JP2010503842A - バイオチップに付着させた生体分子標的の定量測定方法、及びそれを実施するための装置 - Google Patents
バイオチップに付着させた生体分子標的の定量測定方法、及びそれを実施するための装置 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】図6
Description
蛍光標識の立体障害が大きいため、プローブと標的との間の認識の調節が散発的になる結果、多くの不自然な測定結果(measurement artifacts)がもたらされ、実験再現性が低下する、
定量測定でないため、2つの異なる標的間の発現のレベルを比較することができない、並びに
この現行の技術のコストが製造及び実施の両面で高い
といった或る特定数の大きな制限がある。
マイクロ流体カードにおける「RT PCR」技術(「逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応」、すなわち、相補的DNAへのリボ核酸の逆転写後のポリメラーゼ連鎖増幅)(最大で386個の異なる標的を並行して増幅することが可能であると共に、実施が簡単で且つ検出が改善されるが、標的間で真に比較するための定量測定ができない、分析対象の標的の数が制限される(低複雑性バイオチップをはるかに下回る)、及び実施コストが高いという欠点がある)、
大量の標的のハイブリダイゼーション及び化学発光による標識に基づく、「ナイロン」フィルム上のバイオチップ(これも実施が簡単で、検出が改善されるが、それにもかかわらず、定量測定ができない、大きな反応容量を必要とする(低濃度のサンプルの分析を制限する)及び製造コスト及び実施コストが非常に高いという欠点がある)並びに
標識をしないバイオチップという新たなコンセプト(インピーダンスの測定又は表面プラズモン共鳴(SPR)による標的の検出に基づき、特に非特許文献1、非特許文献2又は非特許文献3に記載されているが、標的の数を定量することができないため、高密度チップの製造には問題があると共に、インピーダンス測定技法及びSPR技法のどちらについても、標的の大きさ及び立体配座が多様であるために、不自然な測定結果を伴う)
といったこの技術に対する幾つかの代替案が近年開発されている理由である。
a)少なくとも1つのレーザー光線を各測定点に集束照射して(focused)、そこから上記標的及び必要に応じて上記プローブにも存在する定量対象の化学元素を含む閉じ込められたホットプラズマを抽出する工程と、
b)上記プラズマからの輝線(light emission lines)を、これらの線の各強度を測定することによって、各測定点に関して検出及び分析する工程と、その後の
c)定量対象の上記元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との相関を実証するこれらの線の事前の較正を通じて、上記標的中の上記元素又はそれを含む基の各測定点における濃度を求める工程と、
を含む。
(i)ダブルパルスLIBSタイプのダブルレーザーパルスを行うことによって、LIBS技法を実施すること、及び/又は
(ii)このLIBS技法をLIF技法と併用すること(すなわち、LIBSとLIFとの組合せ)
が可能である。
生体分子標的がハイブリダイズするプローブのマトリクスであって、複数の当該プローブをそれぞれ含む多数の測定点又は「スポット」を含む、マトリクスを備えるタイプのバイオチップと、
測定点に少なくとも1つのレーザー光線を集束照射して、そこから上記標的及び必要に応じて上記プローブにも存在するリン等の定量対象の化学元素を含有するホットプラズマを抽出するための手段、並びにこうして抽出された上記プラズマ又は各プラズマを閉じ込める手段を含む、プラズマ生成及び閉じ込めユニットと、
上記プラズマ生成ユニットと接続し、且つ、上記元素の各測定点における濃度を、定量対象の上記元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との間の相関に基づいて求めるように、各測定点のプラズマからの輝線を検出及び分析するのに好適な分光写真ユニットと、
を含む。
重なり合い、且つ互いに好ましくは0.4nm〜1nm離れる幾つかの波長で上流光線を放出する単一のレーザー源と、
