JP2010107248A - ブロッティング装置及びブロッティング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 転写効率やブロッティング膜に転写された核酸又は蛋白質分子の抗体による染色性に関して濾紙を用いる場合とほとんど遜色がないばかりか、ゲルへの緩衝液の供給効率に優れ、繰り返し使用が可能な吸水性物質を用いるブロッティング装置及びブロッティング方法を提供する。
【解決手段】 電気泳動により分画された核酸又は蛋白質分子を含むゲルにブロッティング膜を重層する。ゲルとブロッティング膜とを吸水性物質により挟み、吸水性物質の吸水作用を利用して緩衝液を保持する。ゲルに荷電してそのゲル内の核酸又は蛋白質分子を電気泳動させる。吸水性物質として親水性の樹脂多孔質体を用いる。樹脂多孔質体が、ポリビニルホルマール樹脂又はポリウレタン樹脂であり、その平均気孔径が２０〜２００μｍ、その平均気孔率が８０〜９４％であることが望ましい。
【選択図】 図１

Description

本発明は、電気泳動によりゲル中に分画された核酸又は蛋白質分子を、ゲル中からゲル表面に密着させたブロッティング膜に移動させて転写させることに用いられるブロッティング装置に関する。また、本発明は、電気泳動によりゲル中に分画された核酸又は蛋白質分子を、ゲル中からゲル表面に密着させたブロッティング膜に移動させて転写させるブロッティング方法に関する。

ブロッティングは、生化学、分子生物学などの研究分野、ＤＮＡ組み換え技術を利用した各分野において必須の技法として汎用されている。ブロッティングでは、ＤＮＡを対象とするものがサザンブロッティング、ＲＮＡを対象とするものがノーザンブロッティング、蛋白質を対象するものがウェスタンブロッティングと称されている。

現在行われているブロッティングの方法はＳｏｕｔｈｅｒｎの報告した方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ９８；５０３，１９７５）に基づくものであり、その中でも、取り扱いやすさや分析時間を短縮するために最も広く用いられている方法は半乾式法（半乾式ブロッティング法）と呼ばれている。半乾式ブロッティング法は、ニトロセルロースなどのブロッティング膜（メンブレン）を、電気泳動によって分画させた核酸又は蛋白質分子を含むゲルに密着させ、その上下を５ｍｍ程度の層厚に積層した複数枚の濾紙で挟み、この濾紙に緩衝液（ブロッティング液）を吸収させてゲルに供給することにより、ゲル中の核酸や蛋白質分子をゲル中から溶出させてブロッティング膜に移動させて転写させる、というものである（たとえば、特許文献１、特許文献２参照）。このブロッティング方法では、上記濾紙が吸水性物質に相当していて、その濾紙の吸水作用を利用して緩衝液がゲルに供給される。

特許第３６８１１７９号公報 特開２００８−１１３５７６号公報

しかしながら、上記した汎用的な半乾式ブロッティング法では、吸水性物質としての濾紙を何枚も重ねて使用するために、操作が煩雑になるという問題や、濾紙の使用量がかなりの量にのぼってその費用を無視することができなくなるという問題がある。濾紙の費用が嵩むという問題は、濾紙を再利用することができず、その都度廃棄せざるを得ないことに鑑みると上記した汎用的な半乾式ブロッティング法において回避することのできないコスト面での重大な問題点であると云える。

本発明は、以上の状況の下でなされたものであり、ブロッティング膜への転写効率やブロッティング膜に転写された核酸又は蛋白質分子の抗体による染色性に関して濾紙を用いる場合とほとんど遜色がないばかりか、緩衝液に対する高い吸水性を示してゲルへの緩衝液の供給効率に優れ、しかも、繰り返し使用が可能な吸水性物質を用いるブロッティング装置及びブロッティング方法を提供することを目的とする。

