JP2010150291A - Ｋｉｍ−１の分断を阻害するための分子および方法 - Google Patents

Ｋｉｍ−１の分断を阻害するための分子および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】損傷または罹患した腎臓細胞において発現されるポリペプチドに結合する抗体、ならびにそのような抗体の産生および使用のための方法を提供する。
【解決手段】本発明は、損傷または罹患した腎臓細胞において発現されるポリペプチドに結合する抗体、ならびにそのような抗体の産生および使用のための方法に関する。ＫＩＭ−１（腎臓損傷分子−１）発現細胞からの可溶性ＫＩＭ−１ポリペプチドのタンパク質分解性放出を阻害する抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドが開示される。ＫＩＭ−１ポリペプチドの分断を阻害するために、この抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドを使用する方法もまた、開示される。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、損傷または罹患した腎臓細胞において発現されるポリペプチドに結合する抗体、ならびにそのような抗体の産生および使用のための方法に関する。
（発明の背景）
腎臓損傷分子−１（「ＫＩＭ−１」）遺伝子は、その発現が、損傷していないラット腎臓細胞における遺伝子発現と比較して虚血後のラット腎臓細胞においてアップレギュレートされる遺伝子として特定されている。このＫＩＭ−１遺伝子は、Ｉ型細胞膜糖タンパク質をコードする。この遺伝子の２つの形態が、ヒトにおいて記載されている。第一の形態は、ＫＩＭ−１（ａ）と名付けられており、そしてこれは３３４アミノ酸長である。第二の形態は、ＫＩＭ−１（ｂ）と名付けられており、そしてこれは３５９アミノ酸長である。これら２つのヒトホモログは、それらのアミノ末端の３２３アミノ酸配列を通して同一であるが、これらのカルボキシル末端アミノ酸における配列が異なる。ＫＩＭ−１遺伝子は、損傷した領域における脱分化した近位尿細管上皮（ｔｕｂｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）細胞において発現される。高レベルの発現が、髄質外層の外側細片における近位尿細管のＳ３セグメントにおいて観察される。この領域は、虚血または毒素の結果として非常に損傷されやすい。
ＫＩＭ−１タンパク質のアミノ鎖末端領域は、ＫＩＭ−１タンパク質の細胞外部分を含む。この領域は、ムチン様Ｏ−グリコシル化タンパク質の特徴を有する６つのシステイン免疫グロブリン様ドメインおよび１つのＴ／ＳＰリッチドメインを含む。免疫グロブリン様ドメインは、（特に、これらが細胞−細胞の相互作用および細胞−細胞外マトリクスの相互作用について応答性である細胞表面での）タンパク質−タンパク質相互作用の媒介において広範に関連する。
本発明は、ヒトＫＩＭ−１細胞外ドメインに対して惹起されたモノクローナル抗体が、可溶性ＫＩＭ−１ポリペプチドの、膜結合形態のＫＩＭ−１タンパク質からのタンパク質分解性放出（分断（ｓｈｅｄｄｉｎｇ））を阻害し得るという発見に一部基づく。
一般的に、本発明は、可溶性ＫＩＭ−１ポリペプチドの、ＫＩＭ−１を発現する細胞からのタンパク質分解性放出を阻害する抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドの特徴とする。この抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。この抗体は、ヒト化モノクローナル抗体または完全なヒトモノクローナル抗体であり得る。この抗体は、例えば、ＩｇＧポリペプチドを含み得る。
この抗体は、全長ＫＩＭ−１ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、この抗体は、ＫＩＭ−１ポリペプチドの細胞外ドメインにおけるアミノ酸配列ＳＳＤＧＬＷＮＮＮＱＴＱＬＦＬＥＨＳ（配列番号１）内に位置するエピトープに結合する。
また、検出可能な標識に連結された、タンパク質分解を阻害するＫＩＭ−１抗体、抗体誘導体または抗原結合ポリペプチドを含む結合体も、本発明により提供される。検出可能な標識は、例えば、放射標識または蛍光標識であり得る。
本発明はまた、ＫＩＭ−１タンパク質の分解を阻害する抗体、抗体誘導体、または抗体結合ポリペプチドおよび毒素部分を含む結合体または融合ポリペプチドを含む。
また、登録番号ＰＴＡ−３３５０の下でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体と同じエピトープ特異性を有する抗体も、本発明の範囲内である。
本発明はさらに、登録番号ＰＴＡ−３３５０の下でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体の結合をクロスブロック（ｃｒｏｓｓｂｌｏｃｋ）する抗体も、提供する。いくつかの実施形態において、この抗体は、登録番号ＰＴＡ−３３５０の下でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマにより産生される。また、このハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体をコードする核酸も、本発明の特徴である。
本発明はまた、登録番号ＰＴＡ−３３５０の下でＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマも特徴とする。
本発明は、本明細書中に記載されるＫＩＭ−１タンパク質分解を阻害する抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドと薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物を特徴とする。
本発明はまた、可溶性形態のＫＩＭ−１ポリペプチドの、細胞からの放出を阻害する方法も含む。この方法は、ＫＩＭ−１細胞表面ポリペプチドを発現する細胞と、ＫＩＭ−１タンパク質分解を阻害する抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドの有効量とを接触させる工程を包含する。この細胞は、例えば、腎臓細胞であり得る。いくつかの実施形態において、この腎臓細胞は、腎臓癌細胞である。
この細胞は、インビトロまたはインビボで提供され得る。好ましくは、抗体の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの間であり、より好ましくは、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの間であり、そしてなおより好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの間である。細胞がインビボで提供される場合、有効量の抗体が、１〜６時間の注入期間の間、被験体への静脈注入により投与され得る。いくつかの実施形態において、可溶性形態のＫＩＭ−１ポリペプチドは、ポリペプチド配列ＶＫＶＧＧＥＡＧＰ（配列番号２）を含む。実施例３からのデータは、膜貫通ドメインの近位の部位でタンパク質分解性切断によって細胞外環境へと放出された可溶性形態のＫＩＭ−１が、配列番号２により与えられるアミノ酸配列を含むことを明らかにした。
また、ＫＩＭ−１ポリペプチドフラグメントを含むＫＩＭ−１ポリペプチドを発現する細胞と、有効量のＫＩＭ−１タンパク質の分解を阻害する抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドとを接触させることにより、このフラグメントのタンパク質分解性分断を阻害する方法も、本発明により提供される。
本発明はまた、腎臓の疾患または損傷を処置または予防する方法を含む。この方法は、ＫＩＭ−１タンパク質分解を阻害する抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドを、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）に投与する工程を包含する。処置され得る腎臓の疾患の例は、腎臓癌（例えば、腎臓癌腫）である。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する））抗原結合部位を含む分子）をいう。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に使用される場合、用語「誘導体」とは、通常はその分子の一部でないか、または通常その分子の一部である部分より少ない部分を含むかのいずれかの追加の化学部分を含む分子をいう。ある部分の追加または除去は、その分子の可溶性、吸収、もしくは生物学的半減期を改善し得るか、またはその分子の毒性を減少させ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「抗原結合ポリペプチド」とは、その抗体の抗原結合特性を保持する抗体フラグメント、改変体、アナログ、または化学誘導体をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）とは、特有の軽鎖遺伝子産物および特有の重鎖遺伝子産物からなる、１つの分子種の抗体分子のみを含む抗体分子の集団をいう。詳細には、このモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、その集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特有の結合親和性により特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「ＫＩＭ−１タンパク質分解を阻害する抗体」とは、可溶性ＫＩＭ−１ポリペプチドのタンパク質分解性放出を阻害する抗体をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「クロスブロッキング抗体」とは、この抗体の非存在下でエピトープに抗ＫＩＭ−１抗体が結合する量に対して、ＫＩＭ−１ポリペプチド上のエピトープへの抗ＫＩＭ−１抗体が結合する量を低下させる抗体をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「結合体」とは、第二の部分に共有結合された抗体をいう。第二の抗体は、例えば、標識であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「標識」とは、検出可能な分子の部分をいう。標識は、例えば、放射性同位体、酵素、蛍光試薬、または色素であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「融合ポリペプチド」とは、非抗ＫＩＭ−１抗体分子に作動可能に連結された抗ＫＩＭ−１抗体分子をいう。
