JP2010187690A - エクジソンレセプター複合体を介した外来遺伝子の発現を調節するためのケトンリガンド - Google Patents

エクジソンレセプター複合体を介した外来遺伝子の発現を調節するためのケトンリガンド Download PDF

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Abstract

【課題】既知の受容体を利用して遺伝子発現を制御するため、ステロイド系でもジアシルヒドラジンでもない新規のクラスのリガンドを開発するアプローチを提供する。
【解決手段】エクジソン受容体複合体がＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含んでおり、そして１つのリガンドが外来遺伝子および応答エレメントを含むＤＮＡ構築物と接触させられる外来遺伝子発現を調節する方法であって、ここで外来遺伝子が応答エレメントの制御下にあり、該リガンドの存在下での応答エレメントへのＤＮＡ結合ドメインの結合が該遺伝子の活性化または抑制を生じさせる方法よりなる。リガンドは、あるクラスのケトンを含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、バイオテクノロジーまたは遺伝子組換え技術の分野に関する。特に、本発明は遺伝子発現の分野に関する。より詳細には、本発明は置換突然変異を含む新規の核受容体、核受容体ベースの誘導遺伝子発現系におけるそれらの使用、およびこの誘導遺伝子発現系を使用して宿主細胞内の遺伝子発現を調節する方法に関する。
種々の刊行物が本明細書中で引用されており、その開示全体が本明細書中で参考として援用される。しかし、本明細書中の任意の引例の引用は、このような引例が本願の「先行技術」として利用可能であると解釈されるべきではない。
遺伝子工学分野では、遺伝子発現の正確な制御は、発達および他の生理学的プロセスの研究、操作、および制御のための有益なツールである。遺伝子発現は、多数の特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を含む複雑な生物学的プロセスである。タンパク質合成の第１の工程として必要なＲＮＡを産生するように遺伝子発現を誘発するために、転写アクチベーターを、遺伝子転写を制御するプロモーターの近傍に置かなければならない。典型的には、転写アクチベーター自体を、遺伝子のプロモーター領域中に存在するＤＮＡ結合部位に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質に会合させる。したがって、遺伝子発現を起こさせるために、ＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインから適切な距離に存在するトランス活性化ドメインを含むタンパク質を、遺伝子のプロモーター領域中の正確な位置に置かなければならない。
伝統的なトランスジェニックアプローチは、デザインされた導入遺伝子の発現を駆動するための細胞型特異的プロモーターを使用する。導入遺伝子を含むＤＮＡ構築物を、最初に宿主ゲノムに組み込む。転写アクチベーターによって誘発される場合、所与の細胞型で導入遺伝子が発現する。
細胞中での外来遺伝子の別の発現制御手段は、誘導プロモーターによる。このような誘導プロモーターの使用例には、ＰＲ１−ａプロモーター、原核生物リプレッサー−オペレーター系、免疫抑制性イムノフィリン系およびステロイドホルモン受容体系などの高等真核生物転写活性化系が含まれ、以下に記載する。
タバコ由来のＰＲ１−ａプロモーターは、病原体攻撃後の全身獲得抵抗性応答時に誘導される。しばしば内因性物質および病原体、ＵＶ−Ｂ照射、および汚染物質などの外部因子に応答するので、ＰＲ１−ａの使用は制限され得る。熱ショック、インターフェロン、および重金属によって誘導されるプロモーターに基づく遺伝子制御系が記載されている（Ｗｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５４１４−５４１８；Ａｒｎｈｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｃｅｌｌ ６２：５１−６１；Ｆｉｌｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：２７５５０−２７５６０）。しかし、これらの系は、非標的遺伝子発現に対するその影響により制限される。これらの系はまた、リークしやすい。
原核生物リプレッサー−オペレーター系は、細菌リプレッサータンパク質およびこれらに結合する固有のオペレーターＤＮＡ配列を使用する。植物および動物で遺伝子発現を制御するために細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のテトラサイクリン（「Ｔｅｔ」）およびラクトース（「Ｌａｃ」）リプレッサー−オペレーター系が使用されている。Ｔｅｔ系では、テトラサイクリンはＴｅｔＲリプレッサータンパク質に結合し、オペレーターからリプレッサータンパク質を放出する高次構造の変化が起こり、結果として転写される。Ｌａｃ系では、ｌａｃオペロンは、ラクトースまたはイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシドなどの合成アナログの存在に応答して活性化される。不運なことに、このような系の使用は、リガンドの不安定な化学的性質（すなわち、テトラサイクリンおよびラクトース）、その毒性、その天然の存在、または誘導もしくは抑制に比較的高レベルが必要であることによって制限される。類似の理由のために、動物でのこのような系の使用は制限される。
ＦＫ５０６、ラパマイシン、およびシクロスポリンＡなどの免疫抑制分子は、イムノフィリンＦＫＢＰ１２、シクロフィリンなどに結合することができる。この情報を使用して、２つの各タンパク質へのＦＫ５０６の位置付けまたは一方へのＦＫ５０６の位置付けおよび他方へのシクロスポリンＡの位置付けによって簡単に任意の２つのタンパク質をまとめるための一般的なストラテジーが考案されている。次いで、ＦＫ５０６の合成ホモ二量体（ＦＫ１０１２）またはＦＫ５０６−シクロスポリン融合に起因する化合物（ＦＫＣｓＡ）を使用して、これらの分子の二量体化を誘導することができる（Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０１９−２４；Ｂｅｌｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３：４６０４−７）。ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインおよびシクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメインならびにＦＫＣｓＡ化合物を使用して、Ｇａｌ４結合部位を含むプロモーターの制御下でのレポーター遺伝子のヘテロ二量体化および活性化を示した。不運なことに、この系は望ましくない副作用を有し得る免疫抑制物質を含むので、種々の哺乳動物遺伝子スイッチ適用での使用が制限される。
ステロイドホルモン受容体系などの高等真核生物の転写活性化系も使用されている。ステロイドホルモン受容体は、核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、脊椎動物および無脊椎動物の細胞で見出される。不運なことに、特に植物および哺乳動物での遺伝子発現制御のための受容体を活性化するステロイド化合物の使用は、このような生物の多数の他の天然の生体経路の関与によって制限される。このような困難を克服するために、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）を使用した別の系が開発されている。
昆虫の成長、脱皮、および発達は、エクジソンステロイドホルモン（脱皮ホルモン）および幼若ホルモンによって制御される（Ｄｈａｄｉａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５−５６９）。昆虫におけるエクジソンの分子標的は、少なくともエクジソン受容体（ＥｃＲ）およびウルトラスピラクル（ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）タンパク質（ＵＳＰ）からなる。ＥｃＲは、特性（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）ＤＮＡおよびリガンド結合ドメインならびに活性化ドメインによって特徴付けられる核ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｋｏｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｃｅｌｌ，６７：５９−７７）。ＥｃＲ受容体は、ポナステロンＡおよびムリステロンＡなどの多数のステロイド系化合物に応答する。最近、エクジステロイドアゴニスト活性を有する非ステロイド系化合物（Ｒｈｏｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙから世界中に販売されている市販の殺虫剤であるテブフェノジドおよびメトキシフェノジドが含まれる）が記載されている（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号および米国特許第５，５３０，０２８号を参照のこと）。両アナログは、他の生物に対して例外的な安全プロフィールを有する。
昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）（哺乳動物ＲＸＲの昆虫ホモログ）とヘテロ二量体化し、エクジステロイドおよびエクジソン受容体応答エレメントに結合し、エクジソン応答遺伝子の転写を活性化する。ＥｃＲ／ＵＳＰ／リガンド複合体は、昆虫の発達および生殖時に重要な役割を果たす。ＥｃＲは、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーであり、以下の５つのモジュラードメインを有する：Ａ／Ｂドメイン（トランス活性化）、Ｃドメイン（ＤＮＡ結合、ヘテロ二量体化）、Ｄドメイン（ヒンジ、ヘテロ二量体化）、Ｅドメイン（リガンド結合、ヘテロ二量体化、およびトランス活性化）、およびＦドメイン（トランス活性化）。Ａ／Ｂ、Ｃ、およびＥなどのこれらのドメインのいくつかは、他のタンパク質と融合した場合にその機能を保持する。
強力に制御された誘導遺伝子発現系または「遺伝子スイッチ」は、遺伝子治療、細胞中でのタンパク質の大量産生、細胞ベースの高処理スクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物および動物の形質の制御などの種々の適用で有用である。
ＥｃＲベースの遺伝子スイッチの第１のバージョンは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）およびＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）を使用し、ステロイドであるポナステロンＡの存在下でこれらの受容体が哺乳動物細胞株およびトランスジェニックマウスにおいてレポーター遺伝子をトランス活性化することを示した（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ Ｋ．Ｓ．，Ｍａｒｋ Ｍ．Ｒ．，Ｂａｊａ Ｊ．Ｖ．，Ｇｏｄｏｗｓｋｉ Ｐ．Ｊ．１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：６３１４−６３１８；Ｎｏ Ｄ．，Ｙａｏ Ｔ．Ｐ．，Ｅｖａｎｓ Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３３４６−３３５１）。後述する，Ｓｕｈｒ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５ ： ７９９９−８００４は、非ステロイド系エクジソンアゴニストであるテブフェノジドにより、外来ヘテロ二量体パートナーの非存在下でＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）によって哺乳動物細胞におけるレポーター遺伝子の高レベルのトランス活性化を誘導することを示した。
国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号（ＷＯ９７／３８１１７号）およびＰＣＴ／ＵＳ９９／０８３８１号（ＷＯ９９／５８１５５号）は、外来遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築物を、リガンドの存在下および任意選択的にサイレントパートナーとして作用することができる受容体の存在下でエクジソン応答エレメントに結合して遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む第２のＤＮＡ構築物によって活性化される、外来遺伝子の発現の調節方法を開示する。最適なエクジソン受容体を、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから単離した。典型的には、最適に活性化するために、このような系には、サイレントパートナー（好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ））の存在が必要である。哺乳動物細胞では、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体化し、リガンド依存性様式で標的遺伝子の発現を制御する。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５（ＷＯ９９／０２６８３号）は、蚕Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉから単離したエクジソン受容体が外来二量体パートナーを必要とせずに哺乳動物系で機能的であることを開示している。
米国特許第６，２６５，１７３Ｂ１号は、遺伝子発現系で使用するために受容体のステロイド／チロイドスーパーファミリーの種々のメンバーをＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒウルトラスピラクル受容体（ＵＳＰ）またはＵＳＰの少なくとも二量体化ドメインを含むそのフラグメントと組み合わせることができることを開示する。米国特許第５，８８０，３３３号は、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが２つの異なるハイブリッドタンパク質に配置される植物で使用されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）ヘテロ二量体系を開示する。不運なことに、これらのＵＳＰベースの系は動物細胞で構成的であるので、レポーター遺伝子発現の制御に有効ではない。
これらのケースの各場合では、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメイン（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号の天然のＥｃＲとして、または国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号の修飾ＥｃＲとして）を、１つの分子に組み込み、他のヘテロ二量体化パートナー（ＵＳＰまたはＲＸＲ）をその天然の状態で使用した。
上記ＥｃＲベースの遺伝子制御系の欠点には、リガンドの非存在下での相当なバックグラウンド活性、並びに植物および動物で使用するためのこれらの系の非利用可能性が含まれる（米国特許第５，８８０，３３３号を参照のこと）。したがって、植物および動物の両方で外来遺伝子の発現を正確に調節するための改良されたＥｃＲベースの系が当該分野で必要である。このような改良された系は、遺伝子治療、タンパク質および抗体の大量産生、細胞ベースの高処理スクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、ならびにトランスジェニック動物の形質の制御などの適用で有用である。遺伝子治療などの一定の適用のために、合成非ステロイド系リガンドに十分に応答すると同時に天然のステロイドに非感受性の誘導遺伝子発現系を有することが望ましい。したがって、簡単且つコンパクトで比較的安価なリガンドに依存し、容易に利用可能であり、且つ宿主に対する毒性が低い改良された系が、生体系の制御に有用である。
最近、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが２つの異なるタンパク質上にこれらを置くことによって互いに分離されているエクジソン受容体ベースの誘導遺伝子発現系により、リガンドの非存在下でバックグラウンド活性が非常に減少し、リガンドの存在下でバックグラウンドを超えて活性が非常に増加することが示されている（係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号（その全体が本明細書中で参考として援用される））。この２ハイブリッド系は、出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５に開示の２つの系と比較して有意に改良された誘導遺伝子発現調節系である。２ハイブリッド系は、ＤＮＡ結合ドメインが遺伝子上のＤＮＡ結合部位に結合した場合にトランス活性化ドメインがプロモーターをより有効に活性化するようにＤＮＡ結合ドメインに関してより好ましい位置に転写活性化ドメインを置く、相互作用するタンパク質対の能力を使用する（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号を参照のこと）。簡単に述べれば、２ハイブリッド遺伝子発現系は、以下の２つの遺伝子発現カセットを含む：核受容体ポリペプチドに融合したＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のカセットおよび異なる核受容体ポリペプチドに融合したトランス活性化ドメインをコードする第２のカセット。リガンドの存在下では、第１のポリペプチドの第２のポリペプチドとの相互作用により、ＤＮＡ結合ドメインをトランス活性化ドメインに有効に結合させる。ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが２つの異なる分子上に存在するので、リガンドの非存在下でのバックグラウンド活性は非常に減少する。
２ハイブリッド系はまた、ステロイド系リガンド（例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロン（「ＭｕｒＡ」））と比較した場合、非ステロイド系リガンド（例えば、ジアシルヒドラジン）に対して改良された感受性を提供する。すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイド系リガンドは、より低濃度でより高い活性を提供する。さらに、ＥｃＲ遺伝子スイッチに基づくトランス活性化がしばしば細胞株依存性であるので、各適用のための最大トランス活性化能を得るためにスイッチング系を作製することは容易である。さらに、２ハイブリッド系により、スイッチングパートナーとして未修飾ＲＸＲを使用した場合にしばしば起こるＲＸＲの過剰発現に起因するいつかの副作用が回避される。好ましい２ハイブリッド系では、ＥｃＲまたはＲＸＲの天然のＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが排除され、結果として、これらのハイブリッド分子は細胞中に存在する他のステロイド系ホルモン受容体と相互作用する機会が減少し、それにより副作用が減少する。
エクジソン受容体ベースの遺伝子制御系の改良により、種々の適用でのその用途が広がり、既存のものよりもより高い活性を有するリガンドの需要が増大している。米国特許出願第６，２５８，６０３号（およびその中で言及された特許）はジベンゾイルヒドラジンリガンドについて開示していた。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号パンフレット 国際公開第ＷＯ９７／３８１１７号パンフレット 国際公開第ＷＯ９９／５８１５５号パンフレット 国際公開第ＷＯ９９／０２６８３号パンフレット 米国特許第５，５３０，０２８号明細書 米国特許第６，２６５，１７３号明細書 米国特許第５，８８０，３３３号明細書 米国特許第６，２５８，６０３号明細書
Ｗｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５４１４−５４１８ Ａｒｎｈｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｃｅｌｌ ６２：５１−６１ Ｆｉｌｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：２７５５０−２７５６０ Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０１９−２４ Ｂｅｌｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３：４６０４−７ Ｄｈａｄｉａｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３：５４５−５６９ Ｋｏｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｃｅｌｌ，６７：５９−７７ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ Ｋ．Ｓ．，Ｍａｒｋ Ｍ．Ｒ．，Ｂａｊａ Ｊ．Ｖ．，Ｇｏｄｏｗｓｋｉ Ｐ．Ｊ．１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：６３１４−６３１８ Ｎｏ Ｄ．，Ｙａｏ Ｔ．Ｐ．，Ｅｖａｎｓ Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３３４６−３３５１ Ｓｕｈｒ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５ ： ７９９９−８００４
既知の受容体を利用して遺伝子発現を制御するための様々なアプローチを提供するためには、ステロイド系でもジアシルヒドラジンでもない新規のクラスのリガンドを開発する持続的な必要が依然としてある。本発明者らは、以前には導入遺伝子の発現を調節する能力を有することが証明されていないあるクラスのリガンドを見いだした。
本発明は、一般式Ｉ〜ＩＩＩの化合物に関する。
Figure 2010187690
本発明は、式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩのリガンドを使用してエクジソン受容体に基づく誘導遺伝子発現系をトランス活性化する方法、並びに宿主細胞内へ遺伝子発現調節系を導入するステップと、および式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩのリガンドを使用してその系を活性化するステップとにより宿主細胞内の遺伝子の発現を調節する方法にさらに関する。
図１は、本発明の化合物によるカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＥｃＲのトランス活性化を測定するために使用したスイッチおよびレポーター構築物の略図である。
本発明は、一般式Ｉ〜ＩＩＩの化合物に関する：
Figure 2010187690
式中、Ｑ１およびＱ２は独立してＯおよびＳからなる群から選択される；
ｎ＝１もしくは２である；
Ｒ１は：
ａ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）ハロアルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ２−Ｃ６）ハロアルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルオキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルアミノ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルアミノ、ジ（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、もしくはシアノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；または
ｂ）非置換もしくは置換の、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリルであるが、ここでこれらの置換基は独立して下記の１から４つから選択される：
ｉ シアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルケニル、（Ｃ３−Ｃ６）アルカジエニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロハロアルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルオキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルチオ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルチオ、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルスルフィニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルケニルスルフィニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルスルホニル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ３−Ｃ６）（シクロアルキル）アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルコキシアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ３−Ｃ６）（シクロアルキル）アミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、もしくはトリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシリル；または
ｉｉ 非置換もしくは置換の、フェニル、フェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリル、フェノキシ、ヘテロシクリルオキシ、ベンゾイル、ヘテロシクリルカルボニル、フェニルチオ、ヘテロシクリルチオ、フェニルスルホニル、もしくはヘテロシクリルスルホニル、ここで１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニルおよびシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルからなる群から選択され、
ここで前記置換フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリル基では、２つの隣接置換位置はそれらが結合する原子と一緒に結合して非置換もしくは置換の、不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、４−、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成してもよいが、ここで：
複素環はＮ、Ｏ、もしくはＳから選択される１から３個のヘテロ原子を含有している；および１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される；
ただしＲ１がフェニルであるときに、フェニルが少なくとも２つの隣接位置で置換されていることを前提とするが；ここで置換基は融合して１つの環を形成する；
Ｒ２およびＲ３は独立して以下のものから選択される：
ａ）シアノ、アミノカルボニル、カルボキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）ハロアルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、シアノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、もしくはカルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；または
ｂ）非置換もしくは置換の、フェニル、フェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ベンゾイル、ナフチル、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリル、ヘテロシクリルカルボニル、ここで１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルからなる群から選択される；
ここでＲ２およびＲ３はそれらが結合している炭素と一緒に結合して非置換もしくは置換の、部分不飽和もしくは飽和の、３−、４−、５−、６−、７−もしくは８−員炭素環もしくは複素環を形成することができ、ここで複素環はＯ、Ｎ、もしくはＳから選択される１から３個のヘテロ原子を含有する；および１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、オキソ、メトキシイミノ、およびスピロ−（Ｃ１−Ｃ４）アルカジオキシからなる群から選択される；
Ｒ４は以下のものから選択される：
ａ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）ハロアルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ２−Ｃ６）ハロアルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルオキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルアミノ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルアミノ、ジ（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、もしくはシアノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；または
ｂ）非置換もしくは置換の、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリル基、ここで１から４つの置換基は独立して以下のものから選択される：
ｉ シアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルケニル、（Ｃ３−Ｃ６）アルカジエニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロハロアルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルオキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルチオ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルチオ、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルスルフィニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルケニルスルフィニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルスルホニル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ３−Ｃ６）（シクロアルキル）アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルコキシアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ３−Ｃ６）（シクロアルキル）アミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、もしくはトリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシリル；または
ｉｉ 非置換もしくは置換の、フェニル、フェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリル、フェノキシ、ヘテロシクリルオキシ、ベンゾイル、ヘテロシクリルカルボニル、フェニルチオ、ヘテロシクリルチオ、フェニルスルホニル、もしくはヘテロシクリルスルホニル、ここで１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニルおよびシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルからなる群から選択され；
