JP2010505820A - 抗糖尿病化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
A-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-B (I)
グルカゴン:NH2-1RSQGTFTSD9YSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-CONH2 (配列番号1)
GLP-l (7〜36):NH2-1HAEGTFTSD9VSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-CONH2 (配列番号2)
C末端アミドを有するGLP-1ペプチドのN末端の最初の1〜9残基:NH3 (+)-1HAE(-)GTFTSD9(-)-CONH2 (配列番号3):正味荷電ネガティブ
C末端アミドを有するグルカゴンペプチドのN末端の最初の1〜9残基:NH3 (+)-1HSQGTFTSD9(-)-CONH2 (配列番号4):正味荷電ニュートラル
アミノ酸に対する1文字略記は、Zubay, G.、Biochemistry第2版、1988年、MacMillan Publishing、New York、33頁に見ることができる。
一般式Xaa1〜Xaa11を有する一連のヒトGLP-1模倣物が報告されており、この場合Xaa1〜Xaa9はGLP-1ペプチドの最初の1〜9残基を表し(HAEGTFTSD;配列番号3)、いくつかの類似体ではXaa2はAlaを表し、または場合によりAibで置換されており、Xaa3はグルタミン酸、アスパラギン酸などではあるがGln(Q)ではないカルボン酸側鎖を有するアミノ酸を表し、グルカゴンペプチドのN末端配列に保存されている(HSQGTFTSD、配列番号4)。Xaa6はPheを表し、または-α-Me-2F-Phe-で場合により置換されており、Xaa9はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンなどのカルボン酸またはアミド側鎖を有するアミノ酸を表し、Xaa10およびXaa11は置換または非置換のビフェニルアラニン(Bip)誘導体の組合せを表す(WO2003/033671 A2、US2004/0127423 A1、WO2004/094461 A2、US2006/0004222 A1、WO2006/014287 A1、WO2006/127948 A2、WO2007/082264 A2、US2007/0021346 A1、US2007/0099835)。
グルカゴンとGLP-1ペプチドとの間の類似性、およびそれぞれの受容体間の類似性は、両方の受容体に結合することができるが、グルカゴン受容体ではアンタゴニスト活性を、GLP-1受容体ではアゴニスト活性を選択的に表すハイブリッドのペプチドミメティックを生成する可能性が生じる。さらに、経口のバイオアベイラビリティを有し、代謝上の安定性を増大するために、アミノ酸配列のより短いペプチドミメティックを開発することも不可欠である。
本発明の好ましい一実施形態は、糖尿病の治療/緩和/制御に適する、一般式(I)の新規なペプチドミメティック、これらの互変異性体型、これらの合成に関与する新規な中間物質、これらの薬学的に許容できる塩、これらの薬学的に許容できる溶媒和物、およびこれらまたはこれらの混合物を含む薬剤組成物を提供することである。
以下の略語を、実施例および本明細書の他所で使用する:
Aib=α-アミノイソ酪酸、
ACN=アセトニトリル、
Bip=ビフェニルアラニン残基、
Bn=ベンジル、
Boc=tert-ブトキシカルボニル、
But=O-tert-ブチル基,
cAMP=環状アデノシン3',5'-一リン酸、
DCM=ジクロロメタン、
DMF=N,N-ジメチルホルムアミド、
DIPCDI=ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA=ジイソプロピルエチルアミン
Et=エチル、
Et2O=ジエチルエーテル、
Fmoc=フルオレニルメトキシカルボニル、
g=グラム、
GLP-1R=グルカゴン様ペプチド-1受容体
グルカゴンR=グルカゴン受容体、
h=時間、
HOBt=ヒドロキシベンゾトリアゾール、
HOAt=7-アザヒドロキシベンゾトリアゾール、
HBTU=2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロリン酸、
HPLC=高速液体クロマトグラフィー、
i.p.=経口、
L=リットル、
