JP2010213628A - ポリ−ガンマ−グルタミン酸の調整方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】微生物を用いてポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法において、枯草菌におけるpgsBCA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が発現してなる微生物に、枯草菌におけるpgsB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsC遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、枯草菌におけるpgsC遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、枯草菌におけるpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を導入することを特徴とするポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法及び/又はポリ−ガンマ−グルタミン酸のL‐体比率調整方法。
【選択図】なし
Description
ここで、「PGAの分子量調整」とは、本発明の遺伝子導入によって、導入前の微生物が生産するPGAの分子量に比較して、導入後の微生物が生産するPGAを高分子化又は低分子化して、その分子量を調整することである。なお、ここで分子量と重量平均分子量は同義である。
また、「PGAのL-体比率調整」とは、本発明の遺伝子導入によって、導入前の微生物が生産するPGA中の総グルタミン酸量に対するL-体グルタミン酸量の比率に比較して、導入後の微生物が生産するPGA中のL-体グルタミン酸量の比率を高めたり減らしたりすることである。
(1) 微生物を用いてPGAを生産する方法において、枯草菌におけるpgsBCA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が発現してなる微生物に、枯草菌におけるpgsB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsC遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsC遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を導入することを特徴とするPGAの分子量調整方法。
(3) 上記微生物を用いてPGAを生産する方法において、枯草菌における枯草菌におけるpgsC若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又はpgsC遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を導入し、PGAを低分子化する、上記(1)のPGAの分子量調整方法。
(6) 上記PGAの分子量調整方法及び/又はPGAのL‐体比率調整方法を用いて、生成されたPGAを取得することを特徴とするPGAの製造方法。
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
また、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質とは、PGA合成に関与する膜結合型酵素系の関与によって、グルタミン酸を重合してPGAを合成する酵素であり、当該アミドリガーゼ活性は、グルタミン酸及びATP又はGTPを基質とし、これに当該酵素及び塩化マンガンを加えたものを反応溶液として用いた場合に、反応溶液中にPGAの生成を確認することにより測定することができる[Urushibata, Y., et al.: J. Bacteriol., 184, 337-343 (2002)]。
(d)配列番号1で示される塩基配列と60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
(f)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
(g)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
また、前述の「PgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する」といったPgsCタンパク質の機能とは、宿主微生物にてpgsB遺伝子とともにpgsC遺伝子を発現させた際に菌体外にPGAを生産する能力を意味する。これは、pgsB遺伝子を単独で発現させた宿主微生物ではPGAが生産されず、pgsB遺伝子とともにpgsC遺伝子を発現させた場合に、PGAが生産されるといった本発明者らが見出した知見に基づいている。
(i)配列番号3で示される塩基配列と55%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、PgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
(j)配列番号3で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、PgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
(k)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