ここで前記置換フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリル基では、Ｒ４上の、２つの隣接置換位置はそれらが結合する原子と一緒に結合して非置換もしくは置換の、不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、４−、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成してもよいが、ここで複素環はＮ、Ｏ、もしくはＳから選択される１から３個のヘテロ原子を含有する；および１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される；
Ｒ５は：
ａ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）ハロアルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ２−Ｃ６）ハロアルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、もしくはシアノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；または
ｂ）非置換もしくは置換の、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリルであるが、ここで１から４つの置換基は独立して以下のものから選択される：
ｉ シアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルケニル、（Ｃ３−Ｃ６）アルカジエニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロハロアルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルオキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルチオ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルチオ、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルスルフィニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルケニルスルフィニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルスルホニル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルスルフィニル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ３−Ｃ６）（シクロアルキル）アミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルコキシアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ３−Ｃ６）（シクロアルキル）アミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、もしくはトリ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシリル；または
ｉｉ 非置換もしくは置換の、フェニル、フェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリル、フェノキシ、ヘテロシクリルオキシ、ベンゾイル、ヘテロシクリルカルボニル、フェニルチオ、ヘテロシクリルチオ、フェニルスルホニル、もしくはヘテロシクリルスルホニル、ここで１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルからなる群から選択される、
ここで前記置換フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリル基では、２つの隣接置換位置はそれらが結合する原子と一緒に結合されて非置換もしくは置換の、不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、４−、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成してもよいが、ここで複素環はＮ、Ｏ、もしくはＳから選択される１から３個のヘテロ原子を含有する；および１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される；および
Ｒ６およびＲ７は独立して以下のものから選択される：
ａ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）ハロアルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ２−Ｃ６）ハロアルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルコキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルオキシ、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルチオ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルアミノ、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ６）ハロアルキルアミノ、ジ（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、もしくはシアノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；または
ｂ）非置換もしくは置換の、フェニル、フェニル（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヘテロシクリル、フェノキシ、ヘテロシクロキシ、フェニルチオ、ヘテロシクリルチオ、ナフチル、フェニルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、Ｎ−フェニル−Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、もしくはＮ−ヘテロシクリル−Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノ、ここで１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルからなる群から選択されるが、
ここでＲ６およびＲ７はそれらが結合しているリンと一緒に結合して不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、非置換もしくは置換の、４−から７−員複素環を形成することができ、ここで複素環は１個のリン、および０から３個のＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子を含有する；および１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される。
式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物は下記の場合に好ましい：
式中、Ｑ１はＯおよびＱ２はＳであり、ｎ＝２であり；
Ｒ１は非置換もしくは置換の、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリル基であり、ここで置換基は独立して下記の基：シアノ、ニトロ、ハロ、アミノ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ３）アルケニルオキシ、（Ｃ３）アルキニルオキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ３）アルケニルチオ、（Ｃ３）アルキニルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルのうちの１から４つの基からなる群から選択されるが；
ここで前記置換フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリルでは、２つの隣接置換位置はそれらが結合する原子と一緒に結合されて非置換もしくは置換の、不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、４−、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成してもよいが、ここで：
複素環はＮ、Ｏ、もしくはＳから選択される１から３個のヘテロ原子を含有しており；および
１から４つの置換基は独立して：シアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される；
ただしＲ１がフェニルであるときに、フェニルが少なくとも２つの隣接位置で置換されていることを前提とするが；その置換基は融合して１つの環を形成する；
Ｒ４は非置換もしくは置換の、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリル基から選択されるが、ここで１から４つの置換基は独立して以下のものから選択される：
ａ）シアノ、ニトロ、ハロ、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ３）アルケニルオキシ、（Ｃ３）アルキニルオキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、もしくはシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；または
ｂ）非置換もしくは置換の、フェニル、フェニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ヘテロシクリル、フェノキシ、ヘテロシクリルオキシ、ベンゾイル、ヘテロシクリルカルボニル、フェニルチオ、ヘテロシクリルチオ、フェニルスルホニル、もしくはヘテロシクリルスルホニル、ここで１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルからなる群から選択されるが、
ここでＲ４上の２つの隣接位置はそれらが結合している原子と一緒に結合して非置換もしくは置換の、不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、４−、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成することができ、ここで：
複素環はＮ、Ｏ、もしくはＳから選択される１から３個のヘテロ原子を含有しており；および１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される；および
Ｒ６およびＲ７は独立して以下のものから選択される：
ａ）（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ３）アルケニルオキシ、（Ｃ３）アルキニルオキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルカルボニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、もしくはシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル；または
ｂ）非置換もしくは置換の、フェニル、フェニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、フェノキシ、フェニルチオ、ナフチル、フェニルアミノ、もしくはＮ−フェニル−Ｎ−（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ここで１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、ホルミル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルから選択され、および
ここでＲ６およびＲ７はそれらが結合しているリンと一緒に結合して不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、非置換もしくは置換の、４−から７−員複素環を形成することができるが、ここで複素環は１個のリン、および０から３個のＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子を含有する；および１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される。
式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物は下記の場合により好ましい：
式中、Ｑ１はＯ、Ｑ２はＳ、およびｎ＝２であり；
Ｒ１は非置換もしくは置換の、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリル基であるが、ここで置換基は独立して下記の基：ハロ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、およびジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノの１から４つの基からなる群から選択される；
ここで前記置換フェニル、ナフチルもしくはヘテロシクリルにおいて、２つの隣接置換位置はそれらが結合している原子と一緒に結合して非置換もしくは置換の、不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、４−、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成することができるが、ここで：
複素環はＮ、Ｏ、もしくはＳから選択される１から３個のヘテロ原子を含有しており；および
１から４つの置換基は独立して：シアノ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される；
ただしＲ１がフェニルであるときに、フェニルが少なくとも２つの隣接位置で置換されていることを前提とするが；その置換基は融合して１つの環を形成する；
Ｒ２およびＲ３は独立して：（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）ハロシクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）ハロアルケニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニルアミノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、シアノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、およびカルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルからなる群から選択されるが；
ここでＲ２およびＲ３はそれらが結合している炭素と一緒に結合して非置換もしくは置換の、部分不飽和もしくは飽和３−、４−、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成することができるが、ここで複素環はＯもしくはＳから選択される１から３個のヘテロ原子を含有する；および１から４つの置換基は独立して：シアノ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニルからなる群から選択される；
Ｒ４は非置換もしくは置換の、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくは他のヘテロシクリルから選択されるが、ここで１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニルから選択され；
ここでＲ４上の２つの隣接位置はそれらが結合している原子と一緒に結合して非置換もしくは置換の、不飽和、部分不飽和もしくは飽和の、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成することができるが、ここで複素環はＮ、Ｏ、もしくはＳから選択される１から３個のヘテロ原子を含有する；および１から４つの置換基は独立してシアノ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される；
Ｒ５は非置換もしくは置換の、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、フェニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニル（Ｃ２−Ｃ３）アルケニル、ナフチル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェノキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、フェニルアミノ、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、フラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、イソキサゾリル、イミダゾリルもしくはその他のヘテロシクリルであり、ここで１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ３）アルケニルオキシ、（Ｃ３）アルキニルオキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ３）アルケニルチオ、（Ｃ３）アルキニルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルフィニル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルからなる群から選択されるが；
ここで２つの隣接位置はそれらが結合している原子と一緒に結合して非置換もしくは置換の、不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、４−、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成することができるが、ここで：
複素環はＮ、Ｏ、もしくはＳから選択される１から３個のヘテロ原子を含有しており；および１から４つの置換基は独立してシアノ、ニトロ、ハロ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、カルボキシ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、カルバモイル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、シアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される；および
Ｒ６およびＲ７は独立して（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、および非置換もしくは置換のフェニルからなる群から選択されるが、ここで置換基は１から４つであって、置換基は、シアノ、ニトロ、ハロ、ホルミル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルコキシ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルチオ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびシアノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルからなる群から独立して選択され、
ここでＲ６およびＲ７はそれらが結合しているリンと一緒に結合して不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、非置換もしくは置換の、５−から６−員複素環を形成することができるが、ここで複素環は１個のリンおよび０から３個のＮ、Ｏ、もしくはＳから選択されるヘテロ原子を含有する；および１から４つの置換基は（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から独立して選択される。
式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物は下記の場合にいっそうより好ましい：
式中、Ｑ１はＯ、Ｑ２はＳ、およびｎ＝２であり；
Ｒ１は置換フェニルであるが、ここで１から２つの置換基は（Ｃ１−Ｃ２）アルキルおよび（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシからなる群から独立して選択され；
ここで前記置換フェニルでは、２つの隣接位置はそれらが結合している原子と一緒に結合して非置換もしくは置換の、不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成するが、ここで：
複素環は１から２個の酸素原子を含有する；および
１から４つの置換基は独立してシアノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノカルボニル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される；
Ｒ２およびＲ３は独立して（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルチオ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルフィニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルスルホニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルカルボニルアミノ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、および（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシカルボニル（Ｃ１−Ｃ３）アルキルからなる群から選択され；
ここでＲ２およびＲ３はそれらが結合している炭素と一緒に結合して非置換もしくは置換の、部分不飽和、もしくは飽和の、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成することができるが、ここで：
複素環はＯもしくはＳから選択される１個のヘテロ原子を含有する；および
１から４つの置換基は独立して（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニル、およびジ（Ｃ１−Ｃ３）アルキルアミノカルボニルからなる群から選択される；
Ｒ４は非置換もしくは置換の、フェニルもしくはピリジルから選択され、ここで１から４つの置換基は独立して（Ｃ１−Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１−Ｃ３）アルコキシからなる群から選択される；
Ｒ５は非置換もしくは置換のフェニルであるが、ここで１から２つの置換基は独立して（Ｃ１−Ｃ２）アルキルおよび（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシからなる群から選択されるが；
ここで２つの隣接位置はそれらが結合している原子と一緒に結合して非置換もしくは置換の、不飽和、部分不飽和、もしくは飽和の、５−、６−もしくは７−員炭素環もしくは複素環を形成することができるが、ここで：
複素環は１から２個の酸素原子を含有する；および
１から４つの置換基は独立してシアノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ、（Ｃ１−Ｃ２）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノカルボニル、オキソ、およびメトキシイミノからなる群から選択される；および
Ｒ６およびＲ７はそれらが結合しているリンと一緒に結合して飽和、非置換もしくは置換の、５−もしくは６−員複素環を形成するが、ここで複素環は１個のリンおよび１から２個のＮ、Ｏ、もしくはＳから選択されるヘテロ原子を含有する；および１から４つの置換基は独立して（Ｃ１−Ｃ３）アルキルおよび（Ｃ１−Ｃ３）ハロアルキルからなる群から選択される。
式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物は下記の場合に最も好ましい：
式中、Ｑ１はＯ、Ｑ２はＳ、およびｎ＝２であり；
Ｒ１は、２−メチル−３，４−メチレンジオキシフェニル、２−エチル−３，４−メチレンジオキシフェニル、２−メチル−３，４−エチレンジオキシフェニル、２−エチル−３，４−エチレンジオキシフェニル、２−メチル−３，４−オキシジメチレンフェニル、２−エチル−３，４−オキシジメチレンフェニル、２−メチル−３，４−オキシトリメチレンフェニル、および２−エチル−３，４−オキシトリメチレンフェニルからなる群から選択される；
Ｒ５は４−エチルフェニル、３−フルオロ−４−エチルフェニル、２−フルオロ−４−エチルフェニル、２，３−ジメチルフェニル、２，３−ジエチルフェニル、２−メチル−３−メトキシフェニル、２−エチル−３−メトキシフェニル、２−メチル−３，４−メチレンジオキシフェニル、２−エチル−３，４−メチレンジオキシフェニル、２−メチル−３，４−エチレンジオキシフェニル、２−エチル−３，４−エチレンジオキシフェニル、２−メチル−３，４−オキシジメチレンフェニル、２−エチル−３，４−オキシジメチレンフェニル、２−メチル−３，４−オキシトリメチレンフェニル、２−エチル−３，４−オキシトリメチレンフェニル、２−メチル−３，４−ジメチレンオキシフェニル、２−エチル−３，４−ジメチレンオキシフェニル、２−メチル−３，４−トリメチレンオキシフェニルおよび２−エチル−３，４−トリメチレンオキシフェニルからなる群から選択される；および
Ｒ６およびＲ７はそれらが結合しているリンと一緒に飽和６−員複素環を形成するが、ここで複素環は１つのリンおよび２個の酸素原子を含有しており、そして２個の酸素原子は（Ｃ１−Ｃ２）アルキルの４つまでの置換基を有する３個の炭素原子によって結合されている。
合成
本発明の化合物は、当業者であれば容易に認識するであろう下記の合成経路によって製造することができる。
方法Ａ
式Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩの化合物は、カップリング剤によって媒介される酸ハロゲン化物または酸との反応によって式ＩＶのアミン化合物から調製できる。そこで、カルボン酸塩化物であるＲ１ＣＯＣｌもしくはＲ１ＣＯ２Ｈとジイソプロピルカルボジイミドなどのカップリング剤とを組み合わせて使用すると式Ｉの化合物が得られる。
Figure 2010187690
スルホニルクロライドＲ５ＳＯ２Ｃｌを使用すると式ＩＩの化合物が得られる。
Figure 2010187690
そして、ホスホリルクロライド（Ｒ６Ｒ７Ｐ（＝Ｏ）Ｃｌ）またはチオホスホリルクロライド（Ｒ６Ｒ７Ｐ（＝Ｓ）Ｃｌ）を使用すると式ＩＩＩの化合物が得られる。
Figure 2010187690
式ＩＶのアミン化合物は当業者に知られている様々な方法によって入手できる（Ｌａｒｒａｍｏｎａ Ｃ．Ｒ．， Ｈｅｂｄ． Ｓｅａｎｃｅｓ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９５１，２３２，８４９；Ｏｇａｔａ Ｙ．ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７７，４２，４０６１〜４０６６；Ｓｕｚｕｋｉ Ｍ．ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７３，３８，３５７１〜３５７５；Ｂｅｓｔｍａｎｎ，Ｈ．Ｊ．；Ｋｕｎｓｔｍａｎｎ，Ｒ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９６９，１０２，１８１６〜１８３２；Ｆａｒｎｕｍ Ｄ．Ｇ．；Ｃａｒｌｓｏｎ Ｇ．Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９７２，１９１〜２を参照）。
方法Ｂ
あるいはまた、式Ｉの化合物は式ＶのＷｅｉｎｒｅｂアミド並びにＧｒｉｇｎａｒｄおよび有機リチウム試薬などの式ＶＩの有機金属試薬から調製される。
Figure 2010187690
アミドＶはＫｅｍｐ Ａ．；Ｎｅｒ Ｓ．Ｋ．；Ｒｅｅｓ Ｌ．；Ｓｕｃｋｌｉｎｇ Ｃ．Ｊ．；Ｔｅｄｆｏｒｄ Ｍ．Ｃ．；Ｂｅｌｌ Ａ．Ｒ．；Ｗｒｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈ Ｒ．Ｊ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．２，１９９３，７４１〜７４８の方法にしたがってアザラクトンＶＩＩから調製される。
Figure 2010187690
方法Ｃ
さらに、式Ｉの化合物は式ＶＩＩＩの第２級アルコールから調製される。この酸化反応は、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンおよびピリジニウムクロロクロメートを含む様々な試薬によって実施することができる。
Figure 2010187690
第２級アルコールであるＶＩＩＩはアルデヒドＩＸと有機金属試薬ＶＩとの反応によって調製される。
Figure 2010187690
アルデヒドＩＸは、当業者に知られている様々な酸化剤を使用する第１級アルコールＸの酸化によって調製される。
Figure 2010187690
第１級アルコールＸは、Ｒ１＝式ＩＩの場合に、アザラクトンＶＩＩの還元によって
Figure 2010187690
またはアミノアルコールＸＩと酸クロライドＲ１ＣＯＣｌとの反応によって調製される。
Figure 2010187690
方法Ｄ
さらに、式ＩＩの化合物は式ＸＩＩの第２級アルコールから調製される。この酸化反応は、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンおよびピリジニウムクロロクロメートを含む様々な試薬によって実施できる。
Figure 2010187690
第２級アルコールであるＸＩＩはスルホニルクロライドとアミノアルコールＸＩＩＩとの反応によって調製される：
Figure 2010187690
対応するアミノアルコールＸＩＩＩと酸クロライドとの反応は第２級アルコールＶＩＩＩを生じさせる：
Figure 2010187690
アミノアルコールＸＩＩＩはニトロアルコールＸＩＶの還元によって調製される。この還元反応は、酸性条件下で亜鉛を含む様々な試薬によって実施することができる。
Figure 2010187690
ニトロアルコールＸＩＶは塩基性条件下でアルデヒドとの反応によって調製される。
Figure 2010187690
式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物は多数の光学活性炭素原子を含有している場合があるので、それらはエナンチオマー、ジアステレオマー、ステレオイソマー、またはそれらの混合物として存在している可能性がある。
用語「アルキル」には、分岐および直鎖のアルキル基が含まれる。典型的なアルキル基には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソオクチル、ノニル、およびデシルが含まれる。
用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードをいう。
用語「ハロアルキル」は、１以上のハロ基で置換されたアルキル基（例えば、クロロメチル、２−ブロモエチル、３−ヨードプロピル、トリフルオロメチル、およびペルフルオロプロピルなど）をいう。
用語「シクロアルキル」は、任意選択的にアルキル、水酸基、またはハロで置換された環状脂肪族環構造（シクロプロピル、メチルシクロプロピル、シクロブチル、２−ヒドロキシシクロペンチル、シクロヘキシル、および４−クロロシクロヘキシルなど）をいう。
用語「ヒドロキシアルキル」は、１以上の水酸基で置換されたアルキル基（例えば、ヒドロキシメチルおよび２，３−ジヒドロキシブチルなど）をいう。
用語「アルキルスルホニル」は、アルキル基に置換されたスルホニル部分（例えば、メシルおよびｎ−プロピルスルホニルなど）をいう。
用語「アルケニル」は、１つまたは２つのエチレン結合を有するエチレン性不飽和炭化水素基（直鎖または分岐鎖）（例えば、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソプロペニル、および２−ペンテニルなど）をいう。