LC/MS=液体クロマトグラフィー/質量分析法、
Me=メチル、
Min=分、
mL=ミリリットル、
μl=マイクロリットル、
mg=ミリグラム、
mmol=ミリモル、
MS=質量分析法、
PyBOP=ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロリン酸、
SPPS=固相ペプチド合成、
sc=皮下、
TMS=トリメチルシリル、
TIPS=トリイソプロピルシラン、
TFA=トリフルオロ酢酸、
TBTU=2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアンモニウムテトラフルオロホウ酸塩、
Trt=トリチル基。
A-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-B
(I)
式中、Aは、-NH-R1、R3-CO-、またはR3-SO2-基を表し、R1は、水素、または場合により置換されている直鎖もしくは分枝(C1〜C10)アルキル鎖を表し、R3は、直鎖、または分枝(C1〜C10)アルキル、(C3〜C6)シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、もしくはアリールアルキル基から選択される。
Bは、-COOR2、-CONHR2、もしくはCH2OR2、またはテトラゾールを表し、R2は、H、直鎖または分枝(C1〜C10)アルキル基、先に定義したアリールもしくはアラルキル基から選択される場合により置換されている基を表し、
Z1はヒスチジン(H)を表し、
Z2は、L-セリン、D-セリン、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸(Aib)、1-アミノシクロプロパンカルボン酸(ACP)からなる群から選択される、天然または非天然アミノ酸を表し、
Z5は、ヒドロキシル側鎖を含む天然または非天然アミノ酸を表し、好ましいZ5はスレオニンまたは式IIIの化合物であり、
「天然アミノ酸」という語は、天然に存在する20個のアミノ酸全てを示す。
α-アルキル化(例えば、Alaのα-メチルAla(Aib)での置換、またはPheのα-メチルPheでの置換え)、
アミノ酸の側鎖上の置換(例えば、芳香族アミノ酸側鎖の、ハロゲン、(C1〜3)アルキル、アリール基での置換、より詳しくはPheの2および4-ハロPheでの置換)
による、LもしくはDアミノ酸、アミノアルキル酸の適切な修飾のいずれかを意味する。
ペプチド合成の技術分野の技術者にはよく知られているいくつかの合成経路を用いて、本発明のペプチドミメティックを調製することができる。全ての記号が先に定義した通りである、式(I)のペプチドミメティックは、ペプチド合成の技術分野の技術者には知られている従来の技術、または当業者には理解されるその変形とともに、以下に記載する方法を用いて合成することができる。言及する方法は、以下に記載するものを含むが、それだけには限定されない。
ペプチドミメティックの樹脂上の構築
十分量(50〜100mg)のFmoc-PAL-PEG-PS樹脂またはFmoc-RinkアミドMBHA樹脂、ローディング:0.5〜0.6mmol/gを、2〜10分間、DMF(1〜10ml/樹脂100mg)中で膨張させた。次いで、樹脂上のFmoc基を、樹脂をDMF中10〜30%ピペリジン(10〜30ml/樹脂100mg)と、10〜30分間インキュベートすることによって除去した。脱保護した樹脂をろ過し、過剰のDMF、DCM、およびエーテルで洗浄した(50ml×4)。洗浄した樹脂を、窒素雰囲気下で5分間、新たに蒸留したDMF(1ml/樹脂100mg)中でインキュベートした。最初にFmoc保護したアミノ酸(1〜3eq.)、予めHOBtと活性化したもの(1〜3eq.)、およびDMF中DIPCDI(1〜2eq.)の0.5M溶液を樹脂に加え、次いで、樹脂を窒素雰囲気下で1〜3時間振盪した。カップリングの完了を、ニンヒドリン定性試験を用いてモニターした。最初のアミノ酸のカップリング後、樹脂をDMF、DCM、およびジエチルエーテルで洗浄した(50ml×4)。次のアミノ酸をカップリングするために、最初に、樹脂とカップリングした最初のアミノ酸上のFmoc保護を、10〜20%ピペリジン溶液を用いて脱保護し、その後、先に記載したような適切なカップリング剤を用いてFmoc保護した第2のアミノ酸をカップリングした。脱保護、洗浄、カップリング、および洗浄のサイクルの繰返しを、上記の一般スキーム1の通り、樹脂上に所望のペプチド鎖が構築されるまで行った。
