JP2010239918A - 微生物検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】液体試料中の微生物を検出する微生物検出方法であって、微生物の標本の観察作業をより効率化することができる微生物検出方法を提供することを目的とする。
【解決手段】微生物検出方法が、液体試料中の微生物を検出する微生物検出方法であって、微生物を捕集したフィルタを寒天溶液に浸し、寒天溶液に浸されたフィルタをスライドガラスに貼り付け、スライドガラスに貼り付けたフィルタを乾燥させる平坦化工程と、スライドガラスに貼り付けたフィルタにハイブリダイゼーションバッファを塗布し、当該ハイブリダイゼーションがフィルタになじんだ後に、ハイブリダイゼーションバッファにプローブが含まれるプローブ溶液を、フィルタ上の微生物に塗布するプローブ溶液塗布工程とを、具備する。
【選択図】図２

Description

本発明は、標本としての微生物を検出する微生物検出方法に関する。

ＦＩＳＨ法とは、蛍光標識したプローブを、標的の微生物のみに反応させることによって、標的微生物のみを蛍光染色する手法であり、自然界の微生物研究の多くに活用されている。このＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）法で用いるプローブとは、標的とする微生物の核酸、多くの場合ｒＲＮＡ（ribosome Ribonucleic acid）の配列に相補的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を共有結合したものである。そのオリゴヌクレオチドは適切な反応条件では、完全に相補的な核酸配列にのみ結合するため、当該相補的な核酸配列を有する標的微生物の選択的染色が可能となる。

そして、一般的に、水中の微生物または微生物の懸濁体の観察時には、微生物をメンブレンフィルタで捕集し、捕集した微生物をＦＩＳＨ法によって染色する。
しかし、メンブレンフィルタ、特に微生物観察用に普及しているポリカーボネートフィルタは、非常に薄く、波打ちやすい為に、標本の調整中にメンブレンフィルタの平坦性が失われてしまうことがある。この為、ステージの移動を自動化した顕微鏡では、視野の移動ごとにメンブレンフィルタの形状に応じてフォーカスを合わせる必要がある為に、標本の観察時に、余分な時間が生じてしまうという課題があった。

そして、このような課題を解消する発明として、下記特許文献１には、オートフォーカス機能を有する光学顕微鏡、蛍光顕微鏡及びレーザ顕微鏡等の顕微鏡がオートフォーカスするための合焦用マーカーを有する平坦な基材層と、当該基材層表面上に積層された所定厚さを有する粘着層とからなる捕集シートで微生物を捕集する工程を備えることによって、平坦な標本を作製することができる微生物検出方法が開示されている。

国際公開第２００４／０２２７７４号パンフレット

ところで、上記従来技術では、上述したように、標本の調整中にメンブレンフィルタの平坦性が失われてしまうことがある為に、ステージの移動を自動化した顕微鏡では、視野の移動ごとにフォーカスを合わせなければならないという問題があった。また、撮影した画像を画像処理することによって微生物を検出するためには、画像全体にフォーカスを合わせる必要があるが、ＦＩＳＨ法で染色した標本を通常の蛍光顕微鏡で撮影した場合には、１０視野に１視野程度の割合でしか、フォーカスの合った画像を得ることができなかった。

さらに、現在、一般的に行われているＦＩＳＨ法では、染色むら、また背景に未反応のプローブがメンブレンフィルタに付着することで余計な蛍光を発することがあった。そして、これにより、画像ごとの明度が異なってしまう為、自動的な画像解析が難しく、画像処理作業に手間がかかっていた。
また、特許文献１における微生物検出方法では、平坦な基材上に薄い粘着層を作製し、そこに微生物を付着させることによって、微生物を捕集しているが、この方法では、液体中の微生物を採取することは困難である。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、液体試料中の微生物を検出する微生物検出方法であって、微生物の標本の観察作業をより効率化することができる微生物検出方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明では、微生物検出方法に係る第１の解決手段として、液体試料中の微生物を検出する方法であって、微生物を捕集したフィルタを寒天溶液に浸し、前記寒天溶液に浸された前記フィルタをスライドガラスに貼り付け、前記スライドガラスに貼り付けた前記フィルタを乾燥させる平坦化工程を、具備するという手段を採用する。