(l)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsB及びPgsCとの共存下でPGA合成能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
また、上記「PgsB及びPgsCタンパク質との共存下でPGA合成能を有するタンパク質」は、PgsB及びPgsCタンパク質との共存下でPGA合成能があるものであり、PGAの菌体外排出に関与するタンパク質であることが示唆されているが[例えば、Ashiuchi, M., et al.: Eur. J. Biochem.,268, 5321-5328 (2001)]、現在までにその機能は明確にはされていない。
(n)配列番号5で示される塩基配列と30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、PgsB及びPgsCとの共存下でPGA合成能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
(o)配列番号5で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、PgsB及びPgsCタンパク質との共存下でPGA合成能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
上記遺伝子を単離/同定する方法としては、例えば、上記の微生物からゲノムDNAを抽出し、前述した配列番号1、3又は5などに示した塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションによってpgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子又はpgsA遺伝子に相当する遺伝子について単離することができる。さらに、近年の急速なゲノム解読の進展によりPGA非生産微生物であってもそのゲノム配列情報を基に、Oceanobacillus iheyensis等から前述のように定義した枯草菌pgsB遺伝子に相当する遺伝子、pgsC遺伝子に相当する遺伝子又はpgsA遺伝子に相当する遺伝子を単離/同定することができる。
具体的には、pgsB遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号13、19、25又は31に示すアミノ酸配列又はそれぞれの配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、グルタミン酸を基質とするアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、配列番号12、18、24又は30など)が挙げられる。
また、pgsC遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号15,21、27又は33に示すアミノ酸配列又はそれぞれの配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、前述のPgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、配列番号14,20、26又は3など)が挙げられる。
また、pgsA遺伝子に相当する遺伝子としては、配列番号17、23、29又は35に示すアミノ酸配列又はそれぞれの配列において数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsB及びPgsCと共存下、PGA合成活性を有すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子(例えば、配列番号16、22、28又は34など)が挙げられる。
このような制御領域として、Bacillus sp. KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の上流0.4〜1.0kb領域(制御領域)、Bacillus属細菌のrapA遺伝子の制御領域、Bacillus属細菌のspoVG遺伝子の制御領域などが例示されるが特に限定されない。
前述したBacillus sp. KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子に由来する当該制御領域の塩基配列は配列番号7の塩基番号1〜572で示され、また、Bacillus属細菌のrapA遺伝子(BG10652)の塩基配列の制御領域は配列番号8で、Bacillus属細菌由来のspoVG遺伝子(BG10112)の塩基配列の制御領域は配列番号9で示されるが、これらの各塩基配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有し、且つ同等の機能を有する塩基配列からなる領域も包含される。ここでの塩基配列の同一性とは前述と同じ定義を用いる。
当該遺伝子を宿主微生物に導入する際は、従来公知のプラスミド(ベクター)を使用することができる。また、プラスミドは遺伝子導入対象の宿主微生物の種類に応じて適宜選択することができる。枯草菌を宿主とする場合、例えば、pT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、pHY300PLK等を例示することができる。選択されるプラスミドは、宿主細胞内で自己複製可能なプラスミドであることが好ましく、そのプラスミドが多コピーであることがより好ましい。