直鎖のペプチド鎖であるH2N-H-Aib-QGT-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2CF3)- PAL-PEG-PSを、Fmoc固相ペプチド合成(SPPS)アプローチを用いて、自動化CS-Bio 536 PepSynthesiser(商標)上で構築した(スキーム2)。Fmocアミノ酸および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(TBTU)を一緒にバイアルに充填し、合成機のアミノ酸モジュールに配置した。ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA;0.9M)およびDMFの保存液を、乾燥窒素雰囲気下、試薬ビンに貯蔵した。樹脂、Fmoc-PAL-PEG-PS(0.38mmol/g;1g)を、真空中(1時間)P2O5上で乾燥し、新たに蒸留したDMF(5mL)中、膨張させた。膨張した樹脂をガラスカラム中にスラリー充填し、合成機に配置した。合成サイクルは全て、流速5mL分-1で行った、表1。樹脂を、新たに蒸留したDMFで10分間洗浄した。Fmoc基の脱保護を、DMF中20%ピペリジンで10分間行い、脱保護を、カラム流出物を304nmのUV検出によってモニターした。
所望のペプチドミメティックを、以下のようにTFA切断混合物で処理することによって、それぞれのペプチジル-樹脂から切断および脱保護した。TFA/水/トリイソプロピルシラン(95:2.5:2.5)(10ml/ペプチジル樹脂100mg)の溶液をペプチジル樹脂に加え、混合物を時々撹拌して室温に保った。樹脂をろ過し、切断混合物で洗浄し、ろ液を併せて蒸発乾燥した。得られた残渣を水10mlに溶解し、水層をエーテル(各20ml)で3回抽出し、最後に水層を凍結乾燥した。凍結乾燥後に得られた粗製ペプチドを、以下の通り、調製用HPLCによって精製した。
ShimadzuLC-8A液体クロマトグラフ上で、調製用HPLCを行った。DMFまたは水に溶解した粗製ペプチドの溶液を、寸法250×50mmのsemi-Prepカラム(Luna10μ;C18;100Å)中に注入し、溶出物を220nmのPDA検出器でモニターしながら、両方とも0.1%TFAで緩衝した水中ACNのリニアグラジエントで、流速15〜50ml/分を用いて溶出した。50分の期間にわたって、1分あたり1%のグラジエント変化で、0.1%TFAで緩衝した20%から70%の水-ACN混合液の典型的なグラジエントを用いた。溶出した所望の生成物を単一の10〜20ml分画に収集し、各HPLC分画を凍結乾燥することによって、非結晶性の白色粉末の純粋なペプチドミメティックを得た。
先に記載したように調製用HPLCによって精製した後、各ペプチドを、ShimadzuLC-10AD分析用HPLCシステム上で分析用RP-HPLCによって分析した。ペプチドミメティックをHPLC分析するために、0.1%TFAおよびACNバッファーのリニアグラジエントで、寸法250×4.6mmカラム、Luna5μ;C18;100Åを用い、PDA検出器を用いて220nmでクロマトグラムの獲得を行った。
各ペプチドを、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によって、フローインジェクションまたはLC/MSモードのいずれかでキャラクタリゼーションした。ポジティブおよびネガティブのイオンエレクトロスプレーモードにおける全ての分析で、3重の四重極型質量分析器(API-3000(MDS-SCIES、カナダ))を用いた。ユニット分解で操作した、四重極の質量範囲にわたって、フルスキャンデータを獲得した。全ての場合において、実験的に測定した分子量は0.5以内であった。
先に記載した通りに調製したペプチドミメティックを以下に関して試験した。
a)in vitroのグルコース依存性インスリン分泌(RIN5F細胞アッセイスクリーニングプロトコール)
b)in vitroのヒトGLP-1Rアゴニスト活性(サイクリックAMP定量)
c)in vitroのヒトグルカゴンアンタゴニスト活性(サイクリックAMP定量)
d)DPP IV酵素、ヒト血漿、擬似胃液、腸液、および肝ミクロソームに対するペプチドミメティックの安定性
e)以下に記載するような様々なin vitroおよびin vivoのアッセイを用いたC57BL/6Jマウス(in vivo)における試験化合物(ペプチドミメティック)のin vivo有効性の実証
