JP2010502936A - ナノポア電極、ナノポア膜、それらの作製と表面修飾の方法、及びそれらの使用 - Google Patents
ナノポア電極、ナノポア膜、それらの作製と表面修飾の方法、及びそれらの使用 Download PDFInfo
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Abstract
ナノディスク電極、ナノポア電極、及びナノポア膜の、製作、特性解析、及び利用を提供する。これら三つのナノ構造は、同じ製作工程を共有する。一態様において、ディスク電極の製作には、尖らせた内部シグナル伝達要素（"ISTE"）を基材の中に封じ込める工程、その後、ナノメートルサイズのISTEのディスクが露出するまで基材を研磨する工程が含まれる。ナノポア電極の製作は、ナノディスク電極をエッチングしてポアを基材中に作ることによって達成され、ポアの底部を含むISTEが残される。ISTEの完全な除去によってナノポア膜がもたらされ、そこにおいて、基材の薄い膜の中に円錐形のポアが埋め込まれている。
Description
優先権主張
本出願は、2007年5月3日に出願された米国出願第11/744,154号に基づく優先権を主張し、そして、2007年3月23日に出願された米国仮出願第60/919,659号及び2006年5月5日に出願された米国仮出願第60/797,850号の米国特許法119条（e）に基づく利益を主張し、それぞれの全内容が、参考文献として援用される。
本出願は、2007年5月3日に出願された米国出願第11/744,154号に基づく優先権を主張し、そして、2007年3月23日に出願された米国仮出願第60/919,659号及び2006年5月5日に出願された米国仮出願第60/797,850号の米国特許法119条（e）に基づく利益を主張し、それぞれの全内容が、参考文献として援用される。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国防高等研究計画局によって授けられた#FA9550-06-C-0006の補助を受けて、政府の援助を伴ってなされた。本発明はまた、国立衛生研究所によって授けられた#ES013548の補助を受けて、政府の援助を伴ってなされた。本発明はまた、国立科学財団によって授けられたCHE-0616505の補助を受けて、政府の援助を伴ってなされた。合衆国政府は、本発明に対して特定の権利を有し得る。
本発明は、国防高等研究計画局によって授けられた#FA9550-06-C-0006の補助を受けて、政府の援助を伴ってなされた。本発明はまた、国立衛生研究所によって授けられた#ES013548の補助を受けて、政府の援助を伴ってなされた。本発明はまた、国立科学財団によって授けられたCHE-0616505の補助を受けて、政府の援助を伴ってなされた。合衆国政府は、本発明に対して特定の権利を有し得る。
技術分野
本発明はナノテクノロジーの分野に関する。具体的には、本発明は、ナノディスク電極、電極及びナノポア膜に関する。
本発明はナノテクノロジーの分野に関する。具体的には、本発明は、ナノディスク電極、電極及びナノポア膜に関する。
背景
個別のポアにおける分子輸送（例えば、タンパク質イオンチャネル（(a)Kasianowicz, J. J.; Brandin, E.; Branton, D.; Deamer, D. W. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93, 13770; (b) Bayley, H; Cremer, P. S. Nature 2001, 413, 226; (c) Gu, L.-Q.; Braha, O.; Conlan, S. ; Cheley, S. and Bayley, H. Nature 1999, 398, 686）及び合成チャネル（(a) Ito, T.; Sun, L.; Crooks, R. M. Anal. Chem. 2003, 75, 2399; (b) Ito, T.; Sun. L.; Henriquez, R. R.; Crooks, R. M. Acc. Chem. Res. 2004, 37, 937; (c) Hinds, B. J.; Chopra, N.; Rantell, T.; Andrews, R.; Gavalas, V.; Bachas, L. G. Science 2004, 303, 62. (d) Majumber, M.; Chopra, N.; Hings, B. J. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 9062; (e) Li, J.; Gershow, M.; Stein, D.; Brandin, D.; Golovchenko, J. A. Nat. Mater. 2003, 2, 611; (f) Li, J.; Stein, D.; McMullan, C.; Branton, D.; Aziz, M. J.; Golovchenko, J. A. Nature 2001, 412, 166.））及び、ナノメートルサイズのポアを含む材料における分子輸送（例えば、ゼオライト触媒及びゼオライト膜）は、化学及び生物学全体にわたって、興味を持たれている。ポアの大きさが十分に小さく、ポア表面と通過物との間の相互作用が局所的輸送動力学に影響する場合、通過物の化学的特性又は物理学的特性に基づく輸送選択性が、ポアにおいてしばしば観察されると一般に理解されている（“通過物”とはポアを通過する分子又はイオンのことをいう）。例えば、グラミシジンチャネルを通るアルカリ金属イオン輸送の速度は、金属イオン半径に大きく依存するが、これはチャネル半径（約2Å）が無水イオン半径と同程度であることによる（(a) Andersen, O. S.; Feldberg, S. W. J. Phys. Chem. 1996, 100, 4622; (b) Andersen, O. S. Biophys. J. 1983, 41, 147; (c) Andersen, O. S. Biophys. J. 1983, 41, 135）。ポア表面と通過物との間の数ナノメートルから数十ナノメートルにわたるより長距離の相互作用（例えば、静電気力）もまた、より大きな寸法のポアにおける輸送選択性を導くことができる（(a) Daiguji, H.; Yang, P.; Majumdar, A. Nano Lett. 2004, 4, 137; (b) Karnik, R.; Fan, R.; Yue, M.; Li, D.; Yang, P.'; Majumdar, A. Nano Lett., 2005, 5, 943）。
個別のポアにおける分子輸送（例えば、タンパク質イオンチャネル（(a)Kasianowicz, J. J.; Brandin, E.; Branton, D.; Deamer, D. W. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93, 13770; (b) Bayley, H; Cremer, P. S. Nature 2001, 413, 226; (c) Gu, L.-Q.; Braha, O.; Conlan, S. ; Cheley, S. and Bayley, H. Nature 1999, 398, 686）及び合成チャネル（(a) Ito, T.; Sun, L.; Crooks, R. M. Anal. Chem. 2003, 75, 2399; (b) Ito, T.; Sun. L.; Henriquez, R. R.; Crooks, R. M. Acc. Chem. Res. 2004, 37, 937; (c) Hinds, B. J.; Chopra, N.; Rantell, T.; Andrews, R.; Gavalas, V.; Bachas, L. G. Science 2004, 303, 62. (d) Majumber, M.; Chopra, N.; Hings, B. J. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 9062; (e) Li, J.; Gershow, M.; Stein, D.; Brandin, D.; Golovchenko, J. A. Nat. Mater. 2003, 2, 611; (f) Li, J.; Stein, D.; McMullan, C.; Branton, D.; Aziz, M. J.; Golovchenko, J. A. Nature 2001, 412, 166.））及び、ナノメートルサイズのポアを含む材料における分子輸送（例えば、ゼオライト触媒及びゼオライト膜）は、化学及び生物学全体にわたって、興味を持たれている。ポアの大きさが十分に小さく、ポア表面と通過物との間の相互作用が局所的輸送動力学に影響する場合、通過物の化学的特性又は物理学的特性に基づく輸送選択性が、ポアにおいてしばしば観察されると一般に理解されている（“通過物”とはポアを通過する分子又はイオンのことをいう）。例えば、グラミシジンチャネルを通るアルカリ金属イオン輸送の速度は、金属イオン半径に大きく依存するが、これはチャネル半径（約2Å）が無水イオン半径と同程度であることによる（(a) Andersen, O. S.; Feldberg, S. W. J. Phys. Chem. 1996, 100, 4622; (b) Andersen, O. S. Biophys. J. 1983, 41, 147; (c) Andersen, O. S. Biophys. J. 1983, 41, 135）。ポア表面と通過物との間の数ナノメートルから数十ナノメートルにわたるより長距離の相互作用（例えば、静電気力）もまた、より大きな寸法のポアにおける輸送選択性を導くことができる（(a) Daiguji, H.; Yang, P.; Majumdar, A. Nano Lett. 2004, 4, 137; (b) Karnik, R.; Fan, R.; Yue, M.; Li, D.; Yang, P.'; Majumdar, A. Nano Lett., 2005, 5, 943）。
ポア輸送機構及び輸送選択性の起源を理解する際の過去数十年にわたる発展は、ナノメートルスケールのチャネル及びポアを通る選択的輸送に基づく、化学的センサー及び生物学的センサーの開発についての最近の関心を導いた。標的分析物と相互作用するように操作又は化学修飾された、α-ヘモリジンといったタンパク質イオンチャネルは、分析物結合時にタンパク質を通るイオン電流の変化を測定することによって、個々の分子を検出することができる（Meller, A. J. Phys. Condens. Matter 2003, 15, R581）。協調的な平均の結果ではなく、個々のナノポア内部における分子又は粒子の輸送動力学を観測する能力は、生物学的親和性対及び合成親和性対を用いたポアに関する基礎研究の動機付けとなった（Umezawa, Y.; Aoki, H. Anal. Chem. 2004, 76, 320 A）。
