KR20090086272A - 프로스타글란딘／시클로옥시게나제 대사 경로의 조절 - Google Patents

프로스타글란딘／시클로옥시게나제 대사 경로의 조절 Download PDF

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KR20090086272A
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Abstract

시클로옥시게나제의 활성 및 프로스타글란딘 합성과 관련된 대사 경로와 관계된 다양한 질환 및 장애, 예를 들어, 2형 당뇨병 및 그 후유증, 허혈성 혈관 질환, 염증과 관련된 통증, 염증성 피부 증상, 척수 손상, 말초 신경병증, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 및 류마티스 관절염, 및 다양한 형태의 암은 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 선택적으로 증가시키는 작용제의 이용에 의하여 치료 또는 예방될 수 있다. 이러한 화합물은 7-하이드록시-스테로이드 또는 축합된 인돌이다.
프로스타글란딘, 시클로옥시게나제, 대사 경로, 스테로이드

Description

프로스타글란딘／시클로옥시게나제 대사 경로의 조절{MODULATION OF PROSTAGLANDIN/CYCLOOXYGENASE METABOLIC PATHWAYS}
본 발명은 시클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 프로스타글란딘 신타제(prostaglandin synthase)의 활성 및 프로스타글란딘의 합성에 관여하는 대사 경로(metabolic pathways)를 조절하며, 결과로, 그 일부는 종래 치료법에 대하여 매우 고질적인 것으로 증명되었던 다양한 질병 및 장애의 치료 및 예방에 이용될 수 있는 것으로 발견된 일련의 화합물에 관한 것이다.
프로스타노이드(prostanoids)로도 나타내어지는 프로스타글란딘(prostaglandins(PGs))은 생리학적 및 병리학적 측면 모두에서 세포 기능을 조절하는 산소화 지질(oxygenated lipids)의 광범위하게 분포된 군이다. PGs의 생합성은 포스포리파제 A2(phospholipase A2(PLA2))에 의하여 촉진되는 반응인, 세포막으로부터 주요 지방산인 아라키돈산(arachidonic acid(AA))의 방출을 통하여 개시된다. 방출된 AA는 시클로옥시게나제(COX)에 의하여 불안정한 산소화 중간체(oxygenated intermediate(PGH2))로 변환된다. 일단 형성되면, PGH2 중간체는 프로스타글란딘 신타제라고 불리는 많은 특정 효소(예를 들어, PGE 신타제 또는 PGE-S, PGD 신타제 또는 PGD-S 등)에 의하여, 프로스타글란딘 E2(PGE2), 프로스타시클린(prostacyclin(PGI2)), 프로스타시클린 F2α(PGF2α) 또는 프로스타글란딘 D2(PGD2))와 같은 다양한 프로스타글란딘으로 변환될 수 있다.
COX는 3종의 이소폼(isoform): COX-1, COX-2 및 COX-1 스플라이스 변이체(splice variant) COX-3으로 존재한다. COX-1은 대부분의 조직에서 구조적으로 발현되는 반면, COX-2는 염증전 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 및 스트레스(stress)에 반응하여 일반적으로 유도된다. 이러한 발견에 의하여, COX-2가 프로스타노이드의 유해한 염증전 효과에 대하여 책임이 있다는 직접적 견해에 이르게 된다. 따라서, COX-2의 억제는 염증성 질환의 치료를 위한 약물 개발에서 주요 목표로 생각되어 왔다. 그러나, 연구자들은 COX-2가 기저 기관(basal organ) 및 조직 항상성(homeostasis)에 중요한 역할을 하는 것을 나타내었다.
최근의 임상 시험은 COX-2 억제제에 의한 장기간 치료는 뇌졸중 및 심근 경색의 발생, COX-2 유래 PGI2의 혈관보호 효과(vasoprotective effects)의 차단에 기인하는 합병증을 증가시키는 것을 밝혔다. 그러나, COX 효소의 차단은 또한 PGD2의 생산을 감소시킨다. 말초 조직에서, PGD2는 혈관확장(vasodilatation)을 촉진하고, 혈소판 응집을 억제한다. 뇌에서, 이는 가장 풍부한 프로스타글란딘이며, 최근 연구는 PGD2가 해마 뉴런에서 신경보호 효과(neuroprotective effects)를 매개하는 것을 나타낸다. 따라서, COX-2 유래 PGD2의 차단은 COX-2 억제제에 의한 임상 시험에서 관찰된 뇌졸중 및 심근경색의 발생 증가에 기여할 수 있다.
PGD2는 매우 짧게 존속하며, 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro)에서 탈수되어 프로스타글란딘 15-데옥시-프로스타글란딘 J2(15d-PGJ2)를 포함하는, J2 시리즈의 생물학적 활성 프로스타글란딘을 산출한다. 이 프로스타글란딘은 PGD2의 천연의 화학적으로 안정한 항염증성 유도체이다. 15d-PGJ2는 항염증 작용을 포함하는 광범위한 세포 기능에 관련된 리간드-의존성 핵 전사인자(ligand-dependent nuclear transcription factor)인 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)) 아형(subtype) PPARγ에 대한 고-친화성 리간드(high-affinity ligand)이다. 15d-PGJ2는 PPARγ-의존성 및 PPARγ-비의존성 메커니즘을 통하여 산화질소 신타제(nitric oxide synthase) 유전자, 프로스타글란딘 E 신타제(PGES) 유전자 및 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α(TNF-α)) 유전자와 같은 몇몇 염증 유전자를 억제한다. 래트 연골세포에서, 15d-PGJ2는 사이토카인 자극된 PGE2 합성 및 PGES 발현을 거의 완전히 감소시켰으며, 이는 15d-PGJ2가 이러한 세포에서 염증전 프로스타글란딘 PGE2의 생성을 중단시키는 항염증성 메신저인 것을 나타낸다. 메커니즘에 무관하게, 15d-PGJ2는 염증의 흡수 상(resolution phase) 동안에 생체내에 존재하며, 이는 다시 15d-PGJ2가 염증 반응의 피드백 조절자(feedback regulator)로서 기능할 수 있음을 시사한다. 15d-PGJ2의 투여는 염증성 장 질환 모델인, 래트에서 실험적 대장염 발생을 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서, PGD2 및 15d-PGJ2를 위하여 프로스타글란딘 생성의 균형을 기울게 하는 작용제 및 조건은 항염증 효과를 갖는 것으로 예상된다.
중추 신경계에서, 15d-PGJ2의 항염증 작용은 알츠하이머병, 파킨슨병 및 다 발성 경화증과 같은 신경퇴화 질병(neurodegenerative disorders)에서, 및 염증이 뇌 손상 및 세포사의 원인이 되는 뇌졸중, 척수 손상 및 뇌 외상에서 이로울 수 있다. 모든 이러한 증상에서, 뇌 손상은 과도한 미세교세포 활성화(microglial activation)와 관련된다. 중추 신경계에서, 고유 본래 면역 세포(resident innate immune cells)인 미세교세포(microglia)는 염증 과정에 주요 역할을 한다. 미세교세포의 제어되지 않은 활성화는 염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α, IL-6), NO, PGE2, 및 초과산화물(superoxide)과 같은 다양한 물질을 방출함으로써 뇌 세포에 직접적으로 독성일 수 있다. 몇몇 연구는 15d-PGJ2가 활성화된 미세교세포 및 성상세포(astrocytes)에 의하여 염증성 사이토카인 및 NO의 생성을 억제할 수 있는 것을 나타내었으며, 이는 프로스타글란딘이 과도한 교세포(glial cell) 활성화와 관련된 뇌 손상을 방지하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 시사하는 것이다. 다발성 경화증에 대한 동물 모델인, 실험적 자가면역 뇌염(autoimmnune encephalitis(EAE))의 발병 전 및 발병 시의, 15d-PGJ2의 투여가 EAE의 심각도를 현저하게 감소시켰다는 발견은 15d-PGJ2가 염증성 신경퇴화 질병에서 뇌 손상을 방지하는데 효과적일 수 있음을 시사하는 것이다.
최근의 실험 연구는 15d-PGJ2가 래트에서 뇌내 출혈(intra-cerebral haemorrhage) 후에 뇌 조직 염증 및 행동 장애 및 뉴런 손실을 감소시키며, 뇌졸중의 실험적 모델에서 허혈-재관류 손상(ischaemia-reperfusion injury)으로부터 뇌를 보호하는 것을 나타낸다. 15d-PGJ2의 뇌실내 주입(intra-ventricular infusion)은 PPARγ-의존적 방식으로, 뇌 경색 용적(brain infarct volume)을 감소 시키고, 뇌 및 뉴런 아포토시스(apoptosis)를 억제하고, NF-κB 활성화를 억제하고, 강한 내생적 항산화제인 헴 옥시게나제-1(haeme oxygenase-1(HO-1))을 상향조절(upregulate)하였다. 허혈성 뇌졸중에서 15d-PGJ2의 신경보호 효과를 시사하는 이러한 결과는 급성 허혈성 뇌졸중을 앓는 환자가 정상적인 대상보다 15d-PGJ2의 더 높은 혈장 수준을 가지며, 증가된 혈장 15d-PGJ2가 더 이른 및 늦은 신경학적 결과(neurological outcome)와 관련되는 것을 나타내는 최근 연구에 의하여 더 확실하게 된다. 증가된 혈장 15d-PGJ2는 감소된 경색 용적과 관련되었으며, 이러한 효과는 다른 중요한 예후적 변수의 효과에 비의존적이었다. 따라서, 15d-PGJ2에 대하여 프로스타글란딘 생성의 균형을 이동시키는 작용제 및 조건은 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD) 및 다발성 경화증과 같은 만성 염증성 신경퇴화 장애에서, 및 뇌졸중, 척수 손상 및 외상성 뇌 손상과 같은 급성 증상에서 모두 이로운 효과를 가질 것으로 예상된다.
AD는 세포 밖 Aβ(아밀로이드-β) 플라크(plaque)의 축적(deposition) 및 뇌에서의 세포내 엉킴(tangle) 형성에 의하여 특징지워지는 진행성의 치명적인 신경퇴화 장애이다. Aβ 플라크는 아밀로이드-β 및 Aβ 펩티드로 주로 구성된다. Aβ 축적은 AD의 병인에 원인이 되고, 뉴런 손상을 증가시키는 것으로 제안되었던 염증 반응을 야기한다. 용해성 Aβ-펩티드의 증가된 뇌 수준은 또한, 플라크 축적이 일어나기 오래 전에 뉴런 기능장애 및 인지 장애를 야기하는 것으로 생각된다. 따라서, 뇌에서의 Aβ-펩티드의 형성은 AD의 병인의 주요 계기가 된다.
Aβ의 발생은 Aβ-펩티드의 N 말단측에서 더 큰 전구체 단백질인 β-아밀로 이드 전구체 단백질(βAPP)를 절단하는 프로테아제(protease)에 의하여 개시된다. β-시크리타제(secretase) 또는 β-자리 APP-절단 효소(β-site APP-cleaving enzyme(BACE1))로도 불리는 이 프로테아제는 트랜스-멤브레인 아스파르틸 프로테아제(trans-membrane aspartyl protease)이다. BACE1 단백질 수준 및 β-시크리타제 생성물(β-C-말단 절편))은 산발성(sporadic) AD 환자의 뇌에서 증가된다. 따라서, AD 뇌에서의 Aβ 생성의 감소는 주요한 치료학적 목표이다.
BACE1 mRNA 및 단백질 수준은 염증전 매개체(mediators)에 의하여 증가되며, 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체-γ(PPARγ)에 대한 작용제(agnists)인 약물에 의하여 하향조절된다(down regulated). 좀더 최근에, PPARγ의 소모(depletion)는 BACE1 유전자 프로모터(promoter) 활성을 증가시킴으로써 β-시크리타제 mRNA 수준을 증가시키는 반면, PPARγ 및 PPARγ 활성화제(activators)의 과발현은 BACE1 유전자 프로모터 활성을 억제함으로써 BACE1 전사(transcription)를 특이적으로 조절하며, 이는 PPARγ이 BACE1의 억제제(repressor)일 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, PPARγ 작용제에 의한 유전자 이식(transgenic) hAPP-쥐의 치료는 피질 뉴런(cortical neurones)에서의 BACE1 mRNA 및 세포내 β-아밀로이드 수준을 모두 감소시켰다.
PPARγ의 과발현은 유비퀴티네이션(ubiquitination)의 활성화 및 전구체 단백질 βAPP의 프로테아좀-매개 분해(proteasome-mediated degradation)를 통하여 배양된 세포에서 Aβ 분비를 감소시키는 것으로 나타내어졌으며, PPARγ의 활성화는 배양물 중의 세포에 외부적으로 가해진 Aβ의 안정성에 직접적으로 영향을 미치 는 것으로 보고되었다. 이러한 안정성 저하는 PPARγ 활성화가 아밀로이드 펩티드에 대한 급속한 세포 제거 메커니즘(rapid celluar clearance mechanism)을 유도할 수 있음을 시사한다.
전체적으로 보아, 이러한 데이터는 아밀로이드-β 생성의 조절에서 PPARγ에 대한 주요한 역할을 뒷받침하며, PPARγ의 활성화가 뇌에서 아밀로이드-β 펩티드의 생성을 감소시키는 보호 메커니즘(protective mechanism)을 시사한다.
퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체(PPAR) 아형 PPARγ에 대한 고친화성 리간드인 15d-PGJ2는 PPARγ-의존성 및 PPARγ-비의존성 메커니즘을 통하여 몇몇 염증성 유전자를 억제한다. 따라서, 15d-PGJ2의 내생적 생성을 증가시키는 증상은 뇌 염증 과정을 억제하고, 또한, AD 뇌에서 아밀로이드 펩티드 형성을 감소시킬 것으로 예측된다. 결과적으로, 15d-PGJ2의 내생적 생성을 증가시키는 작용제 및 조건은 알츠하이머병 치료에 유리한 효과를 가질 것으로 예측된다.
J2 시리즈의 프로스타글란딘은 신경성장인자(nerve growth factor(NGF)) 및 뇌 유래 신경성장인자(brain derived nerve growth factor(BDNF)) 생성의 강력한 유도인자(inducers)이고, 세포 배양에서 NGF에 의한 신경돌기 성장(neurite outgrowth)을 촉진한다. 합성 PPARγ 작용제 및 길항제는 15-데옥시-PGJ2의 신경돌기-촉진 효과를 변화시키지 않으므로, 15d-PGJ2의 신경돌기 촉진 능력(promoting ability)은 PPARγ을 통하여 발생되지 않는다. 동물 연구에서, NGF의 뇌혈관 투여(intracerebroventricular administration)는 콜린성 뉴런(cholinergic neurons) 을 구하는 것으로 나타났다. 유사하게, NGF의 뇌혈관 주입은 뇌 허혈을 갖는 게르빌루스쥐의 해마에서 뉴런사를 감소시켰다. BDNF는 시험관내에서 발생 뉴런의 생존 및 성장을 촉진하고, 동물 모델에서 운동 뉴런 기능(motor neuronal functions)을 향상시키는 것으로 나타났다. 일시적 전뇌 허혈을 갖는 동물에서, BDNF는 허혈성 뉴런 손상을 감소시켰다. 불행하게도, 혈액 뇌관문을 통한 이러한 뉴로트로핀(neurotrophins)의 낮은 침투에 기인하여, 임상시험은 현저한 효과를 나타내는데 실패하였다. 그러나, 15d-PGJ2의 내생적인 수준을 증가시키는 조건 또는 처리는 모두 이러한 성장 인자의 국부적 생산을 촉진하고, 뉴런 성장을 촉진하여, 척수 및 뇌에서의 뉴런 회복을 촉진하는 것으로 예측된다.
염증성 마커의 증가된 수준은 허혈성 혈관 질병과 관련되며, 염증은 급성 관상동맥 증후군의 병인에 관련되는 것으로 더욱더 생각되고 있다. 염증은 죽상동맥경화증의 발병 및 진행에 관련 역할을 하지만, 응고 과정을 활성화함으로써 혈전증 발생(thrombosis development)에 일차적 역할을 할 수 있다. 혈관 염증을 감소시키는 조건 및 작용제는 따라서, 관상동맥 심장병과 같은, 염증이 세포사 또는 세포 손상의 원인이 되는 심장혈관 장애에 이로울 수 있다.
프로스타글란딘 D 신타제(Prostaglandin D synthase(PGDS)) mRNA는 심장에서 발현된다. 따라서, 국부적으로 생산된 PGD2는 근육세포(myocytes) 또는 주위 세포(surrounding cells)에서의 15d-PGJ2를 야기할 수 있다. PPARγ는 심장 근육세포에서 존재하며 기능적이다. 최근 연구는 PGD2의 자연적인 대사산물인 15d-PGJ2가 PPAR 의존적 방식으로, IL-1β-자극된 COX-2, PGE-S 및 iNOS를 조절함으로써 심장 근육세포에서 항염증 효과를 발휘하는 것을 나타내었다. 그러나, PGE2 생산의 15d-PGJ2 차단된 IL-1β 자극은 PGI2 또는 PGF2α의 IL-1β 자극을 조절하지 않았으며, 이는 PPARγ 리간드 효과가 PGE-S에 대해서 특이적인 것을 나타낸다. 15d-PGJ2에 의한 IL-1β 유도 PGE-S의 차단은 심장 조직에서 염증전 프로스타글란딘 PGE2의 생산을 감소시킬 것으로 예측된다. 15d-PGJ2는 심장 근육세포에서 헴 옥시게나제-1(HO-1)의 발현을 상승 조절하고, 국부적 허혈-재관류-유도(ischeamia-reperfusion-induced) 심근 경색의 래트 모델에서 심근 경색 크기를 감소시키는 것으로 나타났다. 연구된 상이한 PPARγ 리간드 중에서, 15d-PGJ2가 분명히 가장 현저한 경색 크기의 감소를 야기하였다. 이러한 효과가 PPARγ를 통하여 매개되는 반면에, 항산화 및 세포보호 단백질 HO-1의 증가된 발현은 PPARγ 비의존적이었다. 요컨대, 이러한 결과는 15d-PGJ2의 내생적 수준을 증가시키는 조건 및 작용제가 혈관 염증을 감소시킬 수 있으며, 따라서 심장혈관 장애에 이로울 수 있음을 시사한다.
증가하는 증거들이 특히 비만 존재하에서, 순환 염증 인자(circulating inflammatory factors)의 주요 근원으로서의 지방조직(adipose tissue)을 증명한다. 지방(fat)은 TNF-α, 렙틴(leptin), PAI-1, IL-6 및 안지오텐시노겐(angiotensinogen)을 포함하는 염증전 아디포사이토카인(adipocytokines)을 생산 한다. TNF-α는 NFκB의 주요 활성체(activator)이다. TNF-α는 인슐린 신호를 억제하고, 이에 의하여 인슐린 내성을 야기한다. PAI-1 수준은 CAD 및 당뇨를 예측하며, 이는 비만의 전혈전 상태(pro-thrombotic state)에 대한 주요 기여자이다. IL-6는 C-반응성 단백질(C-reactive protein(CRP))의 간 생산을 자극하고, 비만인 대상의 혈청에서 높은 고민감성(highly sensitive(hs)) CRP 수준에 기여한다. HsCRP는 심근경색, 뇌졸중, 말초 동맥 질병 및 급사를 예측한다. 안지오텐시노겐은 혈관 손상의 다중 메커니즘을 활성화하는 것으로 잘 알려진 Ang Ⅱ의 전구체이다. 일반적으로, 이러한 아디포카인(adipokines)은 모두 염증전 환경(proinflammatory milieu)을 생성하는 증가된 내장 비만을 앓는 인슐린-내성 대상에서 증가된다. 따라서, 2형 진성 당뇨병(T2D) 및 비만은 염증성 증상이다.
지방조직은 다른 조직과 비교하여 가장 높은 수준의 PPARγ를 발현한다. PPARγ 리간드는 지방 세포 분화 및 자유 지방산의 지방조직으로의 흡수(uptake)를 촉진한다. 이는 TNF-α, PAI-1 및 IL-6의 발현을 감소시키고, 지방(fat)에서의 아디포넥틴(adiponectin) 발현을 증가시킴으로써 염증전 환경을 약화시키는 중요한 효과를 갖는다. 따라서, PPARγ 활성화는 혈관 세포에서 직접적으로, 및 지방조직에서 유전자 발현의 조절(regulation)을 통하여 간접적으로 염증을 억제한다.
T2D 및 대사증후군은 골격근, 간 및 지방조직을 포함하는, 말초 조직에서 인슐린의 작용에 대한 내성(resistance)을 특징으로 한다. 티아졸리딘디온(thiazolidinediones)과 같은 특정 합성 리간드에 의한 PPARγ의 활성화는 T2D의 설치류 모델에서 인슐린 분비를 자극하지 않고, 인슐린 민감성을 향상시키며, 글루 코오스, 트리글리세라이드 및 자유 지방산의 순환 수준(circulating levels)을 낮춘다. PPARγ 작용제는 인간에게서 말초 인슐린 내성을 완화시키며, T2D 환자의 치료에 효과적으로 이용되었다.
15-데옥시-프로스타글란딘 J2(15d-PGJ2)는 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 아형 PPARγ에 대한 추정의, 내생성, 고친화성 리간드인 것으로 여겨지는 천연의 화학적으로 안정한 항염증 프로스타글란딘이다. 따라서, 15d-PGJ2의 내생적 생산을 증가시키는 작용제 및 조건은 혈관 염증을 억제하고, 2형 당뇨병에서 인슐린 민감성을 향상시킬 것으로 예상된다.