上流光線を、それぞれ、励起レーザー光線の伝搬を目的とした励起光ファイバーと同数の波長を有する下流光線に分離するための波長分波器と、
に由来し得る。
Kは、2つの隣接するチャンバの各励起ファイバー間の距離Pと、各レーザーパルスでアブレートされた表面のX軸に沿った幅lとの比P/lによって規定され、この比は、気化後のアブレーションの形状因子によって調節され、且つ
これら2つの励起ファイバー間の距離Pは、等式P=L/(N−1)(但し、N>1、Lは、バイオチップの幅であり、且つNは、上記配列中の励起ファイバーの数である)によって規定される。
標的がハイブリダイズするプローブのマトリクスを備えるタイプであり、多数のプローブスポット2を含むバイオチップ1と、
バイオチップ1の様々な点に幾つかのレーザー光線を同時に集束照射して、そのそれぞれから、これらの標的にのみ存在するリン等の定量対象の化学元素を含有するホットプラズマを抽出する、集束照射するための手段3及び4、並びにこうして抽出された上記プラズマ又は各プラズマを閉じ込めるための手段を含む、プラズマ生成及び閉じ込めユニットと、
プラズマ生成及び閉じ込めユニットと接続し、且つ、上記元素の各スポット2における濃度を、上記元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との間の相関に基づいて求めるように、各スポット2のプラズマからの輝線を検出及び分析するのに好適な分光写真ユニット5と、
を含む。
本発明による方法の実施及びこの方法で使用するバイオチップの加工の例
なお、事前に、本発明の第1の実施形態による装置の各プラズマチャンバ7の上部に設けられた励起ファイバー10を、1つ又は2つのさらなるファイバーを用いて2倍又は3倍にして、一方では、ビデオカメラ又はデジタル撮影装置により、バイオチップ1の表面を撮像することができ(「RGB」モード、すなわち、赤緑青で)、他方では、白色光でこの表面を照らすことができる。したがって、本発明によるこの装置により、バイオチップ1の表面のカラー画像又は白黒画像を生成することができる。
本出願人による、2006年2月24日に出願された国際特許出願第PCT/FR2006/00428号に記載の、核酸懸濁液の分析方法、及び
本出願人名義の国際特許出願公開第WO−A−02/43855号に記載の、固定化ベクターを用いた磁性カップリングにより支持体と結合したプローブのアレイ組織の加工方法。
c 光の速度
λij 考察中のより高い状態iからより低い状態jへの遷移の波長
gi 輝線の初期エネルギー準位iの統計的重み
Aij 考察中の線の遷移確率
Z(Texc) 分配関数
Ei 遷移が起こる励起した準位のエネルギー
Texc プラズマの温度
図29及び図30は、LIBS技法によるバイオチップの分析中の特有な(parasitic)元素の存在を示す(これらのバイオチップは特に、ケイ素系(ガラス基板を備えるバイオチップの最も広く知られた例)である)。
核酸の骨格:C、N、O及び/又は
プローブを結合するための分子自己集合体:Au、S、O、C、N、Br
中に存在し得る他の特有な元素を一覧にすると、3つの元素Si、Fe(Fe+)及びCのみが、160nm〜260nmのスペクトル域で、リンの線と比較して多少強い線を有することが分かる(図29参照)。
特有な線に対するこの線の組の相対「距離」(198.89nmの弱めのケイ素線及び212.41nmの別の強めのケイ素線の存在)(203nmを中心とし、スペクトルバンド幅が3nm〜6nmの干渉フィルタを使用することがこの場合には非常に好適であることが特定される)と、
単一の線ではなく、「累積」強度が253.56nmのリン線よりも(4倍〜5倍)大きい、一組の線を取り扱う可能性と、
の間で達成される折衷に基づいて、特に有利だと考えられることである。
Claims (46)
- 生体分子標的がハイブリダイズするプローブ(44)のマトリクスであって、複数の該プローブをそれぞれ含む多数の測定点(2)を含む、マトリクスを備えるタイプのバイオチップ(1)に付着させた生体分子標的の定量測定方法であって、
a)少なくとも1つのレーザー光線(10’、110、18、118)を各測定点に集束照射して、そこから前記標的及び必要に応じて前記プローブにも存在する定量対象の化学元素を含む閉じ込められたホットプラズマ(P)を抽出する工程と、