本発明では、微生物検出方法に係る第２の解決手段として、液体試料中の微生物を検出する方法であって、微生物を捕集したフィルタにハイブリダイゼーションバッファを塗布し、当該ハイブリダイゼーションが前記フィルタになじんだ後に、前記フィルタ上の微生物にプローブを含むハイブリダイゼーションバッファを塗布するプローブ溶液塗布工程を、具備するという手段を採用する。

本発明では、微生物検出方法に係る第３の解決手段として、液体試料中の微生物を検出する方法であって、微生物を捕集したフィルタを寒天溶液に浸し、前記寒天溶液に浸された前記フィルタをスライドガラスに貼り付け、前記スライドガラスに貼り付けた前記フィルタを乾燥させる平坦化工程と、前記スライドガラスに貼り付けた前記フィルタにハイブリダイゼーションバッファを塗布し、当該ハイブリダイゼーションが前記フィルタになじんだ後に、ハイブリダイゼーションバッファにプローブが含まれるプローブ溶液を、前記フィルタ上の微生物に塗布するプローブ溶液塗布工程とを、具備するという手段を採用する。

本発明では、微生物検出方法に係る第４の解決手段として、上記第１または第３の解決手段において、前記寒天溶液の寒天の濃度は、０．１％であるという手段を採用する。

本発明によれば、微生物検出方法が、液体試料中の微生物を検出する方法であって、微生物を捕集したフィルタを寒天溶液に浸し、寒天溶液に浸されたフィルタをスライドガラスに貼り付け、スライドガラスに貼り付けたフィルタを乾燥させる平坦化工程と、スライドガラスに貼り付けたフィルタにハイブリダイゼーションバッファを塗布し、当該ハイブリダイゼーションがフィルタになじんだ後に、ハイブリダイゼーションバッファにプローブが含まれるプローブ溶液を、フィルタ上の微生物に塗布するプローブ溶液塗布工程とを、具備する。

このように、微生物検出方法では、平坦化工程によって、フィルタを平坦化すると、蛍光顕微鏡の視野の移動毎に、フォーカスを合わせる必要がない為、観察時に生じる余分な時間を低減することができる。

また、プローブ溶液塗布工程では、プローブ溶液の塗布前に、フィルタにハイブリダイゼーションバッファをなじませている為に、フィルタに塗布されたプローブ溶液は、略均一の円状に広がる。また、プローブ溶液の塗布前に塗布したハイブリダイゼーションバッファが膜となって、プローブが、微生物ではなくて、フィルタに強く付着してしまうことを防ぐことができる。これにより、背景の蛍光及び染色むらを低減するが可能になり、蛍光顕微鏡による観察時に微生物が鮮明になる為、微生物の認識効率を向上することができる。そして、画像処理によって、微生物を検出する場合にも、画像全体にフォーカスが良好な画像が多く取れている為、作業効率を向上することができる。

本発明の一実施形態に係る微生物検出方法の第２の工程におけるろ過装置１０の部分斜視図である。 本発明の一実施形態に係る微生物検出方法の平坦化工程を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る微生物検出方法のプローブ溶液塗布工程を示す模式図である。

以下、図面を参照して、本発明の一実施形態について説明する。本実施形態は、標本としての微生物を検出する微生物検出方法に関する。

本実施形態に係る微生物検出方法における工程について、説明する。
本実施形態に係る微生物検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いて微生物を検出する方法であり、微生物を捕集したメンブレンフィルタを平坦化させる平坦化工程と、染色むら及び背景における蛍光を低減するプローブ溶液塗布工程とを、備えている。
微生物検出方法における、上記平坦化工程及びプローブ溶液塗布工程を含む各工程について、手順に沿って順番に説明する。