종양 괴사 인자-알파(tumour necrosis factor(TNF)-alpha)와 같은 염증전 사이토카인은 건선 및 아토피성 피부염에서 과발현된다. TNF-α는 염증의 발병 및 지속(persistence)에 중요한 역할을 하며, 최근 실험 데이터는 건선의 실험 모델에서 병변(lesion)의 발생이 TNF-α에 의하여 매개되는 것을 나타낸다. 건선의 병인에 있어서 TNF-α의 역할을 시사하는 이러한 발견은 TNF-α(인플릭시맙(infliximab))에 대한 단일클론 항체(monoclonal antibody)(mAb) 또는 가용성 TNF 수용체 융합 단백질(TNF receptor fusion protein)(에타네르셉트(etanercept))의 투여가 건선 환자에게서 질병 개선을 야기하는 것을 나타내는 최근 임상시험으로부터의 결과에 의하여 뒷받침된다.
프로스타글란딘 PGD2의 화학적으로 안정한 대사산물인 15d-PGJ2는 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체 γ(PPARγ)에 대한 고친화성 리간드이다.
PGD2는 유도성 NO 신타제(inducible NO synthase(iNOS)) 및 종양 괴사 인자 α(TNF-α)를 포함하는, 활성화된 대식세포, 미세교세포 및 인간 성상세포에서의 몇몇 염증전 유전자를 억제하며, 이러한 억제는 PPARγ 발현에 적어도 부분적으로 의존한다. 또한, 인슐린-민감성 티아졸리딘디온(insulin-sensitizing thiazolidinediones)과 같은 합성 PPARγ 리간드는 인간 대상에서 건선을 개선시키는 것으로 나타났다. 요컨대, 이러한 발견은 15d-PGJ2의 내생적 생산을 증가시키는 작용제 및 조건이 건선 치료에 효과적일 수 있음을 시사한다.
최근의 증거는 특정 합성 PPARγ 작용제가 많은 상피-유래 인간 암 세포주에 대하여 적당한(moderate) 항-증식 활성(anti-proliferative activities)을 발휘하는 것을 나타낸다. 또한, 최근 데이터는 정상 전립선 상피 세포 및 T 림프구가 이러한 PPARγ 리간드에 의한 아포토시스 유도(apoptotic induction)에 좀더 저항성인 것을 나타낸다. 이러한 암-특이적 효과의 관점에서, 화학적 예방제(chemo-preventive agent)로서 PPARγ의 잠재적 이용은 많은 주목을 받았다.
PPARγ에 대한 천연 리간드인 15d-PGJ2는 항종양 활성(anti-tumor activity)을 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어, 15d-PGJ2는 세포 성장을 현저하게 억제하며, 결장암 세포, 위암 세포, 유방암 세포 및 간암 세포를 포함하는 몇몇 형태의 암세포에서 아포토시스(apoptosis)를 유도한다. 기계적 연구는 이러한 성장 억제 효과가 PPARγ-비의존적 메커니즘을 통하여 매개되는 것을 시사한다. 그러나, 관여된 메커니즘에 무관하게, 15d-PGJ2의 내생적 수준을 증가시키는 작용제 또는 조건은 종양 성장 및 진행을 억제할 것으로 예상된다.
증가된 수준의 프로스타글란딘 E2(PGE2)가 다양한 악성 종양(malignancies)에서 검출되었다. 종양에서 증가된 수준의 PGE2의 발견 이상으로, 몇몇 증거는 PGE2가 암의 발생 및 진행에 역할을 하는 것을 시사한다. 예를 들어, PGE2는 아포토시스 및 면역 감시를 억제하면서 세포 증식 및 운동성을 자극할 수 있다. 중요하게, PGE2는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)를 포함하는 전-혈관신생 인자(pro-angiogenetic factor)의 생산을 향상시킴으로써, 적어도 부분적으로, 혈관신생을 유도할 수 있다. 이러한 발견과 일관되게, 암 조직 시편에서 PGE2의 더 높은 수준은 전이성 질환(metastatic disease)의 발생 및 증가된 종양 혈관화(tumor vascularisation)와 현저하게 서로 관련되는 것으로 나타났다.
실험 동물에서의 최근 연구는 PGE2가 발암(carcinogenesis)을 촉진시킬 수 있는 것을 시사한다. PGE2 수용체 EP2의 유전자 파괴(genetic disruption)는 실험 종양의 수 및 크기를 감소시키는 것으로 나타났으며, 다른 연구들은 항-PGE2 단일클론 항체에 의한 처리가 이식가능한(transplantable) 종양의 성장을 억제하는 것을 나타내었다. 이러한 배경지식이 주어지면, 암에서 PGE2의 증가된 양을 야기하는 효소적 경로(enzymatic pathways)를 억제하는 작용제 및 조건은 종양 성장의 진행을 억제하는 것을 예상할 수 있다.
아라키돈산으로부터 PGE2의 합성은 순서대로 작용하는 2종의 효소인 시클로옥시게나제(cyclooxygenase(COX)) 및 프로스타글란딘 E 신타제(prostaglandin E synthase(PGES))를 필요로 한다. PGES의 증가된 발현은 몇몇 인간 악성 종양에서 검출되었으며, 이는 비정상적인 PGES의 발현이 세포 증식 및 종양 성장에 기여하는 PGE2의 생산을 증가시키는 가능성을 높이는 것이다. 15d-PGJ2는 사이토카인-유도 PGE2 합성 및 막 PGE-신타제 발현을 거의 완전히 억제하는 것으로 보고되었다. 결과적으로, 15d-PGJ2의 내생적 수준을 증가시키는 작용제 및 조건은 PGE2 합성, 이에 따라 세포 증식 및 종양 성장을 감소시킬 것으로 예상되며, 따라서, 암 치료에 있어서 이로운 효과를 가질 것으로 예상된다.
우리는 내생적인 7-하이드록시스테로이드인 7β-하이드록시-에피안드로스테론(7β-hydroxy-EPIAndrosterone(7β-OH-EPIA))이 신경보호 효과 및 심장보호 효과(cardioprotective effects)를 모두 갖는 것을 이전에 나타내었다(WO 02/00224, WO 02/00225 및 WO 03/015791). 스테로이드는 시험관 내에서(기관형적 해마조직 절편 배양물(OTHSC) 및 PC12 세포) 뉴런 세포사에 대하여 보호하고, 다수의 생체내 실험 모델에서 뇌 손상으로부터 보호하며, 관류된 래트 심장에서 국부 허혈-유도 심근경색에 대한 보호에 효과적이다. 요컨대, 이러한 발견은 7β-OH-EPIA가 뇌졸중, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, AD와 같은 신경퇴화성 증상의 예방 및 치료에, 및 심근경색(MI)과 같은 심장혈관 증상에 이로운 효과를 가질 수 있음을 시사한다.
좀더 최근에, 우리는 시클로옥시게나제(COX) 억제제인 인도메타신과 함께 PC12 세포를 배양하면 허혈에 대하여 7β-OH-EPIA-유도된 보호를 완전히 둔화시키는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 COX 활성이 7β-OH-EPIA의 신경보호 효과를 위하여 요구되는 것임을 시사한다.
이제, 우리는 나노몰 농도(nanomolar concentration)의 7β-OH-EPIA와 함께 인간 단구성 혈액 세포(human monocytic blood cells(hMBC))를 배양하면 프로스타글란딘 15데옥시-Δ12,14-J2(15d-PGJ2) 생산을 약 10배 증가시키는 것을 나타낸다. 스테로이드는 이러한 세포에서 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생산을 현저하게 변화시키지 않으므로, 7-하이드록시스테로이드의 이러한 효과는 15d-PGJ2에 대하여 특이적인 것으로 여겨진다. 반대로, 염증전 사이토카인 종양 괴사 인자-α(pro-inflammatory cytokine tumour necrosis factor-α(TNFα))와 함께 hMBC를 배양하면, 프로스타글란딘 둘다의 생산을 약 3배 증가시켰다. 또한, TNF-α와 7β-OH-EPIA의 공동 배양(co-incubation)은 7β-OH-EPIA 단독에서 관찰된 증가와 유사하게 15d-PGJ2를 증가시켰으나, 반면에 7β-OH-EPIA의 나노몰 농도의 첨가는 TNFα에 의한 PGE2의 증가를 완전히 무효화시켰다.
15d-PGJ2는 래트 연골세포에서 사이토카인-유도 PGE2 합성 및 막 PGE-신타제(mPGES) 발현을 거의 완전히 억제하는 것으로 보고되었으며, 이는 15d-PGJ2가 이러한 세포에서 염증전 프로스타글란딘 PGE2의 생산을 중단시키는 항염증성 메신저(anti-inflammatory messenger)임을 나타내는 것이다. 따라서, 우리의 발견은 7β-OH-EPIA에 의한 염증전 프로스타글란딘 PGE2의 TNFα-유도 생산의 억제가 15d-PGJ2의 증가된 방출을 통하여 매개됨을 나타낼 수 있다.
15d-PGJ2는 항염증 작용, 신경보호 작용, 심장보호 작용, 대사 작용 및 항종양 작용을 포함하는, 광범위한 세포 작용에 관련되어 왔던 리간드-의존성 핵 전사 인자인 퍼옥시좀 증식체-활성화 수용체(PPAR) 아형 PPARγ에 대한 고친화성 리간드이다. 우리는 15d-PGJ2의 생산을 선택적으로 촉진할 수 있는 7β-OH-EPIA와 같은 작용제가 염증성 장 질환 및 건선과 같은 염증 및 피부 장애에서, 및 염증이 기능장애 및 세포사의 원인이 되는, 뇌졸중, 척수 손상, 외상성 뇌 손상, AD, PD, 관상동맥질환 및 2형 당뇨에서, 및 PGE2의 증가된 생산이 세포 증식 및 종양 성장의 원인이 되는 다양한 형태의 암에서 이로울 수 있음을 발견하였다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 증가된 수준의 프로스타글란딘 E2 또는 시클로옥시게나제 및 프로스타글란딘 신타제 활성의 다른 대사산물에 의하여 매개되는 증상(conditions)의 치료 또는 예방용, 또는 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 감소된 수준 또는 감소된 유효성(availability)에 기인하여 악화되는 증상의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 증가시키는 작용제의 용도에 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 증가된 수준의 프로스타글란딘 E2 또는 시클로옥시게나제-2의 다른 대사산물에 의하여 매개되는 증상의 치료 또는 예방용, 또는 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 감소된 수준 또는 감소된 유효성에 기인하여 악화되는 증상의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한, 염증 유발제(inflammatory causing agent)의 존재하에, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 촉진하고, 프로스타글란딘 E2의 생산을 선택적으로 억제하는 작용제의 용도에 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 신경돌기 성장(neurite outgrowth)을 촉진하거나 또는 말초 신경병증(peripheral neuropathy)을 치료하는 의약 제조를 위한, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 증가시키는 작용제의 용도에 있다.
말초 신경병증은 시스플라틴(cisplatin)과 같은 화학치료제에 의한 치료에 기인할 수 있으며, 또는 당뇨병성 신경병증과 같은 다른 원인으로부터 기인할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PPAR감마의 활성화를 필요로 하는 증상을 치료하는 의약 제조를 위한, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 증가시키고, 차례로 PPAR감마를 활성화시키는 작용제의 용도에 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 증가시키는 화합물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 암 세포 증식을 억제하거나, 암 세포에서 아포토시스(apoptosis)를 유도하거나 또는 종양 성장 및 진행을 억제하는 의약 제조를 위한, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 증가시키는 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명의 이러한 측면이 특히 유용한 암 세포는 직장암 세포(colorectal cancer cells), 위암 세포(gastric cancer cells), 유방암 세포(breast cancer cells), 간암 세포(hepatic cancer cells), 전립선암 세포(prostate cancer cells), 방광암 세포(bladder cancer cells), 갑상선 유두암 세포(thyroid papillary cancer cells) 및 식도암 세포(oesophageal cancer cells)를 포함한다.
또한, 본 발명의 화합물은 하기:
염증과 관련된 통증;
말초 동맥 질환(사지로 향하는 혈액 흐름을 손상시키고, 말초 동맥경화에 의하여 야기되는 장애를 포함) 및 중증 사지 허혈과 같은 그의 후유증;
허혈성 심장 질환(예를 들어 안정형 및 불안정형 협심증) 및 심근경색(MI)과 같은, 관상 동맥 질환 및 그 후유증;
뇌졸중 및 일과성 허혈 발작(transient ischaemic attacks(TIA))과 같은, 뇌혈관 질환 및 그 후유증;
간 및 신장 허혈, 예를 들어 죽상동맥경화성 신동맥 협착(atherosclerotic renal artery stenosis);
2형 당뇨와 같은 대사 질환 및 말초 동맥 질환, 관상 동맥 질환, 신장의 혈관 질환 및 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy)과 같은 그 후유증;
비만 및 2형 당뇨, 말초 동맥 질환 및 관상 동맥 질환과 같은 그 후유증;
천식(asthma) 및 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease(COPD)), 예를 들어 만성 기관지염(chronic bronchitis)과 같은 염증성 기도 질환(inflammatory airways diseases), ;
알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증 및 말초 신경병증과 같은 만성 신경퇴화 질환(chronic neurodegerative diseases);
외상성 뇌 손상 및 척수 손상과 같은 급성 신경 퇴화성 증상(acute neurological degenerative conditions);
염증성 장 질환;
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 및 1차 및 2차 골관절염(osteoarthritis)과 같은 관절 연골(articular cartilage)의 퇴화에 의하여 특징지워지는 염증성 질환 및 그 후유증;
상처 치유(wound healing); 및
화학치료제에 의하여 야기되는 독성 또는 말초 신경병증(peripheral neuropathies)의 치료 및 예방에 이용될 수 있다.
바람직하게, 이러한 작용제는 진성 당뇨병 및 그 후유증; 허혈성 혈관 질환; 염증과 관련된 통증; 염증성 피부 증상; 척수 손상; 말초 신경병증; 다발성 경화증; 염증성 잘 질환; 류마티스 관절염, 대사 증후군 X(metabolic syndrome X), 비만, 말단비대증(acromegaly) 및 상처 치유를 치료하는데 이용될 수 있다.
이러한 작용제는 예를 들어 간 및 신장 허혈에 의하여 야기된, 말초 기관, 예를 들어 간 및 신장의 염증성 질환과 같은 증상의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.
이러한 작용제에 의하여 치료될 수 있는 다른 염증성 증상은 천식, 비염, 기관지염 및 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)과 같은 염증성 기도 질환(inflammatory airway diseases)을 포함한다.
본 발명은 첨부되는 도면에 의하여 상세하게 설명되며, 도면 및 하기에서 7β-하이드록시-에피안드로스테론은 7β-OH EPIA로 나타내어진다.
본 발명에 이용될 수 있는 화합물은 하기 화학식(Ｉ):
[화학식 Ｉ]
Figure 112009039903748-PCT00001
(상기에서,
점선 원은 그것을 포함하는 고리(ring)가 완전히 포화될 수 있거나, 또는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 가질 수 있음을 나타내며;
점선은 결합이 탄소-탄소 단일 또는 이중 결합일 수 있음을 나타내며;
R1은 수소 원자 또는 메틸기를 나타내며;
R2, R3 및 R4는 서로 동일하거나 또는 상이하며, 각각은 옥소기, 하이드록시기, 메르캅토기, 수소 원자, 할로겐 원자, 알콕시기, 아릴옥시기 또는 아실기를 나타낸다)
의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스테르를 포함한다.
상기 화학식에서 숫자 (3) 및 (7)은 단지 안내를 위하여, 채용된 넘버링 시스템(numbering system)을 나타내는 것이다. 물론, R2가 옥소기를 나타내는 경우, 점선 원은 완전히 포화된 고리(고리 내에 이중 결합이 없다는 점으로부터), 또는 1 또는 2개의 이중 결합만을 나타낼 수 있다.
이러한 화합물 중에서, 바람직한 화합물은 하기 화학식(Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
Figure 112009039903748-PCT00002
(여기에서, R1 , R2, R3 및 R4는 상기에서 정의한 바와 같다)
의 화합물 및 그의 에스테르를 포함한다.
이러한 화합물의 다른 바람직한 분류는 하기 화학식(Ⅲ):
[화학식 Ⅲ]
Figure 112009039903748-PCT00003
(여기에서, R2a는 옥소기, 하이드록시기, 메르캅토기 또는 할로겐 원자를 나타내며, R1 , R3 및 R4는 상기에서 정의한 바와 같다)
의 화합물 및 그의 에스테르를 포함한다.
이러한 화합물의 또 다른 바람직한 분류는 하기 화학식(Ⅳ):
[화학식 Ⅳ]
Figure 112009039903748-PCT00004
(여기에서, R1 , R2, R3 및 R4는 상기에서 정의한 바와 같다)
의 화합물 및 그의 에스테르이다.
이러한 화합물의 또 다른 바람직한 분류는 하기 화학식(Ⅴ):
[화학식 Ⅴ]
Figure 112009039903748-PCT00005
(여기에서, R2, R3 및 R4는 상기에서 정의한 바와 같다)
의 화합물이다.
화학식(Ⅱ)의 화합물의 예는 하기 화학식(Ⅱa):
[화학식 Ⅱa]
Figure 112009039903748-PCT00006
를 갖는 7-하이드록시테스토스테론(7-hydroxytestosterone) 및 그의 에스테르를 포함한다. 이 화합물의 7-하이드록시기는 알파 또는 베타 배열(configuration)일 수 있으며, 또는 2종의 이성질체(isomers)의 혼합물이 이용될 수 있다.
화학식(Ⅲ)의 화합물의 예는 하기 화학식(Ⅲa):
[화학식 Ⅲa]
Figure 112009039903748-PCT00007
를 갖는 7α-하이드록시-디하이드로에피안드로스테론(7α-hydroxy-dehydroEPIAndrosterone(7α-하이드록시-DHEA(7α-hydroxy-DHEA))) 및 그의 에스테르, 및 하기 화학식(Ⅲb):
[화학식 Ⅲb]
Figure 112009039903748-PCT00008
를 갖는 7β-동족체(analogue) 및 그의 에스테르, 및 하기 화학식(Ⅲc):
[화학식 Ⅲc]
Figure 112009039903748-PCT00009
를 갖는 7β-하이드록시-프레그네놀론(7β-hydroxy-pregnenolone) 및 그의 에스테르, 및 7α-하이드록시 동족체(7α-hydroxy analogue) 및 그의 에스테르를 포함한다.
화학식(Ⅳ)의 화합물의 예는 그의 7α 또는 7β 이성질체 형태일 수 있는 7-하이드록시에피안드로스테론(7-hydroxyEPIAndrosterone), 및 그의 에스테르를 포함한다. 이후 7β-OH EPIA로 나타내어지는 7β-하이드록시에피안드로스테론은 하기 화학식(Ⅳa):
[화학식 Ⅳa]
Figure 112009039903748-PCT00010
을 가지며, 이후 7α-OH EPIA로 나타내어지는 7α-하이드록시에피안드로스테론은 하기 화학식(Ⅳb):
[화학식 Ⅳb]
Figure 112009039903748-PCT00011
을 갖는다.
화학식(Ⅴ)의 화합물의 예는 하기 화학식(Ⅴa):
[화학식 Ⅴa]
Figure 112009039903748-PCT00012
를 갖는 7β-하이드록시-17β-에스트라디올(7β-hydroxy-17β-oestradiol) 및 그의 에스테르, 및 7α-동족체 및 그의 에스테르, 및 하기 화학식 (Ⅴb):
[화학식 Ⅴb]
Figure 112009039903748-PCT00013
를 갖는 7β-하이드록시-에스테론(7β-hydroxy-oestrone) 및 그의 에스테르, 및 7α-동족체 및 그의 에스테르이다.
본 발명의 화합물에서, R2, R2a, R3 및 R4는 할로겐 원자를 나타내는 경우, 이는 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자, 바람직하게는 염소 원자일 수 있다.
R2, R2a, R3 및 R4가 알콕시기를 나타내는 경우, 이는 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는, 직쇄 또는 분지쇄 기일 수 있다. 그러한 기의 예는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, sec-부톡시기, 이소부톡시기, t-부톡시기, 펜틸옥시기 및 헥실옥시기를 포함한다.
R2, R2a, R3 및 R4가 아릴옥시기(aryloxy group)를 나타내는 경우, 이는 바람직하게는 페녹시기(phenoxy group) 또는 나프틸옥시기(naphtyloxy group)이다.
R2, R2a, R3 및 R4가 아실기(acyl group)를 나타내는 경우, 이는 예를 들어, 지방족 아실기 또는 방향족 아실기일 수 있다. 지방족 아실기의 예는 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 발레릴기, 이소발레릴기, 피발로일기 및 헥사노일기와 같은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 기를 포함한다. 방향족 아실기의 예는 벤조일기, 나프토일기 및 톨루오일기를 포함한다.
화합물이 식 -OR(여기서, R은 R2 등에 관하여 상기에 정의된 임의의 기 및 원자이다)의 기를 포함하는 경우, 활성종은 자유 하이드록시기(free hydroxy group)를 포함하는 화합물일 것이다. 따라서, 생체내에서 하이드록시로 변환될 수 있는 임의의 기는 하이드록시기 대신에 이용될 수 있다.
이러한 화합물은 모 스테로이드(parent steroids)로부터 출발하는, 본래 잘 알려진 다양한 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 EP 1294382에 기재된 방법에 의하여 제조될 수 있다.
화학식(Ｉ)의 화합물은 만성 및 급성 신경 퇴화 질병 또는 증상의 치료 또는 예방에의 이용에 대하여 EP 1294382, WO 2002/000224 및 WO 2002/000225에 개시되어 있고, 만성 및 급성 심장퇴화 질병 또는 증상의 치료 또는 예방에의 이용에 대하여 WO 2002/015791에 개시되어 있으며, 물론 그러한 치료 또는 예방은 단지 화학식(Ｉ)의 화합물에 관하여서만 본 특허청구범위로부터 배제된다.