b)前記プラズマからの輝線を、これらの線の各強度を測定することによって、各測定点に関して検出及び分析する工程と、その後の
c)定量対象の前記元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との相関を実証するこれらの線の事前の較正を通じて、前記標的中の前記元素又はそれを含む基の各測定点における濃度を求める工程と、
を含むことを特徴とする、方法。 - 工程c)から各測定点(2)における前記元素の原子の数を演繹して、そこから前記標的がハイブリダイズしたプローブ(44)の数を演繹することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記レーザー誘起ブレークダウン分光(LIBS)技法を、工程a)〜工程c)の実施に使用することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- レーザー誘起蛍光(LIF)技法を、工程a)〜工程c)の実施に併用することを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 非標識核酸を含む標的を使用することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)及びリボ核酸エーテル(ERN)から成る群から選ばれるプローブを使用することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸標的中に存在するリンのみを、工程b)において、リンからの原子輝線及びイオン輝線を前記プラズマ(P)中で検出するために定量する元素として使用することを特徴とする、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記核酸標的及び核酸も含む前記プローブの両方に存在するリンを、標的とプローブとを区別する事前の工程の後、工程b)において、リンからの原子輝線及びイオン輝線を前記プラズマ(P)中で検出するために定量する元素として使用することを特徴とする、請求項5又は6に記載の方法。
- 工程b)において、リンからの前記輝線を、138nm±3nm、148nm±3nm、154nm±3nm、167nm±3nm、177nm±3nm、190nm±3nm、193nm±3nm、203nm±3nm、213nm±3nm及び253nm±3nmから成る群から選ばれる値の波長で検出することを特徴とする、請求項7又は8に記載の方法。
- 工程b)において、リンからの前記輝線を、203nm±3nmの波長で検出することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 工程a)の前に、各標的を、その大きさを各プローブ(44)の大きさと実質的に等しくする較正工程で処理して、前記標的のハイブリダイズしていない部分を除去することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記較正工程を、前記バイオチップ(1)を、各測定点(2)上に存在する全ての一本鎖核酸を分解して、プローブ/標的二本鎖のみを保存することが可能なエキソヌクレアーゼ等のヌクレアーゼタイプの酵素で処理することによって実施することを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 工程a)で使用する前記レーザー光線又は各レーザー光線(10’、110、18、118)を、周波数10Hz〜100kHz、エネルギー1mW〜1kWの1fs〜100nsのパルスにより、赤外−可視−紫外域で放出することを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レーザー光線又は各レーザー光線(10’、110、18、118)の各測定点(2)の表面での出力密度を1GW/cm2よりも大きくすることで、気化により、寿命が約2μsの前記ホットプラズマ(P)を得ることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 