さらに、係る断片は1細胞当たり1コピーの導入で目的のタンパク質の生産に対し充分な効果を発揮すると予測されることから、プラスミドによって導入した場合、生産培養中に一部のプラスミドが脱落しても、その影響は受け難いので、そのプラスミドのコピー数が宿主ゲノム(染色体)に対し、2以上100コピー以下であれば良く、好ましくは2以上50コピー以下、より好ましくは2以上30コピー以下であれば良い。また、発現ベクターを用いた形質転換には、従来公知の手法、例えばプロトプラスト法[Chamg, S., Cohen, SH.: Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979)]やコンピテントセル法[Young, FE., Spizizen, J.: J. Bacteriol., 86, 392-400 (1965)]を適用することができる。
ここで上記宿主微生物は特に限定されないが、具体的には、野生型でPGA生産能を有するBacillus amyloliquefaciens、Bacillus pumilus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans、Bacillus subtilis 等のバチルス(Bacillus)属細菌や、遺伝子組み換えによりPGA生産能を付与したクロストリジウム(Clostridium)属細菌、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌、大腸菌(Escherichia coli)或いは酵母等が挙げられる。なかでも、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、宿主微生物として安全かつ且つ優良と認められた微生物菌株として開発されている点から、Bacillus属細菌のなかでも特に枯草菌(Bacillus subtilis)が好ましい。
例えば、まず、係る制御領域を含むDNA断片の上流にpgsBCA遺伝子の本来の翻訳開始制御領域及び/又は転写開始制御領域を含む薬剤耐性遺伝子断片を作製し、さらにこの下流にpgsBCA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片をSOE(splicing by overlap extension)−PCR法[Horton, RM., et al.: Gene, 77, 61-68 (1989)]などの公知の方法により結合させる。この様にして、pgsBCA遺伝子の本来の制御領域とその上流領域を含む薬剤耐性遺伝子断片、目的とする当該制御領域断片、pgsBCA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片、の順に結合したDNA断片を得る。
次に、係るDNA断片を、公知の方法により宿主微生物細胞内に取り込ませることにより、宿主微生物ゲノムのpgsBCA遺伝子の本来の転写開始制御領域とその上流領域、及びpgsBCA遺伝子の構造遺伝子領域の2箇所において、二回交差の相同組換えが起こる。その結果、上記薬剤耐性遺伝子を指標として、本来の制御領域が目的とする当該制御領域に置換された形質転換体を分離することができる。これにより、ゲノム上のpgsBCA遺伝子上流へ導入された制御領域は、遺伝的に安定に保持されることとなる。
枯草菌のggt遺伝子の塩基配列を配列番号10に示し、ggt遺伝子によりコードされるPGA分解酵素GGTのアミノ酸配列を配列番号11に示す。
枯草菌のggt遺伝子と同じ機能を有する、及び/又はこの遺伝子の塩基配列と塩基配列において90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有する、他の微生物(好ましくはBacillus属細菌)由来の遺伝子は、これら遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失、不活性化すべき遺伝子に含まれる。
また、ggt遺伝子は、配列番号11に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたPGA分解能を有するアミノ酸配列を含む。ここで、「1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列」には、例えば1〜12個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜4個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への1〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
また、ggt遺伝子は、配列番号11で示されるアミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、PGA分解活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは前述と同じ定義を用いる。ggt遺伝子或いはその遺伝子に相当する遺伝子を欠失させる方法としては、従来公知の手法を適宜使用することができる。例えば、ggt遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミド(ベクター)にクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを宿主微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって宿主微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して欠失又は不活性化することが可能である[Leenhouts, K., et al.: Mol. Gen. Genet., 253, 217-224 (1996)]。
