JP2010190575A - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光するとき、レーザ光源部から出射するレーザ光を強度変調するための変調信号を生成し、この変調信号を用いてレーザ光を変調する。このレーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を取得し、この蛍光信号から、変調信号に対する蛍光の位相遅れを算出する。その際、位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、変調信号の周波数を制御する。この制御が整定したときの変調信号の周波数の条件で得られる位相遅れを用いて、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時間を算出する。
【選択図】 図2
Description
このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のDNA、RNA、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。
これの使用においては、より多くの測定対象物を、短時間に正確に蛍光の情報から特定することが要求されている。
当該文献によると、レーザ光を強度変調して測定対象物に照射し、測定対象物からの蛍光の蛍光信号の、レーザ光の強度変調に用いた変調信号に対する位相遅れを求め、この位相遅れから、蛍光緩和時間を算出することが記載されている。
すなわち、蛍光検出装置は、
(A)測定対象物に照射するレーザ光を強度変調して出射する光源部と、
(B)レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、
前記光源部から出射するレーザ光を強度変調するための変調信号を生成する光源制御部と、
(C)前記受光部で出力された蛍光信号から、前記変調信号に対する蛍光の位相遅れを算出し、この位相遅れを用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出する処理部と、
(D)前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数を制御する信号制御部と、を有する。
そのとき、前記信号制御部は、前記サンプル粒子のレーザ測定場の通過の開始直後に、前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数の制御を開始し、前記サンプル粒子の前記レーザ測定場の通過終了前に、設定された時点での前記位相遅れと前記変調信号の周波数から前記蛍光緩和時間を算出することが好ましい。
そのとき、前記信号制御部は、前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数の制御を行って、前記制御が整定したときの前記位相遅れと前記変調信号の周波数から前記蛍光緩和時間を算出することも、同様に好ましい。
すなわち、蛍光検出方法は、
(E)レーザ光源部から出射するレーザ光を強度変調するための変調信号を生成し、この変調信号を用いてレーザ光を変調するステップと、
(F)このレーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を取得するステップと、
(G)前記蛍光信号から、前記変調信号に対する蛍光の位相遅れを算出するステップと、
(H)前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数を制御するステップと、
(I)前記制御が整定したときの前記変調信号の周波数の条件で得られる位相遅れを用いて、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップと、を有する。
そのとき、前記サンプル粒子のレーザ測定場の通過の開始直後に、前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数の制御を開始し、前記サンプル粒子の前記レーザ測定場の通過終了前に、設定された時点での前記位相遅れと前記変調信号の周波数から前記蛍光緩和時間を算出することが好ましい。
そのとき、前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数の制御を行って、前記制御が整定したときの前記位相遅れと前記変調信号の周波数から前記蛍光緩和時間を算出することも、同様に好ましい。
特に、予め設定された値を45度にすることにより、変調信号の周波数に対する位相遅れの感度の高いところで位相遅れが算出されるので、精度の高い蛍光緩和時間を算出することができる。