生物学的ポアに加えて、近年、合成ポアを用いた分析検出において大きな躍進があり、これは、ナノスケール合成のための方法及び材料に関する急速な開発によって、主として可能になった（(a) Jirage, K. B.; Hulteen, J. C.; Martin, C. R. Science 1997, 278, 655; (b) Harrell, C. C.; Lee, S. B.; Martin, C. R. Anal. Chem. 2003, 75, 6861 (c) Harrell, C. C.; Kohli, P. Siwy, Z.; Martin, C. R. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15646. (d) Fologea, D.; Gershow, M.; Ledden, B.; McNabb, D. S.; Golovchenko, J. A.; Li, Jiali Nano Lett. 2005, 5, 1905; (e) Fologea, D.; Gershow, M.; Uplinger, J; Thomas, B.; McNabb, D. S.; Li, Jiali Nano Lett. 2005, 5, 1734; (f) Chen, P.; Gu, J.; Brandin, E., Kin, Y.-R., Wang, Q.; Branton, D. Nano Lett., 2004, 4, 2293; (g) Storm, A. J.; Chen, J. H.; Ling, x. S.; Zandbergen, H. W.; Dekker, C. Nat. Mater. 2003, 2, 537; (h) Liu, N.; Dunphy, D. R.; Atanassov, P.; Bunge, S. D.; Chen, Z.; Lo' pez, G. P.; Boyle, T. J.; Brinker, C. J. Nano Lett. 2004, 4, 551; (i) Fan, R. Karnik, R.; Yue, M. Li, D., Majumdar, A; Yang, P. Nano Lett. 2005, 5, 1633）。例えば、ナノサイズのチャネルを含むポリカーボネート膜を用いて、金ナノチューブの鋳型を合成し、次いで、DNA分子の検出を含むバイオセンサー利用のために機能化することができる（Heins, E. A.; Siwy, Z. S.; Baker, L. A.; Martin, C. R. Nano Lett., 2005, 5, 1824.）。pH切換可能なイオン輸送選択性は、Auナノチューブの表面にシステインを結合することによって達成された（Lee, S. B.; Martin, C. R. Anal. Chem. 2001, 73, 768）。Si3N4膜中に作られた半導体（steady-state）ナノポア（(a) Fologea, D.; Gershow, M.; Ledden, B.; McNabb, D. S.; Golovchenko, J. A.; Li, Jiali Nano Lett. 2005, 5, 1905; (b) Fologea, D.; Gershow, M.; Uplinger, J; Thomas, B.; McNabb, D. S.; Li, Jiali Nano Lett. 2005, 5, 1734; (c) Chen, P.; Gu, J.; Brandin, E., Kin, Y.-R., Wang, Q.; Branton, D. Nano Lett., 2004, 4, 2293; (d) Storm, A. J.; Chen, J. H.; Ling, x. S.; Zandbergen, H. W.; Dekker, C. Nat. Mater. 2003, 2, 537; (e) Liu, N.; Dunphy, D. R.; Atanassov, P.; Bunge, S. D.; Chen, Z.; Lopez, G. P.; Boyle, T. J.; Brinker, C. J. Nano Lett. 2004, 4, 551）は、単分子解析及びDNA検出のために用いられ、そしてシリコンナノチューブは、DNAセンシングのためにマイクロ流体システムと一体化される（Fan, R. Karnik, R.; Yue, M. Li, D., Majumdar, A; Yang, P. Nano Lett. 2005, 5, 1633.）。カーボンナノチューブ（CNT）は、ナノ粒子のコールター・カウンターとして用いられる（Ito, T.; Sun, L.; Crooks, R. M. Anal. Chem. 2003, 75, 2399）。高分子フィルム中に組み込まれてマルチチャネル膜構造を作る、整列されそして化学修飾されたCNTもまた、分析物の結合を記録することができる（Majumber, M.; Chopra, N.; Hings, B. J. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 9062）。
単分子の検出のための生物学的ナノポアの使用は、20年にわたって実施されてきた（例えば、Deamer, D. W., Branton, D., Acc. Chem. Res. 2002, 35, 817-825参照）。例えば、Staphylococcus aureus 由来の生体タンパク質ナノポアであるα-ヘモリジン（αHL）は、単分子検出のために理想的であることが証明されており、1.6 nmの内部ポアのくびれの直径（inner pore constriction diameter）を与える（Song, S., Hobaugh, M. R., Shustak, C., Cheley, S., Bayley, H., Govaux, J. E., Science, 1996, 274, 1859-1865）。
ナノメートルスケールの電極の使用もまた、1980年代後半から基礎研究におけるツールとしてかなりの注目を集めた。例えば、ナノ電極は、高速電子移動反応の研究において使用され（Watkins, J. J.; Chen, J.; White, H. S.; Abruna, H. D.; Maisonhaute, E.; and Amatore, C. Anal. Chem. 2003, 75, 3962; Penner, R. M.; Heben, M. J.; Longin, T. L.; Lewis, N. S. Science 1990, 250, 1118）、界面構造の研究において使用され（Conyers, J. L. Jr.; White, H. S. Anal. Chem. 2000, 72, 4441; Chen, S.; Kucernak, A. J. Phys. Chem. B 2002, 106, 9396）、単電子及び単分子の電気化学の研究において使用され（Fan, F-R. F.; Bard, A. J.; Science 1995, 267, 871; Fan, F-R, F.; Kwak, J.; Bard, A. J. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 9669）、燃料電池触媒の模倣体として使用され（Chen, S.; Kucernak, A. J. Phys. Chem. B 2004, 108, 13984）、及び生物電気化学的測定における分析プローブとして使用された（Wightman, R. M. Science 2006, 311, 1570）。
ナノメートルサイズの電極を作る方法は、いくつかの報告において見ることができる（Zoski, C. G. Electroanalysis 2002, 14, 1041; Watkins, J. J.; Zhang, B.; White, H. S. J. Chem. Edu. 2005, 82, 712; Arrigan, D. W. M. Analyst 2004, 129, 1157）。最も多くは、電気化学的にエッチングした炭素繊維又は金属ワイヤの末端を絶縁材料（例えばガラス、蝋、及び高分子）の中へ封じ込め、繊維又はワイヤの先端を露出させる（Penner, R. M.; Heben, M. J.; Lewis, N. S. Anal. Chem. 1989, 61, 1630; Huang, W-H.; Pang, D-W.; Tong, H.; Wang, Z-L.; Cheng, J-K. Anal. Chem. 2001, 73, 1048; Hrapovic, S.; Luong, J. H. T. Anal. Chem. 2003, 75, 3308; Slevin, C. J.; Gray, N. J.; Macpherson, J. V.; Webb, M. A.; Unwin, P. R. Electrochem. Comm. 1999, 1, 282; Woo, D-H.; Kang, H.; Park, S-M. Anal. Chem. 2003, 75, 6732）。この方法で作られた電極は一般に、絶縁材料の薄い層に包まれた半球形又は円錐形を有する。絶縁体の性質によって、電極の使用が制限される可能性がある。例えば、薄い有機層で絶縁された電極は簡単に作られるが、その使用は一般に水溶液に制限され、そして、薄い絶縁層の静電容量によって、一過性の測定における非常に大きい容量性電流を示す傾向がある（Watkins, J. J.; Chen, J.; White, H. S.; Abruna, H. D.; Maisonhaute, E.; and Amatore, C. Anal. Chem. 2003, 75, 3962）。
ナノメートルサイズのディスク電極は、マイクロピペット・プラー（micro-pipette puller）でガラス毛管内に埋め込まれたPtワイヤを引き、そして次に機械研磨又は化学的エッチングを用いて金属のディスク状領域を露出させることによって、作られる（Ballesteros Katemann, B.; Schuhmann, W. Electroanalysis 2002, 14, 22）。その結果として生じるガラスに包まれた電極は、耐久性があり、そして好ましい電気的特性を有する。しかし、この手順を用いると、一定の大きさを有する電極を作製することが難しい。さらに、高価なピペット・プラーの使用が必要となる。Shaoらは、ガラスに封じ込められたPtナノ電極の研磨中に抵抗をモニタリングすることに言及しているが（Shao, Y.; Mirkin, M. V.; Fish, G.; Kokotov, S.; Palanker, D.; Lewis, A. Anal. Chem. 1997, 69, 1627）、方法論及び器具使用の詳細は公開されていない。
発明の開示
ナノディスク電極
第一の表面及び第二の表面を有する基材並びに第一の表面及び第二の表面を有する内部シグナル伝達要素（"ISTE"）を含む、図１（Ａ）に例示のナノディスク電極を提供する。ISTEは基材中に埋め込まれ、それにより、ISTEの第一の表面は、基材の第一の表面と同一平面内にあり、そしてISTEの第二の表面は、伸長するか、又は基材の第二の表面を通って露出する。ISTEの第一の表面は、露出表面の半径によって、“ディスク”、“ナノディスク”又は“マイクロディスク”と定義され、そしてISTEの第一の表面を通って露出する。基材は、一より多いISTEを含むか、又はISTEのアレイを含むように構成することができる。
ナノディスク電極
第一の表面及び第二の表面を有する基材並びに第一の表面及び第二の表面を有する内部シグナル伝達要素（"ISTE"）を含む、図１（Ａ）に例示のナノディスク電極を提供する。ISTEは基材中に埋め込まれ、それにより、ISTEの第一の表面は、基材の第一の表面と同一平面内にあり、そしてISTEの第二の表面は、伸長するか、又は基材の第二の表面を通って露出する。ISTEの第一の表面は、露出表面の半径によって、“ディスク”、“ナノディスク”又は“マイクロディスク”と定義され、そしてISTEの第一の表面を通って露出する。基材は、一より多いISTEを含むか、又はISTEのアレイを含むように構成することができる。
様々な態様において、基材は、例えば、ガラス、Si、SiO2、Si3N4、石英、アルミナ、窒化物、金属、高分子、又は他の適した材料で作ることができる。基材は、純物質又は混合物であってよい。特定の態様において、基材は、ソーダ石灰ガラス毛管又は鉛ガラス毛管である。
