KR20110118716A - 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법 - Google Patents

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KR1020117021110A
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시게유키 나카다
쿄우지 도이
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미쯔이 죠센 가부시키가이샤
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Abstract

레이저광의 조사(照射)를 받는 것에 의하여 측정 대상물이 발하는 형광을 수광(受光)할 때, 형광 검출 장치는, 레이저 광원부로부터 출사(出射)하는 레이저광을 강도 변조하기 위한 변조 신호를 생성하고, 이 변조 신호를 이용하여 레이저광을 변조한다. 형광 검출 장치는, 이 레이저광이 조사된 측정 대상물로부터 발하는 형광의 형광 신호를 취득하고, 이 형광 신호로부터, 변조 신호에 대한 형광의 위상 지연을 산출한다. 그 때, 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 형광 검출 장치는, 변조 신호의 주파수를 제어한다. 이 제어가 정정(整定)되었을 때의 변조 신호의 주파수의 조건에서 얻어지는 위상 지연을 이용하여, 형광 검출 장치는, 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 완화 시간을 산출한다.

Description

형광 검출 장치 및 형광 검출 방법{FLUORESCENCE DETECTION DEVICE AND FLUORESCENCE DETECTION METHOD}
본 발명은, 레이저광의 조사(照射)를 받은 측정 대상물이 발하는 형광을 수광(受光)하는 것에 의하여 얻어지는 형광 신호의 신호 처리를 행하는 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 관한 것이다.
의료, 생물 분야에서 이용되는 플로우 사이토미터(flow cytometer)에는, 레이저광을 조사하는 것에 의하여 측정 대상물의 형광 색소로부터의 형광을 수광하여, 측정 대상물의 종류를 식별하는 형광 검출 장치가 끼워 넣어져 있다.
구체적으로는, 플로우 사이토미터는, 현탁액(懸濁液) 중의 세포, DNA, RNA, 효소, 단백 등의 생체 물질을 형광 시약으로 라벨화하고, 압력을 주어 매초 10m이내 정도의 속도로 관로(管路) 내를 흐르는 시스액(sheath fluid)에 측정 대상물을 흐르게 한다. 이것에 의하여, 라미나 시스 플로우(laminar sheath flow)가 형성된다. 이 플로우 중의 측정 대상물에 레이저광을 조사하는 것에 의하여, 측정 대상물에 부착한 형광 색소가 발하는 형광을 수광하여, 이 형광을 라벨로서 식별하는 것으로 측정 대상물을 특정한다.
이 플로우 사이토미터는, 예를 들어, 세포 내의 DNA, RNA, 효소, 단백질 등의 세포 내 상대량을 계측하고, 또한 이들의 작용을 단시간에 해석할 수 있다. 또한, 특정의 타입의 세포나 염색체를 형광에 의하여 특정하고, 특정한 세포나 염색체만을 산 상태로 단시간에 선별 수집하는 셀·소터(cell·sorter) 등이 이용된다.
이것의 사용에 있어서는, 보다 많은 측정 대상물을, 단시간에 정확하게 형광의 정보로부터 특정하는 것이 요구되고 있다.
하기 특허 문헌 1에는, 레이저광의 조사에 의한 측정 대상물로부터 발하여지는 형광의 형광 수명(형광 완화 시간)을 산출하는 것으로, 많은 측정 대상물을, 단시간에 정확하게 특정할 수 있는 형광 검출 장치 및 방법이 기재되어 있다.
당해 문헌에 의하면, 레이저광을 강도 변조하여 측정 대상물에 조사하고, 측정 대상물로부터의 형광의 형광 신호의, 레이저광의 강도 변조에 이용한 변조 신호에 대한 위상 지연을 구하여, 이 위상 지연으로부터, 형광 완화 시간을 산출하는 것이 기재되어 있다.
일본국 공개특허공보 특개2006－226698호
이 장치 및 방법에서는, 형광 완화 시간을 정도(精度) 높게 단시간에 구할 수 있지만, 형광 완화 시간을 일정한 정도로 구할 수 있는 범위(형광 완화 시간의 값의 범위)는, 한정된 범위로 되어 있었다. 이것은, 위상 지연이 형광 완화 시간에 주는 기여가 일정하지 않고 비선형으로 변화하는 것에 의한 것이다. 즉, 위상 지연의 값에 의하여, 형광 완화 시간의 산출 정도가 크게 변화한다.　또한, 각 구성 장치의 변동 오차 등에 의하여 위상 지연이 변화하여 형광 완화 시간이 크게 변화하는 경우도 있다. 이 때문에, 형광 완화 시간을 일정한 정도로 산출할 수 없다고 하는 문제가 있다.
그래서, 본 발명은, 상기 문제점을 해결하기 위하여, 형광 완화 시간을, 광범위하고 일정한 정도로, 나아가, 정도 높게 산출할 수 있는 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양(態樣)은, 레이저광의 조사를 받은 측정 대상물이 발하는 형광을 수광하는 것에 의하여 얻어지는 형광 신호의 신호 처리를 행하는 형광 검출 장치이다.
당해 장치는,
측정 대상물에 조사하는 레이저광을 강도 변조하여 출사하는 광원부와,
레이저광이 조사된 측정 대상물로부터 발하는 형광의 형광 신호를 출력하는 수광부와,
상기 광원부로부터 출사하는 레이저광을 강도 변조하기 위한 변조 신호를 생성하는 광원 제어부와,
상기 수광부에서 출력된 형광 신호로부터, 상기 변조 신호에 대한, 측정 대상물이 발하는 형광의 위상 지연을 산출하고, 상기 위상 지연을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 산출하는 처리부와,
상기 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 상기 변조 신호의 주파수를 제어하는 신호 제어부를 가진다.
본 발명의 다른 일 태양은, 레이저광의 조사를 받은 측정 대상물이 발하는 형광을 수광하는 것에 의하여 얻어지는 형광 신호의 신호 처리를 행하는 형광 검출 방법이다.