用語「ハロアルキル」は、１以上のハロ基で置換されたアルケニル基をいう。
用語「アルキニル」は、１つまたは２つのアセチレン結合を有する不飽和炭化水素基（直鎖または分岐鎖）（例えば、エチニルおよびプロパギルなど）をいう。
用語「アルキルカルボニル」は、アルキルケト官能基（例えば、アセチルおよびｎ−ブチリルなど）をいう。
用語「フラッシュクロマトグラフィ」は、典型的には１０〜５０ｐｓｉの範囲の空気、アルゴン、または窒素圧下で行うシリカゲルクロマトグラフィをいう。
用語「グラジエントクロマトグラフィー」は、化学物質が漸進的に変化する溶媒混合液の組成物を備えるカラムから溶出されるシリカゲルクロマトグラフィーを意味する。
用語「Ｒｆ」は、溶出溶媒系の移動距離と比較した薄層クロマトグラフィプレート上の目的の化学物質の移動の画分距離をいう。
用語「Ｐａｒｒ水素化装置」および「Ｐａｒｒ攪拌機」は、目的の化学物質を含有する溶液と任意の固体懸濁触媒および加圧された内蔵される反応ガス雰囲気との強力な混合を容易にするように設計されたＰａｒｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社（イリノイ州モリーン）から入手できる装置を意味する。典型的には、ガスは水素であり、触媒は小さな活性炭粒子上に堆積したパラジウム、白金、またはその酸化物である。水素圧は、典型的には３０から７０ｐｓｉの範囲内である。
用語「Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬」は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ／Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から入手できるジクロロメタン中の溶液としての（１，１，１−トリアセトキシ）−１，１−ジヒドロ−１，２−ベンズヨードキソール−３（１Ｈ）−オンを意味する。
用語「ＰＳ−ＮＭＭ」は、Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州サンカルロス）から入手できる−ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ２）３−モルホリン官能化ポリスチレン樹脂を意味する。
用語「ＡＰ−ＮＣＯ」は、Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州サンカルロス）から入手できるイソシアネート官能化樹脂を意味する。
用語「ＡＰ−トリサミン」は、Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州サンカルロス）から入手できるポリスチレン−ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）２樹脂を意味する。
用語「ＰＳ−ＴｓＮＨＮＨ２樹脂」は、Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州サンカルロス）から入手できるポリスチレン−Ｐｈ−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＮＨ２樹脂を意味する。
用語「ヒドロキシベンゾトリアゾール樹脂」は、ヒドロキシベンゾトリアゾール修飾ポリスチレン樹脂を意味する；１つのタイプはＡｒｇｏｎａｕｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州サンカルロス）から入手できる。
用語「Ｃｈｅｍ Ｅｌｕｔｅ」および「Ｃｈｅｍ Ｅｌｕｔｅカートリッジ」は、Ｖａｒｉａｎ社から入手できる化合物精製のために使用される珪藻土固相抽出媒体を意味する。
用語「ヘテロシクリル」または「複素環」は、１つ、２つ、または３つのヘテロ原子、好ましくは独立して酸素、窒素、および硫黄からなる群から選択された１つまたは２つのヘテロ原子を含む置換または非置換で、飽和、部分的不飽和、または不飽和の５または６員環をいう。複素環の例には、例えば、ピリジル、チエニル、フリル、ピリミジル、ピラジニル、キノリニル、イソキノリニル、ピロリル、インドリル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、モルホリニル、ピペラジニル、ジオキソラニル、およびジオキサニルが含まれる。
用語「アルコキシ」には、末端酸素原子に結合した分岐鎖および直鎖アルキル基の両方が含まれる。典型的なアルコキシ基には、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｔｅｒｔ−ブトキシが含まれる。
用語「ハロアルコキシ」は、１以上のハロ基で置換されたアルコキシ基（例えば、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、およびペルフルオロイソブトキシなど）をいう。
用語「アルキルチオ」には、末端硫黄原子に結合した分岐鎖および直鎖アルキル基の両方（例えば、メチルチオなど）が含まれる。
用語「ハロアルキルチオ」は、１以上のハロ基で置換されたアルキルチオ基（例えば、トリフルオロメチルチオなど）をいう。
用語「アルコキシアルキル」は、アルコキシ基で置換されたアルキル基（例えば、イソプロポキシメチルなど）をいう。
本発明の目的のための用語「単離」は、その元の環境（天然に存在する環境）から取り出された生体物質（核酸またはタンパク質）を示す。例えば、植物または動物中の天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、天然に存在する隣接核酸から分離されたこの同じポリヌクレオチドは、「単離された」と見なす。用語「精製」は、物質が他の化合物の存在を除いた、絶対純度を示す形態で存在する必要はない。それらはむしろ相対的な定義である。
ポリヌクレオチドは、出発物質または天然の物質の精製後、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、好ましくは４または５桁「精製された」状態にある。
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合したサブユニットから構成される高分子化合物である。核酸には、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（その両方が一本鎖または二本鎖であり得る）が含まれる。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡは、線状、環状、またはスーパーコイルであり得る。
「核酸分子」は、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン：「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）またはその任意のホスホエステルアナログ（ホスホロチオエートおよびチオエステルなど）のリン酸エステル重合形態をいう。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語「核酸分子」、特に「ＤＮＡまたはＲＮＡ分子」は、分子の一次構造および二次構造のみをいい、いかなる特定の三次元形態に制限されない。したがって、この用語には、特に線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミド、および染色体で見出される二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の考察では、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’→３’方向の配列のみを示す通常の慣習にしたがって、本明細書中に配列を記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
用語「フラグメント」は、基準核酸と比較して短い長さのヌクレオチド配列を意味し、共通部分（基準核酸と同一のヌクレオチド配列）を含むと理解される。本発明のこのような核酸フラグメントは、必要に応じて、それを構成するより長いポリヌクレオチド中に含めることができる。このようなフラグメントは、本発明の核酸の少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００、または１５００個の連続ヌクレオチド長範囲のオリゴヌクレオチドを含むか、またはこれらからなる。
本明細書中で使用される、「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖または二本鎖で、任意選択的に合成、非天然、または変化したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１以上のセグメントから構成され得る。
「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリをいい、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸が含まれる。「遺伝子」はまた、特定のタンパク質またはポリペプチドを発現し、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に制御配列を含む核酸フラグメントをいう。「天然の遺伝子」は、それ自体の制御配列を有する天然で見出される遺伝子をいう。「キメラ遺伝子」は、天然で共に見出されない制御配列および／またはコード配列を含む天然の遺伝子ではない任意の遺伝子をいう。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源由来の制御配列およびコード配列、または同一の供給源由来の制御配列およびコード配列であるが、（天然で見出されるものと異なる様式で配置されているもの）を含み得る。キメラ遺伝子は、異なる供給源由来のコード配列および／または異なる供給源由来の制御配列を含み得る。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然の位置における天然の遺伝子をいう。「外来」遺伝子または「異種」遺伝子は、宿主生物中で通常見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子をいう。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然の遺伝子またはキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに組み込まれた遺伝子である。
「異種」ＤＮＡは、細胞中または細胞の染色体部位中に天然に存在しないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡには、細胞に対して外来の遺伝子が含まれる。
用語「ゲノム」には、染色体ならびにミトコンドリア、クロロプラスト、およびウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。
核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液のイオン強度について適切な条件下で他の核酸分子にアニーリングすることができる場合、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズする」ことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと（後述する））。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９），（特に、１１章および表１１．１）（その全体が本明細書中で参考として援用される）で説明されている。温度およびイオン強度条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決定される。
中程度に類似のフラグメント（遠縁にあたる生物由来の相同配列など）、高度に類似するフラグメント（近縁の生物由来の機能酵素を複製する遺伝子など）をスクリーニングするために、ストリンジェンシー条件を調節することができる。相同核酸の予備スクリーニングのために、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（Ｔｍ５５°に相当する）を使用することができる（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、０．２５％ミルク、ホルムアミドなし；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ（例えば、４０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ）に相当する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ（例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ）に相当する。
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能であることが必要である。用語「相補性」は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用する。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。したがって、本発明はまた、本明細書中に開示されているか使用されている完全な配列に相補的な単離された核酸フラグメントおよび実質的に類似の核酸配列を含む。
本発明の特定の実施形態では、５５℃のＴｍでのハイブリダイゼーション工程を含むハイブリダイゼーション条件の使用および上記条件の使用によってポリヌクレオチドを検出する。好ましい実施形態では、Ｔｍは６０℃であり、より好ましい実施形態では、Ｔｍは６３℃であり、さらにより好ましい実施形態では、Ｔｍは６５℃である。
ハイブリダイゼーション後の洗浄もまた、ストリンジェンシー条件を決定する。一組の好ましい条件は、６×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳでの、室温で１５分間から開始し、その後２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの４５℃で３０分間を繰り返し、その後０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの５０℃で３０分間を２回を繰り返す一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェント条件の組は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの３０分間で２回の洗浄における温度を６０℃に上昇させること以外は、洗浄が上記条件と同一である、より高温を使用する。別の好ましい高ストリンジェンシー条件の組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で２回の最終洗浄を使用する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能であることが必要である。
核酸のハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度（当該分野で周知の変数）に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相補性が高いほどこれらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍ値が高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（高Ｔｍに対応する）は、以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，９．５０−０．５１を参照のこと（上述））。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションのために、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さにより、その特異性が決定される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１１．７−１１．８を参照のこと（上述））。
本発明の特定の実施形態では、５００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃のハイブリダイゼーション工程および少なくとも６３℃で２×ＳＳＰＥの洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件の使用によってポリヌクレオチドを検出する。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程のために２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃を含む。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程の両方のための２×ＳＳＰＥおよび６３℃を含む。
１つの実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度を必要に応じてプローブの長さなどの因子に従って調節することができることを認識する。
用語「プローブ」は、相補的一本鎖標的核酸と塩基対を形成して二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子をいう。
本明細書中で使用される、用語「オリゴヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡ、またはｍＲＮＡ分子とハイブリダイズすることができる一般に少なくとも１８ヌクレオチドの核酸をいう。オリゴヌクレオチドを、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチドで、またはビオチンなどの標識が共有結合したヌクレオチドで、標識することができる。標識オリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、核酸の存在を検出することができる。核酸の全長またはフラグメントのクローニングのため、または核酸の存在を検出するために、オリゴヌクレオチド（標識することができる１つまたは両方）をＰＣＲプライマーとして使用することができる。オリゴヌクレオチドを使用して、ＤＮＡ分子と三重ヘリックスを形成することもできる。好ましくは核酸合成機によって、一般にオリゴヌクレオチドを合成する。したがって、天然に生じないホスホエステルアナログ結合（たとえば、チオエステル結合など）を使用してオリゴヌクレオチドを調製することができる。
「プライマー」は、適切な条件下でのＤＮＡ合成のための開始点として使用することができる二本鎖核酸領域を作製するための標的核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。このようなプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応で使用することができる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと略し、特定の核酸配列を酵素的に増幅するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を意味する。ＰＣＲは、以下の３つの段階を含む各サイクルを使用した温度サイクルの一連の繰り返しを含む：標的分子鎖を分離するためのテンプレート核酸の変性、テンプレート核酸への一本鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングしたプライマーの伸長。ＰＣＲは、核酸の出発プール内の標的分子の相対量を決定するための、定量的または半定量的条件下での標的分子の存在を検出するための手段を提供する。
「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＲＴ−ＰＣＲと略され、ＲＮＡ分子由来の標的ｃＤＮＡ分子を酵素的に産生し、その後、上述のように、標的ｃＤＮＡ分子内の特定の核酸配列の酵素的増幅のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を意味する。ＲＴ−ＰＣＲもまた、核酸の出発プール内の標的分子の相対量を決定するための、定量的または半定量的条件下での標的分子の存在を検出するための手段を提供する。
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な制御配列の制御下に置かれた場合にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにて細胞中で転写およびポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列をいう。制御配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造が含まれ得る。５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終結コドンによってコード配列の境界が決定される。コード配列には、原核生物配列、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。コード配列が真核細胞での発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’に位置する。
「読み取り枠」はＯＲＦと略され、ＡＴＧまたはＡＵＧなどの翻訳開始シグナルまたは開始コドンおよび終結コドンを含み、ポリペプチド配列に翻訳することができる可能性のある核酸配列（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡのいずれか）の長さを意味する。
用語「ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ」は、本明細書中で２つのポリヌクレオチド配列の互いの方向を記載するために使用される。一方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端に隣接し、それにより各ポリヌクレオチドの転写方向が他方のポリヌクレオチドの５’末端から離れて進行する場合、２つのポリヌクレオチドは、ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ方向にある。用語「ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ」は、（５’）−ｔｏ−（５’）と略すことができ、記号（←→）または（３’←５’５’→３’）によって示すこともできる。
用語「ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ」は、本明細書中で２つのポリヌクレオチド配列の互いの方向を記載するために使用される。一方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接し、それにより各ポリヌクレオチドの転写方向が他方のポリヌクレオチドに向かって進行する場合、２つのポリヌクレオチドは、ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ方向にある。用語「ｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ」は、（３’）−ｔｏ−（３’）と略すことができ、記号（→←）または（５’→３’３’←５’）によって示すこともできる。
用語「ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ」は、本明細書中で２つのポリヌクレオチド配列の互いの方向を記載するために使用される。一方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接し、それにより各ポリヌクレオチドの転写方向が他方のポリヌクレオチドのと同一の方向で進行する場合、２つのポリヌクレオチドは、ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ方向にある。用語「ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ」は、（５’）−ｔｏ−（３’）と略すことができ、記号（→→）または（５’→３’５’→３’）によって示すこともできる。
用語「下流」は、基準ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、下流ヌクレオチド配列は、一般に、転写開始点に続く配列をいう。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
用語「上流」は、基準ヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオチド配列をいう。特に、上流ヌクレオチド配列は、一般に、コード配列または転写開始点の５’側に位置する配列をいう。例えば、ほとんどのプロモーターは、転写開始部位の上流に位置する。
用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、二本鎖ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に結合して切断する酵素をいう。
「相同組換え」は、外来ＤＮＡ配列の別のＤＮＡ分子への挿入（例えば、染色体中のベクターの挿入）をいう。好ましくは、ベクターは、相同組換えのための特定の染色体部位を標的する。特定の相同組換えのために、ベクターは、相補的に結合して染色体内にベクターが組み込まれることを可能にするのに充分な長さの、染色体配列に対する相同領域を含む。相同領域が長いほど配列の類似度が高くなり、相同組換え効率を増大させることができる。
当該分野で公知のいくつかの方法を使用して、本発明のポリヌクレオチドを増やすことができる。一旦適切な宿主系および成長条件が確立されると、組換え発現ベクターを大量に増殖および調製することができる。本明細書中に記載されるように、使用することができる発現ベクターには、以下のベクターまたはその誘導体が含まれ得るが、これらに限定されない：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスなどのヒトまたは動物のウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、λ）；並びにプラスミドおよびコスミドＤＮＡなど。
「ベクター」は、宿主細胞への核酸のクローニングおよび／または導入のための任意の手段である。ベクターは、結合したセグメントを複製するために別のＤＮＡセグメントを結合させることができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＮＡ複製の自律単位として機能する（すなわち、それ自体の制御下で複製することができる）任意の遺伝的要素（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語「ベクター」には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで核酸を細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルス手段が含まれる。核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み込むなどのために当該分野で公知の非常に多数のベクターを使用することができる。可能なベクターには、例えば、プラスミドまたは改変ウイルス（例えば、λ誘導体などのバクテリオファージ、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミド、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターが含まれる）が含まれる。例えば、相補的付着末端を有する選択されたベクターへの適切なＤＮＡフラグメントのライゲーションによって、応答エレメントおよびプロモーターに対応するＤＮＡフラグメントを適切なベクターに挿入することができる。あるいは、ＤＮＡ分子の末端を酵素によって修飾することができ、またはＤＮＡ末端へのヌクレオチド配列（リンカー）のライゲーションによって任意の部位を提供することができる。このようなベクターを、マーカーを細胞ゲノムに組み込んだ細胞を選択する選択マーカー遺伝子を含むように操作することができる。このようなマーカーにより、マーカーによってコードされるタンパク質を組み込んで発現する宿主細胞を同定および／または選択することができる。
ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターが、細胞および生きた動物対象における広範な遺伝子送達適用で使用されている。使用することができるウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルス、およびカリモウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、および生体高分子が含まれる。核酸に加えて、ベクターは、１以上の制御領域ならびに／または核酸導入結果（組織への導入、発現持続時間など）の選択、測定、およびモニタリングに有用な選択マーカーを含むこともできる。
用語「プラスミド」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を保有する、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態の染色体外エレメントをいう。このようなエレメントは、任意の供給源に由来する、自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列、線状、環状、またはスーパーコイルの一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであることができ、このエレメントにおいては、多数のヌクレオチド配列が、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーターフラグメントおよび選択される遺伝子産物のＤＮＡ配列を細胞に導入することができる、固有の構築物に連結または組換えられている。
「クローニングベクター」は、結合されたセグメントを複製するために別の核酸セグメントを結合することができる、連続して複製され、複製起点を含む核酸（好ましくはＤＮＡ）の単位長である「レプリコン」（たとえば、プラスミド、ファージ、またはコスミドなど）である。クローニングベクターは、ある細胞型で複製され、且つ別の細胞型で発現することができる（「シャトルベクター」）。
当該分野で公知の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体）によってベクターを所望の宿主細胞に導入することができる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；およびＨａｒｔｍｕｔ ｅｔ ａｌ．，カナダ国特許出願 Ｎｏ．２，０１２，３１１，出願日 １９９０年３月１５日を参照のこと）。
本発明のポリヌクレオチドを、リポフェクチンによってｉｎ ｖｉｖｏで導入することもできる。過去十年間で、ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸のカプセル化およびトランスフェクションのためのリポソームの使用は増加している。リポソーム媒介トランスフェクションが遭遇する困難および危険性を制限するようにデザインされた合成カチオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＰＮＡＳ ８４：７４１３；Ｍａｃｋｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１；およびＵｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８）。カチオン性脂質の使用により、負電荷の核酸のカプセル化を促進することができ、負電荷の細胞膜との融合を促進することもできる（Ｆｅｌｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｎｇｏｌｄ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８）。核酸導入のための特に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許出願公開ＷＯ９５／１８８６３号およびＷＯ９６／１７８２３号ならびに米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。外来遺伝子を特定の組織にｉｎ ｖｉｖｏで導入するためのリポフェクションの使用は一定の実用的利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子ターゲティングにより、１つの有利な領域が得られる。細胞が多様である組織（膵臓、肝臓、腎臓、および脳など）において特定の細胞型に対するトランスフェクションの指示が特に好ましいことが明らかである。ターゲティングのために脂質を他の分子に化学的に結合させることができる（Ｍａｃｋｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８８（上述））。ターゲットにされたペプチド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）および抗体などのタンパク質または非ペプチド分子をリポソームに化学的に結合させることができる。
