3μg/mlのシスプラチンを用いたインキュベート
フィールド当たり平均61本の感覚神経が、48時間においてシスプラチンなく、<<ビヒクル>>と一緒の培地中でのインキュベート後、観察された。3μg/mlのシスプラチンを用いたインキュベートが、フィールド当たりある1平均41本の感覚神経にまで、神経数を抑えた。シスプラチンによる複数の神経細胞体のこの損失(ロス)が、シスプラチンなく、つまり、ビヒクルだけを含有している培地が、48時間後、査定された細胞体の数に比べられた場合、統計的に有意であった(−33%、p<0.001)。
フィールド当たり平均54本の感覚神経が、72時間においてシスプラチンなく、<<ビヒクル>>と一緒の培地中でのインキュベート後、観察された。3μg/mlのシスプラチンを用いたインキュベートが、フィールド当たりある1平均33本の感覚神経にまで、神経数を抑えた。シスプラチンによる複数の神経細胞体の損失(ロス)が、シスプラチンなく、つまり、ビヒクルだけを含有している培地が、72時間後、査定された細胞体の数に比べられた場合、統計的に有意であった(−39%、p<0.001)。
本研究が、複数の1次培養における解離脊髄の複数の運動神経および複数の感覚神経への7β−OH EPIAの神経突起成長促進効果を評価する。複数の神経が、抗β−チューブリン抗体を用いて染色され、全神経長の解析が、<<In Cell Analyzer>>を使用しながら、完遂された。複数の神経細胞培養が、10-9M〜10-4Mの7β−OH EPIAを用いてインキュベートされ、その神経ネットワークの密度が、インキュベート6時間後、12時間後、および24時間後、査定された。複数の運動神経に特異的な成長因子たる、脳由来神経成長因子(BDNF)、および、複数の感覚神経に特異的な成長因子たる、神経成長因子(NGF)が、複数の対照化合物として使用された。我々のデーターが、7β−OH EPIAが、複数の運動神経および複数の感覚神経両方への、顕著な複数の神経栄養効果を持つことを示す。これらの効果が、BDNFの効果およびNGFの効果に比肩可能であったが、このヒドロキシステロイドのナノモル濃度において特に見受けられた。全く持って、我々の知見が、神経突起の外殖を促進させていくためのおよび末梢ニューロパシーを処置するに至る複数の7−ヒドロキシステロイドの使用を裏付ける。
1.1.複数のラット脊髄運動神経細胞培養の調製
複数のラット脊椎運動神経が、Martinouら、1992年(Martinou JC、Martinou I、Kato AC、コリン作動分化因子(CDF/LIF)が、in vitroにおける複数の単離ラット胚運動神経の延命を促進させる。Neuron.1992年4月;8(4):737〜44)により記述された方法に従いながら、調製された。端的に、妊娠15日の複数の妊娠雌Wistarラットが、頸脱臼により屠殺され、その複数の胎児が、子宮から除かれた。それらの脊髄が、除かれ、牛血清アルブミン(脂肪酸なしBSA、Eurobio、Les Ulis、フランス、GXXBSA01−65)1%を含有しているLeibovitz(L15、Invitrogen、11415−049)氷冷培地に入れられた。複数の髄膜が、注意して除かれた。
複数のラット感覚神経が、Hallら、1997年(Hall AK、Ai X、Hickman GE、MacPhedran SE、Nduaguba CO、Robertson CP。ラット感覚神経節(ガングリオン)における神経の不均一さの発生。J Neurosci.1997年4月15日;17(8):2775〜84)により記述された方法に従いながら、調製された。端的に、複数の雌ラット(妊娠15日)が、頸脱臼により屠殺され(Rats Wistar;Janvier、Le Genest−St−Isle、フランス)、それらの胎児が、子宮から除かれた。その複数の背根神経節(DRG)と共にそれらの脊髄が、除かれ、ペニシリン50UI/ml−ストレプトマイシン50μg/ml(PS、1%)および牛血清アルブミン(BSA1%、Sigma A6003)を含有しているLeibovitz氷冷培地(L15、Fisher 11415−049)に入れられた。これらDRGが、回収され、37℃での20分間のトリプシン処理により解離され(トリプシンEDTA 10X、10%、Fisher 15400054)、カルシウムおよびマグネシウムなく、PBS中、稀釈された(Fisher 2007−03)。この反応が、DNase I グレード II(II等級、0.1mg/ml Roche 診断薬 104159)および牛胎児血清(FBS10%、Fisher 10270−098)を含有しているDulbecco修飾Eagle培地(DMEM、Fisher 21969−035)の添加により止められた。この細胞懸濁が、10mlのピペットを用いてすりつぶされ、室温において10分間、350×gにおいて遠心された。解離された複数の細胞のペレットが、次いで、定められた培養培地中、再懸濁された。
本培養培地が、下記:
コントロール(ビヒクル、0.1%DMSO)
7β−OH EPIA−10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、および10-9M(0.1%DMSO中)