in vitroのグルコース依存性インスリン分泌(RIN5F細胞アッセイスクリーニングのプロトコール)
RIN5F(ラットインスリノーマ)細胞を、37℃の加湿したインキュベーター(CO25%)中、ピルビン酸ナトリウム(1mM)HEPESおよびグルコース(4.5g/L)を補ったRPMI1640培地で培養した。トリプシン処理後、RIN5F細胞を、12ウェルプレートに、1ウェルあたり0.2×106細胞の濃度で接種した。細胞を、一夜、80%のコンフルエントに増殖させ、以下の通りにインスリン分泌実験を行った(Montrose-Rafizadeh C.ら、Mol. Cell. Endo.、1997年、130巻、109頁;Wang, X.ら、Endocrinology、2001年、5巻、1820頁)。
新規なペプチドミメティックを、安定にトランスフェクトしたCHO/ヒトGLP-1R細胞で、cAMP細胞ベースのアッセイを用いて、ヒトGLP-1受容体(HGLP-1R)アゴニスト活性に対してスクリーニングした(in vitro)。CHO-K1細胞(CRL9618)を、アメリカ培養細胞系統保存機関(Rockville、MD)から得た。CHO細胞をL-グルタミン(2mM)、HEPES(25mM)、NaHCO3(1.1 g/L)を含み、ウシ新生児血清(NBCS;10%)、ペニシリン(50U/ml(v/v))、およびストレプトマイシン(50ug/ml(v/v))を補ったハムF12培地で増殖させた。細胞を3日毎に1:8に分割した。
ヒトGLP-1受容体をコードするcDNAを、標準のプロトコールにしたがってRT-PCRによって単離した。全長のcDNAをpcDNA3.1(+)にクローニングした。GLP-1受容体を発現するCHO細胞系を生成するために、CaPO4を用い、標準のプロトコールにしたがって、CHO細胞を発現プラスミドpcDNA/hGLP-1R 10μgにトランスフェクトした(Wheeler,M.B.ら、Endocrinology、1993年、133巻、57頁)。受容体を発現するクローンを、G418(800μg/ml活性、Sigma)選択によって産生した。安定なクローンを、以後、500ug/ml(G418)に維持した。選択されたクローンを、cAMPアッセイ用に9〜25継代の間で用いた。
ヒトGLP-1Rを安定にトランスフェクトしたCHO細胞を、70〜75%のコンフルエントまでハムF12+10%NBCS+500ug/mlG418に維持した。細胞を、TPVG(0.25%トリプシン、EDTA0.53mM、グルコース1.38mM)2mlを用いてトリプシン化した。トリプシンを、10%NBCSを含むハムF12培地を用いて不活性化し、細胞を完全培地2mlに懸濁した。次いで、2×105細胞/ウェルを12ウェルプレートに接種し、プレートを16〜18時間、37℃の加湿した雰囲気でインキュベートした(Fermann,H.C.ら、Peptides、1994年、15巻、453頁)。翌日、細胞が90〜95%のコンフルエントを示した場合にアッセイを進めた。培地を12ウェルプレートから吸引し出し、細胞をハムF12(プレーン)を用いて1回洗浄した。細胞を、37℃で30分間、ハムF12+1%BSA+0.125mMRO-20 500ulでインキュベートした。インキュベート後、培地を吸引し出し、新鮮な培地(プレーンハムF12+1%BSA+0.25mMRO-20)を、水(MilliQ)に溶解してある試験化合物(ペプチドミメティック)5μlとともに加えた。細胞を30分間、加湿雰囲気下37℃で、試験化合物とインキュベートした。インキュベート後、培地を除去し、細胞をプレーンハムF12で1回洗浄した。引き続き、各ウェルに氷冷した0.1NHCl500ulを加えることによって細胞を溶解し、200rpmで30分間振盪した。次いで細胞をスクラップし、可溶化液をミクロ遠心管に収集し12000rpmで10分間遠心して残骸片を除去した。次いで、各ミクロ遠心管からの上清300ulをガラス試験管中に移し、cAMP推定用に30分間N2下で乾燥した。全cAMPを、Cyclic AMPイムノアッセイキット(R&D systems、Minneapolis、MN)を用いて製造元のプロトコールにしたがってサンプルから推定した。残渣の上清を用いて、ミクロBCA(Sigma)を用いてタンパク質濃度を定量した。データを対照のパーセントとして計算し(ビヒクル:水)、平均値±SDとして表してある。代表的なペプチドミメティックのin vitroのヒトGLP-1受容体アゴニスト活性を表4に列挙する。
