JP2010085609A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】ピンホールから射出される光を確実に検出する。
【解決手段】対物レンズ１９により、光源１４から射出される照明光が試料１２に集光され、集光レンズ２１により、試料１２からの観察光が結像される。光分離部材２２は、試料１２の集光点と略共役な位置に配置され、観察光を２つの光束に分離して、一側面に設けられている反射膜２２ｄに形成されているピンホール２２ａおよび２２ｂから射出する。ファイバ２３ａおよび２３ｂは、光分離部材２２のピンホール２２ａおよび２２ｂから射出される光束を、それらの光束を検出する光検出器２４ａおよび２４ｂにそれぞれ伝達する。本発明は、例えば、共焦点顕微鏡に適用できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関し、特に、ピンホールから射出される光を確実に検出することができるようにした共焦点顕微鏡に関する。

従来、共焦点顕微鏡では、生体標本などの試料に照明光を集光させるとともに、その照明光が集光するスポット（集光部）を走査させ、スポットから射出する光束を共焦点絞り面に集光させて、その共焦点絞りを通過した光束の光量を光検出器で検出することにより、その試料の二次元の画像が取得される。

また、共焦点顕微鏡は、共焦点面にピンホール部材を配置し、そのピンホール（開口）内に集光する光のみを通過させることで、試料の特定の高さから射出した光のみが光検出器に入射し、その高さ以外の部分から射出した光がカットされるよう構成されている。これにより、共焦点顕微鏡では、試料の特定の高さに位置する薄い層にのみ限定（セクショニング）された画像を取得することができる。

そして、共焦点顕微鏡では、ピンホール部材の開口径を変更することにより、セクショニング分解能（観察対象となる層の厚み）が変更され、開口径を大きくするとセクショニング分解能を低くすることができ、開口径を小さくするとセクショニング分解能を高くすることができる。

また、例えば、特許文献１に開示されている共焦点顕微鏡では、試料から射出する観察光を分離させて、開口径が異なる複数のピンホールをそれぞれ通過させ、それぞれの光を光検出器で検出することにより、セクショニング分解能の異なる複数の画像が取得される。そして、それらのセクショニング分解能の異なる複数の画像に基づいて、それらの画像とはセクショニング分解能の異なる画像が作成される。

特開２００５−２７４５９１号公報

ところで、特許文献１に開示されている共焦点顕微鏡では、複数のピンホールどうしの間隔が狭い場合、例えば、光検出器を設置することが難しくなるため、ピンホールから射出される光の検出が困難になることがあった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、ピンホールから射出される光を確実に検出することができるようにするものである。

本発明の共焦点顕微鏡は、光源から射出される照明光を試料に集光する照明光学系と、前記試料からの観察光を結像する結像光学系と、前記結像光学系に関し前記試料の集光点と略共役な位置に配置され、前記観察光を複数の光束に分離して、一側面に形成されている複数のピンホールから射出させる光分離部材と、前記複数のピンホールから射出された前記複数の光束をそれぞれ検出する検出手段と、前記複数の光束をそれぞれ前記検出手段に伝達する光伝達手段とを備えることを特徴とする。

本発明の共焦点顕微鏡においては、照明光学系により、光源から射出される照明光が試料に集光され、結像光学系により、試料からの観察光が結像される。また、結像光学系に関し試料の集光点と略共役な位置に配置される光分離部材により、観察光が複数の光束に分離されて、光分離部材の一側面に形成されている複数のピンホールから射出される。そして、複数のピンホールから射出された光束がそれぞれ光伝達手段により検出手段に伝達され、検出される。

本発明の共焦点顕微鏡によれば、ピンホールから射出される光を確実に検出することができる。

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。

図１において、共焦点顕微鏡１１では、観察の対象となる試料１２がステージ１３に載置されており、試料１２に励起光を照射することにより試料１２に含まれている蛍光成分が励起され、試料１２から発せられる蛍光（観察光）を検出することで、試料１２の画像データが取得される。