本発明に係るブロッティング装置は、電気泳動により分画された核酸又は蛋白質分子を含むゲルと、このゲルに重層されるブロッティング膜と、それらのゲルとブロッティング膜とを両面から挟んで重層されて吸水作用により緩衝液を保持する吸水性物質と、上記ゲルに荷電してそのゲル内の核酸又は蛋白質分子を電気泳動させることにより上記ブロッティング膜に転写させるための陽極側電極及び陰極側電極と、を備えている。そして、上記吸水性物質が親水性の樹脂多孔質体でなる、というものである。

この発明のブロッティング装置によると、吸水性物質として親水性の樹脂多孔質体を用いていることにより、吸水性物質として上記した濾紙を用いる場合に比べて、吸水性物質が緩衝液に濡れやすくなり、しかも、緩衝液の保持容量が増大する。その結果、電流効率が向上し、発熱も抑えられるそのことが、ブロッティング膜への核酸又は蛋白質分子の転写時間を短くすることに役立つ。

本発明において、吸水性物質としての親水性の樹脂多孔質体には、ゲルやゲルに重層されるブロッティング膜に対して密着し、かつ、緩衝液を保持する性質を発揮するものであれば使用可能である。特に、上記樹脂多孔質体には、ポリビニルホルマール樹脂又はポリウレタン樹脂を好適に用いることができる。

本発明において、上記樹脂多孔質体は、その平均気孔径が２０〜２００μｍであり、その平均気孔率が８０〜９４％であることが望ましい。樹脂多孔質体の平均気孔径が２０μｍよりも小さいと緩衝液の吸液性が低くなり、緩衝液を含ませにくいといった不都合がある。樹脂多孔質体の平均気孔径が２００μｍより大きいと緩衝液が多孔質体から流れ出して、内部に保持しにくいといった不都合がある。樹脂多孔質体の平均気孔径が２０〜２００μｍであると、緩衝液の吸液性が低くなり、緩衝液を含ませにくいといった不都合、或いは、緩衝液が多孔質体から流れ出して、内部に保持しにくいといった不都合が生じなくなって、容易に緩衝液が吸液し、保持容量も大きくできるなどの利点が得られる。樹脂多孔質体の平均気孔率が８０％よりも小さいと緩衝液の保持容量が少なくなり、ブロッティング時に電気が流れにくく、発熱したりするといった不都合がある。樹脂多孔質体の平均気孔率が９４％よりも大きいと機械強度が低下し、取り扱い時に破損しやすいといった不都合がある。樹脂多孔質体の平均気孔径が２０〜２００μｍであると、緩衝液の保持容量が少なくなり、ブロッティング時に電気が流れにくく、発熱したりするといった不都合、或いは、機械強度が低下し、取り扱い時に破損しやすいといった不都合が生じなくなって、緩衝液を十分保持でき、通電時の発熱も少なく、破損することもないなどの利点が得られる。

本発明に係るブロッティング方法は、電気泳動により分画された核酸又は蛋白質分子を含むゲルにブロッティング膜を重層し、それらのゲルとブロッティング膜とを吸水性物質により両面から挟み、それらの吸水性物質の吸水作用を利用して緩衝液を保持すると共に、上記ゲルに荷電してそのゲル内の核酸又は蛋白質分子を電気泳動させることにより上記ブロッティング膜に電気的に転写させるブロッティング方法であって、上記吸水性物質として親水性の樹脂多孔質体を用いる、というものである。

上記樹脂多孔質体には、ポリビニルホルマール樹脂又はポリウレタン樹脂を好適に用いることができる。また、上記樹脂多孔質体は上記緩衝液で洗浄して繰り返し使用することが可能である。このことにより、吸水性物質のコストが低減するという利点が生じる。上記樹脂多孔質体は、その平均気孔径が２０〜２００μｍであり、その平均気孔率が８０〜９４％であることが望ましい。

以上のように、本発明に係るブロッティング装置及びブロッティング方法は、ゲルとゲルに重層されたブロッティング膜とを両面から挟んで重層されて吸水作用により緩衝液を保持する吸水性物質として、親水性の樹脂多孔質体、特に好ましくは、平均気孔径が２０〜２００μｍであり、平均気孔率が８０〜９４％であるポリビニルホルマール樹脂又はポリウレタン樹脂を用いているので、ブロッティング膜への転写効率やブロッティング膜に転写された核酸又は蛋白質分子の抗体による染色性に関して濾紙を用いる場合とほとんど遜色がないばかりか、緩衝液に対する高い吸水性を示して電流効率に優れ、しかも、繰り返し使用が可能な吸水性物質を用いるブロッティング装置及びブロッティング方法を提供することが可能になる。