この場合、ggt構造遺伝子内への塩基置換、塩基挿入或いは一部欠失といった変異導入の他に、プロモーター領域等の制御領域への同様の変異導入、またはggt遺伝子の発現制御に関連する遺伝子への同様の変異導入によっても同等の効果が期待できる。
さらに、より効率的な手法として、ggt遺伝子の上流、下流領域を含むがggt遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片を前述のSOE-PCR法によって構築し、これを宿主微生物細胞内に取り込ませて宿主微生物ゲノム上のggt遺伝子の外側の2ヶ所で二回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上のggt遺伝子を欠失させるといった手法も実施可能である(図2参照)。
本製造例には、PGA合成に関与する遺伝子群のクローニング方法を示した(図1参照)。Bacillus属細菌 KSM-366株(FERM BP-6262)から調製した染色体DNAを鋳型とし、表2に示したP-S237/BSpgsB atg FW(配列番号38)及びHindIII_BSpgsBCA RV(配列番号43)のプライマーセットを用いて、2.9kbのpgsBCA遺伝子DNA断片(BCA)を調製した(図1参照)。同様に、P-S237_BSpgsC FW(配列番号40)及びHindIII_BSpgsBCA RV(配列番号43)のプライマーセットを用い1.7kbのpgsCA遺伝子DNA断片(CA)、P-S237/BSpgsB atg FW(配列番号38)及びHindIII_BSpgsB RV(配列番号45)のプライマーセットを用い1.2kbのpgsB遺伝子DNA断片(B)、P-S237_BSpgsC FW(配列番号40)及びHindIII_BSpgsBC RV(配列番号44)のプライマーセットを用い0.5kbのpgsC遺伝子DNA断片(C)、P-S237_BSpgsA FW(配列番号39)及びHindIII_BSpgsBCA RV(配列番号43)のプライマーセットを用い1.2kbのpgsA遺伝子DNA断片(A)を調製した。また、P-S237/BSpgsB atg FW(配列番号38)及びpgsC FW(配列番号42)のプライマーセットを用い1.2kbのpgsB遺伝子DNA断片(b)、comp_pgsA/pgsC RV(配列番号41)及びHindIII_BSpgsBCA RV(配列番号43)のプライマーセットを用い1.2kbのpgsA遺伝子DNA断片(a)を予め調製し、これら断片(b及びa)を鋳型として配列番号38及び43のプライマーセットを用い、SOE−PCR法にてpgsBA遺伝子2.4kbのDNA断片(BA)を調製した。さらに、Bacillus属細菌 KSM-S237株(FERM BP-7875)から調製した染色体DNAを鋳型とし、表2に示したCm_S237 FW(配列番号36)及びP-S237 RV(配列番号37)のプライマーセットを用いて、Bacillus属細菌 KSM-S237株(FERM BP-7875)由来のS237セルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)の0.6kbのプロモーター領域DNA断片(P_S237)を調製した。次に、得られた断片(P_S237)及び(BCA)と配列番号36及び43のプライマーセットを用いて、SOE−PCR法にて断片(P_S237)と(BCA)を一断片化した3.5kbのDNA断片(P_BCA)を得た(図1参照)。同様に、断片(P_S237)及び(BA)と配列番号36及び43のプライマーセットを用い3.0kbのDNA断片(P_BA)、断片(P_S237)及び(CA)と配列番号36及び43のプライマーセットを用い2.3kbのDNA断片(P_CA)、断片(P_S237)及び(B)と配列番号36及び45のプライマーセットを用い1.8kbのDNA断片(P_B)、断片(P_S237)及び(C)と配列番号36及び44のプライマーセットを用い1.1kbのDNA断片(P_C)、断片(P_S237)及び(A)と配列番号36及び43のプライマーセットを用い1.8kbのDNA断片(P_A)を得た。尚、PCR反応にはGeneAmp9700(PE Applied Biosystems)とTaKaRa LA Taq(Takara)を用い、キット添付のプロトコールに従い実施した。
製造例1にて調製したDNA断片をそれぞれ制限酵素BamHI及びHindIIIにて制限酵素処理し、同様の制限酵素処理を施したプラスミドベクターpHY300PLK(Takara)とDNA Ligation kit Ver.2(Takara)を用いてライゲーション反応(結合化)を行なった。上記ライゲーション試料にて、コンピテントセル法にて大腸菌(HB101株)を形質転換し、テトラサイクリン-塩酸塩(SIGMA)を15ppm添加したLB寒天培地(LBTc寒天培地)上に出現したコロニーを形質転換体とした。得られた形質転換体を再度LBTc寒天培地にて生育させ、得られた菌体からハイピュア プラスミドアイソレーションキット(ロッシュ・ダイアグノスティックス)を用い組換えプラスミドを調製した。これらを制限酵素BamHI及びHindIIIにて制限酵素処理し、電気泳動法にてプラスミドベクター上のマルチクローニングサイトに、製造例1に示した目的とするDNA断片(P_BCA)、(P_BA)、(P_CA)、(P_B)、(P_C)及び(P_A)が挿入されていることを確認した。