安定にトランスフェクトしたCHO/ヒトグルカゴンR細胞で、cAMP細胞ベースのアッセイを用いて、新規なペプチドミメティックをヒトグルカゴン受容体(H-グルカゴン-R)アンタゴニスト活性に対してスクリーニングした(in vitro)。CHO-K1細胞(CRL9618)を、アメリカ培養細胞系統保存機関(Rockville、MD)から得た。CHO細胞を、L-グルタミン(2mM)、HEPES(25mM)、NaHCO3(1.1g/L)を含み、ウシ新生児血清(NBCS;10%)、ペニシリン(50U/ml(v/v))、およびストレプトマイシン(50ug/ml(v/v))を補ったハム F12培地で増殖させた。細胞を3日毎に1:8分割した。
ヒトグルカゴン受容体をコードするcDNAを、標準のプロトコールにしたがってRT-PCRによって単離した。全長のcDNAをpcDNA3.1(Invitrogen)にクローニングした。グルカゴン受容体を発現するCHO細胞系を生成するために、CHO細胞に、CaPO4を用いて標準のプロトコールにしたがって発現プラスミドpcDNA/H-グルカゴン-R10μgをトランスフェクトした。受容体を発現するクローンを、G418(800μg/ml活性、Sigma)選択によって産生した。安定なクローンを、以降、500ug/ml(G418)に維持した。cAMPアッセイには9〜25継代の間の選択されたクローンを用いた。
ヒトグルカゴンRを安定にトランスフェクトしたCHO細胞を、70〜75%のコンフルエントまでハムF12+10%NBCS+500ug/ml G418に維持した。細胞を、TPVG(0.25%トリプシン、EDTA0.53mM、グルコース1.38mM) 2mlを用いてトリプシン化した。トリプシンを、10%NBCSを含むハムF12培地を用いて不活性化し、細胞を完全培地2mlに懸濁させた。次いで、2×105細胞/ウェルを12ウェルプレートに接種し、プレートを16〜18時間、37℃の加湿した雰囲気下でインキュベートした。翌日、細胞が90〜95%のコンフルエントを示した場合にアッセイを進めた。培地を12ウェルプレートから吸引し出し、細胞をハムF12(プレーン)を用いて1回洗浄した。細胞を、37℃で30分間、ハムF12+1%BSA+0.125mMRO-20 500ulでインキュベートした。インキュベート後、培地を吸引し出し、新鮮な培地(プレーンハムF12+1%BSA+0.25mMRO-20)を、水(MilliQ)に溶解してある試験化合物(ペプチドミメティック)5μlとともに加え、その後グルカゴンペプチドを(アゴニストとして)加えた。細胞を30分間、37℃の加湿した雰囲気下で、ペプチドミメティックおよびグルカゴンペプチドとインキュベートした。インキュベート後、培地を除去し、細胞をプレーンハムF12で1回洗浄した。引き続き、各ウェルに氷冷した0.1NHCl500ulを加えることによって細胞を溶解し、200rpmで30分間振盪した。次いで細胞をスクラップし、可溶化液をミクロ遠心管に収集し12000rpmで10分間遠心して残骸片を除去した。次いで、各ミクロ遠心管からの上清300ulをガラス試験管中に移し、cAMP推定用に30分間N2下で乾燥した。全cAMPを、Cyclic AMPイムノアッセイキット(R&Dシステムズ、Minneapolis、MN)を用いて製造元のプロトコールにしたがってサンプルから推定した。残渣の上清を用いて、ミクロBCA(Sigma)を用いてタンパク質濃度を定量した。データを対照のパーセントとして計算し(ビヒクル:水)、平均値±SDとして表してある。代表的なペプチドミメティックのin vitroのヒトグルカゴン受容体アンタゴニスト活性を表5に列挙する。
様々なペプチドミメティック(最終濃度2μM)を、DPP IV(1:25mU)、またはプールヒト血漿(7.5μL)、または擬似胃液(pH1.5;組成HCl、NaCl、およびペプシン)、または擬似腸液(pH7.5)、またはヒト肝ミクロソームのいずれかと、0、2、4、6、12、および24時間(37℃;50mMトリエタノールアミン-HClバッファー;pH7.8)インキュベートした。DPP IV酵素/ヒト血漿/擬似胃液/擬似腸液/ヒト肝ミクロソームの濃度を、2〜4時間以内に約50%のエキセンジンの分解をもたらし、したがって24時間にわたって観察するのに時間依存性の分解可能であるように予備実験において選択した。TFA/H2O(15mL、10%(v/v))を加えることによって反応を終結させた。次いで、反応生成物をVydac C18分析カラム(4.6×250mm)に適用し、主要な分解フラグメントを完全なペプチドミメティックから分離した。カラムを、流速1mL/分でTFA/H2Oと平衡にした。70%アセトニトリル/H2O中0.1%(v/v)TFAを用いて、溶離溶媒中のアセトニトリル濃度を10分かけて0%から28%に、30分かけて28%から42%に上げた。UV検出器を用いて206nmの吸光度をモニターし、ピークを手操作で収集した後、ESI-MS分析した。曲線下面積を試験ペプチドミメティックおよびその代謝物に対して測定し、24時間の期間にわたって各時間点の分解パーセント値を計算した。DPP IV酵素、ヒト血漿、擬似胃液、腸液、および肝ミクロソームに対する選択されたペプチドミメティックの安定性試験の結果(in vitro)を、表6に列挙する。