他の分子はまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸のトランスフェクションの促進に有用である（カチオン性オリゴペプチド（例えば、ＷＯ９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８号）、またはカチオン性ポリマー（例えば、ＷＯ９５／２１９３１号）など）。
裸のＤＮＡプラスミドとしてベクターをｉｎ ｖｉｖｏで導入することも可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号を参照のこと）。受容体媒介ＤＮＡ送達アプローチを使用することもできる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４；およびＷｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６２：４４２９−４４３２）。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来または異種ＲＮＡまたはＤＮＡの取り込みを意味する。このようなＲＮＡまたはＤＮＡが細胞内に導入された場合、外来または異種ＲＮＡまたはＤＮＡによって細胞は「トランスフェクション」されている。トランスフェクションされたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化に影響を与える場合、外来または異種ＲＮＡまたはＤＮＡによって細胞は「形質転換」されている。形質転換ＲＮＡまたはＤＮＡを染色体ＤＮＡに組み込んで（共有結合させて）、細胞ゲノムを作製することができる。
「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝される宿主生物のゲノムへの核酸フラグメントの導入をいう。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物を、「トランスジェニック」、「組換え」、または「形質転換」生物という。
用語「遺伝子領域」は、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子またはヌクレオチド配列の領域をいう。
さらに、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、その増幅または発現が考慮される細胞宿主での複製のための１以上の起点、マーカー、または選択マーカーを含み得る。
用語「選択マーカー」は、マーカー遺伝子の効果（すなわち、抗生物質耐性、除草剤耐性、比色分析マーカー、酵素、および蛍光マーカーなど）に基づいて選択することができ、この効果を使用して目的の核酸の遺伝性を追跡し、そして／または目的の核酸が遺伝している細胞または生物を同定する、同定因子（通常、抗生物質または化学物質耐性遺伝子）を意味する。公知且つ当該分野で使用されている選択マーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、およびスルホンアミドなどに耐性を示す遺伝子、ならびに表現型マーカーとして使用される遺伝子（すなわち、アントシアニン制御遺伝子およびイソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子など）が含まれる。
用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができ、この効果を使用して目的の核酸の遺伝性を追跡し、目的の核酸を遺伝している細胞または生物を同定し、そして／または遺伝子発現の誘導もしくは転写を測定する、同定因子をコードする核酸を意味する。公知且つ当該分野で使用されているレポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、およびβ−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが含まれる。選択マーカー遺伝子を、レポーター遺伝子と見なすこともできる。
「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列をいう。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターはその全体が天然の遺伝子に由来し得るか、天然に見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成され得るか、または合成ＤＮＡセグメントを含み得る。異なるプロモーターは異なる組織もしくは細胞型、または異なる発達段階、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して遺伝子発現を指示することができることが当業者に理解される。ほとんどの細胞型でいつでも遺伝子を発現させるプロモーターを、一般に、「構成的プロモーター」という。特定の細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターを、一般に、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」という。特定の発生段階または細胞分化段階で遺伝子を発現させるプロモーターを、一般に、「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」という。プロモーターを誘導する薬剤、生体分子、化学物質、リガンド、または光などへの細胞の曝露または処理後に、誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターを、一般に、「誘導プロモーター」または「制御プロモーター」という。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界が完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識される。
「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼが結合して下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。本発明の定義のために、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位を境界とし、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小の塩基またはエレメント数を含むように上流（５’方向）に伸長している。プロモーター配列内に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって簡便に画定される）およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、その後トランス−ＲＮＡスプライシングされ（コード配列がイントロンを含む場合）、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、コード配列は細胞中の転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞中でコード配列を発現させるＤＮＡ制御配列（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）である。真核細胞では、ポリアデニル化シグナルが制御配列である。
用語「応答エレメント」は、第１のキメラ遺伝子のＤＮＡ結合ドメインとの相互作用をによって媒介されるプロモーターに対して応答性を付与する１以上のシス作動性ＤＮＡエレメントを意味する。このＤＮＡエレメントは、その配列中で回文構造であるか（完全または不完全）、種々の数のヌクレオチドによって分離された配列モチーフまたはハーフサイトから構成され得る。ハーフサイトは、類似しているか同一であってよく、正方向（ｄｉｒｅｃｔ）もしくは逆方向反復としてまたは１つのハーフサイトもしくは隣接するハーフサイトの縦列多量体として配置することができる。応答エレメントは、応答エレメントが組み込まれる細胞または生物の性質に依存して異なる生物から単離した最小プロモーターを含み得る。第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で、応答エレメントのＤＮＡ配列に結合し、この応答エレメントの制御下で下流遺伝子の転写を開始または抑制する。天然のエクジソン受容体の応答エレメントのためのＤＮＡ配列の例には、以下が含まれる：ＲＲＧＧ／ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（Ｃｈｅｒｂａｓ Ｌ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９１），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５，１２０−１３１を参照のこと）；ＡＧＧＴＣＡＮ（ｎ）ＡＧＧＴＣＡ（Ｎ（ｎ）は１以上のスペーサーヌクレオチドであり得る）（Ｄ’ＡｖｉｎｏＰＰ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１１３，１−９を参照のこと）；およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴ（Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ Ｃ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９４）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４，４４６５−４４７４を参照のこと）。
用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方の機能に影響を与えるような１つの核酸フラグメントへの核酸配列の関連をいう。例えば、コード配列の発現に影響を与えることができる（すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。コード配列を、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結させることができる。
本明細書中で使用される、用語「発現」は、核酸またはポリヌクレオチド由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写または安定な蓄積をいう。発現はまた、ｍＲＮＡのタンパク質またはポリペプチドへの翻訳をいうことができる。
用語「カセット」、「発現カセット」、および「遺伝子発現カセット」は、特定の制限部位または相同組換えによって核酸またはポリヌクレオチドに挿入されうるＤＮＡのセグメントいう。ＤＮＡのセグメントは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は転写および翻訳のための適切な読み取り枠中にカセットを確実に挿入するようにデザインされている。「形質転換カセット」は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、且つポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にするエレメントを有する特定のベクターをいう。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセット、および形質転換カセットはまた、宿主細胞中での目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を増強することが可能なエレメントを含み得る。これらのエレメントには、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、およびポリアデニル化配列などが含まれ得るが、これらに限定されない。
本発明の目的のために、用語「遺伝子スイッチ」は、プロモーターと関連した応答エレメントと、１以上のリガンドの存在下で応答エレメントおよびプロモーターが組み込まれる遺伝子の発現を調節するＥｃＲベースの系との組み合わせをいう。
用語「調節する」は、核酸または遺伝子発現を誘導、減少、または阻害してタンパク質またはポリペプチド産生をそれぞれ誘導、減少、または阻害することを意味する。
本発明のプラスミドまたはベクターは、宿主細胞中での遺伝子発現の駆動に適切な少なくとも１つのプロモーターをさらに含み得る。用語「発現ベクター」は、宿主への形質転換後に挿入された核酸配列を発現することができるようにデザインされたベクター、プラスミド、またはビヒクルを意味する。クローン化遺伝子（すなわち、挿入された核酸配列）は、通常、プロモーター、最小プロモーター、またはエンハンサーなどの制御エレメントの制御下に置かれる。所望の宿主細胞中での核酸の発現の駆動に有用な開始制御領域またはプロモーターは多数存在し、当業者に周知である。事実上、これらの遺伝子を駆動することができる任意のプロモーターが本発明に適切であり、以下が含まれるが、これらに限定されない：ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導プロモーター、光制御プロモーター（ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰ１）、アルカリホスファターゼプロモーター（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現に有用）；ＡＯＸ１プロモーター（Ｐｉｃｈｉａにおける発現に有用）、β−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃプロモーター（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける発現に有用）；光制御プロモーター、種子特異的プロモーター、花粉特異的プロモーター、子房特異的プロモーター、病原もしくは疾患関連プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＣＭＶ ３５Ｓ最小プロモーター、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質プロモーター、リブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーター、シュート特異的プロモーター、根特異的プロモーター、キチナーゼプロモーター、ストレス誘導性プロモーター、イネツングロバシリフォームウイルスプロモーター、植物スーパープロモーター、ジャガイモロイシンアミノペプチダーゼプロモーター、硝酸還元酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、ユビキチンプロモーター、ゼインタンパク質プロモーター、およびアントシアニンプロモーター（植物細胞における発現に有用）；当該分野で公知の動物および哺乳動物プロモーター（ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）中に含まれるプロモーター、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、バキュロウイルスＩＥ１プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターの制御配列および転写制御配列、ユビキタスプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、およびチューブリンなど）、中間フィラメントのプロモーター（デスミン、神経フィラメント、ケラチン、およびＧＦＡＰなど）、（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、または第ＶＩＩＩ因子型などの）治療遺伝子のプロモーター、病原または疾患関連プロモーター、および組織特異性を示し、且つトランスジェニック動物で使用されているプロモーター（膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域など）が含まれるが、これらに限定されない）；膵臓β細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域；肝臓で活性なアルブミン遺伝子、ＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡＩＩ制御領域、肝臓で活性なα−フェトタンパク質遺伝子制御領域、肝臓で活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域、脊髄細胞で活性なβ−グロビン遺伝子制御領域、脳内の乏突起膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋で活性なミオシン軽鎖２遺伝子制御領域、視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸タンパク質プロモーター、平滑筋細胞（αアクチン）プロモーターなど。さらに、エンハンサーまたは制御配列などの付加によってこれらの発現配列を修飾することができる。
本発明の実施形態で使用することができるエンハンサーには、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子１（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エンハンサー、およびウイルス遺伝子エンハンサーなど。
終結制御領域（すなわち、ターミネーターまたはポリアデニル化配列）はまた、好ましい宿主由来の種々の遺伝子に由来し得る。任意選択的に、終結部位は不必要であり得るが、含まれるのが最も好ましい。本発明の好ましい実施形態では、終結制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはウイルスターミネーター配列などを含み得るかこれらに由来し得る。
用語「３’非コード配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」は、コード配列の下流（３’）に位置するＤＮＡ配列をいい、ポリアデニル化［ｐｏｌｙ（Ａ）］認識配列およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることができる制御シグナルをコードする他の配列を含み得る。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加の影響によって特徴付けられる。
「制御領域」は、第２の核酸配列の発現を制御する核酸配列を意味する。制御領域は、特定の核酸（相同領域）の発現を天然に担う配列を含み得るか、異なるタンパク質または合成タンパク質（異種領域）の発現を担う異なる供給源の配列を含み得る。特に、配列は、特異的もしくは非特異的様式および誘導もしくは非誘導様式で遺伝子の転写を刺激または抑制する、原核生物、真核生物、もしくはウイルス遺伝子の配列、または由来する配列であり得る。制御領域には、複製起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、および標的細胞の分泌経路にポリペプチドを向わせるシグナル配列が含まれる。
「異種供給源」由来の制御領域は、発現される核酸に天然では関連しない制御領域である。異種制御領域のうち、異なる種由来の制御領域、異なる遺伝子由来の制御領域、ハイブリッド制御配列、および天然に存在しないが当業者によってデザインされる制御領域が含まれる。
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写に起因する産物をいう。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、これを一次転写物というか、または一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であってよく、これを成熟ＲＮＡという。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、且つ細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡをいう。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡと相補的であり、且つｍＲＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡをいう。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物をいう。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部もしくは一部に相補的であり、且つ標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物をいう。アンチセンスＲＮＡは、特定の遺伝子転写物（すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列）の任意の部分と相補的であり得る。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されていないが依然として細胞過程に影響を与える他のＲＮＡをいう。
「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基から構成される高分子化合物である。アミノ酸は、以下の一般式：
Figure 2010187690
 を有する。
アミノ酸は、側鎖Ｒに基づいて以下の７つの群に分類される：（１）脂肪族側鎖、（２）水酸基（ＯＨ）を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側鎖、（４）酸性またはアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳香環を含む側鎖、および（７）プロリン（側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸）。本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４個のアミノ酸を含む。
「タンパク質」は、生細胞で構造的または機能的役割を果たすポリペプチドである。
「単離されたポリペプチド」または「単離されたタンパク質」は、その天然状態で、それらと通常関連する化合物（例えば、他のタンパク質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質である。「単離された」は、他の化合物との人工または合成混合物を除外すること、または生物活性を妨害せず、且つ例えば不完全な精製、安定剤の添加、薬学的に許容可能な調製物への混合によって存在し得る夾雑物の存在を除外することを意味しない。
「置換変異ポリペプチド」または「置換変異体」は、野生型または天然に存在するポリペプチドに対して異なるアミノ酸での、少なくとも１つの野生型または天然に存在するアミノ酸の置換を含む変異ポリペプチドを意味すると理解される。置換変異ポリペプチドは、１つのみの野生型または天然に存在するアミノ酸の置換を含むことができ、「点変異」または「１点変異」ポリペプチドということができる。あるいは、置換変異ポリペプチドは、野生型または天然に存在するポリペプチドに対して２つまたはそれ以上のアミノ酸での、２つまたはそれ以上の野生型または天然に存在するアミノ酸の置換を含み得る。本発明によれば、置換変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドは、野生型または天然に存在するグループＨ核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドに対して、異なるアミノ酸での、少なくとも１つの野生型または天然に存在するアミノ酸の置換を含む。
置換変異ポリペプチドが２つまたはそれ以上の野生型または天然に存在するアミノ酸の置換を含む場合、この置換は、置換のために欠失された同数の野生型または天然に存在するアミノ酸（すなわち、２つの野生型または天然に存在するアミノ酸が２つの非野生型または天然に存在しないアミノ酸に置換される）または置換のために欠失された同数でない野生型アミノ酸（すなわち、２つの野生型アミノ酸が１つの非野生型アミノ酸に置換される（置換＋欠失変異）または２つの野生型アミノ酸が３つの非野生型アミノ酸に置換される（値置換＋挿入変異））のいずれかを含み得る。
基準ポリペプチド配列内で置換されたアミノ酸の残基および数ならびに新規に置換されたアミノ酸残基を示すための省略表記システムを使用して置換変異を記載することができる。例えば、ポリペプチドの２０番目（２０ｔｈ）のアミノ酸残基が置換された置換変異を、「ｘ２０ｚ」（「ｘ」は置換されたアミノ酸であり、「２０」はポリペプチド内のアミノ酸残基の位置または番号であり、「ｚ」は新規の置換アミノ酸である）と略すことができる。したがって、交換可能に「Ｅ２０Ａ」または「Ｇｌｕ２０Ａｌａ」と略される置換変異は、変異が、ポリペプチドの２０位でグルタミン酸（当該分野で一般に「Ｅ」または「Ｇｌｕ」と略される）の変わりにアラニン残基（当該分野で一般に「Ａ」または「Ａｌａ」と略される）を含むことを示す。
当該分野で公知の任意の突然変異誘発技術（ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９８４，ＤＮＡ ３：４７９−４８８；Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４４：１７７；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７１０）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、制限エンドヌクレアーゼ消化／フラグメント欠失および置換、ならびにＰＣＲ媒介／オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発などが含まれるが、これらに限定されない）によって置換変異を作製することができる。部位特異的突然変異誘発にはＰＣＲベースの技術が好ましい（Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９８９，”Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ＤＮＡ”，ｉｎ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ６，ｐｐ．６１−７０を参照のこと）。
本発明のポリペプチドの「フラグメント」は、そのアミノ酸配列が基準ポリペプチドより短く、これらの基準ポリペプチドを有する部分全体にわたり、同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味すると理解される。このようなフラグメントは、適切な場合には、より大きなポリペプチドの一部として含まれ得る。本発明のこのようなポリペプチドのフラグメントは、少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２６、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、２４０、または３００アミノ酸長を有し得る。
ポリペプチドまたはタンパク質の「変異型」は、ポリペプチドまたはタンパク質に由来し、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの生物学的性質を保持する任意のアナログ、フラグメント、誘導体、または変異体である。ポリペプチドまたはタンパク質の異なる変異型は天然に存在し得る。これらの変異型は、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の相違によって特徴付けられる対立遺伝子のばらつきでありうるか、異なるスプライシングまたは翻訳後修飾を含み得る。当業者は、１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、または置換を有する変異型を産生することができる。これらの変異型には、特に、（ａ）１以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸に置換された変異型、（ｂ）ポリペプチドまたはタンパク質に１以上のアミノ酸が付加された変異型、（ｃ）１以上のアミノ酸が置換基を含む変異型、および（ｄ）ポリペプチドまたはタンパク質が血清アルブミンなどの別のポリペプチドと融合した変異型が含まれ得る。これらの変異型を得るための技術（遺伝子的（抑制、欠失、変異など）、化学的、および酵素的技術が含まれる）が当業者に公知である。変異ポリペプチドは、好ましくは少なくとも約１４個のアミノ酸を含む。
「異種タンパク質」は、細胞中で天然に産生されないタンパク質をいう。
「成熟タンパク質」は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド（すなわち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除去されたもの）をいう。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの一次翻訳産物（すなわち、プレペプチドまたはプロペプチドが依然として存在するもの）をいう。プレペプチドおよびプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであり得るが、これに限定されない。
用語「シグナルペプチド」は、成熟タンパク質の分泌前のアミノ末端ポリペプチドをいう。シグナルペプチドは切断されるので、成熟タンパク質中に存在しない。シグナルペプチドは、分泌タンパク質に細胞膜を通過するよう指示して転位させる機能を有する。シグナルペプチドは、シグナルタンパク質ともいう。
「シグナル配列」は、細胞表面で発現されるタンパク質のコード配列の最初に含まれる。この配列は、シグナルペプチド（成熟ポリペプチドのＮ末端）をコードし、宿主細胞にポリペプチドを移動させるように指示する。用語「転位シグナル配列」は、本明細書中で、この一連のシグナル配列をいう。真核生物および原核生物由来の種々のタンパク質に関連し、両タイプの生物型でしばしば機能する転位シグナル配列を見出すことができる。
用語「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の同一性のパーセントをいう。当該分野で公知の技術によって、ある部分と別の部分との配列間の一致を決定することができる。例えば、配列情報の整列および容易に利用可能なコンピュータプログラムの使用による２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって相同性を決定することができる。あるいは、相同領域の間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびその後の一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および消化されたフラグメントのサイズの決定によって相同性を決定することができる。
本明細書中で使用される、その全ての文法的な形態および綴りの変形形態における用語「相同な」は、「共通の進化起源」を有するタンパク質（スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）からのタンパク質、および異なる種からの相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）が含まれる）の間の関係をいう（Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０：６６７．）。このようなタンパク質（およびそのコード遺伝子）は、その高い配列類似度を反映する配列相同性を有する。しかし、一般的な用法および本出願では、用語「相同な」は、「高度に」などの副詞で修飾された場合、配列類似性をいうことができるが、共通の進化起源をいわない。
したがって、その全ての文法的な形態における用語「配列類似性」は、共通の進化起源を有し得るか有し得ないタンパク質の核酸またはアミノ酸配列の間の同一または一致の程度をいう（Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０：６６７を参照のこと）。