1μm幅〜50μm幅の表面で各測定点(2)をアブレートする単一のレーザー光線(110)を使用し、且つ前記バイオチップ(1)を、1μm〜100μmのステップでの平面的なわずかな動きにより前記光線に対して相対的に移動させて、全ての前記測定点をスキャンすることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 幾つかのレーザー光線(10’)を、前記バイオチップ(1)に対して相対的に同時に移動させて、これらの光線により全ての前記測定点(2)をアブレートすることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光線又は各光線(10’、110、18、118)によって生成する前記プラズマ(P)を、このプラズマが分析対象の他の測定点(2)に干渉しないように閉じ込め、且つ前記光線又は各光線に対応する前記プラズマからの前記輝線を同時に検出することを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの活性化剤、例えば、アルゴン、ヘリウム、窒素又はこれらのガスの混合物を、前記閉じ込めたプラズマ又は各閉じ込めたプラズマ(P)に添加することを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載の定量測定方法を実施するための装置であって、
生体分子標的がハイブリダイズするプローブ(44)のマトリクスであって、複数の該プローブをそれぞれ含む多数の測定点(2)を含む、マトリクスを備えるタイプのバイオチップ(1)と、
前記測定点に少なくとも1つのレーザー光線(10’、110、18、118)を集束照射して、そこから前記標的及び必要に応じて前記プローブにも存在するリンのような定量対象の化学元素を含有するホットプラズマ(P)を抽出するための手段(3及び4)並びにこうして抽出された前記プラズマ又は各プラズマを閉じ込めるための手段を含む、プラズマ生成及び閉じ込めユニットと、
前記プラズマ生成及び閉じ込めユニットと接続し、且つ、前記元素の各測定点における濃度を、定量対象の前記元素に特異的な線の強度とこの元素の所定の濃度との間の相関に基づいて求めるように、各測定点の前記プラズマからの輝線を検出及び分析するのに好適な分光写真ユニット(5)と、
を備えた、装置。 - 前記プローブ(44)とハイブリダイズする前記標的が非標識核酸を含み、且つ前記プローブが、核酸、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)及びリボ核酸エーテル(ERN)から成る群から選ばれることを特徴とする、請求項19に記載の装置。
- 各標的の大きさが、各プローブ(44)の大きさに実質的に等しく、各測定点(2)の全ての標的がハイブリダイズされることを特徴とする、請求項20に記載の装置。
- 抽出された前記プラズマ又は各プラズマ(P)を閉じ込めるための前記手段が、バイオチップに対して開いた状態で該バイオチップ(1)上に載る筺体(8、108)によって区切られたn(n≧1)個のプラズマチャンバ(7、107)の少なくとも1つの配列(6、106)を含み、前記筺体には、それぞれ前記プラズマを形成することが可能な励起レーザー光線(10’、110)を受光することを目的とした励起口(9、109)が設けられ、且つこれらのプラズマからの前記輝線を捕捉して前記分光写真ユニット(5)に伝達するための光ファイバー(113)が延在しており、プラズマチャンバ(複数可)の前記配列又は各配列が前記バイオチップに対して相対的に移動することを特徴とする、請求項19〜21のいずれか一項に記載の装置。
- 前記プラズマ生成ユニットが、複数の励起レーザー光線(10’)を放出し、且つそれぞれ及び同時に、前記励起口(9)を介して前記プラズマチャンバ(7)の内部にそれらを伝播するための手段(3)を含むことを特徴とする、請求項22に記載の装置。
- 前記励起レーザー光線(10’)がそれぞれ、各種レーザー源に由来することを特徴とする、請求項23に記載の装置。
- 各プラズマチャンバ(7)の前記励起口(9)が、所定の波長に対応する前記レーザー光線(10’)を導くことを目的とし、且つその自由端に、この光線を前記バイオチップ(1)へ集束させるのに好適な第1の光学レンズが設けられる、励起光ファイバー(10)を収容する(receive)ことを特徴とする、請求項23又は24に記載の装置。