본 발명에 이용될 수 있는 다른 분류의 화합물은 하기 화학식(Ⅵ):
[화학식 Ⅵ]
Figure 112009039903748-PCT00014
(상기에서,
X는 식 >CR5R6의 기를 나타내거나, 또는 R10이 수소 원자를 나타내지 않는 경우 식 >SO2의 기를 나타내며;
Y는 식 >NH의 기 또는 식 >CR5R6의 기를 나타내며;
Z는 식 >C=O의 기, 식 >CH2의 기 또는 직접 결합(direct bond)을 나타내며;
R5는 수소 원자를 나타내며, R6는 수소 원자, 카르복시기 또는 하이드록시기를 나타내거나;
또는
R5 및 R6는 함께 옥소기, 메틸렌디옥시기(methylenedioxy group) 또는 하이드록시이미노기(hydroxyimino group)를 나타내며;
R7은 수소 원자 또는 저급 알킬기를 나타내며;
R8은 2개의 수소 원자, 또는 옥소기 또는 하이드록시이미노기를 나타내며;
R9은 수소 원자, 저급 알킬기 또는 할로겐 원자를 나타내며;
R10은 수소 원자, 저급 알콕시기 또는 카르복시기를 나타내며;
R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 상이하며, 각각 수소 원자, 저급 알킬기 또는 할로겐 원자를 나타낸다)
의 화합물, 및 상기 화합물이 카르복시기를 포함하는 경우 그의 염 및 에스테르를 포함한다.
화학식(Ⅵ)의 화합물에서, Z는 직접 결합일 수 있고, 그 경우에 Z는 5원 질소함유 헤테로시클릭 고리(5-membered nitrogen-containing heterocyclic ring)로 융합되는 5원 고리의 일부를 형성하며, 또는 Z는 식 >CH2의 기 또는 식 >C=O의 기일 수 있고, 그 경우에 Z는 6원 고리의 일부를 형성한다.
R7, R9, R11 또는 R12가 저급 알킬기를 나타내는 경우, 이는 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기일 수 있다. 그러한 기의 예는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, sec-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 네오펜틸기, 2-메틸부틸기, 1-에틸프로필기, 4-메틸펜틸기, 3-메틸펜틸기, 2-메틸펜틸기, 1-메틸펜틸기, 3,3-디메틸부틸기, 2,2-디메틸부틸기, 1,1-디메틸부틸기, 1,2-디메틸부틸기, 1,3-디메틸부틸기, 2,3-디메틸부틸기, 2-에틸부틸기, 헥실기, 이소헥실기, 헵틸기, 옥틸기, 노닐기 및 데실기를 포함하며, 이 중에서 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기 및 헥실기가 바람직하며, 메틸기 및 에틸기가 더욱 바람직하며, 메틸기가 가장 바람직하다.
R9, R11 또는 R12가 할로겐 원자를 나타내는 경우, 이는 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자일 수 있으며, 이 중에서 불소 원자 및 염소 원자가 바람직하다.
R10이 저급 알콕시기를 나타내는 경우, 이는 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시기일 수 있다. 이러한 기의 예는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, sec-부톡시기, t-부톡시기, 펜틸옥시기, 이소펜틸옥시기, 네오펜틸옥시기, 2-메틸부톡시기, 1-에틸프로폭시기, 4-메틸펜틸옥시기, 3-메틸펜틸옥시기, 2-메틸펜틸옥시기, 1-메틸펜틸옥시기, 3,3-디메틸부톡시기, 2,2-디메틸부톡시기, 1,1-디메틸부톡시기, 1,2-디메틸부톡시기, 1,3-디메틸부톡시기, 2,3-디메틸부톡시기, 2-에틸부톡시기, 헥실옥시기, 이소헥실옥시기, 헵틸옥시기, 옥틸옥시기, 노닐옥시기 및 데실옥시기를 포함하며, 이 중에서 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 부톡시기 및 헥실옥시기가 바람직하며, 메톡시기 및 에톡시기가 더욱 바람직하며, 메톡시기가 가장 바람직하다.
본 발명의 상기 화합물에서, 우리는 특히 하기:
X는 식 >CR5R6의 기를 나타내며, 여기에서 R5는 수소 원자를 나타내고, R6는 수소 원자, 하이드록시기 또는 카르복시기를 나타내거나, 또는 R5 및 R6는 함께 옥소기 또는 메틸렌디옥시기를 나타내며;
Y는 식 >CR5R6의 기를 나타내며, 여기에서 R5는 수소 원자를 나타내고, R6는 수소 원자 또는 카르복시기를 나타내며;
R7은 수소 원자를 나타내며;
R8은 2개의 수소 원자 또는 옥소기를 나타내며;
R9는 수소 원자를 나타내며;
R10은 수소 원자, C1-C4 알콕시기 또는 카르복시기를 나타내며; 및
R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 상이하며, 각각은 수소 원자 또는 C1-C4 알킬기를 나타내는
화합물 및 그의 염 및 에스테르를 선호한다.
본 발명의 화합물의 특정 예는 하기 표 1에 주어진다.
[표 1]
Figure 112009039903748-PCT00015
Figure 112009039903748-PCT00016
Figure 112009039903748-PCT00017
Figure 112009039903748-PCT00018
화학식(Ⅵ)의 가장 바람직한 화합물은 상기 표의 4, 6, 7, 8, 10, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22 및 23으로 번호 붙여진 화합물이다.
본 발명의 화합물이 카르복시기를 포함하는 경우, 예를 들어, R5 또는 R10이 카르복시기를 나타내는 경우, 본 발명의 화합물은 에스테르를 형성할 수 있으며, 이는 종래 에스테르화 기술에 의하여 제조될 수 있다. 수득된 화합물이 의학적으로 이용되는 경우에, 화합물이 약학적으로 허용가능하면, 상기 에스테르의 성질에 대한 특별한 제한은 없으며, 즉, 상기 에스테르는 모화합물(parent compound)보다 덜 활성 또는 용인할 수 없게 덜 활성이지 않으며, 또한 모화합물보다 더 독성 또는 용인할 수 없게 더 독성이지 않다. 그러나, 상기 화합물이 비의학적 용도에 이용되는 경우, 예를 들어 다른 화합물의 제조에서 중간체로서 이용되는 경우, 이러한 제한도 적용되지 않으며, 형성될 수 있는 에스테르의 성질에 대해서는 어떠한 제한도 없다.
에스테르기의 예는 하기:
R7, R9, R11 또는 R12에 관하여 예시된 것과 같은 1개 내지 20개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬기, 및 도데실기, 트리데실기, 펜타데실기, 옥타데실기, 노나데실기 및 에이코실기와 같은 당업계에 널리 공지된 고급 알킬기;
3개 내지 7개의 탄소 원자를 갖는 시클로알킬기, 예를 들어, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기 및 시클로헵틸기;
알킬부분은 1개 내지 3개의 탄소 원자를 가지며, 아릴 부분은 6개 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 카르보시클릭(carbocyclic) 방향족기인, 치환되거나 비치환될 수 있는 아랄킬기(aralkyl group); 이러한 아랄킬기의 예는 벤질기, 페네틸기, 1-페닐에틸기, 3-페닐프로필기, 2-페닐프로필기, 1-나프틸메틸기, 2-나프틸메틸기, 2-(1-나프틸)에틸기, 2-(2-나프틸)에틸기, 벤즈하이드릴기(즉, 디페닐메틸기), 트리페닐메틸기, 비스(o-니트로페닐)메틸기, 9-안트릴메틸기, 2,4,6-트리메틸벤질기, 4-브로모벤질기, 2-니트로벤질기, 4-니트로벤질기, 3-니트로벤질기, 4-메톡시벤질기 및 피페로닐기를 포함함;
비닐기, 알릴기, 2-메틸알릴기, 1-프로펜일기 및 이소프로펜일기와 같은, 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐기;
2,2,2-트리클로로에틸기, 2-할로에틸기(예를 들어, 2-클로로에틸기, 2-플루오로에틸기, 2-브로모에틸기 또는 2-아이오도에틸기), 2,2-디브로모에틸기 및 2,2,2-트리브로모에틸기와 같은 1개 내지 6개, 바람직하게는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 할로겐화 알킬기;
치환 실릴알킬기(silylalkyl group), 예를 들어 2-트리(C1-C4)알킬실릴에틸기, 특히 2-트리메틸실릴에틸기;
치환 및 비치환 페닐기, 예를 들어 페닐기, 톨릴기 및 벤즈아미도페닐기;
치환 및 비치환 페나실기(phenacyl groups), 예를 들어 페나실기 그 자체 또는 p-브로모페나실기;
시클릭 및 비시클릭 테르페닐기(terphenyl group), 예를 들어 게라닐기(gerabyl group), 네릴기(neryl group), 리날릴기(linalyl group), 피틸기(phytyl group), 멘틸기(menthyl group)(특히, m- 및 p-멘틸기), 튜질기(thujyl group), 카릴기(caryl group), 피나닐기(pinanyl group), 보르닐기(bornyl group), 노르카릴기(norcaryl group), 노르피나닐기(norpinanyl group), 노르보르닐(norbornyl group), 멘테닐기(menthenyl group), 캄페닐기(camphenyl group) 및 노르보르네닐기(norbornenyl group);
메톡시메틸기, 에톡시메틸기, 프로폭시메틸기, 이소프로폭시메틸기, 부톡시메틸기 및 메톡시에톡시메틸기와 같은, 알콕시 부분은 1개 내지 6개, 바람직하게는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 가지며, 그 자체는 단일 비치환 알콕시기로 치환될 수 있는 알콕시메틸기;
아세톡시메틸기, 프로피오닐옥시메틸기, 부티릴옥시메틸기, 이소부티릴옥시메틸기, 피발로일옥시메틸기, 1-피발로일옥시에틸기, 1-아세톡시에틸기, 1-이소부티릴옥시에틸기, 1-피발로일옥시프로필기, 2-메틸-1-피발로일옥시프로필기, 2-피발로일옥시프로필기, 1-이소부티릴옥시에틸기, 1-이소부티릴옥시프로필기, 1-아세톡시프로필기, 1-아세톡시-2-메틸프로필기, 1-프로피오닐옥시에틸기, 1-프로피오닐옥시프로필기, 2-아세톡시프로필기 및 1-부티릴옥시에틸기와 같은, 아실기는 바람직하게는 알카노일기(alkanoyl group)이며, 더욱 바람직하게는 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알카노일기이며, 알킬 부분은 1개 내지 6개, 바람직하게는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는, 지방족 아실옥시알킬기(aliphatic acyoxyalkyl group);
시클로헥실아세톡시메틸기, 1-(시클로헥실아세톡시)에틸기, 1-(시클로헥실아세톡시)프로필기, 2-메틸-1-(시클로헥실아세톡시)프로필기, 시클로펜틸아세톡시메틸기, 1-(시클로펜틸-아세톡시)에틸기, 1-(시클로펜틸아세톡시)프로필기 및 2-메틸-1-(시클로펜틸아세톡시)-프로필기와 같은, 아실기는 바람직하게는 알카노일기이며, 더욱 바람직하게는 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알카노일기이며, 시클로알킬 치환기는 3개 내지 7개의 탄소 원자를 가지며, 알킬 부분은 1개 내지 6개, 바람직하게는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는, 시클로알킬-치환 지방족 아실옥시알킬기;
1-메톡시카르보닐옥시에틸기, 1-에톡시카르보닐옥시에틸기, 1-프로폭시카르보닐옥시에틸기, 1-이소프로폭시카르보닐옥시에틸기, 1-부톡시카르보닐옥시에틸기, 1-이소부톡시카르보닐옥시에틸기, 1-sec-부톡시카르보닐옥시에틸기, 1-t-부톡시카르보닐옥시에틸기, 1-(1-에틸프로폭시카르보닐옥시)에틸기 및 1-(1,1-디프로필부톡시카르보닐옥시)에틸기와 같은, 알콕시카르보닐옥시알킬기, 특히 1-(알콕시카르보닐옥시)에틸기, 및 2-메틸-1-(이소프로폭시카르보닐옥시)프로필기, 2-(이소프로폭시카르보닐옥시)프로필기, 이소프로폭시카르보닐옥시메틸기, t-부톡시카르보닐옥시메틸기, 메톡시카르보닐옥시메틸기 및 에톡시카르보닐옥시메틸기와 같은, 알콕시기 및 알킬기 모두 1개 내지 6개, 바람직하게는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 다른 알콕시카르보닐알킬기;
시클로알킬카르보닐옥시알킬기 및 시클로알킬옥시카르보닐옥시알킬기, 예를 들어, 1-메틸시클로헥실카르보닐옥시메틸기, 1-메틸시클로헥실옥시카르보닐옥시메틸기, 시클로펜틸옥시카르보닐옥시메틸기, 시클로펜틸카르보닐옥시메틸기, 1-(시클로헥실옥시카르보닐옥시)에틸기, 1-(시클로헥실카르보닐옥시)에틸기, 1-(시클로펜틸옥시카르보닐옥시)에틸기, 1-(시클로펜틸카르보닐옥시)에틸기, 1-(시클로헵틸옥시카르보닐옥시)에틸기, 1-(시클로헵틸카르보닐옥시)에틸기, 1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시메틸기, 1-메틸-시클로펜틸옥시카르보닐옥시메틸기, 2-메틸-1-(1-메틸시클로헥실카르보닐옥시)프로필기, 1-(1-메틸시클로헥실카르보닐옥시)프로필기, 2-(1-메틸시클로헥실카르보닐옥시)프로필기, 1-(시클로헥실카르보닐옥시)프로필기, 2-(시클로헥실카르보닐옥시)프로필기, 2-메틸-1-(1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시)프로필기, 1-(1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시)프로필기, 2-(1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시)프로필기, 1-(시클로펜틸카르보닐옥시)프로필기, 2-(시클로펜틸카르보닐옥시)프로필기, 1-(1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시)에틸기, 1-(1-메틸시클로펜틸카르보닐옥시)프로필기, 아다만틸옥시카르보닐옥시메틸기, 아다만틸카르보닐옥시메틸기, 1-아다만틸옥시카르보닐옥시에틸기 및 1-아다만틸카르보닐옥시에틸기;
시클로알킬알콕시카르보닐옥시알킬기, 예를 들어 시클로프로필메톡시카르보닐옥시메틸기, 시클로부틸메톡시카르보닐옥시메틸기, 시클로펜틸메톡시카르보닐옥시메틸기, 시클로헥실메톡시카르보닐옥시메틸, 1-(시클로프로필메톡시카르보닐옥시)에틸기, 1-(시클로부틸메톡시카르보닐옥시)에틸기, 1-(시클로펜틸메톡시카르보닐옥시)에틸기 및 1-(시클로헥실메톡시카르보닐옥시)에틸기;
테르페닐카르보닐옥시알킬기 및 테르페닐옥시카르보닐옥시알킬기, 예를 들어, 1-(멘틸옥시카르보닐옥시)에틸기, 1-(멘틸카르보닐옥시)에틸기, 멘틸옥시카르보닐옥시메틸기, 멘틸카르보닐옥시메틸기, 1-(3-피나닐옥시카르보닐옥시)에틸기, 1-(3-피나닐카르보닐옥시)에틸기, 3-피나닐옥시카르보닐옥시메틸기 및 3-피나닐카르보닐옥시메틸기;
5-알킬- 또는 5-페닐- (2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)알킬기, 예를 들어, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)메틸기, (5-페닐-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)메틸기, (5-이소프로필-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)메틸기, (5-t-부틸-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)메틸기 및 1-(5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)에틸기; 및
프탈리딜기(phthalidyl group), 인다닐기(indanyl group) 및 2-옥소-4,5,6,7-테트라하이드로-1,3-벤조디옥솔렌-4-일기와 같은, 다른 기, 특히 생체내에서 쉽게 제거되는 기를 포함한다.
또한, 본 발명의 화합물이 카르복시기를 포함하는 경우, 상기 화합물은 종래 방법에 의하여 염기와의 염으로 변환될 수 있다. 화합물이 의학적으로 이용되는 경우, 화합물이 약학적으로 허용가능하면, 그러한 염의 성질에 대한 특정 제한은 없다. 그러나, 화합물이 비의학적 용도로, 예를 들어 다른 화합물 제조에서 중간체로 이용되는 경우에, 이러한 제한도 적용되지 않으며, 형성될 수 있는 염의 성질에 대한 어떠한 제한도 없다. 그러한 염의 예는 소듐, 포타슘 또는 리튬과 같은 알칼리 금속과의 염; 바륨 또는 칼슘과 같은 알칼리토 금속과의 염; 마그네슘 또는 알루미늄과 같은 다른 금속과의 염; 메틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 디이소프로필아민, 시클로헥실아민 또는 디시클로헥실아민과의 염과 같은 유기 염기 염; 및 라이신 또는 아르기닌과 같은 염기성 아미노산과의 염을 포함한다. 우리는 약학적으로 허용가능한 염을 선호한다.
본 발명의 화합물은 종래 방법에 의하여 산과의 염으로 변환될 수 있다. 화합물이 의학적으로 이용되는 경우, 화합물이 약학적으로 허용가능하면, 그러한 염의 성질에 대한 특정 제한은 없다. 그러나, 화합물이 비의학적 용도로, 예를 들어 다른 화합물 제조에서 중간체로 이용되는 경우에, 이러한 제한도 적용되지 않으며, 형성될 수 있는 염의 성질에 대한 어떠한 제한도 없다. 그러한 염의 예는 특히 하이드로할산(hydrohalic acids(하이드로플루오르산, 하이드로브롬산, 하이드로아이오드산 또는 하이드로클로르산과 같은)), 질산, 과염소산, 카본산, 황산 또는 인산과 같은 미네랄산과의 염; 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산 또는 에탄술폰산과 같은 저급 알킬술폰산과의 염; 벤젠술폰산 또는 p-톨루엔술폰산과 같은 아릴술폰산과의 염; 아세트산, 푸마르산, 타르타르산, 옥살산, 말레산, 말산, 숙신산, 벤조산, 만델산, 아스코르브산, 락트산, 글루콘산 또는 시트르산과 같은 유기 카르복실산과의 염; 및 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 아미노산과의 염을 포함한다. 우리는 약학적으로 허용가능한 염을 선호한다.
화학식(Ⅵ)의 화합물은 만성 및 급성 신경퇴화 질환 또는 증상의 치료 또는 예방에의 이용에 대하여, WO 2006/082409에 개시되어 있으며, 물론 그러한 치료 또는 예방은 단지 화학식(Ⅵ)의 화합물에 관해서만 본 특허청구범위에서 배제된다.
따라서, 본 발명의 화합물은 다양한 만성 및 급성 질환 또는 증상의 치료 또는 예방에 이용될 수 있으며, 이러한 목적을 위하여, 당업계에 널리 알려진 바와 같이, 종래의 약학적 제제로서 제제화될 수 있다. 따라서, 화합물은 예를 들어, 정제, 캡슐, 그래뉼, 분말, 시럽, 스프레이의 형태 또는 다른 잘 알려진 형태로 경구 투여될 수 있으며, 또는 예를 들어, 주사, 스프레이, 점안액(eye drops), 점착성 플라스터(adhesive plasters) 또는 좌약제 등에 의하여 비경구적으로 투여될 수 있다.
이러한 약학적 제제는 종래 수단에 의하여 제조될 수 있으며, 의도하는 제제의 용도 및 형태에 따라, 이 기술분야에서 일반적으로 이용되는 형태의 공지된 보조제(adjuvants), 예를 들어, 비히클(vehicles), 바인더(binders), 붕괴제(disintegrators), 윤활제(lubricants), 안정화제(stabilizers), 교정제(corrigents) 등을 포함할 수 있다. 용량(dose)은 환자의 증상, 나이 및 체중에 따라, 또한 치료되어야 하는 장애의 성질 및 심각도에 따라 달라지나, 성인 환자에 대한 경구 투여의 경우, 우리는 체중 ㎏당 0.01 내지 50 ㎎의 총 하루 용량(더욱 바람직하게는 체중 ㎏당 0.05 내지 20 ㎎)을 일반적으로 제안하며, 이는 단일 용량(single dose)으로, 또는 하루에 1번 내지 3번 분할된 용량(divided dose)으로 투여될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 다양한 염증성 증상 또는 염증을 야기하는 대사경로로부터 발생되는 증상의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 이러한 화합물이 이용되는 용도의 예는 신경돌기 성장의 촉진; 진성 당뇨병(특히 2형 진성 당뇨병) 및 그 후유증의 치료 또는 예방; 허혈성 혈관 질환의 치료 및 예방; 염증과 관련된 통증의 치료; 및 건선 및 상처 치유를 포함하는 염증성 피부 증상의 치료 및 예방을 포함한다. 본 발명의 화합물의 이용에 의하여 치료 또는 예방될 수 있는, 또는 그 효과가 완화될 수 있는 다른 염증성 증상은 척수 손상, 말초 신경병증, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 류마티스 관절염; 및 시스플라틴과 같은 화학치료제, 또는 당뇨병성 신경병증과 같은 다른 원인에 의하여 야기된 말초 신경병증 또는 독성(toxicity)을 포함한다. 마지막으로, 본 발명의 화합물의 이용에 의하여 치료 또는 예방될 수 있는, 또는 그 효과가 완화될 수 있는 증상은 다양한 형태의 암을 포함한다.
도 1은 데이터가 평균±측정표준오차(mean±sem)로 표시된, 실시예 1의 4개의 개별적인 실험으로부터의 결합 데이터인 평균 퍼센티지 세포사(mean percentage cell death)를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에서 기록된 개별적인 실험의 평균 퍼센티지 세포사를 나타 낸다.
도 3은 실시예 1에서 기록된 개별적인 실험의 평균 퍼센티지 세포사를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에서 기록된 개별적인 실험의 평균 퍼센티지 세포사를 나타낸다.