また、吸水性物質としてのポリビニルホルマール樹脂又はポリウレタン樹脂を、緩衝液で洗浄して繰り返し使用するというブロッティング方法は、吸水性物質のコストを安価に抑えることに役立つので、この方法を採用することによって、ブロッティング装置及びブロッティング方法を安価に提供又は実施することができるようになるという卓越した効果を発揮する。

図１は一般的なブロッティング装置（半乾式ブロッティング装置）の構成を示した説明図である。図中、１は電気泳動によって分画された核酸又は蛋白質分子を含むゲルであり、このゲル１には、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルを用いることができる。ゲル１にはブロッティング膜２が重層されている。ブロッティング膜２には、疎水性に優れて核酸や蛋白質分子が結合しやすいニトロセルロースやＰＶＤＦメンブレンなどが用いられる。吸水性物質３，４は、ゲル１とブロッティング膜とを両面から挟んでそれらに重層される。本発明では、この吸水性物質３，４として、親水性の樹脂多孔質体、好ましくはポリビニルホルマール樹脂又はポリウレタン樹脂でなる樹脂多孔質体、さらに好ましくは平均気孔径が２０〜２００μｍであり、平均気孔率が８０〜９４％であるポリビニルホルマール樹脂又はポリウレタン樹脂でなる樹脂多孔質体が用いられる。

さらに、ゲル１内で分画されている核酸又は蛋白質分子を電気的にブロッティング膜２に移動させて転写させるための手段として、片側の吸水性物質３に陰極側電極板５が重ね合わされ、他側の吸水性物質４に陽極側電極板６が重ね合わされる。

このブロッティング装置では、緩衝液が、ゲル１に重層されている吸水性物質３，４に保持されている。また、陽極側と陰極側の電極板５，６に定電流を流すと、ゲル１に荷電されてそのゲル１内で分画されている核酸又は蛋白質分子が電気的にブロッティング膜２に移動してブロッティング膜２に転写される。

アクリルアミド濃度１０％で作成したゲルを用い、５つのレーンに分子量マーカー、マウス血管内皮種様細胞株ライセート、ヒトケラチノサイト細胞株ライセート、初代培養ヒト血管内皮細胞ライセート、分子量マーカーを、各２μｇ（マイクログラム）用い、一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質を分離した。

次に、このゲルの蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写するために、図１に示した半乾式ブロッティング装置にセットした。

緩衝液の保持材として、濾紙を用いた場合と、親水性の樹脂多孔質体を用いた場合とで、転写効率を比較した。

濾紙には、トリスーグリシンーメタノール系緩衝液の保持材として一般に使用されているアトー社製ブロッティング用濾紙を用いて比較例１とした。

親水性の樹脂多孔質体にアイオン社製ベルイーターＥＢを用いて実験例１とした。また、親水性の樹脂多孔質体にアイオン社製ソフラスＮを用いて実験例２とした。なお、アイオン社製ベルイーターＥＢは、ポリビニルホルマール樹脂でなる親水性の樹脂多孔質体であって、平均気孔径が１５０μｍであり、その平均気孔率が８９％である。また、アイオン社製ソフラスＮは、ポリウレタン樹脂スポンジでなる親水性の樹脂多孔質体であって、平均気孔径が２５μｍであり、その平均気孔率が８３％である。

比較例１の濾紙は両極に８枚ずつ用い、実験例１のベルイーターＥＢは厚さ２ｍｍのものを両極に１枚ずつ用い、実験例２のソフラスＮも同様に厚さ２ｍｍのものを両極に１枚ずつ用いた。