ISTEは、様々な適した形状であってよい。ISTEは、電気的シグナル伝達のために適した任意の材料で作ることができる。ISTEは好ましくは、例えば、白金（"Pt"）、金（"Au"）、銀（"Ag”）又はタングステン（"W"）といった金属であるが、例えば、炭素（"C"）、半導体（例えば、ケイ素、"Si"）又は電気伝導性高分子（例えば、ポリアナリン（polyanaline））といった任意の伝導性材料であってよい。特定の態様において、ISTEは白金ワイヤを含む。白金ワイヤは、電子機器との外部の電気的接続のために、銀塗装を介したタングステンロッドとさらに結合させることができる。白金ワイヤはまた、銅といった他の材料と結合させることもできる。別の特定の態様において、ISTEはAuワイヤを含む。
ナノディスク電極を作製する方法をさらに提供する。その方法は、ISTEを含む部分を基材の中に封じ込める工程、及びISTEの第一の表面、すなわちディスクが露出するまで基材を研磨する工程を含む。
所望の半径のディスクを有するナノディスク電極を作製する方法をさらに提供する。その方法は、円錐形の先端を有するISTEを提供する工程、基材の外側に伸長させたISTEの第二の表面を含む部分を有する基材の中にISTEの円錐状の先端を封じ込める工程、先端を露出させるために研磨手段を用いて基材を研磨する工程、ISTEと研磨手段との間の電気的導通抵抗を測定する工程、及び測定された抵抗が所望の抵抗に達した場合に研磨を止める工程を含む。例えば、研磨の間、高入力インピーダンスの金属-酸化物半導体電界効果トランジスタ（MOSFET）に基づく回路を用いた断続的な電気測定を行い、ISTEの伸長部分と研磨布との間の抵抗を測定する。測定された抵抗が所望の抵抗と一致した場合、それは所望の大きさのディスクが露出したことを示し、研磨は直ちに止められる。所望の大きさのディスクの露出を示す所望の抵抗は、実験的に得ることができ、又は有限要素シミュレーション及び較正曲線によって決定することができる。
ナノポア電極
図１（Ｂ）に例示されるナノポア電極をさらに提供する。ナノポア電極は、第一の表面及び第二の表面を有する基材、第一の表面及び第二の表面を有するISTE、並びに開口部、底部及び内部表面を有するナノポアを含む。ISTEは基材の中に埋め込まれ、それにより、ISTEの第一の表面はナノポアの底部であり、そしてISTEの第二の表面は伸長し、又は基材の第二の表面を通って露出する。ナノポアの開口部は、基材の第一の表面を通って開口する。ナノポアの内部表面は、基材と不可分の一部である。基材の第一の表面はまた、ナノポアの外部表面と呼ぶこともできる。基材は、一つより多いナノポア及び一つより多いISTEを含むように、又はナノポア及びISTEのアレイを含むように構成することができる。ナノポア電極を、シリコン及び他のマイクロ電子工学的リトグラフによって作られた装置（microelectronic lithographically fabricated device）の中に組み込むことができる。
図１（Ｂ）に例示されるナノポア電極をさらに提供する。ナノポア電極は、第一の表面及び第二の表面を有する基材、第一の表面及び第二の表面を有するISTE、並びに開口部、底部及び内部表面を有するナノポアを含む。ISTEは基材の中に埋め込まれ、それにより、ISTEの第一の表面はナノポアの底部であり、そしてISTEの第二の表面は伸長し、又は基材の第二の表面を通って露出する。ナノポアの開口部は、基材の第一の表面を通って開口する。ナノポアの内部表面は、基材と不可分の一部である。基材の第一の表面はまた、ナノポアの外部表面と呼ぶこともできる。基材は、一つより多いナノポア及び一つより多いISTEを含むように、又はナノポア及びISTEのアレイを含むように構成することができる。ナノポア電極を、シリコン及び他のマイクロ電子工学的リトグラフによって作られた装置（microelectronic lithographically fabricated device）の中に組み込むことができる。
様々な態様において、基材は、例えば、ガラス、Si、SiO2、Si3N4、石英、アルミナ、窒化物、金属、高分子、又は他の適した材料で作ることができる。膜は、純物質又は混合物であってよい。特定の態様において、基材は、ソーダ石灰ガラス毛管又は鉛ガラス毛管である。
ナノポアは様々な適した形状をとってよく、好ましくは、開口部の半径がナノポアの底部の半径より小さい、切断された円錐形をとる。円錐形ナノポアの開口部の半径は、好ましくは、約2 nmから約500 nmの範囲、又はこれ以上である。底部の半径は、100 nmからISTEに用いられるワイヤの直径までの範囲である。円錐形ナノポアの深さは、ナノポアの開口部から底部までの距離である。その深さは、好ましくは、10 nmから100μmの範囲である。
ISTEは、様々な適した形状であってよい。ISTEは、電気的シグナル伝達のために適した任意の材料で作ることができる。ISTEは好ましくは、例えば、Pt、Au、Ag又はWといった金属であるが、例えば、C、半導体（例えば、Si）又は電気伝導性高分子（例えば、ポリアナリン）といった任意の伝導性材料であってよい。特定の態様において、ISTEは白金ワイヤを含む。白金ワイヤは、銀塗装を介したタングステンロッドとさらに結合させることができる。白金ワイヤはまた、銅といった他の材料と結合させることもできる。別の特定の態様において、ISTEはAuワイヤを含む。
ナノポアの内部表面及び／又は外部表面を修飾して、例えば、電荷密度、疎水性、又は親水性といったそれぞれの表面の表面特性を変化させることができる。ナノポアの外部表面を、第一の構成物によって修飾することができる。ナノポアの内部表面を、第二の構成物によって修飾することができる。第一の構成物及び第二の構成物は、異なる構成物であってよい。第一の構成物又は第二の構成物は、高分子、小有機分子、タンパク質などであってよい。表面の修飾は、物理的性質又は化学的性質であってよい。例えば、第一の構成物又は第二の構成物は、例えば疎水性相互作用によって、非共有結合的な力を介してそれぞれの表面に結合することができる。別の例では、第一の構成物又は第二の構成物は、共有結合を介してそれぞれの表面に結合することができる。第二の構成物は、例えば化学反応性アミノ基といった、化学官能基を含むことができ、又は、例えば内部表面に結合してビオチン結合部位を提供するストレプトアビジンといった、機能性結合部位を含むことができる。あるいは、様々な機能的センサー分子を、物理的な力、化学的結合、又は配位共有結合のいずれかによって、ナノポアの内部表面に結合した第二の構成物に結合させ、ナノポアに様々な機能を付与することができる。脂質二重層は、様々な手段によって開口部を覆って沈着され、標的分析物と相互作用し、検出し、そして解析するためのセンサー伝達因子（sensor transduction agent）として機能する可能性のあるタンパク質、酵素、及び他の生体分子のための支持体として機能することができる。
ある態様において、ナノポアの外部表面は、単一の化学官能基を有する構成物によって、化学修飾される。例えばCl(Me)2Si(CH2)3CNといった、不活性末端を有する化学反応性のシランは、ガラスナノポアの外部表面と反応して、-CN基で終わるシラン単層を生成する。様々な末端基、及び／又は様々な表面反応性基（例えば、メトキシ基又は複塩素基（multiple chlorine group））を有する他の反応性シランは、同様に表面に結合し、単層フィルム及び複層フィルムを形成することができる。ナノポアの内部表面を、単一又は複数の官能基を有する構成物で修飾することができる。例えば、ガラスナノポアの内部を、EtO(Me)2Si(CH2)3NH2によってシラン化し、-NH2基で終わる単層をもたらすことができる。様々な機能性分子を、内部表面に結合した-NH2基との反応を介してナノポアの内部表面に結合させることができる。例えば、センサータンパク質のカルボキシレート基は、-NH2基と反応することができ、そしてそれによって、そのタンパク質はアミド結合を介してナノポアの内部表面に共有結合することができる。あるいは、内部表面を、機能性結合部位を有する構成物で直接修飾することができる。例えば、EtO(Me)2Si(CH2)3NH-ストレプトアビジンは、ガラスナノポアの内部表面に結合し、それによって内部表面にビオチン結合特性を付与することができる。あるいは、ナノポアの内部表面を、例えばグルタチオンといった囮要素を含む構成物によって修飾して、それにより、例えばGST-タグ（グルタチオンS-トランスフェラーゼタグ）を有するセンサー分子といった、囮要素を認識する別の機能性構成物を、非共有結合によってナノポアの内部表面に固定することができる。
本明細書中に開示されるナノディスク電極を作製する工程、及び露出したISTEの表面をエッチングして基材の中にナノポアを製造する工程を含む、ナノポア電極を作製する方法をさらに提供する。
基材の中に封じ込められたISTEの部分の形状及び大きさは、ナノポアの底部及び開口部の形状及び大きさを部分的に規定することに注目すべきである。例えば、基材の中に封じ込められたISTEの部分が円筒状である場合、結果的に生じるナノポアは円筒形になるであろう。基材の中に封じ込められたISTEの部分が円錐状である場合、結果的に生じるナノポアは切断された円錐形になるであろう。
化学修飾されたガラスナノポア電極を作製する方法をさらに提供する。そのような方法は、本明細書中に開示されるガラスナノディスク電極を提供する工程；ガラスナノディスク電極の第一の表面を、第一の構成物で修飾する工程；露出したナノディスクをエッチングしてナノポアを製造する工程；及び、ナノポアの内部表面を第二の構成物で修飾する工程；を含む。ガラスナノディスクの第一の表面は、ナノポアの外部表面でもある。ある態様において、ナノポアの外部表面は、Cl(Me)2Si(CH2)3CNで化学修飾される。この修飾によって、-CN基で終わるシラン単層が生成され、外部表面を他の化学反応性構成物とのさらなる反応から保護する。外部表面の修飾の一つの目的は、ナノポアの内部表面を修飾する構成物による外部表面の修飾を防ぐことであり、外部表面を任意の適切な化学的不活性種で修飾し又は覆うことができる。ナノポアが作られた後、ナノポアの内部ガラス表面を、EtO(Me)2Si(CH2)3NH2によってシラン化し、-NH2基で終わる単層をもたらすことができる。様々な機能性分子を、内部表面に結合した-NH2基との反応を介して、ナノポアの内部表面に結合することができる。様々な末端基、及び／又は様々な表面反応性基（例えば、メトキシ基又は複塩素基）を有する他の反応性シランは、同様に表面に結合し、単層フィルム及び複層フィルムを形成することができる。ナノポアの内部表面を、単一又は複数の官能基を有する構成物で修飾することができる。
第一の表面の表面特性を変化させるように第一の表面を第一の構成物によって修飾した、第一の表面及び第二の表面を有する基材を提供する工程；ISTEの第一の表面が基材の中に封じ込められ、そしてISTEの第二の表面が伸長し、又は基材の第二の表面を通って露出している、第一の表面及び第二の表面を有するISTEを提供する工程；基材の第一の表面を通って開口する開口部を有し、ISTEの第一の表面である底部を有し、そして内部表面の表面特性を変化させるように第二の構成物によって修飾された内部表面を有する、ナノポアを提供する工程；及び、第二の構成物を介してナノポアの内部表面に結合した機能性構成物を任意に提供する工程；を含む、表面修飾ナノポア電極を形成する方法をさらに提供する。