まず、微生物検出方法では、第１の工程において、水を主成分とするレジオネラ菌を含む液体試料に、終濃度が４％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該液体試料を４℃の温度の下で一晩保存することによってパラホルムアルデヒドに化学固定を行わせる。そして、第１の工程では、この化学固定によって、液体試料中にレジオネラ菌の固定標本を作製する。

そして、上記第１の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の第２の工程において、第１の工程において作製した固定標本を含む液体試料を、図１に示すろ過装置１０によって、ろ過することで、固定標本を取り出す。図１は、本実施形態に係る微生物検出方法の第２の工程におけるろ過装置１０の部分斜視図である。第２の工程におけるろ過装置１０は、図１に示すように、ガイドタワー１、ろ過器２及び吸引器３を備えている。

ガイドタワー１は、ろ過器２に液体試料を導入する為の筒形状の流路であり、ろ過器２の上側に取り付けられている。
ろ過器２は、ガイドタワー１を介して導入された液体試料中の液体のみをメンブレンフィルタ２ａを通じて下側の吸引器３に通過させることでメンブレンフィルタ２ａ上に固定標本を取り出すものである。

このろ過器２では、メンブレンフィルタ２ａが着脱可能になっており、ろ過毎にメンブレンフィルタ２ａを交換することが可能である。
メンブレンフィルタ２ａは、装着に必要な余白を含めた大きさの直径が２５ｍｍの円形であり、孔径が０．２２μｍであるポリカーボネート製のフィルタである。そして、このメンブレンフィルタ２ａの中心部の直径１６ｍｍの円形領域が、ろ過に使用される。

吸引器３は、ろ過器２のメンブレンフィルタ２ａ上の液体試料から液体のみ通過させる為に、メンブレンフィルタ２ａの下側から吸引を行う。吸引器３は、吸引ビン及び吸引ポンプを備えており、吸引ポンプが吸引ビン内の空気を吸引することで、メンブレンフィルタ２ａを下側から吸引を行う。

そして、第２の工程では、上記構成のろ過装置１０によってレジオネラ菌の固定標本をメンブレンフィルタ２ａ上に取り出した後に、ろ過器２からメンブレンフィルタ２ａを取り外す。そして、第２の工程では、取り外したメンブレンフィルタ２ａを、常温の空気中で乾燥させ、その後に９９．５％エタノールによって脱水し、さらに再度、常温の空気中で乾燥させる。

そして、上記第２の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の平坦化工程において、図２に示すように、シャーレ１１に濃度０．１％の寒天溶液１１ａを作製し、ピンセット１２によって、第２の工程においてレジオネラ菌を捕集したレジオネラ菌捕集部分２ｂを有するメンブレンフィルタ２ａを当該寒天溶液１１ａに浸す。図２は、本実施形態に係る微生物検出方法の平坦化工程を示す模式図である。なお、この寒天溶液１１ａは、寒天（アガロース）を水に加熱溶解したものであり、４０℃程度を保持することで寒天の溶解を保持している。

そして、平坦化工程では、メンブレンフィルタ２ａを寒天溶液１１ａに浸した後に、図２に示すように、ピンセット１２によって、当該メンブレンフィルタ２ａをスライドガラス１３上に貼り付けるように配置する。このように平坦化工程において、濃度０．１％の希薄な寒天溶液に浸したメンブレンフィルタ２ａをスライドガラス１３上に貼り付けるように配置することによって、メンブレンフィルタ２ａを気泡を含まない平坦状にすることができる。
そして、平坦化工程では、スライドガラス１３上に貼り付けたメンブレンフィルタ２ａを乾燥させる。