光源１４から射出される光束は、照明用レンズ１５により平行光とされ、励起フィルタ１６によりフィルタリングされることによって試料１２に含まれている蛍光色素を励起する波長領域の励起光となり、ダイクロイックミラー１７に入射する。

ダイクロイックミラー１７は、所定の波長領域の光のみを反射するとともに、他の波長領域の光を透過することができ、励起フィルタ１６を介して入射する励起光を、光軸Ｌに沿って反射してガルバノミラー１８に入射させる。ガルバノミラー１８は、励起光を反射しつつ回動することで、光軸Ｌに直交する平面で励起光を走査させ、その励起光は、対物レンズ１９により集光されて試料１２にスポットを形成する。

試料１２では、励起光のスポットが形成された領域から蛍光が射出され、その蛍光は、対物レンズ１９を介してガルバノミラー１８に入射する。ガルバノミラー１８は、試料１２に照射した励起光を走査したときと同様の角度で試料１２からの蛍光を反射することで、その蛍光を平行光束に戻し（デスキャンし）、ダイクロイックミラー１７に入射する。

ダイクロイックミラー１７に入射した蛍光は、励起光とは波長が異なることからダイクロイックミラー１７を透過し、蛍光フィルタ２０を通過することにより、試料１２で反射された、蛍光以外の光のうちダイクロイックミラー１７を通過した光などがフィルタリングされて集光レンズ２１に入射する。集光レンズ２１は蛍光フィルタ２０を介して入射する蛍光を集光し、その焦点位置には、即ち、対物レンズ１９の焦点位置とほぼ共役な位置（共焦点位置）には、光分離部材２２が配置されている。

光分離部材２２には、図３を参照して後述するように、直径がそれぞれ異なる２つのピンホール２２ａおよび２２ｂが設けられており、光分離部材２２は、入射した蛍光を分離し、分離された蛍光はピンホール２２ａおよび２２ｂをそれぞれ通過する。そして、ピンホール２２ａを通過した蛍光はファイバ２３ａに入射し、ピンホール２２ｂを通過した蛍光はファイバ２３ｂに入射する。

ファイバ２３ａおよび２３ｂは、ピンホール２２ａおよび２２ｂを通過した蛍光を伝達し、光検出器２４ａおよび２４ｂにそれぞれ導入させる。

光検出器２４ａおよび２４ｂは、例えば、光電子増倍管（PMT：Photo Multiplier Tube）などであり、そこに入射する蛍光を検出し、その光量に応じた電圧の検出信号をコンピュータ２５に供給する。

コンピュータ２５は、光検出器２４ａおよび２４ｂから供給される検出信号から画像データを構築する画像処理を行う。即ち、コンピュータ２５は、ピンホール２２ａを通過した蛍光に基づく画像データと、ピンホール２２ｂを通過した蛍光に基づく画像データとをそれぞれ構築し、それらの画像をコンピュータ２５のモニタに表示させるとともに、ハードディスクドライブなどの記録部に記録させる。

このように、共焦点顕微鏡１１では、光分離部材２２において試料１２から発せられる蛍光が分離され、直径がそれぞれ異なる２つのピンホール２２ａおよび２２ｂをそれぞれ通過した蛍光に基づいた２つの画像データが取得される。

なお、照明用レンズ１５、ダイクロイックミラー１７、対物レンズ１９などは照明光学系を構成し、対物レンズ１９、ダイクロイックミラー１７、集光レンズ２１などは結像光学系を構成している。

ここで、図２を参照して、ピンホール２２ａおよび２２ｂをそれぞれ通過した蛍光に基づく画像データについて説明する。

図２は、試料１２の観察対象となる層と、ピンホール２２ａおよび２２ｂをそれぞれ通過した蛍光に基づく画像データとの関係を模式的に示した図である。

上述したように、対物レンズ１９により励起光が集光されて、試料１２内の所定の深さの集光位置Ｓ１にスポットが形成され、集光位置Ｓ１を中心として、その近傍領域の蛍光色素が励起されることにより、蛍光が射出される。試料１２からの蛍光は、対物レンズ１９により平行光とされた後、集光レンズ２１により集光される。