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および専門用語は、本発明の属する分野における当業者により一般的に理解される用語と同じ意味を有すると考えられる。本明細書中に記載される方法および物質に類似するかまたは等価である方法および物質が本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および物質が以下に記載される。全ての刊行物、特許出願、特許、および本明細書中で言及される他の参考文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。矛盾する場合、定義を含め、本明細書が支配する。さらに、物質、方法および実施例は、例示のみであり、限定することを意図しない。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＫＩＭ−１発現細胞由来の可溶性ＫＩＭ−１ポリペプチドのタンパク質分解性放出を阻害する、抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチド。
（項目２）
モノクローナル抗体である、項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチド。
（項目３）
全長ＫＩＭ−１ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する、項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチド。
（項目４）
アミノ酸配列ＳＳＤＧＬＷＮＮＮＱＴＱＬＦＬＥＨＳ（配列番号１）内に位置するエピトープに結合する、項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチド。
（項目５）
受託番号ＰＴＡ−３３５０の下でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成される抗体と同じエピトープ特異性を有する、抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチド。
（項目６）
受託番号ＰＴＡ−３３５０の下でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成される抗体の結合を交差ブロックする、抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチド。
（項目７）
ヒト化モノクローナル抗体である、項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチド。
（項目８）
完全ヒト抗体である、項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチド。
（項目９）
検出可能な標識に連結されている、項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドを含む、結合体。
（項目１０）
項目９に記載の結合体であって、上記検出可能な標識は、放射性標識または蛍光標識である、結合体。
（項目１１）
項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドおよび毒素部分を含む、結合体または融合ポリペプチド。
（項目１２）
ＩｇＧポリペプチドを含む、項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチド。
（項目１３）
受託番号ＰＴＡ−３３５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成された抗体。
（項目１４）
受託番号ＰＴＡ−３３５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマＡＢＥ３。
（項目１５）
項目１４に記載のハイブリドーマにより生成されるモノクローナル抗体をコードする核酸。
（項目１６）
項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目１７）
細胞からの可溶性形態のＫＩＭ−１ポリペプチドの放出を阻害する方法であって、該方法は、ＫＩＭ−１細胞表面ポリペプチドを発現する細胞と、有効量の項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
（項目１８）
項目１７に記載の方法であって、上記細胞は腎細胞である、方法。
（項目１９）
項目１８に記載の方法であって、上記腎細胞は、腎臓癌細胞である、方法。
（項目２０）
項目１７に記載の方法であって、上記細胞は、インビトロの細胞である、方法。
（項目２１）
項目１７に記載の方法であって、上記細胞は、インビボの細胞である、方法。
（項目２２）
項目２１に記載の方法であって、上記有効量は、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇである、方法。
（項目２３）
項目２２に記載の方法であって、上記有効量は、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇである、方法。
（項目２４）
項目２２に記載の方法であって、上記有効量は、１〜６時間の注入期間の間に静脈内注入により投与される、方法。
（項目２５）
項目１７に記載の方法であって、上記可溶性形態のＫＩＭ−１ポリペプチドは、ＶＫＶＧＧＥＡＧＰ（配列番号２）からなるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目２６）
ＫＩＭ−１ポリペプチドのタンパク質分解を阻害する方法であって、該方法は、ＫＩＭ−１ポリペプチドを発現する細胞と、有効量の項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
（項目２７）
腎臓疾患または腎臓傷害を処置または予防する方法であって、該方法は、その必要のある哺乳動物に、項目１に記載の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
（項目２８）
項目２７に記載の方法であって、上記腎臓疾患または腎臓傷害は、腎臓癌である、方法。
（項目２９）
項目２８に記載の方法であって、上記腎臓癌は、腎臓癌腫である、方法。
（項目３０）
項目２８に記載の方法であって、上記哺乳動物は、ヒトである、方法。
（項目３１）
ＫＩＭ−ｌ発現細胞からの可溶性ＫＩＭ−１ポリペプチドのタンパク質分解性放出を阻害する、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体誘導体。
（項目３２）
細胞からの可溶性形態のＫＩＭ−１ポリペプチドの放出を阻害する方法であって、該方法は、ＫＩＭ−１細胞表面ポリペプチドを発現する細胞と、有効量の項目３１に記載のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体誘導体とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目３３）
ＫＩＭ−１ポリペプチドのタンパク質分解を阻害する方法であって、該方法は、ＫＩＭ−１ポリペプチドを発現する細胞と、有効量の項目３１に記載のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体誘導体とを接触させる工程を包含する、方法。
（項目３４）
腎臓疾患または腎臓傷害を処置または予防する方法であって、該方法は、その必要のある哺乳動物に、項目３１に記載のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体誘導体を投与する工程を包含する、方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲により明らかになる。