図1は、本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ10の概略構成図である。図2は、フローサイトメータ10の信号の流れを中心に示す図である。
フローサイトメータ10は、主に、レーザ光源部22と、受光部24、26と、制御・信号処理部28と、データ処理部(コンピュータ)30と、管路32と、回収容器34と、を有する。
レーザ光源部22は、所定の波長のレーザ光を強度が一定のCW(連続波)レーザ光として出射し、かつこのCWレーザ光の強度を周波数で変調しながら出射するレーザ光源22aと、レーザ光を管路30中の所定の測定点(測定場)に集束させるレンズ系22b(図2参照)と、レーザ光源を駆動する、レーザドライバ22c(図2参照)と、を有して構成される。レーザ光源部22は、1つのレーザ光源からなる装置構成であるが、本発明では、1つのレーザ光源に限定されない。複数のレーザ光源を用いることもできる。この場合、複数のレーザ光源からのレーザ光を、ダイクロイックミラー等を用いて合成して、測定場に向けて出射されるレーザ光を形成することが好ましい。
光電変換器24aは、管路32を挟んでレーザ光源部22と対向するように配置されており、測定場を通過する試料12によって前方散乱するレーザ光を受光することにより、試料12が測定点を通過する旨の検出信号を出力する。
遮蔽板24cは、レーザ光が光電変換器24aに直接入射しないようにレンズ系24bの前面に設けられたものである。この受光部24から出力される信号は、制御・信号処理部28およびデータ処理部30に供給され、制御・信号処理部28およびデータ処理部30において試料12が管路32中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号、測定終了のOFF信号として用いられる。
レンズ系26bは、受光部26に入射した蛍光を光電変換器26aの受光面に集束させるように構成されている。バンドパスフィルタ26cは、フィルタリングして光電変換器26aで所定の波長帯域の蛍光が取り込まれるように、透過波長帯域が設定されている。
受光部26は、1つの光電変換器26aを有するが、本発明では、受光部26は、複数の光電変換器を有することもできる。この場合、ダイクロイックミラーをバンドパスフィラー26cの前に設けて、蛍光を周波数帯域別に分け、この分けた蛍光を光電変換器それぞれが受光するように構成することができる。
光電変換器26aは、例えば光電子増倍管をセンサとして備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は、レーザ光の強度変調と同様に、強度変調して発する蛍光であるので、出力される蛍光信号はレーザ光の強度変調の周波数と同じ周波数を持った信号となる。この蛍光信号は、制御・信号処理部28に供給される。
変調信号制御部40は、レーザ光の強度変調のための変調信号を生成し、レーザドライバ22cに供給するとともに、生成した変調信号を信号処理部42に供給する部分である。
変調信号制御部40は、周波数可変発振器40aと、パワースプリッタ40bと、増幅器40c,40dと、DC信号発生器40eと、周波数カウンタ40fとを有する。
パワースプリッタ40bは、発振した変調信号を均等に分配する部分で、増幅器40cと増幅器40dにそれぞれ供給する。
増幅器40cは、変調信号を増幅してレーザドライバ22cに供給する。増幅器40dは、後述する信号処理部42に供給する。周波数変換部42に変調信号を供給するのは、受光部26から出力された蛍光信号の、変調信号に対する位相遅れを算出するために、参照信号として用いるためである。
周波数カウンタ40fは、周波数可変発振器40aにて発振した変調信号の周波数をカウントする部分である。周波数カウンタ40fのカウント結果は、データ処理部30に供給される。
周波数可変発振器40aとDC信号発生器40eは、それぞれ、データ処理部30と接続されており、データ処理部30からの制御信号により、変調信号の周波数およびDC成分の信号レベルが制御されている。
可変増幅器42aは、蛍光信号を増幅する部分である。可変増幅器42aは、データ処理部30と接続され、データ処理部30からの制御信号に従ってゲインが制御されている。
IQミキサ42bは、90度位相シフタ42d(図2参照)と、ミキサ42e(図2参照),42f(図2参照)を有する。90度位相シフタ42dにより、変調信号と位相が90度ずれた信号が生成され、位相が同相の変調信号と位相が90度ずれた変調信号がそれぞれミキサ42e、42fに供給される。
ミキサ42e,42fでは、供給された位相が同相の変調信号と位相が90度ずれた変調信号を参照信号とし、増幅された蛍光信号とミキシング処理を行う部分である。ミキシングされた蛍光信号は、ローパスフィルタ42cに供給される。