本製造例において、DNA断片(P_BCA)の挿入を確認した組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクター pHY-P_S237/pgsBCA、DNA断片(P_BA)の挿入が確認できた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクター pHY-P_S237/pgsBA、DNA断片(P_CA)の挿入が確認できた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクター pHY-P_S237/pgsCA、DNA断片(P_B)の挿入が確認できた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクター pHY-P_S237/pgsB、DNA断片(P_C)の挿入が確認できた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクター pHY-P_S237/pgsC、DNA断片(P_A)の挿入が確認できた組換えプラスミドをPGA組換え生産用ベクター pHY-P_S237/pgsAとした。
本製造例には、製造例2で得られたベクターを導入するための枯草菌変異株の作製方法を示した(図3参照)。
製造例2において調製したpHY-P_S237/pgsBCAを鋳型とし、表2に示したHindIII_BSpgsB RV(配列番号45)及びTET4-1 F(配列番号46)のプライマーセットを用いて、プラスミド上のテトラサイクリン耐性遺伝子(Tetr)を含むS237セルラーゼプロモーター配列の結合した3.3kbのpgsB遺伝子断片(tet-P_B)を調製した。また、Bacillus subtilis Marburg No.168株(枯草菌168株)から調製した染色体DNAを鋳型とし、tet4-1_comp/pgsB FW(配列番号47)及びpgsB RV(配列番号48)のプライマーセットを用いて、枯草菌ゲノム上のPGA合成関連pgsBCA遺伝子の上流1.0kbのDNA断片(pgsB-UP)を調製した。これら断片(tet-P_B、pgsB-UP)を鋳型として配列番号45及び48のプライマーセットを用い、SOE−PCR法にて枯草菌ゲノム上のpgsBCA遺伝子オペロンの上流プロモーター置換用DNA断片(tet-P_S237)を得た。続いて、得られたDNA断片(tet-P_S237)を用いコンピテントセル法により枯草菌168株の形質転換を行ない、LBTc寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。さらに、得られた形質転換体からゲノムDNAを抽出し、これを鋳型とするPCRによってpgsBCA遺伝子オペロンの上流にS237セルラーゼプロモーターが導入された枯草菌変異株(1cp-P_S237/pgsBCAtet)であることを確認した。続いて、製造例1にて調製したS237セルラーゼプロモーター領域0.6kbのDNA断片(P_S237)、Staphylococcus aureus由来のpC194プラスミド(Horinouchi,S., Weisblum,B.,J.Bacteriol.,150,815,1982)を鋳型として、P-S237F_comp/Cm FW(配列番号49)及びpC194Cm RV(配列番号50)のプライマーセットで調製したクロラムフェニコール耐性遺伝子0.9kbのDNA断片(Cmr)、枯草菌168株の染色体DNAを鋳型として、pgsB RV(配列番号48)及びpgsB/Cm F(配列番号51)のプライマーセットを用いて、pgsBCA遺伝子オペロンの上流プロモーターを含む1.0kbのDNA断片(pgsB-UP2)を調製した。さらに、これらDNA断片(P_S237、Cm、pgsB-UP2)を鋳型として、P-S237 RV(配列番号37)及びpgsB RV(配列番号48)のプライマーセットを用い、SOE−PCR法にて一断片化した2.5kbのDNA断片を得た。得られたDNA断片を用いて、コンピテントセル法により枯草菌変異株(1cp-P_S237/pgsBCAtet)の形質転換を行ない、10ppmクロラムフェニコール(SIGMA)を添加したLB寒天培地上(LBCm寒天培地)に生育したコロニーを形質転換体とし、得られた形質転換体を枯草菌変異株(1cp-P_S237/pgsBCAcm)とした。
本製造例には、製造例2で得られたベクターを導入するための枯草菌変異株の作製方法を示した(図4参照)。枯草菌168株から調製した染色体DNAを鋳型とし、rapA FW(配列番号52)及びP_rapA/Cm R(配列番号53)のプライマーセットを用いて、枯草菌ゲノム上のrapA遺伝子(BG10652)の構造遺伝子(ORF)より0.5kb上流にクロラムフェニコール耐性遺伝子を挿入するための上流側0.5kbのDNA断片(rapA-UP)、同様にP_rapA/Cm F(配列番号54)及びP_rapA RV(配列番号55)のプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を挿入するための下流側0.5kbのDNA断片(rapA-DW)を調製した(尚、この際に配列番号55のプライマーはrapA遺伝子のORF開始コドンttgをatgに変更するようにデザインした)。また、プラスミドpC194を鋳型として、Cm_comp FW(配列番号56)及びCm_comp RV(配列番号57)のプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子0.9kbのDNA断片(Cm2)を作製した。さらに、これらDNA断片(rapA-UP、Cm2、rapA-DW)を鋳型として、配列番号52及び55のプライマーセットを用い、SOE−PCR法にて一断片化した1.9kbのDNA断片を得た。