図１Ａは、ヒトＫＩＭ−１ムチンドメインのポリペプチド配列（配列番号６）およびモノクローナル抗体ＡＣＡ１２、モノクローナル抗体ＡＫＧ７およびモノクローナル抗体ＡＢＥ３の結合エピトープをマッピングするために用いられる対応する１８マーのオーバーラッピング合成ペプチドを示す概略的例示である。 図１Ｂは、種々の抗体濃度での、ペプチド４３〜５０へのモノクローナル抗体ＡＢＥ、モノクローナル抗体ＡＫＧ７、およびモノクローナル抗体ＡＣＡ１２の結合を示すグラフのセットである。 図２Ａ〜図２Ｃは、ＡＢＥ３と反応させた細胞抽出物のウェスタンブロット分析図（図２Ａ）、ヒトＫＩＭ−１（ｂ）Ｃ末端に対するウサギポリクローナル抗体と反応させた細胞抽出物のウェスタンブロット分析図（図２Ｂ）、およびモノクローナル抗体ＡＫＧ７と反応させた馴化培地のウェスタンブロット分析図（図２Ｃ）である。 図３Ａ〜図３Ｃは、ＡＫＧ７と反応させたＣＯＳ−７細胞抽出物または馴化培地のウェスタンブロット分析図（図３Ａ）、ＡＢＥ３と反応させたＣＯＳ−７細胞抽出物または馴化培地のウェスタンブロット分析図（図３Ｂ）、またはヒトＫＩＭ−１（ｂ）Ｃ末端に対して惹起されたウサギポリクローナル抗体と反応させたＣＯＳ−７細胞抽出物または馴化培地のウェスタンブロット分析図（図３Ｃ）である。 図４は、ＫＩＭ−１（ｂ）を発現するＣＯＳ−７細胞の、種々の濃度のＡＢＥ３またはコントロールマウスＩｇＧの存在下で増殖させた馴化培地中の可溶性ＫＩＭ−１の濃度を示すヒストグラムである。 図５は、７６９−Ｐ細胞の、種々の濃度のＢＢ−９４またはＧＭ６００１ ＭＭＰインヒビターの存在下で増殖させた馴化培地中の可溶性ＫＩＭ−１の濃度を示すグラフである。 図６Ａは、ヒトＫＩＭ−１（ａ）（配列番号７）およびヒトＨＡＶｃｒ−１またはＫＩＭ−１（ｂ）（配列番号８）の配列を示す。２つのポリペプチドに共通する配列に対応する残基３２３までの単鎖配列が表される。下線部は、推定の単鎖および膜貫通ドメインである。影付き部は、４つの推定Ｎ−グリコシル化モチーフである。イタリック体は、ＫＩＭ−１（ｂ）のＣ末端に対する抗体を惹起するために用いられる合成ペプチドの配列である。 図６Ｂは、ＫＩＭ−１（ｂ）タンパク質の概略図である。灰色の欄は、シグナル配列および膜貫通ドメインを表す。Ｉｇ様ドメイン中のシステイン残基に印（Ｃ）が付けられている。４つの三角は、推定Ｎ−グリカンを表す。ＴＳＰリッチドメイン領域は、ムチン様ドメインを図式化するために濃くなっている。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＫＩＭ−１ポリペプチドに特異的に結合し、そして可溶性形態のＫＩＭ−１がタンパク質分解的にＫＩＭ−１発現細胞から放出されることを阻害する、抗体を特徴とする。
ＫＩＭ−１は、可溶性（短縮型）形態でもまた存在する、多くの膜タンパク質の１つである。これらの可溶性形態は、選択的スプライシングから生じ得るが、これらは、よりしばしば、膜形態のタンパク質分解から生じる。この切断は、膜貫通ドメインの近くで生じ、生理学的に活性なタンパク質の放出を生じる。
本明細書中に記載される抗体は、ＫＩＭ−１ポリペプチドを発現する細胞（例えば、腎細胞）を検出するために使用され得る。ＫＩＭ−１ポリペプチドは、虚血後の腎細胞または疾患腎細胞において高レベルで発現されるので、本明細書中で開示された抗体は、被験体において、損傷腎細胞または疾患腎細胞を検出するために有用である。この抗体はまた、ＫＩＭ−１ポリペプチドのタンパク質分解による切断を阻害し、それによって、可溶性形態のＫＩＭ−１ポリペプチドによって媒介される機能またはプロセスを阻害するために使用され得る。この抗体はまた、被験体における腎疾患または腎損傷を処置または予防するために、被験体に投与され得る。
（可溶性ＫＩＭ−１ポリペプチドのタンパク質分解による放出を阻害する抗ＫＩＭ−１抗体）
タンパク質分解阻害性ＫＩＭ−１ポリペプチドを調製するために、ＫＩＭ−１ポリペプチドの細胞外ドメインを含む免疫原が使用される。細胞外ドメインは、ヒトＫＩＭ−１ポリペプチドのアミノ酸１〜２９０までにわたる。ヒトＫＩＭ−１ポリペプチドおよびラットＫＩＭ−１ポリペプチドのアミノ酸配列、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸は、１９９７年１１月２７日に公開されたＷＯ９７／４４４６０号およびＩｃｈｉｍｕｒａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４１３５−４２に提供される。
適切な抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｓｃ、Ｆｖ、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。一般的に、ヒトから得られた抗体分子は、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤの１つに分類され得、これらは、分子に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスは、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２など）もまた有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書中の抗体についての言及は、ヒト抗体種のこのような全てのクラス、サブクラスおよび型についての言及を含む。
ＫＩＭ−１ポリペプチドの細胞外ドメイン、またはその部分もしくはそのフラグメントは、抗原として作用し得、さらに、ポリクローナル抗体調製およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を使用して、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。好ましい抗ＫＩＭ−１抗体は、ＫＩＭ−１中のアミノ酸配列ＳＳＤＧＬＷＮＮＮＱＴＱＬＦＬＥＨＳ（配列番号１）内のエピトープか、そのアミノ酸配列と重複するエピトープか、またはそのアミノ酸配列に非常に近いエピトープに結合する。実施例２において得られた結果は、ＫＩＭ−１ポリペプチドに対する抗ＫＩＭ−１抗体ＡＢＥ３の結合エピトープが、配列番号１によって与えられるＫＩＭ−１ポリペプチドのアミノ酸配列の部分の周辺に存在することを示唆した。
当該分野で公知である種々の手順は、可溶性のＫＩＭ−１ポリペプチドをタンパク質分解によってＫＩＭ−１発現細胞から放出させることを阻害するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために使用され得る。例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参考のこと。これらの抗体のいくつかは、以下で考察される。ＫＩＭ−１ポリペプチドに対して惹起された抗体は、以下の実施例２に記載される方法を含む、当該分野で公知の方法を使用して、これらの結合エピトープを同定するために特徴付けられ得る。抗体は、以下の実施例４に記載される方法のような方法を使用して、可溶性形態のＫＩＭ−１のタンパク質分解による放出を阻害する抗体を同定するためにスクリーニングされ得る。
いくつかのタンパク質分解阻害抗体は、モノクローナル抗体ＡＢＥ３を産生するハイブリドーマによって産生される抗体と同一のエピトープ特異性を有する。モノクローナル抗体ＡＢＥ３のＫＩＭ−１ポリペプチド上に存在するエピトープに対する結合を交差ブロック（ｃｒｏｓｓｂｌｏｃｋ）する抗体もまた、企図される。交差ブロック抗体は、ＫＩＭ−１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体ＡＢＥ３の結合を、試験抗体の存在下と非存在下とで比較することによって同定され得る。試験抗体の非存在下でのＡＢＥ３モノクローナル抗体の結合と比べて減少している、試験抗体の存在下でのＡＢＥ３モノクローナル抗体の結合は、その試験抗体が交差ブロック抗体であることを示す。
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の産生のために、任意の適切な動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）は、ＫＩＭ−１エクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）を含むポリペプチドの１回以上の注射によって免疫され得る。このポリペプチドは、例えば、天然に存在するＫＩＭ−１、エクトドメインを表す化学的に合成されたポリペプチド、または組換え発現された融合タンパク質であり得る。融合部分または化学的に結合された部分は、免疫された哺乳動物において免疫原性であることが既知である第２のタンパク質であり得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるがこれらに限定されない。
調製物は、さらにアジュバントを含み得る。免疫学的応答を増加するために使用される種々のアジュバントとしては、フロイントアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノール、など）ヒトにおいて有用なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐａｒｖｕｍ、または類似する免疫刺激剤）が挙げられるがこれらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））が挙げられる。
免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液）から単離され得、さらに周知技術（例えば、免疫血清のＩｇＧ画分を主として提供する、プロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィー）によって精製され得る。その後、または代替的に、その免疫グロブリンの標的であると考えられる特定の抗原またはそのエピトープが、カラム上に固定され、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎによって考察される。Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（２０００）Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １４：２５−２８。