도 5(a) 및 5(b)는 실시예 2에서 기록된, TNF-α의 존재하에 및 TNF-α의 부재하에, 7β-OH-EPIA와 함께 배양된 말초 혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear)의 세포 상청액에서 검출된 PGD2 수준에 대한, 증가하는 농도의 7β-OH-EPIA의 효과를 나타낸다.
도 6(a) 및 6(b)는 실시예 2에서 기록된, TNF-α의 존재하에 및 TNF-α의 부재하에, 7β-OH-EPIA와 함께 배양된 말초 혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear)의 세포 상청액에서 검출된 PGE2 수준에 대한, 증가하는 농도의 7β-OH-EPIA의 효과를 나타낸다.
도 7(a) 및 7(b)는 실시예 2에서 기록된, TNF-α의 존재하에 및 TNF-α의 부재하에, 7β-OH-EPIA와 함께 배양된 말초 혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear)의 세포 상청액에서 검출된 15d-PGJ2 수준에 대한, 증가하는 농도의 7β-OH-EPIA의 효과를 나타낸다.
도 8은 실시예 4에 상세하게 기재된, 결장 조직에서, (A) 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase(MPO)) 및 산화 스트레스 마커(oxidative stress markers) 즉, (B) Prot CO, (C) Tbars 및 (D) 항산화 마커(antioxidant marker) GSH에 대한, 7β-하이드록시-EPIA 처리의 효과를 나타낸다.
도 9는 실시예 4에서 7β-OH-EPIA 처리 중의 다양한 시간에서 결장 15d-PGJ2 수준(A) 및 COX-2, mPGES-1 및 H-PGDS의 상대적 mRNA 발현의 정량화(B)를 나타낸다.
도 10은 실시예 4에서 DSS 투여 중의 프로스타글란딘 E2, D2 및 15d-PGJ2의 결장 합성(colonic synthesis)에 대한 7β-하이드록시-EPIA의 효과를 나타낸다.
도 11은 실시예 4에서 대장염 유도 중의 COX-2, mPGES-1 및 H-PGDS mRNA의 결장 발현을 나타낸다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의하여 상세하게 설명된다.
실시예 1
PC-12 세포에서 허혈에 대한 7β-하이드록시-에피안드로스테론의 보호 효과: 시클로옥시게나제(COX) 억제제 인도메타신에 의한 억제
본 실시예의 목적은 프로스타글란딘 합성이 인도메타신에 의하여 감소되는 경우, 7β-OH-EPIA가 저산소증(hypoxia) 모델에서 그의 신경보호 효능을 유지하는 지를 조사하기 위한 것이었다. 이용된 주요 실험시스템은 PC12 세포에서 허혈-유도 세포독성(ischaemia-induced cytotoxicity)이었다. 측정된 실험 종말점(end point)은 세포사(cell death)이었다.
허혈-유도 PC-12 세포사는 7β-OH-EPIA에 의하여 일관되게 감소되었다. 프로스타글란딘 합성을 차단하는 인도메타신(10 μM)은 허혈-유도 세포사에 대하여 직접적인 효과를 갖지 않았으나, 1 μM 및 10 μM 7β-OH-EPIA의 신경보호 효과를 완전히 상쇄하였으며(antagonized), 이는 프로스타글란딘 합성이 7β-하이드록시-EPIA의 신경보호 효과를 위하여 요구된다는 가설을 뒷받침하는 것이다.
방법론(Methodology)
PC-12 세포 배양
PC-12 세포는 하기 조성: L-글루타민 없는 및 2 mM L-글루타민을 갖는 RPMI 1640, 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 파이루베이트(Sodium Pyrubate), 4.5 g/ℓ의 최종농도(RPMI는 일반적으로 2 g/ℓ를 가짐)를 제공하기 위한 추가적인 글루코오스, 10% 열 비활성화된 말 혈청(heat inactivated horse serum), 5% 우태아 혈청(fetal calf serum) 및 50 유닛(units)의 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 PC-12 배지에서 콜라겐 타입 1(Collagen type 1)으로 코팅된 플라스크 상에 유지되었다. 배지는 2일마다 교환되었다.
PC-12 세포 분석
PC-12 세포의 융합 배양물(confluent cultures)은 50 ng/㎖ NGF를 갖는 무혈청 PC-12 배지(PC-12 NGF 배지)에서 7일 동안 배양함으로써 분화되었다. 세포는 수확, 세척, 계산되며, 1 × 105 PC-12 세포/웰이 글루코오스 없는(glucose free) PC-12 NGF 배지의 마이크로 티터 플레이트(micro titre plate)에서 하룻밤 동안 평판배양하였다. 이후 배지를 시험 화합물을 함유하는 글루코오스 없는 PC-12 NGF 배지로 교환하고, 플레이트를 30분 동안 정상산소 조건(normoxic condition) 하에 두었다.
이 단계 중에, 무산소(anoxic) 노출에 대한 배지 및 시험 물질은 챔버 내에 놓여졌고, 95% N2/5% CO2로 산소를 제거하였다(de-oxygenated). 플레이트 내의 배지는 산소가 제거된 배지로 교환되었으며, 플레이트는 밀봉 및 37℃에서 하룻밤 동안(18시간) 배양되기 전에, 10분 동안 95% N2/5% CO2가 채워진 혐기성(anaerobic) 챔버 내에 놓여졌다. 정상산소 대조군(normoxia controls)에 있어서, 세포는 모든 배양이 5% CO2/95% 공기에서 이루어진 것을 제외하고는 허혈 처리와 동일하게 처리되었다.
유효성(validity)은 트립판 블루 배제(Trypan Blue exclusion)를 이용하여 결정되었다.
결과
PC-12 세포는 저산소증(hypoxia)에 대하여 상대적으로 저항성이다. 이 때문 에, 우리는 독성(toxicity)을 일으키기 위하여 좀더 심한 결합 산소-글루코오스 부족(combined oxygen-glucose deprivation)(허혈) 프로토콜을 이용하였다(도 1). 7β-OH-EPIA는 이 분석에서 용량-의존적으로 세포 보호성(cytoprotective)이었으며, 현저한 신경보호(neuroprotection)가 1 μM(세포사 26% 감소) 및 10 μM(세포사 53% 감소)에서 관찰되었다. 도 1은 이러한 효과를 나타내는 4개 실험으로부터의 결합 데이터를 나타낸다. 상기 데이터는 평균±측정표준오차(mean±sem)로 표현된다. 76%±2.2% 세포사가 허혈 단독에 대하여 관찰되었다. 통계학적으로 현저한 세포사의 감소가 1 μM 7β-OH-EPIA(세포사 26% 감소, p<0.001), 10 μM 7β-OH-EPIA(세포사 53% 감소, p<0.001)에 대하여 관찰되었다. ***=허혈 단독에 대하여 p<0.001.
NMDA 수용체 길항제 MK-801도 PC-12 세포의 허혈-유도 독성을 감소시켰다(도 2). 시클로옥시게나제 억제제 인도메타신은 100 μM에서 적당한(moderate) 보호 효과를 가졌으나(세포사 29% 감소), 더 낮은 농도에서는 그렇지 않았다(도 2). 도 2는 평균 퍼센티지 세포사(mean percentage cell death)를 나타낸다. 데이터는 평균±측정표준오차로 표현되었다. 79%±5.3% 세포사가 허혈 단독에 대하여 관찰되었다. 통계학적으로 현저한 세포사의 감소가 100 μM 인도메타신(IM)(세포사 29% 감소, p<0.05), 10 μM MK801(세포사 62% 감소, p<0.001)에 대하여 관찰되었다. 허혈 단독에 대하여 **=p<0.01, ***=p<0.001.
7β-OH-EPIA의 신경보호 효과는 10~100 μM 인도메타신(IM)에 의하여 완전히 상쇄되었으며(도 3), 이러한 배양물에서의 독성은 허혈 단독에 노출된 배양물로부 터 구별할 수 없었다. 도 3은 평균 퍼센티지 세포사를 나타낸다. 데이터는 평균±측정표준오차로 표현되었다. 76%±4.2% 세포사가 허혈 단독에 대하여 관찰되었다. 통계학적으로 현저한 세포사의 감소가 10 μM 7β-OH-EPIA(세포사 50% 감소, p<0.001), 10 μM MK801(세포사 42% 감소, p<0.001)에 대하여 관찰되었다. 허혈 단독에 대하여 ***=p<0.001
도 4에 도시된 바와 같이, 10μM 인도메타신은 1 μM 및 10 μM 7β-OH-EPIA의 보호 효과를 완전히 상쇄하였다. 도 4는 평균 퍼센티지 세포사를 나타낸다. 데이터는 평균±측정표준오차로 표현되었다. 76%±4.8% 세포사가 허혈 단독에 대하여 관찰되었다. 통계학적으로 현저한 세포사의 감소가 1 μM 7β-OH-EPIA(세포사 25% 감소, p<0.05), 10 μM 7β-OH-EPIA(세포사 50% 감소, p<0.001)에 대하여 관찰되었다. 허혈 단독에 대하여 *=p<0.05, ***=p<0.001.
결론
허혈-유도 PC-12 세포사는 7β-OH-EPIA에 의하여 일관되게 감소하였다. 프로스타글란딘 합성을 차단하는 인도메타신은 10 μM 이하의 농도에서 PC-12 세포사에 직접적으로 영향을 미치지 않았다. 그러나 농도가 100 μM 까지 증가된 경우, 적당한(moderate) 신경보호 효과가 관찰되었다.
인도메타신(10 μM)은 허혈-유도 세포사에 직접적으로 효과를 나타내지 않았으나, 7β-OH-EPIA의 신경보호 효과를 현저하게 약화시켰으며, 이는 프로스타글란딘 합성이 7β-OH-EPIA의 신경보호 효과를 위하여 필요하다는 가설을 뒷받침하는 것이다.
실시예 2
인간 단핵구 세포(human mononuclear cells)에 의한 프로스타글란딘 D 2 , E 2 및 15-데옥시-Δ 12,14 -J 2 의 생산에 대한 7β-하이드록시-에피안드로스테론의 효과
본 실시예의 목적은 7β-OH-EPIA가 인간 단구 세포(monocytic cells)에서 아라키돈산(arachidonic acid)의 특정 대사산물, 즉 프로스타글란딘 D2(PGD2), 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 15-데옥시-Δ12,14-프로스타글란딘 J2(15d-PGJ2)의 생합성을 유도할 수 있는지를 확인하기 위한 것이었다.
단구 혈액 세포(monocytic blood cells)는 염증전 자극제인 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 부재하에, 또는 존재하에, 넓은 범위의 농도의 7β-OH-EPIA에 노출되었으며, 생산된 PGD2, PGE2 및 15d-PGJ2의 양이 효소 면역측정(enzyme immunoassay(EIA))에 의하여 측정되었다.
7β-OH-EPIA(0.1 nM ~ 1000 nM)는 정상적인 인간 말초 혈액 단핵구 세포로부터 PGD2 생산의 농도-의존적 증가를 유도하였다. TNF-α는 대조군과 비교하여 PGD2의 생산을 증가시켰으며, 이는 7β-OH-EPIA의 가장 높은 농도에서 증가되었다. 7 β-OH-EPIA(1 nM ~ 1000 nM)는 정상적 인간 말초 혈액 단핵구 세포에서 PGE2 생합성에 현저한 효과를 미치지 않는 것으로 나타났으나, PGE2 생산의 TNF-α-유도된 증가를 완전히 억제하였다. 7β-OH-EPIA(0.1 nM ~ 1000 nM)는 각각의 대조군과 비교하여, 정상적 인간 말초 혈액 단핵구 세포에서의 15d-PGJ2의 생산을 TNF-α 부재하에, 약 9~12배 증가시켰으며, TNF-α 존재하에, 2~2.5배 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
방법론
말초 혈액 단핵구 세포
단핵구 세포(단구(monocyte) 및 림프구(lymphocyte))는 인간 전혈 48 ㎖을 피콜/하이페크 밀도 원심분리(Ficoll/hypaque density centrifugation)함으로써 제조되었다. 혈액은 피콜(ficoll)의 상부에 층을 이루었으며(밀도 = 1.077 g/㎖), 1시간 동안 400g에서 원심분리되었고(22℃), 그 후에, 휴지기(interphase)에서의 세포를 피펫으로 제거하고 새 튜브로 옮겼다. 튜브는 완전하게 혼합된 RPMI 1640 배지(2 부피(volumes))로 채워졌으며, 이후 5분 동안 400g에서 원심분리되었다(22℃). 상청액을 버리고, 세포 펠렛(pellet)을 RPMI 1640 배지에서 재현탁하였고, 하기 결과 부분에 나타낸 바와 같이, 배양(incubation) 당 적합한 수의 세포를 제공하도록 부피를 조절하였다. 세포는 37℃, 공기 중 5% CO2 및 100% 습도에서, 18시간 동안 최종 부피 1 ㎖ RPMI 1640 배지에서 멸균 플라스틱 1.5 ㎖ 튜브에서 배양되었다. 이후, 7β-OH-EPIA를 첨가하였으며, 재조합 인간 종양 괴사 인자-α(TNF- α)를 가하기 전에, 세포를 37℃에서 추가로 1시간 동안 배양하였고, 배양은 추가 3시간 동안 계속되었다. 7β-OH-EPIA는 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 제조되었으며, 모든 다른 제제는 RPMI 1640 배지에서 제조되었다. 필수 대조군(requisite controls)은 배지 또는 항상 0.1%v/v보다 작은 동일한 농도의 DMSO의 어느 하나를 포함하였다. 배양은 22℃에서 30초 동안 11,000g에서 튜브를 원심분리하고, 상청액을 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 옮김으로써 종결되었다. 이후 샘플을 후술하는 바와 같이 PGD2 측정을 위하여 즉시 프로세스하거나, 또는 PGE2 또는 15d-PGJ2 측정 전에 -20℃에서 저장하였다.
프로스타글란딘 효소 면역측정( EIAs )
TNF-α에 의한 자극의 부재하에, 또는 존재하에, 7β-OH-EPIA에 반응하는 인간 단구 세포(human monocytic cells)에 의한 프로스타글란딘 생산은 구입가능한 EIA 키트를 이용하여 아이코사노이드(eicosanoid)의 세포 밖 수준을 측정함으로써 결정되었다.
PGD 2 EIA
PGD2는 화학적으로 불안정하고 PGJ2, Δ12-PGJ2 및 15-데옥시-Δ12,14-PGJ2를 포함하는 다수의 J 시리즈 프로스타글란딘으로 급속히 분해되기 때문에, 세포 상청액으로부터 직접적으로 측정될 수 없다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 불안정 한 PGD2는 화학적으로 처리되어 안정한 유도체, 이 경우에는 프로스타글란딘 D2-메톡사민(Methoxamine)(PGD2-MOX)을 제공하였으며, 이는 후속 분석을 위하여 저장되었다. 배양 종결 후 즉시, 100 ㎕의 샘플 상청액을 100 ㎕의 메틸 옥심화 시약(Methyl Oximating Regant(메틸옥실아민 하이드로클로라이드(MOX-HCl)) 및 10:90 v/v, 에탄올/물 용액에 용해된 소듐 아세테이트를 함유하는 1.5 ㎖ 튜브에 가하였다. 이후, 튜브를 수욕에 놓고, 60℃에서 30분 동안 반응을 진행시켰다. 이 기간의 끝나면 샘플을 -80℃에서 저장하였다. PGD2의 수준은 케이먼 케미컬즈 프로스타글란딘 D2-MOX EIA 키트(Cayman Chemical's Prostaglandin D2-MOX EIA Kit(Cat. No. 512011))를 이용하여 후속적으로 평가되었다.
PGE 2 EIA
PGE2의 세포밖 수준은 고민감성 프로토콜에 대한 제조자의 지시에 따라 알앤디 시스템즈 파라미터 PGE2 EIA 키트(R&D Systems' Parameter PGE2 EIA Kit)를 이용하여 평가되었다.
15d-PGJ 2 EIA
15d-PGJ2의 세포밖 수준은 제조자의 지시에 따라 어세이 디자인즈 코릴레이트-EIA 프로스타글란딘 15-데옥시-Δ12,14-프로스타글란딘 J2 EIA 키트(Assay Designs' Correlate-EIA prostaglandin 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2 EIA Kit(Cat. No. 900023))을 이용하여 평가되었다.
통계학적 분석
결과는 n=3 배양에 대하여 평균±표준편차(s.d.)로서 표현된다. 두 세트의 데이터가 서로 상이한 확률(P)을 결정하기 위하여, 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정(unpaired Students t-Test)이 이용되었다. P < 0.05인 경우, 차이는 현저한 것으로 간주되었다. Abacus Concepts Inc.으로부터의 소프트웨어 패키지 스타트뷰(software package Statview)를 이용하여 애플 맥킨토시(Apple Macintosh)에서 통계학적 계산이 수행되었다.
결과
인간 단핵구 세포에 의한 PGD 2 생산에 대한 7β- OH - EPIA 의 효과
도 5(a)는 7β-OH-EPIA와 함께 4시간 동안 배양된 1×107 말초 혈액 단핵구 세포/㎖의 세포 상청액에서 검출된 PGD2 수준에 대한 증가하는 농도의 7β-OH-EPIA(0.1 nM ~ 1000 nM)의 효과를 나타낸다. 7β-OH-EPIA는 PGD2 생산의 농도 의존적 증가를 유도하여 100 nM 7β-OH-EPIA에서 최고에 도달하는 것(102±24 pg/㎖ PGD2)으로 나타났으며, 이는 대조군(40±13 pg/㎖ PGD2; P=0.01)보다 매우 컸다.
도 5(b)는 TNF-α(0.5 ㎍/㎖)의 존재하에 배양된 단핵구 세포의 세포 상청액에서 검출된 PGD2 수준에 대한 증가하는 농도의 7β-OH-EPIA(0.1 nM ~ 1000 nM)의 효과를 나타낸다. TNF-α는 DMSO 비히클 대조군(vehicle control)에 비하여 PGD2의 2.3배 증가를 자극하였다(P<0.05). 0.1 nM ~ 100 nM의 농도에서, 7β-OH-EPIA는 TNF-α-유도 PGD2 생합성에 대하여 효과를 갖지 않는 것으로 나타났다. 이 실험에서 이용된 7β-OH-EPIA의 가장 높은 농도에서(1000 nM), PGD2 수준은 164±31 pg/㎖로 증가하였다(TNF-α 단독과 비교하여 P=0.03).
인간 단핵구 세포에 의한 PGE 2 생산에 대한 7β- OH - EPIA 의 효과
도 6(a)는 7β-OH-EPIA와 함께 4시간 동안 배양된 6×105 말초 혈액 단핵구 세포/㎖의 세포 상청액에서 검출된 PGE2 수준에 대한 증가하는 농도의 7β-OH-EPIA(1 nM ~ 1000 nM)의 효과를 나타낸다. 7β-OH-EPIA는 DMSO 대조군과 비교하여 PGE2 수준을 증가시키는 것으로 나타났으나, 이러한 증가는 통계학적으로 현저하게 다르지 않았다.
도 6(b)는 TNF-α(10 ng/㎖)의 존재하에 배양된 단핵구 세포의 세포 상청액에서 검출된 PGE2 수준에 대한 증가하는 농도의 7β-OH-EPIA(1 nM ~ 1000 nM)의 효과를 나타낸다. TNF-α는 DMSO 대조군에 비하여 PGE2의 현저한 1.97배 증가를 자극 하였다(P=0.001). 1 nM ~ 100 nM의 농도에서, 7β-OH-EPIA는 TNF-α 단독에 반응한 167±6 pg/㎖으로부터, 각각 1 nM, 10 nM 및 100nM 7β-OH-EPIA에 대한 75±25 pg/㎖, 82±23 pg/㎖ 및 74±12 pg/㎖까지(TNF-α 단독과 비교하여 모든 P<0.02), TNF-α-유도 PGE2 생합성을 억제하였다. 이 실험에 이용된 7β-OH-EPIA의 가장 높은 농도에서(1000 nM), TNF-α-유도 PGE2 생산에 대한 영향이 관찰되지 않았다.
인간 단핵구 세포에 의한 15d- PGJ 2 생산에 대한 7β- OH - EPIA 의 효과
도 7(a)는 7β-OH-EPIA와 함께 4시간 동안 배양된 단핵구 세포의 세포 상청액에서 검출된 15d-PGJ2 수준에 대한 증가하는 농도의 7β-OH-EPIA(0.1 nM ~ 1000 nM)의 효과를 나타낸다. 7β-OH-EPIA는 이용된 모든 농도에서 15d-PGJ2 수준을 약 9~12배로 상당히 증가시켰다. 수준은 DMSO 대조군에 대한 51±6 pg/㎖으로부터 각각 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM 및 1000 nM 7β-OH-EPIA에 대한 506±101 pg/㎖, 539±51 pg/㎖, 520±45 pg/㎖, 450±133 pg/㎖ 및 590±84 pg/㎖까지 증가하였다(DMSO 대조군과 비교하여 모든 P<0.05).
도 7(b)는 TNF-α(10 ng/㎖)와 함께 배양된 단핵구 세포의 세포 상청액에서 검출된 15d-PGJ2 수준에 대한 증가하는 농도의 7β-OH-EPIA(0.1 nM ~ 1000 nM)의 효과를 나타낸다. 이 실험에 이용된 사이토카인의 모든 농도에서, TNF-α는 15d-PGJ2의 작은 증가를 자극하는 것으로 나타났으나, 이는 DMSO 대조군과 현저하게 다르지 않았다. 이용된 모든 농도에서, 7β-OH-EPIA는 TNF-α 존재하에 15d-PGJ2 수준을 증가시켰다. 15d-PGJ2 수준은 TNF-α 단독 존재하의 157±39 pg/㎖로부터, 각각 TNF-α에 더하여 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM 및 1000 nM 7β-OH-EPIA의 존재하의 348±48 pg/㎖, 334±24 pg/㎖, 356±85 pg/㎖, 406±30 pg/㎖ 및 318±100 pg/㎖까지 증가하였다(TNF-α 단독과 비교하여 모든 P<0.05).