非経口(i.p.)および経口両方の投与経路による、C57BL/6Jまたはdb/dbマウスにおける試験化合物(ペプチドミメティック)のin vivoの有効性(抗高血糖/抗糖尿病活性)の実証
急性の単回投与量の120分の時間経過実験を、自家繁殖させた8〜12週齢のC57BL/6Jまたはdb/dbオスマウスで行った。動物を飼育器の条件(25±4℃、相対湿度60〜65%、午前7:30に光を当て、12:12時間の明:暗サイクル)に慣らすために、1ケージあたり6匹のグループで1週間飼育した。動物実験は全て、「Zydus Research Center動物倫理委員会」による認可にしたがって、世界的に有効なガイドラインにしたがって行った。
いくつかの試験化合物(ペプチドミメティック)およびエキセンジン-4のin vivoのグルコース低下の性質を、以下に記載するようにC57BL/6J(中程度の高血糖)またはdb/db動物モデルで評価した。試験2日前に、動物を、食後グルコースレベルに基づいて無作為化し、5グループ(n=6)に分割した。実験日、食餌を全てのケージから引き上げ、水を自由に摂取させ、一夜絶食させた。ビヒクル(通常の食塩水)/試験/標準化合物を、体重ベースで非経口的に(i.p.)または経口的に投与した。0分直後、エーテルでの軽度の麻酔下で後眼窩の経路により、各動物から血液を採取し、引き続き30、60、および120分、または最高240分に血液を採取した(Chen,D.ら、Diabetes Obesity Metabolism、2005年、7巻、307頁;Kim,J.G.ら、Diabetes、2003年、52巻、751頁)。
先に記載したように、本発明で調製したペプチドミメティック全てを、in vitroおよびin vivoで評価し、選択したペプチドミメティックのデータを、代表的なペプチドミメティックの例として上記セクションに表した。RIN 5F(ラットインスリノーマ)の細胞ベースのアッセイでは、ペプチドミメティックは全て、1〜10nMの濃度の範囲においてグルコース依存性のインスリン分泌のみを示し(表3)、それによって、これらのクラスのペプチドミメティックは、スルホニル尿素などの他のクラスのインスリン分泌促進物質に通常観察される高血糖の発症がない可能性がある。ヒトのグルカゴン受容体アッセイにおいて、試験ペプチドミメティックをグルカゴンペプチドと一緒にインキュベートした場合に、ペプチドミメティックのin vitroのアンタゴニスト活性を、cAMP生成量の阻害を測定することによって推定した。表5に示すように、概して、ペプチドは全て1nMから1000nMの範囲で著しいグルカゴン受容体アンタゴニスト活性を示した。HGLP-1Rアッセイでは、新規なペプチドミメティックは、1〜100nMの濃度範囲で濃度依存性のcAMP生成(in vitroのGLP-1アゴニスト活性)を示した(表4)。ペプチドミメティックにはこの二重の性質(グルカゴン受容体のアンタゴニスト、およびGLP-1受容体のアゴニスト)があるため、2型糖尿病および関連の代謝障害の安全かつ有効な治療の理想的な候補となっている。
好ましい一実施形態では、本発明は、グルカゴン受容体のアンタゴニストおよびGLP-1受容体のアゴニストの両方として機能し、両方の受容体に対して異なる程度の親和性/選択性を有し、循環グルコースレベルを低減し、糖尿病を治療するのに有用なペプチドミメティックを作成する方法を提供する。
Claims (18)
- その互変異性体、溶媒和物を含む、式(I)の配列を有する単離されたペプチドミメティック:
A-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-B
(I)
[式中、