（モノクローナル抗体およびハイブリドーマ）
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって記載される方法のような、ハイブリドーマ法を使用して調製され得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、代表的に免疫剤で免疫され、この免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘発する。
免疫剤は代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質を含む。一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合には、末梢血リンパ球が使用されるか、または非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合には、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）５９頁〜１０３頁。不死化細胞株は、通常、トランスフォームされた哺乳動物細胞（特に、齧歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞）である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が、使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む、適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損する場合、ハイブリドーマに対する培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含有し、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する。
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞株である。より好ましい不死化細胞株は、マウス骨髄腫株であり、これらは、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得られ得る。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）５１頁〜６３頁）。
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対して指向されるモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １０７：２２０のスキャッチャード分析によって決定され得る。好ましくは、標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体が、単離される。
所望されるハイブリドーマ細胞が同定された後、このクローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ得、標準的な方法によって増殖され得る。この目的のために適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中において腹水として、インビボで増殖され得る。
モノクローナル抗体サブクローンＡＢＥ３．１６を産生するハイブリドーマは、２００１年５月２日に米国メリーランド州２０８５２ロックビル、パークローン ドライブ１２３０１のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、受託番号ＰＴＡ−３３５０を割り当てられた。ＡＢＥ３．１６は、ＡＢＥ３のサブクローンである。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地または腹水から、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど）によって単離または精製され得る。
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される）によって作製され得る。目的のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され得、そして従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する免疫グロブリン可変領域遺伝子のクローニングは、確立された技術である。例えば、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２０６−２１１を参照のこと。一旦、単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され、次いで、この発現ベクターは、宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質をさもなくば産生しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成が得られる。
ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列に代えて重鎖ヒト定常ドメインおよび軽鎖ヒト定常ドメインについてのコード配列で置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２−１３）、または、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全部または一部分と免疫グロブリンコード配列を共有結合することによって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに代わって置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変領域について置換され得て、キメラ二価抗体を作製し得る。
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対して指向される抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに包含し得る。これらの抗体は、投与される免疫グロブリンに対するヒトによる強力な免疫応答を生じることなく、ヒトへの投与について適切である。抗体のヒト化形態は、ヒト免疫グロブリンの配列を原則として含む、免疫グロブリンの鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）であり、かつ、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む。ヒト化は、げっ歯類のＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列について置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよびその共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）に従い実施され得る（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと）。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応するヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても移植されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つでありそして代表的には２つである可変領域を実質的に含み、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応するか、または実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のヒトのフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体はまた、最適には、少なくとも、一部分の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）を含み、代表的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域を含む（Ｊｏｎｅｓら，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８ ；ａｎｄ Ｐｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６）。
（ヒト抗体）
完全ヒト抗体とは、軽鎖および重鎖の両方の本質的に配列全体（ＣＤＲを含む）がヒト遺伝子から得られる抗体分子をいう。このような抗体は、本明細書中で「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれている。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体を産生するための、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら．１９８５ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）によって調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを使用すること（Ｃｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）によってか、またはＢ細胞をＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓをインビトロで使用して形質転換すること（Ｃｏｌｅら．（１９８５）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）によって産生され得る。