실시예 3
7α-하이드록시-DHEA, 7β-하이드록시-DHEA 및 7β-하이드록시-EPIA는 디하이드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone(DHEA)) 및 에피안드로스테론(epiandrosterone(EPIA))의 천연 대사산물이다. 다수의 스테로이드가 염증 과정 및 면역 과정에 관여하는 것으로 보고되기 때문에, 우리의 목적은 PG 생산 및 관련된 효소 유전자 발현에 대한 이러한 하이드록시스테로이드의 효과를 시험하기 위한 것이었다. 인간 말초 혈액 단구(Human peripheral blood monocytes(PBMC))는 전염증성 사이토카인 TNF-α(10 ng/㎖)를 첨가한, 또는 첨가하지 않은, 각각의 스테로이드의 존재하에(1~100 nM) 4시간 및 24시간 동안 배양되었다. PGE2, PGD2 및 15-데옥시-Δ12,14-PGJ2(15d-PGJ2)는 배양 매질에서 측정되었으며, 시클로옥시게나제(COX-2) 및 PGE 신타제(m-PGES1)의 mRNA의 세포 함량(cell content)이 정량적 RT-PCR에 의하여 평가되었다. TNF-α의 첨가는 PG 생산을 높였으며, COX-2 및 m-PGES1 mRNA 수준을 증가시켰다. 시험된 3종의 스테로이드 중에서, 7β-하이드록시 -EPIA만이 PGE2를 현저하게 감소시키고 15d-PGJ2 생산을 증가시키면서, COX-2 및 m-PGES1 발현을 감소시켰다. 이러한 결과는 7β-하이드록시-EPIA가 항염증 효과를 가짐을 나타내는 것이다.
1.1 인간 PBMC 제제 및 배양
전혈(whole blood)이 기증자로부터 Etablissment Francais du Sang(Brest, France)에서 EDTA-보충된 파우치(EDTA-supplemented pouches)에 수집되었다. PBMC는 수집 후 36시간 내에 멸균 조건하에서 전혈로부터 분리되었다. 경사 밀도 원심분리(gradient density centrifugation)이 Ficoll(Eurobio)에서 수행되었다. RPMI 1640 배지(Eurobio)에서 세척한 후, 세포를 10% 열-비활성화된 우태아혈청(fetal calf serum)(Eurobio), 2 mM 글루타민(D. Dutscher), 100U 페니실린/㎖(D. Dutscher). 및 100 μg 스트렙토마이신/㎖(D. Dutscher)이 보충된 RPMI 1640 배지에 현탁하였다. 단구(monocyte)는 1시간 동안 성형 접착(plastic adherence)에 의하여 선택되었으며, 약 107개 세포가 6-웰 조직 배양 플레이트에 놓여졌다(웰 당 3 ㎖ 배지). 모든 배양은 37℃ 및 5% CO2에서, 가습 배양기(humidified incubator)에서 수행되었다. 세포는 회수되어 0.01 μg/㎖ TNF-α(Sigma-Aldrich)의 존재하에 또는 부재하에, 7β-하이드록시-EPIA, 7β-하이드록시-DHEA 또는 7α-하이드록시-DHEA(20 ㎕ 에탄올 중의)의 어느 하나가 보충된 2 ㎖의 새로운 배양 매질에 분산되었다. 대조군 배양물은 20 ㎕ 에탄올을 포함하였으나, 스테로이드는 포함하지 않 았다. 그들의 PG 함량을 측정하기 위하여 배양 4시간 및 24시간 후에 상청액을 수집하였으며, 세포는 후속적인 RNA 분리에 이용되었다. 트리졸 시약(Trizol Reagent(Invitrogen, Cergy-Pontoise, Franse))을 이용하는 단일 단계 추출 방법(single step extraction method)에 의하여 총 RNA가 제공되었다.
1.2. 실시간 역전사효소 ( reverse transcriptase ) PCR
cDNA는 Superscript first strand synthesis system kit(Invitrogen)을 이용하여 TURBO DNase Ｉ-처리된 RNA(Ambion, Huntingdon, UK)로부터 합성되었다. RT-PCR 증폭 혼합물(50 ㎕)은 2.5×RealMaster Mix/20×SYBR 용액(11.25 ㎕)(Eppendorg, Le Pecq, France) 및 200 nM 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 포함하였다. 반응은 RealPlex ep gradient S mastercycler(Eppendorf)에서 이루어졌다. 순환 조건(cycling condition)은 95℃에서 10분, 및 각각 15초, 30초 및 30초 동안 95℃, 55℃ 및 68℃에서 45사이클(cycle)이었다. 각각의 분석은 대조군 cDNA의 4개의 연속적인 희석 점(dilution point)의 표준 곡선(standard curve)을 포함하였다. HPRT1 하우스키핑 유전자가 정량화에 이용되었다. 모든 올리고뉴클레오티드 프라이머(표 2)는 Genecust/Distribio(Evry, France)에 의하여 합성되었다. 증폭된 생성물의 특이성(specificity)은 생성물의 융해곡선을 시험함으로써 모니터링되었고, 아가로스(agarose) 겔 전기영동에 의한 분석으로 확인되었다.
1.3. PG 측정
구입가능한 EIA 키트가 배양 매질 중의 PGE2 수준(Oxford Biomedical Research, UK) 및 15d-PGJ2 수준(Assay designs, Euromedex, France)의 결정에 이용되었다. PGD2 수준의 측정은 프로스타글란딘 D2-MOX EIA 키트(Cayman Chemical, Euromedex)를 이용하여 얻어졌다. 이 경우 및 분석 이전에, 새로운 샘플은 PGD2를 PGD2-MOX로 변환시키는 MOX-HCl 시약으로 즉시 처리되어 더 이상의 화학적 분해를 방지하였다.
1.4. 데이터의 통계학적 분석
모든 분석은 3번 수행되었으며, 결과는 평균±S.E.M으로 플롯되었다. 그룹간의 차이를 비교하기 위하여, 일원분산분석(one-way analysis of variance)이 수행된 후 던컨 다중 범위 검정(Duncan's multiple range tests)이 수행되었다. p<0.05인 경우, 차이는 통계학적으로 현저한 것으로 간주되었다.
2.1. 7α- 하이드록시 - DHEA 의 효과
인간 HMBC는 4시간 또는 24시간 동안 TNF-α가 첨가되어, 또는 TNF-α가 첨가되지 않고 배양되었다. PGE2, PGD2 및 15d-PGJ2 수준은 배양 매질에서 측정되었으며, 관련 유전자(COX-2, m-PGES1)의 mRNA 생산은 세포에서 측정되었다. 얻어진 데이터는 표 2에 나타낸다. TNF-α의 부재 및 3개의 상이한 농도의 7α-하이드록시-DHEA의 보충은 4시간 동안 배양물에서 PGE2, PGD2 및 15d-PGJ2 수준에 현저한 변화를 야기하지 않았다. 15d-PGJ2만이 24시간 배양 후에 적당하게 증가하였다. 7α-하이드록시-DHEA를 갖는 배양은 24시간 후에 배양물에서 m-PGES1 mRNA 수준을 현저하게 증가시켰다.
TNF-α의 존재는 24시간 후에 모든 PG의 수준에서 예측되는 증가를 야기하였다. 4시간 동안 7α-하이드록시-DHEA를 갖는 공동 배양은 시험된 어떤 농도에서도 PG 수준을 변화시키지 않았다. 반대로, PGE2의 수준, 및 커플 PGD2-15d-PGJ2의 수준은 TNF-α 단독과 비교했을 때, 24시간 동안 7α-하이드록시-DHEA 및 TNF-α와 함께 공동 배양(co-incubation)된 후, 각각 현저하게 증가 및 감소하였다. 또한, TNF-α를 갖는 배양(즉, 염증 활성화)은 COX-2 및 m-PGES1 mRNA 생산의 현저한 증가를 야기하였다. 7α-하이드록시-DHEA를 갖는 공동 배양은 TNF-α 단독과 비교할 때 mRNA 수준에 일관된 변화를 야기하지 않았다.
2.2. 7β-하이드록시-DHEA의 효과
인간 PBMC는 4시간 또는 24시간 동안 TNF-α가 첨가되어, 또는 TNF-α가 첨가되지 않고 배양되었다. PGE2, PGD2 및 15d-PGJ2 수준은 배양 매질에서 측정되었고, 관련 유전자(COX-2, m-PGES1)의 mRNA 생산은 세포에서 측정되었다. 얻어진 데이터는 표 3에 나타낸다. TNF-α의 부재하에, 4시간 동안, 3개의 상이한 농도의 7 β-하이드록시-DHEA를 갖는 배양은 배양 매질에서 PGE2, PGD2 및 15d-PGJ2 수준에 현저한 변화를 야기하지 않았다. 그러나, 배양물에서 7β-하이드록시-DHEA를 갖는 배양의 24시간 후에 PGE2, PGD2 및 15d-PGJ2, 및 m-PGES1 mRNA 수준이 증가하였다.
TNF-α의 존재는 24시간에서 모든 PG에서 예측되는 증가를 야기하였다. 4시간 동안 7β-하이드록시-DHEA를 갖는 공동 배양은 시험된 어떤 농도에서도 PG 수준을 더 변화시키지 않았다. 반대로, PGD2 및 15d-PGJ2의 수준은 TNF-α 단독과 비교했을 때, 24시간 동안 7β-하이드록시-DHEA 및 TNF-α와 함께 공동 배양(co-incubation)된 후, 현저하게 감소하였다. 또한, TNF-α를 갖는 배양(즉, 염증 활성화)은 COX-2 및 m-PGES1 mRNA 생산의 현저한 증가를 야기하였다. 7β-하이드록시-DHEA를 갖는 공동 배양은 TNF-α 단독과 비교할 때 mRNA 수준에 일관된 변화를 야기하지 않았다.
2.3. 7β-하이드록시-EPIA의 효과
인간 PBMC는 4시간 또는 24시간 동안 TNF-α가 첨가되어, 또는 TNF-α가 첨가되지 않고 배양되었다. PGE2, PGD2 및 15d-PGJ2 수준은 배양 매질에서 측정되었고, 관련 유전자(COX-2, m-PGES1)의 mRNA 생산은 세포에서 측정되었다. 얻어진 데이터는 표 4에 나타낸다. TNF-α의 부재하에, 4시간 동안, 3개의 상이한 농도의 7β-하이드록시-EPIA를 갖는 배양은 배양 매질에서 PGE2, PGD2 및 15d-PGJ2 수준에 현저한 변화를 야기하지 않았다. 그러나, 세포 배양물이 7β-하이드록시-EPIA와 함께 24시간 동안 배양된 후에, PGD2 및 15d-PGJ2는 모두 현저하게 증가하였다. COX-2 발현은 4시간 또는 24시간에서 스테로이드에 의하여 현저하게 변화되지 않았으나, m-PGES1 mRNA 수준은 4시간 및 24시간에서 각각 현저한 감소 및 증가를 나타냈다.
TNF-α의 존재는 24시간에서 모든 PG에서 예측되는 증가를 야기하였다. 4시간 동안 7β-하이드록시-EPIA를 갖는 공동 배양은 시험된 어떤 농도에서도 PG 수준을 더 변화시키지 않았다. 반대로, TNF-α 단독과 비교할 때, 24시간에서, 7β-하이드록시-EPIA의 2개의 더 낮은 용량은 PGD2 수준을 감소시켰고, 15d-PGJ2 수준을 증가시켰다. TNF-α를 갖는 배양(즉, 염증 활성화)은 COX-2 및 m-PGES1 mRNA 생산의 현저한 증가를 야기하였다. 세포 배양물이 24시간 동안 10 nM 및 100 nM 7β-하이드록시-EPIA와 함께 배양된 경우, TNF-α에 의한 COX-2 및 m-PGES1 mRNA 생산의 증가는 둔화되었다.
전체적으로 보아, 이러한 결과는 7β-하이드록시-EPIA가 현저한 항염증 효과를 가짐을 명확하게 나타낸다.
[표 2]
Figure 112009039903748-PCT00019
[표 3]
Figure 112009039903748-PCT00020
[표 4]
Figure 112009039903748-PCT00021
실시예 4
대장염의 실험 모델에 대한 7β- OH - EPIA 의 효과
연속 6일 동안 래트에 대한 음료수 중의 덱스트란 소듐 설페이트(DDS)의 투여는 결장 길이 감소, 증가된 MPO 활성, 배상 세포(goblet cell)에서의 점액 감소, 및 COX-2 및 mPGES-1 신타제의 증가된 발현 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생산으로 특징지워지는 결장 염증(colonic inflammation(대장염))을 야기한다. 또한, DDS의 투여는 소화관에서 단백질 카르보닐(protein carbonyl(Prot CO)) 및 Tbars와 같은 산화 스트레스 마커를 증가시킨다. 우리는 DSS 투여 전에 7일 동안 하루에 한번 7β-하이드록시-EPIA에 의한 처리가 DSS-유도 대장염의 발생을 방지할 수 있다는 증거를 제공한다. 0.01 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA의 투여는 대장염 손상 및 조직 염증을 완전히 예방하였으며, 7β-하이드록시-EPIA의 이러한 효과는 산화 스트레스 마커 및 PGE2 생산의 현저한 감소와 관련되었으며, COX-2 발현의 초기 일시적 증가 및 항염증성 프로스타글란딘 15d-PGJ2 생산의 지속적인 증가와 관련되었다. 이러한 결과는 7β-하이드록시-EPIA가 이러한 염증성 장 질환(Inflammatory Bowel Disease(IBD))의 수용된 실험 모델의 매우 낮은 용량 수준에서 현저한 항염증 효과를 가짐을 나타내는 것이다.
실험 과정
동물
모든 실험 프로토콜과 과정은 실험 동물의 이용에 대한, 유럽 공동체의 명령(directive) 86/609/CEE에 따라서 이루어졌다. Charles River(L'Arbresle France)로부터 구입한 수컷 위스터 래트(Wistar rats)(180~200 g)에게 설치류 실험 사료(rodent laboratory chow)를 먹이고, 물은 임의로 주었다.
약물 처리 및 대장염 유도
7일의 적응 기간 후에, 동물을 2개 대조군(모의 대조군(sham-conrol) 및 7β-하이드록시-EPIA-처리된 대조군) 및 2개의 대장염 군(대장염 및 7β-하이드록시-EPIA-처리된 대장염)으로 나누었다. 7β-하이드록시-EPIA(DMSO에 용해된, 0.01, 0.1 및 1 ㎎/체중 ㎏) 또는 DMSO 단독(비히클(vehicle))은 0일째(day 0)에서 7일째 (day 7)까지, 7일 동안, 하루에 한번, 복강내(i.p.) 투여되었다. 대장염은 음료수에의 DSS(분자량 36~50 kDa; MP Biotmedicals, France)의 첨가에 의하여 7일째부터 14일째까지 유도되었다. 2개의 대조군은 수돗물만 받았다.
결장 손상의 현미경 평가
9일째, 11일째, 13일째, 14일째에, 체중, 결장 길이, 대변 경도(stool consistency)가 기록되었고, 새로운 직장 출혈(rectal bleeding)이 육안검사에 의하여 평가되었다. 결장 손상의 심각도(severity)는 Mabley et al., 2001, Inflamm. Res.;50:561-569에 기재된 바와 같이 맹검으로(blindly) 점수 매겨졌 다(0: 잘 형성된 펠렛 및 결장 손상 없음; 1: 배설물과 혼합되어 존재하는 소량의 혈액을 갖는 결장; 2: 배설물과 혼합되어 존재하는 다량의 혈액을 갖는 결장; 3: 혈액으로 채워지고 배설물이 없는 결장).
조직학적 시험
근위 결장(proximal colon)의 일부(1 ㎝)를 4% 포름알데하이드(Labonaord, Templemars, France)에 고정하고, 파라핀에 삽입하였다. 조직 절편(5 ㎛)을 제조한 후, 불순물을 제거하고, 수화시키고, 각각 결장 손상 및 점액 배상 세포 함량의 조직학적 평가를 위한 표준 프로토콜에 따라 헤마톡실린/에오신(hematoxylin/eosin)으로 또는 알시안 블루(Alcian blue)로 염색하였다.
조직 호모제네이트(tissue homogenates)의 제조
결장을 장간막을 따라 열고, 상피 세포를 유리 슬라이드의 무딘 모서리로 쓸어 내린 후, 무게를 측정하고, 세척 및 원심분리하였다. 펠렛을 9 부피(volumes)의 TKE 버퍼(10 mM Tris-HCl; 150 mM KCl; 1 mM EDTA; 0.25 mM PMSF, pH 7.4)에서 균질화한 후, 추가적인 이용때까지 -80℃에서 동결시켰다. 호모제네이트의 단백질 함량은 Lowry et al.(J. Bio Chem 1951;193:365-74)에 따라 측정되었다.
MPO 활성
MPO 활성은 Pelissier et al.(Steroids 2006;71(3):240-8)의 변형과 함께 Krawisz et al.(Gastroenterology 1984;87(6):1344-50)의 o-디아니시딘(o-dianisidine) 방법을 이용하여 호모제네이트에서 평가되었다. MPO 활성은 산화된 o-디아니시딘에 대한 흡광 계수(extinction coefficient)(1.13×104mol-1·㎝-1)를 이용하여 460 ㎚에서의 흡광도(absorbance)의 분당 변화(per minute change)를 일으키는데 필요한 효소의 양으로서 표현되었다.
산화 스트레스의 생화학적 결정
지질 과산화(lipid peroxidation)(Tbars)는 Ohkawa et al.(Anal Biochem 1979;95:315-58)에 의해 기재된 방법의 Albrecht et al.,(1992, Toxicol. Lett;63:91-96)에 의한 변형에 의하여 측정되었다. 레드 1:2 부가물 말론디알데하이드-티오바르비투르산(red 1:2 adduct malondialdehyde-thiobarbituric acid)(Sigma-Aldrich, St Quentin-Fallavier, France)는 532 ㎚에서 측정되었다(이용된 흡광 계수: 0.156 μmol-1·㎝-1). 산화 단백질의 카르보닐 함량(Prot CO)는 Levine et al.(Methods Encymol 1990;186:464-78)의 방법에 의하여 평가되었다. 비-단백질 설프하이드릴기(non-protein sulfhydyl group) 함량(대부분 GSH)은 호모제네이트에서 항산화 방어 마커(anti-oxidant defense marker)로서 얻어지며, Sedlak and Lindsay의 방법(Anal Biochem 1968;25(1):192-205)에 의하여 결정되었다.
프로스타글란딘 면역측정
구입가능한 EIA 키트가 새로운 호모제네이트로부터 얻어진 결장 상청액(colonic supernants)에서의 PGE2(Oxford Biomedical Reserch, UK) 수준 및 15d-PGJ2(Assay designs, Euromedex, France) 수준의 결정에 이용되었다. PGD2 수준의 측정은 프로스타글란딘 D2-MOX EIA 키트(Cayman Chemical, Euromedex)를 이용하여 얻어졌다. 이 경우, 및 분석 전에, 새로운 샘플이 PGD2를 PGD2-MOX로 변환시키는MOX-HCl로 즉시 처리되어, 더 이상의 화학적 분해를 방지하였다.
실시간 역전사효소 PCR
새로운 결장 샘플(300 ㎎)로부터 총 RNA가 트리졸 시약(Trizol Reagent(Invitrogen, Cergy-Pontoise, France))을 이용하여 추출되었다. 폴리(A) RNA가 MicroPoly(A) Purist 키트(Ambion, Huntingdon, UK)에 의하여 총 RNA로부터 정제되었다. cDNA는 Superscript first strand synthesis sytem kit(Invitrogen)을 이용하여 합성되었다. 실시간 PCR이 2.5× RealMaster Mix/20× SYBR 용액(11.25 ㎕)(Eppendorf, Le Pecq, France) 및 300 nM 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 함유하는 혼합물(25 ㎕)을 이용하여 수행되었다. 반응은 RealPlex ep gradient S mastercycler(Eppendorf) 상에서 수행되었다. 순환 조건(cycling condition)은 95℃에서 10분, 및 각각 15초, 30초 및 30초 동안 95℃, 55℃ 및 68℃에서 45사이클(cycle)이었다. 각각의 분석은 대조군 cDNA의 4개의 연속적인 희 석 점(dilution point)의 표준 곡선(standard curve)을 포함하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Genecust/Distribio(Evry, France)에 의하여 합성되었다. 증폭된 생성물의 특이성(specificity)은 생성물의 융해곡선을 시험함으로써 모니터링되었고, 아가로스(agarose) 겔 전기영동에 의한 분석으로 확인되었다. mRNA의 수준은 HPTR1으로의 표준화(normalization) 후에, DMSO 대조군의 mRNA의 수준에 대하여 표현되었다
통계학적 분석
모든 분석은 각각의 동물에 대하여 3번씩 수행되었고, 결과는 평균±측정평균오차(S.E.M.)로 플롯되었다. 그룹간의 차이를 비교하기 위하여, 일원분산분석(one-way analysis of variance)이 수행된 후 던컨 다중 범위 검정(Duncan's multiple range tests)이 수행되었다. p<0.05인 경우, 차이는 통계학적으로 현저한 것으로 간주되었다.