また、集光レンズ２１の焦点位置Ｓ２には、光分離部材２２のピンホール２２ａが配置され、焦点位置Ｓ２から光学的に所定の間隔（後述する図３の透明基板２２Ｃの屈折率をｎとすると、その２／ｎ倍の間隔）離れた位置Ｓ３に光分離部材２２のピンホール２２ｂが配置されている。

ピンホール２２ａおよび２２ｂは、後述する図３に示すように、ピンホール２２ａの径よりもピンホール２２ｂの径が大きく（例えば、２倍に）なるように形成されており、試料１２の集光位置Ｓ１の近傍領域から発せられる蛍光のうちの、集光位置Ｓ１を中心とした薄い層１２ａから発せられた蛍光のみが、ピンホール２２ａを通過する。そして、薄い層１２ａを挟む上下２層（厚い層１２ｂから薄い層１２ａを差し引いた層）から発せられた蛍光のみが、ピンホール２２ｂを通過する。

従って、ピンホール２２ａを通過し、ファイバ２３ａを介して光検出器２４ａにより検出された蛍光に基づいて、試料１２の薄い層１２ａを観察対象とした画像データＤａが取得される。また、ピンホール２２ｂを通過し、ファイバ２３ｂを介して光検出器２４ｂにより検出された蛍光に基づいて、厚い層１２ｂから薄い層１２ａを差し引いた層を観察対象とした画像データＤｂが取得される。

このように、共焦点顕微鏡１１では、観察対象となる層が薄い画像データＤａと、観察対象となる層が厚い画像データＤｂとが取得され、コンピュータ２５の記録部に記録される。コンピュータ２５は、記録部に記録されている画像データＤａと画像データＤｂとを用いた演算を行うことで、観察者により指定される任意のセクショニング分解能の画像データを作成し、その画像をモニタに表示させることができる。

例えば、任意のセクショニング分解能の画像データＤは、Ｄ＝Ｄａ＋αＤｂで算出される。ここで、αは、重み関数であり、観察者が、−１から＋１の範囲でαを指定することで、画像データＤａのセクショニング分解能および画像データＤｂのセクショニング分解能とは異なる任意のセクショニング分解能の画像データＤを作成することができる。

次に、図３を参照して、光分離部材２２について説明する。

図３Ａには、光分離部材２２の断面が示されており、図３Ｂには、図３Ａに示されている矢印Ａから光分離部材２２を見た図が示されており、図３Ｃには、図３Ａに示されている矢印Ｂから光分離部材２２を見た図が示されている。

光分離部材２２は、例えば、光を透過する性質の光学ガラス基板などからなる透明基板２２Ｃの一側面に反射膜２２ｄが成膜され、他側面に反射膜２２ｅおよび反射防止膜２２ｆが成膜された構造となっている。また、光分離部材２２は、反射膜２２ｅおよび反射防止膜２２ｆが成膜されている側面が試料１２に向けられ、ピンホール２２ａおよび２２ｂが集光レンズ２１の焦点深度内となるように配置される。また、光分離部材２２は、反射膜２２ｄが形成されている側面が、光軸Ｌに垂直な面に対して所定の角度（例えば、１５度程度）で傾斜し、反射防止膜２２ｆおよびピンホール２２ａが光軸Ｌ上となるように配置される。

反射膜２２ｄおよび２２ｅは、クロム膜などの光を反射する性質の光学膜である。反射膜２２ｄには、所定の中心間隔Ｘでピンホール２２ａおよび２２ｂが形成されており、ピンホール２２ａの径よりもピンホール２２ｂの径が大きく（例えば、２倍に）なるように形成される。ピンホール２２ａの直径は、結像光学系の解像限界の２〜６倍が望ましい。ピンホール２２ｂの径は、ピンホール２２ａの径の２〜４倍が望ましい。具体的には、ピンホール２２ａの直径が225μｍとなり、ピンホール２２ｂの直径が450μｍとなり、ピンホール２２ａおよび２２ｂの中心間隔Ｘが750μｍとなるように反射膜２２ｄが成膜される。