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリーを含む）を使用して産生され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニックマウス（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化され得る）に導入することによって作成され得る。チャレンジの際に、全ての点（遺伝子再配置、アセンブリおよび抗体レパートリー）でヒトにおいて見られる抗体産生と非常に似ているヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、ならびにＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０，７７９７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ ３６８，８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，（ Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４，８２６（１９９６））；およびＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３
６５−９３（１９９５））において記載されている。
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答してその動物の内因性抗体よりも完全ヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用してさらに産生され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと。非ヒト宿主において免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性遺伝子が可能となり、そしてヒト免疫グロブリン重鎖およびヒト免疫グロブリン軽鎖をコードする活性な遺伝子座が、宿主のゲノムに挿入される。これらのヒト遺伝子は、例えば、必須のヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して組み込まれる。次いで、全ての所望される改変を提供する動物は、改変の完全でない相補性を含む中間体トランスジェニック動物を交配することによってその後代として得られる。このような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、そして、ＰＣＴ公開ＷＯ ９６／３３７３５および同ＷＯ ９６／３４０９６に記載されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。これらの抗体は、目的の免疫原での免疫後の動物から直接的に得られるか（例えば、ポリクローナル抗体の調製物）、または、動物由来の不死化したＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から得られる。さらに、ヒトの可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回収され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るためにさらに改変され得る。
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主を産生する方法の例（マウスが例示される）は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。これは、胚性幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座からＪセグメント遺伝子を欠失させ、この遺伝子座の再配置を妨げ、かつ再配置された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の産生を妨げる工程を包含する方法によって得られ、この欠失は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的ベクター；ならびに体細胞および生殖細胞がこれらの選択マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から産生することによって与えられる。
本発明の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生するために有用な方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示されている。この方法は、培養物中の１つの哺乳動物宿主細胞に、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する工程、別の哺乳動物宿主細胞に軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する工程、およびこれらの２つの細胞を融合してハイブリッド細胞を形成する工程を包含する。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。さらなる有用な手順（すなわち、免疫原についての臨床的に関連するエピトープを同定する方法および抗親和性でこの関連するエピトープに免疫特異的に結合する抗体を分泌するための相関する方法が、ＰＣＴ公開ＷＯ ９９／５３０４９に記載されている。
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のための技術が適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のための方法が、タンパク質またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、またはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で効率的な同定を可能にするために適用され得る（例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４６：１２７５−１２８１）。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、以下を含むがこれらに限定されない当該分野で公知の技術によって産生され得る：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することのよって生成されるＦａｂ’フラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することによって生成されるＦａｂフラグメントならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
（免疫結合体）
本明細書中に記載の抗体は、薬剤（例えば、化学療法剤、造影剤、毒素（例えば、細菌起源、真菌起源、植物起源、または動物起源の酵素活性毒素あるいはそれらのフラグメント）あるいは放射性同位体（すなわち、放射性結合体）に対して結合体化され得る。
使用され得る酵素活性毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリン（ａｂｒｉｎ）Ａ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファサルシン（ｓａｒｃｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ナデシコ（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モルモディカカランチアインヒビター（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、カルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、コロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリアオフィシナリスインヒビター（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリク
トシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が挙げられる。種々の放射性核が、放射性核結合体化抗体の産生に利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