そして、上記平坦化工程が終了すると、次に、微生物検出方法のプローブ溶液塗布工程において、図３に示すように、マイクロピペット２１によって、スライドガラス１３上のメンブレンフィルタ２ａにハイブリダイゼーションバッファを３００〜４００ｍｌほど滴下することで塗布し、その後にハイブリダイゼーションバッファを塗布したメンブレンフィルタ２ａを約５分据え置くことによって、ハイブリダイゼーションバッファをメンブレンフィルタ２ａになじませる。図３は、本実施形態に係る微生物検出方法のプローブ溶液塗布工程を示す模式図である。

上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、ＮａＣｌが０．９％、Ｔｒｉｓ‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５％、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔが２％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２％である。ハイブリダイゼーションバッファでは、ＳＤＳが含まれている為、界面張力が弱い。その為、ハイブリダイゼーションバッファは、スライドガラス１３上のメンブレンフィルタ２ａに滴下されると、滴下された位置を中心に略均一の円状に広がる。そして、約５分かけて、ハイブリダイゼーションバッファをメンブレンフィルタ２ａになじませる。

プローブ溶液塗布工程では、約５分かけてハイブリダイゼーションバッファをメンブレンフィルタ２ａになじませた後に、マイクロピペット２１によって、スライドガラス１３上のメンブレンフィルタ２ａ上のレジオネラ菌捕集部分２ｂに、ハイブリダイゼーションバッファにプローブ８０ｐｍｏｌ／μｌが含まれるプローブ溶液を、滴下することで塗布する。

プローブ溶液塗布工程では、プローブ溶液の塗布前に、メンブレンフィルタ２ａにハイブリダイゼーションバッファをなじませている為に、メンブレンフィルタ２ａに滴下されたプローブ溶液は、滴下された位置を中心に略均一の円状に広がる。また、プローブ溶液の塗布前に塗布したハイブリダイゼーションバッファが膜となって、プローブが、レジオネラ菌の固定標本ではなく、メンブレンフィルタ２ａに強く付着してしまうことを防ぐことができる。
そして、プローブ溶液塗布工程では、プローブ溶液がメンブレンフィルタ２ａ上のレジオネラ菌捕集部分２ｂに十分広がると、４６℃の温度下で、約２時間保存することによって、レジオネラ菌の固定標本にプローブを結合させる。

そして、上記プローブ溶液塗布工程が終了すると、次に、微生物検出方法の第５の工程において、５０ｍｌの遠沈管にウォッシングバッファを入れ、遠沈管のウォッシングバッファにメンブレンフィルタ２ａが張り付いたスライドガラス１３を浸し、４８℃の環境下で、ウォッシングバッファにメンブレンフィルタ２ａを１５分浸した状態にすることによって、メンブレンフィルタ２ａ上の未反応のプローブを洗浄する。
上記ウォッシングバッファの構成は、Ｔｒｉｓ−Ｃｌが２０ｍＭ、ＮａＣｌが８０ｍＭ、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）が５ｍＭ、ＳＤＳが０．０１％である。ウォッシングバッファでは、未反応のプローブが自然拡散によって、メンブレンフィルタ２ａから剥がれ落ちる。

そして、上記第５の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の第６の工程において、ウォッシングバッファによって洗浄されたメンブレンフィルタ２ａの貼り付いたスライドガラス１３を、９９．５％のエタノールに入れることによって、メンブレンフィルタ２ａを１分間脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる。

そして、上記第６の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の第７の工程において、スライドガラス１３上のメンブレンフィルタ２ａのレジオネラ菌捕集部分２ｂにベクターシールドを滴下し、その上に気泡がはいらないようカバーガラスを載せて、密着させる。

そして、上記第７の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の第８の工程において、蛍光顕微鏡にスライドガラス１３を取り付け、波長４９５ｎｍの青色の励起光をスライドガラス１３上のメンブレンフィルタ２ａへ蛍光顕微鏡に照射させることによって、メンブレンフィルタ２ａのプローブを、波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発光させる。