ナノポアを通した荷電種の物質輸送は、ナノポアの開口部における電荷密度を調節することによって、静電気的にゲート“オン”及びゲート“オフ”することができる。したがって、表面修飾ナノポア電極を用いて荷電種の輸送を調節する方法をさらに提供する。そのような方法は、解析されるべき少なくとも一つの荷電種を含有する試料溶液を提供する工程；ナノポアの内部表面を構成物で修飾して、それにより適切な調節種によってポア開口部における電荷密度を調節可能にした、ISTEを含むナノポア電極を提供する工程；ナノポア電極に溶液を接触させて、それにより、ナノポアの外部表面を溶液に浸漬し、そしてナノポアを溶液で満たす工程；溶液とISTEとの間に適切な電圧を印加する工程；適切な調節種を溶液に加えて、それにより、開口部における電荷密度を変化させ、そして開口部における電荷密度を調節することによってナノポアを通過する少なくとも一つの荷電種を、静電気的にゲート“オン”及びゲート“オフ”にすることを可能にする工程；ナノポアの電気伝導率をモニタリングする工程；及び、電気伝導率を解析して、荷電種の移動がどの程度まで調節されたかを決定する工程；を含む。溶液は、補助的な電解質を含有する必要はない。
例えば、ガラスナノポア電極の内部表面は、末端-NH2基を有する構成物によって修飾される。溶液のpH調節は、ポアの内部表面に結合した-NH2基の可逆的プロトン化をもたらす。よって、ポア開口部における電荷密度は、ポアの内部表面上の-NH2基のプロトン化の程度を変化させることによって調節することができる。したがって、-NH3 +基をもたらすナノポアの内部領域のプロトン化は、-NH3 +基と正電荷基との間の静電気的反発力によって、ナノポアの中への正荷電種の侵入を防ぐことができる。
試料溶液のpH値を調節することによって、表面修飾ガラスナノポア電極を用いて酸化還元反応の速度を調節することもできる。例えば、酸化還元反応において、正荷電種Roxは種Rredに還元される。Rredは荷電していても荷電していなくてもよい。溶液のpH値は調節することができて、それにより、末端-NH3 +基を生ずるナノポアの内部領域のプロトン化は、-NH3 +基とRoxとの間の静電気的反発力によって、正荷電種Roxがナノポアの中へ侵入することを防ぐことができる。したがって、RoxからRredへの還元反応の速度を、Roxの輸送速度を調節することによって調節する。
溶液のpHをモニタリングする方法もまた提供する。そのような方法は、pH指示種としての荷電種を含有する試料溶液を提供する工程；ナノポアの内部表面が構成物によって修飾されて、それにより、溶液のpH値に依存してポア開口部における電荷密度が変化する、ISTEを含むガラスナノポア電極を提供する工程；ナノポア電極に溶液を接触させて、それにより、ナノポアの外部表面を溶液に浸漬し、そしてナノポアを溶液で満たす工程；溶液とISTEとの間に適切な電圧を印加する工程；ナノポアの電気伝導率をモニタリングする工程；及び、電気伝導率を解析して、溶液のpHを決定する工程；を含む。
ナノポアの内部表面に結合した機能性構成物への分析物の結合時におけるポアの伝導率の変化を測定することによって、ナノポアの内部表面に結合した機能性構成物を有する表面修飾ナノポア電極を、化学分子及び生体分子の検出のためのセンサーとして使用することができる。したがって、ナノポア電極を用いて分析物の選択的結合をモニタリングする方法を提供する。本方法は、対象とする分析物を含有する試料溶液を提供する工程；ナノポアの内部表面を機能性構成物で修飾して、それにより、対象とする分析物に機能性構成物が選択的に結合する、ISTEを含むナノポア電極を提供する工程；ナノポア電極に溶液を接触させて、それにより、ナノポアの外部表面を溶液に浸漬し、そしてナノポアを溶液で満たす工程；溶液とナノポア電極のISTEとの間に適切な電圧を印加する工程；ナノポアの電気伝導率をモニタリングする工程；及び、電気伝導率を解析し、対象とする分析物の濃度を決定する工程；を含む。一態様において、脂質二重層膜は、開口部を覆って沈着され、そして単一チャネル記録のための生体膜貫通イオンチャネルの支持体として使用される。例えば、対象とする分析物と相互作用するように操作又は化学修飾された、α-ヘモリジンといったタンパク質イオンチャネルは、二重層膜中へ挿入される。対象とする分析物のタンパク質イオンチャネルへの結合は、ナノポアを通るイオン性電流の変調をもたらす。ある態様において、適切な分子（例えば、抗体、一本鎖DNA）はナノポアの内部表面に結合し、タンパク質及びDNAを選択的に検出する。
ナノポア膜
厚さを有し、第一の面が第二の面の反対側にある第一の面及び第二の面を有し、そして膜の厚さを超えて膜を貫通するナノポアを有する膜もまた提供する。ナノポア膜を、図１（Ｃ）に例示する。
厚さを有し、第一の面が第二の面の反対側にある第一の面及び第二の面を有し、そして膜の厚さを超えて膜を貫通するナノポアを有する膜もまた提供する。ナノポア膜を、図１（Ｃ）に例示する。
本発明の様々な態様において、膜はSi、SiO2、Si3N4、石英、アルミナ、窒化物、金属、高分子、又は他の適した材料で作ることができる。膜は、純物質又は混合物であってよく、必要がある場合は、材料の表面を修飾する被覆を含む。特定の態様において、基材はソーダ石灰ガラス毛管又は鉛ガラス毛管である。膜の厚さは、典型的には、膜の最も小さい寸法である。膜は、典型的には、約10μmから数百マイクロメートルの範囲の厚さである。
膜は、一つより多いナノポア、又はナノポアのアレイを含むように構成することができる。各々のナノポアをそれぞれ、各々のチャンバーの中に封入することができ、そしてそのような各々のチャンバーを、適した支持構造上でアレイ構成に並べることができる。
様々な態様において、ナノポアは第一の開口部及び第二の開口部を有する。第一の開口部は膜の第一の面に対して開いており、そして第二の開口部は膜の第二の面に対して開いている。二つの開口部は、異なる大きさ又は形状であってよい。好ましくは、第一の開口部は、第二の開口部より小さい。具体的には、ナノポアは、第一の開口部が第二の開口部より小さい、切断された円錐形である。ナノポアの第一の開口部の半径は、好ましくは約2 nmから約500 nmの範囲、又はこれ以上である。第二の開口部の半径は、約1μmから25μmであってよい。ナノポアは、膜を貫通し、そして膜の第一の面及び第二の面を連通するため、膜の厚さが膜の全域で均一である場合、膜の厚さは、典型的にはナノポアの長さ又は深さである。ナノポアの長さは、好ましくはナノポアの第一の開口部の半径の20倍である。ナノポアの長さは、約20μmから約75μmの範囲であってよい。ナノポアの位置は、膜上のいずれかのあらかじめ定められた位置に決めることができる。
分析センサー測定における大きな利点を提供する、円錐形ナノポア電極及び円錐形ナノポア膜の特徴は、最も大きい物質輸送及び最も大きいポアのイオン性抵抗をポア開口部に局在化することである。この特徴は、（i）大部分の溶液からディスク状の開口部への分子及びイオンの収束的径方向流（convergent radial flux）及び（ii）開口部から電極への分子の発散的径方向流（divergent radial flux）の組合せの結果である。よって、大部分の溶液からポアへの分子及びイオンの流れは、開口部において最大値をとり、それはポアの底部における流れより大きい桁になるであろう。開口部におけるポアのこの形状に基づいた抵抗の局在化は、小さな開口部において小体積及び高抵抗の伝達領域を提供することによって円錐形ナノポアの適用を強化し、一方、残りの広領域のポアは伝達領域への低抵抗のアクセスを提供する。
本明細書中に記述される円錐ポア形状のさらなる利点は、円錐形ポアの深さがポアの開口部の半径、a、より約50倍大きい場合、円錐形ポアを通るイオン及び分子の流れが漸近的に一定値に達することである。円錐形ポアの抵抗もまた、円錐形ポアの深さがポアの開口部の半径、a、より約50倍大きい場合、漸近的に一定値に達する。
本明細書中に開示されるISTEを含む修飾ナノポア電極又は非修飾ナノポア電極を作製する工程、及び膜中にナノポアを残してISTEを取り除く工程を含む、修飾ナノポア膜又は非修飾ナノポア膜を作製する方法をさらに提供する。
発明を実施するための形態
ナノスケール規模の開口部を通る分子輸送を調べるための、構造的に単純でありそして信頼できるナノポア基盤を開発することは特に有用である。内蔵ISTEを有する表面修飾ナノポア電極、その作製及び使用を提供する。支持のない膜の中のポア（複数）に基づく分析測定とは対照的に、ガラスナノポア電極は、単一の開口部を通して溶液に対して開いている。この設計の利点には、製作の簡易性及び再現性；ポアを通る輸送（分子輸送又はイオン伝導率のどちらか）をモニタリングするための内蔵シグナル伝達要素（例えば、Pt電極）；及び、固体電極の機械的頑健性が含まれる。この装置は、携帯可能であり、製造が比較的安価であり、そして複数の分析物を同時に検出するためのナノポア電極センサーのアレイに簡単に拡張することができる。装置概念は、シリコン及び他のマイクロ電子工学的リトグラフによって作られた装置の中に組み込むこともできる。これらの分析器は、製薬産業、本土防衛、及び軍事利用のためのセンサーとして使用することができる。
ナノスケール規模の開口部を通る分子輸送を調べるための、構造的に単純でありそして信頼できるナノポア基盤を開発することは特に有用である。内蔵ISTEを有する表面修飾ナノポア電極、その作製及び使用を提供する。支持のない膜の中のポア（複数）に基づく分析測定とは対照的に、ガラスナノポア電極は、単一の開口部を通して溶液に対して開いている。この設計の利点には、製作の簡易性及び再現性；ポアを通る輸送（分子輸送又はイオン伝導率のどちらか）をモニタリングするための内蔵シグナル伝達要素（例えば、Pt電極）；及び、固体電極の機械的頑健性が含まれる。この装置は、携帯可能であり、製造が比較的安価であり、そして複数の分析物を同時に検出するためのナノポア電極センサーのアレイに簡単に拡張することができる。装置概念は、シリコン及び他のマイクロ電子工学的リトグラフによって作られた装置の中に組み込むこともできる。これらの分析器は、製薬産業、本土防衛、及び軍事利用のためのセンサーとして使用することができる。
以下の記述において、本発明のいくつかの態様を実例によって示す添付の図面を参照する。
図２（Ａ）はガラスナノポア電極を示し、そして図２（Ｂ）は表面修飾ガラスナノポア電極を示す。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）において、ナノポア電極100は、ガラス基材110、Ptワイヤ120、及びナノポア130を含む。ガラス基材110は、第一の表面112及び第二の表面124を有する。第一の表面112はまた、ナノポア130の外部表面とも呼ばれる。第一の表面112は第一の構成物116によって修飾される。第一の表面112に結合した第一の構成物116は第一の表面112の表面特性を変化させる。第一の構成物116の選択は、所望の表面特性に依存する。Ptワイヤ120は、第一の表面122及び第二の表面124を有する。第一の表面122は基材110の中に埋め込まれている。Ptワイヤ120は、第二の表面124を含む末端で基材110を通って伸長してもよい。任意で、Ptワイヤ120は、Ptワイヤ120の第二の表面124が基材110の第二の表面124を通って露出する限りは、基材110の第二の表面114通って伸長しない。ナノポア130は内部表面132、円形の開口部134、及び円形の底部122を含む。開口部134は、基材110の第一の表面112を通って開口する。ナノポア130の底部122はPtワイヤ120の第一の表面であることに注意すべきである。底部122はまた、ディスク、この場合はPtディスクとも呼ばれる。内部表面132は、第二の構成物136で修飾される。内部表面132に結合した第二の構成物136は、内部表面132の表面特性を変化させる。第二の構成物136の選択は、所望の表面特性に依存する。ナノポア130は、開口部134の半径が底部122の半径より小さい切断された円錐形のナノポアである。開口部134の半径は、典型的には、2nmから30μmの範囲である。図２においてdと表される深さは、典型的には10 nmから100μmの範囲である。