抗体および細胞傷害性薬剤の結合体は、例えば、以下の種々の二機能性タンパク質結合薬剤を使用して作製され得る：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルイレン２，６−ジイソシアネート（ｔｏｌｙｅｎｅ ２，６−ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ））、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）。例えば、リシン免疫毒素（ｒｉｃｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）は、Ｖｉｔｅｔｔａら，（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８に記載されるように調製され得る。１４Ｃ標識１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸 （ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射性核の結合体化のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
本明細書中に記載の抗体はまた、検出可能な信号を生じる造影剤で標識し得る。造影剤およびこのような試薬で抗体を標識するための手順は周知である（例えば、ＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ，Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８３）；Ｃｏｌｃｈｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１：８０２−１６を参照のこと）。これらの標識された抗体は、当該分野で認識されている技術（例えば、放射性核スキャニング（例えば、Ｂｒａｄｗｅｌｌら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編）ｐｐ．６５−８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと）を含む）を使用して検出され得る。
（薬学的組成物）
本明細書に記載の抗体は、腎細胞を画像化するかまたは腎細胞関連障害を処置するために哺乳動物被験体（例えば、ヒト）に投与され得る。これらの抗体は、単独または混合物として使用され得る。例えば、これらの抗体は、薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア（例えば、生理食塩水）の存在下で投与され得る。これらの賦形剤またはキャリアは、投与のモード（様式）および経路に基づいて選択され得る。適切な薬学的キャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）およびＵＳＰ／ＮＦ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）に記載されている。
薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例としては、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所的）投与、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、アセテート、シトレート、またはホスフェート）；および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような、酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数回用量バイアルの中に入れられ得る。
本発明の薬学的組成物は、「治療的有効量」または「予防的有効量」の本発明の抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドを含み得る。本明細書中で使用される場合、「治療的有効量」は、投薬量および必要とされる期間について、所望の治療結果を達成するために有効な量を意味する。抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドの治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発するその抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドの能力のような要因に従って、変動し得る。治療的有効量が投与される場合、その抗体、抗体誘導体、または抗原結合ポリペプチドのあらゆる毒性または有害な作用よりも、治療的に有益な効果が上回る。本明細書中で使用される場合、「予防的有効量」は、投薬量および必要とされる期間について、所望の予防結果を達成するために有効な量を意味する。予防的用量は、疾患の発症前に被験体に投与されるので、予防的有効量は代表的に、治療的有効量よりも少ない。
投薬レジメンは、最適の所望される応答（例えば、治療的応答または予防的応答）を与えるために調整され得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、単回のボーラスが投与される。他の実施形態では、数回に分けられた用量が、長期間にわたって投与される。用量は、状態の緊急度によって示されるように比例して減少または増加され得る。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を処方することが有益である。本明細書中で使用される場合、「投薬単位形態」は、処置される哺乳動物被験体のための単位投薬量として適切な物理的に別個の単位であって、ここで各々が、必要とされる薬学的キャリアと共に所望の治療効果を生ずるために算出された予め決定された量の活性成分を含む、単位を意味する。
本発明の抗体または抗体部分の治療的有効量または予防的有効量についての例示的な非制限的範囲は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１〜２０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投薬量の値は、処置される状態の型および重篤度に応じて変動し得る。任意の特定の被験体について、特定の投薬レジメンが、その個体の必要性、およびこの組成物を投与する人物またはこの組成物の投与を監督する人物の専門的判断に従って、長期間にわたり調整されるべきである。本明細書中に示される投薬量範囲が単なる例示であり、そして本願発明の範囲を制限することを意図されないことが理解されるべきである。
非経口的な注射可能な投与は、一般的に、皮下、筋内または静脈内での注射および注入のために使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、米国特許第３，７１０，７９５号（本明細書中で参考として援用される）に従う、一定レベルの投薬量が維持されることを保証する緩徐放出システムまたは持続放出システムの移植を使用する。
一般的に、適切な被験体は、ＫＩＭ−１抗体が投与され得る任意の哺乳動物である。処置のために特に意図される被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ジャービル、ラットおよびマウスが挙げられる。
有益に処置され得る腎臓の状態としては、ＫＩＭ−１細胞表面タンパク質を発現する細胞からの可溶性ＫＩＭ−１の放出阻害が、その状態を改善し得る状態が挙げられる。このような状態の例は、腎臓癌または腎臓損傷（腎臓癌（例えば、腎臓癌腫）を含む）である。他の状態としては、例えば、腎不全、慢性腎不全、急性腎炎、腎炎症候群、尿細管欠損、腎臓移植、毒性損傷、低酸素性損傷、および外傷が挙げられる。尿細管欠損は、腎多嚢胞病、腎髄質嚢胞病および髄質海綿腎のような、遺伝性または後天性のいずれかの性質のものが挙げられる。
（寄託）
モノクローナル抗体ＡＢＥ３．１６を産生するハイブリドーマを、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規約のもと、２００１年５月２日付けでアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））に寄託し、そして受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３５５０を有する。出願人らは、本明細書に基づいて発行される特許存続期間の満了日前に、請求があった場合に、万が一この寄託物の状態により寄託機関がサンプルを供給し得ない場合には、この寄託物を取り替える義務を負うことを了解する。出願人らはまた、この寄託物が公的に利用可能となる時点となる、このような特許の発行に関してＡＴＣＣに通知する義務を負うことを理解する。その時点の前に、この寄託物は、米国特許法施行規則第１．１４条および米国特許法第１１２条の条項のもとで、特許庁長官に利用可能となる。
本発明をさらに、以下の例示的な実施例により例示する。この実施例は、単なる例示のために提供され、そして本発明の範囲または概念を制限するものとして解釈されるべきではない。
（実施例１：抗ＫＩＭ−１モノクローナル抗体の生成）
モノクローナル抗体を、ヒトＫＩＭ−１ポリペプチドの細胞外ドメインに対して産生した。ヒトＫＩＭ−１の細胞外ドメイン（残基１〜２９０）を、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒンジＣＨ２＋ＣＨ３ドメイン）に結合し、そして哺乳動物発現プラスミドｐＥＡＧ３４７にクローン化した構築物（ＫＩＭ−１−Ｉｇ）を構築した。ヒトＫＩＭ−１（ｂ）全長ｃＤＮＡを、ヒト癌腫細胞株７６９−Ｐ由来のｍＲＮＡおよび公開されたＤＮＡ配列（Ｆｅｉｇｅｌｓｔｏｃｋら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６６２１−２８）に基づくプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって得た。