得られたDNA断片を用いて、コンピテントセル法により枯草菌168株の形質転換を行ない、LBCm寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体とし、得られた形質転換体を枯草菌変異株(P-rapA/Cm)とした。続いて、上記枯草菌変異株(P-rapA/Cm)から調製した染色体DNAを鋳型とし、P_rapA RV(配列番号55)及びpC194Cm FW(配列番号58)のプライマーセットを用いて、0.9kbのクロラムフェニコール耐性遺伝子と枯草菌ゲノム上の0.5kb のrapA遺伝子上流のプロモーター領域(P_rapA)からなる1.4kbのDNA断片(Cm-P_rapA)を調製した。また、枯草菌168株から調製した染色体DNAを鋳型とし、pgsC FW(配列番号42)及びcomp_P-rapA R/BSpgsBatg FW(配列番号60)のプライマーセットを用いて、枯草菌ゲノム上のpgsBCA遺伝子のORF開始コドンatgから下流までの1.2kbのDNA断片(pgsBatg)、pgsB RV(配列番号48)及びCmFW_comp/pgsB F(配列番号59)のプライマーセットを用いて、枯草菌ゲノム上のpgsBCA遺伝子上流1.0kbのDNA断片(pgsB-UP3)を調製した。さらに、これらDNA断片(Cm-P_rapA、pgsBatg、pgsB-UP3)を鋳型として、配列番号42及び48のプライマーセットを用い、SOE−PCR法にて一断片化した3.6kbのDNA断片を得た。得られたDNA断片を用いて、コンピテントセル法により枯草菌168株の形質転換を行ない、LBCm寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体とし、得られた形質転換体を枯草菌変異株(1cp-P_rapA/pgsBCAcm)とした。
本製造例には、枯草菌及びその改変株の形質転換方法を示した。
製造例3で作製した枯草菌変異株(1cp-P_S237/pgsBCAcm)及び製造例4で作製した枯草菌変異株(1cp-P_rapA/pgsBCAcm)を遺伝子導入の元株として、組換え生産の対照となる組換えDNA断片導入前のプラスミド(pHY300PLK)及び製造例2で作製したPGA合成関連遺伝子発現ベクター(pHY-P_S237/pgsBCA、pHY-P_S237/pgsBA、pHY-P_S237/pgsCA、pHY-P_S237/pgsB、pHY-P_S237/pgsC、pHY-P_S237/pgsA)を用い、プロトプラスト法にて形質転換を行なった。30ppmテトラサイクリン-塩酸塩を添加したDM3プロトプラスト再生培地(DM3培地)上に生育したコロニーをプラスミドが導入された目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。
製造例5で得られた枯草菌形質転換体のうち、1cp-P_S237/pgsBCAcm株を遺伝子導入の元株として、pHY300 PLKを対照に、pHY-P_S237/pgsBCA、pHY-P_S237/pgsBA、pHY-P_S237/pgsBを導入した形質転換体をLBTc寒天培地上に接種し、30℃で一晩静置培養を行なった。この後、LBTc寒天培地上に生育した上記形質転換体を、予め滅菌した2.0mL容微量遠心チューブ内で0.8〜1.6mLの改変2xL/Maltose+MSG培地(以下2xL/Mal+MSG培地、2.0%トリプトン、1.0%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、8.0%グルタミン酸ナトリウム1水和物、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン-塩酸塩)中で攪拌/懸濁し、静置した後の上清液を種培養液とした。この種培養液を新たな2xL/Mal+MSG培地に1%(v/v)接種し、坂口フラスコにて、37℃、120rpm、1日間の往復振盪培養(TB-20R-3F、高崎科学機器)に供した。
評価培養終了後、後述の測定例に示した分析条件にてPGAの分子量を測定し、評価結果を表3に示した。表3に示すように、対照となるpHY300PLKベクターの導入株に対して、pHY-P_S237/pgsBA及びpHY-P_S237/pgsB導入株において、生産されるPGAが高分子化することが明らかとなった。また、その効果はpHY-P_S237/pgsBCA導入株に比べて顕著であった。
製造例5で得られた枯草菌形質転換体のうち、1cp-P_rapA/pgsBCAcm株を遺伝子導入の元株として、pHY300 PLKを対照に、pHY-P_S237/pgsBCA、pHY-P_S237/pgsBA、pHY-P_S237/pgsBを導入した形質転換体を前述の実施例1と同様の生産性評価に供した。
評価培養終了後、実施例1と同様に測定例に示した条件にて分析を行ない、評価結果を表4に示した。表4に示すように、対照となるpHY300PLKベクターの導入株に対して、pHY-P_S237/pgsBA及びpHY-P_S237/pgsB導入株において、生産されるPGAが高分子化することが明らかとなった。また、その効果はpHY-P_S237/pgsBCA導入株に比べて顕著であった。
製造例5で得られた枯草菌形質転換体のうち、1cp-P_S237/pgsBCAcm株を遺伝子導入の元株として、pHY300 PLKを対照に、pHY-P_S237/pgsCA、pHY-P_S237/pgsC、pHY-P_S237/pgsAを導入した形質転換体を前述の実施例1と同様の生産性評価に供した。
評価培養終了後、実施例1と同様に測定例に示した条件にて分析を行ない、評価結果を表5に示した。表5に示すように、対照となるpHY300PLKベクターの導入株に対して、pHY-P_S237/pgsCA、pHY-P_S237/pgsC及びpHY-P_S237/pgsA導入株において、生産されるPGAが低分子化することが明らかとなった。