図２（Ａ）はガラスナノポア電極を示し、そして図２（Ｂ）は表面修飾ガラスナノポア電極を示す。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）において、ナノポア電極100は、ガラス基材110、Ptワイヤ120、及びナノポア130を含む。ガラス基材110は、第一の表面112及び第二の表面124を有する。第一の表面112はまた、ナノポア130の外部表面とも呼ばれる。第一の表面112は第一の構成物116によって修飾される。第一の表面112に結合した第一の構成物116は第一の表面112の表面特性を変化させる。第一の構成物116の選択は、所望の表面特性に依存する。Ptワイヤ120は、第一の表面122及び第二の表面124を有する。第一の表面122は基材110の中に埋め込まれている。Ptワイヤ120は、第二の表面124を含む末端で基材110を通って伸長してもよい。任意で、Ptワイヤ120は、Ptワイヤ120の第二の表面124が基材110の第二の表面124を通って露出する限りは、基材110の第二の表面114通って伸長しない。ナノポア130は内部表面132、円形の開口部134、及び円形の底部122を含む。開口部134は、基材110の第一の表面112を通って開口する。ナノポア130の底部122はPtワイヤ120の第一の表面であることに注意すべきである。底部122はまた、ディスク、この場合はPtディスクとも呼ばれる。内部表面132は、第二の構成物136で修飾される。内部表面132に結合した第二の構成物136は、内部表面132の表面特性を変化させる。第二の構成物136の選択は、所望の表面特性に依存する。ナノポア130は、開口部134の半径が底部122の半径より小さい切断された円錐形のナノポアである。開口部134の半径は、典型的には、2nmから30μmの範囲である。図２においてdと表される深さは、典型的には10 nmから100μmの範囲である。
図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示される、切断された円錐形のナノポア電極の形状が、さらに図２（Ｃ）に図示される。ナノポア130は、次の四つのパラメータのいずれか三つによって特徴づけることができる：ポアの深さ、d、ポアの底部におけるPtディスクの半径（例えば、図２（Ａ）の底部122）、ap、開口部の半径、a、及び半円錐角（half-cone angle）、θ。角度θは、ガラスの中に封じ込められる前のエッチングされたPtワイヤの円錐角によって決定され、その円錐角は、Zhang et al, Anal. Chem. 2004, 76, 6229-6238中に記載されているように、1°以内まで光学顕微鏡によって簡単に測定される。開口部の半径、a、はPtのエッチングの前の露出したPtディスク（例えば、図１のPtディスク）の半径と等しい。
図３は、薄いガラス膜中の切断された円錐形のナノポアの断面図である。図３において、ナノポア装置100は、ガラス毛管110、及びナノポア120を含む。ガラス膜130はガラス毛管110の不可分の一部である。ガラス膜130は、第一の面140及び第二の面150を有する。ナノポア120は、ガラス膜130を通って伸長し、それによって、ガラス膜130の第一の面及び第二の面を連通するチャネルを形成する。ナノポア120は、ガラス膜130の第一の面に面している第一の開口部160、及びガラス膜130の第二の面に面している第二の開口部170を有する。第一の開口部160は第二の開口部170より小さい。典型的には、第一の開口部160は2 nmから500 nmの範囲であり、そして第二の開口部は5μmから25μmの範囲である。ガラス膜130の厚さは、そしてこの場合ナノポア120の長さもまた、約20〜75μmである。
ガラスナノポア膜を作製する一般的手順を図４に概略的に示す。ナノディスク電極、ナノポア電極及びナノポア膜の作製は、本明細書中の実施例を用いてさらに例示される。ナノポア膜の作製には、典型的に四つの主要な工程が関わる：円錐形の先端を有するISTEを作製する工程、ガラス基材の中にISTEの先端を封じ込める工程、先端が露出するまで基材を研磨してナノディスク電極を製造する工程、ISTEの先端をエッチングしてナノポア電極を製造する工程、及びISTEを取り除いてナノポア膜を製造する工程。図４（a）において、電極280は、Ag塗装を介してWロッド260と結合したPtワイヤ210を含む。Ptワイヤ210は電気化学的にエッチングされて、尖った先端が製造される。図４（b）において、尖ったPt先端210を有する電極280は、ガラス毛管220の内部に挿入される。図４（c）において、ガラス毛管220は封じ込められて、Pt先端210が埋め込まれた底壁230を製造する。図４（d）において、毛管220の封じ込められた底壁230は、Ptディスク240が露出するまで研磨される。図４（e）において、露出したPtディスク240は電気化学的にエッチングされ、ナノポアを製造する。図４（f）において、Ptワイヤは、Wロッド（Ptに接続される）を静かに抜くことによって、又はPtワイヤの電気化学的若しくは化学的エッチングによって、除去される。
ナノポアの開口部（例えば、図２（Ａ）に示される開口部134、又は図３の第一の開口部160）の大きさは、ISTEの露出したディスクの大きさを調節することによって調節することができる。研磨を助けるために、電気的導通回路を用いて、研磨の間の金属の露出を知らせることができる。研磨の間にISTEのディスクが最初に露出したちょうどその瞬間に、使用者に知らせるように回路を設計することができる。これを達成するための一つの方法は、基材の中に封じ込められたISTEと電解液で湿らされた研磨布などの研磨手段との間の電気的導通を解析すること、例えば研磨の間におけるISTEの先端上部にある基材の厚さの関数として電気抵抗を解析することである。ISTE、基材、及び研磨布の合成抵抗は、本明細書において研磨回路の抵抗と呼ばれる。基材の中に埋め込まれたISTEと研磨布と接触した基材表面との間の全抵抗は、有限要素シミュレーションを用いてコンピュータ計算され、それによって研磨の間に露出したディスクの大きさの推定を可能にする。有限要素シミュレーションを用いてディスクの大きさの調節を補助する方法は、添付の実施例においてさらに示される。
図５は、ナノポアの大きさを調節するために用いることができる電気的フィードバック回路を示す。図５（c）に示されるように、電極410は、伸長したWロッドを有するPt先端を含み、そのPt先端はガラス毛管420のなかに封じ込められている。ガラス毛管420は初めに、Pt先端上部に約0.5μmのガラスが残るまで、400、800、1200グリットの紙やすりで磨かれる。次いで、ガラス毛管420は、例えば0.1 M KClといった電解質を含有する磨き粉の水性スラリーで湿らせたフェルト研磨紙上で研磨される。MOSFET“オン／オフ”切換回路に基づいてもよい装置440を用いた電気的導通測定は、毛管の上端から伸長するWロッドと湿った研磨布との間のDC抵抗が1〜2GΩ未満に下がった場合に行われ、Pt先端の露出を知らせる。研磨はこの時点で直ちに止められる。1〜2 GΩの抵抗は実験的に決定されており、2〜30 nmの範囲と電気化学的に決定された半径を有する露出したPtディスク（例えば、図４のPtディスク240）をもたらす。シグナル抵抗及び回路を調節して、様々な半径の露出したPtディスクを製造し、そしてそれによって、開口部の大きさの調節を提供することができる。
ナノポア電極の外部表面及び内部表面の化学修飾の例を図６に示す。図６（a）において、円錐形先端を有するPtワイヤ512は、ガラス基材510の中に封じ込められる。図６（b）に示されるように、表面514が研磨され、外部表面516が製造され、そしてPtディスク518を露出する。外部表面516は、末端に“不活性”官能基を有するアルカンシランの共有結合によって、まず保護される。この単層の不活性末端の目的は、外部表面に対する分子及び分析物の結合又は特異的相互作用を防ぐためである。露出したPtディスク518は、電気化学的にエッチングされてポア520が製造され、その結果ポア底部にPtディスク522をもたらす。Ptディスク522は、電気化学的測定又は伝導率測定のための電気的シグナル伝達機構として機能する。次いで、ガラスポアの内部表面524は修飾され、結合部位又は外部刺激に反応する化学官能基を導入する。例えば、-NH2で終わるシランは、内部表面524と結合することができ、そのアミン基は分析物特異的なリガンドとのカップリングのための使いやすい開始点である。
本発明のいくつかの態様が、Zhang, Anal Chem., 2004, Zhang, Anal Chem., 2006; Zhang, 7PC, 2006, Wang, JACS 2006, White, Langmuir, 2006に開示されている。
本発明を、以下に例示する実施例によってさらに記述する。
本発明を、以下に例示する実施例によってさらに記述する。
実施例
ガラスナノディスク電極、ガラスナノポア電極、及びガラスナノポア膜の製作
Au先端及びPt先端の電気化学的エッチング
2 cmの長さのPtワイヤ又はAuワイヤを、Ag導電性エポキシ（DuPont）を用いてWロッドと接続する。Pt/W又はAu/Wの組合せを、15分間120℃のオーブンで熱してAgエポキシを乾燥させる。Auワイヤ又はPtワイヤの末端を、他で報告された標準的方法（(a) Melmed, A. J. J. Vac. Sci. Technol. B 1991, 9, 601. (b) Melmed, A. J.; Carroll, J. J. J. Vac. Sci. Technol. A 1984, 2, 1388）に従い、6 M NaCN/0.1 M NaOH溶液中で電気化学的にエッチングし、先を尖らせる。簡潔には、100〜300 HzのAC電圧（約4 Vの振幅）を、Ptワイヤ又はAuワイヤと広領域のPt電極との間に、Agilent 33220A関数／任意波形発生器を用いて印加する。電気化学的エッチングの間に、泡が金属／溶液の界面において形成された；その泡が止まった時に、直ちに印加された電圧を除去し、そして尖ったワイヤをH2Oで洗浄する。Pt先端を、カスタム波形発生器を用いて、本明細書中の以下に記述するように、さらに尖らせた。
ガラスナノディスク電極、ガラスナノポア電極、及びガラスナノポア膜の製作
Au先端及びPt先端の電気化学的エッチング
2 cmの長さのPtワイヤ又はAuワイヤを、Ag導電性エポキシ（DuPont）を用いてWロッドと接続する。Pt/W又はAu/Wの組合せを、15分間120℃のオーブンで熱してAgエポキシを乾燥させる。Auワイヤ又はPtワイヤの末端を、他で報告された標準的方法（(a) Melmed, A. J. J. Vac. Sci. Technol. B 1991, 9, 601. (b) Melmed, A. J.; Carroll, J. J. J. Vac. Sci. Technol. A 1984, 2, 1388）に従い、6 M NaCN/0.1 M NaOH溶液中で電気化学的にエッチングし、先を尖らせる。簡潔には、100〜300 HzのAC電圧（約4 Vの振幅）を、Ptワイヤ又はAuワイヤと広領域のPt電極との間に、Agilent 33220A関数／任意波形発生器を用いて印加する。電気化学的エッチングの間に、泡が金属／溶液の界面において形成された；その泡が止まった時に、直ちに印加された電圧を除去し、そして尖ったワイヤをH2Oで洗浄する。Pt先端を、カスタム波形発生器を用いて、本明細書中の以下に記述するように、さらに尖らせた。
図７は、6 M NaCN/0.1 M NaOH中でのエッチング後の、Pt先端及びAu先端の電子顕微鏡写真を示す。同じような条件が用いられているが（例えば、約180 Hz、Ptに3.6 V、Auに4.5 V）、Auワイヤのエッチングは、Pt（約30 nm）より有意に小さい曲率半径（＜10 nm）を有する先端をもたらす。