당해 형광 검출 방법은,
레이저 광원부로부터 출사하는 레이저광을 강도 변조하기 위한 변조 신호를 생성하고, 상기 변조 신호를 이용하여 레이저광을 변조하는 스텝과,
상기 레이저광이 조사된 측정 대상물로부터 발하는 형광의 형광 신호를 취득하는 스텝과,
상기 형광 신호로부터, 상기 변조 신호에 대한 형광의 위상 지연을 산출하는 스텝과,
상기 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 상기 변조 신호의 주파수를 제어하는 스텝과,
상기 제어가 정정(整定: 변화가 없이 안정됨(settle))되었을 때의 상기 변조 신호의 주파수의 조건에서 얻어지는 위상 지연을 이용하여, 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 완화 시간을 산출하는 스텝을 가진다.
상술의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법은, 형광 완화 시간을 산출할 때, 위상 지연이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 레이저광의 변조 신호의 주파수를 조정하는 것에 의하여, 위상 지연이 형광 완화 시간에 주는 비선형의 기여를 일정하게 할 수 있다. 이 때문에, 일정한 정도로 형광 완화 시간을 산출할 수 있는 범위를 넓힐 수 있다. 예를 들어, 형광이 1차 지연의 완화 응답에 따르는 경우, 비선형의 부분인 tanθ(θ를 위상 지연으로 한다)를 형광 완화 시간에 한정하지 않고 대략 일정한 값으로 할 수 있기 때문에, 위상 지연 θ가 큰 경우와 작은 경우에서 tanθ의 기여가 크게 달라, 정도가 변화하는 것을 방지할 수 있다.
특히, 미리 설정된 값을 45도로 하는 것에 의하여, 변조 신호의 주파수에 대한 위상 지연의 감도가 높은 곳에서 위상 지연이 산출되기 때문에, 정도가 높은 형광 완화 시간을 산출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 형광 검출 장치를 이용한 플로우 사이토미터의 개략 구성도이다.
도 2는 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터의 신호의 흐름을 중심으로 도시하는 도면이다.
도 3은 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터의 제어·신호 처리부의 개략의 구성을 도시하는 도면이다.
도 4는 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터의 데이터 처리부의 개략의 구성을 도시하는 도면이다.
도 5의 (a) 및 (b)는, 본 발명의 형광 검출 장치 및 위상 검출 방법에서 이용하는 위상 지연 θ의 조정에 의한 효과를 설명하는 도면이다.
도 6은 본 발명의 형광 검출 방법의 일 실시예의 플로우를 설명하는 도면이다.
이하, 본 발명의 형광 검출 장치를 호적하게 이용한 플로우 사이토미터를 기초로 상세하게 설명한다.
도 1은, 본 발명의 형광 검출 장치를 이용한 플로우 사이토미터(10)의 개략 구성도이다. 도 2는, 플로우 사이토미터(10)의 신호의 흐름을 중심으로 도시하는 도면이다.
플로우 사이토미터(10)는, 주로, 레이저 광원부(22)와 수광부(24, 26)와 제어·신호 처리부(28)와 데이터 처리부(컴퓨터)(30)와 관로(32)와 회수 용기(34)를 가진다.
레이저 광원부(22)는, 350nm ~ 800nm의 가시광 대역의 파장을 가지고, 제어된 변조 신호에 의하여 강도 변조된 레이저광을 출사한다. 변조 신호는, 변조하는 주파수와 DC 성분의 신호 레벨이 제어되고 있다.
레이저 광원부(22)는, 레이저 광원(22a)과 렌즈계(22b)(도 2 참조)와 레이저 드라이버(22c)(도 2 참조)를 가진다. 레이저 광원(22a)은, 소정의 파장의 레이저광을 강도가 일정한 CW(연속파) 레이저광으로서 출사하고, 또한 이 CW레이저광의 강도를 주파수로 변조하면서 출사한다. 렌즈계(22b)는, 레이저광을 관로(30) 중의 소정의 측정점(측정장)에 집속시킨다. 레이저 드라이버(22c)는, 레이저 광원을 구동한다. 레이저 광원부(22)는, 1개의 레이저 광원으로 구성되지만, 1개의 레이저 광원으로 한정되지 않는다. 레이저 광원부(22)는, 복수의 레이저 광원을 이용할 수도 있다. 이 경우, 복수의 레이저 광원으로부터의 레이저광을, 다이크로익 미러(Dichroic mirror) 등을 이용하여 합성하고, 측정장을 향하게 하여 출사되는 레이저광을 형성하는 것이 바람직하다.
레이저광을 출사하는 광원으로서 예를 들어 반도체 레이저가 이용된다. 레이저광은, 예를 들어 5 ~ 100mW 정도의 출력이다. 한편, 레이저광의 강도를 변조하는 주파수(변조 주파수)는, 그 주기가 형광 완화 시간에 비하여 약간 길며, 예를 들어 10 ~ 200MHz이다.
광원부(22)에 설치되는 레이저 드라이버(22c)는, 레이저광의 강도의 DC 성분의 레벨 및 강도 변조의 주파수가 제어되도록 구성되어 있다. 즉, 레이저광의 강도는, DC 성분에 강도 변조가 더하여진 강도 변화를 나타내며, 최저 강도는 0보다 커지고 있다.
수광부(24)는, 광전 변환기(24a)(도 2 참조)와, 광전 변환기(24a)로 전방(前方) 산란광을 수속(收束)시키는 렌즈계(24b)(도 2 참조)와, 차폐판(遮蔽板, 24c)(도 2 참조)을 가진다.
광전 변환기(24a)는, 관로(32)를 사이에 두고 레이저 광원부(22)와 대향하도록 배치되어 있고, 측정장을 통과하는 시료(12)에 의하여 전방 산란하는 레이저광을 수광하는 것에 의하여, 시료(12)가 측정점을 통과하는 취지의 검출 신호를 출력한다.
차폐판(24c)은, 레이저광이 광전 변환기(24a)로 직접 입사(入射)하지 않도록 렌즈계(24b)의 전면(前面)에 설치되어 있다. 이 수광부(24)로부터 출력되는 신호는, 제어·신호 처리부(28) 및 데이터 처리부(30)로 공급되며, 제어·신호 처리부(28) 및 데이터 처리부(30)에 있어서 시료(12)가 관로(32) 중의 측정점을 통과하는 타이밍을 알리는 트리거 신호, 측정 종료의 OFF 신호로서 이용된다.