そして、上記工程によって作製した標本を蛍光顕微鏡によって観察すると、メンブレンフィルタ２ａが平坦である為に、蛍光顕微鏡を１０視野以上移動させてもほとんど蛍光顕微鏡のフォーカスを調整する必要がない。また、通常の方法と比較しても、プローブの結合したレジオネラ菌の背景の蛍光が弱く、また染色も均一である為に、染色された標的菌体が明確に確認することができた。

そして、蛍光顕微鏡によって画像を撮影したところ、通常の方法では画像全体にフォーカスの合う写真は１０枚に1枚程度であったが、本実施形態に係る微生物検出方法を使うことによって、９０％以上の画像において画像全体で良好なフォーカスが得られた。さらに、蛍光顕微鏡の視野の移動毎に、ほとんどフォーカス合わせの必要がなかった。

以上のように、本実施形態に係る微生物検出方法では、平坦化工程において、メンブレンフィルタ２ａを寒天溶液に浸し、当該メンブレンフィルタ２ａをスライドガラス１３に貼り付けることによって、メンブレンフィルタ２ａを平坦化する。このように、メンブレンフィルタ２ａを平坦化すると、蛍光顕微鏡の視野の移動毎に、フォーカスを合わせる必要がない為、観察時に生じる余分な時間を低減することができる。

また、プローブ溶液塗布工程では、プローブ溶液の塗布前に、メンブレンフィルタ２ａにハイブリダイゼーションバッファをなじませている為に、メンブレンフィルタ２ａに滴下されたプローブ溶液は、滴下された位置を中心に略均一の円状に広がる。また、プローブ溶液の塗布前に塗布したハイブリダイゼーションバッファが膜となって、プローブが、レジオネラ菌の固定標本ではなく、メンブレンフィルタ２ａに強く付着してしまうことを防ぐことができる。これにより、背景の蛍光及び染色むらを低減するが可能になり、蛍光顕微鏡による観察時に微生物が鮮明になる為、微生物の認識効率を向上することができる。そして、画像処理によって、微生物を検出する場合にも、画像全体にフォーカスが良好な画像が多く取れている為、作業効率を向上することができる。

１…ガイドタワー、２…ろ過器、２ａ…メンブレンフィルタ、２ｂ…レジオネラ菌捕集部分、３…吸引器、１０…ろ過装置、１１…シャーレ、１１ａ…寒天溶液、１２…ピンセット、１３…スライドガラス、２１…マイクロピペット

Claims (4)

1. 液体試料中の微生物を検出する方法であって、
   微生物を捕集したフィルタを寒天溶液に浸し、前記寒天溶液に浸された前記フィルタをスライドガラスに貼り付け、前記スライドガラスに貼り付けた前記フィルタを乾燥させる平坦化工程を、具備することを特徴とする微生物検出方法。
2. 液体試料中の微生物を検出する方法であって、
   微生物を捕集したフィルタにハイブリダイゼーションバッファを塗布し、当該ハイブリダイゼーションが前記フィルタになじんだ後に、前記フィルタ上の微生物にプローブを含むハイブリダイゼーションバッファを塗布するプローブ溶液塗布工程を、具備することを特徴とする微生物検出方法。
3. 液体試料中の微生物を検出する方法であって、
   微生物を捕集したフィルタを寒天溶液に浸し、前記寒天溶液に浸された前記フィルタをスライドガラスに貼り付け、前記スライドガラスに貼り付けた前記フィルタを乾燥させる平坦化工程と、
   前記スライドガラスに貼り付けた前記フィルタにハイブリダイゼーションバッファを塗布し、当該ハイブリダイゼーションが前記フィルタになじんだ後に、ハイブリダイゼーションバッファにプローブが含まれるプローブ溶液を、前記フィルタ上の微生物に塗布するプローブ溶液塗布工程とを、
   具備することを特徴とする微生物検出方法。
4. 前記寒天溶液の寒天の濃度は、０．１％であることを特徴とする請求項１または３に記載の微生物検出方法。
   
   

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