系統的研究によって、いくつかの重要な相関関係が明らかにされた。第一に、より大きい直径の金属ワイヤは、先端においてより高い直径円錐角（diameter cone-angle）を生じる。例えば、直径25μmのPtワイヤをエッチングすると、8.5±1°の半円錐角を有する先端ができ、一方、直径100μmのPtワイヤをエッチングすると14±1°の半円錐角を有する先端ができる。ガラスナノポアの輸送抵抗はこのパラメータに影響を受けるので、先端の円錐角を調節できる能力は実用的である。第二に、エッチングされた金属先端の表面の粗さは、特にPtにおいて、印加されたAC電圧の周波数に非常に依存する。より高い周波数によって、有意により滑らかな表面ができる。しかし、エッチングの電圧の周波数は、鋭い先端を製造するためには1000 Hz未満が好ましい。実験的に、110〜300 Hzの範囲の周波数によって、ナノディスクを製造するために十分な先端ができる。
Pt先端の電気化学的尖鋭化
上述のようにして尖らせたPt先端を用いて、30から100 nmの間の半径を有するナノディスク電極を作ることができる。さらに小さいPt電極を作るために、STMで使用するPtを尖らせるためのLibioulleらによって記述された手順（Libioulle, L.; Houbion, Y.; Gilles, J.-M. Rev. Sci. Instrum. 1995, 66, 97）を、2、3の改良を加えて採用した。図８Ａは、この目的のために用いるU字型の電気化学的セルを示す。このセルは、左側に大きな容器を有し、これを用いて、右にある水平ガラス管における空気-溶液（0.1 M H2SO4）の界面の位置を定める。エッチングしたPt先端の末端は、水平ガラス管内の0.1 M H2SO4のメニスカスに直角に交差して挿入される。次いで、パルス化電圧の波形を印加して先端をさらに電気化学的に尖らせる。4 kHz、15 V、16μsのパルス波形を自家製の波形発生器で1 sの間印加し、その後、-1.1 VのDC電位を10 sの間印加して、あらゆるPtOxを除去した。時間の関数としての電圧プログラムを図８Ｂに示す。このプログラムを続けて三回繰り返し、電極製作のための十分に尖った先端を得た。
上述のようにして尖らせたPt先端を用いて、30から100 nmの間の半径を有するナノディスク電極を作ることができる。さらに小さいPt電極を作るために、STMで使用するPtを尖らせるためのLibioulleらによって記述された手順（Libioulle, L.; Houbion, Y.; Gilles, J.-M. Rev. Sci. Instrum. 1995, 66, 97）を、2、3の改良を加えて採用した。図８Ａは、この目的のために用いるU字型の電気化学的セルを示す。このセルは、左側に大きな容器を有し、これを用いて、右にある水平ガラス管における空気-溶液（0.1 M H2SO4）の界面の位置を定める。エッチングしたPt先端の末端は、水平ガラス管内の0.1 M H2SO4のメニスカスに直角に交差して挿入される。次いで、パルス化電圧の波形を印加して先端をさらに電気化学的に尖らせる。4 kHz、15 V、16μsのパルス波形を自家製の波形発生器で1 sの間印加し、その後、-1.1 VのDC電位を10 sの間印加して、あらゆるPtOxを除去した。時間の関数としての電圧プログラムを図８Ｂに示す。このプログラムを続けて三回繰り返し、電極製作のための十分に尖った先端を得た。
図９は、本明細書の上記に概説した手順によって尖らせた典型的なPt先端のTEM画像を示す。先端の曲率半径はおよそ2 nmであり、そして表面には酸化物沈着がみられない。TEMの特徴解析から、図８Ｂのプログラムを用いて加工されたPt先端の大部分は、＜10 nmの半径を有することが示される。
ガラスの中へのPt先端及びAu先端の封じ込め
Ptワイヤ又はAuワイヤの尖らせた末端をガラス毛管の中へ挿入し、先端とガラス管の末端とに約3 mmの間を置く。次いで、H2-O2炎の中で毛管をゆっくり柔らかくすることによって、このワイヤをガラス管の中に封じ込める。光学顕微鏡を用いて、この工程の間の封じ込めの質を頻繁に確認する（例えば、金属先端の近くに気泡が捕捉されないようにする）。許容できる封じ込めを得られた後、Wロッドの上端をエポキシ（Dexter）でガラス毛管に固定する。細かい紙やすり又はエミリークロス（emery cloth）を用いて、ガラスの大きい部分を取り除く大まかな研磨を仕上げる（例えば、金属先端と毛管の外部の縁との間に約100μmを残すまで）。Ptディスク又はAuディスクを露出する最終的な研磨は、グリーンガラスプレート上に取り付けられた、湿らせたBuehlerのMICROCLOTHTMの研磨パッドを用い、本明細書の以下に記述する電気的導通テスターを用いて実行する。
Ptワイヤ又はAuワイヤの尖らせた末端をガラス毛管の中へ挿入し、先端とガラス管の末端とに約3 mmの間を置く。次いで、H2-O2炎の中で毛管をゆっくり柔らかくすることによって、このワイヤをガラス管の中に封じ込める。光学顕微鏡を用いて、この工程の間の封じ込めの質を頻繁に確認する（例えば、金属先端の近くに気泡が捕捉されないようにする）。許容できる封じ込めを得られた後、Wロッドの上端をエポキシ（Dexter）でガラス毛管に固定する。細かい紙やすり又はエミリークロス（emery cloth）を用いて、ガラスの大きい部分を取り除く大まかな研磨を仕上げる（例えば、金属先端と毛管の外部の縁との間に約100μmを残すまで）。Ptディスク又はAuディスクを露出する最終的な研磨は、グリーンガラスプレート上に取り付けられた、湿らせたBuehlerのMICROCLOTHTMの研磨パッドを用い、本明細書の以下に記述する電気的導通テスターを用いて実行する。
非常に尖ったPt先端及びAu先端を壊さないで、ガラス毛管の中に金属を封じ込めるために、二つの基礎条件を満たさなければならない。第一に、ガラスの熱膨張係数を金属の熱膨張係数と等しいか又はより大きくし、冷却時に割れ目ができないようにすべきである。第二に、先端の形状の変化を防ぐために、封じ込めの温度は金属の融点よりはるかに低くしなければならない。したがって、ガラスの軟化温度は、金属の融点よりかなり低くするべきである。
表１は、この研究で用いる金属及びガラスの融点及び線膨張係数を一覧にする。Ptの融点（約1770℃）はソーダ石灰ガラス又はPbドーピングガラスのどちらの軟化温度より約1000℃高く、そして、Pt及び両タイプのガラスの膨張係数は同程度である。これらの条件は、Ptがどちらの毛管の中への封じ込めにもよく適していることを示す。Auは、ソーダ石灰ガラス又は鉛ガラスのどちらよりもかなり高い熱膨張係数、及びガラスの軟化温度より300〜400℃だけ高い融点（約1060℃）を有するが、我々はAuをPbドーピングガラス毛管の中にうまく封じ込めた（ボルタンメトリー反応から判断された）。
ガラス電極の研磨
手磨きのために、高入力インピーダンスのMOSFETに基づく電気的導通回路を用いて、研磨の間の金属の露出を知らせる。ガラスの中に封じ込められたPtワイヤ又はAuワイヤとフェルト研磨布（KCl溶液で湿らされ、そして金属クリップで外部回路と接続される）との間の電気的導通を測定する。この戦略の実施の成功は回路の設計によって決まり、それによって使用者は、研磨の間に金属が最初に露出したちょうどその瞬間にそれを知らされる。これを達成する一つの方法は、研磨の間に、先端上部のガラスの厚さの関数としての電気抵抗の解析を利用することである。Ptワイヤ、ガラス、及び電解液で湿らせた研磨布の合成抵抗を、ここでは研磨回路の抵抗と呼ぶ。
手磨きのために、高入力インピーダンスのMOSFETに基づく電気的導通回路を用いて、研磨の間の金属の露出を知らせる。ガラスの中に封じ込められたPtワイヤ又はAuワイヤとフェルト研磨布（KCl溶液で湿らされ、そして金属クリップで外部回路と接続される）との間の電気的導通を測定する。この戦略の実施の成功は回路の設計によって決まり、それによって使用者は、研磨の間に金属が最初に露出したちょうどその瞬間にそれを知らされる。これを達成する一つの方法は、研磨の間に、先端上部のガラスの厚さの関数としての電気抵抗の解析を利用することである。Ptワイヤ、ガラス、及び電解液で湿らせた研磨布の合成抵抗を、ここでは研磨回路の抵抗と呼ぶ。
ガラスの中に埋め込まれたPtワイヤと研磨布と接触している平らなガラス表面との間の全抵抗は、有限要素シミュレーションを用いてコンピュータ計算される。ガラスの電気伝導率を10-10（オーム・m）-1に定め、これはソーダ石灰ガラスの典型値であり（表１）、そしてPtより約17桁小さい。Ptの露出の前は、金属と研磨布との間のガラス層が非常に主要な抵抗である（溶液の抵抗は無視できる）。先端の露出時に、ナノディスク／電解液の界面における広がり抵抗が調節されるようになり、そして等式：
を用いてコンピュータ計算されるようになり（Bard, A. J.; Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications; 2nd Edition, 2001）、ここで、κは研磨布の0.02 M KCl溶液の伝導率（κは約0.14（オーム m）-1）であり、そしてaは金属ディスクの半径である。他のKCl濃度及び様々な電解液を用いて、電気的フィードバック回路を用いた研磨をすることができる。電解液における電圧の降下は非常に短い距離（約10a）にわたって起こるので、研磨布上の電解液層の形状を正確にモデリングする必要はない。
図１０は、研磨深度L（nm）の関数としての研磨回路抵抗の対数プロット（log R（Ω））を示す。L = 0の値は、金属先端の末端と並んだガラス表面に対応する。よって、Lの負の値は、先端が露出する前のガラス層の厚さに対応し、一方、正の値は、先端の露出後に除去されたガラスの厚さに対応する。幾何解析を用いて、Lの値を露出したディスクの半径に変換することができる（a；選択されたaの値を図１０に示す）。よって、原理的に、研磨回路抵抗の測定により、研磨の間の金属ディスクの大きさを推定することが可能になる。
図１０は、研磨深度L（nm）の関数としての研磨回路抵抗の対数プロット（log R（Ω））を示す。L = 0の値は、金属先端の末端と並んだガラス表面に対応する。よって、Lの負の値は、先端が露出する前のガラス層の厚さに対応し、一方、正の値は、先端の露出後に除去されたガラスの厚さに対応する。幾何解析を用いて、Lの値を露出したディスクの半径に変換することができる（a；選択されたaの値を図１０に示す）。よって、原理的に、研磨回路抵抗の測定により、研磨の間の金属ディスクの大きさを推定することが可能になる。
リアルタイムのフィードバックを得るために、DC導通テスターとしてのMOSFET回路を用いて、研磨の間に金属先端が露出する瞬間を決定する。図１０Ａのシミュレーションから、我々は、約1018Ω（測定不可）から約109ΩまでのRの減少として導通を定義することができる。注目すべき経過はa = 0.1 nmにおけるR = 8.9 GΩ、a = 0.2 nmのときの4.5 GΩ、及びa = 0.5 nmでの1.8 GΩである。本明細書の以下に記述する回路においては、R = 約2 GΩの場合に電気的導通を知らせ、これはaが約0.5 nmの金属ナノディスクに相当する（円状ディスクにおける0.15 nmの約10個の金属原子を露出することがこの基準に合致する）。図１０Ｂは、この方法によって製造されたガラス表面において露出されたPtディスクのSEMを示す。
導通テスターの回路図を図１１Ａに示す。約2 GΩより小さい抵抗は、音声信号及び／又はLEDの点灯によって示される。より感度の高いテスターを開発することができるが、そのような高感度装置は、テストリード（test lead）の表面汚染を介した、そして先端が露出する直前のナノメートルの薄いガラス膜を通じた伝導又はトンネル現象を介した非常に弱い漏洩電流を原因とする誤った読み取りに影響を受けやすい。