한편, 수광부(26)는, 레이저 광원부(22)로부터 출사되는 레이저광의 출사 방향에 대하여 수직 방향이고, 또한 관로(32) 중의 시료(12)의 이동 방향에 대하여 수직 방향으로 배치되어 있으며, 측정점에서 조사된 시료(12)가 발하는 형광을 수광하는 광전 변환기(26a)(도 2 참조)를 구비하고 있다.
수광부(26)는, 광전 변환기(26a) 외에, 시료(12)로부터의 형광 신호를 집속시키는 렌즈계(26b)(도 2 참조)와, 밴드 패스 필터(band-pass filter, 26c)(도 2 참조)를 가진다.
렌즈계(26b)는, 수광부(26)로 입사한 형광을 광전 변환기(26a)의 수광면에 집속시키도록 구성되어 있다. 밴드 패스 필터(26c)는, 필터링하여 광전 변환기(26a)로 소정의 파장 대역의 형광이 받아들여지도록, 투과 파장 대역이 설정되어 있다.
수광부(26)는, 1개의 광전 변환기(26a)를 가지지만, 본 실시예에서는, 수광부(26)는, 복수의 광전 변환기를 가질 수도 있다. 이 경우, 다이크로익 미러를 밴드 패스 필러(26c)의 앞에 설치하여, 형광을 주파수 대역별로 나누고, 이 나눈 형광을 광전 변환기 각각이 수광하도록 구성할 수 있다.
밴드 패스 필터(26c)는, 각 광전 변환기(26a)의 수광면의 전면에 설치되어, 소정의 파장 대역의 형광만이 투과하는 필터이다. 투과하는 형광의 파장 대역은, 형광 색소가 발하는 형광의 파장 대역에 대응하여 설정된다.
광전 변환기(26a)는, 예를 들어 광전자 증배관을 센서로서 구비한다. 광전 변환기(26a)는, 광전면에서 수광한 광을 전기 신호로 변환한다. 여기서, 수광하는 형광은, 레이저광의 강도 변조와 마찬가지로, 강도 변조하여 발하는 형광이기 때문에, 출력되는 형광 신호는 레이저광의 강도 변조의 주파수와 같은 주파수를 가진 신호로 된다. 이 형광 신호는, 제어·신호 처리부(28)로 공급된다.
도 3은, 제어·신호 처리부(28)의 구성을 도시하는 도면이다. 제어·신호 처리부(28)는, 변조 신호 제어부(40)와 주파수 변환부(42)와 AD 변환부(44)를 가진다.
　변조 신호 제어부(40)는, 레이저광의 강도 변조를 위한 변조 신호를 생성하여, 레이저 드라이버(22c)로 공급한다. 나아가, 변조 신호 제어부(40)는, 생성한 변조 신호를 주파수 변환부(42)로 공급한다.
변조 신호 제어부(40)는, 주파수 가변 발진기(40a)와 파워 스플리터(40b)와 증폭기(40c, 40d)와 DC 신호 발생기(40e)와 주파수 카운터(40f)를 가진다.
주파수 가변 발진기(40a)는, 데이터 처리부(30)로부터의 제어 신호에 따라 정해진 주파수로 발진하여, 변조 신호를 생성한다. 주파수 가변 발진기(40a)에는, 예를 들어, 전압 제어 발생기가 호적하게 이용된다.
파워 스플리터(40b)는, 발진한 변조 신호를 균등하게 분배하는 부분이며, 증폭기(40c, 40d)로 각각 공급한다.
증폭기(40c)는, 변조 신호를 증폭하여 레이저 드라이버(22c)로 공급한다. 증폭기(40d)는, 후술하는 주파수 변환부(42)로 공급한다. 주파수 변환부(42)로 변조 신호를 공급하는 것은, 수광부(26)로부터 출력된 형광 신호의, 변조 신호에 대한 위상 지연을 산출하기 위하여, 참조 신호로서 이용하기 위함이다.
DC 신호 발생기(40e)는, 변조 신호의 DC 성분을 생성하여 레이저 드라이버(22c)로 공급한다. DC 성분의 레이저 드라이버(22c)로의 공급은, 레이저광의 강도를 조정하는 것으로, 시료(12)가 발하는 형광의 강도를 소정의 강도가 되도록 조정하여, 정도가 높은 위상 지연의 값, 나아가서는 정도가 높은 형광 완화 시간을 산출하기 위함이다. 즉, 레이저광의 강도는, DC 성분에 강도 변조가 더하여진 강도 변화를 나타내며, 최저 강도는 0보다 커지도록 하기 위함이다.
주파수 카운터(40f)는, 주파수 가변 발진기(40a)에서 발진한 변조 신호의 주파수를 카운트한다. 주파수 카운터(40f)의 카운트 결과는, 데이터 처리부(30)로 공급된다.
주파수 가변 발진기(40a)와 DC 신호 발생기(40e)는, 각각, 데이터 처리부(30)와 접속되어 있어, 데이터 처리부(30)로부터의 제어 신호에 의하여, 변조 신호의 주파수 및 DC 성분의 신호 레벨이 제어되고 있다.
주파수 변환부(42)는, 수광부(26a)로부터 공급된 형광 신호에 주파수 변환을 행하여 다운 컨버전(down conversion)을 실시한다. 주파수 변환부(42)는, 가변 증폭기(42a)와 IQ 믹서(42b)와 로 패스 필터(low pass filter, 42c)를 주로 가진다.
가변 증폭기(42a)는, 형광 신호를 증폭하는 부분이다. 가변 증폭기(42a)는, 데이터 처리부(30)와 접속되어, 데이터 처리부(30)로부터의 제어 신호에 따라 게인이 제어되고 있다.
IQ 믹서(42b)는, 증폭된 형광 신호를, 변조 신호 제어부(40)로부터 공급된 변조 신호를 참조 신호로서, 저주파로의 주파수 변환(다운 컨버전)을 행하여, 형광 신호의, 변조 신호와 동상(同相)의 신호와, 위상이 90도 벗어난 변조 신호를 생성한다.