Aは、-NH-R1、R3-CO-、またはR3-SO2-基を表し、ここで、R1は、水素、または場合により置換されている直鎖もしくは分枝(C1〜C10)アルキル鎖を表し、R3は、直鎖もしくは分枝(C1〜C10)アルキル、(C3〜C6)シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキル基から選択され、Bは、-COOR2、-CONHR2、もしくはCH2OR 2基、またはテトラゾールを表し、ここで、R2は、H、直鎖もしくは分枝(C1〜C10)アルキル、アリール、またはアラルキル基から選択される場合により置換されている基を表し、Z1はヒスチジンを表し、Z2は、L-セリン、D-セリン、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、1-アミノシクロプロパンカルボン酸からなる群から選択される、天然または非天然アミノ酸を表し、Z3は、グルタミン(Gln;Q)または式IIの化合物を表し、
Z7およびZ8は、独立に、ヒドロキシル側鎖を含む天然または非天然アミノ酸を表し、Z9は、独立に、酸性基を含むアミノ酸側鎖を有する天然または非天然アミノ酸を表し、
Z10は、式IVの天然または非天然アミノ酸を表し、
- Z5がスレオニンである、請求項1に記載の式1の化合物。
- Z6が、Phe(F)、α-メチル-フェニルアラニン(-α-Me-Phe-)、α-メチル-2-フルオロフェニルアラニン(-α-Me-2F-Phe-)、またはα-メチル-2,6-ジフルオロフェニルアラニン(-α-Me-2,6-F-Phe-)、または2-フルオロフェニルアラニン(-2F-Phe)基を表す、請求項1に記載の式1の化合物。
- 式1の化合物
A-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-B
(I)
[式中、
Aは、-NH-R1、R3-CO-、またはR3-SO2-基を表し、ここで、R1は、水素、または場合により置換されている直鎖もしくは分枝(C1〜C10)アルキル鎖を表し、R3は、直鎖もしくは分枝(C1〜C10)アルキル、(C3〜C6)シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはアリールアルキル基から選択され、Bは、-COOR2、-CONHR2、もしくはCH2OR2、またはテトラゾールを表し、ここで、R2は、H、直鎖もしくは分枝(C1〜C10)アルキル基、アリール、またはアラルキル基から選択される場合により置換されている基を表し、Z1はヒスチジン(H)を表し、Z2は、L-セリン、D-セリン、L-アラニン、D-アラニン、α-アミノイソ酪酸、1-アミノシクロプロパンカルボン酸から選択され、Z3は、グルタミン(Gln;Q)または式IIの化合物を表し、
- アリール基が、フェニル、ナフチル、インダニル、フルオレニル、またはビフェニル基から選択される、請求項1に記載の式1の化合物。
- ヘテロアリール基が、ピリジル、チエニル、フリル、イミダゾリル、ベンゾフラニル基から選択される、請求項1に記載の式1の化合物。
- HSQGTFTSD-Bip(OMe)-Bip(2Me);
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H-(ACP)-QG-(PCA)-FTSD-Bip(OMe)-Bip(2CF3);
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HAQG-(PCA)-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2F);
HAQG-(PCA)-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2CF3);
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H-Aib-QG-(PCA)-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2F);
H-Aib-QG-(PGA)-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2CF3);
H-(ACP)-QG-(PCA)-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2Me);
H-(ACP)-QG-(PCA)-(α-Me-2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(Pyr);
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HSQG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2Me);