知らせる機構は、半導体警報器（solid-state beeper）及びLEDから成り、それらは共に、+9 V電池の端子とVL0300L MOSFETトランジスタのドレインリード（drain lead）との間に接続される。このトランジスタのソースリード（source lead）は、電池の負端子と接続される。テストリードはトランジスタが回路のスイッチとして働くように接続され；約2GΩ未満の抵抗によってテストリードの間に完全な回路が作られた場合、警報器が鳴り、そしてLEDが点灯することになる。これは、一方のテストリードを+9 V電池の端子へ直接接続し、そして他方を負の電池端子に直列に配線された500 MΩの抵抗器を介してトランジスタゲートへ接続することによって達成される。テストリードを通る十分な導通がある場合、500 MΩの抵抗器を越える際の1.5 Vの降下がトランジスタを作動させることになる。エンハンスメントモードのFETは通常オフであり、したがって警報器及びLEDは通常オフである。しかし、FETのゲートにおける約1.5 Vがトランジスタを作動させ、それによって警報器及びLEDを作動させる。
実施においては、一方のテストリードを、ガラス毛管の中に埋め込まれたPtワイヤ又はAuワイヤと接するWロッドと接続し、そしてもう一方のリードを研磨布の溶液中に浸す。ガラスが十分に研磨されてちょうどぎりぎりPt/Au先端が露出したとき、十分な電流がプローブを通って流れ、500 MΩゲート抵抗器を越える際の電圧降下を引き起こし、入れ替わりにトランジスタを作動させる。
金属の最初の露出時に、断続的な音声シグナル又はLEDシグナルが生じるが、これはおそらく容量静電流のためである。さらに数秒の研磨によって、H2Oの酸化若しくは還元、又は研磨布を湿らせている電解液の他の酸化還元活性成分（Cl-、O2）がおそらく関連する連続的なシグナルが生じる。
図１１Ａの研磨回路は、図１１Ｂに示すように500 MWの抵抗器を様々な抵抗器RGと置換することによって、変えることができる。これにより、図１０Ａの計算及びRGの値によって決定された大きさのディスク電極が製造されたという、研磨器への電気的シグナル、光学的シグナル又は音声シグナルを生ずる。研磨は、LEDシグナル又は音声シグナルのどちらかによって所望のディスクサイズが示された時に、直ちに止められる。
露出した金属ディスクの半径は、いくつかの手段によって決定することができ、それらには、定常状態ボルタンメトリー、原子間力顕微鏡、（金属の除去後のポアの）伝導率測定、及び電子顕微鏡が含まれる。ナノディスクの半径を定常状態ボルタンメトリーによって測定し、これは、非常に最もおおまかな方法である。代表的な試料もまた追加の方法によって特徴解析して、ボルタンメトリー測定との相関を確立し、相互に妥当性を確認する。ボルタンメトリーにおいて、ナノディスクの半径は、定常状態限界電流idを用いて、可溶性の酸化還元種の酸化について式
を通して評価され（Saito, Y. Rev. Polarog. (Japan) 1968, 15, 177.）、ここで、nは電子の化学量論、Fはファラデー定数、そしてD及びC*はそれぞれ酸化還元分子の拡散係数及びバルク濃度である。aの値は、アセトニトリル（補助電解質0.2 M TBAPF6）中の5.0 mMフェロセン（Fc、D = 1×105 cm2 s-1）の酸化におけるidの測定によって決定された。
図１２は、先端の露出前（Ａ）、導通テスターが断続的警報で露出を知らせた直後（Ｂ）、及び約20 sにわたってエタノール中でナノディスクを超音波処理した後（Ｃ）の5.0 mM Fc/0.2 M TBAPF6溶液中のPtディスク電極のボルタンメトリー反応を示す。金属先端の露出前に、弱い充電電流（約0.5 pA、図１２Ａ）があり、これは、少なくとも部分的に、機器の浮遊容量に対応する。このバックグラウンド容量は、金属ナノディスクが露出したか否かに関わらず観測され、そして毛管及び金属ワイヤが溶液からすっかり取り出されたときであっても見られる。図１２Ｂのボルタンメトリー曲線は、E0'（熱力学的酸化還元電位）付近の指数関数的立ち上がりに近い電流の増加を示す。この電流は、拡散律速のプラトーには達さず、そして、（1）Pt先端上部に残る非常に薄いガラス層（＜1 nm）を通じた伝導若しくはトンネル現象、又は（2）ナノメートル未満の半径のナノディスクにおける速度論的に調節されたFcの酸化の、いずれかの組合せをから生ずる可能性がある。図１２Ｃは、電極の短い超音波処理（5 s）後に、明確な拡散律速の電流プラトーを示すボルタンメトリー反応を得ることを示す。調節されていないやり方ではあるが、超音波処理によって、電極表面に残されたあらゆるガラスが除去されると考えられる。超音波処理後のボルタンメトリー反応は約4 nmの半径に相当する。
断続的警報の段階（持続的音声警報を得るまでのもの）を一時的に越えた連続研磨は、明確なボルタンメトリーを与える電極を生ずる。二つの異なるPt電極についての電解液のみ及び5.0 mM Fc溶液におけるi-V曲線を図１３に示す。これらの電極は、ソーダ石灰ガラス（a = 11 nm、図１３Ａ）及びPbドーピングガラス（a = 15 nm、図１３Ｂ）を用いて作製された。図１４Ａ及び図１４Ｂのように、尖ったAuワイヤを用いて作製したガラスに包まれたナノディスクについて、同様のボルタンメトリー反応が得られた。図１１の回路を用いて、我々は、2から25μmの間の範囲の半径を有するPtナノディスク及びAuナノディスクを規定通りに作製することができ、その大部分がほぼ理想的なボルタンメトリーの挙動（本明細書中に示された実施例と同様）を示すことを見いだす。
図１３の詳しい試験によって、ソーダ石灰ガラス毛管及びPbドーピングガラス毛管を用いて作製された二つのPt電極のボルタンメトリー反応の違いが明らかにされる。ソーダ石灰ガラスに包まれたPt電極のi-V反応は、Pbドーピングガラスの線型バックグラウンド傾き（linear background slope）（測定不可能なほど小さい）より有意に大きい線型バックグラウンド傾き（75 pA/V）を示す。この傾きは、ガラス／金属の封じ込めの質が悪いためではなく、その代わり、大部分のソーダ石灰ガラス内のNa+の定常状態流（steady-state flux）を反映する。この仮定は、Ptワイヤがソーダ石灰ガラスの中に完全に封じ込められた状態（研磨無し）における実験によって支持される。露出前を除く、研磨の間の任意の時点におけるこれらの電極のi-V曲線の傾きは、区別できない。ガラス内部のNa+の輸送による導通過程は、Fc酸化におけるボルタンメトリー反応と、重ね合わされるようである。例えば、図１３Ａにおいて、封じ込められたPtにおけるi-V曲線は、Pbドーピングガラスの中に封じ込められた電極についての図１３Ｂにおける対応するi-V曲線より大きいヒステリシスを示す。この影響は、データ記録に用いる高い電流感度によって容易に検出される。Pbドーピング毛管を用いた場合の、抵抗のバックグラウンドの再現可能な欠如は、ソーダ石灰ガラスと比べてPbドーピングガラスのイオン伝導率がはるかに低いことと一致する（表１参照）。
既に述べたように、電子顕微鏡を用いて、我々のPtナノディスク電極（及び、以下のようにナノディスクから作られたナノポア電極）の半径を測定した。一般に、我々はSEMで決定した半径とボルタンメトリーの結果との間によい一致を見ている。ナノディスク電極から作製されたナノポア電極開口部のAFM画像及び伝導率測定は、ボルタンメトリー測定由来の値と非常によく一致する半径をもたらす。
図１５は、図１１Ｂの回路における抵抗RGを調節することによって事前に選択した値に対する測定されたPtディスクの半径のプロットを示す。このデータにより、図１０Ａに示す計算と併せて、図１１Ｂの回路を用いてディスクの大きさを調節できることが示される。
ガラスナノポア電極
ガラスナノポア電極（図１Ｂ参照）は、60 Hzの周波数で約5 Vの振幅のAC電圧を用いて、20％CaCl2溶液中で、Ptナノディスク電極又はAuナノディスク電極をエッチングすることによって作られる。エッチングの間にPtを取り除いて、円錐形のポアを作り、エッチング時間を変えることによってその深さを調節する。ナノディスク電極に関するPtナノポア電極の動作の本質的違いは、拡散律速電流の顕著な減少である。この減少は、ポアのより大きい物質輸送抵抗の結果であり、したがってポアの大きさに対応する。図１６は、5.0 mM Fc中における、半径86 nmのPtディスク電極及び対応するガラスナノポア電極のボルタンメトリー反応を示す。この特定のナノポアは、約250 nmの深さまでPtをエッチングすることにより生じ、これは、ポアの深さと開口部の半径との間の比（d/a）に対する律速電流の依存性から決まる（Bo Zhang, Yanhui Zhang, and Henry S. White, The Steady-State Voltammetric Response of the Nanopore Electrode, Anal. Chem. 78, 477-483 (2006)）。
ガラスナノポア電極（図１Ｂ参照）は、60 Hzの周波数で約5 Vの振幅のAC電圧を用いて、20％CaCl2溶液中で、Ptナノディスク電極又はAuナノディスク電極をエッチングすることによって作られる。エッチングの間にPtを取り除いて、円錐形のポアを作り、エッチング時間を変えることによってその深さを調節する。ナノディスク電極に関するPtナノポア電極の動作の本質的違いは、拡散律速電流の顕著な減少である。この減少は、ポアのより大きい物質輸送抵抗の結果であり、したがってポアの大きさに対応する。図１６は、5.0 mM Fc中における、半径86 nmのPtディスク電極及び対応するガラスナノポア電極のボルタンメトリー反応を示す。この特定のナノポアは、約250 nmの深さまでPtをエッチングすることにより生じ、これは、ポアの深さと開口部の半径との間の比（d/a）に対する律速電流の依存性から決まる（Bo Zhang, Yanhui Zhang, and Henry S. White, The Steady-State Voltammetric Response of the Nanopore Electrode, Anal. Chem. 78, 477-483 (2006)）。
図１６の、ポアの形成時の律速電流における約65％の減少は、公知の数値シミュレーションと一致する（Anal. Chem. 78, 477-483 (2006)）。図１７は、（Ａ）ナノポア電極を作製するために用いるPtナノディスク電極のボルタンメトリー反応、及び(Ｂ）上記で概説した手順を用いて、このナノディスク電極をエッチングすることにより生じるナノポア電極の開口部のAFM画像である。Ptナノディスクの半径は、拡散律速電流の測定から23 nmと決定される（図１５Ａ）。23 nmのスケールバーをAFM画像上に示し、ボルタンメトリー測定がAFM画像と非常によく一致することを図示する。この観測は、より大きいポアのSEM実験とも一致し、そこにおいてナノポアの大きさ及び対応するナノディスク電極の大きさは類似している。これらの結果は、ボルタンメトリー反応が金属ディスクの半径の正確な値をもたらし、そしてCaCl2中のPtの電気化学的エッチングは、生じるナノポアの壁から多量のガラスを除去しないことを示す。
ガラスナノポア膜
封じ込められた金属ワイヤを、エッチング工程及び機械的工程の組合せによってガラスから完全に取り除き、個別の円錐形ナノポアを含むガラス膜を作ることができる。特殊な手順を用いて、Ptワイヤの尖った末端の非常に短い長さ（25〜50 μm）の封じ込めを達成する。まず、先端をガラス毛管の中央に置いてガラス壁に接触しないようにしながら、ガラスをH2炎で熱する。初めに、Ptをガラス毛管の末端から＞0.5 cmの位置に置きながら、毛管の末端を熱する。毛管が柔らかくなって崩れるので、内部表面は非常に平らになる。この時点で、ガラス毛管を炎から取り出し、そして光学顕微鏡でこの進展をモニタリングすることにより、ガラス表面への物理的接触を防ぐように注意して、Pt先端を毛管の封じられた末端に向かってできるだけ近づける。次いで、毛管を、炎のより低くより冷たい部分へ戻し、内部の平らな表面を継続的に目視しながらガラスを柔らかくし続ける。ガラスを炎の中で柔らかくし続けていると、ガラスは最終的に尖ったPt先端と接触する。この接触を、接触点におけるスポットの急速な出現により、リアルタイムで目で（よく練習して）観測する。末端にPt先端を封じ込めた毛管を直ちに炎から取り出し、冷やす。