IQ 믹서(42b)는, 90도 위상 시프터(42d)(도 2 참조)와 믹서(42e, 42f)(도 2 참조)를 가진다. 90도 위상 시프터(42d)에 의하여, 변조 신호와 위상이 90도 벗어난 신호가 생성되어, 위상이 동상인 변조 신호와 위상이 90도 벗어난 변조 신호가 각각 믹서(42e, 42f)로 공급된다.
믹서(42e, 42f)에서는, 공급된 위상이 동상인 변조 신호와 위상이 90도 벗어난 변조 신호를 참조 신호로 하여, 증폭된 형광 신호와 믹싱 처리를 행한다. 믹싱된 형광 신호는, 로 패스 필터(42c)로 공급된다.
로 패스 필터(42c)는, 믹싱된 형광 신호로부터, 변조 신호보다 낮은 소정의 주파수 영역의 신호를 여과하여, 저주파 신호를 추려낸다. 이것에 의하여, 주파수 0 영역의 신호 성분을 주성분으로 하는, 형광 신호의 Re 성분과 Im 성분이 구하여진다. 구하여진 Re 성분과 Im 성분은, AD 변환부(44)로 공급된다.
AD 변환부(44)는, 공급된 Re 성분과 Im 성분을 디지털 데이터로 변환하는 부분이다. AD 변환부(44)는, 증폭기(44a)와 AD 변환기(44b)를 가진다. 증폭기(44a)는, 소정의 게인으로 Re 성분과 Im 성분을 증폭한 후, AD 변환기(44b)로 공급한다. AD 변환기(44b)는, 증폭된 Re 성분과 Im 성분을 디지털 데이터로 변환하고, 디지털화한 Re 성분 데이터와 Im 성분 데이터를 데이터 처리부(30)로 공급한다.
데이터 처리부(30)는, 공급된 Re 성분 데이터 및 Im 성분 데이터를 이용하여 형광의 위상 지연 θ 및 형광 강도 신호의 값을 구한다. 나아가, 데이터 처리부(30)는, 이 위상 지연 θ의 값이 미리 설정된 값에 가까워지고, 또한, 형광 강도 신호의 값, 구체적으로는 형광 강도 신호의 값이 미리 설정된 강도 범위에 들어갈 때의 위상 지연 θ를 이용하여, 형광 완화 시간 τ와 그 때의 형광의 형광 강도를 산출한다.
보다 상세하게 설명하면, 산출된 형광 강도 신호의 값이, 미리 설정된 강도 범위에 들어갈 때까지, DC 신호 발생기(40e)에서 생성하는 DC 성분의 레벨, 혹은 가변 증폭기(42a)의 게인의 조정을 행하기 위한 제어 신호를 생성하는 것으로, AD 변환기(44b)에서 행하는 Re 성분과 Im 성분의 신호 레벨을 조정한다. 나아가, 산출된 위상 지연 θ의 값이, 미리 설정된 값에 가까워지도록, 주파수 가변 발진기(40a)에서 생성하는 변조 신호의 주파수를 조정하기 위한 제어 신호를 생성하는 것으로, 변조 신호를 제어한다. 미리 설정된 값은, 후술하는 도 5(a)에 도시하는 그래프로부터, 각주파수(角周波數) 변화에 대한 위상 지연 θ의 변화의 값을 크게 취할 수 있는 25 ~ 65도로 설정할 수 있다. 이 중에서 특히 45도로 하는 것이 바람직하다. 미리 설정된 값에 가까워진다는 것은, 변조 신호의 제어의 전과 후에서는, 제어 후의 위상 지연 θ의 값은 제어 전의 위상 지연 θ의 값에 비하여 미리 설정된 값에 가까운 것을 의미한다. 위상 지연 θ의 값은, 이 제어에 의하여 미리 설정된 목표로 하는 값에 가까워지지만, 이 목표로 하는 값에 대하여, 미리 설정된 허용 범위 내에서 수속하는 것이 바람직하다. 허용 범위는, 목표로 하는 형광 완화 시간의 산출하려고 하는 정도에도 의존하지만, 예를 들어, ±10도, ±5도 혹은 ±2도이다. 위상 지연 θ의 값이, 목표로 하는 값에 대하여 미리 설정된 허용 범위 내에 들어갈 때, 제어는 정정된 상태로 된다.
도 4는, 데이터 처리부(30)의 개략의 구성을 도시하는 도면이다. 데이터 처리부(30)는, 형광 강도 신호 생성부(30a)와 형광 강도 산출부(30b)와 위상 지연 산출부(30c)와 신호 제어부(30d)와 형광 완화 시간 산출부(30e)를 가진다. 이들 각 부분은, 컴퓨터가 실행 가능한 프로그램을 실행하는 것으로 형성되는 모듈이다. 즉, 데이터 처리부(30)는, 컴퓨터 상에서, 소프트웨어를 기동하는 것에 의하여 각 기능이 생성된다.
위상 지연 산출부(30c)와 형광 완화 시간 산출부(30e)는, 적어도, 형광 신호로부터, 변조 신호에 대한 형광의 위상 지연을 산출하고, 이 위상 지연을 이용하여 시료(12)의 형광의 형광 완화 시간을 산출하는 처리부에 대응한다.
형광 강도 신호 생성부(30a)는, AD 변환기(44b)로부터 공급된 Re 성분 데이터와 Im 성분 데이터를 제곱 가산하여 제곱근을 구하는 것에 의하여, 형광 강도 신호를 생성한다. 산출된 형광 강도 신호는 형광 강도 산출부(30b)로 보내진다. 형광 강도 신호의 값은, 레이저광의 DC 성분 및 가변 증폭기(42a)의 게인이 조정된 결과의 값이기 때문에, 이들 조정 결과에 따라 값이 크게 변화한다. 따라서, 형광 강도 산출부(30b)에 있어서, 형광 강도 신호는, 레이저광의 강도인 DC 성분의 레벨과 게인의 정보를 이용하여 보정되어, 형광 강도가 산출된다. 그러나, 이 보정은, 신호 제어부(30d)로부터 후술하는 결정 지시를 받았을 때, 처음 행하여진다.
덧붙여, 형광 강도 신호는, 시료(12)가 레이저광의 측정장을 통과하는 기간에 연속하여 공급되는 Re 성분 데이터와 Im 성분 데이터를 이용하여 산출되는 시계열 데이터이다.