製造例5で得られた枯草菌形質転換体のうち、1cp-P_rapA/pgsBCAcm株を遺伝子導入の元株として、pHY300 PLKを対照に、pHY-P_S237/pgsCA、pHY-P_S237/pgsC、pHY-P_S237/pgsAを導入した形質転換体を前述の実施例1と同様の生産性評価に供した。
評価培養終了後、実施例1と同様に測定例に示した条件にて分析を行ない、評価結果を表6に示した。表6に示すように、対照となるpHY300PLKベクターの導入株に対して、pHY-P_S237/pgsCA、pHY-P_S237/pgsC及びpHY-P_S237/pgsA導入株において、生産されるPGAが低分子化することが明らかとなった。
実施例1〜4に示した評価培養終了後の培養液試料を、室温にて14,800rpmで30分間遠心分離(himacCF15RX、日立工機)に供し、遠心分離にて得られた培養液上清中の組換えPGA生産量の測定を行なった。TSKGel G4000PWXL及びTSKGel G6000PWXLゲルろ過カラム(東ソー)を用いたHPLC分析を実施した。尚、分析条件は溶離液に0.1M硫酸ナトリウムを使用し、流速1.0mL/分、カラム温度50℃、UV検出波長を210nmとした。また、濃度検定には分子量80万のPGA(明治フードマテリアル)を用いて検量線を作成した。さらに、分子量検定にはプルラン Shodex STANDRD P-82(昭和電工)を用いて予め重量平均分子量を求めた各種分子量の異なるポリグルタミン酸[和光純薬工業(162-21411、162-21401)、SIGMA-ALDRICH(P-4886、P-4761)、明治フードマテリアル(分子量88万)]を用いた。
実施例1〜4(表3〜表6参照)に示した評価終了後の各培養液を、後述の測定例2に示した分析条件にてPGA中の全グルタミン酸量(D-体及びL-体の総和)を求め、これを100%とするL-グルタミン酸量(L-体比率)を測定し、評価結果を表7及び8に示した。
実施例1〜4(表3〜表6参照)に示した評価終了後の各培養液上清に等量の蒸留水を加え、さらにこれに2倍量のエタノールを添加し、4℃にて冷却後、4℃にて3,000rpmで30分間遠心分離(himacCF7D2、日立工機)に供し、遠心分離にて生成した沈殿を回収した。続いて、回収した沈殿生成物を乾固させ、これに6N塩酸を加えて窒素封入し、115〜120℃にて24時間の加熱処理を行なった。加熱処理後、窒素ガス気流下で塩酸及び水分を留去し、これを加水分解物試料とした。続いて、全自動アミノ酸分析計L-8500(商品名、日立計測機器)及びL-グルタミン酸測定キット(ヤマサ醤油)を用いて、上記加水分解物試料のグルタミン酸量(D-体及びL-体の総量)とL-グルタミン酸の定量分析を行なった。全自動アミノ酸分析計による分析において光学活性異性体総量が定量結果として得られ、これよりL-体測定キットから得られた定量結果を差し引いた差分をD-体量とした。
Claims (15)
- 微生物を用いてポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法において、枯草菌におけるpgsBCA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が発現してなる微生物に、枯草菌におけるpgsB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsC遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsC遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を導入することを特徴とするポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
- 上記微生物を用いてポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法において、枯草菌におけるpgsB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又はpgsB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を導入し、ポリ−ガンマ−グルタミン酸を高分子化する、請求項1記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
- 上記微生物を用いてポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法において、枯草菌における枯草菌におけるpgsC若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又はpgsC遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を導入し、ポリ−ガンマ−グルタミン酸を低分子化する、請求項1記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