封じ込められた金属ワイヤを、エッチング工程及び機械的工程の組合せによってガラスから完全に取り除き、個別の円錐形ナノポアを含むガラス膜を作ることができる。特殊な手順を用いて、Ptワイヤの尖った末端の非常に短い長さ（25〜50 μm）の封じ込めを達成する。まず、先端をガラス毛管の中央に置いてガラス壁に接触しないようにしながら、ガラスをH2炎で熱する。初めに、Ptをガラス毛管の末端から＞0.5 cmの位置に置きながら、毛管の末端を熱する。毛管が柔らかくなって崩れるので、内部表面は非常に平らになる。この時点で、ガラス毛管を炎から取り出し、そして光学顕微鏡でこの進展をモニタリングすることにより、ガラス表面への物理的接触を防ぐように注意して、Pt先端を毛管の封じられた末端に向かってできるだけ近づける。次いで、毛管を、炎のより低くより冷たい部分へ戻し、内部の平らな表面を継続的に目視しながらガラスを柔らかくし続ける。ガラスを炎の中で柔らかくし続けていると、ガラスは最終的に尖ったPt先端と接触する。この接触を、接触点におけるスポットの急速な出現により、リアルタイムで目で（よく練習して）観測する。末端にPt先端を封じ込めた毛管を直ちに炎から取り出し、冷やす。
毛管を上述のように図１０の電気回路を用いて研磨し、Ptナノディスクを作り、その大きさはこの中間の時点において特徴づけることができる。次いで、PtをCaCl2中で電気化学的にエッチングし、ガラスからできるだけ多くのPtワイヤを取り除く。残ったPtは、毛管内部のPtに結合したWワイヤを静かにねじることによって、この時点でガラスから簡単に取り除くことができる。図１８は、（Ａ）ガラスに封じ込められたPt先端；（Ｂ）研磨されたPtナノディスク電極；（Ｃ）先端を取り除いた後のガラスナノポア膜；及び（Ｄ）寸法を示したガラスナノポア膜の概略図の、断面光学画像を示す。
ガラスナノポア膜の小さな開口部半径は、既知のイオン伝導率の溶液中で測定したポアの抵抗からコンピュータ計算することができる。ポアの抵抗は、膜の反対に位置する二つのAg/AgCl電極の間の電位を変えることによって記録される、抵抗性i-V曲線の傾きから得る。膜の抵抗Rpと小さな開口部の半径aとの間の関係は：
によって与えられ（Ryan J. White, Bo Zhang, Susan Daniel, John Tang, Eric N. Ervin, Paul S. Cremer, and Henry S. White, "Ionic Conductivity of the Aqueous Layer Separating a Lipid Bilayer Membrane and a Glass Support," Langmuir, 22, 10777-10783 (2006)）、ここでRpは抵抗、κは溶液の伝導率、そしてθは半円錐角である。最後のθは、封じ込められる前のPtワイヤの半円錐角と等しく、光学顕微鏡によって測定される。
図１９Ｂは、0.2 M KClを含有する10 mM Ru(NH3)6Cl3溶液中のPtナノディスク電極のボルタンメトリー反応を示す。Ptディスクの半径は、拡散律速の定常状態電流から、32 nmであると計算される。図１９Ａは、様々な濃度のKCl溶液中の対応するガラスナノポア膜のボルタンメトリー反応を示す。1 M KClにおけるi-V反応は抵抗性であるとわかり、約31 nmの半径の小さな開口部に対応する傾きを有し、電気化学的反応から計算される値とよく一致する。低濃度のKCl中のi-V反応は、電流整流効果を示し、これは先を細くしたガラスナノピペットを通る電流についてのWeiらによって報告されたものと類似する（Wei, C.; Bard, A. J.; Feldberg, S. W. Anal. Chem. 1997, 69, 4627.）。円錐形ナノポアにおける電流整流はSiwyによって最近概説されている（Siwy, Z. S. Adv. Funct. Mater. 2006, 16, 735）。
この発明は特定の態様について記述されている一方、本発明はこの開示の精神と範囲内でさらに修正することができる。したがって、本出願は、発明の一般原則を用いた、発明のあらゆる変形、用途、又は適合に及ぶことを意図する。さらに、本出願は、この発明が関連し及び添付の請求項の限定に含まれる、当該技術分野において既知の又は慣習的な実施の範囲内に相当する、本開示から逸脱したものに及ぶことを意図する。
刊行物、特許及び特許出願を含む、本明細書に記載の全ての参考文献は、それぞれの参考文献が個別に及び具体的に参考文献として援用されると示され、そして本明細書においてその内容がすべて説明された場合とあたかも同じ程度に、参考文献として本明細書中に援用される。本明細書において検討された参考文献は、本願の出願日前の開示のためだけに提供される。本明細書中の内容は全て、発明者が先行発明によってそのような開示に先行する権利を与えられないことの承認とは解釈されない。
Claims (20)
- 少なくとも一つの内部シグナル伝達要素（"ISTE")の円錐形の先端を、基材の中に封じ込める工程；
ISTEの先端を露出させるために、研磨手段を用いて基材を研磨する工程；
テスターを用いて、研磨の程度をモニタリングする工程；及び
約2 nmから約500 nm間の範囲の、所望の半径のディスクが露出し、そしてそれによって、ナノディスク電極が製造されたことをテスターが知らせた場合に、研磨を止める工程：
を含む、円錐形の原子レベルで尖った先端を有する少なくとも一つのISTEを用いて、円錐形ナノポア装置を作製する方法。 - ISTEの露出したディスクにエッチング処理を施して、ナノポア電極を製造する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- ISTEが白金又は金を含む、請求項２に記載の方法。
- 基材がガラス又は石英である請求項３に記載の方法。
- モニタリング工程が、
ISTEの伸長部分と研磨手段との間の電気抵抗を、断続的に測定する工程；及び
ISTEの先端上部の基材の厚さの関数として、又はISTEの露出したディスクの大きさの関数として、電気抵抗を解析する工程：
を含む、請求項４に記載の方法。 - 電気抵抗を有限要素解析によって解析し、ISTEの露出したディスクの大きさを推定する、請求項５に記載の方法。
- テスターが、高入力インピーダンスの金属-酸化膜半導体電界効果トランジスタ（MOSFET）に基づく回路テスターである、請求項６に記載の方法。
- モニタリング工程が、研磨の間に電極を断続的に調べて、封じ込められた円錐形の先端の領域周囲の基材の厚さを決定する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
- 所望の半径のディスクが露出した後、基材の外部表面を第一の構成物で修飾する工程；及び
ナノポアが作られた後、内部表面を第二の構成物で修飾する工程：
をさらに含む、請求項５に記載の方法。 - 第一の構成物が、不活性末端を有する反応性シランであり、そして、第二の構成物が、ガラスと反応可能な第一の官能基と標的分析物に選択的に結合可能なセンサー構成要素と反応可能な第二の官能基とを含むシランである、請求項９に記載の方法。
- ナノポアが作られた後に、基材からISTEを取り除き、それによってナノポア膜を製造する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
- 解析される少なくとも一つの荷電種を含有する試料溶液を提供する工程；
内部シグナル伝達要素（"ISTE"）を含むナノポア電極であって、ナノポアの内部表面が、ポアの開口部における電荷密度を適切な調節種によって調節可能にする構成物を含む、前記ナノポア電極を提供する工程；
ナノポア電極に溶液を接触させて、それにより、ナノポアの外部表面を溶液に浸漬し、そしてナノポアを溶液で満たす工程；
溶液とISTEとの間に適切な電圧を印加する工程；
適切な調節種を溶液に加えて、それにより、開口部における電荷密度を変化させ、そして、開口部における電荷密度を調節することによって、ナノポアを通過する少なくとも一つの荷電種を、静電気的にゲート“オン”及びゲート“オフ”にすることを可能にする工程；
ナノポアの電気伝導率をモニタリングする工程；及び
電気伝導率を解析して、荷電種の移動がどの程度まで調節されたかを決定する工程：
を含む、表面修飾ナノポア電極を用いて、荷電種の輸送を調節する方法。 - 荷電種が、ナノポアの底部の周りで起こる酸化還元反応の反応物であり；それによって、ナノポアの開口部を通る荷電種の輸送を調節する工程が、酸化還元反応の速度を調節する、請求項１２に記載の方法。
- 試料溶液を提供する工程；
ナノポアの内部表面が、溶液のpH値に依存してポアの開口部における電荷密度を変化させる構成物を含む、内部シグナル伝達要素（"ISTE"）を含むガラスナノポア電極を提供する工程；
ナノポア電極に試料溶液を接触させて、それにより、ナノポア電極の外部表面を溶液に浸漬し、そしてナノポアを溶液で満たす工程；
溶液とISTEとの間に適切な電圧を印加する工程；
ナノポアの電気伝導率をモニタリングする工程；及び
電気伝導率を解析して、溶液のpHを決定する工程：
を含む、表面修飾ナノポア電極を用いて、試料溶液のpHを測定する方法。 - 対象とする分析物を含有する試料溶液を提供する工程；
ナノポアの内部表面を機能性構成物で修飾して、それにより、機能性構成物が対象とする分析物に選択的に結合する、内部シグナル伝達要素（"ISTE"）を含むナノポア電極を提供する工程；
ナノポア電極に溶液を接触させて、それにより、ナノポアの外部表面を溶液に浸漬し、そしてナノポアを溶液で満たす工程；
溶液とナノポア電極のISTEとの間に適切な電圧を印加する工程；
ナノポアの電気伝導率をモニタリングする工程；及び
電気伝導率を解析し、対象とする分析物の濃度を決定する工程：
を含む、表面修飾ナノポア電極を用いて、試料溶液中の対象とする分析物の濃度を測定する方法。 - 第一の構成物がCl(Me)2Si(CH2)3CNであり、第二の構成物がEtO(Me)2Si(CH2)３NH2である、請求項１０に記載の方法。
- ナノポアが作られた後、基材からISTEを取り除き、それによってナノポア膜を製造する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
- 内部表面が化学修飾された後、基材からISTEを取り除き、それによって修飾ナノポア膜を製造する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
- 内部表面を化学修飾し、修飾ナノポア膜を製造する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
- 対象とする分析物を含有する試料溶液を提供する工程；
ナノポア膜を提供する工程；
ナノポア膜に溶液を接触させて、それによって、ナノポア膜の外部表面及び内部表面を共に溶液と接触させる工程であって、ここで、外部溶液又は内部溶液のいずれかが解析される分析物を含有する前記工程；
ナノポア膜において相対する面に位置する溶液間に、適切な電圧を印加する工程；
ナノポアの電気伝導率をモニタリングする工程；
電気伝導率を解析し、対象とする分析物の濃度又は性質を決定する工程：
を含む、非修飾ナノポア膜又は表面修飾ナノポア膜を用いて、試料溶液中の対象とする分析物の濃度及び性質を測定する方法。
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