형광 강도 산출부(30b)는, 신호 제어부(30d)로부터 받는 결정 지시에 따라, 형광 강도 신호 생성부(30a)에서 생성된 형광 강도 신호를, 레이저광의 강도인 DC 성분의 레벨과 게인의 정보를 이용하여 보정하여, 형광 강도를 산출한다. 구체적으로는, 형광 강도 신호의 값을, DC　성분의 레벨 및 가변 증폭기(42a)의 게인을 조정하는 제어 신호의 값으로부터 정해지는 계수로 제산(除算)하는 것에 의하여, 형광 강도가 구하여진다. 덧붙여, 제산에 이용하는 계수는, DC 성분의 레벨 및 게인을 조정하는 제어 신호의 값과, 계수를 관련지은 LUT(look up table)을 참조하여 얻어진다.
보정에 이용하는 레이저광의 DC 성분은, 제어 신호가 주는 신호값이어도 무방하고, 수광부(24)에서 계측된 전방 산란광의 강도를 이용할 수도 있다. 가변 증폭기(42a)의 게인은, 제어 신호가 주는 신호값이어도 무방하고, 게인을 별도 계측한 결과의 값을 이용할 수도 있다.
신호 제어부(30d)로부터 받는 결정 지시는, 형광 강도 신호 생성부(30a)에서 생성되는 제어 중의 형광 강도 신호의 값이 소정의 설정값을 넘어 최대값이 되었을 때에 나오게 된다. 여기서, 소정의 설정값이란, 미리 설정된 범위를 정하는 하한값이다. 이 때의 형광 강도 신호의 값을 제어 신호의 값으로 제산하는 것에 의하여, 형광 강도가 얻어진다.
형광 강도 신호의 값은, 미리 설정된 강도 범위에 들어가도록, DC 신호 발생기(40e)에서 생성하는 DC 성분의 레벨 및 가변 증폭기(42a)의 게인의 조정(조작량의 조정)을 행하지만, 시료(12)가 측정장을 통과하는 후반부는, 형광 강도 신호가 약해진다. 이 때, DC 신호 발생기(40e)에서 생성하는 DC 성분의 레벨 및 가변 증폭기(42a)의 게인의 조정(조작량의 조정)에서는, 조작량을 최대로 하여도 목표값에 도달하지 않는다. 한편, 시료(12)가 측정장을 통과하는 전반부 ~ 중간부의 단계에서는, 형광 강도 신호가 서서히 강해지기 때문에, 이 단계에 있어서 형광 강도 신호가 미리 설정된 범위에 일단 들어가면, 조작량은 조정되지 않고 일정하게 된다. 이 때, 형광 강도 신호의 값은, 상기 범위를 정하는 설정값을 넘어 최대값이 된다. 따라서, 이 때의 형광 강도 신호를, 이 때의 제어 신호의 값으로 정해지는 계수로 제산하는 것에 의하여, 보정한 형광 강도를 구한다.
형광 강도의 산출 방법은, 상기 방법에 의하여 값을 산출하는 것 외에, 제어 중의 형광 강도 신호의 값을 제어 신호의 값으로 정해지는 계수로 제산한 값을 제어 시간　중 적산(積算)하고, 이 적산값을 제어 시간으로 제산한 값을, 형광 강도의 값으로서 산출할 수도 있다.
위상 지연 산출부(30c)는, 공급된 Re 성분 데이터와 Im 성분 데이터를 이용하여 tan-1(Im/Re)(Im은 Im 성분 데이터의 값, Re는 Re 성분 데이터의 값이다)를 산출하는 것으로, 위상 지연 θ를 산출한다. 산출된 위상 지연 θ는 신호 제어부(30d)로 공급된다. 또한, 산출된 위상 지연 θ는 형광 완화 시간 산출부(30e)로 공급된다.
형광 완화 시간 산출부(30e)는, 신호 제어부(30d)로부터의 결정 지시에 따라, 위상 지연 산출부(30c)로부터 공급된 위상 지연 θ를 이용하여, 형광 완화 시간 τ를 τ = 1/(2πf)·tanθ에 따라 구한다. 형광 완화 시간 τ를, 상기 식에 따라 구할 수 있는 것은, 형광은, 대략 1차 지연의 완화 응답에 따르기 때문이다. 덧붙여, 변조 신호의 주파수 f는, 주파수 카운터(40f)로부터 공급되는 변조 신호의 주파수의 카운트 결과가 이용된다. 주파수의 카운트 결과를 이용하는 대신에, 신호 제어부(30)가 제어 신호로 정한 변조 신호의 목표의 주파수여도 무방하다.
신호 제어부(30d)는, 형 위상 지연 산출부(30c)로부터 공급된 위상 지연 θ와 광 강도 신호 생성부(30a)에서 생성된 형광 강도 신호의 값이, 각각 따로따로 설정된 범위에 들어가는지의 여부를 판정하고, 판정 결과에 따라, 제어 신호를 생성한다.
즉, 신호 제어부(30d)는, 위상 지연 θ의 값이 미리 설정된 값, 예를 들어 45도에 가까워지도록, 변조 신호의 주파수를 제어한다. 신호 제어부(30d)는, 위상 지연 θ의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 주파수 가변 발진기(40a)의 발진 주파수를 조정하는 제어 신호를 생성하여, 주파수 가변 발진기(40a)로 공급한다. 이것에 의하여, 레이저 드라이버(22c)로 주파수가 조정된 변조 신호가 공급되어, 레이저광의 강도 변조는 조정된다.
신호 제어부(30d)에서, 위상 지연 θ의 값이 설정된 허용 범위 내에서 45도에 일치하는 경우, 후술하는 형광 강도 신호의 값의 판정 결과에 따라, 정도가 높은 위상 지연 θ가 얻어졌다고 판정한다.
또한, 신호 제어부(30d)는, 형광 강도 신호의 값이 미리 설정된 범위에 들어가도록, 광원부(22)로부터 출사되는 레이저광의 DC 성분의 레벨 및 가변 증폭기(44b)의 게인을 제어한다.