特定の実施形態では、少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％）のヌクレオチドが画定された長さのＤＮＡ配列にわたって適合する場合、２つのＤＮＡ配列は、「実質的に相同」または「実質的に類似」している。配列データバンクまたは例えば特定の系のために画定されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で利用可能な標準的なソフトウェアを使用した配列の比較によって、実質的に相同な配列を同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の画定は、当業者の範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと（上述））。
本明細書中で使用される、「実質的に類似の」は、１以上のヌクレオチド塩基の変化により１以上のアミノ酸が置換されるが、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の機能的性質に影響を与えない核酸フラグメントをいう。「実質的に類似の」はまた、１以上のヌクレオチド塩基の変化によりアンチセンスまたは同時抑制テクノロジーによる遺伝子発現の変化を媒介する核酸フラグメントの能力に影響を与えない核酸フラグメントをいう。「実質的に類似の」はまた、得られた転写物の機能的性質に実質的に影響を与えない１以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入などの本発明の核酸フラグメントの修飾をいう。したがって、本発明は特定の例示的配列以外の配列も含まれると理解される。提案された各修飾は、コードされる産物の生物活性の保持の決定であるので、十分に当業者の日常的技術の範囲内である。
さらに、当業者は、本発明に含まれる実質的に類似の配列はまた、ストリンジェントな条件下で（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃ならびに２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄）本明細書中に例示の配列とハイブリダイズする能力によって画定されることを認識する。本発明の実質的に類似の核酸フラグメントは、そのＤＮＡ配列が本明細書中に報告した核酸フラグメントのＤＮＡ配列と少なくとも７０％同一である核酸フラグメントである。本発明の好ましい実質的な核酸フラグメントは、そのＤＮＡ配列が本明細書中に報告した核酸フラグメントのＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である核酸フラグメントである。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書中に報告した核酸フラグメントのＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である。本明細書中に報告した核酸フラグメントのＤＮＡ配列と少なくとも９５％同一である核酸フラグメントがさらにより好ましい。
約４０％を超えるアミノ酸が同一であるか、６０％超が類似している（機能的に同一である）場合、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同な配列を、例えば、ＧＣＧ （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを使用したアラインメントによって同定する。
用語「対応する」は、本明細書中で、類似性または相同性を測定する分子に対して、正確な位置が同一または異なる類似または相同な配列をいう。核酸またはアミノ酸配列アラインメントは、スペースを含み得る。したがって、用語「対応する」は、配列類似性をいい、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングではない。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動の評価またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照のこと）などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定のいずれかによるポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、既知のタンパク質または遺伝子に相同なポリペプチドまたは核酸配列の推定的同定のために、１０またはそれ以上の連続したアミノ酸配列、または３０またはそれ以上のヌクレオチド配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）の配列依存的方法で使用することができる。さらに、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、プライマーを含む特定の核酸フラグメントを得るためのＰＣＲでの増幅プライマーとして使用することができる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質部分」は、配列を含む核酸フラグメントの特異的同定および／または単離に十分な配列を含む。
当該分野で公知の用語「同一性パーセント」は、配列比較によって決定されるような、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該分野では、「同一性」はまた、場合に応じて、このような配列の文字列間の適合性によって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の関連の程度を意味する。「同一性」および「類似性」を、公知の方法（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されている方法が含まれるがこれらに限定されない）によって容易に計算することができる。好ましい同一性の決定方法を、試験した配列間の最良の適合が得られるようにデザインする。同一性および類似性の決定方法を、公的に利用可能なコンピュータプログラムでコード化する。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して行うことができる。デフォルトパラメーター（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０）を使用したアラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して、複数の配列アラインメントを行うことがきる。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用してペアワイズアラインメントについてのデフォルトパラメーターを選択することができる：ＫＴＵＰＬＥ＝１、ギャップペナルティ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５。
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムをいう。「配列分析ソフトウェア」は、市販されているか自作することができる。典型的な配列分析ソフトウェアには、ＧＣＧスーツプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本願の文脈内で、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、分析結果は特記しない限り参照プログラムの「デフォルト値」に基づくと理解される。本明細書中で使用される、「デフォルト値」は、最初の初期化時のソフトウェアを最初にロードした値またはパラメータの任意のセットを意味する。
当業者に公知の手順を使用して化学合成したオリゴヌクレオチドの構築ブロックから「合成遺伝子」を構築することができる。これらの基礎単位をライゲーションおよびアニーリングして遺伝子セグメントを形成し、その後酵素的に組み立てて完全な遺伝子を構築する。ＤＮＡ配列に対して言及される「化学合成」は、構成成分ヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てることを意味する。十分に確立された手順を使用してＤＮＡを手動で化学合成するか、多数の市販の機械の１つを使用して自動で化学合成することができる。したがって、宿主細胞のコドンの偏りを反映するためのヌクレオチド配列の最適化に基づいて、遺伝子を適切な遺伝子発現のために仕立てることができる。当業者は、コドン使用頻度を、宿主によって好まれるコドンに偏らせる場合の首尾の良い遺伝子発現の見込みを認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が利用可能な宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。
本明細書中で使用される、「２つまたはそれ以上の個別に操作可能な遺伝子制御系」は、ａ）選択された濃度でのその各リガンドによる、所与の各系の調節により、その系の遺伝子発現の大きさが測定可能に変化する場合、およびｂ）前記変化が、実際の調節の同時性または連続性と無関係に、細胞、組織、または生物中で同時に操作可能な他の全ての系の発現の変化よりも統計学的に有意な差である場合に「直交する」といわれる。好ましくは、それぞれ個別に操作可能な遺伝子制御系の調節は、細胞、組織、または生物中の他の全ての操作可能な系よりも少なくとも２倍の遺伝子発現の変化に影響を与える。より好ましくは、変化は少なくとも５倍超である。さらにより好ましくは、変化は少なくとも１０倍超である。さらにより好ましくは、変化は少なくとも１００倍超である。なおさらにより好ましくは、変化は少なくとも５００倍超である。理想的には、所与の各系の選択された濃度でのその各リガンドによる調節により、その系の遺伝子発現の大きさが測定可能に変化し、細胞、組織、または生物中で操作可能な全ての他の系の発現は測定可能に変化しない。このような場合、複数の誘導性遺伝子制御系は、「完全に直交する」といわれる。本発明は、直交リガンドおよび直交受容体ベースの遺伝子発現系（同時に係属している米国出願０９／９６５，６９７号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のものなど）の検索に有用である。
用語「調節する」は、所与のリガンド／受容体複合体が外来遺伝子のトランス活性化を誘導または抑制する能力を意味する。
用語「外来遺伝子」は、対象に対して外来の遺伝子、すなわち、形質転換プロセスによって対象に導入された遺伝子、内因性突然変異遺伝子の非変異バージョン、または内因性非変異遺伝子の変異バージョンを意味する。形質転換法は本発明に重要ではなく、当業者に公知の対象に適切な任意の方法であり得る。例えば、形質転換された細胞からの再生によってトランスジェニック植物が得られる。文献から多数の形質転換手順が公知である（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはそのＴ１プラスミドを使用したアグロインフェクション、エレクトロポレーション、植物細胞およびプロトプラストのマイクロインジェクション、およびマイクロインジェクタイル形質転換など）。動物細胞の形質転換およびトランスジェニック動物におけるこのような形質転換細胞の再生のための補足的技術が公知である。外来遺伝子は、逆転写などによってＤＮＡ中間体を介して機能することができるＤＮＡまたはＲＮＡの形態で対象に導入される天然または合成遺伝子および治療遺伝子であり得る。このような遺伝子を、標的細胞に導入するか、対象に直接導入するか、対象への形質転換細胞の導入によって間接的に導入することができる。用語「治療遺伝子」は、遺伝子が発現される宿主細胞に有利な機能を付与する遺伝子を意味する。治療遺伝子は、宿主細胞中に天然に見出されない。
用語「エクジソン受容体複合体」は、一般に、ステロイド受容体ファミリーの２つのメンバーであるエクジソン受容体（「ＥｃＲ」）タンパク質およびウルトラスピラクル（「ＵＳＰ」）タンパク質からなるヘテロ二量体タンパク質複合体をいう（Ｙａｏ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６，４７６−４７９；Ｙａｏ，Ｔ；Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ７１，６３−７２を参照のこと）。機能的エクジステロイド受容体複合体はまた、イムノフィリンなどのさらなるタンパク質を含み得る。転写因子として公知のステロイド受容体ファミリーのタンパク質のさらなるメンバー（ＤＨＲ３８、βＦＴＺ−１、または他の昆虫ホモログなど）はまた、ＥｃＲおよび／またはＵＳＰのリガンド依存性または非依存性パートナーであり得る。エクジソン受容体複合体はまた、エクジソン受容体タンパク質と、ウルトラスピラクルタンパク質の脊椎動物ホモログであるレチノイン酸Ｘ受容体（「ＲＸＲ」）タンパク質とのヘテロ二量体であり得る。エクジソン受容体タンパク質またはＵＳＰのホモ二量体複合体はまた、いくつかの環境下で機能的であり得る。
複合体のタンパク質の１つ（ＥｃＲを含むが、複合体の他のタンパク質を排除しない）に結合した活性エクジステロイドまたは非ステロイド系リガンドによってエクジステロイド受容体複合体を活性化することができる。
エクジソン受容体複合体には、全てのメンバーがアミノ末端トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域によって分離されるリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在によって特徴付けられるステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質が含まれる。ファミリーのいくつかのメンバーはまた、ＬＢＤのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインを有し得る。ＤＢＤは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を付与する２つのアミノ酸モチーフ（ＰボックスおよびＤボックス）の間の２つのシステイン亜鉛フィンガーの存在によって特徴づけられる。これらのドメインは、天然であるか、修飾されているか、異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラであり得る。
異種遺伝子、応答エレメント、およびエクジソン受容体複合体を作製するＤＮＡ配列を、始原細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、もしくは他の腸内細菌などの原核細胞、または植物もしくは動物細胞などの真核細胞に組み込むことができる。しかし、遺伝子によって発現される多数のタンパク質が細菌で不正確にプロセシングされるので、真核細胞が好ましい。細胞は、単細胞生物または多細胞生物の形態で存在し得る。外来遺伝子、応答エレメント、および受容体複合体のヌクレオチド配列を、ＲＮＡ分子（好ましくはタバコモザイクウイルスなどの機能的ウイルスＲＮＡの形態で）として組み込むこともできる。真核細胞のうち、エクジソン受容体についての本発明のリガンドに対する応答を付与する分子を本質的に欠くので、脊椎動物細胞が好ましい。結果として、これらは本発明のリガンドに非感受性を示す。したがって、本発明のリガンドは、形質転換細胞または生物全体に対して無視してよい生理学的効果または他の効果しか有していない。したがって、リガンド自体の存在によって実質的に影響を受けずに細胞が成長して所望の産物を発現することができる。
用語「対象」は、インタクトな植物もしくは動物または植物もしくは動物由来の細胞を意味する。対象が真菌または酵母である場合、リガンドは等しく十分に作用することも認識される。対象がインタクトな動物である場合、好ましくは動物は脊椎動物であり、最も好ましくは哺乳動物である。
その後外来遺伝子に連結する応答エレメントに結合するエクジソン受容体複合体と共に使用される場合、本発明のリガンドは、外来遺伝子発現の外部一時的制御手段を提供する。種々の成分が互いに結合する順序（すなわち、受容体複合体へのリガンドの結合および応答エレメントへの受容体複合体の結合）は重要でない。典型的には、外来遺伝子発現の調節は、特定の制御または制御ＤＮＡエレメントへのエクジソン受容体複合体の結合に応答する。ステロイド受容体ファミリーの他のメンバーと同様に、エクジソン受容体タンパク質は、少なくとも３つのドメイン（トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメイン）を有する。ステロイド受容体ファミリーのサブセットと同様に、この受容体は、ヘテロ二量体化特性を担う十分に画定されていない領域も有する。ＵＳＰまたはＲＸＲタンパク質とのヘテロ二量体化後のエクジソン受容体タンパク質のリガンド結合ドメインへのリガンドの結合により、ヘテロ二量体タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが活性形態の応答エレメントに結合し、それにより外来遺伝子を発現または抑制することができる。この機構は、ＥｃＲまたはＵＳＰのいずれかに結合するリガンドの可能性を排除せず、活性なホモ二量体複合体が形成される（例えば、ＥｃＲ＋ＥｃＲまたはＵＳＰ＋ＵＳＰ）。好ましくは、１以上の受容体ドメインを変化させて、キメラ遺伝子スイッチを得ることができる。典型的には、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合、および特定の応答エレメントの認識のために選択された、宿主細胞または生物中でキメラ受容体が最適化されるように、３つのドメインのうちの１つまたは複数を他のドメインの供給源と異なる供給源から選択することができる。さらに、キメラエクジソン受容体複合体を適合させるために、応答エレメント自体を、酵母由来のＧＡＬ−４タンパク質（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，ｅｔ．ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３５，５６３−５６４を参照のこと）またはＥ．ｃｏｌｉ由来のＬｅｘＡタンパク質（Ｂｒｅｎｔ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ （１９８５），Ｃｅｌｌ，４３，７２９−７３６を参照のこと）などの他のＤＮＡ結合タンパク質ドメインについての応答エレメントに改変するか、これと置換することができる。キメラ系の別の利点は、これらにより所望の最終結果によって外来遺伝子を駆動するために使用されるプロモーターを選択可能であることである。このような二重制御は、発現のタイミングおよび発現する細胞の両方を制御することができるので、特に細胞毒性タンパク質を産生する場合に、遺伝子治療分野で特に重要であり得る。用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される特定のヌクレオチド配列を意味する。配列は、適切な条件下で転写を特異的に開始することができる部位である。適切なプロモーターに作動可能に連結された外来遺伝子を対象の細胞に導入する場合、外来遺伝子の発現は、本発明のリガンドの存在によって制御される。プロモーターを構成的または誘導的に制御することができるか、組織特異的であるか（すなわち、特定の細胞型のみで発現される）、生物の一定の発生段階に特異的であり得る。
本発明のまた別の態様は、対象における１つ以上の外来遺伝子の発現を調節する方法であって、有効量の、すなわち所望の遺伝子発現もしくは抑制を引き出すために必要とされる量の、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物を含むリガンドを対象に投与することを含み、
ここで対象の細胞が
ａ）１）ＤＮＡ結合ドメイン、
２）リガンドに対する結合ドメイン、および
３）トランス活性化ドメイン
を含むエクジソン受容体複合体；並びに
ｂ）１）外来遺伝子、および
２）応答エレメント
を含むＤＮＡ構築物
を含み、ここで、
ｉ）外来遺伝子が応答エレメントの制御下にあり、さらに
ｉｉ）リガンドの存在下における応答エレメントへのＤＮＡ結合ドメインの結合が、当該遺伝子の活性化または抑制を生じさせる方法である。
本発明の関連態様は、トランスジェニック対象における内因性もしくは異種遺伝子発現を調節する方法であって、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物を含むリガンドを対象の細胞内のエクジソン受容体と接触させることを含み、ここで、細胞はエクジソン受容体に対するＤＮＡ結合配列を含有し、そしてエクジソン受容体−リガンド−ＤＮＡ結合配列複合体の形成が当該遺伝子の発現を誘導する方法である。
本発明の第４態様は、ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物を含むリガンドへの曝露に実質的に非感受性である細胞を選択するステップと；
ｂ）１）ａ）ポリペプチドをコードする外来遺伝子、および
ｂ）応答エレメント
を含み、当該遺伝子が応答エレメントの制御下にあるＤＮＡ構築物、並びに
２）ａ）ＤＮＡ結合ドメイン、
ｂ）リガンドに対する結合ドメイン、および
ｃ）トランス活性化ドメイン
を含むエクジソン受容体複合体
を細胞に導入するステップ；並びに
ｃ）細胞をリガンドへ曝露させるステップ
を含む方法である。
細胞によるポリペプチド産物を一時的に制御する利点と同様に、本発明のこの態様は、このようなポリペプチドの蓄積が細胞を損傷し得る場合、ポリペプチドの発現が短期間に限定され得るというさらなる利点を提供する。このような制御は、外来遺伝子が治療遺伝子である場合に特に重要である。糖尿病患者におけるインスリン産生などの必要な機能を制御するポリペプチドを産生するように治療遺伝子に要求することができる。これらを使用して、癌細胞に致死的なタンパク質などの損傷または致死タンパク質を産生することもできる。このような制御は、産生されたタンパク質レベルがトランスジェニック植物などの成長または生殖おけるメタボリックドレイン（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｒａｉｎ）を構成し得る場合にも重要であり得る。
種々のポリペプチドをコードする多数のゲノムおよびｃＤＮＡ核酸配列が当該分野で周知である。本発明のリガンドに有用な外来遺伝物質には、目的の生物活性タンパク質（例えば、細胞から放出されることができる分泌タンパク質；毒性物質から非毒性物質、または不活性物質から活性物質に基質を代謝することができる酵素；制御タンパク質；および細胞表面受容体など）をコードする遺伝子が含まれる。有用な遺伝子には、凝血因子、インスリン、副甲状腺ホルモン、黄体形成ホルモン放出因子、αおよびβ精巣インヒビン、およびヒト成長ホルモンなどのホルモンをコードする遺伝子；その非存在により異常な状態を引き起こす酵素などのタンパク質をコードする遺伝子；インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、コロニー刺激因子１、腫瘍壊死因子、およびエリスロポイエチンなどのサイトカインまたはリンホカインをコードする遺伝子；α１−アンチトリプシンなどのインヒビター物質をコードする遺伝子；ジフテリア毒素およびコレラ毒素などの薬物として機能する物質をコードする遺伝子なども含まれる。有用な遺伝子には、癌治療および遺伝子障害の治療に有用な遺伝子も含まれる。当業者は、事実上全ての公知の遺伝子の核酸配列情報にアクセスし、公的寄託機関（配列を公開している団体）から直接核酸分子を入手するか、分子のルーチン化された調製方法を使用することができる。
遺伝子治療での使用のために、本明細書中に記載のリガンドを薬学的に許容可能なキャリア（例えば、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、軟膏、エリキシル、および注射可能な組成物など）中に含めることができる。薬学的調製物は、０．０１重量％から９９重量％までのリガンドを含み得る。調製物は、単回または複数回投与形態のいずれかであり得る。任意の特定の薬学的調製物中のリガンドの量は、有効量（すなわち、所望の遺伝子の発現または抑制の誘発に必要な用量）に依存する。
薬学的調製物の適切な投与経路には、経口、直腸、局所（皮膚、口腔内、および舌下が含まれる）、膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内、および硬膜外が含まれる）、および経鼻胃管が含まれる。好ましい投与経路は治療条件に依存し、レシピエントの状態などの因子によって変化させることができることが当業者に理解される。
本明細書中に記載のリガンドを、他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて投与することもできる。レシピエントに対する悪影響または化合物間の望ましくない相互作用を回避するために、本明細書中に記載のリガンドと組み合わせて使用される薬学的に活性な化合物を選択することが当業者に理解される。リガンドと組み合わせて使用することができる他の薬学的に活性な化合物の例には、例えば、ＡＩＤＳ化学療法薬、アミノ酸誘導体、鎮痛剤、麻酔薬、肛門直腸製剤、制酸薬、整腸剤、抗生物質、抗凝固薬、解毒剤、抗線維素溶解薬、抗ヒスタミン薬、抗炎症薬、抗新生物薬、抗寄生虫薬、抗原虫薬、解熱薬、防腐薬、鎮痙薬、抗コリン作用薬、抗ウイルス薬、食欲抑制薬、関節炎用製剤（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ）、生物反応改変物質、骨代謝制御薬、瀉下薬、心血管薬、中枢神経興奮薬、脳代謝増強薬、耳垢溶解薬、コリンエステラーゼインヒビター、感冒薬（ｃｏｌｄ ａｎｄ ｃｏｕｇｈ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、コロニー刺激因子、避妊薬、細胞保護薬、歯科製剤、消臭薬、皮膚用製剤、解毒薬、糖尿病用製剤、診断薬、下痢止め薬、ドーパミン受容体アゴニスト、電解質、酵素および消化薬、麦角製剤、不妊治療薬、繊維補助食品、抗真菌薬、乳汁漏出症インヒビター、胃酸分泌インヒビター、腸管運動促進薬、ゴナドトロピンインヒビター、発毛剤、増血剤、痔核薬、止血薬、ヒスタミンＨ２受容体アンタゴニスト、ホルモン、高血糖薬、脂質低下薬、免疫抑制薬、緩下薬、抗らい菌薬、白血球搬出添加薬、肺サーファクタント、片頭痛薬、粘液溶解薬、筋弛緩アンタゴニスト、筋弛緩薬、麻薬アンタゴニスト、スプレー式点鼻薬、悪心薬ヌクレオシドアナログ、栄養補助剤、骨粗鬆症製剤、分娩促進薬、副交感神経遮断薬、副交感神経興奮薬、パーキンソン病用薬、ペニシリンアジュバント、リン脂質、血小板インヒビター、ポルフィリン症薬、プロスタグランジンアナログ、プロスタグランジン、プロポンポンプインヒビター、そう痒薬、向精神薬、キノロン、呼吸促進薬、唾液促進薬、代用塩、硬化剤、皮膚創傷製剤、禁煙助剤、スルホンアミド、交感神経遮断薬、血栓溶解薬、トゥーレット症候群薬、振せん製剤、結核製剤、尿酸排泄薬、尿路薬、子宮収縮薬、子宮弛緩薬、膣製剤、めまい薬、ビタミンＤアナログ、ビタミン、造影剤が含まれる。いくつかの場合、リガンドは、例えば、特定の薬物を代謝する酵素を産生する遺伝子を「止める」ための薬物療法の添加剤として有用であり得る。
農業への適用のために、上記適用に加えて、本発明のリガンドを使用して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）毒素などの殺虫剤タンパク質の発現を制御することもできる。このような発現は、組織または植物特異的であり得る。さらに、特に植物害虫の制御も必要である場合、１以上の殺虫剤を本明細書中に記載のリガンドと組み合わせ、それによりさらなる利点および有効性（殺虫剤を個別に提供するよりも全量が少量で済むことが含まれる）を得ることができる。殺虫剤との混合物を使用する場合、組成物中の各成分の組成比は、相対的効力、処理されるべき作物、害虫、および／または雑草に対する各殺虫剤の所望の適用率に依存する。当業者は、殺虫剤混合物により、１種類の殺虫剤の使用より広範なスペクトルの活性などの利点が得られることを認識する。組成物中で本明細書中に記載のリガンドと組み合わせることができる殺虫剤の例には、防カビ剤、除草剤、殺虫剤、ダニ殺虫剤、および殺微生物剤が含まれる。
本明細書中に記載のリガンドを、従来の高リットル水圧噴霧、低リットル噴霧、エアブラスト、およびエアリアルスプレーなどの一般的に使用されている方法による水スプレーとして植物の枝葉に適用することができる。適用の希釈および速度は、使用装置の型、所望の適用方法および頻度、ならびにリガンド適用率に依存する。噴霧タンク内にさらなるアジュバントを含めることが望まれる場合がある。このようなアジュバントには、界面活性剤、分散剤、スプレッダー、固着剤、消泡剤、乳化剤、およびＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ／Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、およびＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（全てＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＭＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）によって毎年発行されている）に記載の他の類似の物質が含まれる。適用前にリガンドを肥料または肥沃化物質と混合することもできる。リガンドおよび固体肥沃化物質を、混合装置またはブレンド装置中で混合することもできるか、これらを肥料と共に顆粒処方物中に組み込むことができる。処理される作物および雑草に適切な任意の相対比率の肥料組成を使用することができる。本明細書中に記載のリガンドは、一般に、５％〜５０％の肥沃化組成物を含む。これらの組成物により、所望の植物の急速な成長を促進すると同時に遺伝子発現を制御する肥沃化物質が得られる。
（本発明の宿主細胞および非ヒト生物）
上記のように、本発明の遺伝子発現系を調節するためのリガンドを使用して、宿主細胞中の遺伝子発現を調節することができる。トランスジェニック宿主細胞における発現は、種々の目的遺伝子の発現に有用であり得る。本発明は、原核および真核宿主細胞における遺伝子発現の調節のためのリガンドを提供する。トランスジェニック宿主細胞における発現は、目的の種々のポリペプチド（ワクチンとして植物で産生される抗原、α−アミラーゼ、フィターゼ、グルカナーゼ、およびキシラナーゼなどの酵素、昆虫、線虫、真菌、細菌、ウイルス、および非生物ストレスの耐性遺伝子、抗原、栄養補助食品、医薬品、ビタミン、アミノ酸成分、除草剤耐性、寒気、干ばつ、および熱耐性、工業製品、油、タンパク質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不妊植物、花、燃料、他の産出形質、治療ポリペプチド、経路中間体を改変するための遺伝子；宿主を使用して従来不可能であった新規の産物の合成のための宿主中の既存の経路の改変のための遺伝子；細胞ベースのアッセイのための遺伝子；機能的ゲノミクスアッセイ、生体治療タンパク質産生、プロテオミクスアッセイのための遺伝子などが含まれるが、これらに限定されない）の発現に有用である。さらに、遺伝子産物は、宿主の高成長収率の付与、または使用される別の成長様式を可能にすることに有用であり得る。
したがって、本発明は、本発明の単離された宿主細胞における遺伝子発現の調節のためのリガンドを提供する。宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞、または哺乳動物細胞であり得る。さらに別の実施形態では、本発明は、置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下にて培養培地で上記の宿主細胞を培養する工程と、前記培養物から置換突然変異を含む核受容体リガンド結合ドメインを単離する工程とを含む、宿主細胞における遺伝子発現の調節のためのリガンドに関する。