- pgsB遺伝子が以下の(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードする遺伝子である請求項1又は2記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号2で示されるアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。 - pgsC遺伝子が以下の(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードする遺伝子である請求項1、3又は4記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsBタンパク質の共存下でポリ−ガンマ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質
(c)配列番号4で示されるアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、PgsBタンパク質の共存下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子 - pgsA遺伝子が以下の(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードする遺伝子である請求項1〜5の何れか1項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
(a)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、PgsB及びPgsCタンパク質との共存下でポリ−ガンマ−グルタミン酸合成能を有するタンパク質
(c)配列番号6で示されるアミノ酸配列と30%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、PgsB及びPgsCとの共存下でPGA合成能を有するタンパク質をコードする遺伝子。 - 上記導入される遺伝子が、上記微生物の宿主細胞内で自己複製可能なプラスミド(ベクター)に組み込まれている請求項1〜6の何れか1項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
- 上記導入される遺伝子が、その上流に、微生物において機能を有する転写開始制御領域及び/又は翻訳開始制御領域を有する請求項1〜7の何れか1項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
- 微生物がバチルス(Bacillus)属細菌である請求項1〜8の何れか1項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
- バチルス(Bacillus)属細菌が枯草菌(Bacillus subtilis)である請求項9記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法。
- 微生物を用いてポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法において、枯草菌におけるpgsBCA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が発現してなる微生物に、枯草菌におけるpgsB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsC遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子及びpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsB遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsC遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子、又は枯草菌におけるpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を導入することを特徴とするポリ−ガンマ−グルタミン酸のL‐体比率調整方法。
- 請求項1〜10の何れか1項記載の微生物を用いることを特徴とするポリ−ガンマ−グルタミン酸のL‐体比率調整方法。
- 請求項1〜10の何れか1項記載の微生物を培養し、生成されたポリ−ガンマ−グルタミン酸を取得することを特徴とするポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
- 請求項1〜10の何れか1項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量調整方法又は請求項11又は12記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸のL‐体比率調整方法を用いて、生成されたポリ−ガンマ−グルタミン酸を取得することを特徴とするポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
- ポリ−ガンマ−グルタミン酸合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌におけるpgsBCA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が発現してなる微生物に、枯草菌におけるpgsA遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入して得られる組換え微生物。
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- 2009-03-17 JP JP2009064563A patent/JP5669361B2/ja active Active
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