판정 결과, 형광 강도 신호의 값이 설정된 범위에 들어가지 않는 경우, DC 신호 발생기(40e)의 DC 성분의 신호 레벨을 조정하는 제어 신호를 생성하여, DC 신호 발생기(40e)로 공급한다. 이것에 의하여, 레이저 드라이버(22c)로 DC 성분의 신호 레벨 조정된 변조 신호가 공급되어, 레이저광의 강도 변조는 조정된다. 이것에 의하여, 레이저 드라이버(22c)로 DC 성분의 신호 레벨이 조정된 변조 신호가 공급된다. 또한, 수광부(26a) 직후에 설치된 가변 증폭기(42a)의 게인을 조정하는 제어 신호를 생성하여, 가변 증폭기(42a)의 게인을 제어한다.
본 실시예는, DC 신호 발생기(40e)의 변조 신호의 제어와 가변 증폭기(26a)의 게인의 제어를 행하지만, 변조 신호의 제어만을 행하여도 무방하다.
신호 제어부(30d)는, 위상 지연 θ가 미리 설정된 범위에 들어가고, 또한, 형광 강도 신호의 값이 설정된 범위에 들어가는 경우, 정도가 높은 위상 지연 θ가 얻어졌다고 판정하여, 형광 강도 산출부(30b) 및 형광 완화 시간 산출부(30e)에, 형광 강도의 산출과 형광 완화 시간의 산출의 결정 지시를 한다.
이와 같이, 위상 지연 θ와 형광 강도 신호의 값이 모두 설정된 범위에 들어가는 경우, 정도가 높은 위상 지연 θ가 얻어진다. 따라서, 정도가 높은 형광 완화 시간이 산출된다. 본 실시예에서는, 적어도, 위상 지연 θ의 값이, 허용 범위 내에서 목표값인 45도에 일치하는지의 여부를 판정하는 것으로, 정도가 높은 위상 지연 θ가 얻어진다.
도 5(a)에는, 레이저광의 강도 변조의 주파수(각주파수 2πf)와 그 때의 형광의 위상 지연 θ의 관계를, 종종(種種)의 형광 완화 시간 τ에 관련하여 도시하고 있다.
위상 지연 θ가 45도에서 각주파수 2πf에 대한 위상 지연 θ의 각도 변화가 최대로 된다. 즉, 각도 45도에서 위상 지연 θ의 감도가 높아지고 있다. 따라서, 위상 지연 θ가 목표값인 45도에 가까워지도록 변조 신호의 주파수를 제어하는 것에 의하여, 감도가 높은 위치에서 위상 지연 θ 를 산출할 수 있다. 즉, 정도가 높은 위상 지연 θ가 산출될 수 있다.
또한, AD 변환기(44b)에서 AD 변환을 행할 때, 도 5(b)에 도시하는 바와 같이, Re 성분이나 Im 성분에 오차가 포함되며, AD 변환에 있어서의 양자화 레벨이 1개 변동하여도, 위상 지연 θ가 허용 범위 내에서 목표값인 45도에 일치하는 경우의 위상 지연의 변화 Δθ1은, 그 이외의 범위에 있는 위상 지연 Δθ2에 비하여 작다. 따라서, 위상 지연 θ가 허용 범위 내에서 45도에 일치할 때, 양자 오차에 의한 위상 지연 θ의 오차를 작게 할 수 있다.
도 6은, 형광 검출 장치(10)에서 행하여지는 형광 검출 방법의 일 실시예의 플로우를 설명하는 도면이다. 이 실시예는, 형광 강도와 형광 완화 시간의 산출을 위하여, 레이저광의 강도의 DC 성분과, 형광의 수광 직후의 형광 신호의 증폭 게인과, 변조 신호의 주파수를 조정하는 방법이다.
우선, 데이터 처리부(30)로부터의 제어 신호에 기초하여, 변조 신호 제어부(40)에 있어서, 레이저광의 강도 변조에 이용하는 변조 신호의 DC 성분의 신호 레벨과, 주파수 변환부(42)의 가변 증폭기(42a)의 게인이 설정된다(스텝 S10). 이들은, 처리 개시 시는, 디폴트 설정되어 있는 DC 성분의 신호 레벨과 게인이 설정된다.
나아가, 변조 신호 제어부(40)에 있어서, 데이터 처리부(30)로부터의 제어 신호에 기초하여 변조 신호의 주파수가 설정된다. 예를 들어 주파수가 디폴트 설정된다. 이상의 설정된 DC 성분의 신호 레벨 및 게인과 변조 신호의 주파수를 이용하여 변조 신호를 생성하고, 레이저 광원(22a)으로부터 강도 변조된 레이저광이 출사된다(스텝 S12).
다음으로, 레이저광이 조사되어, 측정장을 통과하는 시료(12)가 발하는 형광이 수광부(26a)에서 수광되어, 형광 신호가 출력된다(스텝 S14).
다음으로, 가변 증폭기(42a)에서 설정된 게인으로 증폭되어, 믹서(42e, 42f)로 공급되고, 믹싱되어, Re 성분 및 Im 성분이 구하여진다. 나아가, Re 성분 및 Im 성분은, AD 변환부(44)에서 디지털 신호로 변환되어, Re 성분 데이터 및 Im 성분 데이터가 얻어진다(스텝 S16).
다음으로, 데이터 처리부(30)의 위상 지연 산출부(30c)에서는, 디지털화한 Re 성분 데이터 및 Im 성분 데이터로부터, 형광 신호의 위상 지연 θ가 산출된다(스텝 S18).
　다음으로, 신호 제어부(30d)에서는, 산출된 위상 지연 θ가, 미리 설정된 목표값인 45도로 허용 범위 내에서 일치하는지의 여부가 판정된다(스텝 S20). 여기서, 위상 지연 θ가 허용 범위 내에서 목표값에 일치하지 않는 경우, 변조 신호의 주파수는 변경하는 제어 신호가 생성되어, 주파수 가변 발진기(40a)로 공급된다. 이렇게 하여, 변조 신호의 주파수가 변경된다(스텝 S22). 여기서, 주파수의 변경은, 산출된 위상 지연 θ를 이용하여, 예를 들어, 주파수 f = 2πf1/tan(θ)(f1은, 현재 설정되어 있는 변조 신호의 주파수)로 되도록 행하여진다.