BDNF 50ng/mlおよび10ng/ml(0.1%DMSO中)
の条件を伴いながら、12時間のインキュベート期間後、定められた培養培地へと変更された。
本培養培地が、下記:
コントロール(ビヒクル、0.1%DMSO)
7β−OH EPIA−10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、および10-9M(0.1%DMSO中)
NGF 50ng/mlおよび10ng/ml(0.1%DMSO中)
の条件を伴いながら、12時間のインキュベート期間後、定められた培養培地へと変更された。
複数の運動神経および複数の感覚神経が、インキュベート溶液(FCS5%およびサポニン0.1%を有するPBS、Sigma S−7900)中、1:400において稀釈されたモノクローナル抗β−チューブリン抗体(Sigma T8660)により標識された(ラベルされた)。この抗体が、複数の神経細胞体および複数の神経突起を特異的に標識する(ラベルする)。
2.1.複数の運動神経の神経突起長への薬剤処理の効果
複数の細胞伸長の全長の解析が、これらテスト化合物の神経栄養特性のある1指示を与える。
これら結果が、表13中、示されている。50ng/mlおよび10ng/mlでのBDNFを用いた処理が、それぞれ、180%および193%、前記ビヒクルに比べられたら、複数の運動神経により形成された神経突起ネットワークの密度を、有意に増加させた(p<0.001)。
これら結果が、表14中、示されている。50ng/mlおよび10ng/mlのBDNFを用いた処理が、それぞれ、152%および173%、前記ビヒクルに比べられた場合、複数の運動神経により形成された神経突起ネットワークの密度を、有意に増加させた(p<0.001)。
これら結果が、表15中、示されている。10ng/mlのBDNFを用いたインキュベート24時間が、ビヒクルに比べられた場合、本神経突起ネットワーク密度を有意に増加させた(170%、p<0.01)。しかしながら、50ng/mlのBDNFを用いたインキュベートが、本神経突起ネットワーク密度を有意に修飾しなかった。
a)インキュベート6時間後
これら結果が、表16中、示されている。6時間、50ng/mlおよび10ng/mlのNGFを用いた処理が、それぞれ、273%(p<0.001)および191%(p<0.01)、前記ビヒクルに比べられたら、複数の感覚神経により形成された神経突起ネットワークの密度を、有意に増加させた。
これら結果が、表17中、示されている。50ng/mlおよび10ng/mlのNGFを用いたインキュベートが、それぞれ、216%(p<0.001)および128%(p<0.05)、前記ビヒクルに比べられたら、複数の感覚神経により形成された神経突起ネットワークの密度を、有意に増加させた。
これら結果が、表18中、示されている。インキュベート24時間後、50ng/mlおよび10ng/mlのNGFを用いたら、前記ビヒクルに比べられた場合、それぞれ、309%および371%、複数の感覚神経により形成された神経突起ネットワークの密度が、有意に増加した(p<0.001)。
Claims (30)
- 高められたレベルのプロスタグランジンE2もしくはシクロオキシゲナーゼおよびプロスタグランジン合成酵素(シンターゼ)の作用の他の代謝物により、仲介された病状の処置もしくは予防用の、または、抑えられたレベルもしくは抑えられたアベイラビリティの15−デオキシプロスタグランジンJ2により、より悪くされた病状の処置もしくは予防用の、医薬品の製造のための、15−デオキシプロスタグランジンJ2産生を高める剤の、使用。
- 高められたレベルのプロスタグランジンE2もしくはシクロオキシゲナーゼの作用の他の代謝物により、仲介された病状の処置もしくは予防用の、または、抑えられたレベルもしくは抑えられたアベイラビリティの15−デオキシプロスタグランジンJ2により、より悪くされた病状の処置もしくは予防用の、医薬品の製造のための、炎症発症剤存在下、15−デオキシプロスタグランジンJ2産生を容易化させ、プロスタグランジンE2産生を選択的に阻害する剤の、使用。
- 神経突起の外殖を促進させるか、または、末梢ニューロパシーを処置するための医薬品の製造のための、15−デオキシプロスタグランジンJ2産生を高める剤の、使用。
- PPARγ活性化を必要としている病状を処置するための医薬品の製造のための、15−デオキシプロスタグランジンJ2産生を高め、順に、PPARγを活性化させる剤の、使用。
- 前記剤が、式(I):
この破線の円が、これを含有しているこの環が、全部飽和されていてもよく、または、1、2、もしくは3の炭素炭素2重結合を持ってよいことを指し示し;
この破線の線が、この結合が、炭素炭素単もしくは2重結合であってよいことを指し示し;
R1が、水素原子もしくはメチル基を表し;
R2、R3、およびR4が、互いと同一であるか、もしくは、互いと異なっており、各々が、オキソ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、水素原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、もしくはアシル基を表し;