得られたｃＤＮＡの配列は、ヒトの腎臓および肝臓から得られたｃＤＮＡの配列と同一であった。ｐＥＡＧ３４７発現プラスミドは、構成的発現のためのタンデムプロモーター（ＳＶ４０初期／アデノウイルス主要後期）、および安定に発現する細胞株のメトトレキサート選択のためのＤＨＦＲ遺伝子を含む。融合タンパク質を発現するトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を選択し、懸濁液中に適合させ、そして発酵槽において増殖させた。
４匹のマウスに、ヒトＫＩＭ−１−Ｉｇで免疫した。ＫＩＭ−１に対する抗体力価の増加を、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を行うことによってモニターした。ＥＬＩＳＡを、９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｂ，Ｎｕｎｃ）において実施した。プレートを、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中にある１００μｌの抗原または捕捉抗体と共に４℃で一晩インキュベートすることによってコーティングした。次いで、潜在的な残りの吸着部位を、１％ＢＳＡを含む４００μｌのＰＢＳと共に室温で１時間インキュベートすることによって、ＢＳＡでブロックした。プレートを、各反応工程の後で、ＰＢＳＴにより４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体を、二次検出試薬として使用し、そして呈色反応を、テトラメチルベンジジンを用いて実施した。
ＫＩＭ−１に対して最高の血清学的力価を示すマウスを同定し、そしてＫＩＭ−１−Ｉｇでブーストした。次いで、マウスを屠殺し、そして１：６の比率の脾臓細胞：骨髄腫細胞で、そのマウスの脾臓細胞をＦＬ６５３骨髄腫細胞と融合した。細胞融合物を、１ウェルあたり１０５細胞の密度で、１ウェルあたり３．３×１０４細胞の密度で、または１ウェルあたり１．１×１０４細胞の密度で、選択培地中において９６ウェル組織培養プレートにプレーティングした。増殖についてポジティブなウェルを、ヒトＫＩＭ−１に対する抗体の発現について、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、そしてサブクローニングした。選択の終了時点で、最も強い結合を示す１０個のクローンが残り、そしてＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析によって特徴付けられた。この結果を、表１において下記に示す。
４つのハイブリドーマクローン（ＡＢＥ３、ＡＣＡ１２、ＡＫＧ７およびＡＲＤ５）を、マウスの腹膜腔において増殖させた。腹水を回収し、そして各抗体を、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用するクロマトグラフィーによって精製した。ビオチン化ＡＫＧ７を、アミノ反応性スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）の指向的結合により調製した。
（実施例２：抗ＫＩＭ−１モノクローナル抗体の結合エピトープの同定）
ハイブリドーマＡＢＥ３、ＡＣＡ１２、ＡＫＧ７およびＡＴＥ１１によって産生されるモノクローナル抗体は、ムチンドメインを欠くＫＩＭ−１融合タンパク質（ｈＫＩＭ−１（ｍｕｃｉｎ−ｍｉｎ）Ｉｇ）に結合できない。これらの結果は、これらの抗体の結合エピトープが少なくとも部分的にムチンドメインであること実証した。さらに、これらの４つの抗体は、ウェスタンブロットにおいて還元され、変性されたｈＫＩＭ−１−Ｉｇと反応することが観察された抗体のみである。この観察は、これらの抗体についてのエピトープが、タンパク質の一次構造におけるアミノ酸残基の単一ストレップに対応することを示した。
結合エピトープを、ＫＩＭ−１のムチンドメイン内に位置する残基２１０で始まり、そして細胞外ドメインの最終残基である残基２９０で終わる８つの重複合成１８マーペプチドへの抗体の結合を測定することで同定したる。結合研究に使用されたペプチドを、ＫＩＭ−１ポリペプチド配列に関すして図１Ａに示す。結合研究の結果を、モノクローナル抗体ＡＣＡ１２、ＡＫＧ７およびＡＢＥ３について図１Ｂに示す。ＡＫＧ７およびＡＣＡ１２の両方は、ペプチド４５および４６に結合するが、これらはそれぞれの結合親和性において異なった。これらの結果から、両方の抗体は、ＬＱＧＡＩＲＲＥＰ（配列番号３）（ペプチド４５および４６（図１Ａ）に共通する９残基配列である）を含む配列に結合することが結論付けられている。このペプチド配列は、Ｎ結合グリコシル化またはＯ結合グリコシル化の推定部位を欠損し、ＡＣＡ１２およびＡＫＧ７が、ＫＩＭ−１ポリペプチドのグリコシル化形態および非グリコシル化形態の両方を認識したことを示した。
モノクローナル抗体ＡＢＥ３は、ペプチド＃４９に結合するが、ペプチド＃４８または＃５０のいずれにも実質的に結合することを示さなかった。これらの観察は、ＡＢＥ３の結合エピトープがＤＧＬＷＮＮＮＱＴＱＬ（配列番号１）の周辺であることを示す。この配列は、最後のアスパラギン残基において潜在的なグリコシル化部位を示す。しかし、ＡＢＥ３は合成ペプチドおよび種々のＫＩＭ−１のグリコシル化形態に結合するので、ＡＢＥ３の結合は、主にペプチド部分に対してあると結論付けられた。
（実施例３：ＫＩＭ−１ポリペプチドの分断された（ｓｈｅｄ）形態の同定）
この実施例は、ＫＩＭ−１ポリペプチドの可溶性形態がＫＩＭ−１発現細胞から放出
されることを証明した。
３つの腎臓ヒト細胞株および１つの肝臓ヒト細胞株を、ＫＩＭ−１の発現についてウェスタンブロットで分析した。使用された細胞株は、２９３（アデノウイルスで形質転換された胚性腎細胞：ＣＲＬ−１５７３））、ＨＫ２（ＨＰＶ−１６で形質転換されたヒトの腎臓に近位の管状細胞；ＣＲＬ−２１９０）、７６９−Ｐ（ヒト腎細胞腺癌；ＣＲＬ−１９３３）およびＨｅｐＧ２（肝細胞癌；ＨＢ−８０６５）であった。細胞抽出物または馴化培地由来のタンパク質を、ウェスタンブロットによって分析しタンパク質のカルボキシ末端部位に対して惹起される、、そしてＡＢＥ３モノクローナル抗体、ＡＫＧ７モノクローナル抗体、またはＫＩＭ−１（ｂ）ウサギポリクローナル抗体でプローブした。ウサギポリクローナル抗体を、ヒトのＫＩＭ−１（ｂ）タンパク質のＣ末端で最後の１９残基および結合体化のためのさらなるシステイン残基に対応する、合成ペプチド（ＣＫＥＶＱＡＥＤＮＩＹＩＥＮＳＬＹＡＴＤ（配列番号４）；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に対して惹起した。このペプチドを、マレイミド活性化ＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合体化し、そしてこの結合体を使用して、ウサギに免疫した。抗血清を、様々な免疫化の後に回収した。
馴化培地および細胞を、約９０％の細胞コンフルエンシーで収集した。これらの細胞を、ＰＢＳでリンスし、そして５ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼインヒビター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍｉｎｉ ｔａｂｌｅｔ）のカクテルを含む氷冷ＰＢＳ中でゴム性ポリスマンですくい取った。これらの細胞を、ペレット化し、そしてプロテアーゼインヒビターを有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣＩ、ｐＨ ７．５、１％ ＮＰ−４０中に再懸濁することによって溶解した（細胞ペレット１ｍｇあたり２０μｌの溶解溶液）。氷上で５分後、この不溶性物質を、遠心分離（５分間、１６０００ｇ）によって回収し、上清を２倍の還元ローディング緩衝液と混合した。各馴化培地のアリコートをまた、同じ容量の２倍の還元ローディング緩衝液と混合した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析のために、タンパク質のサンプルを、還元ローディング緩衝液と混合し、５分間９５℃で温めた。次いで、還元しそして変性したタンパク質を、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。このタンパク質を、ニトロセルロースのシート上に移した。このブロットを５％ＰＢＳＴ中の脱脂粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）の溶液でブロックし、そしてマウスモノクローナル抗体のＡＫＧ７、ＡＢＥ３またはＡＣＡ１２（１μｇ／ｍｌで）を用いるか、またはＫＩＭ−１（ｂ）のＣ末端ペプチドに対して惹起されるウサギポリクローナル抗血清（１０００倍希釈）を用いて、同じ溶液中でプローブし、次いで、ヤギの抗マウス抗体またはヤギの抗ウサギ抗体のいずれかは、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した。工程の間の洗浄を、ＰＢＳＴで行った。反応性結合を、化学発光によって示した。
ＡＢＥ３（図２Ａ）を使用しての細胞抽出物のウェスタンブロット分析は、腎臓癌細胞株（レーン３）ならびに形質転換した腎近位管状細胞株ＨＫ２（レーン２）中の
ＫＩＭ−１の発現を示した；約１００ｋＤａでの１つの主要なバンドならびに約７０ｋＤａおよび５０ｋＤａでの他の２つのバンドを、検出した。このパターンは、ラットＫＩＭ−１タンパク質について以前に観察された発現パターンと類似し、このＫＩＭ−１タンパク質はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、３つの識別可能なバンドで出現した（Ｉｃｈｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４１３５−４２）。同じ３つのバンドをまた、ヒトのＫＩＭ１（ｂ）のＣ末端に対応する合成ペプチドに対して惹起されるポリクローナル抗血清で観察した（図２Ｂ）。