ローパスフィルタ42cは、ミキシングされた蛍光信号から、変調信号より低い所定の周波数領域の信号をろ過し、低周波信号を取り出す部分である。これにより、周波数0領域の信号成分を主成分とする、蛍光信号のRe成分とIm成分が求められる。求められたRe成分とIm成分は、AD変換部44に供給される。
より詳しく説明すると、算出された蛍光強度信号の値が、予め設定された強度範囲に入るまで、DC信号発生器40eで生成するDC成分のレベル、あるいは可変増幅器42aのゲインの調整を行うための制御信号を生成することで、AD変換器44bで行うRe成分とIm成分の信号レベルを調整する。さらに、算出された位相遅れθの値が、予め設定された値に近づくように、周波数可変発振器40aで生成する変調信号の周波数を調整するための制御信号を生成することで、変調信号を制御する。予め設定された値は、後述する図5(a)に示すグラフから、角周波数変化に対する位相遅れθの変化の値を大きくとることのできる25〜65度に設定することができる。この中で特に45度とするのが好ましい。予め設定された値に近づくとは、変調信号の制御の前と後では、制御後の位相遅れθの値は、制御前の位相遅れθの値に比べて予め設定された値に近いことを意味する。位相遅れθの値は、この制御により予め設定された目標とする値に近づくが、この目標とする値に対して、予め設定された許容範囲内で収束することが好ましい。許容範囲は、目標とする蛍光緩和時間の算出しようとする精度にも依存するが、例えば、±10度、±5度あるいは±2度である。位相遅れθの値が、目標とする値に対して予め設定された許容範囲内に入るとき、制御は整定された状態となる。
位相遅れ算出部30cと蛍光緩和時間算出部30eは、少なくとも、本発明における、蛍光信号から、変調信号に対する蛍光の位相遅れを算出し、この位相遅れを用いて試料12の蛍光の蛍光緩和時間を算出する処理部に対応する。
なお、蛍光強度信号は、試料12がレーザ光の測定場を通過する期間に連続して供給されるRe成分データとIm成分データを用いて算出される時系列データである。
補正に用いるレーザ光のDC成分は、制御信号が与える信号値でもよいし、受光部24で計測された前方散乱光の強度を用いることもできる。可変増幅器42aのゲインは、制御信号が与える信号値でもよいし、ゲインを別途計測した結果の値を用いることもできる。
信号制御部30dから受ける決定指示は、蛍光強度信号生成部30aで生成される制御中の蛍光強度信号の値が予め設定された範囲を定める設定値を超えて最大値になったときに出される。このときの蛍光強度信号の値を制御信号の値で除算することにより、蛍光強度が得られる。
蛍光強度信号の値は、予め設定された強度範囲に入るように、DC信号発生器40eで生成するDC成分のレベルおよび可変増幅器42aのゲインの調整(操作量の調整)を行うが、試料12が測定場を通過する後半部は、蛍光強度信号が弱くなる。このとき、DC信号発生器40eで生成するDC成分のレベルおよび可変増幅器42aのゲインの調整(操作量の調整)では、操作量を最大にしても目標値に達しない。一方、試料12が測定場を通過する前半部〜中間部の段階では、蛍光強度信号が徐々に強くなるので、この段階において蛍光強度信号が予め設定された範囲に一旦入ると、操作量は調整されず一定となる。このとき、蛍光強度信号の値は、上記範囲を定める設定値を超えて最大値になる。このときの蛍光強度信号を、このときの制御信号の値で定まる係数で除算することにより、補正した蛍光強度を求める。
蛍光強度信号の補正は、上記方法による値の算出の他に、制御中の蛍光強度信号の値を制御信号の値で定まる係数で除算した値を制御時間中積算し、この積算値を制御時間で除算した値を、蛍光強度とすることもできる。
位相遅れ算出部30cは、供給されたRe成分データとIm成分データを用いてtan-1(Im/Re)(ImはIm成分データの値、ReはRe成分データの値である)を算出することで、位相遅れθを算出する部分である。算出された位相遅れθは信号制御部30dに供給される。また、蛍光緩和時間算出部30eに供給される。
すなわち、信号制御部30dは、位相遅れθの値が予め設定された値、例えば45度に近づくように、変調信号の周波数を制御する部分である。信号制御部30dは、位相遅れθの値が予め設定された値に近づくように、周波数可変発振器40aの発振周波数を調整する制御信号を生成し、周波数可変発振器40aに供給する。これにより、レーザドライバ22cに周波数の調整された変調信号が供給され、レーザ光の強度変調は調整される。
信号制御部30dで、位相遅れθの値が設定された許容範囲内で45度に一致する場合、後述する蛍光強度信号の値の判定結果に応じて、精度の高い位相遅れθが得られたと判定する。