特定の実施形態では、単離された宿主細胞は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞である。別の特定の実施形態では、単離された宿主細胞は、無脊椎動物宿主細胞または脊椎動物宿主細胞である。好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞からなる群から選択される。より好ましくは、宿主細胞は、酵母細胞、線虫細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ニワトリ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、雌牛細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、類人猿細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、またはヒト細胞である。好ましい宿主細胞の例には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属などの真菌または酵母類またはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属などの細菌類；リンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミレット、バナナ、オオムギ、豆類、ビート、クロヒヨコマメ、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、アオアズキ、カラスムギ、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウ、コショウ、キマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、モロコシ、ダイズ、スカッシュ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、およびコムギからなる群から選択される植物類；動物；ならびに哺乳動物の宿主細胞が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＣａｎｄｉｄａ宿主細胞からなる群から選択される酵母細胞である。
別の特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｅｌｅｇａｎｓ線虫細胞である。
別の特定の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。
別の特定の実施形態では、宿主細胞は、リンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミット、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、クロヒヨコマメ、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、アオアズキ、カラスムギ、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウ、コショウ、キマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、モロコシ、ダイズ、スカッシュ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、およびコムギ細胞からなる群から選択される植物細胞である。
別の特定の実施形態では、宿主細胞は、ゼブラフィッシュ細胞である。
別の特定の実施形態では、宿主細胞は、ニワトリ細胞である。
別の特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、雌牛細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である。
宿主細胞形質転換は当該分野で周知であり、種々の方法（エレクトロポレーション、ウイルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非ウイルスベクター媒介トランスフェクション、アグロバクテリウム媒介形質転換、およびパーティクルガンなどが含まれるが、これらに限定されない）によって行うことができる。所望の遺伝子産物の発現は、適切な条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程と、形質転換遺伝子の発現を誘導する工程とを含む。原核細胞および真核細胞の培養条件および遺伝子発現プロトコールは当該分野で周知である（実施例の一般的方法の項を参照のこと）。遺伝子産物に特異的なプロトコールに従って細胞を回収し、遺伝子産物を単離することができる。
さらに、挿入したポリヌクレオチドの発現を調節し、所望の特定の様式でポリペプチド産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞を選択することができる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングならびに修飾（例えば、グリコシル化、切断（例えば、シグナル配列の切断））について特徴的且つ特異的な機構を有する。発現した外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にするために適切な細胞株または宿主系を選択することができる。例えば、細菌系での発現を使用して、非グリコシル化コアタンパク質産物を産生することができる。しかし、細菌で発現したポリペプチドを適切に折りたたむことができない。酵母での発現により、グリコシル化産物を産生することができる。真核細胞での発現により、異種タンパク質の「天然の」グリコシル化および折りたたみの可能性を増大させることができる。さらに、哺乳動物細胞での発現により、ポリペプチド活性の再構築または構築ツールを得ることができる。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度でタンパク質切断などのプロセシング反応に影響を与え得る。本発明はまた、本発明の単離された宿主細胞を含む非ヒト生物に関する。特定の実施形態では、非ヒト生物は、原核生物または真核生物である。別の特定の実施形態では、非ヒト生物は、無脊椎動物または脊椎動物である。
好ましくは、非ヒト生物は、細菌、真菌、酵母、線虫、昆虫、魚類、植物、鳥類、動物、および哺乳動物からなる群から選択される。より好ましくは、非ヒト生物は、酵母、線虫、昆虫、植物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、雌牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、類人猿、サル、またはチンパンジーである。
特定の実施形態では、非ヒト生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＣａｎｄｉｄａからなる群から選択される酵母である。
別の特定の実施形態では、非ヒト生物は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｅｌｅｇａｎｓ線虫である。
別の特定の実施形態では、非ヒト生物は、リンゴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、パールミット、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、クロヒヨコマメ、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、アオアズキ、カラスムギ、オクラ、Ｐａｎｉｃｕｍ、パパイヤ、ピーナッツ、エンドウ、コショウ、キマメ、パイナップル、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、モロコシ、ダイズ、スカッシュ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、およびコムギからなる群から選択される植物である。
別の特定の実施形態では、非ヒト生物は、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓマウスである。
（本発明の遺伝子発現調節系）
本発明は、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系で有用なリガンド群に関する。本明細書中に示されるように、新規のリガンド群により、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞の両方で改良された誘導性遺伝子発現系が得られる。したがって、本発明は、遺伝子発現の調節に有用なリガンドに関する。特に、本発明は、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞中で発現することができる少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含む遺伝子発現調節系をトランス活性化する能力を有するリガンドに関する。好ましくは、グループＨ核受容体リガンド結合は、エクジソン受容体、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用たんぱく質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用タンパク質１４、およびファルネソール受容体に由来する。より好ましくは、グループＨ核受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン受容体に由来する。
特定の実施形態では、遺伝子発現調節系は、トランス活性化ドメイン、その発現が調節されるべき遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン；および置換変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを含む。遺伝子発現調節系は、さらに、ｉ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答エレメント、ｉｉ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調節されるべき遺伝子を含む第２の遺伝子発現カセットを含み得る。
別の特定の実施形態では、遺伝子発現調節系は、ａ）トランス活性化ドメイン、その発現が調節される遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン；および置換突然変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびｂ）２つのポリペプチドフラグメントを含む脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメイン、およびキメラリガンド結合ドメイン（第１のポリペプチドフラグメントが脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、またはウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメインに由来し、さらに第２のポリペプチドフラグメントが異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、またはウルトラスピラクルタンパク質リガンド結合ドメインに由来する）からなる群から選択される第２の核受容体リガンド結合ドメインを含む遺伝子発現カセットを含む。遺伝子発現調節系は、さらに、ｉ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答エレメント、ｉｉ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調節される遺伝子を含む第２の遺伝子発現カセットを含み得る。
別の特定の実施形態では、遺伝子発現調節系は、その発現が調節される遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセットならびにトランス活性化ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２の遺伝子発現カセット（前記核受容体リガンド結合ドメインの１つが置換変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインである）を含む。好ましい実施形態では、第１のポリペプチドは、実質的にトランス活性化ドメインを含まず、且つ第２のポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを実質的に含まない。本発明の目的のために、「実質的に含まない」は、問題のタンパク質が活性化または結合活性を得るのに十分な問題のドメインの配列を含まないことを意味する。遺伝子発現調節系は、さらに、ｉ）第１の遺伝子発現カセットの第１のポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答エレメント、ｉｉ）第２の遺伝子発現カセットの第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調節される遺伝子を含む第３の遺伝子発現カセットを含み得る。
たった１つの核受容体リガンド結合ドメインが置換変異を含むグループＨリガンド結合ドメインである場合、他の核受容体リガンド結合ドメインは、置換変異を含むグループＨリガンド結合ドメインと二量体を形成する任意の他の核受容体に由来し得る。例えば、置換変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインが置換変異を含むエクジソン受容体リガンド結合ドメインである場合、他の核受容体リガンド結合ドメイン（「パートナー」）は、エクジソン受容体、脊椎動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、無脊椎動物ＲＸＲ、ウルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）、または脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、およびＵＳＰ（同時に係属している出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５２３５、およびＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７０６（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）からなる群から選択される少なくとも２つの異なる核受容体リガンド結合ドメインポリペプチドフラグメントを含むキメラ核受容体に由来し得る。「パートナー」核受容体リガンド結合ドメインは、さらに、トランケーション変異、欠失変異、置換変異、または別の修飾を含み得る。
好ましくは、脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、ヒトＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、マウスＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ラットＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ニワトリＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、ブタＳｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、カエルＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ、ゼブラフィッシュＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、被嚢類Ｐｏｌｙａｎｄｒｏｃａｒｐａ ｍｉｓａｋｉｅｎｓｉｓ、またはクラゲＴｒｉｐｅｄａｌｉａ ｃｙｓｏｐｈｏｒａのＲＸＲに由来する。
好ましくは、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、バッタＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ ウルトラスピラクルポリペプチド（「ＬｍＵＳＰ」）、マダニＡｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ ＲＸＲホモログ１（「ＡｍａＲＸＲｌ」）、マダニＡｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ ＲＸＲホモログ２（「ＡｍａＲＸＲ２」）、シオマネキＣｅｌｕｃａ ｐｕｇｉｌａｔｏｒ ＲＸＲホモログ（「ＣｐＲＸＲ」）、甲虫Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ ＲＸＲホモログ（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ ＲＸＲホモログ（「ＡｍＲＸＲ」）、アブラムシＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ ＲＸＲホモログ（「ＭｐＲＸＲ」）、または非双翅類／非鱗翅目ＲＸＲホモログに由来する。
好ましくは、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、脊椎動物種ＲＸＲポリペプチドフラグメント、無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチドフラグメント、および非双翅類／非鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲホモログポリペプチドフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチドフラグメントを含む。本発明で使用されるキメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも２つの異なる種のＲＸＲポリペプチドフラグメントを含み得るか、種が同一である場合、２つまたはそれ以上のポリペプチドフラグメントは、２つまたはそれ以上の異なるＲＸＲポリペプチドフラグメント種のアイソフォーム型に由来し得る。
好ましい実施形態では、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊椎動物種ＲＸＲポリペプチドフラグメントおよび１つの無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチドフラグメントを含む。
より好ましい実施形態では、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも１つの脊椎動物種ＲＸＲポリペプチドフラグメントおよび１つの非双翅類／非鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲホモログポリペプチドフラグメントを含む。
特定の実施形態では、その発現が調節される遺伝子は、宿主細胞に関して相同な遺伝子である。別の特定の実施形態では、その発現が調節される遺伝子は、宿主細胞に関して異種の遺伝子である。
下記の本発明で使用されるリガンドは、遺伝子に連結した応答エレメントに結合する核受容体のリガンド結合ドメインと組み合わせた場合、遺伝子発現の外部一時的制御手段を提供する。本発明の種々の成分が互いに結合する結合機構または結合順序（例えば、リガンド結合ドメインへのリガンドの結合、応答エレメントへのＤＮＡ結合ドメインの結合、プロモーターへのトランス活性化ドメインの結合など）は重要でない。
特定の例では、グループＨ核受容体のリガンド結合ドメインおよびその核受容体リガンド結合ドメインパートナーへのリガンドの結合により遺伝子を発現または抑制可能である。この機構は、グループＨ核受容体（ＧＨＮＲ）またはそのパートナーへのリガンド結合およびそれによる活性なホモ二量体複合体（例えば、ＧＨＮＲ＋ＧＨＮＲまたはパートナー＋パートナー）の形成の可能性を排除しない。好ましくは、１以上の受容体ドメインが変化してハイブリッド遺伝子スイッチが得られる。典型的には、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合、および特異的応答エレメントの認識について、ハイブリッド遺伝子および得られたハイブリッドタンパク質が、選択された宿主細胞または生物中で最適化されるように、他のドメインの供給源と異なる供給源から３つのドメイン（ＤＢＤ、ＬＢＤ、およびトランス活性化ドメイン）のうちの１つまたは複数を選択することができる。さらに、応答エレメント自体を、酵母由来のＧＡＬ−４タンパク質（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，ｅｔ．ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３５，５６３−５６４を参照のこと）またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＬｅｘＡタンパク質（Ｂｒｅｎｔ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ （１９８５），Ｃｅｌｌ，４３，７２９−７３６を参照のこと）などの他のＤＮＡ結合タンパク質ドメインのための応答エレメント、またはハブリッド受容体を得るためにこのような特異的相互作用のためにデザイン、修飾、および選択したタンパク質との相互作用をターゲットにするために特異的な合成応答エレメント（例えば、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：３６１６−３６２０を参照のこと）で修飾するかこれと置換することができる。２ハイブリッド系の別の利点は、これらにより所望の最終結果に従って、遺伝子発現を駆動するために使用されるプロモーターを選択可能であることである。このような二重制御は、発現のタイミングおよび発現する細胞の両方を制御することができるので、特に細胞毒性タンパク質を産生する場合に、遺伝子治療分野で特に重要であり得る。適切なプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を被験体の細胞に導入する場合、外来遺伝子の発現は、本発明のシステムの存在によって制御される。プロモーターを構成的または誘導的に制御することができるか、または組織特異的であるか（すなわち、特定の細胞型のみで発現される）、生物の一定の発生段階に特異的であり得る。
エクジソン受容体は、核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー１（グループＨ（本明細書中で、「グループＨ核受容体」という））に分類される。各群のメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメインにおいて４０〜６０％のアミノ酸が同一である（Ｌａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ，１９９９；Ｃｅｌｌ ９７：１６１−１６３）。エクジソン受容体に加えて、この核受容体サブファミリー１（グループＨ）の他のメンバーには、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核受容体１（ＮＥＲ−１）、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質−１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ），肝臓Ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用タンパク質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）が含まれる。
特に、置換変異を含むグループＨ核受容体リガンド結合ドメインを含む遺伝子発現調節系で有用な新規のリガンドを本明細書中に記載する。この遺伝子発現系は、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインが１つのコードポリペプチド上に存在する、「シングルスイッチ」ベースの遺伝子発現系であり得る。あるいは、遺伝子発現調節系は、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが２つの異なるコードポリペプチド上に存在する、「デュアルスイッチ」または「２ハイブリッド」ベースの遺伝子発現調節系であり得る。
本発明のエクジソン受容体ベースの遺伝子発現調節系は、ヘテロ二量体またはホモ二量体のいずれでもよい。機能的ＥｃＲ複合体は、一般に、ステロイド受容体ファミリー、種々の昆虫から得られるエクジソン受容体タンパク質、ウルトラスピラクル（ＵＳＰ）タンパク質またはＵＳＰの脊椎動物ホモログ、レチノイドＸ受容体タンパク質、の２つのメンバーからなるヘテロ二量体タンパク質複合体をいう（Ｙａｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６，４７６−４７９；Ｙａｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｃｅｌｌ ７１，６３−７２を参照のこと）。しかし、複合体は、下記のホモ二量体でもあり得る。機能的エクジソン受容体複合体には、イムノフィリンなどのさらなるタンパク質も含まれ得る。転写因子（ＤＨＲ３８またはβＦＴＺ−１など）として公知のタンパク質のステロイド受容体ファミリーのさらなるメンバーはまた、ＥｃＲ、ＵＳＰ、および／またはＲＸＲのリガンド依存性または非依存性パートナーであり得る。さらに、一般にコアクチベーター（アダプターまたはメディエーターとも呼ばれる）として公知のタンパク質などの他の補因子が必要であり得る。これらのタンパク質は、配列特異的にＤＮＡと結合せず、ベーサルの転写に関連しない。これらは、種々の機構（アクチベーターのＤＮＡ結合の刺激、クロマチン構造への影響、またはアクチベーター開始複合体相互作用の媒介が含まれる）を介した転写活性化でその効果を発揮することができる。このようなコアクチベーターの例には、ＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−ｌ、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−ｌ／ＮＣｏＡ−１、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢｌ／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰ、および無差別のコアクチベーターＣ応答エレメントＢ結合タンパク質（ＣＢＰ／ｐ３００）（概説については、Ｇｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２２２−２３２，１９９７を参照のこと）が含まれる。また、一般にコリプレッサー（リプレッサー、サイレンサー、またはサイレンシングメディエーターとしても公知）として公知のタンパク質補因子は、リガンドの非存在下で転写活性化を有効に阻害するために必要であり得る。これらのコリプレッサーは、応答エレメントでの活性をサイレントにするために非リガンド化エクジソン受容体と相互作用することができる。現在の証明により、リガンドの結合により受容体の高次構造が変化し、その結果コリプレッサーが放出されて上記コアクチベーターが漸増し、それによりそのサイレンシング活性が消失することが示唆される。コリプレッサーの例には、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴが含まれる（概説については、Ｈｏｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：１１６７−１１７７，１９９６を参照のこと）。これらの補因子は、細胞または生物で内因性であるか、制御または非制御様式で発現すべき導入遺伝子として外因的に付加することができる。エクジソン受容体タンパク質（ＵＳＰまたはＲＸＲ）のホモ二量体複合体もいくつかの環境下で機能的であり得る。
エクジソン受容体複合体には、典型的には、全てのメンバーが、一般にアミノ末端トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域によってＤＢＤから分離されるリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在によって特徴付けられる核受容体スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質が含まれる。本明細書中で使用される、用語「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ結合ドメインが特定の応答エレメントと関連するように機能する限り、ＤＮＡ結合タンパク質の最小ポリペプチド配列（全長ＤＮＡ結合タンパク質まで）を含む。核受容体スーパーファミリーのメンバーは、４つまたは５つのドメイン（Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）およびいくつかのメンバーではＦの存在によっても特徴づけられる（米国特許第４，９８１，７８４号およびＥｖａｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８８９−８９５（１９８８）を参照のこと）。「Ａ／Ｂ」ドメインはトランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」はヒンジ領域に対応し、「Ｅ」はリガンド結合ドメインに対応する。ファミリーのいくつかのメンバーは、「Ｆ」に対応するＬＢＤのカルボキシ末端側に別のトランス活性化ドメインも有し得る。
ＤＢＤは、エクジソン応答エレメントに対する特異性を付与する２つのアミノ酸モチーフ（ＰボックスおよびＤボックス）の間の２つのシステイン亜鉛フィンガーの存在によって特徴付けられる。これらのドメインは、天然であるか、修飾されているか、異種受容体タンパク質の異なるドメインのキメラであり得る。ＥｃＲ受容体はまた、ステロイド受容体ファミリーのサブセットと同様に、定義が不十分なヘテロ二量体化特性を担う領域を有する。核受容体のドメインが天然でモジュラーであるので、ＬＢＤ、ＤＢＤ，およびトランス活性化ドメインを相互に交換することができる。
エクジソン受容体複合体由来の成分を組み込む遺伝子スイッチ系が公知である。しかし、これらの公知の系では、ＥｃＲを使用するときはいつでも同一の分子上で天然または修飾ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインと会合する。ＵＳＰまたはＲＸＲは、典型的に、サイレントパートナーとして使用される。ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが同一の分子上に存在する場合、リガンドの非存在下でのバックグラウンド活性は高く、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが異なる分子上（すなわち、ヘテロ二量体複合体またはホモ二量体複合体の２つの各パートナー上）に存在する場合、このような活性は劇的に減少することが以前に示されている（ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号を参照のこと）。
（本発明の遺伝子発現の調節方法）
本発明はまた、本発明の遺伝子発現調節系を使用した宿主細胞における遺伝子発現の調節方法に関する。詳細には、本発明は、ａ）本発明の遺伝子発現調節系を宿主細胞に導入する工程と、ｂ）前記宿主細胞にリガンドを導入する工程とを含み、調節されるべき遺伝子が、ｉ）遺伝子発現系のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント、ｉｉ）遺伝子発現系のトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調節される遺伝子を含む遺伝子発現カセットの成分であり、それにより前記宿主細胞への前記リガンドの導入時に遺伝子の発現が調節される、宿主細胞における遺伝子発現の調節方法を提供する。
本発明はまた、ａ）本発明の遺伝子発現調節系を宿主細胞に導入する工程と、ｂ）前記宿主細胞に本発明の遺伝子発現カセットを導入する工程であって、前記遺伝子発現カセットが、ｉ）遺伝子発現系由来のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるドメインを含む応答エレメント、ｉｉ）遺伝子発現系のトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター、およびｉｉｉ）その発現が調節される遺伝子を含む工程、およびｃ）前記宿主細胞にリガンドを導入する工程とを含み、それにより前記宿主細胞への前記リガンドの導入時に遺伝子の発現が調節される、宿主細胞における遺伝子発現の調節方法を提供する。
本発明はまた、遺伝子発現調節系の第１のハイブリッドポリペプチド由来のＤＮＡ結合ドメインが結合するドメインを含む応答エレメント；遺伝子発現調節系の第２のハイブリッドポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモーター；およびその発現が調節される遺伝子、を含む遺伝子発現カセットを含む宿主細胞における遺伝子発現の調節方法であって、ａ）本発明の遺伝子発現調節系を宿主細胞に導入する工程と、ｂ）前記宿主細胞にリガンドを導入する工程とを含み、それにより前記宿主への前記リガンドの導入時に遺伝子の発現が調節される遺伝子発現の制御方法を提供する。