- 前記励起レーザー光線(10’)が、重なり合い且つ互いに0.4nm〜1nm離れる幾つかの波長を含む上流光線(22)を放出する単一のレーザー源、及びこの上流光線を、それぞれ、前記励起レーザー光線の伝搬を目的とした励起光ファイバー(10)と同数の波長を有する下流光線(21)に分離するための波長分波器(20、30)に由来することを特徴とする、請求項23に記載の装置。
- 前記プラズマ生成ユニットが、単一の励起レーザー光線(110)を放出し、且つそれをガルバノメータヘッド(111)によって1つの励起口(109)から別の励起口へ移動させることによって、続けて前記プラズマチャンバ(107)の内部へ伝播するための手段(103)を含むことを特徴とする、請求項22に記載の装置。
- 各プラズマチャンバ(7、107)が、回転外側面によって区切られ、その上部には前記励起口(9、109)の1つが設けられ、この外側面に前記捕捉ファイバー(13、113)を収容する捕捉口(14、114)を有し、且つ該チャンバの下開口部を介して前記バイオチップ(1)のすぐ上方で開いており、対応する前記レーザー光線(10’、110)によってそこから抽出された前記プラズマ(P)を閉じ込めることを特徴とする、請求項23〜27のいずれか一項に記載の装置。
- 各プラズマチャンバ(7、107)の前記捕捉光ファイバー(14、114)には、前記チャンバに現れるその自由端に第2の光学レンズ(13a、113a)が設けられ、且つ前記外側面の内面が、前記捕捉ファイバー(13、113)の方向に前記プラズマ(P)によって放出される前記光線の反射を最適化することが可能な凹面鏡(15)が部分的に形成されるように設計されることを特徴とする、請求項28に記載の装置。
- 前記プラズマ生成ユニットがまた、第2の励起レーザー光線(18、118)を放出し、且つ各チャンバの外側面の下部の前記プラズマ(P)が膨張する高さ又は前記バイオチップ(1)から抽出された前記物質を排斥する高さに作製された少なくとも1つの第2の励起口(19、119)を介して、1つのチャンバ(7、107)から別のチャンバへこの光線を導入するための補助手段(4、104)を含み、各第2の励起口は、前記捕捉ファイバー(13、113)又は前記凹面鏡(15)による影響を受けないように計画した位置に作製されることを特徴とする、請求項28又は29に記載の装置。
- 請求項28が請求項23に記載のものと同様である場合、前記補助放出手段(4)が、前記第2の励起光線(18)を1つの第2の励起口(19)から別の第2の励起口へ移動させることが可能なガルバノメータヘッド(17)を含むことを特徴とする、請求項30に記載の装置。
- 各第2の励起口(19)に、前記対応する第2の励起レーザー光線(18)を前記膨張する高さ又は前記排斥する高さに集束させることが可能な第3の光学レンズが設けられることを特徴とする、請求項31に記載の装置。
- 請求項28が請求項27に記載のものと同様である場合、各プラズマチャンバ(107)が、互いに向かい合う第2の励起口(119)の対を有し、これらの励起口の対が、チャンバの前記配列(106)内で位置合わせされ、この位置合わせを通じて、前記補助放出手段(104)によって放出される第2の励起レーザー光線(118)を集束照射することを特徴とする、請求項30に記載の装置。
- 各測定点(2)が、例えば、コバルト、ニッケル又はそれらの酸化物の粒子を含有するポリスチレン製の磁性ビーズ又は常磁性ビーズ(41a、41b、41c)を含み、各ビーズは、これらのビーズが前記分光写真ユニット(5)を備える撮像システムによって明瞭に同定することが可能な光学検査対象を形成するように、前記バイオチップ(1)の残部及び他の測定点とは色が異なることを特徴とする、請求項19〜33のいずれか一項に記載の装置。
- 前記バイオチップ(1)が、ビーズ(41a、41b、41c)と同数の穴(42)が作製され、且つこれらの穴において、強度0.5T〜5Tの磁場を生成することが可能な磁気ストリップ(43)の上に載る、例えば、ポリイミド製の遮磁壁を形成するプラスチックシート(40)を含むことを特徴とする、請求項34に記載の装置。