判定結果、蛍光強度信号の値が設定された範囲に入らない場合、DC信号発生器40eのDC成分の信号レベルを調整する制御信号を生成し、DC信号発生器40eに供給する。これにより、レーザドライバ22cにDC成分の信号レベル調整された変調信号が供給され、レーザ光の強度変調は調整される。これにより、レーザドライバ22cにDC成分の信号レベルの調整された変調信号が供給される。また、受光部26a直後に設けられた可変増幅器42aのゲインを調整する制御信号を生成し、可変増幅器42aのゲインを制御する。
本発明では、DC信号発生器40eの変調信号の制御と可変増幅器26aのゲインの制御を行うが、本発明では、いずれか一方の制御であってもよい。
信号制御部30dは、蛍光強度信号の値が設定された範囲に入り、かつ、位相遅れθが予め設定された範囲に入る場合、精度の高い位相遅れθが得られたと判定し、蛍光強度算出部30b及び蛍光緩和時間算出部30eに、蛍光強度の算出と蛍光緩和時間の算出の決定指示をする。
図5(a)には、レーザ光の強度変調の周波数(角周波数2πf)とそのときの蛍光の位相遅れθとの関係を、種々の蛍光緩和時間τに関して示している。
位相遅れθが45度で角周波数2πfに対する位相遅れθの角度変化が最大となる。すなわち、角度45度で位相遅れθの感度が高くなっている。したがって、位相遅れθが目標値である45度に近づくように変調信号の周波数を制御することにより、感度の高い位置で位相遅れθを算出することができる。すなわち、精度の高い位相遅れθを算出することができる。
さらに、データ処理部30からの制御信号に基づいて変調信号の周波数が設定される。例えば周波数がデフォルト設定される。以上の設定されたDC成分の信号レベル及びゲインと変調信号の周波数とを用いて変調信号を生成し、レーザ光源22aから強度変調されたレーザ光が出射される(ステップS12)。
次に、可変増幅器42aで設定されたゲインで増幅され、ミキサ42d,42eに供給され、ミキシングされて、Re成分およびIm成分が求められ、さらに、AD変換部44でデジタル信号に変換され、Re成分データおよびIm成分データが得られる(ステップS16)。
次に、信号制御部30dでは、算出された位相遅れθが、予め設定された目標値である45度に許容範囲内で一致するか否かが判定される(ステップS20)。ここで、位相遅れθが許容範囲内で目標値に一致しない場合、変調信号の周波数は変更する制御信号が生成され、周波数可変発振器40aに供給される。こうして、変調信号の周波数が変更される(ステップS22)。ここで、周波数の変更は、算出された位相遅れθを用いて、周波数f=2πf1/tan(θ)(f1は、現在設定されている変調信号の周波数)となるように行われる。
こうして、位相遅れθが設定された目標値に近づくように、ステップS10〜S22を繰り返す。
蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入らない場合(Noの場合)、変調信号に用いるDC成分の信号レベルとゲインが変更され(ステップS28)、ステップ10に戻される。
こうして、蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るまで、ステップS10〜S24及びステップS28が繰り返される。
算出された計測結果は、DC成分の信号レベル、ゲイン、変調信号の周波数等の情報とともに、図示されないディスプレイあるいはプリンタ等の出力装置に出力される。
サンプル粒子がレーザ光の測定場を通過する時間は、10〜30μ秒程度であり、この時間内に、周波数可変発振器40aを十分に制御することは可能である。
すなわち、信号制御部30は、位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、変調信号の周波数の制御を行い、この制御が整定したときの位相遅れと変調信号の周波数から蛍光緩和時間を算出する。この周波数の制御のとき、同時に、蛍光強度信号が予め設定された範囲に入るDC成分の信号レベルおよびゲインを見出すように、DC成分の信号レベルおよびゲインが制御される。
特に、予め設定された値を45度とすることにより、変調信号の周波数に対する位相遅れの感度の高いところで位相遅れが算出されるので、精度の高い蛍光緩和時間を算出することができる。
上記説明では、いずれも位相遅れと蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るように調整されるが、蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るか否かを判定することなく、位相遅れが予め設定された範囲に入るか否かのみを判定することもできる。
12 試料
22 レーザ光源部
22a レーザ光源