HSQG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(Pyr);
HSQG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2F);
HSQG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2CF3);
HAQG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2Me);
HAQG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(Pyr);
HAQG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2F);
HAQG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2CF3);
H-Aib-QG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2Me);
H-Aib-QG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(Pyr);
H-Aib-QG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2F);
H-Aib-QG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2CF3);
H-(ACP)-QG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2Me);
H-(ACP)-QG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(Pyr);
H-(ACP)-QG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2F);
H-(ACP)-QG-(PCA)-(2F-Phe)-TSD-Bip(OMe)-Bip(2CF3);
から選択される式1の化合物。 - 本明細書に記載の方法にしたがって調製される、請求項1に記載の式(I)の化合物および薬学的に許容できる適切な担体を含む薬剤組成物。
- グルカゴン受容体のアンタゴニストとして作用する、請求項1に記載の式(I)の化合物またはその薬剤組成物。
- GLP-1受容体のアゴニストとしてさらに作用する、請求項1に記載の式(I)の化合物またはその薬剤組成物。
- 高脂血症、高コレステロール血症、高血糖症、高インスリン血症、遊離脂肪酸もしくはグリセロールの血中レベルの増大、高トリグリセリド血症、創傷治癒、耐糖能障害、レプチン耐性、インスリン耐性、または他の糖尿病合併症によって引き起こされる疾患の治療または予防に有用な、請求項11に記載の化合物またはその薬剤組成物。
- 請求項1から14のいずれか一項に定義した式(I)の化合物の有効な、非毒性の量を、それを必要とする患者に投与することを含む、高脂血症、高コレステロール血症、高血糖症、高インスリン血症、遊離脂肪酸もしくはグリセロールの血中レベルの増大、高トリグリセリド血症、創傷治癒、耐糖能障害、レプチン耐性、インスリン耐性、または他の糖尿病合併症によって引き起こされる疾患を予防または治療する方法。
- 疾患が、インスリン耐性が病態生理学的機序の根底にある2型糖尿病、耐糖能障害、異脂肪血症、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、冠動脈疾患、心血管障害、および他の疾患である、請求項14に記載の方法。
- 請求項1に記載の式(I)の化合物、および薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、または溶媒を、それを必要とする患者に投与することを含む、請求項14から16のいずれか一項に規定される疾患状態のいずれかを治療/軽減するための医薬品。
- 請求項1に記載の式(I)の化合物、請求項11に記載のその薬剤組成物、および請求項17に記載のそれらを含む医薬品の、請求項14から16のいずれか一項に規定される疾患の治療に適する薬物としての使用。
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