反射防止膜２２ｆは、光分離部材２２に入射する試料１２からの蛍光が透明基板２２Ｃの表面で反射することを防止する。

また、図３に示すように、ファイバ２３ａおよび２３ｂは、不図示の結像光学系の光軸Ｌに対する光分離部材２２の傾斜角とほぼ同一の角度で、その端面が斜めに切断されている。そして、ファイバ２３ａは、その先端部分の中心軸が光軸Ｌと略同軸となるような向きで、かつ、端面の中心がピンホール２２ａの中心に一致するように反射膜２２ｄに接着される。同様に、ファイバ２３ｂは、その先端部分の中心軸が光軸Ｌと平行（反射膜２２ｄおよび２２ｅにより反射された後の光路と略同軸）となるような向きで、かつ、端面の中心がピンホール２２ｂの中心に一致するように反射膜２２ｄに接着される。なお、ここでは、光軸Ｌが透明基板２２Ｃに入射し、屈折するときの数度の角度変化を簡単のために無視している。

例えば、ファイバ２３ａおよび２３ｂと反射膜２２ｄとの接着に用いる接着剤としては、透明基板２２Ｃと同程度の屈折率を有するものが用いられ、接着剤によりピンホール２２ａおよび２２ｂが充填されるように、即ち、反射膜２２ｄの厚みによる隙間に空気層が形成されないように、ファイバ２３ａおよび２３ｂが接着される。

そして、集光レンズ２１（図１）により集光された蛍光は、反射防止膜２２ｆを透過して透明基板２２Ｃに入射し、ピンホール２２ａを通過する蛍光と、ピンホール２２ａの周囲の反射膜２２ｄにより反射され、反射膜２２ｅにより反射された後にピンホール２２ｂを通過する蛍光とに分離される。即ち、図２を参照して説明したように、集光位置Ｓ１を中心とした薄い層１２ａから発せられる蛍光と、薄い層１２ａを挟む上下２層から発せられる蛍光とに分離される。

また、集光位置Ｓ１を中心とした薄い層１２ａから発せられる蛍光は、ピンホール２２ａを通過してファイバ２３ａにより光検出器２４ａに伝送され、薄い層１２ａを挟む上下２層から発せられる蛍光は、ピンホール２２ｂを通過してファイバ２３ｂにより光検出器２４ｂに伝送される。

このように、共焦点顕微鏡１１では、ファイバ２３ａおよび２３ｂにより、ピンホール２２ａおよび２２ｂから射出される蛍光が光検出器２４ａおよび２４ｂにそれぞれ伝送されるので、ピンホール２２ａおよび２２ｂから射出される蛍光を確実に検出することができる。

即ち、ピンホール２２ａおよび２２ｂから射出される蛍光を光検出器２４ａおよび２４ｂに直接的に入射させるような構成とすることも考えられるが、ピンホール２２ａおよび２２ｂの中心間隔Ｘが狭いため、そのような構成では、光検出器２４ａと２４ｂとを互いに干渉しないように設置することが困難であり、光検出器２４ａおよび２４ｂに蛍光を確実に導入することができないことがあった。これに対し、共焦点顕微鏡１１では、ファイバ２３ａおよび２３ｂを利用することで、光検出器２４ａおよび２４ｂに蛍光を確実に導入することができる。

また、ファイバ２３ａおよび２３ｂを利用することで、光検出器２４ａおよび２４ｂを配置する際の自由度が増し、例えば、光検出器２４ａおよび２４ｂを、試料１２から光分離部材２２までの光学系から離して設置することで、共焦点顕微鏡１１のヘッド部分を小型化することができる。