결과
대장염 유도의 경시적 연구
7일 동안(D7에서 D14) 음료수 중의 5% DSS에 의한 래트의 처리는 사망(mortality) 없이 대장염의 임상적 및 조직학적 징후를 나타냈다. 전형적으로, 모든 래트는 대장염 유도 후 5일에(12일째) 심각한 설사를 나타내었으며, 다음날 직장 출혈이 발생하였다. 체중, 부고환 지방 조직 양 및 간 중량의 감소가 모의 대조군(sham-control)과 비교된 경우 모든 DSS-처리된 래트에서 11일째 기록되었다(각각 -5%, -17%, -8%; p<0.05). 이러한 감소는 14일째에도 관찰되었다(표 5). 비장 중량의 변화는 관찰되지 않았다. 모의 대조군과 비교할 때, DSS-처리된 래트는 11일째(-14%, p<0.05)에서 14일째(-26%; p<0.05)까지 두꺼워진 결장 조직 및 대변 감소와 관련된, 결장의 현저한 축소를 나타내었다. 표 5 참조. 결장 점액에서의 MPO 활성은 호중성 백혈구(neutrophil) 침윤(infiltration)의 지수로서 측정되었다. 13일째 및 14일째, 점막 MPO 활성의 9배 및 7배 증가가 모의 대조군과 비교될 때, 대장염 군에서 관찰되었다(p<0.05)(도 8A). MPO 활성의 변화(modification)는 13일째 이전에는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 조직학적 분석과 일치한다. 또한, 결장 염증의 주요 특징, 즉 이유를 알 수 없는 변형(distortion), 점막 조직으로의 호중성 백혈구 침윤 및 보다 적은 무친(mucins)을 포함하는 배상세포의 감소가 모의 대조군과 비교된 경우, 13일째에 대장염 군에서 나타났고, 14일째에 더 현저하였다(데이터는 나타내지 않음).
도 8에 나타낸 바와 같이, 산화 스트레스에 대한 2종의 마커, 즉 Prot CO, Tbars 및 항산화 방어 파라미터(anti-oxidant defense parameter) GSH 수준은 대장염을 앓는 동물의 결장 점막에서 13일째 및 14일째 대조군 수준을 초과하여 현저하게 증가되었다.
대장염에 대한 7β- 하이드록시 - EPIA 의 효과
2개의 낮은 농도(0.01, 0.1 ㎎/㎏)의 7β-하이드록시-EPIA는 14일째에 설사 및 직장 출혈의 억제에 의하여 나타난 바와 같이 DSS-유도 결장 손상을 예방하였다. DSS 투여 전 7일 동안, 하루에 한번, 0.1 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA의 복강내 주입은 부고환의 중량을 변화시키지 않고 대조군 수준까지 체중을 회복시켰다(표 5). 9일째에서 14일째 사이에, 결장 길이 감소는 대장염 군에서 보다, 2개의 더 낮은 용량의 스테로이드(0.01, 0.1 ㎎/㎏)로 처리된 군에서 덜 현저하였다(데이터는 9일째에 대하여 나타내지 않음, 표 5). 7β-하이드록시-EPIA는 14일째에 배상 세포에서 점액 손실 및 소낭선의 기형 및 부고환 침윤과 같은 조직학적 변화(데이터는 나타내지 않음)를 예방하였고, 모든 용량 수준, 0.01, 0.1 및 1 ㎎/㎏에서 MPO 활성을 현저하게 감소시켰다(도 8A). 산화 스트레스 파라미터(Prot CO, Tbars) 및 GSH 수준은 모든 군, 즉 모의 대조군, 대장염 및 7β-하이드록시-EPIA-처리된(0.01, 0.1 및 1 ㎎/㎏) 대장염 군에서, 9일째(나타내지 않음) 및 11일째 유사하였다(도 8B, C 및 D). 산화 스트레스의 모든 마커 및 항산화 방어 마커는 7β-하이드록시-EPIA로 처리된(D0에서 D7) 동물에서 변화되지 않았으며, 반면에 이러한 파라미터들은 대장염 군에서 현저하게 증가하였다(p<0.05). 이러한 결과는 7β-하이드록시-EPIA가 염증성 장 질환(IBD)의 이 실험 모델에서 매우 낮은 용량 수준에서 현저한 항염증 효과를 갖는 것을 나타낸다.
[표 5]
7일 동안(7일째 ~ 14일째) 수돗물에서 DSS-유도 대장염(DSS(5%))을 앓는 래트의 최종 체중 및 기관(organ) 중량, 결장의 길이, 결장 손상 점수의 현미경 평가. 데이터는 실험 종료시(14일째)에 얻어졌으며, 평균±SEM으로 표현된다. 열(line) 내에 동일한 윗첨자(a~c)를 공유하지 않는 값들은 현저하게 상이하다(p<0.05). 직장 손상의 점수는 Mabley et al.(2001, Inflamm. Res., 50, 561-569)에 따랐다(0: 결장 손상 없는 잘 형성된 펠렛; 1: 배설물과 함께 존재하는 소량의 혈액을 갖는 결장; 2:배설물과 함께 존재하는 다량의 혈액을 갖는 결장; 3: 배설물 없이 혈액으로 채워진 결장). * ㎎/체중 ㎏.
군 대조군 대장염 7β-하이드록시-EPIA 전처리된 대장염 군
0 0 0.01* 0.1* 1*
래트의 수(n) 15 23 3 12 12
체중(g) 304.6±6a 279.6±6.5b 297.5±9.5a 272.1±6b 267.3±7.7b
부고환 중량(g) 2.5±0.08a 2.1±0.1b 2.5±0.03a 1.9±0.14b 1.9±0.1b
간 중량(g) 12.7±0.4a 11.1±0.3b 12.1±0.3a 12.3±0.6a 11.9±0.4a
비장 중량(g) 0.9±0.05a 0.9±0.08a 0.8±0.02a 1.03±0.2a 0.82±0.06a
결장 길이(㎝) 18.4±0.6a 13.7±0.4b 16±0.01c 15.6±0.3c 14.2±0.6b
결장 조직에서 프로스타글란딘( PG ) 생산: 7β- 하이드록시 - EPIA 의 효과
7β-하이드록시-EPIA 처리는 대장염 없는 대조군에서 PGE2 및 PGD2 결장 조직 수준을 변화시키지 않았다(데이터 나타내지 않음). 반대로, 0일째부터 7일째까지의 7β-하이드록시-EPIA의 투여는 2일째부터 14일째까지 15d-PGJ2 수준의 기저 수준(basal level)을 초과하는 현저한 증가를 야기하였다. 0.1 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA의 투여는 2일째에 51배 증가에 이르렀으며, 이는 4일째부터 14일째까지 점진적으로 감소하였다(44배 내지 5배 범위의 증분(increments))(도 9A, 도 10C).
7일째부터 14일째까지 염증성 제제 DSS의 투여는 14일째에 염증전 프로스타글란딘 PGE2의 생산을 현저하게 증가시킨 반면에, 항염증성 프로스타글란딘 15d- PGJ2의 수준은 급격히 감소되었다(도 10).
D0부터 D7까지 0.01 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA에 의한 처리는 PGJ2의 수준을 급격히 증가시킨 반면에, 결장 PGE2의 DSS-유도 생산을 완전히 방지하였다(도 10).
모의 대조군 및 대장염 군에서의 COX-2 및 PG 신타제 발현: 7β-하이드록시-EPIA 전처리의 효과
프로스타글란딘 수준의 현저한 변화가 DSS 투여 및 7β-하이드록시-EPIA 처리에 의하여 관찰되었기 때문에, 우리는 실시간 RT-PCR에 의하여 특정 mRNA를 정량화함으로써 COX-2, mPGES-1 및 H-PGDS의 발현이 스테로이드 전처리에 의하여 변화되는지를 시험하였다. 이러한 유전자의 전사가 시험되었으며, HRPT1 하우스-키핑 유전자(house-keeping gene)의 것과 관련시켰다. 대장염 없는 대조군 래트에서, 0.1 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA의 투여는 15시간에서 COX-2 mRNA 수준의 현저한 1.5배 증가를 유도하였으며, 이후 2일째부터 4일째까지 현저하게 감소한 후, 기저 값으로 회복되었다(도 9B). mPGES-1 mRNA 발현은 6시간(6h)에서 15시간(15h)까지 일시적으로 증가하였으며, 2일째에 기저 수준으로 회복되었다. H-PGDS mRNA 합성은 실험 진행 중에 변화되지 않았다.
DSS에 의한 대장염 유도 이후에, COX-2 mRNA 발현의 2.5배 증가가 13일째 및 14일째에 관찰된 반면(도 11A), mPGES-1 mRNA는 단지 13일째에서 현저하게 증가되 었다(도 11B). H-PGDS는 DSS 투여에 의하여 변화되지 않았다.
7β-하이드록시-EPIA에 의한 전처리(0일째부터 7일째까지)는 DSS에 의한 COX-2 및 mPGES-1 mRNA 합성의 이러한 증가를 모두 억제하였다(도 11).
전체적으로 보아, 이러한 발견은 7β-하이드록시-EPIA의 항염증 효과가 동시적인 PGE2 생산의 감소 및 15d-PGJ2 생산의 증가를 통하여 매개되는 것을 나타낸다. 본 연구에서 나타난 15d-PGJ2 생산에 대한 7β-하이드록시-EPIA의 장기간 효과는 7β-하이드록시-EPIA가 염증 및 그 흡수(resolution)에 관련된 유전자의 발현에 지속적인 변화를 야기하는 것을 시사한다.
도면에서, 도 8은 결장 조직에서 (A) 미엘로퍼옥시다제(MPO) 및 산화 스트레스 마커 즉, (B) Prot CO, (C) Tbars 및 (D) 항산화 마커 GSH에 대한 7β-하이드록시-EPIA 처리의 효과를 나타낸다. 바이오마커(biomarker) 수준은 DSS-처리된 래트가 13일째 및 14일째에 대조군과 현저하게 상이한 것을 나타낸다(p<0.05). 7β-하이드록시-EPIA는 대장염 군과 비교하여 13일째 및 14일째에 MPO 활성을 현저하게 감소시켰으며(p<0.05), 모든 용량 수준에서 13일째 및 14일째에 산화 스트레스 파라미터(B, C 및 D)를 대조군 수준으로 회복시켰다. 값은 군(group) 당 3~23마리의 래트로, 평균±SEM(A) 및 모의 군(sham group)에 대한 퍼센트(B, C 및 D)이다. 도 8A 내지 8D에서, 검은색 막대 = 모의 대조군; 흰색 막대 = DSS-대장염 군; 어두운 회색 막대 = DSS + 0.01 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA; 중간 회색 막대 = DSS + 0.1 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA; 및 밝은 회색 막대 = DSS + 1.0 ㎎/㎏ 7β-하이드록시 -EPIA이다.
DSS-대장염 대(versus) 모의 대조군(p<0.05); §7β-하이드록시-EPIA-처리 군 대 DSS-대장염 군(p<0.05).
도 9는 7β-하이드록시-EPIA 처리 중 다양한 시간에서 결장 15d-PGJ2 수준(A), 및 COX-2, mPGES-1 및 H-PGDS(B)의 상대적 mRNA 발현의 정량화를 나타낸다. 값들은 평균±SEM(n=3 내지 15)(A)이며, mRNA는 HPRT1으로의 표준화 이후, 모의 대조군의 것에 대하여 표현되었다(B). 도 9A에서, 검은색 막대 = 모의 대조군; 어두운 회색 막대 = 0.01 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA; 중간 회색 막대 = 0.1 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA; 및 밝은 회색 막대 = 1.0 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA이다. 도 9B에서, 흰색 점이 있는 어두운 회색 막대 = COX-2; 검은색 점이 있는 밝은 회색 막대 = mPGES-1; 및 검은색 점이 있는 흰색 막대 = H-PGDS이다.
도 10은 DSS 투여 중 프로스타글란딘 E2, D2 및 15d-PGJ2의 결장 합성에 대한 7β-하이드록시-EPIA의 효과를 나타낸다. DSS 투여는 13일째 및 14일째 PGE2(A), PGD2(B) 및 15d-PGJ2(C) 합성을 현저하게 증가시켰다(p<0.05). DSS 투여 전 7일 동안 7β-하이드록시-EPIA에 의한 처리는 13일째 및 14일째 PGE2 합성을 감소시킨 반면에(A), 모든 용량 수준에서 15d-PGJ2 생산을 증가시켰다(C). 데이터는 n=3 내지 23인 평균±SEM으로 표현된다. 도 10A 내지 10C에서, 검은색 막대 = 모의 대조군; 흰색 막대 = DSS-대장염 군; 흰색 점이 있는 어두운 회색 막대 = DSS + 0.01 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA; 검은색 점이 있는 밝은 회색 막대 = DSS + 0.1 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA; 및 검은색 점이 있는 흰색 막대 = DSS + 1.0 ㎎/㎏ 7 β-하이드록시-EPIA이다.
도 5는 대장염 유도 중에 COX-2, mPGES-1 및 H-PGDS mRNA의 결장 발현을 나타낸다. 대장염은 13일째 및 14일째 현저하게 증가된 COX-2 mRNA 합성을 야기하였으며(A), mPGES-1은 13일째에만 증가하였다(B). 유전자 발현의 기저 수준으로의 회복은 7β-하이드록시-EPIA의 모든 용량에 의하여 관찰되었다. 도 10A 내지 10C에서, 흰색 막대 = DSS-대장염 군; 어두운 회색 막대 = DSS + 0.01 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA; 중간 회색 막대 = DSS + 0.1 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA; 및 밝은 회색 막대 = DSS + 1.0 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA이다.
실시예 5
1. 콜라겐 유도 관절염에서 7β- 하이드록시 - EPIA 의 효과
본 연구는 콜라겐 유도 관절염 모델과 관련된 염증 및 병리학적 변화에 있어서 7β-하이드록시-EPIA의 유효성(effectiveness)을 시험하였다. 쥐(murine) 모델은 인간 관절염의 임상적 질병 연상(clinical disease reminiscent)을 설명한다.
수컷 DBA/1 쥐(10~12주령)는 꼬리 기부에 주사에 의하여 0일째(day 0)에 완전 프로인드 보조제(complete Freund's adjuvant)(CII/CFA)로 유화된 100 ㎍ 닭 2형 콜라겐(chicken type Ⅱ 콜라겐)을 받았다. 처리는 하기에 기재된 바와 같이, 피하 주사에 의하여 20일째부터 50일째까지(그룹 2, 3 및 4), 및 피하 주사에 의하여 0일째부터 30일째까지(그룹 5), 매일 이루어졌다:
실험 그룹(n=10/그룹)
그룹 1: 0일째 CII/CFA, 비처리-모의 처리, 20일째부터 50일째까지
그룹 2: 0일째 CII/CFA, 7β-하이드록시-EPIA 1 ㎍/㎏ 처리, 20일째부터 50일째까지
그룹 3: 0일째 CII/CFA, 7β-하이드록시-EPIA 10 ㎍/㎏ 처리, 20일째부터 50일째까지
그룹 4: 0일째 CII/CFA, 7β-하이드록시-EPIA 100 ㎍/㎏ 처리, 20일째부터 50일째까지
그룹 5: 0일째 CII/CFA, 7β-하이드록시-EPIA 10 ㎍/㎏ 처리, 0일째부터 30일째까지
그룹 6: 0일째 CII/CFA, 비처리-모의 처리 0~30일째
종료 시에, 뒷다리를 제거하고, 프로스타글란딘 측정을 위하여 무릎 호모제네이트를 수집하였으며(그룹 1 및 4만), 표준 방법에 의하여 병리학 시험을 위하여 발을 고정하였다. 각 발을 세로로 반을 자르고, 절개하고, 절편을 만들기 위하여 탈회하였다. 탈회된 샘플은 일반적으로 처리되고, 절편을 만들어, 시험을 위하여 하나의 염색된 절편을 제조하였다. 이는 각 견본의 반을 모두 포함하였다. 각 발을 표준 점수 시스템(standard scoring system)에 따라 점수 매겼다. 샘플은 실험 프로토콜 또는 그룹의 정체(identity)에 대한 지식 없이, 맹검 형식(blind fashion)으로 점수 매겨졌다.
임상적 관절 팽창(clinical joint swelling)은 21일째부터 50일까지 1주일에 2번 점수 매겨졌다. 각 경우에, 4개의 사지 각각은 하기 점수 시스템(임상적 질병 점수와 결합됨)에 따라 점수가 주어졌다.
0 정상
1 전체 관절의 약간의 팽창(swelling) 또는 개별적인 발가락의 염증
2 발적(redness)과 함께 전체 관절의 중간 정도의 팽창 및/또는 하나 이상의 발가락의 염증
3 심각한 관절 염증 및 다수 발가락에 퍼진 발적
4 심각한 관절 염증 및 다수 발가락에 퍼진 발적, 뼈 재형성(bone remodelling)의 명백한 징후
결과는 표 6에 나타낸다. 대조군과 비교할때(모의 대조군 1 및 6이 결합됨), 7β-하이드록시-EPIA에 의한 처리는 상기 임상적 질병 점수 방법에 의하여 측정된 관절 팽창의 현저한 감소를 가져왔다. 이러한 발견은 발의 감소된 팽창의 병리학적 증거에 의하여 확인되었다(표 7). 표 7로부터, 콜라겐이 관절염을 유도하기 위하여 주어진 것과 동시에 7β-하이드록시-EPIA 처리가 시작되고 (0일째) 30일째까지 처리가 계속된 경우에, 10마리 동물 중 9마리가 발 관절의 조직병리학적 변화가 전혀 없는 가장 낮은 병리학 점수를 나타내는 것을 볼 수 있었다. 따라서, 류마티스 관절염과 같은 질병의 7β-하이드록시-EPIA에 의한 초기 치료는 이로운 효과를 가질 수 있다.
2. 무릎 호모제네이트에서 프로스타글란딘의 측정
상기에서 제조된 무릎 호모제네이트에서의 15d-PGJ2 및 PGE2의 수준을 표준 분석 기술을 이용하여 측정하였다. 표 8로부터, PGE2의 수준은 비처리 대조군과 비교할 때 0.1 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA로 처리된 군에서 더 낮았다. 0.1 ㎎/㎏ 7β-하이드록시-EPIA로 처리된 군은 비처리 대조군과 비교할 때 15d-PGJ2의 더 높은 수준을 가졌다.
결론
7β-하이드록시-EPIA의 명백한 항염증 효과가 있다. 유도 시의 치료는 가장 큰 효과를 갖는 것으로 나타났다. 이는 이 모델에서 스테로이드를 포함하는 다른 시험 화합물에 의하여도 유지되었으며 존재하는 변화를 반대로 하는 것에 대립하는 것으로서 관절 손상 예방의 상대적 용이함을 반영한다. 이를 말하면서, 20일째까지 처리가 지연되었을 때, 고용량의 7β-하이드록시-EPIA로 처리된 이러한 동물의 질병 수준은 유사하였다. 질병 보호의 이러한 수준은 치료 계획(therapeutic regimen)에 있어서 좋다. 명확한 용량 효과인지 조사하기 위하여는 통계학적 분석이 필요하지만, 가장 낮은 용량의 7β-하이드록시-EPIA는 질병 수준에 효과를 덜 가졌다.
프로스타글란딘 E2 및 15d-J2 수준의 분석은 명백한 치료 효과를 나타내었다. PGE2의 수준은 비처리된 대조군과 비교하여 처리된 쥐에서 더 낮았다. 반대로, 15d-PGJ2의 수준은 처리 후에 증가하였다.
함께 고려되어, 임상적 질병 관찰과 조직병리학은 이 관절염 모델에서 7β-하이드록시-EPIA의 항염증 효과에 대한 강한 증거를 제공한다. 이 모델에서 거의 변화없는 사실이지만, 질병 발병 전의 치료가 가장 효과적이었다. 그러나, 대략 발병 시점에 주어진 경우, 7β-하이드록시-EPIA가 질병 진행을 억제할 수 있다는 발견은 많은 경쟁물질로부터 이 화합물을 주목하고, 매우 유망하다.
[표 6]
CIA 래트의 조직병리학에 대한 7β-하이드록시-EPIA의 효과
20일째~50일째까지의 처리
그룹 n 조직병리학 점수(50일째의 양 발)
모의-비처리 10 1.35
7β-하이드록시-EPIA 1.0 ㎍/㎏ 10 0.60
7β-하이드록시-EPIA 10.0 ㎍/㎏ 9 0.44
7β-하이드록시-EPIA 100.0 ㎍/㎏ 10 0.85
이 결과로부터, 1.0 ㎍/㎏만큼 낮은 용량에서의 7β-하이드록시-EPIA가 관절 손상을 감소시킬 수 있는 것으로 결론지어질 수 있다.
[표 7]
CIA 래트의 조직병리학에 대한 7β-하이드록시-EPIA의 효과
0일째~30일째까지의 처리
그룹 n 조직병리학 점수(50일째의 양 발)
모의-비처리 9 1.22
7β-하이드록시-EPIA 10.0 ㎍/㎏ 10 0.2*
*10마리 중 9마리의 동물이 조직병리학적 변화가 완전히 없었다.
이 결과로부터, 10.0 ㎍/㎏ 7β-하이드록시-EPIA가 질병, 즉 관절 손상의 발생을 거의 완전히 예방하는 것으로 결론지어질 수 있다.
[표 8]
50일째, CIA 래트에서 관절 팽창 및 프로스타글란딘 함량에 대한 7β-하이드록시-EPIA(0.1 ㎍/㎏ 일, D20-50)의 효과
비처리 처리
임상적 점수 7.50±2.51 3.10±2.96
PGE2(pg/㎖) 177.09±70.08 95.61±34.65
15d-PGJ2(pg/㎖) 19.12±6.43 78.96±22.18
PGE2/15d-PGJ2 9.26 1.21
이 결과로부터, 7β-하이드록시-EPIA가 콜라겐-유도 관절염의 임상적 증상의 심각도를 감소시키며, 염증의 흡수, 세포 보호 및 조직 회복을 위하여, 조직 프로스타글란딘 생성을 변화시키는 것으로 결론지어질 수 있다.