あるいは、医薬として許容可能なその塩もしくはそのエステルである、請求項1〜4のいずれか1項に従っている使用。 - 前記化合物が、7−ヒドロキシテストステロンである、請求項5に従っている使用。
- 前記化合物が、7α−ヒドロキシデヒドロEPIアンドロステロンもしくは7β−ヒドロキシデヒドロEPIアンドロステロンである、請求項5に従っている使用。
- 前記化合物が、7β−ヒドロキシプレニェノロンもしくは7α−ヒドロキシプレニェノロンまたはこのエステルである、請求項5に従っている使用。
- 前記化合物が、7α−もしくは7β−ヒドロキシEPIアンドロステロンもしくはこのエステルである、請求項5に従っている使用。
- 前記化合物が、7α−もしくは7β−ヒドロキシ−17β−エストラジオールもしくはこのエステルである、請求項5に従っている使用。
- 前記化合物が、7α−もしくは7β−ヒドロキシエストロンもしくはこのエステルである、請求項5に従っている使用。
- 前記剤が、式(VI):
Xが、式>CR5R6の基を表し、もしくは、R10が、水素原子を表さない場合、式>SO2の基を表し;
Yが、式>NHもしくは式>CR5R6の基を表し;
Zが、式>C=Oの基、式CH2の基、もしくは直接の結合を表し;
R5が、水素原子を表し、R6が、水素原子、カルボキシ基、もしくはヒドロキシ基を表し;
または
R5およびR6が、一緒に、オキソ基、メチレンジオキシ基、もしくはヒドロキシイミノ基を表し;
R7が、水素原子もしくは低級アルキル基を表し;
R8が、2水素原子またはオキソ基もしくはヒドロキシイミノ基を表し;
R9が、水素原子、低級アルキル基、もしくはハロゲン原子を表し;
R10が、水素原子、低級アルコキシ基、もしくはカルボキシ基を表し;
R11およびR12が、互いと同一であるか、もしくは、互いと異なっており、各々が、水素原子、低級アルキル基、もしくはハロゲン原子を表し;
あるいは、該化合物が、カルボキシ基を含有する場合、その塩もしくはそのエステルである、請求項1〜4のいずれか1項に従っている使用。 - 糖尿およびこの後遺症;複数の虚血血管疾病;炎症と関連された痛み;複数の炎症皮膚病状;脊髄傷害;末梢ニューロパシー;多発硬化症;炎症腸疾病;リューマチ関節炎;代謝症候群(メタボリックシンドローム)X;肥満;肢端巨大症;ならびに創傷治癒
の処置もしくは予防のための医薬品の製造のための請求項5〜17のいずれか1項において定義されたとおりの化合物の使用。 - 癌の処置もしくは予防のための医薬品の製造のための15−デオキシプロスタグランジンJ2産生を高める剤の使用。
- 複数の癌細胞におけるアポトーシスを包含し、癌細胞増殖を阻害していくか、または、腫瘍の成長および進展を阻害していくための医薬品の製造のための15−デオキシプロスタグランジンJ2産生を高める剤の使用。
- 前記癌が、直腸結腸、消化管、胸、肝臓、前立腺、膀胱、甲状腺、乳頭、もしくは食道癌である、請求項19および請求項20のいずれか1項に従っている使用。
- 前記化合物が、請求項5〜17のいずれか1項において定義されたとおりである、請求項19、20、および21のいずれか1項に従っている使用。
- 前記病状が、複数の末梢臓器の炎症もしくは炎症疾病を包含する、請求項1もしくは請求項2に従っている使用。
- 前記末梢臓器が、肝臓もしくは腎臓を包含する、請求項23に従っている使用。
- 前記病状が、複数の炎症気道疾病を包含する、請求項1もしくは請求項2に従っている使用。
- 前記炎症気道疾病が、喘息、鼻炎、気管支炎、もしくは慢性閉塞肺疾病を包含する、請求項25に従っている使用。
- 炎症と関連された痛み;
重大な肢の虚血のような末梢動脈疾病およびこれらの後遺症;
冠状動脈疾病およびこの後遺症;
脳血管疾病およびこの後遺症;
肝臓および腎臓の虚血;
複数の代謝疾病;
肥満およびこの後遺症;
複数の炎症気道疾病;
複数の慢性神経変性疾病;
複数の急性神経学的変性病状;
関節軟骨変性により特徴とされた複数の炎症疾病;ならびに
創傷治癒
の処置および予防のための、請求項1〜4のいずれか1項に従っている使用。 - 炎症と関連された痛み;
重大な肢の虚血;
虚血心臓疾病および心筋梗塞のような;
卒中発作および一過性虚血発作;
粥状(アテローム)硬化腎臓動脈狭窄;
2型糖尿およびこの後遺症、複数の末梢動脈疾病、冠状動脈疾病、複数の腎臓血管疾病、および糖尿ニューロパシー;
喘息および慢性閉塞肺疾病;
アルツハイマー病、パーキンソン病、多発硬化、および複数の末梢ニューロパシー;外傷脳傷害および脊髄傷害;
炎症腸疾病;ならびに
リューマチ関節炎および1次骨関節炎および2次骨関節炎およびこれらの後遺症
の処置および予防のための、請求項1〜4のいずれか1項に従っている使用。 - 前記末梢ニューロパシーが、化学療法剤により起こされている、請求項3もしくは請求項18に従っている使用。
- 前記化学療法剤が、シスプラチンである、請求項29に従っている使用。
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