実験例１，２と比較例１とに関して、２．６ｍＡ／ｃｍ² の電流を４０分間流し、蛋白質分子をＰＶＤＦ膜に転写した。その後、ゲルとＰＶＤＦ膜をＣＢＢ染色し、実験例１，２及び比較例１についての蛋白質分子のバンドを観察した。その結果を図２に示した。

また、実験例１のベルイーターＥＢと実験例２のソフラスＮにつき、使用後緩衝液で洗浄し、再度同じ手順でブロッティング操作を４回繰り返し実施した。

（１）転写効率・染色性
図２に示した比較例１、実験例１，２を比較した結果、バンドの濃度がほゞ同じであって大きな差異の存在しないことが判った。また、抗体による染色性についても大きな差異の存在しないことが判った。このことにより、本発明に係るブロッティング装置及びブロッティング方法は、転写効率や染色性に関して、吸水性物質として濾紙を用いるブロッティング装置及びブロッティング方法と遜色のないことが明らかになった。また、実験例１のベルイーターＥＢと実験例２のソフラスＮについての繰り返し使用について考察したところ、両者共に５回目まで１回目と同等の転写効率が得られた。
（２）操作性
比較例１の濾紙、実験例１のベルイータＥＢ、実験例２のソフラスＮにつき、新品（再使用品でないもの）での緩衝液の膨潤に費やされる時間を比較したところ、ベルイータＥＢでは数分の時間が費やされたのに対し、濾紙とソフラスＮとは１分以内の時間が費やされたに過ぎなかった。しかし、このことは、ブロッティング装置及びブロッティング方法を安価に提供又は実施することの障害にはならない。
（３）結論
以上より、実験例１のベルイータＥＢや実験例２のソフラスＮは、比較例１の濾紙と比べて遜色なくブロッティング装置やブロッティング方法に用いることが可能であることが判った。また、実験例１のベルイータＥＢや実験例２のソフラスＮは、緩衝液で洗浄後に繰り返し使用を行っても、転写効率や染色性に劣化が見られないところから、繰り返し使用が可能であるという利点を備えていることが判った。

実施例１の場合と同様に、アクリルアミド濃度１０％で作成したゲルを用い、７つのレーンに、蛋白質分子の量を４０、２０、１０、５，２．５、１．２５μｇ（マイクログラム）と変えてチャージし、蛋白質分子を分離した。

次に、実施例１と同様にブロッティング操作を実施した。緩衝液の保持材として、濾紙を用いた場合と、親水性の樹脂多孔質体を用いた場合とで、転写効率を比較した。

濾紙には、バイオラッド社製ブロッティング用濾紙を用いて比較例２とした。

親水性の樹脂多孔質体にアイオン社製ベルイーターＤ（Ｄ）を用いて実験例３とした。親水性の樹脂多孔質体にアイオン社製ソフラスＮを用いて実験例４とした。親水性の樹脂多孔質体にアイオン社製ソフラスＥＣを用いて実験例５とした。

なお、アイオン社製ベルイーターＤ（Ｄ）は、ポリビニルホルマール樹脂でなる親水性の樹脂多孔質体であって、平均気孔径が８０μｍであり、その平均気孔率が８９％である。また、アイオン社製ソフラスＮ及び同ソフラスＥＣは、ポリウレタン樹脂スポンジでなる親水性の樹脂多孔質体であって、平均気孔径が２５μｍであり、その平均気孔率が８３％である。

比較例２の濾紙はバイオラッド社製を陰極に２枚、陽極に３枚用い、実験例３のベルイーターＤ（Ｄ）、実験例４のソフラスＮ及び実験例５のソフラスＥＣは、厚さ２ｍｍのものを陰極に１枚用い、厚さ３ｍｍのものを陽極に１枚用いた。

比較例２に関して、２．７ｍＡ／ｃｍ² の電流を６０分間流し、実験例３のベルイーターＤ（Ｄ）、実験例４のソフラスＮ及び実験例５のソフラスＥＣは、３．３ｍＡ／ｃｍ² の電流を４０分間流し、蛋白質分子をＰＶＤＦ膜に転写した。その後、ゲルとＰＶＤＦ膜をＣＢＢ染色し、実験例３〜５及び比較例２についての蛋白質分子のバンドを観察した。その結果を図３に示した。