이렇게 하여, 위상 지연 θ가 설정된 목표값에 가까워지도록, 스텝 S10 ~ S22를 반복한다.
스텝 S20의 판정에서, 긍정된 경우(Yes의 경우), 신호 제어부(30)에서는, 나아가, 형광 강도 신호의 값이 미리 설정된 범위에 들어가는지의 여부가 판정된다(스텝 S24). 형광 강도 신호의 값이 미리 설정된 범위에 들어가는 경우(Yes의 경우), 형광 강도 산출부(30b)와 형광 완화 시간 산출부(30e)에, 형광 강도와 형광 완화 시간을 산출하는 결정 지시를 내린다. 이렇게 하여, 형광 강도 신호 생성부(30a)에서 생성되는 형광 강도와, 형광 완화 시간 산출부(30e)에서 산출된 형광 완화 시간이, 시료(12)의 계측 결과로서 결정된다(스텝 S26).
형광 강도 신호의 값이 미리 설정된 범위에 들어가지 않는 경우(No의 경우), 변조 신호에 이용하는 DC 성분의 신호 레벨과 게인이 변경되어(스텝 S28), 스텝 10으로 되돌려진다.
이렇게 하여, 형광 강도 신호의 값이 미리 설정된 범위에 들어갈 때까지, 스텝 S10 ~ S24 및 스텝 S28이 반복된다.
산출된 계측 결과는, DC 성분의 신호 레벨, 게인, 변조 신호의 주파수 등의 정보와 함께, 도시되지 않는 디스플레이 혹은 프린터 등의 출력 장치로 출력된다.
상술의 형광 검출 방법은, 위상 지연 θ가, 허용 범위 내에서 목표값에 일치하는지의 여부를 판정하여, 판정 결과가 긍정된 경우, 형광 강도 신호의 값이 설정된 범위에 들어가는지의 여부를 판정하는 처리를 이용한다. 그러나, 본 실시예는, 형광 강도 신호의 값이 설정된 범위에 들어가는지의 여부를 판정하여, 판정 결과가 긍정된 경우, 위상 지연 θ가 허용 범위 내에서 목표값에 일치하는지의 여부를 판정하는 처리를 이용하여도 무방하다. 상기 2개의 판정을 동시에 행하여도 무방하다.
이와 같은 변조 신호의 주파수의 제어는, 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터에서 행하는 경우, 이하와 같이 실시하면 된다. 즉, 시료(12)는 복수의 샘플 입자로 구성되며, 이 샘플 입자는 레이저광에 의한 측정장을 일정 속도로 1개씩 단속적으로 통과하는 경우를 생각한다. 이 때, 신호 제어부(30d)는, 샘플 입자가 레이저광이 조사하는 측정장을 통과하기 시작한 직후에, 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 변조 신호의 주파수의 제어를 개시한다. 그리고, 데이터 처리부(30)는, 샘플 입자가 레이저광의 측정장의 통과를 종료하기 전에, 위상 지연의 값이 미리 설정된 값이 되는 변조 신호의 주파수를 찾아내고, 찾아내진 주파수의 조건에서 얻어지는 위상 지연과 변조 신호의 주파수로부터 형광 완화 시간을 산출한다. 그 때, 동시에, 변조 신호의 DC 성분의 신호 레벨 및 가변 증폭기(42a)의 게인의 제어도 행한다.
샘플 입자가 레이저광의 측정장을 통과하는 시간은, 10 ~ 30μ초 정도이며, 이 시간 내에, 주파수 가변 발진기(40a)를 충분히 제어하는 것은 가능하다.
또한, 시료(12)가, 큐벳트(cuvette) 등의 일정한 용기에 수용되어, 정지(靜止)한 상태로, 레이저광의 조사를 받는 측정 장치에서는, 이하의 측정 방법을 실시하면 된다.
즉, 데이터 처리부(30)는, 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 변조 신호의 주파수의 제어를 행하고, 이 제어가 정정되었을 때의 위상 지연과 변조 신호의 주파수로부터 형광 완화 시간을 산출한다. 데이터 처리부(30)는, 이 주파수의 제어 시, 동시에, 형광 강도 신호가 미리 설정된 범위에 들어가는 DC 성분의 신호 레벨 및 게인을 찾아내도록, DC 성분의 신호 레벨 및 게인을 제어한다.
이와 같이, 본 실시예는, 형광 완화 시간을 산출할 때, 위상 지연이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 레이저광의 변조 신호의 주파수를 조정하는 것에 의하여, 위상 지연의 형광 완화 시간에 주는 비선형의 기여를 일정하게 할 수 있다. 이 때문에, 본 실시예는, 일정한 정도로 형광 완화 시간을 산출할 수 있는 범위를 넓힐 수 있다. 예를 들어, 형광이 1차 지연의 완화 응답으로 한 경우, 본 실시예는, 비선형의 부분인 tanθ(θ를 위상 지연으로 한다)를 형광 완화 시간에 한정하지 않고 대략 일정한 값으로 할 수 있기 때문에, 위상 지연 θ가 큰 경우와 작은 경우에서 tanθ의 기여가 크게 달라, 정도가 변화하는 것을 방지할 수 있다.
특히, 본 실시예는, 미리 설정된 값을 45도로 하는 것에 의하여, 변조 신호의 주파수에 대한 위상 지연의 감도가 높은 곳에서 위상 지연이 산출되기 때문에, 정도가 높은 형광 완화 시간을 산출할 수 있다.
또한, 형광 신호로부터 얻어진 Re 성분 및 Im 성분의 신호 레벨을 조정하는 것에 의하여, 본 실시예는, 일정한 정도의 위상 지연 θ를 넓은 범위에서 구할 수 있다. Re 성분 및 Im 성분의 신호 레벨이 낮은 경우, IQ 믹서(42b)나 로 패스 필터(42c)나 AD 변환기(44b) 등에 의한 노이즈가 Re 성분 및 Im성분에 혼입하는 것에 의하여, 이들의 성분에 오차가 포함될 수 있다. 이 상태에서 AD 변환을 행하면, 양자화 오차가 커져, 이후 산출하는 위상 지연 θ의 오차가 커진다. 그러나, 본 실시예는, Re 성분 및 Im 성분으로부터 산출되는 형광 강도 신호를 미리 설정된 범위에 들어가도록 하는 것으로, Re 성분 및 Im 성분의 신호 레벨을 일정하게 유지할 수 있다. 이 때문에, 본 실시예는, 위상 지연 θ의 오차를 일정하게 막을 수 있고, 또한 억제할 수 있다.