22b,24b,26b レンズ系
22c レーザドライバ
24,26 受光部
24a,26a 光電変換機
26c 遮蔽板
28 制御・信号処理部
30 データ処理部(コンピュータ)
30a 蛍光強度信号生成部
30b 蛍光強度算出部
30c 位相遅れ算出部
30d 信号制御部
30e 蛍光緩和時間算出部
32 管路
34 回収容器
40 変調信号制御部
40a 周波数可変発振器
40b パワースプリッタ
40c,40d,44a 増幅器
40e DC信号発生器
42 周波数変換部
42a 可変増幅器
42b IQミキサ
42c ローパスフィルタ
42d 90度位相シフタ
42e,42f ミキサ
44 AD変換部
44b AD変換器
Claims (8)
- 測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
測定対象物に照射するレーザ光を強度変調して出射する光源部と、
レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、
前記光源部から出射するレーザ光を強度変調するための変調信号を生成する光源制御部と、
前記受光部で出力された蛍光信号から、前記変調信号に対する、測定対象物が発する蛍光の位相遅れを算出し、この位相遅れを用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出する処理部と、
前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数を制御する信号制御部と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。 - 前記予め設定された値は、45度である、請求項1に記載の蛍光検出装置。
- 測定対象物は複数のサンプル粒子で構成され、このサンプル粒子はレーザ光による測定場を一定速度で1つずつ断続的に通過し、
前記信号制御部は、前記サンプル粒子のレーザ光の測定場の通過の開始直後に、前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数の制御を開始し、前記サンプル粒子の前記レーザ光の測定場の通過終了前に、設定された時点での前記位相遅れと前記変調信号の周波数から前記蛍光緩和時間を算出する、請求項1または2に記載の蛍光検出装置。 - 前記測定対象物は、一定の容器に収容され、静止した状態で、レーザ光の照射を受け、
前記信号制御部は、前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数の制御を行って、前記制御が整定したときの前記位相遅れと前記変調信号の周波数から前記蛍光緩和時間を算出する、請求項1または2に記載の蛍光検出装置。 - 測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法であって、
レーザ光源部から出射するレーザ光を強度変調するための変調信号を生成し、この変調信号を用いてレーザ光を変調するステップと、
このレーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を取得するステップと、
前記蛍光信号から、前記変調信号に対する蛍光の位相遅れを算出するステップと、
前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数を制御するステップと、
前記制御が整定したときの前記変調信号の周波数の条件で得られる位相遅れを用いて、測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。 - 前記予め設定された値は、45度である、請求項5に記載の蛍光検出方法。
- 測定対象物は複数のサンプル粒子で構成され、このサンプル粒子はレーザ光による測定場を一定速度で1つずつ断続的に通過し、
前記サンプル粒子のレーザ光の測定場の通過の開始直後に、前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数の制御を開始し、前記サンプル粒子の前記レーザ光の測定場の通過終了前に、設定された時点での前記位相遅れと前記変調信号の周波数から前記蛍光緩和時間を算出する、請求項5または6に記載の蛍光検出方法。 - 前記測定対象物は、一定の容器に収容され、静止した状態で、レーザ光の照射を受け、
前記位相遅れの値が予め設定された値に近づくように、前記変調信号の周波数の制御を行って、前記制御が整定したときの前記位相遅れと前記変調信号の周波数から前記蛍光緩和時間を算出する、請求項5または6に記載の蛍光検出方法。
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