また、実施例１と同様に、実験例３のベルイーターＤ（Ｄ）、実験例４のソフラスＮ及び実験例５のソフラスＥＣにつき、使用後緩衝液で洗浄し、再度同じ手順でブロッティング操作を４回繰り返し実施した。

（１）転写効率・染色性
図３に示した比較例２、実験例３〜５を比較した結果、バンドの濃度がほゞ同じであって大きな差異の存在しないことが判った。また、抗体による染色性についても大きな差異の存在しないことが判った。このことにより、本発明に係るブロッティング装置及びブロッティング方法は、転写効率や染色性に関して、吸水性物質として濾紙を用いるブロッティング装置及びブロッティング方法と遜色のないことが明らかになった。また、実験例３のベルイーターＤ（Ｄ）、実験例４のソフラスＮ及び実験例５のソフラスＥＣの３者についての繰り返し使用について考察したところ、３者共に５回目まで１回目と同等の転写効率が得られた。
（２）結論
以上より、実験例３のベルイーターＤ（Ｄ）、実験例４のソフラスＮ及び実験例５のソフラスＥＣの３者は、比較例２の濾紙と比べて遜色なくブロッティング装置やブロッティング方法に用いることが可能であることが判った。また、上記３者は、緩衝液で洗浄後に繰り返し使用を行っても、転写効率や染色性に劣化が見られないところから、繰り返し使用が可能であるという利点を備えていることが判った。

上記した実施例１及び実施例２はいずれも蛋白質分子をブロッティング膜に転写した事例であるけれども、核酸についても同様の結果が得られる。

一般的な半乾式ブロッティング装置の構成を示した説明図である。 比較例１、実験例１及び実験例２の結果の図面代用図である。 比較例２、実験例３〜５の結果の図面代用図である。

符号の説明

１ ゲル
２ ブロッティング膜
３，４ 吸水性物質
５ 陰極側電極板
６ 陽極側電極板

Claims (7)

1. 電気泳動により分画された核酸又は蛋白質分子を含むゲルと、このゲルに重層されるブロッティング膜と、それらのゲルとブロッティング膜とを両面から挟んで重層されて吸水作用により緩衝液を保持する吸水性物質と、上記ゲルに荷電してそのゲル内の核酸又は蛋白質分子を電気泳動させることにより上記ブロッティング膜に転写させるための陽極側電極及び陰極側電極と、を備えていると共に、上記吸水性物質が親水性の樹脂多孔質体でなることを特徴とするブロッティング装置。
2. 上記樹脂多孔質体が、ポリビニルホルマール樹脂又はポリウレタン樹脂でなる請求項１に記載したブロッティング装置。
3. 上記樹脂多孔質体は、その平均気孔径が２０〜２００μｍであり、その平均気孔率が８０〜９４％である請求項１又は請求項２に記載したブロッティング装置。
4. 電気泳動により分画された核酸又は蛋白質分子を含むゲルにブロッティング膜を重層し、それらのゲルとブロッティング膜とを吸水性物質により両面から挟み、それらの吸水性物質の吸水作用を利用して緩衝液を保持すると共に、上記ゲルに荷電してそのゲル内の核酸又は蛋白質分子を電気泳動させることにより上記ブロッティング膜に電気的に転写させるブロッティング方法であって、
   上記吸水性物質として親水性の樹脂多孔質体を用いることを特徴とするブロッティング方法。
5. 上記樹脂多孔質体が、ポリビニルホルマール樹脂又はポリウレタン樹脂でなる請求項４に記載したブロッティング方法。
6. 上記樹脂多孔質体を上記緩衝液で洗浄して繰り返し使用する請求項４又は請求項５に記載したブロッティング方法。
7. 上記樹脂多孔質体は、その平均気孔径が２０〜２００μｍであり、その平均気孔率が８０〜９４％である請求項４ないし請求項６のいずれか１項に記載したブロッティング方法。