さらに、共焦点顕微鏡１１では、光分離部材２２に反射防止膜２２ｆが成膜されているので、光分離部材２２内に入射する蛍光の損失を低減させることができる。

また、ファイバ２３ａおよび２３ｂが光分離部材２２に接着され、ファイバ２３ａおよび２３ｂの端面と透明基板２２Ｃとの間に空気層がなく、境界面での反射をなくすことができるので、ピンホール２２ａおよび２２ｂから射出される蛍光の損失を低減させることができる。特に、ファイバ２３ａおよび２３ｂの接着に用いる接着剤として、透明基板２２Ｃと同程度の屈折率を有するものを用い、接着剤によりピンホール２２ａおよび２２ｂが充填されるようにすることで、ファイバ２３ａおよび２３ｂに入射する蛍光の損失をより低減させることができる。

また、ファイバ２３ａおよび２３ｂの端面が、光軸Ｌに対する光分離部材２２の傾斜角とほぼ同一の角度で斜めに切断され、ファイバ２３ａおよび２３ｂの先端部分の中心軸が光軸Ｌと同軸または平行となる向きで、かつ、それらの端面の中心がピンホール２２ａおよび２２ｂの中心に一致するように接着することにより、ファイバ２３ａおよび２３ｂに、そのＮＡの範囲で効率的に、蛍光を導入することができるので、ファイバ２３ａおよび２３ｂに入射する蛍光の損失をさらに低減させることができる。

このように、ファイバ２３ａおよび２３ｂに入射する蛍光の損失を低減させることで、試料１２から射出される蛍光が微弱なものであっても確実に検出することができ、観察精度を向上させることができる。

なお、例えば、ファイバ２３ａおよび２３ｂの端面がピンホール２２ａおよび２２ｂにそれぞれ密着するように、ファイバ２３ａおよび２３ｂを光分離部材２２に対して固定し、ファイバ２３ａおよび２３ｂに入射する蛍光の損失を抑制することができれば、ファイバ２３ａおよび２３ｂが接着されていなくてもよい。

また、例えば、ファイバ２３ａおよび２３ｂと、光分離部材２２とを別々に取り扱う際には、ファイバ２３ａおよび２３ｂの中心間隔が、ピンホール２２ａおよび２２ｂの中心間隔Ｘと一致した状態を保つように、ファイバ２３ａおよび２３ｂの先端部分を固定手段により固定してもよい。

例えば、図４に示すように、ファイバユニット２６により、ファイバ２３ａおよび２３ｂの先端部分を固定して、ファイバ２３ａおよび２３ｂを一体化して取り扱うことができる。

図４Ａには、ファイバユニット２６を側面から見た概略的な構成例が示されており、図４Ｂは、図４Ａに示されている矢印Ｂからファイバユニット２６を見た図が示されている。

ファイバユニット２６は、ファイバ２３ａおよび２３ｂを挟み込む２つのユニットブロック２６ａおよび２６ｂから構成されており、ユニットブロック２６ａおよび２６ｂの互いに向き合う側面には、略Ｖ字形状の２本の溝が間隔Ｘで形成されている。即ち、ファイバユニット２６が、この２本の溝で、ファイバ２３ａおよび２３ｂをそれぞれ挟み込むことで、ファイバ２３ａおよび２３ｂの中心間隔が、ピンホール２２ａおよび２２ｂの中心間隔Ｘと一致した状態で固定される。

また、ファイバ２３ａおよび２３ｂとしては、例えば、クラッド径が700μｍであり、コア径が600μｍであるものが用いられ、ファイバユニット２６により、ファイバ２３ａおよび２３ｂの中心間隔は750μｍで固定される。

このように、ファイバユニット２６によりファイバ２３ａおよび２３ｂを一体化（ユニット化）することにより、ファイバ２３ａおよび２３ｂの中心間隔を、ピンホール２２ａおよび２２ｂの中心間隔Ｘに精度よく一致させることができる。これにより、ファイバ２３ａおよび２３ｂの中心間隔を調整する手間が省け、例えば、光分離部材２２とファイバ２３ａおよび２３ｂとの組み合わせの交換を容易に行うことができる。