실시예 6
시스플라틴-유도 말초 신경병증 모델에 대한 7β- 하이드록시 - EPIA 의 효과
시스플라틴은 암 치료에 이용되는 항유사분열(antimitotic) 화합물이다. 그러나 그 이용은 심각한 역효과에 의하여 제한되며, 그 중 말초 신경병증은 특히 문제이다. 시스플라틴-유도 신경병증은 현저하게 감수성인 신경병증이다. 환자들은 사지 말단의 감수성(sensitivity) 손실과 후속되는 감각 기능장애(sensory ataxia)를 앓는다. 조직학 연구는 축색 퇴화(axonal degeneration)를 나타낸다. 세포 배양에서, 시스플라틴에 의한 감수성 뉴런(sensitive neuron)의 처리는 신경돌기 네트워크(neurite network) 밀도의 감소 및 이후 세포체(cell body) 퇴화를 유발하였다. 감각 뉴런에 대한 특이적 성장인자인 신경성장인자(Nerve Growth Factor(NGF))는 이 중독(intoxication)에 대하여 뉴런에 대한 보호 효과를 갖는다. 따라서, 시스플라틴에 의한 배양물 중의 감각 뉴런 중독은 말초 신경병증에서 화합물의 신경보호 효과의 연구에 대한 적합한 모델이다.
7β-하이드록시-EPIA의 신경보호 효과는 말초 신경병증 모델에서 래트 감각 뉴런에 대하여 평가되었다.
분리된 등배신경절(dorsal root ganglia) 감각 뉴런의 일차 배양물(primary cultures)은 7β-OH EPIA와 함께, 또는 7β-OH EPIA 없이, 48시간 및 72시간 동안, 3 ㎍/㎖ 시스플라틴과 함께 배양된 후, 하기 파라미터가 평가되었다;
- 항 MAP2 항체(anti MAP2 antibody)로 염색된 뉴런 세포체(미세소관 관련 단백질 2(microtubule associated protein 2))
- 항 β-튜뷸린 항체(anti β-Tubulin antibody)로 염색된 신경돌기 네트워크 밀도
뉴런의 배양물
래트 감각 뉴런은 Hall et al 1997[Hall et al.(J. Neurosci. 1997 Apr 15;17(8);2775-84]에 의하여 기재된 방법에 따라 제조되었다. 요약하여, 암컷 래트(15일 잉태(gestation))를 경추 탈골에 의하여 죽이고(Rats Wistar; Janivier, Le Genest-St-Isle, France), 태아는 자궁으로부터 제거되었다. 등배신경절(DRG)을 갖는 그들의 척수는 제거되었고, 페니실린 50 UI/㎖-스트렙토마이신 50 ㎍/㎖(PS, 1%) 및 소혈청 알부민(BSA 1%, Sigmal A6003)을 함유하는 레이보비 츠(Leibovitz)(L15, Fisher 11415-049)의 찬 배지에 놓았다. DRG는 회수되었고 37℃에서 20분 동안 칼슘 및 마그네슘 없는 PBS(Fisher 2007-03)에서 희석된, 트립신처리(trypsinisation)(트립신 EDTA 10X, 10%, Fisher 15400054)에 의하여 분리되었다. 반응은 DNase Ｉ 등급 Ⅱ(0.1 ㎎/㎖ Roche diagnostic 104159) 및 우태아혈청(foetal bovine serum)(FBS 10%, Fisher 10270-098)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco modified Eagle medium)(DMEM, Fisher 21969-035)의 첨가에 의하여 중단되었다. 세포 현탁액은 10 ㎖ 피펫으로 가루로 빻았고, 상온에서 10분 동안 350×g에서 원심분리하였다. 이후, 분리된 세포의 펠렛은 소정 배지에 재현탁되었다.
생존가능한 세포의 수가 트립판 블루 배제 시험을 이용하는 Neubauer 세포분석기(cytometer)(Sigma)에서 산출되었고, 96 웰-플레이트(Nunc)에서 30000 세포/웰의 밀도로 파종되었다. 웰은 초순수 멸균수(ultra pure sterile water)(Merck Eurolab 60759.01)에서 폴리-L-라이신(10 ㎍/㎖, Sigma P2636)으로 선코팅되었다.
세포는 2시간 동안 부착되고, 5% CO2/95% 공기 분위기, 37℃에서 가습 배양기에서 유지되었다.
7β-OH EPIA 과 함께 뉴런 배양물의 배양
배양 5일 후에, 배지는 후술되는 상이한 조건에 따라 소정 배지로 변경되었다:
- 비히클(DMSO 0.1%)
- 비히클(DMSO 0.1%) + 시스플라틴(3 ㎍/㎖, Sigma ref:p4394)
- 시험 화합물 7β-OH EPIA(1 nM, 10 nM 및 100 nM) + 시스플라틴(3 ㎍/㎖)
- 참조 화합물 NGF(10 ng/㎖) + 시스플라틴(3 ㎍/㎖)
조건 당 6개의 웰이 뉴런 생존을 평가하기 위하여 수행되었다. 배양 48시간 및 72시간 후에, 뉴런 세포는 -20℃에서 에탄올/아세트산 용액(95%/5%)에서 5분 동안 고정되었고, PBS에서 3번 헹구었다.
화합물의 향신경효과(neurotropic effect)의 제어를 위하여, NGF(10 ng/㎖) 및 7β-OH EPIA(1 nM, 10 nM 및 100 nM)은 48시간 및 72시간 동안 배양되었다. 배양 종료시에, 세포는 -20℃, 에탄올/아세트산(95%/5%) 용액에서 5분 동안 고정되었고, PBS에서 3번 헹구었다.
필드 당 세포체 및 신경돌기 네트워크의 수 분석
감각 뉴런의 세포체는 단일클론 항 MAP-2 항체(Sigma M4403)에 의하여 표지되었고, 감각 뉴런의 신경돌기는 단일클론 β-튜블린 항체(Sigma T8660)에 의하여 표지되었다. 이러한 항체들은 배양 용액(5% FSC 및 0.1% 사포닌을 갖는 PBS, Sigma S-7900)에서 1:400으로 희석되었다. 이러한 항체들은 특히 각각 뉴런 세포체 및 신경염(neuritis)을 표지한다.
배양 2시간 후에, 세포는 PBS에서 세척되었고 MAP-2 및 β-튜블린 항체를 나타내기 위하여 배양 용액에서 1:300으로 희석된 알렉사 플루오르 488 염소 항 쥐 IgG(Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG(Molecular Probes A11001)과 함께 배양되었다. 세포 핵은 형광 마커(Hoechst staining solution, SIGMA H6024, 1시간 동안 배양 용액에서 1 ㎍/㎖)로 염색되었다.
각 조건에 있어서, 웰 당 2장의 사진(조건 당 12장의 사진)을 컴퓨터 소프트웨 In Cell Analyzer 1000 3.2.(Amersham Biosciences)에 의하여 제어되는 In Cell Analyzer 1000(Amersham Biosciences)를 이용하여 찍었다. MAP-2 표지(labelling)에 있어서, 확대는 ×10이었고, β-튜블린 표지에 있어서 확대는 ×20이었다. 각 표지에 있어서, 모든 이미지는 동일한 조건에서 찍었다.
항-MAP-2 항체로 표지된 세포체의 수, 및 항 β-튜블린 항체로 표지된 신경돌기의 총길이의 분석은 In Cell Anaylzer 1000 3.2. 워크스테이션 소프트웨어(Workstation software)를 이용하여 수행되었다. 결과는 비히클과 비교된 퍼센티지(percentage)로 표현되었다. 각 그룹의 비교는 짝을 이루지 않은 T 검정(unpaired T test)을 이용하여 수행되었다.
결과
시스플라틴-유도 신경돌기 밀도의 감소에 대한 7β- OH EPIA 에 의한 보호
48시간 동안 3 ㎍/㎖ 시스플라틴을 갖는 배양
신결돌기 밀도는 48시간 동안 매질(medium)("비히클")을 갖는, 즉 시스플라틴 없는, 감각 뉴런의 배양 후에, 필드(field) 당 총 신경돌기 길이의 평균 5459 ㎛를 나타내었다. 48시간 동안 시스플라틴을 갖는 배양은 필드 당 총 신경돌기 길 이를 약 4585 ㎛까지 감소시켰다. 이러한 시스플라틴에 의한 신경돌기 네트워크의 감소는 비히클과 비교할 때 통계학적으로 현저하였다(-16%, p<0.001).
48시간 동안 10 ng/㎖ NGF를 갖는 배양은 단지 매질과 함께 배양된 배양물과 비교할 때, 시스플라틴-유도 신경돌기의 감소를 방지하였고, 신경돌기 길이의 현저한 증가를 야기하였다.
1 nM 및 10 nM 7β-OH EPIA를 갖는 배양은 48시간에서 시스플라틴-유도 신경돌기 감소에 대하여 감각 뉴런을 보호하였다. 이러한 효과는 통계학적으로 현저하였다. 총 신경돌기 길이는 1 nM 및 10 nM 7β-OH EPIA를 갖는 배양의 48시간 후에 각각 5378 ㎛ 및 5549 ㎛이었으며, 이는 각각 90.7% 및 101%의 시스플라틴-유도 독성의 감소를 나타낸다.
72시간 동안 3 ㎍/㎖ 시스플라틴을 갖는 배양
시스플라틴 없는 매질 "비히클"에서 감각 뉴런은 필드 당 총 신경돌기 길이의 평균 5320 ㎛를 나타내었다. 72시간 동안 시스플라틴을 갖는 배양은 필드 당 총 신경돌기 길이를 약 4046 ㎛까지 감소시켰다. 이러한 시스플라틴에 의한 신경돌기 네트워크의 감소는 비히클과 비교할 때, 통계학적으로 현저하였다(-24%, p<0.001).
72시간 동안 10 ng/㎖ NGF를 갖는 배양은 단지 매질과 함께 배양된 배양물과 비교할 때, 시스플라틴-유도 신경돌기의 감소를 방지하였으며, 신경돌기 길이의 현저한 증가를 야기하였다.
1 nM 7β-OH EPIA를 갖는 배양은 72시간에서 시스플라틴-유도 신경돌기 감소에 대하여 감각 뉴런을 보호하였다. 이러한 효과는 통계학적으로 현저하였다. 1 nM 7β-OH EPIA을 갖는 배양 72시간 후에, 총 신경돌기 길이는 4948 ㎛이었으며, 이는 70.8%의 시스플라틴-유도 독성의 감소를 나타낸다.
[표 9]
시스플라틴(3 ㎍/㎖)의 존재하에 48시간 배양 후에, 감각 뉴런의 신경돌기 길이에 대한 비히클(0.1% DMSO), NGF(10 ng/㎖) 및 7β-OH EPIA(1 nM, 10 nM 및 100 nM)의 효과
처리 농도 (Conc.) 평균 신경돌기 길이(㎛) SEM n 시스플라틴 없는 대조군 % P(비히클+시스플라틴과 비교됨)
비히클(0.1% DMSO) - 5459.72 184 12 100 p<0.001
비히클(0.1% DMSO) 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 - 4585.52 133 12 84 -
NGF 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 10 ng/㎖ 6362.44 297 12 117 p<0.001
7β-OH EPIA 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 100 nM 4442.51 125 12 81 p>0.05
10 nM 5549.41 146 12 102 p<0.001
1nM 5377.89 106 12 99 p<0.001
[표 10]
시스플라틴(3 ㎍/㎖)의 존재하에 72시간 배양 후에, 감각 뉴런의 신경돌기 길이에 대한 비히클(0.1% DMSO), NGF(10 ng/㎖) 및 7β-OH EPIA(1 nM, 10 nM 및 100 nM)의 효과
처리 농도 (Conc.) 평균 신경돌기 길이(㎛) SEM n 시스플라틴 없는 대조군 % P(비히클+시스플라틴과 비교됨)
비히클(0.1% DMSO) - 5320.43 156.74 12 100 p<0.001
비히클(0.1% DMSO) 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 - 4046.14 138.52 12 76 -
NGF 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 10 ng/㎖ 6000.30 221.31 12 113 p<0.001
7β-OH EPIA 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 100 nM 4080.89 172.07 12 77 p>0.05
10 nM 4275.04 125.14 12 80 p>0.05
1 nM 4947.99 130.81 12 93 p<0.001
시스플라틴-유도 뉴런 세포사(뉴런 세포체의 감소)에 대한 7β-OH EPIA에 의한 보호
48시간 동안 3 ㎍/㎖ 시스플라틴을 갖는 배양
48시간에서 시스플라틴을 갖지 않는 "비히클"과 함께 매질에서 배양된 후에 필드 당 평균 61개 감각 뉴런이 관찰되었다. 3 ㎍/㎖ 시스플라틴을 갖는 배양은 뉴런의 수를 필드 당 평균 41개 감각 뉴런까지 감소시켰다. 이러한 시스플라틴에 의한 뉴런 세포체의 손실은 시스플라틴 없는, 즉 비히클만을 함유하는 매질에서 48시간 후에 평가된 세포체 수와 비교할 때, 통계학적으로 현저하였다(-33%, p<0.001).
48시간 동안 10 ng/㎖ NGF를 갖는 배양은 시스플라틴-유도 세포체 감소를 거의 완전하게 방지하였다.
1 nM, 10 nM 및 100 nM 7β-OH EPIA를 갖는 배양은 48시간에서 시스플라틴-유도 세포사에 대하여 감각 뉴런을 보호하였다. 이러한 효과는 통계학적으로 현저하였다. 1 nM, 10 nM 및 100 nM 7β-OH EPIA와 함께 48시간 후에, 필드 당 총 감 각 뉴런의 수는 각각 51, 45 및 50이었고, 이는 각각 53.1%, 18.7% 및 43.8%의 시스플라틴-유도 세포사의 감소를 나타낸다.
72시간 동안 3 ㎍/㎖ 시스플라틴을 갖는 배양
72시간에서 시스플라틴을 갖지 않는 "비히클"과 함께 매질에서 배양된 후에 필드 당 평균 54개 감각 뉴런이 관찰되었다. 3 ㎍/㎖ 시스플라틴을 갖는 배양은 뉴런의 수를 필드 당 평균 33개 감각 뉴런까지 감소시켰다. 이러한 시스플라틴에 의한 뉴런 세포체의 손실은 시스플라틴 없는, 즉 비히클만을 함유하는 매질에서 72시간 후에 평가된 세포체 수와 비교할 때, 통계학적으로 현저하였다(-39%, p<0.001).
48시간 동안 10 ng/㎖ NGF를 갖는 배양은 시스플라틴-유도 세포체 감소를 거의 완전하게 방지하였다.
1 nM, 10 nM 및 100 nM 7β-OH EPIA를 갖는 배양은 72시간에서 시스플라틴-유도 세포사에 대하여 감각 뉴런을 거의 완전하게 보호하였다. 이러한 효과는 통계학적으로 현저하였다. 1 nM, 10 nM 및 100 nM 7β-OH EPIA를 갖는 배양 72시간 후에, 필드 당 총 감각 뉴런의 수는 각각 52, 55 및 52이었고, 이는 각각 93%, 104% 및 93%의 시스플라틴-유도 세포사의 감소를 나타낸다.
[표 11]
시스플라틴(3 ㎍/㎖)을 갖는 배양 48시간 후에, 필드 당 세포체의 수에 대한 비히클(0.1% DMSO), NGF(10 ng/㎖) 및 7β-OH EPIA(1 nM, 10 nM 및 100 nM)의 효과
처리 농도 (Conc.) 평균 SEM n 시스플라틴 없는 대조군 % P(비히클+시스플라틴과 비교됨)
비히클(0.1% DMSO) - 60.83 1.59 12 100 p<0.001
비히클(0.1% DMSO) 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 - 40.75 1.88 12 67 -
NGF 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 10 ng/㎖ 58.33 1.38 12 96 p<0.001
7β-OH EPIA 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 100 nM 49.58 1.12 12 82 p<0.001
10 nM 45.50 1.26 12 75 p<0.05
1 nM 51.42 2.11 12 85 p<0.001
[표 12]
시스플라틴(3 ㎍/㎖)을 갖는 배양 72시간 후에, 필드 당 세포체의 수에 대한 비히클(0.1% DMSO), NGF(10 ng/㎖) 및 7β-OH EPIA(1 nM, 10 nM 및 100 nM)의 효과
처리 농도 (Conc.) 평균 SEM n 시스플라틴 없는 대조군 % P(비히클+시스플라틴과 비교됨)
비히클(0.1% DMSO) - 53.75 1.29 12 100 p<0.001
비히클(0.1% DMSO) 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 - 32.83 1.47 12 61 -
NGF 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 10 ng/㎖ 54.92 1.41 12 1.2 p<0.001
7β-OH EPIA 3 ㎍/㎖의 시스플라틴으로 중독 100 nM 52.25 1.24 12 97 p<0.001
10 nM 54.58 1.37 12 1.2 p<0.001
1 nM 52.42 1.65 12 98 p<0.001
실시예 7
본 연구는 일차 배양물(primary cultures)에서 분리된 척수 운동 뉴런 및 감각 뉴런에 대한 7β-OH EPIA의 신경돌기 성장-촉진 효과를 평가한다. 뉴런은 항 β-튜블린 항체로 염색되었고, 총 뉴런 길이의 분석은 "In Cell Analyzer"를 이용 하여 수행되었다. 뉴런 세포 배양물은 10-9M~10-4M 7β-OH EPIA와 함께 배양되었고, 뉴런 네트워크 밀도는 배양 6시간, 12시간 및 24시간 후에 평가되었다. 운동 뉴런에 대한 특이적 성장인장인 뇌 유래 신경성장인자(BDNF) 및 감각 뉴런에 대한 특이적 성장인자인 신경성장인자(NGF)가 참조 화합물(reference compounds)로서 이용되었다. 우리의 데이터는 7β-OH EPIA가 운동 뉴런 및 감각 뉴런 모두에 대하여 현저한 향신경효과를 갖는 것을 나타낸다. BDNF 및 NGF와 비교된 이러한 효과는 나노몰 농도의 하이드록시스테로이드(hydroxysteroid)에서 특히 현저하였다. 전체적으로 보아, 우리의 발견은 신경돌기 성장을 촉진하고 말초 신경병증을 치료하기 위한 7-하이드록시스테로이드의 용도를 뒷받침한다.
1. 물질 및 방법
1.1. 래트 척수 운동 뉴런 세포 배양물의 제조
래트 척수 운동 뉴런은 Martinou et al.,1992(Martinou JC, Martinou I, Kato AC Cholinergic differentiation factor(CDF/LIF) promotes survival of isolated rat embryonic motoneurons in vitro. Neuron. 1992 Apr;8(4):737-44)에 의하여 기재된 방법에 따라 제조되었다. 요약하여, 15일 잉태기간의 임신한 암컷 위스터 래트를 경추골절에 의하여 죽이고, 태아는 자궁으로부터 제거하였다. 그의 척수를 제거하여 1% 소혈청 알부민(BSA 지방산 무함유, Eurobio, Les Ulis, France GXXBSA01-65을 함유하는 Leibovitz의 찬 배지(L15, Invitrogen, 11415-049)에 놓았 다. 뇌막(meninges)을 조심스럽게 제거하였다.
척수 운동 뉴런은 칼슘 및 마그네슘 없는 PBS(Invitrogen 2007-03)에서 희석된, 37℃에서 20분 동안 트립신화(trypsinisation)(트립신 EDTA 10X Invitrogen 15400054)에 의하여 분리되었다. 반응은 DNase Ｉ 등급 Ⅱ(0.1 ㎎/㎖ Roche diagnostic 104159) 및 10% 우태아 혈청(foetal calf serum)(FCS)(Invitrogen 10270098)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Invitrogen 21969-035)의 첨가에 의하여 중단되었다. 이후, 현탁액은 10 ㎖ 피펫으로 3개의 패시지(passage)로 기계적으로 분리되었다. 세포는 상온에서 10분 동안 580g에서 원심분리되었다. 분리된 세포의 펠렛은 L15 배지에서 재현탁되었고, 얻어진 현탁액은 L15 배지에서 BSA 용액(3.5%)의 층상에 상온에서 10분 동안 180×g에서 원심분리에 의하여 운동 뉴런이 풍부하게 되었다. 상청액을 버리고, 펠렛을 DNase Ｉ(1%)이 보충된 L15 배지에 재현탁하였다. 이후, 현탁액이 Optiprep(d: 1.06 g/㎖; Abcys, Paris, France; 1030061)의 쿠션 상에 층을 이루었고, 상온에서 15분 동안 335×g에서 원심분리되었다. 정제된 운동 뉴런을 함유하는 상부 층을 수집하고, L15 배지로 재현탁하고, 상온에서 10분 동안 800×g에서 원심분리하였다. 세포 펠렛은 2% B27, 2 mM L-글루타민 및 페니실린 50 UI/㎖-스트렙토마이신 50 ㎍/㎖이 보충된 뉴로베이설(neurobasal) 배지로 이루어진 소정 배양 매질에 마지막으로 재현탁하였다. 생존가능한 세포는 트립탄 블루 배제 시험(Sigma T8154)을 이용하여 Neubauer 세포 측정기에서 수를 세었으며, 이후 96 웰-플레이트(폴리-L-라이신으로 선코팅됨; Nunclon Invitrogen P5899)에서 30000 세포/웰로 평판 배양하고, 가습 공기(95%) CO2(5%) 분위기, 37℃에서 배양하였다.