本明細書中に開示の方法を使用した宿主細胞での発現のための目的の遺伝子は、内因性遺伝子または異種遺伝子であり得る。所望の遺伝子またはタンパク質についての核酸またはアミノ酸配列の情報は、多数の公的にアクセス可能なデータベース（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、およびＰＩＲ）または多数の生物学に関連する定期刊行物の１つに存在し得る。したがって、当業者は、実質的に全ての公知の遺伝子についての核酸配列情報にアクセスできる。次いで、このような情報を使用して、本明細書中に記載の方法で使用される遺伝子発現カセット内に目的の遺伝子の挿入のための所望の構築物を構築することができる。
本明細書中に記載の方法を使用した宿主細胞での発現のための目的の遺伝子の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ワクチンとして植物で産生される抗原、α−アミラーゼ、フィターゼ、グルカナーゼ、およびキシラナーゼなどの酵素、昆虫、線虫、真菌、細菌、ウイルス、および非生物ストレスの耐性遺伝子、栄養補助食品、医薬品、ビタミン、アミノ酸成分、除草剤耐性、寒気、干ばつ、および熱耐性、工業製品、油、タンパク質、炭水化物、抗酸化剤、雄性不妊植物、花、燃料、他の産出形質を改変するための遺伝子；病態、疾患、障害、機能障害、遺伝子欠損の治療に使用することができる治療に望ましいポリペプチドまたは産物（モノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インスリン、エリスロポイエチン、凝血因子、他の血液因子もしくは成分など）をコードする遺伝子、遺伝子治療用のベクター、ワクチン用のウイルス、創薬、機能的ゲノミクス、ならびにプロテオミクス分析および適用のための標的など。
（遺伝子発現／転写の測定）
本発明の方法の１つの有用な測定は、ＲＮＡ（好ましくは、ｍＲＮＡ種）の同一性および存在量を含む細胞の転写状態の測定である。このような測定を、任意のいくつかの既存の遺伝子発現テクノロジーによるｃＤＮＡ存在量の測定によって都合よく行う。
核酸アレイテクノロジーは、異なるｍＲＮＡ発現の決定に有用な技術である。このようなテクノロジーには、例えば、オリゴヌクレオチドチップおよびＤＮＡマイクロアレイが含まれる。これらの技術は、固体支持体上に固定し、細胞、組織、または生物全体から抽出した全ｍＲＮＡプールから調製したプローブとハイブリダイズしてｃＤＮＡに転換される異なる遺伝子またはｃＤＮＡに対応するＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドに依拠する。オリゴヌクレオチドチップは、写真平板技術を使用して基体上で合成したオリゴヌクレオチドのアレイである。１７００個までの遺伝子を分析することができるチップが作製されている。ＤＮＡマイクロアレイは、顕微鏡スライド上にロボットによってプリントされたＤＮＡサンプル（典型的には、ＰＣＲ産物）のアレイである。全長または部分的標的ＤＮＡ配列によって各遺伝子を分析する。１０，０００個までの遺伝子を含むマイクロアレイが現在商業上日常的に製造されている。これら２つの技術の間の主な相違は、オリゴヌクレオチドチップは典型的には２５量体のオリゴヌクレオチドを使用し、これは短いＤＮＡ分子を分画することができるが、マイクロアレイのより巨大なＤＮＡ標的（約１０００塩基対）は、複雑なＤＮＡ混合物の分画でより感受性を提供できる。
本発明の別の有用な測定方法は、当該分野で周知のプロセスを使用した細胞中に存在する構成的タンパク質種の存在量の測定による細胞の翻訳状態の決定方法である。
種々の生理学的機能に関連する遺伝子の同定を所望する場合、細胞の成長、アポトーシス、老化、分化、接着、特定の分子への結合、別の細胞への結合、細胞の組織化、器官形成、細胞内輸送、輸送促進、エネルギー変換、代謝、筋肉発生、神経発生、および／または造血としてこのような機能の変化を測定するアッセイを使用することができる。
さらに、本発明を使用して遺伝子発現調節を測定するために、選択マーカーまたはレポーター遺伝子発現を使用することができる。
遺伝子発現産物の他の検出方法は当該分野で周知であり、サザンブロット分析（ＤＮＡ検出）、ドットもしくはスロットブロット分析（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ノーザンブロット分析（ＲＮＡ）、ＲＴ−ＰＣＲ分析（ＲＮＡ）、ウェスタンブロット分析（ポリペプチド検出）、およびＥＬＩＳＡ（ポリペプチド）分析が含まれる。あまり好ましくないが、標識タンパク質を使用して、これとハイブリダイズする特定の核酸配列を検出することができる。
いくつかの場合、核酸配列の量を増幅させる必要がある。多数の適切な方法のうちの１つまたは複数（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）、鎖置換増幅（「ＳＤＡ」）、および転写ベースの増幅などが含まれる）を使用して、これを行うことができる。公知の技術（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下およびハイブリッド形成条件下でオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して核酸サンプルを処理し、特定の配列の鎖（テンプレート）とハイブリダイズするプライマーが検出される）にしたがってＰＣＲを行う。プライマーは、これとハイブリッド形成するための特定の配列の各テンプレート鎖に十分に相補的である。各プライマーの伸長産物を合成し、これはハブリッド形成する核酸テンプレート鎖と相補的である。各プライマーから合成した伸長産物は、同一のプライマーを使用した伸長産物のさらなる合成のためのテンプレートとして使用することもできる。伸長産物の十分な合成ラウンド数後、検出されるべき配列を評価するために、サンプルを上記のように分析することができる。
本発明は、本発明の例として記載した以下の非限定的な実施例を参照してより深く理解することができる。
一般的方法
本明細書中で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｌｌｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されている。
細菌培養物の維持および成長に適切な材料と方法は、当該分野で周知である。以下の実施例での使用に適切な技術を、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ ａｎｄ Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｉｐｓ，ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４））またはＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＡＴｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）から見出すことができる。宿主細胞の成長および維持のために使用した全ての試薬、制限酵素、および材料は、特記しない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．から利用可能なプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、遺伝子配列を操作することができる。ＧＣＧプログラムの「Ｐｉｌｅｕｐ」を使用する場合、ギャップ作製デフォルト値１２およびギャップ伸長デフォルト値４を使用することができる。ＣＧＣの「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムを使用する場合、デフォルトギャップ作製ペナルティ５０およびデフォルトギャップ伸長ペナルティ３を使用することができる。ＣＧＣプログラムのパラメーターが指示されない場合はいつでも、これらまたは任意の他のＧＣＧプログラムでは、デフォルト値を使用することができる。
略語の意味は以下である：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「Ａ」はアデニンまたはアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミンまたはチミジンを意味し、「Ｇ」はグアニンまたはグアノシンを意味し、「Ｃ」はシチジンまたはシトシンを意味し、「ｘｇ」は重力を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ａａ」はアミノ酸を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｋ」はキロを意味し、「μ」はマイクロを意味し、「℃」は摂氏度を意味する。
実施例１
化合物の調製
方法Ａの実施例
５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸（１−ベンゾイル−シクロペンチル）−アミド（化合物実施例２２）の調製
Figure 2010187690
ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中の粗１−アミノ−１−ベンゾイルシクロペンタン（５００ｍｇ、純度４０％に基づいて〜１ｍｍｏｌ）、２−エチル−３，４−エチレンジオキシ安息香酸（２２０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（４１６μＬ、２．３ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（１２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にＮ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（２２２ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を週末にわたって攪拌した。５％ ＨＣｌ水溶液（８ｍＬ）を用いて２０ｍＬのＣｈｅｍ Ｅｌｕｔカートリッジを予備湿潤し、反応混合液を添加した。エーテル（２５ｍＬ）を用いてこのカートリッジを溶出させた。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用いて第２の２０ｍＬのＣｈｅｍ Ｅｌｕｔカートリッジを予備湿潤化し、それにエーテル溶離液を添加して収集した。この溶離液を乾燥するまで蒸発させると油が残留したので、これをヘキサンにより予備湿潤化した５ｇのシリカカートリッジにアプライした。ヘキサン中の０、１０、２５、５０、７５および１００％エーテル（各２０ｍＬ）を用いてカートリッジを連続的に溶出し、６つのフラクションを収集した。フラクション５および６を集め、５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸（１−ベンゾイル−シクロペンチル）−アミド（化合物実施例２２、１３１ｍｇ）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．８８（ｔ， ３Ｈ， Ｊ＝７．４Ｈｚ）， １．８１（ｍ， ４Ｈ）， ２．０３（ｍ， ２Ｈ）， ２．２５（ｑ， Ｊ＝７．４Ｈｚ）， ２Ｈ）， ２．５５（ｍ， ２Ｈ）， ４．１８（ｓ， ４Ｈ）， ６．４３（ｄ， Ｊ＝８．４Ｈｚ， １Ｈ）， ６．５１（ｄ， Ｊ＝８．４Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７４（ｓ， １Ｈ）， ７．４０（ｍ， ３Ｈ）， ７．８５（ｍ， ２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １４．６， １９．５， ２４．９， ３７．４， ５３．４， ６４．０， ６４．１， ７０．７， １１４．２， １１９．３， １２７．８， １２８．２， １２８．８， １３１．４， １３２．１， １３６．６， １４１．４， １４４．５， １６８．８， ２０１．４．
方法Ｂの実施例
５−（３−メトキシ−２−メチル−フェニル）−６−オキサ−４−アザ−スピロ［２．４］ヘプト−４−エン−７−オン（ＶＩＩ、Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ、Ｒ２＝Ｒ３＝−（ＣＨ２）２−）の調製
Figure 2010187690
〜５℃へ冷却したピリジン（２０ｍＬ）中の１−アミノシクロプロパンカルボン酸（１．０６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、固体の３−メトキシ−２−メチルベンゾイルクロリド（４．３５ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を室温で１週間撹拌し、減圧下で蒸発させると油性固体が残留した。この物質をヘキサン中の２０％エーテル（１７５ｍＬ）に取り、水（５０ｍＬ）、５％ ＨＣｌ水溶液（２×５０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）を用いて洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥して減圧下で蒸発させると、黄色固体として５−（３−メトキシ−２−メチル−フェニル）−６−オキサ−４−アザ−スピロ［２．４］ヘプト−４−エン−７−オン（１．９０ｇ）が残留した。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．８０（ｍ， ２Ｈ）， １．９０（ｍ， ２Ｈ）， ２．４９（ｓ， ３Ｈ）， ３．８５（ｓ， ３Ｈ）， ７．０１（ｄ， １Ｈ）， ７．２２（ｔ， １Ｈ）， ７．４０（ｄ， １Ｈ）．
３−メトキシ−Ｎ−［１−（メトキシ−メチル−カルバモイル）−シクロプロピル］−２−メチル−ベンズアミド、Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ、Ｒ２＝Ｒ３＝−（ＣＨ２）２−の調製
Figure 2010187690
５−（３−メトキシ−２−メチル−フェニル）−６−オキサ−４−アザ−スピロ［２．４］ヘプト−４−エン−７−オン（ＶＩＩ， Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ， Ｒ２＝Ｒ３＝−（ＣＨ２）２−、１．９０ｇ、８．２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンヒドロクロリド（０．９６ｇ、９．９ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．８０ｍＬ、９．９ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（３０ｍＬ）の混合液を室温で１週間にわたり攪拌した。この混合液を酢酸エチル（１５０ｍＬ）により希釈し、５％ ＨＣｌ水溶液（２×５０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×５０ｍＬ）により洗浄し、そして乾燥した。溶媒を除去するとシロップとして粗生成物（２．５４ｇ）が得られた。ヘキサン中の０、２０、４０、６０、８０、１００％エーテル（各２００ｍＬ）および酢酸エチル（５００ｍＬ）を用いて連続的に溶出させる、シリカゲル（７５ｇ）カラム上でのフラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、白色固体として３−メトキシ−Ｎ−［１−（メトキシ−メチル−カルバモイル）−シクロプロピル］−２−メチル−ベンズアミド（１．６７ｇ、６９％）が得られた。ｍｐ（融点）：１７３〜１７５℃。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．１５（ｍ， ２Ｈ）， １．５３（ｍ， ２Ｈ）， ２．２３（ｓ， ３Ｈ）， ３．２２（ｓ， ３Ｈ）， ３．６９（ｓ， ３Ｈ）， ３．８２（ｓ， ３Ｈ）， ６．６７（ｓ， １Ｈ）， ６．８６（ｄ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９０（ｄ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１３（ｔ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， １Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １２．３， １５．１， ３３．６， ３５．１， ５５．６， ６１．０， １１１．４， １１８．６， １２４．９， １２６．５， １３７．４， １５７．９， １７０．３， １７０．９． Ｃ１５Ｈ２０Ｎ２Ｏ４に対する計算値：Ｃ６１．６３；Ｈ，６．９０；Ｎ，９．５８．実測値：Ｃ，６１．２４；Ｈ，６．７５；Ｎ，９．３０。
Ｎ−［１−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−シクロプロピル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（化合物実施例１３）の調製
Figure 2010187690
乾燥Ｎ２を用いて丸底フラスコをフラッシュし、撹拌子および３−メトキシ−Ｎ−［１−（メトキシ−メチル−カルバモイル）−シクロプロピル］−２−メチル−ベンズアミド（Ｖ，Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ、Ｒ２＝Ｒ３＝−（ＣＨ２）２、７３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）および３，５−ジメチルフェニルマグネシウムブロミド（ＴＨＦ中で１Ｍ、１ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を５時間攪拌し、攪拌した飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（６ｍＬ）中へ注入した。この混合液を２０ｍＬのＣｈｅｍ Ｅｌｕｔカートリッジに添加し、５分間放置した。ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を用いてこのカートリッジを溶出させた。溶離液を乾燥するまで蒸発させると、固体として粗生成物（６７ｍｇ）が得られた。
粗生成物を２ｇのシリカカートリッジへアプライし、ヘキサン中の２５、５０および７５％酢酸エチル（各１０ｍＬ）および酢酸エチル（３×１０ｍＬ）を用いて溶出させ、６つの画分を収集した。フラクション２、３および４を集めると、白色固体としてＮ−［１−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−シクロプロピル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド１３（５８ｍｇ）が得られた。ｍｐ：１７４〜１７６℃。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３１（ｍ， ２Ｈ）， １．８３（ｍ， ２Ｈ）， １．９３（ｓ， ３Ｈ）， ２．３２（ｓ， ６Ｈ）， ３．７９（ｓ， ３Ｈ）， ６．４７（ｓ， １Ｈ）， ６．５６（ｄ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８１（ｄ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０６（ｄ， Ｊ＝７．９Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１０（ｓ， １Ｈ）， ７．３３（ｓ， ２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１１．９， １８．６， ２１．２， ４０．７， ５５．６， １１１．４， １１８．１， １２３．５， １２５．１， １２６．４， １３３．１， １３７．１， １３７．７， １３８．０， １５７．９， １７０．４， ２０２．３。
方法Ｃの実施例
４−イソプロピル−２−（３−メトキシ−２−メチル−フェニル）−４−メチル−４Ｈ−オキサゾール−５−オン（ＶＩＩ、Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ、Ｒ２＝ｉ−Ｐｒ、Ｒ３＝Ｍｅ）の調製
Figure 2010187690
〜５℃へ冷却したピリジン（４０ｍＬ）中のα−メチルバリン（２．６２ｇ、２０ｍｍｏｌ）の攪拌懸濁液に、固体の３−メトキシ−２−ベンゾイルクロリド（８．３１ｇ、４５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を室温へ加温させ、１週間にわたり攪拌した。ピリジンをロータリーエバポレータによって除去し、残留物をエーテル（１５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）中に取った。有機相を分離し、５％ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）を用いて洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去すると、油性固体として４−イソプロピル−２−（３−メトキシ−２−メチル−フェニル）−４−メチル−４Ｈ−オキサゾール−５−オン（６．４１ｇ）が残留した。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９７（ｄ， Ｊ＝６．６Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０９（ｄ， Ｊ＝６．６Ｈｚ， ３Ｈ）， １．５１（ｓ， ３Ｈ）， ２．１２（ｍ， １Ｈ）， ２．５０（ｓ， ３Ｈ）， ３．８５（ｓ， ３Ｈ）， ７．０２（ｍ， １Ｈ）， ７．２４（ｍ， １Ｈ）， ７．４０（ｍ， １Ｈ）。
Ｎ−（１−ヒドロキシメチル−１，２−ジメチル−プロピル）−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（Ｘ、Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ、Ｒ２＝ｉ−Ｐｒ、Ｒ３＝Ｍｅ）の調製
Figure 2010187690
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の４−イソプロピル−２−（３−メトキシ−２−メチル−フェニル）−４−メチル−４Ｈ−オキサゾール−５−オン（ＶＩＩ、Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ、Ｒ２＝ｉ−Ｐｒ、Ｒ３＝Ｍｅ、１．７６ｇ、６．７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に室温で固体の水素化ホウ素ナトリウム（０．１５ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を１６時間にわたり攪拌し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。溶媒を除去すると白色のガラス状固体が残留したので、これをＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）中に取り、１％ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）を用いて洗浄し、そして乾燥させた。溶媒を除去すると、白色固体としてＮ−（１−ヒドロキシメチル−１，２−ジメチル−プロピル）−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（１．２５ｇ）が残留した。Ｍｐ：１４２〜１４５℃。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９７（ｄ， Ｊ＝６．６Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９８（ｄ， Ｊ＝６．６Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１１（ｓ， ３Ｈ）， ２．２６（ｓ， ３Ｈ）， ２．５０（ｍ， １Ｈ）， ３．７５（ｍ， ２Ｈ）， ３．８４（ｓ， ３Ｈ）， ５．３９（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ５．８３（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．９０（ｍ， ２Ｈ）， ７．１８（ｍ， １Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １２．４， １６．８， １７．０， １８．３， ３１．１， ５５．５， ６２．４， ６８．１， １１１．２， １１８．１， １２４．０， １２６．６， １３８．２， １５７．９， １７１．３。
Ｎ−（１−ホルミル−１，２−ジメチル−プロピル）−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（ＩＸ、Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ、Ｒ２＝ｉ−Ｐｒ、Ｒ３＝Ｍｅ）の調製
Figure 2010187690
ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中のＮ−（１−ヒドロキシメチル−１，２−ジメチル−プロピル）−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（Ｘ、Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ、Ｒ２＝ｉ−Ｐｒ、Ｒ３＝Ｍｅ、２８５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に室温でＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン溶液（重量で１５％、２．４ｍＬ、約１．１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を室温で４時間攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）中へ注入した。固体のＮａ２Ｓ２Ｏ３（２．１３ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を添加し、この混合液を３０分間攪拌した。エーテル（１５０ｍＬ）を用いてこの混合液を抽出した。エーテル抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）により洗浄し、乾燥し、減圧下で蒸発させると、油としてＮ−（１−ホルミル−１，２−ジメチル−プロピル）−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（２９３ｍｇ）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９８（ｄ， Ｊ＝６．６Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０４（ｄ， Ｊ＝６．６Ｈｚ， ３Ｈ）， １．５１（ｓ， ３Ｈ）， ２．２７（ｓ， ３Ｈ）， ２．２９（ｍ， １Ｈ）， ３．８４（ｓ， ３Ｈ）， ６．３０（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．９１（ｍ， １Ｈ）， ６．９６（ｍ， １Ｈ）， ７．１８（ｍ， １Ｈ）， ９．６０（ｓ， １Ｈ）。
Ｎ−［１，２−ジメチル−１−（３−メチル−ベンゾイル）−プロピル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（化合物実施例３１）の調製
Figure 2010187690
オーブンで乾燥させた、撹拌子を装備したバイアルをＮ２でフラッシュし、無水ＴＨＦ（１ｍＬ）中のＮ−（１−ホルミル−１，２−ジメチル−プロピル）−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（ＩＸ、Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ、Ｒ２＝ｉ−Ｐｒ、Ｒ３＝Ｍｅ、１３１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を装填し、ドライアイスアセトン中で冷却した。３−メチルフェニル−マグネシウムブロミド（１．０Ｍ、２ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、この混合液を室温で２時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍＬ）を添加することによりこの反応をクエンチし、１０ｍＬのＣｈｅｍ Ｅｌｕｔカートリッジ上に注入した。５分後に、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を用いてこのカートリッジを溶出させた。この溶出液を蒸発させると第２級アルコール、Ｎ−［１−（ヒドロキシ−ｍ−トリル−メチル）−１，２−ジメチル−プロピル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（ＶＩＩＩ、Ｒ１＝２−Ｍｅ−３−ＭｅＯ−Ｐｈ、Ｒ２＝ｉ−Ｐｒ、Ｒ３＝Ｍｅ、Ｒ４＝３−Ｍｅ−Ｐｈ、１８０ｍｇ）が残留した。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲはアルデヒドの完全消費を証明した。
Figure 2010187690
ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中の粗Ｎ−［１−（ヒドロキシ−ｍ−トリル−メチル）−１，２−ジメチル−プロピル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド、ＶＩＩＩの攪拌溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（１．４ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中で１５重量％、０．６５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を室温で６時間にわたり攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍＬ）により希釈し、固体のＮａ２Ｓ２Ｏ３（〜１ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を用いて処理した。この混合液を３０分間攪拌し、１０ｇのＣｈｅｍ Ｅｌｕｔカートリッジへ添加し、５分間放置し、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）により溶出させた。この溶出液を蒸発させると粗ケトン１（９５ｍｇ）が残留した。この粗ケトンをＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中に取り上げ、ＰＳ−ＴｓＮＨＮＨ２樹脂（０．２０ｇ、２．９ｍｍｏｌ／ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を用いて処理し、６時間にわたり放置した。この混合液を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２およびエーテルを用いて洗浄した。この溶出液を蒸発させると固体が残留したので、これを２ｇのシリカカートリッジ上で分別し、ヘキサン中の０、２５、５０および７５％エーテル（各１０ｍＬ）およびエーテル（２×１０ｍＬ）を用いて連続的に溶出させた。第４フラクション（ヘキサン中の７５％エーテル）はオフホワイトの固体としてＮ−［１，２−ジメチル−１−（３−メチル−ベンゾイル）−プロピル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド３１（２７ｍｇ）を含有していた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９４（ｄ， Ｊ＝６．８Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０９（ｄ， Ｊ＝６．７Ｈｚ， ３Ｈ）， １．６７（ｓ， ３Ｈ）， ２．０１（ｓ， ３Ｈ）， ２．３７（ｓ， ３Ｈ）， ２．５０（ｍ， １Ｈ）， ６．３６（ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．７６（ｄ， Ｊ＝７．６Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８４（ｄ， Ｊ＝８．１Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１２（ｍ， １Ｈ）， ７．４０（ｍ， ２Ｈ）， ７．７８（ｍ， ２Ｈ）。
方法Ｄの実施例
（３，５−ジクロロ−フェニル）−（１−ニトロ−シクロヘキシル）−メタノール（ＸＩＶ）の調製
Figure 2010187690