ＫＩＭ−１の発現は、形質転換された胚腎細胞株２９３または線癌細胞株ＨｅｐＧ２において検出され得なかった。ヒトＫＩＭ１ポリペプチドの予測された大きさは３６ｋＤａであるが、タンパク質が、Ｎグリコシル化のための４つの潜在的部位および複数のＯグリコシル化部位を示すので、タンパク質のバンドは、より高い見かけ上の分子量で検出されたことが予測される。
７６９−Ｐ細胞の細胞表面ビオチン化は、１００ｋＤａのＫＩＭ−１バンドが、実際の細胞表面タンパク質であったことを示した。他のバンドは、ゴルジ体を介して移行するＫＩＭ−１プロセッシング中間体におそらく対応する。
ＡＫＧ７モノクローナル抗体（図２Ｃ）を使用しての馴化培養培地のウェスタンブロット分析は、約９０ｋＤａで移動する可溶性ＫＩＭ−１タンパク質の存在を示した。９０ｋＤａのバンドをまた、ＡＣＡ１２モノクローナル抗体で検出したが、ＡＢＥ３モノクローナル抗体または抗ＫＩＭ−１（ｂ）Ｃ末端抗体では検出しなかった。約１４ｋＤａでのタンパク質のバンドをまた、抗ＫＩＭ−１（ｂ）Ｃ末端血清を用いて検出した。このバンドはＫＩＭ−１に無関係であり得るが、１４ｋＤａのバンドは、ＫＩＭ１（ｂ）の細胞表面切断のＣ末端産物を示す可能性もまだである。
１０ｋＤａのサイズの減少ならびにＡＢＥ３結合の欠損は、細胞環境へ可溶性形態を放出する細胞表面タンパク質分解性切断の結果であり得る。あるいは、この可溶性形態は、選択的スプライシング事象から生じ得、ここで、選択的なスプライシングの結果として生成されるタンパク質は、膜貫通ドメインおよび細胞ドメインを欠損していた。
９０ｋＤａの溶解性ヒトＫＩＭ−１形態がＫＩＭ−１ ｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じ得る可能性に焦点を当てるために、組換えヒトＫＩＭ−１を、ＫＩＭ−１ ｃＤＮＡ構築物から発現した（図３Ａ〜３Ｃ）。ＫＩＭ−１（ｂ） ｃＤＮＡを、哺乳動物細胞中で構成的な過剰発現のためのベクター（ｐＢＥＧ３４７）にクローニングした。得られたプラスミド（ｐｈＫＩＭｌ．２およびｐＥＡＧ３４７）を使用して、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。形質転換細胞を、コンフルエンシーに達するまで（トランスフェクションの後、約４日間）、増殖した。ＫＩＭ−１発現細胞の馴化培地のアリコートを、１日および２日後に取り出した。４日で、馴化培地を回収し、そしてこの細胞を以前の節に記載したように加工し、細胞抽出物を得た。このサンプルを、ＡＫＧ７（図３Ａ）、ＡＢＥ３（図３Ｂ）ｈＫＩＭ１（ｂ）のカルボキシ末端に対して惹起されるポリクローナル抗体（図３Ｃ）を用いて、ウェスタンブロットによって分析した。
腎細胞株由来のネイティブなヒトＫＩＭ−１を用いて観察されたパターンに類似して、組換えＫＩＭ−１（ｂ）は、タンパク質の種々の翻訳後の改変された形態に対応するいくつかのバンドに現われた。ＡＫＧ７を使用する細胞培養の上清の分析はまた、ＫＩＭ−１の可溶性形態が細胞培養培地中に放出され、そしてその細胞培養培地において蓄積されたことを明らかに示した。ネイティブな可溶性ＫＩＭ−１のような放出された組換えＫＩＭ
−１は、抗ｈＫＩＭ１（ｂ）のＣ末端抗体を用いて検出されなかった。これはまた、ＡＢＥ３でも検出されなかったが、かすかなバンドを、タンパク質の高い濃度で時々観察した。この観察は、切断の後、抗体のいくつかの弱い結合を可能にするエピトープの一部が、離れたことを示した。１４ｋＤａのバンドをまた、排他的な抗ｈＫＩＭ−１（ｂ）−Ｃ末端ポリクローナル抗体を用いて、細胞抽出物中で検出した。
一緒に、これらのデータは、可溶性ＫＩＭ−１が、膜貫通ドメインに近接する部位でのタンパク質分解性切断によって細胞外環境中へ放出しそしてＡＢＥ３結合エピトープで重複したことを示した。免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離された可溶性ＫＩＭ−１のエドマン分解によるＮ末端スプライシング分析は、実際のシグナル配列がＰＳＯＲＴ ＩＩプログラムを使用するｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅの方法によって決定された予測されたシグナル配列よりも４残基長いか、またはＮ末端がシグナルペプチドの除去の後、短縮されるかのいずれかを示す、配列ＳＶＫＶＧＧＥＡＧＰＸＶＸＬＸ（配列番号５）を同定した。
（実施例４：ＡＢＥ３モノクローナル抗体用いる分断（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）ＫＩＭ−１ポリペプチドの同定）
ＫＩＭ−１のタンパク質分解放出でのＡＢＥ３モノクローナル抗体の効果を試験するために、一過的にヒトＫＩＭ−１（ｂ）を発現するＣＯＳ−７細胞を、種々の濃度のＡＢＥ３またはネガティブコントロールとしてマウスＩｇＧの存在下で、２日間増殖した（図４）。
ヒト組換えＫＩＭ−１（ｂ）の一過性の発現に対して、ＣＯＳ−７細胞を、１０６細胞あたり１０μｇのプラスミドＤＮＡを用いてエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、プレーティングし、そして４ｍＭ グルタミンおよび１０％ ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中で増殖した。細胞を付着させるための４時間のインキュベーションの後、培地を、新しい培地を交換した。次いで、細胞コンフルエンシーは、約２０％であった。分断阻害研究について、トランスフェクトした細胞を、１２ウェルプレートのウェルにプレーティングし、そして、種々の濃度のＡＢＥ３またはネガティブコントロールとしてマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を追加した培地で増殖した。実験を、三通り行った。インキュベーションの２日後、馴化培地を、これらのウェルから回収し、遠心分離によって清澄化し、そして標準として精製したＫＩＭ−１−Ｉｇを使用するＥＬＩＳＡによって評価した。
この結果を、図４に示す。非特異的マウスＩｇＧの添加は、培地中の可溶性ＫＩＭ−１のレベルに影響しなかったが、ＡＢＥ３が培地中に存在する場合、これらは可溶性ＫＩＭ−１の実質的な増加であった。従って、ＡＢＥ３抗体と競合的に結合することによって、ＫＩＭ−１のタンパク質分解性放出を部分的に阻害することが可能である。これは、ＫＩＭ−１切断部位がＡＢＥ３の結合部位でまたは結合部位に密接して位置することを確認した。
可溶性ＫＩＭ−１の放出は、ＡＢＥ３の結合部位での非特異的プロテアーゼに対するＫＩＭ−１の高い感受性から生じ得ることが考えられ得る。しかし、Ｃ末端での６つのヒスチジン残基を有する細胞外ドメインの全体に対応する組換え可溶性ＫＩＭ−１のＣ末端の切断は観察されず、そして同じ培地中での全長のＫＩＭ−１として一過的に発現した。
（実施例５：メタロプロテイナーゼインヒビターを用いたＫＩＭ−１ポリペプチド分断の阻害）
メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはデスインテグリン（ｄｅｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）およびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）は、細胞表面タンパク質の特異的切断に関与している。２つのＭＭＰインヒビターのＫＩＭ−１ポリペプチドの切断に対する効果を、試験した。
ＢＢ−９４（ｂａｔｉｓｍａｔａｔ）およびＧＭ６００１（Ｉｌｏｍａｓｔａｔ）は、いくつかのマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を阻害する、２つの広いスペクトルのヒドロキサム酸ベースの亜鉛メタロプロテイナーゼインヒビターである（２０）。ＢＢ−９４はまた、ＴＡＣＥ（ＴＮＦα変換酵素）の強力なインヒビターである（１８）。細胞培養物におけるＫＩＭ−１の分断に対するこれら２つのインヒビターの活性を、試験した。
ＢＢ−９４およびＧＭ６００１のストック溶液を、ＢＢ−９４については７０ｍＭの濃度にて、およびＧＭ６００１については２．５ｍＭの濃度にて、ＤＭＳＯ中で維持した。化合物を、０．５μｍ〜３２μｍの範囲の濃度へ新たな培地中に直接希釈した。腎臓癌腫細胞７６９−Ｐを、ＲＰＭＩ培地（１０％ ウシ胎仔血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを補充した）中で、種々の濃度のＢＢ−９４およびＧＭ６００１の存在下で、２８時間にわたり増殖させた。２つの化合物に細胞毒性がないことを、細胞生存度を２８時間の培養期間の終わりに、ミトコンドリア色素ＭＴＴを用いてチェックすることにより確認した（１９）（２１）。２８時間の期間の間に細胞外環境へ放出される可溶性ＫＩＭ−１の量を、ＥＬＩＳＡにより測定した(図５）。
ＫＩＭ−１分断の完全な阻害は、３２μＭのいずれかのＭＭＰインヒビターの存在下で達成された。ＢＢ−９４は、ＧＭ６００１について、ＩＣ５０が約４μＭであったことと比較して、わずかにより有効であるようであった（約１μＭのＩＣ５０）。これらの結果により、ＫＩＭ−１の切断が、メタロプロテイナーゼ、おそらく、ＭＭＰファミリーのメンバーまたはＡＤＡＭファミリーのメンバーにより媒介されることが示された。
他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。

Claims (1)

  1. 明細書中に記載の発明。
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