- 各ビーズ(41a、41b)が2つの半球(S1及びS2又はS1’及びS2’)から構成され、該2つの半球は、前記穴(42)の1つで互いに結合し、且つ前記磁気ストリップ(43)側を向いた下半球(S2又はS2’)のみが常磁性であり、前記プローブ(44)が、着色された上半球(S1又はS1’)の凸面にグラフトされて、前記光学検査対象を形成することを特徴とする、請求項35に記載の装置。
- 各ビーズ(41c)が、前記光学検査対象の形成を目的とし、且つその凸面上に、前記プローブ(44)がグラフトされる着色された上半球(S1’’)、並びに底面を介してこの半球の縁(T)の下で結合し、前記穴(42)の内部の前記磁気ストリップ(43)側にある常磁性の円錐体(S2’’)から構成されることを特徴とする、請求項35に記載の装置。
- 各プラズマチャンバ(7、107)の前記外側面が、前記バイオチップ(1)に向かって徐々に広がり、高さが2mm〜10mmであり、且つ前記バイオチップから5μm〜200μmの距離が開いている円柱又は円錐であり、前記下開口部の直径が1mm〜5mmであることを特徴とする、請求項28〜37のいずれか一項に記載の装置。
- 各プラズマチャンバ(7、107)に、前記励起口(9、109)のすぐ近傍の前記外側面上に作製され、且つ前記チャンバから酸素を除くと共に、前記プラズマ(P)をその形成時に活性化することが可能なアルゴン又はヘリウム等の不活性ガスの導入を目的とした管(12)を収容する、ガス注入口(11)がさらに設けられることを特徴とする、請求項28〜38のいずれか一項に記載の装置。
- プラズマチャンバ(7)の前記配列(6)及び前記バイオチップ(1)がそれぞれ、2つの直交軸X及びYに沿って移動することができるように載置され、Y軸に沿って前記バイオチップがそれぞれ移動すると、前記配列がX軸に沿ってKだけ移動するようにし、ここで、
Kは、2つの隣接するチャンバの各励起ファイバー(10)間の距離Pと、各レーザーパルスでアブレートされた表面のX軸に沿った幅lとの比P/lによって規定され、この比は、気化後のアブレーションの形状因子によって調節され、且つ
これら2つの励起ファイバー間の距離Pは、等式P=L/(N−1)(但し、N>1、Lは、前記バイオチップの幅であり、且つNは、前記配列中の励起ファイバーの数である)によって規定されることを特徴とする、請求項22〜39のいずれか一項に記載の装置。 - 2つの隣接する励起ファイバー(10)間の前記距離Pが、前記バイオチップ(1)上の2つの測定点(2)間の複数の前記ステップであることを特徴とする、請求項40に記載の装置。
- 前記筺体(8、108)に、その中での磁場の生成に好適な少なくとも1つのソレノイドを設けて、特に、前記プラズマ又は各プラズマ(P)の寿命を増加させ、および/または、それらの形状を制御することを特徴とする、請求項22〜41のいずれか一項に記載の装置。
- 例えば、前記バイオチップの支持体の導電性物質又は他ではこのバイオチップ支持体が担持する電極から構成される電場を生成するための手段が設けられ、前記電極は前記筺体が担持する別の電極と関連し、電位差を生成することを特徴とする、請求項22〜42のいずれか一項に記載の装置。
- 前記筺体(8、108)が、幾つかのプラズマチャンバ(7、107)の少なくとも1系統の包囲に好適であり、且つ光造形、積層、焼結又はフォトリソグラフィ等の、粉末又は液体ポリマーを使用するレーザー構造化技法又は機械的構造化技法によって形成される、実質的に平行六面体形状であることを特徴とする、請求項22〜43のいずれか一項に記載の装置。
- 前記分光写真ユニット(5)が、光電子増倍管タイプの少なくとも1つの分光写真器を含み、且つ所望の波長のみを通す光学フィルタが、各捕捉光ファイバー(13、113)と前記分光写真器との間に配置されることを特徴とする、請求項19〜44のいずれか一項に記載の装置。
- 前記バイオチップ(1)を含有する閉鎖筺体から構成される単一のプラズマチャンバ(7’)を含み、少なくともその上面(7a’)は、石英製又は励起波長及び捕捉波長を通す任意の他の物質製であり、この閉鎖チャンバが、アルゴン又は窒素等のプラズマ形成性ガスを充填するためのバルブ(V1)及び空気を排除するためのバルブ(V2)を備えることを特徴とする、請求項22に記載の装置。
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