メタノール（４０ｍＬ）を用いて２５％ナトリウムメトキシド溶液（２４．９ｍｍｏｌ、５．７ｍＬ）を希釈し、氷浴中で冷却し、そして１０分間をかけて滴下法でニトロシクロヘキサンを添加した。この混合液を３０分間にわたり攪拌し、氷浴中で冷却し、そして固体の３，５−ジクロロベンズアルデヒドを添加した。この混合液を週末にわたって攪拌し、氷浴中で再冷却し、２ｍＬの氷酢酸を用いて処理した。この混合液を水（１２５ｍＬ）に注入し、エーテル（２×７５ｍＬ）を用いて抽出した。合わせたエーテル抽出物を水（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去すると、黄色油として粗（３，５−ジクロロ−フェニル）−（１−ニトロ−シクロヘキシル）−メタノール（８．９３ｇ）が残留した。ヘキサン中の０〜１００％エーテルを用いて勾配溶出させるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより純度の上昇した（約７０％）の生成物が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．３５（ｓ， １Ｈ）， ７．１９（ｓ， ２Ｈ）， ４．９０（ｓ， １Ｈ）， ０．９〜１．８（ｍ， １０Ｈ）。
（１−アミノ−シクロヘキシル）−（３，５−ジクロロ−フェニル）−メタノール（ＸＩＩＩ）の調製
Figure 2010187690
〜５℃へ冷却したメタノール（４０ｍＬ）および濃ＨＣｌ（１０ｍＬ）中の（３，５−ジクロロ−フェニル）−（１−ニトロ−シクロヘキシル）−メタノール（５．８７ｇ、１９．３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に亜鉛末を添加した。この混合液を室温で一晩かけて攪拌し、セライトに通して濾過した。濾過ケークをメタノール（２×１００ｍＬ）により洗浄し、濾液を乾燥するまで蒸発させた。この残留物を５％ ＮａＯＨ水溶液（１００ｍＬ）により処理し、酢酸エチル（２×２００ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させると白色固体として（１−アミノ−シクロヘキシル）−（３，５−ジクロロ−フェニル）−メタノール（４．３６ｇ）が残留した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．２５（ｓ， １Ｈ）， ７．１８５（ｓ， ２Ｈ）， ４．２１（ｓ， １Ｈ）， １．５５（ｍ， ４Ｈ）， １．３（ｍ， ３Ｈ）， １．１（ｍ， ３Ｈ）。
Ｎ−｛１−［（３，５−ジクロロ−フェニル）−ヒドロキシ−メチル］−シクロヘキシル｝−４−メチル−ベンゼンスルホンアミド（ＸＩＩ）の調製
Figure 2010187690
ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中の（１−アミノ−シクロヘキシル）−（３，５−ジクロロ−フェニル）−メタノールおよびピリジン（１００μＬ、１．２４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にｐ−トルエンスルホニルクロリドを添加した。この混合液を約３５℃で８時間加熱した。５％ ＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を用いて予備湿潤した１０ｍＬのＣｈｅｍ Ｅｌｕｔカートリッジへこの混合液を適用し、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を用いて溶出させた。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用いて予備湿潤した第２のＣｈｅｍ Ｅｌｕｔカートリッジへこの溶出液を適用した。第２カートリッジからの溶出液を蒸発させると、油としてＮ−｛１−［（３，５−ジクロロ−フェニル）−ヒドロキシ−メチル］−シクロヘキシル｝−４−メチル−ベンゼンスルホンアミド（１３９ｍｇ）が残留した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．７（ｄ， ２Ｈ）， ７．２（ｓ， ２Ｈ）， ７．１５（ｄ， ２Ｈ）， ７．１（ｓ， １Ｈ）， ４．８２（ｓ， １Ｈ）， ４．１６（ｓ， １Ｈ）， ２．３３（ｓ， ３Ｈ）， ０．９〜１．９（ｍ， １０Ｈ）。
Ｎ−［１−（３，５−ジクロロ−ベンゾイル）−シクロヘキシル］−４−メチル−ベンゼンスルホンアミド（ＩＩ）の調製
Figure 2010187690
ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中のＮ−｛１−［（３，５−ジクロロ−フェニル）−ヒドロキシ−メチル］−シクロヘキシル｝−４−メチル−ベンゼンスルホンアミドの攪拌溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬を添加した。この混合液を６時間攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍＬ）および固体のＮａ２Ｓ２Ｏ３（約１ｇ）を添加した。３０分間攪拌した後、この混合液を１０ｍＬのＣｈｅｍ Ｅｌｕｔカートリッジに添加し、５分間放置した。ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を用いてこのカートリッジを溶出し、溶出液を蒸発させると油として予定のケトン（１０２ｍｇ）が残留した。粗生成物をＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中に溶解させ、ＰＳ−ＴｓＮＨＮＨ２樹脂（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）と一緒に３時間攪拌した。この混合液を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）、エーテル（５ｍＬ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を用いて洗浄した。この濾液を蒸発させると、油としてＮ−［１−（３，５−ジクロロ−ベンゾイル）−シクロヘキシル］４−メチル−ベンゼンスルホンアミド（９８ｍｇ）が残留した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．８（ｓ， ２Ｈ）， ７．６（ｄ， ２Ｈ）， ７．４（ｓ， １Ｈ）， ７．２（ｄ， ２Ｈ）， ５．７５（ｓ， １Ｈ）， ２．３５（ｓ， ３Ｈ）， １．９（ｍ， ２Ｈ）， １．８（ｍ， ２Ｈ）， １．４（ｍ， ３Ｈ）， １．３（ｍ， ２Ｈ）， １．２（ｍ， １Ｈ）。
種々の方法
［１−（メトキシ−メチル−カルバモイル）−１−メチル−エチル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの調製
Figure 2010187690
Ｂｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ（５ｇ、２４．６１ｍｍｏｌ、１当量）、ＭｅＮＨＯＭｅ．ＨＣｌ（２．８８ｇ、２９．５３ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＤＭＡＰ（３．６１ｇ、２９．５３ｍｍｏｌ、１．２当量）、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（５．０２ｍＬ、２９．５３ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）の攪拌混合液にＤＣＣ（６．０９ｇ、２９．５３ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。この混合液を室温で５日間攪拌した。この混合液を濾過して沈殿したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシウレアを除去し、濾液を減圧下で蒸発させた。残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）中に溶解し、１０％クエン酸水溶液（３×２００ｍＬ）、１０％ ＮａＨＣＯ３水溶液（３×２００ｍＬ）および飽和塩化ナトリウム水溶液（３×２００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去して産生した粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル ６０：４０）によって精製すると、白色固体として［１−（メトキシ−メチル−カルバモイル）−１−メチル−エチル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４．８５ｇ、８０％）が得られた。１Ｈ ＮＭＲ（２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４３（ｓ， ６Ｈ）， １．５８（ｓ， ９Ｈ）， ３．２２（ｓ， ３Ｈ）， ３．６９（ｓ， ３Ｈ）， ６．９５（ｂｓ， １Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ、＋ｖｅイオン）：ｍ／ｚ ２４７．２（Ｍ＋１）＋。
２−アミノ−Ｎ−メトキシ−２，Ｎ−ジメチル−プロピオンアミドの調製
Figure 2010187690
Ｂｏｃ−保護Ｗｅｉｎｒｅｂアミドである［１−（メトキシ−メチル−カルバモイル）−１−メチル−エチル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．１ｇ、４．４７ｍｍｏｌ）をＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２溶液（１：１、５０ｍＬ）中に取り、２０分間攪拌した。溶媒を除去すると、そのＴＦＡ塩として２−アミノ−Ｎ−メトキシ−２，Ｎ−ジメチル−プロピオンアミド（１．１５ｇ、９９％、定量的収率）が残留した。１Ｈ ＮＭＲ（２００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．６３（ｓ， ６Ｈ）， ３．２５（ｓ， ３Ｈ）， ３．７８（ｓ， ３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ、陽イオン）：ｍ／ｚ １４７．３（Ｍ＋１）＋。
Ｎ−（１，１−ジメチル−２−オキソ−ブチル）−ベンズアミドの調製
Figure 2010187690
ヒドロキシベンゾトリアゾール樹脂（０．１０７ｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ−ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）中の、安息香酸（０．１２ｇ、０．９８２ｍｍｏｌ、５当量）、ＤＩＣ（０．１５２ｍＬ、０．９８２ｍｍｏｌ、５当量）およびＤＭＡＰ（０．０２４ｇ、０．１９６ｍｍｏｌ、１当量）により処理し、５時間振とうした。この混合液を濾過し、樹脂をＤＭＦ（１０×５ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１０×５ｍＬ）を用いて洗浄すると、樹脂支持安息香酸ベンゾトリアゾール−１−イルエステルが得られた。ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中の樹脂エステル（０．１９６ｍｍｏｌ、１．５当量）の懸濁液にｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（０．０３３ｍＬ、０．１９６ｍｍｏｌ、１．５当量）および２−アミノ−２−メチル−ペンタン−３−オン（０．０３ｇ、０．１３１ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。この混合液を１６時間攪拌して濾過した。この濾液を弱塩基性イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ−９５（１ｇ、４．７ｍｍｏｌ ｇ−１、２５当量）と一緒に１６時間攪拌して溶液中に存在する安息香酸を除去して濾過した。この濾液をシリカゲルの短いカラム（ヘキサン／酢酸エチル ５０：５０）に通して溶出させることにより未反応アミンを除去した。有機溶媒を蒸発すると、白色固体としてＮ−（１，１−ジメチル−２−オキソ−ブチル）−ベンズアミド（０．０３ｇ、８７％）が残留した。１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．１４（ｔ， Ｊ＝７．２Ｈｚ， ３Ｈ）， １．５７（ｓ， ６Ｈ）， ２．６３（ｑ， Ｊ＝７Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２１（ｂｓ， １Ｈ）， ７．３８−７．５６（芳香族 Ｈ’ｓ， ３Ｈ）， ７．７９（ｄｄ， Ｊ＝８， １．８Ｈｚ， ２Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ、陽イオン）：ｍ／ｚ ２２０．２（Ｍ＋１）＋。
Ｎ−［４−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ピペリジン−４−イル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミドの調製
Figure 2010187690
ＣＨ２Ｃｌ２およびトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）中の４−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−４−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイルアミノ）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの溶液を室温で２時間攪拌した。ロータリーエバポレータによって溶媒を除去し、残留物をエーテル（１５０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）の間で分配させた。有意な量の未溶解固体が存在した。エーテル層をＭｇＳＯ４の上方で乾燥させて蒸発させると、固体としてＮ−［４−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ピペリジン−４−イル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（０．５０ｇ）が残留した。ＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）を用いて水相の抽出および濃縮によって追加の生成物（０．１１ｇ）を入手した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．５５（ｓ， ２Ｈ）， ７．１２（ｍ， ２Ｈ）， ６．８７（ｄ， １Ｈ）， ６．７７（ｄ， １Ｈ）， ６．６５（ｂｒ， １Ｈ）， ３．８（ｓ， ３Ｈ）， ３．１（ｂｒ， ２Ｈ）， ２．９５（ｂｒ， ２Ｈ）， ２．３（ｓ， ６Ｈ）， ２．２５（ｂｒ ｓ， ４Ｈ）， １．９４（ｓ， ３Ｈ）。
Ｎ−［１−アセチル−４−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ピペリジン−４−イル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミドの調製
Figure 2010187690
２５ｍＬのバイアルに電磁撹拌子を装着し、モルホリノメチルポリスチレン（ＰＳ−ＮＭＭ、〜３００ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ／ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を装填した。Ｎ−［４−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ピペリジン−４−イル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミド（７６ｍｇ、２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中で０．２ｍｍｏｌ）の溶液、次に塩化アセチル（１６μＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を２日間攪拌し、濾過し、２ｇシリカゲルカートリッジ上で分画化し、ヘキサン中の０〜１００％の酢酸エチルを用いて勾配溶離することによりＮ−［１−アセチル−４−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ピペリジン−４−イル］−３−メトキシ−２−メチル−ベンズアミドが得られた。１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：７．６（ｓ， ２Ｈ）， ７．１５（ｍ， ２Ｈ）， ６．８７（ｄ， ２Ｈ）， ６．７（ｄ， １Ｈ）， ４．１７（ｄｔ， １Ｈ）， ３．８（ｓ， ３Ｈ）， ３．７８（ｍ， １Ｈ）， ３．４５（ｔ， １Ｈ）， ３．２５（ｔ， １Ｈ）， ２．５（ｍ， １Ｈ）， ２．３５（ｍ， １Ｈ）， ２．３２（ｓ， ６Ｈ）， ２．２（ｍ， １Ｈ）， ２．１７（ｍ， １Ｈ）， ２．０５（ｓ， ３Ｈ）， １．９２（ｓ， ３Ｈ）。
一部の関連するＲ２／Ｒ３誘導体化は塩基としてモルホリノプロピル変性シリカゲルを用いて実施した。過剰なアルキル化剤またはアシル化剤は、ジアミン−変性シリカゲルを用いて除去した。
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
実施例２
化合物の生物学的試験
本発明のリガンドは、遺伝子治療、宿主細胞中での当該タンパク質の発現、トランスジェニック生物の産生、およびセルベース・アッセイを含む様々な用途において有用である。
Ｚ３アッセイ
安定な細胞株
Ｆ． Ｇａｇｅ博士は、Ｓｕｈｒ， Ｓ．Ｔ．， Ｇｉｌ， Ｅ．Ｂ．， Ｓｅｎｕｔ Ｍ．Ｃ．， Ｇａｇｅ， Ｆ．Ｈ．（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５， ７９９９〜８０４に記載されたＣＶＢＥおよび６ＸＥｃＲＥを含有する安定性形質転換細胞の集団を提供した。ヒト２９３腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３細胞とも呼ばれる）に、最初にスイッチ構築物ＣＶＢＥ、その後にレポーター構築物６×ＥｃＲＥ ＬａｃＺをコードするレトロウイルスベクターを連続的に感染させた。スイッチ構築物は、フレーム中に挿入されたＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉＥｃＲ（ＢＥ）（Ｉａｔｒｏｕ）由来のアミノ酸２６〜５４６のコード配列およびＶＰ１６トランス活性化ドメイン（ＶＢＥ）の下流を含んでいた。合成ＡＴＧ開始コドンを、サイトメガロウイルス（ＣＶＢＥ）即時型初期プロモーターの制御下に置き、ロングターミナルリピートに隣接させた。レポーター構築物は、ＬａｃＺの上流に配置され、且つＬＴＲ配列が両側に隣接された６コピーのエクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）結合部位（６×ＥｃＲＥ）を含んでいた。
希釈クローニングを使用して、各クローンを単離した。４５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８および１００ｎｇ／ｍｌピューロマイシンを使用してクローンを選択した。各クローンを、試験リガンドの存在下および非存在下におけるその応答に基づいて評価した。スクリーニングおよびＳＡＲ目的のために、クローンＺ３を選択した。
哺乳動物細胞株
ＣＶＢＥおよび６×ＥｃＲＥ ｌａｃｋで安定に形質転換されたヒト２９３腎臓細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２６１４０−０８７）、４５０ ｇｕｍＧ４１８（Ｍｅｄｉａｔｅｓ，３０−２３４−ＣＲ）、および１００ ｇｎｏｍｅ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｐ−７２５５）を含む最少基礎培地（Ｍｅｄｉａｔｅｓ，１０−０１０−ＣＶ）中にて、３７℃、５％ＣＯ２を含む雰囲気下で維持し、７５％コンフルエントに達した時点で継代培養を行った。
リガンドでの処置
２．５×１０３細胞／ウェルの濃度のＺ３細胞を、９６ウェル組織培養プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＤＭＳＯ中にリガンドのストック溶液を調製した。リガンドストック溶液を培地で１００倍に希釈し、５０μＬのこの希釈リガンド溶液（３３μＭ）を細胞に添加した。コントロールおよび処置群の両方で、ＤＭＳＯの最終濃度を０．０３％に維持した。
レポーター遺伝子アッセイ
レポーター遺伝子発現を細胞処置から４８時間後に評価し、β−ガラクトシダーゼ活性をＴｒｏｐｉｘのＧａｌ Ｓｃｒｅｅｎ（商標）バイオ発光レポーター遺伝子アッセイ系（ＧＳＹ１０００）を使用して測定した。リガンド処理された細胞中の相対光単位（「ＲＬＵ」）をＤＭＳＯ処理された細胞中のＲＬＵで割ることによって、誘導活性倍率を計算した。ＤｙｎｅｘＭＬＸマイクロタイタープレート照度計を使用して室温で発光を検出した。
スイッチ構築物ＣＶＢＥおよびレポーター構築物６×ＥｃＲＥＬａｃＺの略図を図１に示す。両構築物はロングターミナルリピートに隣接し、Ｇ４１８およびピューロマイシンは選択マーカーであり、ＣＭＶはサイトメガロウイルスであり、ＶＢＥはＶＰ１６トランス活性化ドメインの下流に挿入されたＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉＥｃＲ由来のアミノ酸２６〜５４６のコード配列であり、６×ＥｃＲＥは６コピーのエクジソン応答エレメントであり、ｌａｃＺはレポーター酵素β−ガラクトシダーゼをコードする。Ｓｕｈｒ Ｓ．Ｔ．， Ｇｉｌ Ｅ．Ｂ．， Ｓｅｎｕｔ Ｍ．Ｃ．， Ｇａｇｅ Ｆ．Ｈ．（１９９８）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５， ７９９９−８０４． Ｓｗｅｖｅｒｓ Ｌ．， Ｄｒｅｖｅｔ Ｊ．Ｒ．， Ｌｕｎｋｅ Ｍ．Ｄ．， Ｉａｔｒｏｕ Ｋ．（１９９５）， Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５， ８５７〜８６６。
２７−６３アッセイ
遺伝子発現カセット
ＧＡＬ４ＤＢＤ（１−１４７）−ＣｆＥｃＲ（ＤＥＦ）／ＶＰ１６ＡＤ−βＲＸＲＥＦ−ＬｍＵＳＰＥＦ：
トウヒシントメハマキのＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ ＥｃＲ由来の野生型Ｄ、Ｅ、およびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ」；配列番号１）を、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＢＤ１−１４７」；配列番号２のヌクレオチド３１〜４７１）に融合し、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（「ＰＧＫ」；配列番号３）の制御下に置いた。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＲＸＲβ由来のＥＦドメインのヘリックス１〜８およびＬｕｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａウルトラスピラクルタンパク質のＥＦドメインのヘリックス９〜１２（「ＨｓＲＸＲβ−ＥＦ−ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」；配列番号４）を、ＶＰ１６のトランス活性化ドメイン（「Ｖ１６ＡＤ」；配列番号５）に融合し、伸長因子−１αプロモーター（「ＥＦ−１α」；配列番号６）の制御下に置いた。５つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（「５×ＧＡＬ４ＲＥ」；配列番号７を含む５つのＧＡＬ４ＲＥを含む）を、合成ＴＡＴＡ最少プロモーター（配列番号８）に融合し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（配列番号９）の上流に置いた。
安定な細胞株
ＣＨＯ細胞を、１つのプラスミド上の普遍的に活性な細胞プロモーター（それぞれＰＧＫおよびＥＦ−１α）によって制御されたＧＡＬ４ＤＢＤ（１−１４７）ＣｆＥｃＲ（ＤＥＦ）およびＶＰ１６ＡＤβＲＸＲＥＦ−ＬｍＵＳＰＥＦについての転写カセットで一時的にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞を、ゼオシン耐性によって選択した。それぞれ単離したＣＨＯ細胞クローンを、ＧＡＬ４ＲＥ−ルシフェラーゼレポーター（ｐＦＲ Ｌｕｃ）で一時的にトランスフェクトした。ハイグロマイシンを使用して、２７−６３クローンを選択した。
リガンドでの処理
細胞をトリプシン処理し、２．５×１０４細胞ｍＬに希釈した。１００μＬの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに置き、５％ＣＯ２下にて３７℃で２４時間インキュベートした。ＤＭＳＯ中でリガンドストック溶液を調製し、全処理のために３００倍に希釈した。用量応答試験は、３３μＭから０．０１μＭまでの範囲の８つの濃度からなる。
レポーター遺伝子アッセイ
ＰｒｏｍｅｇａのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（Ｅ２６５０）を使用して、細胞処理から４８時間後にルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を測定した。Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸマイクロタイタープレート照度計を使用して、室温で発光を検出した。
１３Ｂ３アッセイ
遺伝子発現カセット
ＧＡＬ４ ＤＢＤ−ＣｆＥｃＲ（ＤＥＦ）／ＶＰ１６ＡＤ−ＭｍＲＸＲＥ：
トウヒシントメハマキのＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ ＥｃＲ由来の野生型Ｄ、Ｅ、およびＦドメイン（「ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ」；配列番号１）を、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（「Ｇａｌ４ＤＢＤ１−１４７」；配列番号２のヌクレオチド３１〜４７１）に融合し、ｐＭベクターのＳＶ４０ｅプロモーター（ＰＴ３１１９−５、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）の制御下に置いた。Ｍｕｓ ＭｕｓｃｕｌｕｓＲＸＲ由来のＤおよびＥドメイン（「ＭｍＲＸＲ−ＤＥ」；配列番号１０）を、ＶＰ１６由来のトランス活性化ドメイン（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号５）に融合し、ｐＶＰ１６ベクター（ＰＴ３１２７−５，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＳＶ４０ｅプロモーターの制御下に置いた。
安定な細胞株
ＣＨＯ細胞を、ＳＶ４０ｅプロモーターによって制御されたＧＡＬ４ＤＢＤ−ＣｆＥｃＲ（ＤＥＦ）およびＶＰ１６ＡＤ−ＭｍＲＸＲＥについての転写カセットで一時的にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞を、ハイグロマイシンによって選択した。それぞれ単離したＣＨＯ細胞クローンを、ＧＡＬ４ＲＥ−ルシフェラーゼレポーター（ｐＦＲ Ｌｕｃ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で一時的にトランスフェクトした。ゼオシンを使用して、１３Ｂ３クローンを選択した。
リガンドでの処理
細胞をトリプシン処理し、２．５×１０４細胞ｍＬに希釈した。１００μＬの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに置き、５％ＣＯ２下にて３７℃で２４時間インキュベートした。ＤＭＳＯ中でリガンドストック溶液を調製し、全処理のために３００倍に希釈した。用量応答試験は、３３μＭから０．０１μＭまでの範囲の８つの濃度からなる。
レポーター遺伝子アッセイ
ＰｒｏｍｅｇａのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（Ｅ２６５０）を使用して、細胞処理から４８時間後にルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を測定した。Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸマイクロタイタープレート照度計を使用して、室温で発光を検出した。
ＡＡ３Ｔ３Ｖ１アッセイ
遺伝子発現カセット
Ｇａｌ４ＤＢＤ／ＡａＥｃＲ（ＤＥＦ）：
蚊Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ ＥｃＲ由来の野生型Ｄ、Ｅ、およびＦドメイン（「ＡａＥｃＲ−ＤＥＦ」；配列番号１１）を、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号２のヌクレオチド３１〜４７１）に融合し、長ＣＭＶプロモーター（配列番号１２）の制御下に置いた。マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＲＸＲ由来のＥドメイン（「βＲＸＲ−Ｅ」；配列番号１３）を、ＶＰ１６からの活性化ドメイン（配列番号５）のカルボキシル末端に融合し、ＳＶ４０プロモーター（配列番号１４）の制御下に置いた。
細胞株およびリガンドでの処理
３Ｔ３細胞をトリプシン処理し、２．５×１０３細胞／ウェルを９６ウェルプレートに入れた。５％ＣＯ２下にて３７℃で２４時間のインキュベーション後、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、Ｇａｌ４ＤＢＤ／ＡａＥｃＲ（ＤＥＦ）遺伝子発現カセットおよび５×ＧＡＬ４応答エレメントおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミド（ｐＦＲＬｕｃ）を含む無血清培地で細胞をトランスフェクトした。３７℃で４時間のトランスフェクション後、細胞をリガンドを含む血清培地で処理した。ＤＭＳＯ中にリガンドストック溶液を調製し、全処理のために３００倍に希釈した。３３μＭで単回用量試験を行った。用量応答試験は、３３μＭから０．０１μＭまでの範囲の８つの濃度からなる。
レポーター遺伝子アッセイ
ＰｒｏｍｅｇａのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ系（Ｅ２６５０）を使用して、細胞処理から４８時間後にルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を測定した。Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸマイクロタイタープレート照度計を使用して、室温で発光を検出した。
アッセイの結果は表４および５に示した。リガンド処理された細胞中の相対光単位（ＲＬＵ）をＤＭＳＯ処理細胞中のＲＬＵで割ることによって、単回用量試験から誘導倍率を計算した。３パラメーターのロジスティックモデルを使用して、用量応答データからＥＣ５０を計算した。任意の濃度で認められたＧＳ−（商標）−Ｅリガンド（３，５−ジメチル安息香酸Ｎ−ｔｅｒｔ−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）の最大誘導倍率に対する、任意の濃度で認められた試験リガンド（本発明の実施形態）の最大誘導倍率として相対最大ＦＩを決定した。
Figure 2010187690
Figure 2010187690
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Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
Figure 2010187690
さらに、当業者であれば、グループＨおよびグループＢ核受容体に基づく遺伝子発現系を使用して本明細書に開示したリガンドが、上記に記載した様々な細胞タイプにおける遺伝子発現を調節するためにも機能することを予測できよう。

Claims (1)

  1. 宿主細胞中での標的遺伝子の発現を調節する方法であって、宿主細胞は、
    （ｉｖ）トランス活性化ドメイン；
    （ｖ）ＤＮＡ結合ドメイン、および
    （ｖｉ）グループＨ核受容体リガンド結合ドメイン；
    を含む第１ポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１遺伝子発現カセット、
    （ｉｖ）前記ＤＮＡ結合ドメインに結合できる応答エレメント；
    （ｖ）前記トランス活性化ドメインにより活性化されるプロモーター；および
    （ｖｉ）前記標的遺伝子；
    を含む第２遺伝子発現カセット
    を含み、
    前記宿主細胞と下記の化合物からなる群から選択される化合物を接触させることを含む方法：
    Figure 2010187690
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