なお、図４に示すように、ファイバユニット２６は、ファイバ２３ａおよび２３ｂの中心軸がピンホール２２ａおよび２２ｂの中心に一致するように、光分離部材２２に対して固定されているだけであり、ファイバユニット２６は光分離部材２２に接着されていないが、例えば、ファイバユニット２６ごと、ファイバ２３ａおよび２３ｂの端面を光分離部材２２に接着させてもよい。

即ち、図５に示すように、ファイバユニット２６、並びに、ファイバ２３ａおよび２３ｂを光分離部材２２に接着させ、光分離部材２２、ファイバユニット２６、並びに、ファイバ２３ａおよび２３ｂを一体化することができる。また、その接着に用いる接着剤には、透明基板２２Ｃと同程度の屈折率を有するものが用いられ、接着剤によりピンホール２２ａおよび２２ｂが充填されるように接着される。

これにより、光分離部材２２に対してファイバ２３ａおよび２３ｂを確実に固定することができ、例えば、ファイバ２３ａおよび２３ｂがピンホール２２ａおよび２２ｂに対してズレてしまうことなどによる測定精度の低下を回避することができる。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。 試料１２の観察対象となる層と、光分離部材２２のピンホール２２ａおよび２２ｂをそれぞれ通過する蛍光との関係を模式的に示した図である。 光分離部材２２について説明する図である。 ファイバユニット２６によりファイバ２３ａおよび２３ｂが一体化した構成例を示す図である。 光分離部材２２にファイバユニット２６を接着させた構成例を示す図である。

符号の説明

１１ 共焦点顕微鏡， １２ 試料， １３ ステージ， １４ 光源， １５ 照明用レンズ， １６ 励起フィルタ， １７ ダイクロイックミラー， １８ ガルバノミラー， １９ 対物レンズ， ２０ 蛍光フィルタ， ２１ 集光レンズ， ２２ 光分離部材， ２２ａおよび２２ｂ ピンホール， ２３ａおよび２３ｂ ファイバ， ２４ａおよび２４ｂ 光検出器， ２５ コンピュータ， ２６ ファイバユニット， ２６ａおよび２６ｂ ユニットブロック

Claims (7)

1. 光源から射出される照明光を試料に集光する照明光学系と、
   前記試料からの観察光を結像する結像光学系と、
   前記結像光学系に関し前記試料の集光点と略共役な位置に配置され、前記観察光を複数の光束に分離して、一側面に形成されている複数のピンホールから射出させる光分離部材と、
   前記複数のピンホールから射出された前記複数の光束をそれぞれ検出する検出手段と、
   前記複数の光束をそれぞれ前記検出手段に伝達する光伝達手段と
   を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記光伝達手段の端面が、前記ピンホールが形成されている前記光分離部材の側面に接着されている
   ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記光分離部材は、前記ピンホールが形成されている側面が、前記結像光学系の光軸に垂直な面に対して所定の角度をなして配置され、
   前記光伝達手段は、前記光束が入射する端面が前記角度に略一致する角度で傾斜するように形成され、前記入射する端面の中心軸が前記結像光学系の光軸と略一致または略平行となるように、前記光分離部材に対して配置される
   ことを特徴とする請求項１または２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記光伝達手段は、複数の光ファイバであり、それぞれの入射端面の中心が、前記複数のピンホールの中心と略一致するように前記光分離部材に対して配置される
   ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記光伝達手段は、複数の光ファイバであり、前記光ファイバは保持部材により一体保持され、ユニット化されている
   ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
6. 前記複数の光ファイバの前記入射端面の中心間隔が、前記複数のピンホールの中心間隔と略一致するように、前記複数の光ファイバの前記入射端面を固定する固定手段を
   さらに備えることを特徴とする請求項４または５に記載の共焦点顕微鏡。
7. 前記光ファイバの前記入射端面が、前記ピンホールが形成されている前記光分離部材の側面に接着されている
   ことを特徴とする請求項４乃至６に記載の共焦点顕微鏡。

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