상기 설명에서는, 모두 위상 지연과 형광 강도 신호의 값이 미리 설정된 범위에 들어가도록 조정되지만, 형광 강도 신호의 값이 미리 설정된 범위에 들어가는지의 여부를 판정하는 일 없이, 위상 지연이 미리 설정된 범위에 들어가는지의 여부만을 판정할 수도 있다.
이상, 본 발명의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 관하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고, 본 발명의 주지를 일탈하지 않는 범위에 있어서, 종종의 개량이나 변경을 하여도 무방한 것은 물론이다.
10 : 플로우 사이토미터
12 : 시료
22 : 레이저 광원부
22a : 레이저 광원
22b, 24b, 26b : 렌즈계
22c : 레이저 드라이버
24, 26 : 수광부
24a, 26a : 광전 변환기
26c : 차폐판
28 : 제어·신호 처리부
30 : 데이터 처리부(컴퓨터)
30a : 형광 강도 신호 생성부
30b : 형광 강도 산출부
30c : 위상 지연 산출부
30d : 신호 제어부
30e : 형광 완화 시간 산출부
32 : 관로
34 : 회수 용기
40 : 변조 신호 제어부
40a : 주파수 가변 발진기
40b : 파워 스플리터
40c, 40d, 44a : 증폭기
40e : DC 신호 발생기
42 : 주파수 변환부
42a : 가변 증폭기
42b : IQ 믹서
42c : 로 패스 필터
42d : 90도 위상 시프터
42e, 42f : 믹서
44 : AD 변환부
44b : AD 변환기

Claims (8)

  1. 레이저광의 조사(照射)를 받은 측정 대상물이 발하는 형광을 수광(受光)하는 것에 의하여 얻어지는 형광 신호의 신호 처리를 행하는 형광 검출 장치이며,
    측정 대상물에 조사하는 레이저광을 강도 변조하여 출사하는 광원부와,
    레이저광이 조사된 측정 대상물로부터 발하는 형광의 형광 신호를 출력하는 수광부와,
    상기 광원부로부터 출사하는 레이저광을 강도 변조하기 위한 변조 신호를 생성하는 광원 제어부와,
    상기 수광부에서 출력된 형광 신호로부터, 상기 변조 신호에 대한, 측정 대상물이 발하는 형광의 위상 지연을 산출하고, 상기 위상 지연을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 산출하는 처리부와,
    상기 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 상기 변조 신호의 주파수를 제어하는 신호 제어부를 가지는 것을 특징으로 하는 형광 검출 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미리 설정된 값은 45도인, 형광 검출 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    측정 대상물은 복수의 샘플 입자로 구성되며, 상기 샘플 입자는 레이저광에 의한 측정장을 일정 속도로 1개씩 단속적으로 통과하고,
    상기 신호 제어부는, 상기 샘플 입자의 상기 측정장의 통과의 개시 직후에, 상기 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 상기 변조 신호의 주파수의 제어를 개시하고, 상기 샘플 입자의 상기 레이저광의 측정장의 통과 종료 전에, 상기 위상 지연의 값이 미리 설정된 값이 되는 상기 변조 신호의 주파수는 찾아내지고, 찾아내진 상기 주파수의 조건에서 얻어지는 상기 위상 지연과 상기 변조 신호의 주파수로부터 상기 형광 완화 시간을 산출하는, 형광 검출 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 측정 대상물은, 일정한 용기에 수용되어, 정지(靜止)한 상태로, 레이저광의 조사를 받고,
    상기 신호 제어부는, 상기 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 상기 변조 신호의 주파수의 제어를 행하여, 상기 제어가 정정(整定)되었을 때의 상기 위상 지연과 상기 변조 신호의 주파수로부터 상기 형광 완화 시간을 산출하는, 형광 검출 장치.
  5. 레이저광의 조사를 받은 측정 대상물이 발하는 형광을 수광하는 것에 의하여 얻어지는 형광 신호의 신호 처리를 행하는 형광 검출 방법이며,
    레이저 광원부로부터 출사하는 레이저광을 강도 변조하기 위한 변조 신호를 생성하고, 상기 변조 신호를 이용하여 레이저광을 변조하는 스텝과,
    상기 레이저광이 조사된 측정 대상물로부터 발하는 형광의 형광 신호를 취득하는 스텝과,
    상기 형광 신호로부터, 상기 변조 신호에 대한 형광의 위상 지연을 산출하는 스텝과,
    상기 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 상기 변조 신호의 주파수를 제어하는 스텝과,
    상기 제어가 정정되었을 때의 상기 변조 신호의 주파수의 조건에서 얻어지는 위상 지연을 이용하여, 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 완화 시간을 산출하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 미리 설정된 값은 45도인, 형광 검출 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    측정 대상물은 복수의 샘플 입자로 구성되며, 이 샘플 입자는 레이저광에 의한 측정장을 일정 속도로 1개씩 단속적으로 통과하고,
    상기 샘플 입자의 레이저광의 측정장의 통과의 개시 직후에, 상기 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 상기 변조 신호의 주파수의 제어를 개시하고, 상기 샘플 입자의 상기 레이저광의 측정장의 통과 종료 전에, 상기 위상 지연의 값이 미리 설정된 값이 되는 상기 변조 신호의 주파수는 찾아내지고, 찾아내진 상기 주파수의 조건에서 얻어지는 상기 위상 지연과 상기 변조 신호의 주파수로부터 상기 형광 완화 시간을 산출하는, 형광 검출 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 측정 대상물은, 일정한 용기에 수용되어, 정지한 상태로, 레이저광의 조사를 받고,
    상기 위상 지연의 값이 미리 설정된 값에 가까워지도록, 상기 변조 신호의 주파수의 제어를 행하여, 상기 제어가 정정되었을 때의 상기 위상 지연과 상기 변조 신호의 주파수로부터 상기 형광 완화 시간을 산출하는, 형광 검출 방법.
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