1.2. 래트 감각 뉴런 세포 배양물의 제조
래트 감각 뉴런을 Hall et al.1997(Hall AK, Ai X, Hickman GE, MacPhedran SE, Nduaguba CO, Robertson CP. The generation of neuronal heterogeneity in a rat sensory ganglion. J Neurosci. 1997 Apr 15;17(8):2775-84)에 기재된 방법에 따라 제조되었다. 요약하여, 암컷 래트(15일 잉태기간)을 경추 골절에 의하여 죽이고(래트 위스터; Janvier, Le Genest-St-Isle, France), 태아는 자궁으로부터 제거하였다. 등배신경절(DRG)을 갖는 그들의 척수를 제거하고, 페니실린 50 UI/㎖-스트렙토마이신 50 ㎍/㎖(PS, 1%) 및 소 혈청 알부민(BSA 1%, Sigmal A6003)을 함유하는 Leibovitz의 찬 배지(L15, Fisher 11415-049)에 놓았다. DRG는 회수되었고, 칼슘 및 마그네슘 없는 PBS(Fisher 2007-03)에서 희석된, 37℃에서 20분 동안 트립신화(trypsinisation)(트립신 EDTA 10X, 10%, Fisher 15400054)에 의하여 분리되었다. 반응은 DNase Ｉ 등급 Ⅱ(0.1 ㎎/㎖ Roche diagnostic 104159) 및 10% 우태아 혈청(foetal bovine serum)(FBS 10%, Fisher 10270-098)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Fisher 21969-035)의 첨가에 의하여 중단되었다. 세포 현탁액을 10 ㎖ 피펫으로 가루로 빻았으며, 상온에서 10분 동안 350×g에서 원심분리되었다. 분리된 세포의 펠렛은 소정 배지에서 재현탁되었다.
생존가능한 세포는 트립탄 블루 배제 시험(Sigma)을 이용하여 Neubauer 세포 측정기에서 수를 세었으며, 이후 96 웰-플레이트(Nunc)에서 25000 세포/웰의 밀도로 파종하였다. 웰은 초순수 멸균수(Merck Eurolab 60759.01) 중의 폴리-L-라이신(10 ㎍/㎖, Sigma P2636)으로 선코팅되었다.
세포는 2시간 동안 부착되었으며 5% CO2/95% 공기 분위기, 37℃, 가습 배양기에서 유지되었다.
1.3. 활성 화합물을 갖는 척수 운동 뉴런 세포 배양물의 배양
배지는 하기 조건에 따라 12시간의 배양 후에 소정 배지로 교환되었다:
대조군(비히클, 0.1% DMSO 0.1%)
7β-OH EPIA 10-4M, 10-5M, 10-6M, 10-7M, 10-8M 및 10-9M(0.1% DMSO 중)
BDNF 50 ng/㎖ 및 10 ng/㎖(0.1% DMSO 중)
배양 6시간, 12시간 및 24시간 후에, 세포는 -20℃, 에탄올/아세트산(95%/5%) 용액에서 5분 동안 고정되었으며, PBS에서 3번 헹구었다.
1.4. 활성 화합물을 갖는 감각 뉴런 세포 배양물의 배양
배지는 하기 조건에 따라 12시간의 배양 후에 소정 배지로 교환되었다:
대조군(비히클, 0.1% DMSO 0.1%)
7β-OH EPIA 10-4M, 10-5M, 10-6M, 10-7M, 10-8M 및 10-9M(0.1% DMSO 중)
NGF 50 ng/㎖ 및 10 ng/㎖(0.1% DMSO 중)
배양 6시간, 12시간 및 24시간 후에, 세포는 -20℃, 에탄올/아세트산(95%/5%) 용액에서 5분 동안 고정되었으며, PBS에서 3번 헹구었다.
1.5. 신경돌기 성장의 분석
운동 뉴런 및 감각 뉴런은 배양 용액(5% FCS 및 0.1% 사포닌을 갖는 PBS, Sigma S-7900)에서 1:400으로 희석된, 단일클론 항 β-튜블린 항체(Sigma T8660)에 의하여 표지되었다. 이 항체는 뉴런 세포체 및 신경돌기를 특이적으로 표지한다.
배양 2시간 후에, 세포는 PBS에서 세척되고, β-튜블린 Ⅲ 항체를 나타내기 위하여, 배양 용액에서 1:300으로 희석된, 알렉사 플루오르 488 염소 항 쥐 IgG(Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG)(Molecular Probes A11001)와 함께 배양되었다.
항 β-튜블린 항체로 표지된 뉴런의 총 길이의 분석은 In Cell Analyzer 1000 3.2.Workstation software를 이용하여 수행되었다.
이 결과는 비히클과 비교한 퍼센티지로 표현되었다. 그룹의 비교는 짝을 이루지 않는 T 검정을 이용하여 수행되었다.
2. 결과
2.1. 운동 뉴런의 신경돌기 길이에 대한 약물 처리의 효과
세포 신장(cell extension)의 총 길이의 분석은 시험 화합물의 향신경 특성(neurotropic properties)의 표시를 나타내었다.
a) 배양 6시간 후
결과를 표 13에 나타낸다. 50 ng/㎖ 및 10 ng/㎖의 BDNF에 의한 처리는 운동 뉴런에 의하여 형성된 신경돌기 네트워크의 밀도를 비히클과 비교하여 각각 180% 및 193% 현저하게 증가시켰다(p<0.001).
6시간 동안의 10-8M 및 10-9M 7β-OH EPIA를 갖는 배양은 운동 뉴런의 신경돌기 네트워크 밀도를 비히클과 비교하여 각각 150% 및 188% 현저하게 증가시켰다(p<0.001).
b) 배양 12시간 후
결과를 표 14에 나타낸다. 50 ng/㎖ 및 10 ng/㎖의 BDNF에 의한 처리는 운동 뉴런에 의하여 형성된 신경돌기 네트워크의 밀도를 비히클과 비교하여 각각 152% 및 173% 현저하게 증가시켰다(p<0.001).
12시간 동안의 10-4M 내지 10-9M 7β-OH EPIA를 갖는 배양은 운동 뉴런의 신경돌기 네트워크 밀도를 비히클과 비교하여 각각 226% 내지 137% 현저하게 증가시켰다.
c) 배양 24시간 후
결과를 표 15에 나타낸다. 10 ng/㎖의 BDNF를 갖는 24시간의 배양은 신경돌기 네트워크의 밀도를 비히클과 비교하여 현저하게 증가시켰다(170%, p<0.01). 그 러나, 50 ng/㎖의 BDNF를 갖는 배양은 신경돌기 네트워크 밀도를 현저하게 변화시키지 않았다.
24시간 동안의 10-8M 7β-OH EPIA를 갖는 배양은 신경돌기 네트워크 밀도를 비히클과 비교하여 174% 현저하게 증가시켰다(p<0.005).
2.2. 감각 뉴런의 신경돌기 길이에 대한 약물 처리의 효과
a) 배양 6시간 후
결과를 표 16에 나타낸다. 50 ng/㎖ 및 10 ng/㎖의 NGF에 의한 처리는 감각 뉴런에 의하여 형성된 신경돌기 네트워크의 밀도를 비히클과 비교하여 각각 273%(p<0.001) 및 191%(p<0.01) 현저하게 증가시켰다.
6시간 동안의 10-7M, 10-8M 및 10-9M 7β-OH EPIA를 갖는 배양은 감각 뉴런의 신경돌기 네트워크 밀도를 비히클과 비교하여 각각 171%(p<0.001), 176%(p<0.005) 및 149%(p<0.05) 현저하게 증가시켰다.
b) 배양 12시간 후
결과를 표 17에 나타낸다. 50 ng/㎖ 및 10 ng/㎖의 NGF에 의한 처리는 감각뉴런에 의하여 형성된 신경돌기 네트워크의 밀도를 비히클과 비교하여 각각 216%(p<0.001) 및 128%(p<0.05) 현저하게 증가시켰다.
10-9M 및 10-7M 7β-OH EPIA를 갖는 배양은 신경돌기 네트워크 밀도를 비히클 과 비교하여 각각 145%(p<0.001) 내지 134%(p<0.05) 현저하게 증가시켰다.
c) 배양 24시간 후
결과를 표 19에 나타낸다. 50 ng/㎖ 및 10 ng/㎖의 NGF를 갖는 24시간의 배양은 감각 뉴런에 의하여 형성된 신경돌기 네트워크의 밀도를 비히클과 비교하여 각각 309% 및 371% 현저하게 증가시켰다(p<0.001).
24시간 동안의 10-7M, 10-8M 및 10-9M 7β-OH EPIA를 갖는 배양은 신경돌기 네트워크 밀도를 비히클과 비교하여 173%(p<0.005), 174%(p<0.01) 및 147%(p<0.05) 현저하게 증가시켰다.
[표 13]
6시간 배양 후의 필드 당 운동 뉴런-신경돌기 길이
처리 농도(Conc.) 평균(㎛) sem n 비히클 % P
비히클(0.1% DMSO) - 254.3 19.0 12 100 -
BDNF 50 ng/㎖ 457.2 19.4 12 180 p<0.001
10 ng/㎖ 489.5 19.0 12 193 p<0.001
7β-OH EPIA 10-4M 315.9 18.9 12 124 p<0.05
10-5M 293.3 22.8 12 115 p<0.05
10-6M 354.5 33.7 12 139 p<0.05
10-7M 350.5 34.3 12 138 p<0.05
10-8M 382.4 25.8 12 150 p<0.001
10-9M 479.3 40.8 12 188 p<0.001
[표 14]
12시간 배양 후의 필드 당 운동 뉴런-신경 돌기 길이
처리 농도(Conc.) 평균(㎛) sem n 비히클 % P
비히클(0.1% DMSO) - 423.8 38.3 12 100 -
BDNF 50 ng/㎖ 643.7 34.1 12 152 p<0.001
10 ng/㎖ 731.3 34.8 12 173 p<0.001
7β-OH EPIA 10-4M 602.4 24.8 12 142 p<0.001
10-5M 680.9 30.8 12 161 p<0.001
10-6M 580.3 55.5 12 137 p<0.05
10-7M 956.7 54.6 12 137 p<0.001
10-8M 759.0 61.6 12 179 p<0.001
10-9M 764.9 59.9 12 180 p<0.001
[표 15]
24시간 배양 후의 필드 당 운동 뉴런-신경돌기 길이
처리 농도(Conc.) 평균(㎛) sem n 비히클 % P
비히클(0.1% DMSO) - 215.8 39.6 12 100 -
BDNF 50 ng/㎖ 293.6 20.1 12 136 p<0.001
10 ng/㎖ 366.1 29.6 12 170 p<0.001
7β-OH EPIA 10-4M 188.4 23.3 12 87 p<0.05
10-5M 200.9 20.7 12 93 p<0.05
10-6M 224.8 36.7 12 104 p<0.05
10-7M 271.7 34.0 12 126 p<0.05
10-8M 374.6 22.3 12 174 p<0.005
10-9M 265.9 26.2 12 123 p<0.05
[표 16]
6시간 배양 후의 필드 당 감각 뉴런-신경돌기 길이
처리 농도(Conc.) 평균(㎛) sem n 비히클 % P
비히클(0.1% DMSO) - 102.2 14.1 12 100 -
NGF 50 ng/㎖ 279.1 31.8 12 273 p<0.001
10 ng/㎖ 195.2 28.8 12 191 p<0.01
7β-OH EPIA 10-4M 103.2 10.7 12 101 p<0.05
10-5M 114.8 8.2 12 112 p<0.05
10-6M 97.7 11.4 12 96 p<0.05
10-7M 151.8 11.7 12 149 p<0.05
10-8M 179.3 16.0 12 176 p<0.005
10-9M 174.2 9.1 12 171 p<0.001
[표 17]
12시간 배양 후의 필드 당 감각 뉴런-신경돌기 길이
처리 농도(Conc.) 평균(㎛) sem n 비히클 % P
비히클(0.1% DMSO) - 298.4 12.8 12 100 -
NGF 50 ng/㎖ 644.3 40.0 12 216 p<0.001
10 ng/㎖ 381.3 31.4 12 128 p<0.05
7β-OH EPIA 10-4M 290.3 32.3 12 97 p<0.05
10-5M 321.0 18.4 12 108 p<0.05
10-6M 287.0 24.3 12 96 p<0.05
10-7M 398.4 35.8 12 134 p<0.05
10-8M 368.3 32.2 12 123 p<0.05
10-9M 431.8 24.2 12 145 p<0.001
[표 18]
24시간 배양 후의 필드 당 감각 뉴런-신경돌기 길이
처리 농도(Conc.) 평균(㎛) sem n 비히클 % P
비히클(0.1% DMSO) - 220.7 12.4 12 100 -
NGF 50 ng/㎖ 682.1 64.2 12 309 p<0.001
10 ng/㎖ 819.9 61.5 12 371 p<0.001
7β-OH EPIA 10-4M 228.6 38.8 12 104 p<0.05
10-5M 244.8 28.2 12 111 p<0.05
10-6M 189.9 24.4 12 86 p<0.05
10-7M 380.8 45.8 12 173 p<0.005
10-8M 384.3 52.2 12 174 p<0.01
10-9M 324.9 45.1 12 147 p<0.05

Claims (30)

  1. 프로스타글란딘 E2 또는 시클로옥시게나제 및 프로스타글란딘 신타제 활성의 다른 대사산물의 증가된 수준에 의하여 매개되는 증상의 치료 또는 예방용, 또는 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 감소된 수준 또는 감소된 유효성에 기인하여 악화되는 증상의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 증가시키는 작용제의 용도.
  2. 프로스타글란딘 E2 또는 시클로옥시게나제 활성의 다른 대사산물의 증가된 수준에 의하여 매개되는 증상의 치료 또는 예방용, 또는 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 감소된 수준 또는 감소된 유효성에 기인하여 악화되는 증상의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한, 염증 유발제(inflammatory causing agent)의 존재하에, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 촉진하고, 프로스타글란딘 E2의 생산을 선택적으로 억제하는 작용제의 용도.
  3. 신경돌기 성장(neurite outgrowth)을 촉진하거나 또는 말초 신경병증(peripheral neuropathy)을 치료하는 의약 제조를 위한, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 증가시키는 작용제의 용도.
  4. PPAR감마의 활성화를 필요로 하는 증상을 치료하는 의약 제조를 위한, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 증가시키고 차례로 PPAR감마를 활성화시키는 작용제의 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 작용제는 하기 화학식(Ｉ):
    [화학식 Ｉ]
    Figure 112009039903748-PCT00022
    (상기에서,
    점선 원은 그것을 포함하는 고리(ring)가 완전히 포화될 수 있거나, 또는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 가질 수 있음을 나타내며;
    점선은 결합이 탄소-탄소 단일 또는 이중 결합일 수 있음을 나타내며;
    R1은 수소 원자 또는 메틸기를 나타내며;
    R2, R3 및 R4는 서로 동일하거나 또는 상이하며, 각각은 옥소기, 하이드록시기, 메르캅토기, 수소 원자, 할로겐 원자, 알콕시기, 아릴옥시기 또는 아실기를 나타낸다)
    의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르인
    용도.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식(Ⅱ):
    [화학식 Ⅱ]
    Figure 112009039903748-PCT00023
    (여기에서, R1 , R2, R3 및 R4는 제5항에서 정의한 바와 같다)
    를 갖거나, 또는 그의 에스테르인
    용도.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식(Ⅲ):
    [화학식 Ⅲ]
    Figure 112009039903748-PCT00024
    (여기에서, R2a는 옥소기, 하이드록시기, 메르캅토기 또는 할로겐 원자를 나타내며, R1 , R3 및 R4는 제5항에서 정의한 바와 같다)
    을 갖거나, 또는 그의 에스테르인
    용도.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식(Ⅳ):
    [화학식 Ⅳ]
    Figure 112009039903748-PCT00025
    (여기에서, R1 , R2, R3 및 R4는 제5항에서 정의한 바와 같다)
    을 갖거나, 또는 그의 에스테르인
    용도.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식(Ⅴ):
    [화학식 Ⅴ]
    Figure 112009039903748-PCT00026
    (여기에서, R2, R3 및 R4는 상기에서 정의한 바와 같다)
    을 갖는
    용도.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 7-하이드록시테스토스테론(7-hydroxytestosterone)인
    용도.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 7α-하이드록시디하이드로에피안드로스테론(7α-hydroxydehydroEPIAndrosterone) 또는 7β-하이드록시디하이드로에피안드로스테론(7β-hydroxydehydroEPIAndrosterone)인
    용도.
  12. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 7β-하이드록시프레그네놀론(7β-hydroxypregnenolone) 또는 7α-하이드록시프레그네놀론(7α-hydroxypregnenolone) 또는 그의 에스테르인
    용도.
  13. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 7α- 또는 7β-하이드록시에피안드로스테론(7α- or 7β-hydroxyEPIAndrosterone) 또는 그의 에스테르인
    용도.
  14. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 7α- 또는 7β-하이드록시-17β-에스트라디올(7α- or 7β-hydroxy-17β-oestradiol) 또는 그의 에스테르인
    용도.
  15. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 7α- 또는 7β-하이드록시-에스트론(7α- or 7β-hydroxyoestrone) 또는 그의 에스테르인
    용도.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 작용제는 하기 화학식(Ⅵ):
    [화학식 Ⅵ]
    Figure 112009039903748-PCT00027
    (상기에서,
    X는 식 >CR5R6의 기를 나타내거나, 또는 R10이 수소 원자를 나타내지 않는 경우 식 >SO2의 기를 나타내며;
    Y는 식 >NH의 기 또는 식 >CR5R6의 기를 나타내며;
    Z는 식 >C=O의 기, 식 >CH2의 기 또는 직접 결합(direct bond)을 나타내며;
    R5는 수소 원자를 나타내고, R6는 수소 원자, 카르복시기 또는 하이드록시기를 나타내거나;
    또는
    R5 및 R6는 함께 옥소기, 메틸렌디옥시기 또는 하이드록시이미노기를 나타내며;
    R7은 수소 원자 또는 저급 알킬기를 나타내며;
    R8은 2개의 수소 원자, 또는 옥소기 또는 하이드록시이미노기를 나타내며;
    R9은 수소 원자, 저급 알킬기 또는 할로겐 원자를 나타내며;
    R10은 수소 원자, 저급 알콕시기 또는 카르복시기를 나타내며;
    R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 상이하며, 각각 수소 원자, 저급 알킬기 또는 할로겐 원자를 나타낸다)
    의 화합물, 또는 상기 화합물이 카르복시기를 포함하는 경우 그의 염 또는 에스테르인
    용도.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화합물 1 내지 23:
    Figure 112009039903748-PCT00028
    Figure 112009039903748-PCT00029
    Figure 112009039903748-PCT00030
    Figure 112009039903748-PCT00031
    의 하나인
    용도.
  18. 진성 당뇨병 및 그 후유증; 허혈성 혈관 질환; 염증과 관련된 통증; 염증성 피부 증상; 척수 손상; 말초 신경병증; 다발성 경화증; 염증성 장 질환; 류마티스 관절염, 대사 증후군 X, 비만, 말단 비대증 및 상처 치유의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한, 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 화합물의 용도.
  19. 암의 치료 또는 예방용 의약 제조를 위한, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2(15-deoxy-prostaglandin J2)의 생산을 증가시키는 작용제의 용도.
  20. 암 세포 증식의 억제용, 암 세포에서 아포토시스(apoptosis)의 유도용 또는 종양 성장 및 진행의 억제용 의약 제조를 위한, 15-데옥시-프로스타글란딘 J2의 생산을 증가시키는 작용제의 용도.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    암은 직장암(colorectal cancer), 위암(gastric cancer), 유방암(breast cancer), 간암(hepatic cancer), 전립선암(prostate cancers), 방광암(bladder cancer), 갑상선 유두암(thyroid papillary cancer) 또는 식도암(oesophageal cancer)인
    용도.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물은 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 것인
    용도.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 증상은 말초 기관의 염증 또는 염증성 질환을 포함하는
    용도.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 말초 기관은 간 또는 신장을 포함하는
    용도.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 증상은 염증성 기도 질환을 포함하는
    용도.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 염증성 기도 질환은 천식, 비염, 기관지염, 또는 만성 폐쇄성 폐 질환을 포함하는
    용도.
  27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    염증과 관련된 통증;
    말초 동맥 질환 및 중증 사지 허혈과 같은 그의 후유증;
    관상 동맥 질환 및 그 후유증;
    뇌혈관 질환 및 그 후유증;
    간 및 신장 허혈;
    대사 질환;
    비만 및 그 후유증;
    염증성 기도 질환;
    만성 신경퇴화 질환(chronic neurodegerative diseases);
    급성 신경 퇴화성 증상(acute neurological degenerative conditions);
    염증성 장 질환;
    관절 연골(articular cartilage)의 퇴화에 의하여 특징지워지는 염증성 질환; 및
    상처 치유(wound healing)의 치료 및 예방용인
    용도.
  28. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    염증과 관련된 통증;
    중증 사지 허혈(critical limb ischaemia);
    허혈성 심장 질환 및 심근 경색;
    뇌졸중 및 일과성 허혈 발작;
    죽상동맥경화성 신동맥 협착(atherosclerotic renal artery stenosis);
    2형 당뇨 및 그 후유증, 말초 동맥 질환, 관상 동맥 질환, 신장의 혈관 질환 및 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy);
    천식(asthma) 및 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease(COPD));
    알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증 및 말초 신경병증;
    외상성 뇌 손상 및 척수 손상;
    염증성 장 질환; 및
    류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 및 1차 및 2차 골관절염(osteoarthritis) 및 그 후유증의 치료 및 예방용인
    용도.
  29. 제3항 또는 제18항에 있어서,
    말초 신경병증은 화학치료제에 의하여 야기된 것인
    용도.
  30. 제29항에 있어서,
    화학치료제는 시스플라틴인
    용도.
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